WO2008099088A2 - Procede de culture in vitro de lymphocytes t, en particulier de lymphocytes t infiltrant les tumeurs dits til - Google Patents

Procede de culture in vitro de lymphocytes t, en particulier de lymphocytes t infiltrant les tumeurs dits til Download PDF

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WO2008099088A2
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Sylvain Bercegeay
Soraya Saiagh
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Centre Hospitalier Universitaire De Nantes
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    • C12N2502/00—Coculture with; Conditioned medium produced by
    • C12N2502/11—Coculture with; Conditioned medium produced by blood or immune system cells

Definitions

  • the present invention relates to a method of in vitro culture of T lymphocytes, in particular of T cells infiltrating tumors called TIL, or TILs, as well as a container intended for the culture of such T lymphocytes and an anti-tumor pharmaceutical composition comprising such T lymphocytes
  • adoptive cellular immunotherapy appears today as a therapeutic alternative. It consists of injecting cancer patients with autologous T cells previously amplified in vitro in order to increase the frequency of T lymphocytes with specific anti-tumor activity.
  • the culture method described in this publication comprises a first stage of treatment of tumor samples (enzymatic, filtration, cell separation) with a view to extracting T lymphocytes potentially specific to the tumor. These T lymphocytes then undergo a stimulation step in RPMI-type culture medium supplemented in particular with recombinant interleukin-2 and culture supernatant of LAK cells from healthy donors, this stimulation step being itself followed by an amplification step.
  • the stimulation step is most commonly performed in 24-well plates even if the use of culture bags is suggested. This process is criticized because of the large amount of culture medium needed to produce 2.10 11 cells (more than 200 L). In addition, it requires the use of a very high dose of interleukin 2 whose toxic character at such concentrations for the recipient has been demonstrated. Finally, the preparation of tumor samples is laborious and involves the use of incompatible reagents for a clinical application.
  • the patent application EP-0,690,125 describes a process for the preparation of cytotoxic tumor killing anti-tumor T cells.
  • the method involves co-culturing lymphocytes from the peripheral blood of tumor patients and living or fixed raw tumor tissue obtained from the same subject. This co-culture step is carried out in culture plates and implements a complex culture medium supplemented with several cytokines.
  • the T lymphocyte stimulation step utilizes an autologous co-culture system suggesting a lower final yield than that obtained in the case of an allogeneic stimulation system.
  • an open culture system (culture dish) is not compatible with clinical use. Indeed, in a medical setting, the culture vessels must provide guarantees for cell containment, prevention of contamination risks and technical handling errors. These containers must therefore comply with the strict rules of good practice for transfusable products for closed packaging and cell transfer.
  • the T cell culture method described in this publication comprises a step of emergence of T-lymphocytes from live tumor fragments that takes place in 12-well plates, a T-cell stimulation step that takes place in 96-well plates. and an amplification step in culture trays.
  • the whole process uses culture medium supplemented with human allogeneic serum posing the problem of the viral safety of the finished product.
  • said method is implemented in an open system incompatible with clinical use.
  • a culture method comprising a primary culture step (in Costar multiwell plate or in a plastic container Surlyn pocket type) of a human tumor sample from which the TIL will be amplified and maintained in culture for a certain period (addition of medium (AIM V or RPMI supplemented with rll_2) regular but without withdrawal). At the end of this period, a defined amount (75%) of TIL present in this primary culture is transferred to a culture vessel adapted to cell amplification (preferably a SteriCell-type gas-permeable pocket having a culture surface more important, and a possibility of formation of lesser cell aggregates). The rest of the TILs (25%) are kept in primary culture containing Surlyn.
  • the SteriCell pocket TILs are maintained by regular addition of fresh medium (AIM V + rII_2 described in the Rosenberg protocol) and the cultures are split into new pockets each time the culture medium changes color (pH variation of medium) or that the cell concentration exceeds one million / ml.
  • the culture of pocket TILs is supplemented with cells from the primary culture and / or culture supernatant from the primary culture. The pocket TILs are thus stimulated by these cells from the primary culture or by the composition of the primary culture supernatant.
  • the culture operates in an autologous context since the TILs are stimulated by the cells originating from the tumor mass of which they themselves originate. This results in a cellular activation of lesser yield.
  • the stimulation step during which the TILs are stimulated by the cells derived from the primary culture and by the supernatants of the medium derived from this primary culture makes it necessary to maintain in parallel two culture systems corresponding to one at the primary culture stage. or emergence of TILs, the other at the stimulation stage. Maintaining two culture systems in parallel makes the complex complex and tedious in terms of manipulation.
  • An object of the present invention is therefore to provide a method of in vitro culture of T lymphocytes whose specificity of the steps implemented allows a culture in closed system respecting good practices, especially in terms of containment and risk of contamination without harming neither the yield of cells produced nor the quality of the cells produced, the number of tumor-specific lymphocytes, in particular CD8 + T lymphocytes, and their cytotoxic activity with respect to the autologous tumor line being greater than all the results observed so far.
  • the subject of the invention is a method for the in vitro culture of T lymphocytes, in particular of T cells infiltrating tumors known as TIL, modified or otherwise, from tumor samples or blood from a patient suffering from a tumor, said method comprising successively at least one "emergence" stage of the T lymphocytes contained in the tumor or the blood taken, a step of stimulation of the T lymphocytes resulting from the emergence stage and a step of amplification of the stimulated T lymphocytes , characterized in that one proceeds to the stimulation of T lymphocytes in a closed compartmentalized culture vessel.
  • closed culture vessel means a system for maintaining cells in culture in a suitable medium without these being directly in contact with the external environment.
  • the container is closed, that is to say that its internal volume is not in contact with the ambient air, especially during the culture phase, when the cells and the culture medium are introduced into the container.
  • the implementation of the stimulation step in a compartmentalised closed culture vessel allows a significant quantitative increase in the overall yield of TILs (up to 2.5 times) compared with the same technique implemented in an open system or not compartmentalized. It also allows a qualitative increase in the TILs produced. Indeed, among the TIL products, the proportion of CD8 + TIL is greater than that produced (85% versus 60%) under conventional conditions and has a specific cytotoxic activity with respect to the larger autologous tumor line (14% versus 2%). ).
  • T lymphocytes are stimulated in the presence of at least non-proliferating allogeneic feeder cells.
  • These allogeneic feeder cells that is to say from the same species, but from a genetically different individual, are rendered non-proliferating, for example by irradiation.
  • T cells are stimulated by co-culture with a mixture of mononuclear cells from healthy human donor blood and transformed LAZ EBV B cells.
  • the implementation of the T cell stimulation step in a closed container compartmentalized by co-culture with allogeneic cells probably explains the advantages of yield and specificity obtained.
  • the presence of a compartment in the culture vessel combined with the use of feeder cells, preferably allogeneic, in order to increase the antigenic diversity makes it possible to promote close contact between the TILs and the feeder cells while allowing medium changes without inducing turbulence in the cell layer.
  • non-proliferating allogeneic feeder cells and T cells are co-cultured in an X-VIVO 15 TM serum-free selective culture medium supplemented with interleukin 2.
  • the culture medium X -VIVO 15 TM is a serum-free culture medium marketed by Cambrex Corp., Walkersville, Md., USA and optimized for TIL culture.
  • Interleukin 2 plays an important role as a growth and activation factor for lymphocytes.
  • a mitotic agent such as PHA L (L-type phytohemaglutinine) is introduced into the closed stimulation receptacle in parallel with the lymphocytes and is favorable for the amplification of the lymphocytes.
  • the closed stimulation container having at least two compartments, said one technical chamber, the other plenum, communicating with each other, and at least one access path opening into one of the compartments, are introduced lymphocytes and non-proliferative allogeneic feeder cells suspended in a culture medium via said access route, and the culture medium is renewed via the one or another access route.
  • the closed container having at least two access routes opening into the technical chamber, the lymphocytes and non-proliferating allogeneic feeder cells are introduced in suspension in a culture medium via a first access route. who is positioned closest to the plenum, and the culture medium is renewed through a second access path which is positioned farthest from said plenum.
  • the closed stimulation container is placed with the technical chamber extending above the plenum. Because of this arrangement, this again results in an improvement in the contact between feeder cells and T cells capable of increasing the yield of specific cytotoxic T lymphocytes.
  • the step of emergence of T lymphocytes is carried out in a closed culture vessel.
  • the stimulated T lymphocytes are preferably transferred, after stimulation, into a closed amplification culture vessel.
  • the steps of emergence, stimulation and amplification are implemented in a closed culture container different from one step to another.
  • the invention also relates to an antitumor pharmaceutical composition, characterized in that it comprises as active agent T cells obtained by the method of the aforementioned type.
  • This composition is a cell therapy product composed of a heterogeneous cell suspension of T lymphocytes whose proportion of CD8 + cytotoxic T lymphocytes specific for the autologous tumor is greater than that obtained by the conventional preparation techniques described so far.
  • the subject of the invention is also a culture vessel for carrying out the step of stimulating the in vitro culture method of T lymphocytes of the aforementioned type, characterized in that the culture vessel is a compartmentalised closed vessel which comprises : a first and a second sheet of flexible thermoplastic material secured to one another in the vicinity of their periphery so as to form an interior volume;
  • At least one access path to said volume which is arranged to allow the introduction of the cells
  • weld bead between the sheets which is arranged to form, in the interior volume, two compartments communicating with each other and with the or at least one access way, said weld bead being discontinuous and being associated in a sealed manner with a edge of the container.
  • the or at least one access path is provided on the edge of the container which is opposite the edge at which the weld seam is associated.
  • FIG. 1 schematically represents a front view of the closed compartmented culture vessel of the stimulation step
  • FIG. 2 schematically represents a cross-section along A-A of the container of FIG. 1.
  • the culture method which is the subject of the invention, comprises at least three successive steps, namely: a step of emergence of the T lymphocytes contained in the tumor or the blood taken,
  • the transfer from one closed container to another is done in a sterile way, for example by connecting, using a Terumo-type SCD® sterile connection device, the tubings used as pathways. access.
  • the closed emergence, stimulation and amplification containers are preconnected to each other at the time of manufacture, so as to form a closed system.
  • Such a system makes it possible to complete the complete culture of T cells in a closed system, thus limiting the risk of contamination.
  • this method is characterized by the stimulation step implemented in a compartmentalized closed culture container 1.
  • This container 1 generally comprises:
  • a first and a second sheet of flexible thermoplastic material secured to one another in the vicinity of their periphery so as to form an interior volume; at least one access path 4 to said volume which is arranged to allow the introduction of the cells;
  • weld bead 6 between the sheets which is arranged to form, in the interior volume, two compartments 2, 3 communicating with each other and with the or at least one access channel 4, said weld bead 6 being discontinuous and being associated tightly with an edge of the container 1.
  • the sealed connection between the weld bead 6 and the edge of the container 1 is shown at 7 in FIG.
  • the or at least one access channel 4 is provided on the edge of the container 1 which is opposite the edge to which the weld bead 6 is associated.
  • the container 1 comprises two channels 4, 5 of access to the internal volume respectively for the introduction and the recovery of the cells.
  • the two access ways 4, 5 open into the same compartment 2, the compartments 2, 3 being respectively formed between an edge of said container 1 and the weld seam 6, the weld seam extending parallel to the longitudinal edges of said container 1.
  • This weld seam is formed of a succession of dots welding which are regularly spaced. These soldering points have a length of between 1 mm and 5 mm while the spacings have a length of between 1 mm and 1 cm.
  • the welding bead 6 has at its end opposite to that extending in the vicinity of the access channels 4, 5 a sealed connection 7 to said container 1.
  • the two access channels 4, 5 open here in a first compartment 2 called technical chamber 2, this technical chamber 2 extending above the second compartment 3 called the plenum 3.
  • Each access channel 4,5 is for example formed of a portion of tubing, welded between the two sheets 2 , 3 forming the container.
  • the tubing extends into the interior volume of the container.
  • This tubing may be provided with a clamp for controlling the flow of fluid through the tubing.
  • the end of the tubing is for example provided with a female Luer type connector, closed by a removable cap. This connector makes it possible to connect a syringe filled with cells or a container of culture medium.
  • the non-proliferating lymphocytes and non-proliferating feeder cells are thus introduced into suspension in a culture medium via the first access path 4 which is positioned closest to the plenum 3 and the culture medium is renewed. through the second access way 5 which is positioned farthest from said plenum 3.
  • the introduction of the cells through the access path 4 closest to the plenum 3 allows to limit the course of the cells in the container 1, and thus to limit their stress.
  • the use of two different access routes 4.5 for the introduction of cells and the renewal of the medium limits the risk of contamination during handling of the container.
  • the presence of this plenum 3 promotes close contact between TILs and feeder cells while allowing medium changes without inducing turbulence in the cellular mat.
  • the technical chamber 2 is indeed used to introduce and / or remove culture medium in the interior volume of the container 1, without disturbing the cells placed in the plenum 3. Indeed, the weld bead 6 slows and deflects a flow of fluid arriving on it, so that the cells are not in direct contact with the flow of the newly introduced medium, thus limiting the displacement or resuspension of the cells.
  • the container 1 is positioned to dispose the technical chamber 2 above the plenum 3. In this position, the cells sediment in the bottom of the plenum 3 which has a V-shaped promoting concentration and communication of cells in culture.
  • the weld bead 6 is discontinuous, that is to say that it has a plurality of interruptions, in particular more than three. These interruptions allow a limited fluid exchange between the plenum 3 and the technical chamber 2.
  • the weld bead 6 is sealingly associated with an edge 7 of the container, so that the technical chamber 2 and the plenum 3 do not do not communicate with each other at this level.
  • the cells placed in the plenum 3 can not be transferred to the technical chamber 2, at this level.
  • the cells remain in the plenum 3.
  • the plenum 3 provides a confined space in which the cells are quiet, that is, - say little or no displacement after their introduction into the container 1.
  • Example I relates to the stimulation, in a closed compartmentalized system, of TILs originating from primary culture of tumor fragments of a patient identified as BOSE and suffering from melanoma. It should be noted that tumor infiltrating T cells or TILs are immune cells isolated from a tumor or blood from a tumor patient. Reinjected after stimulation and amplification, they have antitumour power, specific to the tumor from which they are derived.
  • these T lymphocytes can be modified by incorporation of a gene such as a chimeric receptor gene, increasing their antitumor power.
  • the method comprises a step of emergence or extraction of TIL from tumor fragments.
  • the TILs are obtained at the end of the primary culture of tumor fragments of a patient with melanoma (BOSE patient) who underwent axillary lymph node dissection.
  • the tumor fragments are obtained by mechanical fragmentation of one of the nodes of the ganglionic chain removed and having a malignant tumor process, and then frozen.
  • the tumor fragments are then thawed and then cultured in 12-well plates (Nunc) in X-VIVO 15 TM medium (Cambrex) supplemented with rlL2 at 300 Ul final / ml (Chiron).
  • the primary culture of fragments is maintained twice a week (withdrawal of medium and addition of new medium).
  • the TILs at the outlet of the tumor fragments are harvested and frozen in cryotubes in DMSO 10% (Braun) / AH4% (LFB).
  • the study described below was performed from a frozen TIL library from a single BOSE patient.
  • the emergence step is followed by a polyclonal stimulation step of the TIL in compartmentalized pocket.
  • the TILs from the frozen TIL bank are thawed and then cultured (OJ) in a closed culture system of compartmentalized pocket type ( Figure 1) (Maco-Pharma SA).
  • This stimulation step will allow polyclonal stimulation of TILs and their proliferation.
  • the seeding phase of the TILs in this specific culture pocket takes place in two steps: *> In a first step, TILs are co-seeded in the presence of allogeneic source cells (to increase the antigenic diversity) previously irradiated and therefore non-proliferating.
  • the feeder cells are composed of a pool of mononuclear cells from 3 healthy donors and a line of B lymphocytes transformed by I 1 EBV (Epstein-Barr Virus) LAZ type.
  • the set TIL and feeder cells is introduced into the bag 1, and more particularly in the so-called plenum chamber, by the access path 4 close to this chamber (FIG. 1) at the following ratios: 0.39 x
  • the bag 1 is held in a vertical position (in its widest part, FIG. 1) in order to facilitate the deposition of the cells at the bottom of the plenum chamber 3 and to promote the close contact between the cells. cells, imperative condition at optimal stimulation output.
  • the TIL are kept in culture in this pocket 1, always in a vertical position, for a period of 10 days.
  • the culture is maintained twice a week by removal of 1/3 of the medium (by removal of the medium at the level of the access path 5 and addition of 1/3 of new medium (X-VIVO 15 TM supplemented with 150 IU / ml final)) by this same way. Transfers of medium by this way avoid inducing turbulence in the chamber 3 of tranquilization can disrupt the cell contact TIL-feeder cells very important during this phase of stimulation.
  • the stimulation step is followed by an amplification step.
  • the TILs cultured in the plenum chamber 3 are suspended by repeated massages of the compartmentalized pouch.
  • the cell suspension of TIL is then transferred via the access route 5 into a suitable transfer bag (Baxter) to be concentrated by centrifugation.
  • the cell pellet is then resuspended in 15 M supplemented X-VIVO medium (150 ul final / ml) at 1 x 10 6 / ml.
  • the cell suspension thus obtained is then transferred from the transfer bag to one or more conventional culture bags adapted to cell amplification (Lifecell type gas-permeable culture bag, Miltenyi Biotec) for an additional 7 days (J20). ).
  • the cultures are maintained every 3 days and the cell concentration is reduced to 1 ⁇ 10 6 cells / ml by addition of new medium.
  • invention In order to evaluate the production parameters of the TILs using the method of the present invention, hereinafter referred to as "invention" and in particular, using the stimulation of the TILs in a compartmentalized culture pocket closed system, the results were compared to those obtained under the conventional culture conditions as currently used in the context of the multicentric clinical research protocol entitled TIL (T ⁇ mor Infiltrating Lymphocytes) and Interleukin 2 versus abstention in adjuvant treatment of melanomas with a single ganglion invaded after ganglion dissection.
  • TIL Tumor Infiltrating Lymphocytes
  • Interleukin 2 Interleukin 2 versus abstention in adjuvant treatment of melanomas with a single ganglion invaded after ganglion dissection.
  • Phase III study randomized, open, multicentric ".
  • Amplification factor (compared to JO)
  • the cell stimulation phase does not require to maintain in parallel a primary culture of tumor sample (containing TIL + autologous tumor cells) as a source of stimulation and nutrients for the subsequent expansion of TILs.
  • This is the culture of a single cell population, the TILs, in co-culture with non-proliferative allogeneic feeder cells. This method is all the more effective since it makes it possible to polyclonically stimulate TIL, the diversity of antigenic stimulation being provided by the co-culture of TIL with the allogeneic cells.
  • the cell yield in total TILs is 1.5 times greater than that obtained by the classical method of plaque stimulation.
  • the amplification factor is of the order of 2810 for TILs grown under the conditions using the stimulation method of the present invention against 1806 for the conventional method of plates.
  • the cellular amplification factor of the TILs observed by the present invention corresponds to more than twice that observed in the method described in the international application WO 90/14097 (of a value of 1229). It is therefore possible by this method to produce 2 times more TILs for an identical culture time.
  • TIL's produced by the process of the invention may then be packaged in a saline solution containing 4% human serum albumin type Vialebex ® 40 mg / ml (LFB) for a therapeutic use as an anti-tumor composition.
  • LLB human serum albumin type Vialebex ® 40 mg / ml
  • the cell viability is at J20 10% higher than that observed in the "control" method demonstrating perfect tolerance of TILs to the stimulation process of the invention.
  • a cellular therapy product of good cell viability makes it possible to avoid the risks of product intolerance linked to an excessive concentration of dead cells and cellular debris.
  • CD8 + specific autologous tumor line (specific CD8 + levels up to 26 times higher than that obtained by the classical method of plaque stimulation).
  • the total amount of TIL to be produced will therefore be less than that which will have to be produced under conventional plate conditions, which represents a saving not only in terms of cost but also in terms of production time. .
  • this method of compartmentalized pocket stimulation allows the rapid preparation of an effective and high quality anti-tumor composition (at a specific CD8 + TIL level) that is safe and economical.
  • CD8 + T lymphocytes may be specific for a given antigen previously characterized (alone or loaded on allogeneic tumor lines or on dendritic cell-type antigen presenting cells).
  • This second example describes a method of stimulation, in a closed compartmentalized system, of PBL (peripheral blood lymphocytes) originating from a patient suffering from melanoma and previously stimulated by a tumor-specific antigen of melanoma.
  • PBL peripheral blood lymphocytes
  • This method comprises a first step of specific stimulation of the PBLs with a specific antigen of melanoma.
  • PBLs are obtained from a blood sample of a patient with melanoma.
  • the lymphocytes are extracted from the peripheral blood by Ficoll gradient cell separation (density gradient centrifugation method).
  • the cell suspension thus obtained is enriched in mononucleated cells of monocyte and lymphocyte types.
  • the mononuclear cells, and more specifically the T cells are initially stimulated by a peptide antigen specific for melanoma.
  • This specific antigen can be used alone or previously loaded on an allogeneic tumor line so as to amplify the stimulation signal.
  • This pre-stimulation phase is generally performed in a 96-well plate (Falcon) but can also be carried out in a secure culture bag.
  • This pre-stimulation phase takes place in 1, 2 or 3 successive stimulations in RPMI medium supplemented with one or more cytokines and allogeneic safe human serum.
  • the culture time is generally 20 days in a humid atmosphere incubator, at 5% CO 2 and at a constant temperature of 37 ° C.
  • This prestimulation phase allows, by amplification, to specifically select CD8 + T lymphocytes specific for the tumor antigen up to 30 to 40% of total CD8 + T lymphocytes).
  • This step is followed by a step of polyclonal stimulation of compartmentalized T-cells.
  • the specific stimulation phase can be followed by a second stimulation phase, this time polyclonal.
  • the cells are co-cultured in the presence of allogeneic feeder cells in a closed culture system of compartmentalized pocket type (FIG. 1) (Maco-Pharma SA).
  • FOG. 1 compartmentalized pocket type
  • This additional stimulation step will make it possible to amplify the CD8 + T lymphocytes of interest.
  • the methodology applied to this stimulation phase is exactly the same as that described in Example 1 described above.
  • This stimulation step may be followed by an optional amplification step.
  • an amplification step can then be applied if a more important cells of interest is desired.
  • the methodology applied to this amplification phase is exactly the same as that described in Example 1 described above.

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Abstract

L'invention conceme un procède de culture in vitro de lymphocytes T, en particulier de lymphocytes T infiltrant les tumeurs dits TIL, modifies ou non, a partir de prélèvement tumoral ou de sang issu de patient atteint de tumeur, ledit procède comprenant successivement au moins une étape d'emergence des lymphocytes T contenus dans Ia tumeur ou Ie sang prélevé, une étape de stimulation des lymphocytes T issus de I'etape d'emergence et une étape d'amplification des lymphocytes T stimules. Ce procède est caractérise en ce qu'on procède a Ia stimulation des lymphocytes T dans un récipient de culture clos compartimente.

Description

Procédé de culture in vitro de lymphocytes T. en particulier de lymphocytes T infiltrant les tumeurs dits TIL
La présente invention concerne un procédé de culture in vitro de lymphocytes T, en particulier de lymphocytes T infiltrant les tumeurs dits TIL, ou TILs, ainsi qu'un récipient destiné à la culture de tels lymphocytes T et une composition pharmaceutique anti-tumorale comprenant de tels lymphocytes T.
Face à l'inefficacité relative de la chimiothérapie pour le traitement de certains cancers ou tumeurs, de nouveaux traitements par immunothérapie cellulaire adoptive sont apparus. L'immunothérapie cellulaire adoptive apparaît aujourd'hui comme une alternative thérapeutique. Elle consiste à injecter à des patients atteints de cancer des lymphocytes T autologues préalablement amplifiés in vitro en vue d'accroître la fréquence des lymphocytes T à activité anti-tumorale spécifique.
L'un des précurseurs dans ce domaine fut l'équipe de Rosenberg, dont les travaux sont relatés dans la publication "Topalian SL, Muul LM, Solomon D, Rosenberg SA. Expansion of human tumor infiltrating lymphocytes for use in immunotherapy trials. Journal of immunological methods. 1987:102: 127-141 ".
Le procédé de culture décrit dans cette publication comprend une première étape de traitement de prélèvements tumoraux (enzymatique, filtration, séparation cellulaire) en vue d'en extraire les lymphocytes T potentiellement spécifiques de la tumeur. Ces lymphocytes T subissent ensuite une étape de stimulation en milieu de culture type RPMI supplémenté notamment en interleukine 2 recombinante et en surnageant de culture de cellules LAK de donneurs sains, cette étape de stimulation étant elle-même suivie d'une étape d'amplification.
L'étape de stimulation s'opère le plus généralement en plaques 24 puits même si l'utilisation de poches de culture est suggérée. Ce procédé est critiqué du fait de la grande quantité de milieu de culture nécessaire pour produire 2.1011 cellules (plus de 200 L). En outre, il nécessite l'utilisation d'une dose d'interleukine 2 très élevée dont le caractère toxique à de telles concentrations pour le receveur a été démontré. Enfin, la préparation des prélèvements tumoraux est laborieuse et implique l'utilisation de réactifs incompatibles pour une application clinique.
La demande de brevet EP-0.690.125 décrit quant à elle un procédé de préparation de lymphocytes T à activité tueuse cytotoxique anti-tumorale. Le procédé consiste en la co-culture de lymphocytes issus du sang périphérique de patients atteints de tumeur et d'un tissu tumoral brut vivant ou fixé obtenu à partir du même sujet. Cette étape de co-culture s'opère en plaques de culture et met en œuvre un milieu de culture complexe supplémenté de plusieurs cytokines. L'étape de stimulation des lymphocytes T utilise un système de co- culture autologue laissant présager un rendement de production final plus faible que celui obtenu dans le cas d'un système de stimulation allogénique. Par ailleurs, l'utilisation d'un système de culture ouvert (boîte de culture) n'est pas compatible avec un usage clinique. En effet, dans un cadre médical, les récipients de culture doivent présenter des garanties en matière de confinement des cellules, de prévention des risques de contamination et des erreurs techniques de manipulation. Lesdits récipients se doivent donc de respecter les règles strictes de bonnes pratiques des produits transfusables pour le conditionnement clos et le transfert des cellules.
Un autre procédé de culture en système ouvert est décrit dans l'article Pandolfino MC, Labarrière N, Tessier MH, Cassidanius A, Bercegeay S, Lemarre P, Dehaut F, Dreno B, Jotereau F. High scale expansion of melanoma-reactive TIL by a polyclonal stimulus : predictability and relation with disease advancement. Cancer Immunol. Immunother. 2001 ; 50 (3):134-40.
Le procédé de culture de lymphocytes T décrit dans cette publication comprend une étape d'émergence des lymphocytes T à partir de fragments tumoraux vivants qui s'opère en plaques 12 puits, une étape de stimulation des lymphocytes T qui s'opère en plaques 96 puits et une étape d'amplification en plateaux de culture. L'ensemble du procédé utilise du milieu de culture supplémenté en sérum allogénique humain posant le problème de la sécurité virale du produit fini. D'autre part, le dit procédé est mis en œuvre dans un système ouvert incompatible avec un usage clinique.
On connaît également, à travers la demande internationale WO 90/14097 un procédé de culture comprenant une étape de culture primaire (en plaque multi puits Costar ou dans un contenant plastique de type poche Surlyn) d'un échantillon tumoral humain à partir duquel les TIL vont être amplifiés et maintenus en culture pendant une certaine période (rajout de milieu (AIM V ou RPMI additionné d'rll_2) régulier mais sans retrait). Au bout de cette période, une quantité définie (75 %) de TIL présents dans cette culture primaire est transférée dans un récipient de culture adapté à l'amplification cellulaire (de préférence une poche perméable au gaz de type SteriCell, présentant une surface de culture plus importante, et une possibilité de formation d'agrégats cellulaires moindre). Le reste des TILs (25%) est maintenue en culture primaire en contenant Surlyn. Les TILs en poche SteriCell sont entretenus par addition régulière de milieu neuf (AIM V + rll_2 décrit dans le protocole de Rosenberg) et les cultures sont dédoublées dans de nouvelles poches à chaque fois que le milieu de culture change de couleur (variation de pH du milieu) ou que la concentration cellulaire dépasse le million/ ml. Périodiquement, la culture des TILs en poche est additionnée de cellules provenant de la culture primaire et / ou de surnageant de culture issu de la culture primaire. Les TIL en poche sont ainsi stimulés par ces cellules issues de la culture primaire ou par la composition du surnageant de culture primaire.
A nouveau, la culture s'opère dans un contexte autologue puisque les TILs sont stimulés par les cellules issues de la masse tumorale dont ils sont eux-mêmes originaires. Il en résulte une activation cellulaire de rendement moindre. L'étape de stimulation pendant laquelle les TILs sont stimulés par les cellules issues de la culture primaire et par les surnageants du milieu dérivé de cette culture primaire oblige à maintenir en parallèle deux systèmes de culture correspondant l'un à l'étape de culture primaire ou d'émergence des TILs, l'autre à l'étape de stimulation. Le maintien en parallèle de deux systèmes de culture rend l'ensemble complexe et fastidieux en termes de manipulation.
En conclusion, tous les procédés décrits ci-dessus présentent des inconvénients résultant soit d'un rendement de production plus faible dû notamment au contexte autologue des conditions de culture, soit d'un procédé mis en œuvre dans un système ouvert (plaque de puits de culture, boîtes de Pétri) empêchant toute mise en œuvre d'un tel procédé dans un contexte clinique.
Un but de la présente invention est donc de proposer un procédé de culture in vitro de lymphocytes T dont la spécificité des étapes mises en œuvre permet une culture en système clos respectant les bonnes pratiques, notamment en termes de confinement et de risque de contamination sans nuire ni au rendement de cellules produites, ni à la qualité des cellules produites, le nombre de lymphocytes spécifiques de la tumeur, en particulier de lymphocytes T CD8+ et leur activité cytotoxique vis-à-vis de la lignée tumorale autologue étant supérieurs à tous les résultats observés jusqu'à présent.
A cet effet, l'invention a pour objet un procédé de culture in vitro de lymphocytes T, en particulier de lymphocytes T infiltrant les tumeurs dits TIL, modifiés ou non, à partir de prélèvement tumoral ou de sang issu de patient atteint de tumeur, ledit procédé comprenant successivement au moins une étape « d'émergence » des lymphocytes T contenus dans la tumeur ou le sang prélevé, une étape de stimulation des lymphocytes T issus de l'étape d'émergence et une étape d'amplification des lymphocytes T stimulés, caractérisé en ce qu'on procède à la stimulation des lymphocytes T dans un récipient de culture clos compartimenté.
II est à noter que dans tout ce qui précède et dans tout ce qui suit, on entend par récipient de culture clos un système permettant d'entretenir des cellules en culture dans un milieu adapté sans que celles-ci ne soient directement au contact avec l'environnement extérieur. Ainsi, le récipient est clos, c'est-à-dire que son volume intérieur n'est pas en contact avec l'air ambiant, notamment lors de la phase de culture, lorsque les cellules et le milieu de culture sont introduits dans le récipient.
La mise en œuvre de l'étape de stimulation dans un récipient de culture clos compartimenté permet une augmentation quantitative significative du rendement global des TILs (jusqu'à 2,5 fois) par comparaison avec la même technique mise en œuvre dans un système ouvert ou non compartimenté. Elle permet également une augmentation qualitative des TILs produits. En effet, parmi les TIL produits, la proportion de TIL CD8+ est supérieure à celle produite (85% versus 60%) en condition classique et présente une activité cytotoxique spécifique vis à vis de la lignée tumorale autologue plus importante (14% versus 2%). Elle permet, grâce à l'utilisation d'un système de culture clos, la sécurisation du procédé permettant une utilisation plus appropriée dans un contexte clinique, un gain de temps lors des manipulations et par conséquent un coût de main d'œuvre moindre puisque l'utilisation d'un récipient de culture clos de type poche permet de cultiver, dans au maximum 4 poches, l'équivalent de 60 plaques de culture 96 puits.
II doit être noté que les améliorations mentionnées ci-dessus ne sont observées que dans un récipient clos compartimenté et non dans un récipient clos non compartimenté. En effet, des essais ont montré qu'en récipient clos non compartimenté, les rendements de production sont jusqu'à deux fois et demi inférieurs aux rendements de production obtenus en plaques 96 puits, ce qui ne constituait pas une incitation à retenir un système clos.
Selon une mise en œuvre préférée du procédé, on stimule les lymphocytes T en présence au moins de cellules nourricières allogéniques non proliférantes. Ces cellules nourricières allogéniques, c'est-à-dire provenant de la même espèce, mais d'un individu génétiquement différent, sont rendues non proliférantes par exemple par irradiation. On stimule les lymphocytes T par co- culture avec un mélange formé de cellules mononucléées issues de sang de donneur humain sain et de cellules B EBV transformées de type LAZ. La mise en œuvre de l'étape de stimulation des lymphocytes T dans un récipient clos compartimenté par co-culture avec des cellules allogéniques explique probablement les avantages de rendement et de spécificité obtenus. En effet, la présence d'un compartiment dans le récipient de culture combiné à l'utilisation de cellules nourricières, de préférence allogéniques, afin d'augmenter la diversité antigénique, permet de favoriser un contact étroit entre les TILs et les cellules nourricières tout en permettant les changements de milieu sans induire de turbulences au niveau du tapis cellulaire.
Dans un mode de mise en œuvre préféré du procédé, on co-cultive les cellules nourricières allogéniques non proliférantes et les lymphocytes T dans un milieu de culture sélectif sans sérum de type X-VIVO 15™ supplémenté en interleukine 2. Le milieu de culture X-VIVO 15™ est un milieu de culture sans sérum commercialisé par Cambrex Corp., Walkersville, Md., USA et optimisé pour la culture des TIL. L'interleukine 2 joue un rôle important comme facteur de croissance et d'activation des lymphocytes. En outre, au cours de l'étape de stimulation, on introduit dans le récipient de stimulation clos, parallèlement aux lymphocytes, un agent mitotique tel que la PHA L (phytohémaglutinine de type L) favorable à l'amplification des lymphocytes.
Généralement, le récipient clos de stimulation comportant au moins deux compartiments, dits l'un chambre technique, l'autre chambre de tranquillisation, communiquant entre eux, et au moins une voie d'accès débouchant dans l'un des compartiments, on introduit les lymphocytes et les cellules nourricières allogéniques non proliférantes en suspension dans un milieu de culture par l'intermédiaire de ladite voie d'accès, et on renouvelle le milieu de culture par l'intermédiaire de la ou d'une autre voie d'accès.
De préférence, le récipient clos comportant au moins deux voies d'accès débouchant dans la chambre technique, on introduit les lymphocytes et les cellules nourricières allogéniques non proliférantes en suspension dans un milieu de culture par l'intermédiaire d'une première voie d'accès qui est positionnée la plus proche de la chambre de tranquillisation, et on renouvelle le milieu de culture par l'intermédiaire d'une seconde voie d'accès qui est positionnée la plus éloignée de ladite chambre de tranquillisation.
Lors de l'étape de stimulation, on dispose le récipient clos de stimulation avec la chambre technique s'étendant au-dessus de la chambre de tranquillisation. Du fait de cette disposition, il en résulte à nouveau une amélioration du contact cellules nourricières - lymphocytes T apte à accroître le rendement en lymphocytes T cytotoxiques spécifiques.
De préférence, préalablement à l'étape de stimulation, on met en oeuvre l'étape d'émergence des lymphocytes T, en particulier de culture primaire du ou des prélèvements tumoraux, dans un récipient de culture clos. De même, postérieurement à l'étape de stimulation, de préférence, on transfère, après stimulation, les lymphocytes T stimulés dans un récipient de culture clos d'amplification. Ainsi, on met en oeuvre les étapes d'émergence, de stimulation et d'amplification dans un récipient de culture clos différent d'une étape à une autre.
L'invention a encore pour objet une composition pharmaceutique anti-tumorale, caractérisée en ce qu'elle comprend comme agent actif des lymphocytes T obtenus par le procédé du type précité. Cette composition est un produit de thérapie cellulaire composé d'une suspension cellulaire hétérogène de lymphocytes T dont la proportion de lymphocytes T CD8+ cytotoxiques spécifiques de la tumeur autologue est supérieure à celle obtenue par les techniques de préparation conventionnelle décrites jusqu'à présent.
L'invention a encore pour objet un récipient de culture pour la mise en œuvre de l'étape de stimulation du procédé de culture in vitro de lymphocytes T du type précité, caractérisé en ce que le récipient de culture est un récipient clos compartimenté qui comprend : - une première et une deuxième feuilles en matériau thermoplastique souple solidarisées l'une à l'autre au voisinage de leur périphérie de sorte à former un volume intérieur ;
- au moins une voie d'accès audit volume qui est agencée pour permettre l'introduction des cellules ;
- un cordon de soudure entre les feuilles qui est agencé pour former, dans le volume intérieur, deux compartiments communiquant entre eux et avec la ou au moins une voie d'accès, ledit cordon de soudure étant discontinu et étant associé de façon étanche à un bord du récipient.
De préférence, la ou au moins une voie d'accès est prévue sur le bord du récipient qui est opposé au bord auquel le cordon de soudure est associé.
L'invention sera bien comprise à la lecture de la description suivante d'exemples de réalisation, en référence aux dessins annexés dans lesquels :
la figure 1 représente de façon schématique une vue de face du récipient de culture clos compartimenté de l'étape de stimulation et
la figure 2 représente de façon schématique une coupe transversale suivant A-A du récipient de la figure 1.
Comme mentionné ci-dessus, le procédé de culture, objet de l'invention, comprend au moins trois étapes successives, à savoir : - une étape d'émergence des lymphocytes T contenus dans la tumeur ou le sang prélevé,
- une étape de stimulation des lymphocytes T issus de l'étape d'émergence
- et une étape d'amplification des lymphocytes T stimulés.
II est possible de mettre en oeuvre les étapes d'émergence, de stimulation et d'amplification dans un récipient de culture clos différent d'une étape à une autre. Dans ce cas, le transfert d'un récipient clos à un autre est réalisé de façon stérile, par exemple en connectant, à l'aide d'un appareil de connexion stérile de type SCD® de Terumo, les tubulures servant de voies d'accès.
En variante, les récipients clos d'émergence, de stimulation et d'amplification sont préconnectés entre eux au moment de la fabrication, de sorte à former un système clos.
Un tel système permet de réaliser la culture complète des lymphocytes T en système clos, limitant ainsi le risque de contamination.
De manière caractéristique à l'invention, ce procédé se caractérise par l'étape de stimulation mise en œuvre dans un récipient 1 de culture clos compartimenté.
Ce récipient 1 comprend généralement :
- une première et une deuxième feuilles en matériau thermoplastique souple solidarisées l'une à l'autre au voisinage de leur périphérie de sorte à former un volume intérieur ; - au moins une voie d'accès 4 audit volume qui est agencée pour permettre l'introduction des cellules ;
- un cordon 6 de soudure entre les feuilles qui est agencé pour former, dans le volume intérieur, deux compartiments 2, 3 communiquant entre eux et avec la ou au moins une voie 4 d'accès, ledit cordon 6 de soudure étant discontinu et étant associé de façon étanche à un bord du récipient 1. La liaison étanche entre cordon 6 de soudure et bord du récipient 1 est représentée en 7 à la figure 1.
La ou au moins une voie 4 d'accès est prévue sur le bord du récipient 1 qui est opposé au bord auquel le cordon 6 de soudure est associé. Dans l'exemple représenté aux figures, le récipient 1 comprend deux voies 4, 5 d'accès au volume intérieur respectivement pour l'introduction et la récupération des cellules. Les deux voies 4, 5 d'accès débouchent dans le même compartiment 2, les compartiments 2, 3 étant formés respectivement entre un bord dudit récipient 1 et le cordon 6 de soudure, le cordon de soudure s'étendant parallèlement aux bords longitudinaux dudit récipient 1. Ce cordon de soudure est formé d'une succession de points de soudure qui sont régulièrement espacés. Ces points de soudure ont une longueur comprise entre 1 mm et 5 mm tandis que les espacements présentent une longueur comprise entre 1 mm et 1 cm. Le cordon 6 de soudure présente à son extrémité opposée à celle s'étendant au voisinage des voies 4, 5 d'accès une liaison 7 étanche audit récipient 1. Les deux voies 4, 5 d'accès débouchent ici dans un premier compartiment 2 appelé chambre technique 2, cette chambre technique 2 s'étendant au-dessus du second compartiment 3 appelé la chambre de tranquillisation 3. Chaque voie d'accès 4,5 est par exemple formée d'une portion de tubulure, soudée entre les deux feuilles 2,3 formant le récipient. Dans une variante non représentée, la tubulure s'étend dans le volume intérieur du récipient. Cette tubulure peut être munie d'un clamp pour contrôler l'écoulement de fluide au travers de la tubulure. L'extrémité de la tubulure est par exemple munie d'un connecteur de type Luer femelle, fermé par un bouchon amovible. Ce connecteur permet de venir connecter une seringue remplie de cellules ou un container de milieu de culture. On introduit donc les lymphocytes et les cellules nourricières allogéniques non proliférantes en suspension dans un milieu de culture par l'intermédiaire de la première voie 4 d'accès qui est positionnée la plus proche de la chambre de tranquillisation 3 et on renouvelle le milieu de culture par l'intermédiaire de la seconde voie d'accès 5 qui est positionnée la plus éloignée de ladite chambre de tranquillisation 3. L'introduction des cellules par la voie d'accès 4 la plus proche de la chambre de tranquillisation 3 permet de limiter le parcours des cellules dans le récipient 1 , et donc de limiter leur stress. L'utilisation de deux voies d'accès 4,5 différentes pour l'introduction des cellules et le renouvellement du milieu limite les risques de contamination lors de la manipulation du récipient. La présence de cette chambre de tranquillisation 3 favorise un contact étroit entre TILs et cellules nourricières tout en permettant les changements de milieu sans induire de turbulences au niveau du tapis cellulaire. La chambre technique 2 est en effet utilisée pour introduire et/ou retirer du milieu de culture dans le volume intérieur du récipient 1 , sans perturber les cellules placées dans la chambre de tranquillisation 3. En effet, le cordon de soudure 6 ralentit et dévie un écoulement de fluide arrivant sur lui, de sorte que les cellules ne sont pas en contact direct avec le flux du milieu nouvellement introduit, limitant ainsi le déplacement ou la remise en suspension des cellules. Lors de la phase de culture des cellules, le récipient 1 est positionné de sorte à disposer la chambre technique 2 au dessus de la chambre de tranquillisation 3. Dans cette position, les cellules sédimentent dans le fond de la chambre de tranquillisation 3 qui présente une forme en V favorisant la concentration et la communication des cellules en culture.
Comme illustré sur les figures, le cordon de soudure 6 est discontinu, c'est-à- dire qu'il présente une pluralité d'interruptions, notamment plus de trois. Ces interruptions permettent un échange fluidique limité entre la chambre de tranquillisation 3 et la chambre technique 2. Le cordon de soudure 6 est associé de façon étanche à un bord 7 du récipient, de sorte que la chambre technique 2 et la chambre de tranquillisation 3 ne communiquent pas entre elles à ce niveau. Ainsi, les cellules placées dans la chambre de tranquillisation 3 ne peuvent pas être transférées dans la chambre technique 2, à ce niveau. Notamment, lors de l'introduction des cellules, par exemple du côté opposée à cette zone, les cellules restent dans la chambre de tranquillisation 3. La chambre de tranquillisation 3 fournit un espace confiné dans lequel les cellules sont tranquilles, c'est-à-dire peu ou pas déplacées après leur introduction dans le récipient 1.
Deux exemples de mise en œuvre d'un procédé de culture vont à présent être décrits, chacun étant, pour son étape de stimulation mis en œuvre dans un récipient conforme à celui décrit ci-dessus.
L'exemple I concerne la stimulation, en système clos compartimenté, de TIL issus de culture primaire de fragments tumoraux d'un patient identifié BOSE et atteint de mélanome. II doit être noté que les lymphocytes T infiltrant les tumeurs ou TIL sont des cellules immunes isolées à partir d'une tumeur ou de sang issu de patient atteint de tumeur. Réinjectés après stimulation et amplification, ils ont un pouvoir antitumoral, spécifique de la tumeur de laquelle ils sont issus.
Dans le cadre de la thérapie génique, ces lymphocytes T peuvent être modifiés par incorporation de gène tel qu'un gène de récepteurs chimères, augmentant leur pouvoir antitumoral.
Le procédé comprend une étape d'émergence ou d'extraction des TIL à partir de fragments tumoraux. Les TILs sont obtenus à l'issue de la culture primaire de fragments tumoraux de patient atteint de mélanome (patient BOSE) et ayant subi un curage ganglionnaire axillaire. Les fragments tumoraux sont obtenus par fragmentation mécanique d'un des ganglions de la chaîne ganglionnaire prélevée et présentant un processus tumoral malin, puis congelés. Les fragments tumoraux sont ensuite décongelés puis cultivés en plaques 12 puits (Nunc) en milieu X-VIVO 15™ (Cambrex) supplémenté en rlL2 à 300 Ul final/ ml (Chiron). La culture primaire de fragments est entretenue deux fois par semaine (retrait de milieu et rajout de milieu neuf). A l'issue de 11 jours de culture en incubateur à atmosphère humide, à 5% de CO2 et à température constante de 37°C, les TILs en sortie des fragments tumoraux sont récoltés et congelés en cryotubes en DMSO10% (Braun) /AH4% (LFB). L'étude décrite ci dessous a été réalisée à partir d'une banque de TIL congelés issu d'un même patient BOSE.
L'étape d'émergence est suivie d'une étape de stimulation polyclonale des TIL en poche compartimentée. Les TIL issus de la banque TIL congelés sont décongelés puis mis en culture (JO) dans un système de culture clos, de type poche compartimentée (figure 1) (Maco-Pharma SA). Cette étape de stimulation va permettre la stimulation polyclonale des TILs ainsi que leur prolifération. La phase d'ensemencement des TILs dans cette poche spécifique de culture se déroule en 2 étapes : *> Dans un premier temps, les TILs sont co-ensemencés en présence de cellules nourricières de source allogéniques (afin d'augmenter la diversité antigénique) préalablement irradiées donc non proliférantes. Les cellules nourricières sont composées d'un pool de cellules mononucléées issues de 3 donneurs sains et d'une lignée de lymphocytes B transformés par I1EBV (Virus Epstein-Barr) de type LAZ. L'ensemble TIL et cellules nourricières est introduit dans la poche 1 , et plus particulièrement dans la chambre dite de tranquillisation, par la voie d'accès 4 proche de cette chambre (figure 1) aux ratios suivants : 0,39 x
106 TIL, 26 x 106 LAZ et 52 x 106 CMN en suspension sous 10 ml de milieu X-VIVO 15™ seul (soit 1 TIL pour 66 LAZ et 133 CMN).
•> Dans un second temps, le volume de suspension cellulaire TIL-cellules nourricières préalablement déposé dans la chambre dite de
« tranquillisation » est complété par un volume de 185 ml de milieu cette fois complet (X-VIVO 15™ supplémenté en rlL2 à 150 Ul final / ml et de l'agent mitogène PHA-L (Sigma) à raison de 1 μg/ml). Ce volume additionnel est introduit dans la poche par la voie d'accès 5 située au niveau de la chambre 2 dite « technique ».
Durant toute la phase d'ensemencement, la poche 1 est maintenue en position verticale (dans sa partie la plus large, figure 1) afin de faciliter le dépôt des cellules au fond de la chambre 3 de tranquillisation et de favoriser le contact étroit entre les cellules, condition impérative à un rendement de stimulation optimal.
Les TIL sont maintenus en culture dans cette poche 1 , toujours en position verticale, pendant une période de 10 jours. La culture est entretenue deux fois par semaine par retrait de 1/3 du milieu (par retrait du milieu au niveau de la voie d'accès 5 et rajout d'1/3 de milieu neuf (X-VIVO 15™ additionné de 150 Ul / ml final)) par cette même voie. Les transferts de milieu par cette voie évitent d'induire des turbulences au niveau de la chambre 3 de tranquillisation pouvant perturber le contact cellulaire TIL-cellules nourricières très important durant cette phase de stimulation.
L'étape de stimulation est suivie d'une étape d'amplification. A l'issue des 13 jours de culture (J13), les TIL en culture dans la chambre 3 de tranquillisation sont mis en suspension par massages répétés de la poche compartimentée. La suspension cellulaire de TIL est ensuite transférée via la voie d'accès 5 dans une poche adaptée dite de transfert (Baxter) pour être concentrée par centrifugation. Le culot cellulaire est ensuite remis en suspension dans du milieu X-VIVO 15M supplémenté en rll_2 (150 Ul final /ml) à raison de 1 x 106 / ml. La suspension cellulaire ainsi obtenue est ensuite transférée de la poche de transfert vers une ou plusieurs poches de culture classiques adaptées à l'amplification cellulaire (poche de culture de type Lifecell perméable au gaz, Miltenyi Biotec) pendant une période supplémentaire de 7 jours (J20). Les cultures sont entretenues tous les 3 jours et la concentration cellulaire est ramenée à 1 x 106 Cellules / ml par ajout de milieu neuf.
Afin d'évaluer les paramètres de production des TIL utilisant le procédé de la présente invention, désigné ci-après « Invention » et en particulier, utilisant la stimulation des TIL en système clos en poche de culture compartimentée, les résultats ont été comparés à ceux obtenus dans les conditions classiques de culture telles qu'elles sont actuellement utilisées dans le cadre du protocole de recherche clinique multicentrique intitulé « TIL (Tυmor Infiltrating Lymphocytes) et Interleukine 2 versus abstention en traitement adjuvant des mélanomes avec un seul ganglion envahi après curage ganglionnaire. Etude de phase III, randomisée, ouverte, multicentrique». Cette technique que l'on appellera « Contrôle » s'inspire de la méthode de production décrite dans l'article référencé « High-scale expansion of melanoma-reactive TIL by a polyclonal stimulus: predictability and relation with disease advancement. Cancer Immunol Immunother. 2001 May;50(3): 134-40 ». Dans cette technique conventionnelle, les étapes « extraction des TIL » et « phase d'amplification » sont identiques à celles décrites dans la technique « test » à l'exception de l'étape de stimulation polyclonale des TIL, qui se déroule en système ouvert de type plaques de culture 96 puits (Falcon). Au cours de cette étape de stimulation en plaques, les ratios TIL-cellules nourricières, le milieu de culture, les réactifs et les fréquences d'entretien sont exactement les mêmes que la technique « test ». Le volume de suspension cellulaire ensemencé à JO et en cours de culture jusqu'à J10 est toujours maintenu à 150 μl /puits au maximum. Au total 13 plaques de culture sont ensemencées à JO ce qui représente un total de 0,39 x 106 TIL soit l'équivalent de la quantité de TIL ensemencée en poche de culture compartimentée.
Les paramètres de production des TIL utilisant les 2 techniques comparatives sont les suivants :
• Rendement en cellules viables et facteur d'amplification par rapport à JO obtenus par numération manuelle (sur cellule de Malassez) des cellules aux points J 13, J 17 et J20. • Phénotype à J13 et J20 des sous-populations de lymphocytes T (T cytotoxiques CD8+ et T helper CD4+) par immunomarquage et analyse par cytométrie en flux.
• Spécificité des T CD8+ par évaluation de la proportion (sur les TIL totaux) à J20 de T CD8+ produisant de NNFγ en réponse à la lignée tumorale autologue (par immunomarquage anti-CD8 et anti-INFγ puis analyse par cytométrie de flux).
Les résultats représentés dans les tableaux 1 à 5 ci-dessous indiquent la moyenne des valeurs obtenues sur 4 essais indépendants.
Tableau 1
Nombre de TIL totaux viables
Figure imgf000016_0001
Figure imgf000017_0001
Tableau 2
Facteur d'amplification (par rapport à JO)
Figure imgf000017_0002
Tableau 3
Viabilité cellulaire des TIL totaux produits
Figure imgf000017_0003
Tableau 4
Nombre de TIL CD8+ viables
Figure imgf000017_0004
Figure imgf000018_0001
Tableau 5 :
Nombre de TIL CD8+ spécifiques (*106) delà lignée tumorale autoloque
Figure imgf000018_0002
L'utilisation du procédé de stimulation polyclonale des TILs décrit dans la présente invention et illustrée par l'exemple décrit ci dessus, fait apparaître plusieurs avantages d'ordre technique mais également quantitatifs et qualitatifs par comparaison à la méthode classique de stimulation utilisée en plaques mais également par rapport à la méthode de production décrite par d'autres auteurs (confer demande internationale WO 90/14097, Pandolfino et coll, 2001 ) :
Les avantages techniques sont les suivants : • Gain de temps considérable à valeur économique sur le coût de production globale puisqu'il faut en moyenne 2h30 pour l'entretien de 60 plaques de culture alors que moins d'une heure est nécessaire pour l'entretien en poche de l'équivalent du même nombre de plaques.
• Facilité de production (manipulation en poche de culture plus simple qu'en plaques de culture)
• La phase de stimulation cellulaire ne nécessite pas de maintenir en parallèle une culture primaire d'échantillon tumoral (contenant TIL + cellules tumorales autologues) comme source de stimulation et d'éléments nutritifs pour l'expansion ultérieure des TILs. Il s'agit ici de la culture d'une seule population cellulaire, les TILs, en co-culture avec des cellules nourricières allogéniques non proliférantes. Cette méthode est d'autant plus efficace, puisqu'elle permet de stimuler de manière polyclonale les TIL, la diversité de stimulation antigénique étant apportée par la co-culture des TIL avec les cellules allogéniques.
• La consommation de milieu (X-VIVO 15™ supplémenté en rlL2) dans les
2 méthodes est équivalente (soit 8 litres au total) donc économiquement viable par rapport à la méthode de culture en plaques décrite précédemment et nécessitant 1 ,5 fois plus de milieu pour produire une quantité de TIL équivalente.
• Les concentrations d'IL2, seule cytokine utilisée dans la culture, sont également largement inférieures puisqu'elles varient de 300UI/ml (phase de culture primaire des fragments tumoraux) à 150UI/ml (phases de stimulation et d'amplification) contre 1000 Ul/ml dans le modèle décrit précédemment (confer demande internationale WO 90/14097) pour un rendement de prolifération 2 fois moindre. Ces résultats ont non seulement un intérêt économique certain mais plaident également en faveur d'une toxicité cellulaire moindre liée à l'utilisation de concentrations trop élevées de cette cytokine.
Les avantages en termes de rendement cellulaire en référence aux tableaux 1 et 2 sont les suivants :
Le rendement cellulaire en TILs totaux est 1.5 fois supérieur à celui obtenu par la méthode classique de stimulation en plaques. En effet le facteur d'amplification est de l'ordre de 2810 pour les TILs cultivés dans les conditions utilisant le procédé de stimulation de la présente invention contre 1806 pour le procédé conventionnel en plaques. Par ailleurs, le facteur d'amplification cellulaire des TILs observé par la présente invention correspond à plus du double de celui observé dans la méthode décrite dans la demande internationale WO 90/14097 (d'une valeur de 1229). Il est donc possible par cette méthode de produire 2 fois plus de TILs pour une durée de culture identique.
Enfin, les avantages thérapeutiques sont les suivants : Les TILs produits par le procédé de l'invention peuvent ensuite être conditionnés dans une solution saline contenant 4% de sérum albumine humaine de type Vialebex® 40 mg/ml (LFB) en vue d'une utilisation thérapeutique en tant que composition anti-tumorale.
En effet plusieurs paramètres sont indicateurs d'une utilisation dans un contexte thérapeutique.
• La viabilité cellulaire est à J20 supérieure de 10% à celle observée dans la méthode « contrôle » démontrant une parfaite tolérance des TILs au procédé de stimulation de l'invention. Un produit de thérapie cellulaire de bonne viabilité cellulaire permet d'éviter les risques d'intolérance au produit liée à une trop forte concentration de cellules mortes et de débris cellulaires.
• L'analyse des résultats indiqués en tableaux 3 et 5 démontre clairement que la méthode de stimulation en poche favorise, non seulement la prolifération des CD8+ totaux Qusqu'à 2,3 plus de TIL CD8+ totaux produits), mais également, la sélection dans cette population, de TIL
CD8+ spécifiques de la lignée tumorale autologue (taux de CD8+ spécifiques jusqu'à 26 fois supérieur à celui obtenu par la méthode classique de stimulation en plaques). Pour une dose thérapeutique de CD8+ spécifiques donnée, la quantité de TIL totaux à produire sera donc inférieure à celle qu'il faudra produire en condition classique en plaques ce qui représente une économie non seulement en termes de coût mais également en terme de temps de production.
• Optimisation du temps de production (mise à disposition d'un traitement anti-tumoral efficace (TIL spécifiques) plus rapide. • Production sécurisée (système entièrement clos) en faveur de la sécurité biologique du patient. En conclusion, dans le cadre de cet exemple 1 , ce procédé de stimulation en poche compartimentée permet la préparation rapide d'une composition anti-tumorale efficace et de qualité (à taux de TIL CD8+ spécifique élevé), sécurisée et économique.
II doit être noté que des résultats comparables auraient pu être obtenus par comparaison d'un procédé mettant en œuvre une stimulation en récipient clos compartimenté et d'un procédé mettant en œuvre une stimulation en récipient clos non compartimenté. On constate de manière surprenante que les résultats obtenus avec une stimulation en récipient clos non compartimenté sont inférieurs aux résultats obtenus avec une stimulation en plaques 96 puits, c'est pourquoi il a été décidé d'illustrer l'invention par comparaison avec la méthode en plaques 96 puits.
L'utilisation de ce procédé peut également être élargie à d'autres préparations de composition anti-tumorale impliquant des lymphocytes CD8+ spécifiques. Ces lymphocytes T CD8+ pouvant être spécifiques d'un antigène donné préalablement caractérisé (seul ou chargé sur des lignées tumorales allogéniques ou sur des cellules présentatrices d'antigène de type cellules dendritiques).
Le deuxième exemple ci-dessous décrit la méthodologie appliquée à cette nouvelle approche.
Ce deuxième exemple décrit un procédé de stimulation, en système clos compartimenté, de PBL (lymphocytes du sang périphérique) issus de patient atteint de Mélanome et préalablement stimulés par un antigène tumoral spécifique du mélanome.
Ce procédé comporte une première étape de stimulation spécifique des PBL par un antigène spécifique du mélanome. Les PBL sont obtenus à partir d'un prélèvement sanguin de patient atteint de mélanome. Les lymphocytes sont extraits du sang périphérique par séparation cellulaire sur gradient de Ficoll (méthode de centrifugation sur gradient de densité). La suspension cellulaire ainsi obtenue est enrichie en cellules mononucléées de types monocytes et lymphocytes. Les cellules mononucléées, et plus précisément les lymphocytes T sont, dans un premier temps stimulées, par un antigène peptidique spécifique du mélanome. Cet antigène spécifique peut être utilisé seul ou préalablement chargé sur une lignée tumorale allogénique de manière à amplifier le signal de stimulation. Cette phase de pré-stimulation est généralement réalisée en plaque 96 puits (Falcon) mais peut également se dérouler en poche de culture sécurisée. Cette phase de pré-stimulation se déroule en 1 , 2 ou 3 stimulations successives en milieu RPMI supplémenté d'une ou plusieurs cytokines et de sérum humain allogénique sécurisé. La durée de culture est généralement de 20 jours en incubateur à atmosphère humide, à 5% de CO2 et à température constante de 37°C. Cette phase de préstimulation permet, par amplification, de sélectionner spécifiquement les lymphocytes T CD8+ spécifiques de l'antigène tumoral Qusqu'à 30 à 40% des lymphocytes T CD8+ totaux).
Cette étape est suivie d'une étape de stimulation polyclonale des lymphocytes T en poche compartimentée. En effet, la phase de stimulation spécifique peut être suivie d'une deuxième phase de stimulation, cette fois polyclonale. Les cellules sont co-cultivées en présence de cellules nourricières allogéniques dans un système de culture clos, de type poche compartimentée (figure 1) (Maco-Pharma SA). Cette étape de stimulation supplémentaire va permettre d'amplifier les lymphocytes T CD8+ d'intérêt. La méthodologie appliquée à cette phase de stimulation reprend exactement celle décrite dans l'exemple 1 décrit précédemment.
Cette étape de stimulation peut être suivie d'une étape d'amplification facultative. A l'issue de l'étape de stimulation en poche compartimentée, une étape d'amplification peut alors être appliquée si une production plus importante des cellules d'intérêt est souhaitée. La méthodologie appliquée à cette phase d'amplification reprend exactement celle décrite dans l'exemple 1 décrit précédemment.
Les avantages techniques et thérapeutiques mis en évidence au travers de cette nouvelle approche rejoignent sensiblement ceux décrit dans l'exemple I.

Claims

REVENDICATIONS
1. Procédé de culture in vitro de lymphocytes T, en particulier de lymphocytes T infiltrant les tumeurs dits TIL, modifiés ou non, à partir de prélèvement tumoral ou de sang issu de patient atteint de tumeur, ledit procédé comprenant successivement au moins une étape d'émergence des lymphocytes T contenus dans la tumeur ou le sang prélevé, une étape de stimulation des lymphocytes T issus de l'étape d'émergence et une étape d'amplification des lymphocytes T stimulés, caractérisé en ce qu'on procède à la stimulation des lymphocytes T dans un récipient (1) de culture clos compartimenté.
2. Procédé de culture in vitro de lymphocytes T selon la revendication 1 , caractérisé en ce qu'on transfère, après stimulation, les lymphocytes T stimulés dans un récipient de culture clos d'amplification.
3. Procédé de culture in vitro de lymphocytes T selon l'une des revendications 1 et 2, caractérisé en ce qu'on stimule les lymphocytes T en présence au moins de cellules nourricières allogéniques non proliférantes.
4. Procédé de culture in vitro de lymphocytes T selon la revendication 3, caractérisé en ce qu'on stimule les lymphocytes T par co-culture avec un mélange formé de cellules mononucléées issues de sang de donneur humain sain et de lymphocytes B transformés par l'EBV de type LAZ.
5. Procédé de culture in vitro de lymphocytes T selon l'une des revendications 3 et 4, caractérisé en ce qu'on co-cultive les cellules nourricières allogéniques non proliférantes et les lymphocytes T dans un milieu de culture sélectif de type X- VIVO 15™ supplémenté en interleukine 2.
6. Procédé de culture in vitro de lymphocytes T selon l'une des revendications 3 à 5, caractérisé en ce que, au cours de l'étape de stimulation, on introduit dans le récipient de stimulation clos, parallèlement aux lymphocytes, un agent mitotique, tel que la PHA L (phytohémaglutinine de type L), apte à favoriser l'amplification des lymphocytes.
7. Procédé de culture in vitro de lymphocytes T selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que le récipient (1) clos de stimulation comportant au moins deux compartiments (2, 3), dits l'un chambre technique (2), l'autre chambre de tranquillisation (3), communiquant entre eux, et au moins une voie (4, 5) d'accès débouchant dans l'un (2) des compartiments (2, 3), on introduit les lymphocytes et les cellules nourricières allogéniques non proliférantes en suspension dans un milieu de culture par l'intermédiaire de ladite voie (4) d'accès, et en ce qu'on renouvelle le milieu de culture par l'intermédiaire de la (4) ou d'une autre voie (5) d'accès.
8. Procédé de culture in vitro de lymphocytes T selon la revendication 7, caractérisé en ce que le récipient (1) clos comportant au moins deux voies (4, 5) d'accès débouchant dans la chambre technique (2), on introduit les lymphocytes et les cellules nourricières allogéniques non proliférantes en suspension dans un milieu de culture par l'intermédiaire d'une première voie (4) d'accès qui est positionnée la plus proche de la chambre de tranquillisation (3), et en ce qu'on renouvelle le milieu de culture par l'intermédiaire d'une seconde voie d'accès (5) qui est positionnée la plus éloignée de ladite chambre de tranquillisation (3).
9. Procédé de culture in vitro de lymphocytes T selon la revendication 7 ou 8, caractérisé en ce que, lors de l'étape de stimulation, on dispose le récipient (1) clos de stimulation avec la chambre technique (2) s'étendant au-dessus de la chambre de tranquillisation (3).
10. Procédé de culture in vitro de lymphocytes T selon l'une des revendications 1 à 9, caractérisé en ce qu'on met en oeuvre l'étape d'émergence des lymphocytes T, en particulier de culture primaire du ou des prélèvements tumoraux, dans un récipient (1 ) de culture clos.
11. Procédé de culture in vitro de lymphocytes T selon l'une des revendications 1 à 10, caractérisé en ce qu'on met en oeuvre les étapes d'émergence, de stimulation et d'amplification dans un récipient de culture clos différent d'une étape à une autre.
12. Composition pharmaceutique anti-tumorale, caractérisée en ce qu'elle comprend comme agent actif des lymphocytes T obtenus par le procédé conforme à l'une des revendications 1 à 11.
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