WO2008094027A1 - Uso de la suramina para la preparación de un medicamento para inhibir la neovascularizacion retinal y corneal - Google Patents
Uso de la suramina para la preparación de un medicamento para inhibir la neovascularizacion retinal y corneal Download PDFInfo
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- Suramin suramin, suramine
- suramin suramin, suramine
- chemotherapy cytotoxic substances
- the suramin can be referred to as the acid 8 - [[4- methyl-3 - [[3 - [[3 - [[2-methyl-5 - [(4,6,8-trisulfonaphthalen-1 -
- suramin is usually used salified, under the sodium form, also called hexasodium.
- suramin can be used successfully for the treatment of retinal diseases, and particularly for the treatment of retinal angiogenesis (retinal neovascularization), a pathological process present in several retinal diseases. Moreover, it has been found that suramin is also effective in the treatment of corneal neovascularization. I Medical aspects of the invention
- Purinérgios-P2 receptors have been found activated in retinal diseases.
- the objective of the present invention has been to analyze the expression of purinergic receptors in an animal model of oxygen-induced retinopathy, and examine the effect of suramin, purinergic antagonist, on retinal angiogenesis.
- the positive immunoreactivity of P2X2 was found in the neovascular tufts and in the inner plexiform layer of animals exposed to oxygen. An increase in the density of cells labeled with antibodies against P2Y2 in the fiber layer was also found. Immunoreactivity against P2X1 and P2X3 receptors was not detected. Positive immunoreactivity to the P2X2 receptor was observed in the external plexiform layer of animals exposed and not exposed to oxygen. Suramin stopped preretinal neovascularization. The results suggest that P2 purinergic receptors are involved in oxygen-induced retinopathy. The non-specific purinergic antagonist suramin is able to stop preretinal neovascularization. Suramin or other purinergic antagonists-P2 could be pharmacological means for the treatment of preretinal neovascularization.
- the other objective of the present investigation has been to analyze the efficacy of suramin, a non-specific purinergic antagonist, in corneal angiogenesis.
- a well known method was used to induce corneal neovascularization.
- the appearance of neoformation vessels in the cornea was documented through a digital camera over a period of 35 days.
- the effect of suramin was compared with animals treated with bevacizumab (Avastin) used in colon cancer because of its antiangiogenic effect that decreases tumor growth, and with animals that did not receive treatment (control).
- Suramin or other purinergic antagonists could be pharmacological means for the treatment of corneal angiogenesis.
- Figures 1A to U illustrate immunoreactivity to the P2Y2 and P2X2 receptors in retinas of control and oxygen exposed mice, and expression of the P2X2 receptor in retinal neovases, more specifically:
- Figure 1A shows the P2Y2 control receptors in a 1OX magnification
- Figure 1B shows the P2Y2 control receptors in a 2OX magnification
- Figure 1C shows the P2Y2 receptors exposed to oxygen in a 10X magnification
- Figure 1D shows the P2Y2 receptors exposed to oxygen in a 2OX magnification
- Figure 1 E shows the P2X2 control receivers at a magnification of 10X
- Figure 1F shows the P2X2 control receptors at a magnification of 2OX
- Figure 1G shows the P2X2 receptors exposed to oxygen at a magnification of 10X
- Figure 1H shows the P2X2 receptors exposed to oxygen at a magnification of 2OX
- Figure 11 illustrates the immunohistochemistry at a 2OX magnification of the neovasive P2X2 receptors
- Figure U illustrates the immunofluorescence at a 2OX magnification of the P2X2 receptors (I).
- Figures 2A and 2B show images of the preretinal neovascularization, with the nuclei of neoformation vessels above the internal limiting membrane of the retina in animals exposed to oxygen, respectively, without suramin treatment and with suramin treatment.
- Figure 3 shows the development of corneal neovases 21 days after the injury.
- Figure 4 illustrates the evolution of the neo-vessels in each of the three animal groups, the Control (A) being treated with suramin (B), treated with bevacizumab (avastin) (C).
- P2 receptors The cell surface receptors for extracellular nucleotides are called P2 receptors. These are activated by nucleotides such as purines and / or pyrimidines. P2 receptors are divided into two large groups: P2X and P2Y. P2X receptors are involved in the control of the flow of ions in the cell in response to ATP (adenosine triphosphate).
- ATP adenosine triphosphate
- P2X receptors participate in rapid neurotransmission and are found in large quantities in tissues with excitatory function.
- the subtypes P2X1, P2X2, P2X3, etc. are described in the bibliography.
- P2Y receptors belong to the family of receptors coupled to Protein G, and several types have also been found such as P2Y1, P2Y2, etc. (Abbrachio & Burnstock 1994).
- P2 receptors are present in the gual cells and in the retina (Lazarowski E; Fries JE 2005, Wang 2002, Li Y 2001, Fries 2004). They have been activated, with greater immunoreactivity in diseases of the retina (Morigiwa et al 2000).
- INS37217 synthetic agonist of the P2Y2 receptor
- P2Y2 receptors located in the apical membrane of RPE using ATP has been shown to stimulate ion transport and fluid absorption in monolayers of fresh and isolated RPE cells of bovine tissue (Nour M 2003).
- P2Y receptors were found to have a dominant role in rabbit Muller cells, and there was a hyper-expression of these receptors in retinal cells with PVR (Francke 2002).
- PVR vitreoretinal proliferation
- Muller's cells showed an increased regulation of their response to extracellular ATP.
- the trigger enzyme Proteolytic, was injected into the vitreous developing a different type of retinopathy, which showed no signs of PVR. This retinopathy was thought to be a distinct pathognomonic entity and that could precede the development of PVR.
- Retinal pathological angiogenesis as occurs in retinopathy of prematurity (ROP), is an important cause of blindness in prematurely born children (Gallo & Lennerstrand 1991). It must be taken into account that the retina in the child ends up vascularizing in the temporal periphery around week 42 of gestational age. Therefore, a child born with 30 weeks of gestational age will have an important part of the retina still not vascularized.
- ROP retinopathy of prematurity
- ROP is a vasculopathy whose pathophysiological mechanism it begins in the zone of interface between the vascular and avascular area of the retina, with a process of cellular hyperplasia that if it progresses gives rise to the appearance of neovases that extend in the retina and in the vitreous, giving rise to the development of vitreous proliferation retinal that usually leads to retinal detachment.
- a vasculopathy whose pathophysiological mechanism it begins in the zone of interface between the vascular and avascular area of the retina, with a process of cellular hyperplasia that if it progresses gives rise to the appearance of neovases that extend in the retina and in the vitreous, giving rise to the development of vitreous proliferation retinal that usually leads to retinal detachment.
- the investigation carried out was aimed at evaluating the expression of P2 receptors in an experimental model of oxygen-induced retinopathy in mice and analyzing whether retinopathy was stopped by Suramine, a non-specific antagonist of P2 receptors.
- mice Retinal neovascularization was induced by the exposure of 7-day-old mice C57BL / 6J to 75% oxygen therapy for 5 days, returning to a room with conventional air on day 12, remaining there for 5 more days. On day 12, after returning to the room, the mice were divided into two groups.
- Retinas corresponding to 5 animals treated with suramin and seven without receiving P2 antagonists as well as seven animals not exposed to oxygen were analyzed with immunohistochemical techniques.
- the eyeball after being enucleated was fixed for 48 hours in 4% paraformaldehyde (Sigma-Aldrich, St Louis, MO). Subsequently, the eyeball was placed in immersion for cryoprotection in solutions other than glucose (5%, 10%, 15% and 20%) and then in mixed OCT glucose compounds ((Barthel and Raymond 1990). Cuts of 14 microns were obtained and fixed on the suces of polylysine treated glasses (Shandon AS325 Retraction).
- the primary antibodies used against purinergic receptors were: anti-P2X1 and anti-P2X3 (rabbit polyclonal), P2X2 (guinea pig polyclonal) (1: 1000) and P2Y2 (rabbit polyclonal, 1: 800), (Neuromics, Minneapolis, USES). After being incubated in primary antibody overnight at 4 ° C temperature, preparations were processed with biotinylated secondary antibodies followed av ⁇ dina peroxidase complex: biot ⁇ nilados (ABC Elite Vectastin, Vector Laboratories, Burlingame, CA). Finally, the reaction color was obtained using nickel solution Ia amplified 3,3' -diam ⁇ nobencidina (DAB) to dye (Sigma-Aldrich, St Louis, MO).
- DABC Elite Vectastin nickel solution Ia amplified 3,3' -diam ⁇ nobencidina (DAB) to dye (Sigma-Aldrich,
- the specimens were labeled with conjugated antibodies of anti-rabbit rhodamine and lysamine anti-rabbit Ig-G or with conjugated antibodies of anti-guinea pig Ig-G with fluorescence isothiocyanate-5 (Jackson Immunoresearch Laboratories, West Grove, PA).
- P2X2 and P2Y2 receptors were found with increased immunoreactivity in a mouse model of oxygen-induced retinopathy (Fig. 1).
- the cells had a morphology similar to astrocytes and sex cells.
- the retinas of animals exposed to oxygen showed outbreaks of intravitreal neovascularization. Positive immunoreactivity to the P2X2 receptor was observed in the wall of the retinal neovases. The location of these receptors in the neovessels was confirmed by immunofluorescence techniques (Fig 2).
- Suramin is a non-specific antagonist of the purinergic-P2 receptors. It is also known that suramin is a potent inhibitor of angiogenesis and has suppressive properties in the development of some malignant tumors, being used in some cancer treatments (Kathir et al 2006). Suramin has been found blocking VEGF receptors (Waltenberger J et al 1996).
- P2-receptors could be considered a drug therapy target to inhibit retinal neovascularization, especially in retinopathy of prematurity, the most important cause of blindness in childhood.
- the cornea located in the anterior part of the eye, is a transparent and avascular tissue. Some ocular pathologies can cause loss of their avascularity and transparency, producing decrease or loss of vision. It is estimated that in the United States, 1.5 million patients develop corneal neovascularization, some of them with loss of vision, called blind patients by cornea (Brodovsky et al 2000). The most frequent causes of corneal vessel invasion
- corneal neovascularization are: eye infections such as herpes simplex virus, sequelae of diseases such as Pemphigus and Steven Johnson Syndrome, giant Pterigion, and especially alkali burns.
- eye infections such as herpes simplex virus
- sequelae of diseases such as Pemphigus and Steven Johnson Syndrome, giant Pterigion, and especially alkali burns.
- the mentioned pathologies usually present with severe damage or destruction of the stem cells of the corneal limbus (stem cells), which would have the function of not allowing the entry of blood vessels through the corneal periphery (Dua H et al 2003).
- corneal neovascularization continues to be complex, although some advances have been made in the treatment of this pathology. Cases that could benefit from a cornea transplant have a poor prognosis due to the frequent recurrence of neovascularization in the transplanted corneal button. Experience shows that it is necessary to significantly reduce neovascularization before conventional cornea transplantation (Garg P et al 2005; Whitcher JP et al 2002). New treatments such as corneal limbo stem-cell transplantation are in an early stage of development. However, in the few cases reported it is common to find recurrence of corneal neovascularization.
- Neovascularization Score After anesthetizing the rabbit with an intramuscular injection of midazolam and Ketamine hydrochloride, perform the instillation of topical proparacaine (Anestalcon, Alcon, Argentina) in the eye and a biefarostat was placed in the right eye. For 20 seconds, 7 mm diameter Whatman filter paper discs were embedded in 1 N Na (OH) solution. The paper disc was placed with a clamp on the central part of the cornea leaving it for 2 minutes. Immediately afterwards, the injured area was washed with 15 ml of saline solution (0.9% NaCl) for one minute. The same procedure was carried out in 9 rabbits. Neovascularization Score
- the measurement of the vessels was carried out on digital images taken with the camera with the Nikon Coolpix 5700 Digital Camera (Nikon, Tokyo, Japan) at 9, 15, 21 and 35 days post-injury (Mei Zheng et al 2001).
- the first clinical examination was performed and then continued every three days. It was carried out using an operating microscope or a magnifying glass for surgeries and photos were taken with a Nikon Coolpix 5700 digital camera. The INV registration was done at 9, 15, 21 and 35 days in all animals. The average INV of each group was used to perform the comparative analysis.
- Avastin and suramin had a neovascularization inhibitory effect during the 35 days. Greater inhibition of the neovessels was obtained in the first two weeks using bevacizumab (Avastin). A lower inhibitory effect of corneal angiogenesis was observed in the first two weeks with suramin. However, its degree of inhibition neovascular remained stable from 15 days onwards (See graph in Fig 4).
- bevacizumab inhibits angiogenesis by binding to the VEGF peptide and thus prevents this molecule from interacting with its corresponding receptors (1996 - 2006 Productos Roche S.A.Q. and I, wholesome Aires,
- the dose of suramin used in our study has been indicated as non-toxic to the human organism according to previous studies (Villalona-Calero M et al 2003).
- the dose of bevacizumab is the minimum known dose with antiangiogenic effects in cancer patients.
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Abstract
La presente invención se refiere al uso de Ia suramina, o una sal farmacéuticamente aceptable de Ia misma, en Ia preparación de un medicamento para inhibir Ia neovascularización retinal y corneal en un paciente. La presente invención se refiere también a un método para el tratamiento de Ia neovascularización retinal y corneal en un paciente en necesidad de tal tratamiento, caracterizado porque comprende administrar mediante inyección al paciente una cantidad efectiva de suramina, o una sal farmacéuticamente aceptable de Ia misma.
Description
USO DE LA SURAMINA PARA LA PREPARACIÓN DE UN MEDICAMENTO PARA INHIBIR LA NEOVASCULARIZACION RETINAL Y CORNEAL
CAMPO DE LA INVENCIÓN
La suramina (suramin, suramine) es una droga conocida desde hace muchos años para el tratamiento de enfermedades causadas por nematodos y protozoos. También se han descrito sus propiedades como agente anti- neoplásico a través de varios mencanismos: inhibición de Ia angiogénesis de tumores, incremento de Ia sensibilidad celular a sustancias citotóxicas (quimioterapia), acción citotóxica por si misma.
Químicamente Ia suramina puede ser denominada como el ácido 8-[[4- met¡l-3-[[3-[[3-[[2-met¡l-5-[(4,6,8-trisulfonaftalen-1-
¡OcarbamoiOfenillcarbamoi^fenillcarbamoi^aminolbenzoi^aminol-naftalen-I .S.δ- trisulfónico, de fórmula empírica C51H40N6O23S6 y número CAS 145-63-1. Para aplicaciones farmacéuticas, Ia suramina habitualmente se utiliza salificada, bajo Ia forma sódica, también denominada hexasódica.
De manera inesperada y sorprendente se ha encontrado ahora que Ia suramina puede ser utilizada con éxito para el tratamiento de enfermedades de Ia retina, y particularmente para el tratamiento de Ia angiogénesis retinal (neovascularizacion retinal), proceso patológico presente en varias enfermedades retínales. Más aun, se ha encontrado que las suramina también eficaz en el tratamiento de Ia neovascularizacion corneal.
I Aspectos médicos de Ia invención
1.1 Retina
Los receptores purinérgios-P2 se han encontrado activados en enfermedades retínales.
El objetivo de Ia presente invención ha sido analizar Ia expresión de los receptores purinérgicos en un modelo animal de retinopatía inducida por oxígeno, y examinar el efecto de Ia suramina, antagonista purinérgíco, en Ia- angiogénesis retinal.
Para tales propósitos se utilizó un método bien conocido para inducir neovascularización preretinal. La expresión de los receptores purinérgicos en Ia retina fue analizada mediante técnicas de inmunohistoquímica utilizando anticuerpos contra receptores P2X1 , P2X1 , P2X2, P2X3 y P2Y2. El efecto de Ia suramina fue estudiado en el mismo modelo animal.
La inmunoreactividad positiva del P2X2 fue encontrada en los penachos neovasculares y en Ia capa de Ia plexiforme interna de los animales expuestos a oxígeno. También se encontró un incremento de Ia densidad de las células marcadas con anticuerpos contra el P2Y2 en Ia capa de fibras. La inmunoreactividad contra los receptores P2X1 y P2X3 no fue detectada. Inmunoreactividad positiva al receptor P2X2 fue observada en Ia capa plexiforme externa de los animales expuestos y no expuestos a oxígeno. La suramina detuvo Ia neovascularización preretinal.
Los resultados sugieren que los receptores purinérg¡cos-P2 están involucrados en Ia retinopatía inducida por oxígeno. El antagonista no-específico purinérgico suramina es capaz de detener Ia neovascularización preretinal. La suramina u otros antagonistas purinérgicos-P2 podrían ser medios farmacológicos para el tratamiento de Ia neovascularización preretinal.
1.2 Cornea
El otro objetivo de Ia presente investigación ha sido analizar Ia eficacia de Ia suramina, antagonista purinérgico no específico, en Ia angiogénesis corneal.
Para tales propósitos se utilizó un método bien conocido para inducir neovascularización en Ia cornea. La aparición de vasos de neoformación en Ia córnea fue documentada a través de una cámara digital a Io largo de un período de 35 días. El efecto de Ia suramina fue comparado con animales tratados con bevacizumab (Avastin) utilizado en el cáncer de colón por su efecto antiangiogénico que disminuye el crecimiento tumoral, y con animales que no recibieron tratamiento (control).
La suramina y el bevacizumab administrados por vía endovenosa disminuyeron el desarrollo de neovasos en Ia cornea. El bevacizumab tuvo un mayor efecto en las dos primeras semanas posteriores al tratamiento, mientras que el efecto de Ia suramina fue menor al comienzo pero se mantuvo estable y fue mayor que el efecto del bevacizumab a partir de las 3 semanas siguientes al inicio del tratamiento.
Los resultados sugieren que el antagonista no-específico purinérgico suramina es capaz de detener Ia neovascularización corneal. La suramina u otros antagonistas purinérgicos podrían ser medios farmacológicos para el tratamiento de Ia angiogénesis corneal.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LAS FIGURAS
Las Figura 1A a U ¡lustran Ia ¡nmunoreactividad a los receptores P2Y2 y P2X2 en retinas de ratones controles y expuestos a oxígeno, y expresión del receptor P2X2 en neovasos retínales, más específicamente:
La Figura 1A se muestra los receptores P2Y2 controles en una magnificación de 1OX;
La Figura 1B muestra los receptores P2Y2 controles en una magnificación de 2OX; La Figura 1C muestra los receptores P2Y2 expuestos a oxígeno en una magnificación de 10X;
La Figura 1D muestra los receptores P2Y2 expuestos a oxígeno en una magnificación de 2OX;
La Figura 1 E muestra los receptores P2X2 controles a una magnificación de 10X
La Figura 1F muestra los receptores P2X2 controles a una magnificación de 2OX;
La Figura 1G muestra los receptores P2X2 expuestos a oxígeno a una magnificación de 10X;
La Figura 1H muestra los receptores P2X2 expuestos a oxígeno a una magnificación de 2OX,
La Figura 11 ¡lustra Ia inmunohistoquímica a una magnificación de 2OX de los receptores P2X2 neovasos; La Figura U ¡lustra Ia inmunofluorescencia a una magnificación de 2OX de los receptores P2X2 (I).
Las Figuras 2A y 2B muestran imágenes de Ia neovascularización pre- retinal, con los núcleos de vasos de neoformación por encima de Ia membrana limitante interna de Ia retina en animales expuestos a oxígeno, respectivamente, sin tratamiento de suramina y con tratamiento de suramina.
La Figura 3 muestra el desarrollo de neovasos corneales 21 días después de Ia lesión.
La Figura 4 ilustra Ia evolución de los neovasos en cada uno de los tres grupos animales, siendo el Control (A), tratado con suramina (B), tratado con bevacizumab (avastin) (C).
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
I. Retina
1.1 Introducción
Los receptores de Ia superficie celular para nucleótidos extracelulares se denominan receptores P2. Estos son activados por nucleótidos como las purinas
y/o pirimidinas. Los receptores P2 se dividen en dos grandes grupos: P2X y P2Y. Los receptores P2X están involucrados en el control del flujo de iones en Ia célula en respuesta al ATP (adenosin trifosfato).
Los receptores P2X participan en Ia neurotransmisión rápida y se encuentran en gran cantidad en los tejidos con función excitatoria. Los subtipos P2X1 , P2X2, P2X3, etc se encuentran descriptos en Ia bibliografía. Los receptores P2Y pertenecen a Ia familia de receptores acoplados a Proteína G, y también se han encontrado varios tipos como el P2Y1 , P2Y2, etc. (Abbrachio & Burnstock 1994). Los receptores P2 se encuentran presentes en las células guales y en Ia retina (Lazarowski E; Fries JE 2005, Wang 2002, Li Y 2001 , Fries 2004). Se han encontrado activados, con una mayor inmunoreactividad en enfermedades de Ia retina (Morigiwa et al 2000). Estudios experimentales en animales sobre desprendimiento de retina demostraron una inmunoreactividad positiva de los receptores P2Y2 especialmente en las capas internas de Ia retina, lográndose una clara identificación de ellos en células guales como en astrocitos y células de Muller. Sin embargo, después de 7 días de evolución del desprendimiento de retina ya se expresaba el receptor P2Y2 en otras partes de Ia retina (Uhlmann S 2006, Uckermann 2003). El transporte activo y pasivo de iones y fluidos a través de las células del epitelio pigmentario de Ia retina (RPE) juega un rol importante en Ia regulación del volumen y composición del fluido subretinal. La activación apropiada de vías de transporte de fluido en las RPE puede ser un buen blanco para medios que promuevan el desprendimiento de retina. Algunas investigaciones han
demostrado que el INS37217, agonista sintético del receptor P2Y2, estimula Ia reabsorción del fluido subretinal y mejora el porcentaje de reaplicación de Ia retina en modelos experimentales de desprendimiento de retina realizados en ratas y conejos. La activación de los receptores P2Y2 localizados en Ia membrana apical de RPE usando ATP ha demostrado que estimula el transporte de iones y absorción de fluidos en monocapas de células de RPE, frescas y aisladas, de tejido bovino (Nour M 2003).
En un modelo animal de desprendimiento de retina Ia reactividad de las células de Muller (guales) era evidente a las 24 hs. La aplicación de Suramina durante Ia cirugía inhibió Ia disminución de Ia corriente de potasio, pero no Ia elevada respuesta al ATP extracelular de los receptores P2Y2. PPADS, otro inhibidor P2 inespecífico, no tuvo ningún efecto (Uhlmann 2003).
En un modelo animal de proliferación vitreoretinal (PVR) utilizando dispasa, las células de Muller mostraron hipertrofia, baja regulación de Ia rectificación de Ia corriente de K+ intracelular y despolarización del potencial de membrana, todos cambios dependientes de Ia severidad de Ia PVR (Francke 2003).
Para determinar el tipo de receptores purinergicos mediadores de Ia respuesta al ATP que inducen los cambios en Ia corriente de K+ diferentes agonistas fueron testeados. Se encontró que los receptores P2Y tenían un rol dominante en las células de Muller de conejos, y había una hiper-expresión de estos receptores en células provenientes de retinas con PVR (Francke 2002). Durante Ia proliferación vitreoretinal (PVR) las células de Muller mostraban una regulación aumentada de su respuesta al ATP extracelular. La dispasa, enzima
proteolítica, fue inyectada dentro del vitreo desarrollando un tipo de retinopatía diferente, que no mostró signos de PVR. Esta de retinopatía se pensó que constituía una entidad patognomónica distinta y que podría preceder al desarrollo de Ia PVR. Hay que tener en cuenta que Ia retinopatía inducida por dispasa y Ia retinopatía diabética comparten algunos signos comunes: alteraciones microvasculares y gliosis de las células de Muller. Estas células se transforman en células reactivas como Io indica Ia expresión aumentada de Ia glial fibrillary acidic protein (GFAP). En los mismos experimentos se notó también en las células de Muller una regulación aumentada de Ia respuesta al ATP extracelular. Por Io tanto, una mayor respuesta al ATP extracelular pareciera ser más una característica general de Ia gliosis de células de Muller, que es también observada en otras retinopatías. La PVR y Ia retinopatía diabética se acompañan de gliosis de las células de Muller. En Ia retinopatía diabética las células de Muller participan en Ia formación de membranas pre y subretinales. La expresión del VEGF en las células de Muller ha sido relacionada con Ia inducción de Ia neovascularización retinal en Ia retinopatía diabética no-proliferativa (Francke 2003, Bringman 2002).
La angiogénesis patológica retinal como ocurre en Ia retinopatía del prematuro (ROP), es una causa importante de ceguera en niños nacidos prematuramente (Gallo & Lennerstrand 1991). Hay que tener en cuenta que Ia retina en el niño termina de vascularizarse en Ia periferia temporal alrededor de Ia semana 42 de edad gestacional. Por Io tanto, un niño que nace con 30 semanas de edad gestacional tendrá una parte importante de Ia retina aún sin vascularizar. La ROP es una vasculopatía cuyo mecanismo fisiopatológico
comienza en Ia zona de interfase entre el área vascular y avascular de Ia retina, con un proceso de hiperplasia celular que si progresa da origen a Ia aparición de neovasos que se extienden en Ia retina y en el vitreo, dando inicio al desarrollo Ia proliferación vitreo retinal que habitualmente conduce al desprendimiento de retina. A pesar de grandes avances ocurridos en su prevención y tratamiento continúa siendo Ia causa más importante de ceguera en Ia infancia.
La investigación llevada a cabo tuvo como objetivo evaluar Ia expresión de los receptores P2 en un modelo experimental de retinopatía inducida por oxígeno en ratones y analizar si Ia retinopatía era detenida por Ia Suramina, un antagonista no-específico de los receptores P2.
1.2 Ejemplos
1.2.1 Materiales y Métodos
Angiogénesis retinal patológica
La neovascularización retinal fue inducida por Ia exposición de ratones de 7 días de vida C57BL/6J a oxigenoterapia al 75% durante 5 días, retornando a una habitación con aire convencional al día 12, permaneciendo en ella 5 días más. El día 12, después de retornar a Ia habitación, los ratones fueron divididos en dos grupos. El grupo tratado con suramina (n = 10) recibió una inyección intraperitoneal de 1 ,75 mg de suramina sódica (Sigma-Aldrich, St-Louis, MO) disuelta en 1 mi de Cl Na (solución fisiológica) con una concentración de
suramina sódica de 1 ,75 mg/ml, mientras que el grupo control (n = 14) no recibió ninguna inyección.
Los núcleos de las células vasculares de neoformación encima de Ia capa limitante interna de Ia retina fueron contados según Ia descripción realizada por otros investigadores (Smith et al 1994). Aproximadamente 24 secciones de 4 mieras de grosor fueron cortadas de cada ojo. Se excluyeron aquellos cortes que incluían el nervio óptico. Diferencias entre el número de los núcleos por encima de Ia membrana limitante interna fueron comparados.
Immunohistoquímica
Retinas correspondientes a 5 animales tratados con suramina y a siete sin haber recibido antagonistas-P2 así como de siete animales no expuestos a oxígeno fueron analizadas con técnicas de inmunohistoquímica. El globo ocular después de ser enucleado fue fijado por 48 hs en paraformaldeído al 4 % (Sigma-Aldrich, St Louis, MO). Posteriormente el globos ocular se colocó en inmersión para crioprotección en soluciones distintas de glucosa (5 %, 10 %, 15 % y 20 %) y después en compuestos mixtos de glucosa OCT ((Barthel and Raymond 1990). Cortes de 14 mieras fueron obtenidos y fijados en sudes de vidrios tratados con polilisina (Shandon AS325 Retraction).
Los anticuerpos primarios utilizados contra receptores purinérgicos fueron: anti-P2X1 y anti-P2X3 (policlonal de conejo), P2X2 (policlonal de cobayo) (1 :1000) y P2Y2 (policlonal de conejo, 1 :800), (Neuromics, Minneapolis, USA).
Después de ser incubados en anticuerpos primarios durante una noche a temperatura de 4o C, los preparados se procesaron con anticuerpos secundarios biotinilados seguidos del complejo peroxidas av¡dina:biot¡nilados (Vectastin Élite ABC, Vector Laboratories, Burlingame, CA). Finalmente, Ia reacción de color fue obtenida usando Ia solución amplificada con níquel de 3,3'-diam¡nobencidina (DAB) para teñir (Sigma-Aldrich, St Louis, MO).
Para inmunofluorescencia los especímenes fueron marcados con anticuerpos conjugados de Ig-G antíconejo rodamina y lísamina o con anticuerpos conjugados de Ig-G anti-cobayo con isotiocianato-5 de fluorescencia (Jackson Immunoresearch Laboratories, West Grove, PA).
Los especímenes de inmunohístoquímica fueron examinados utilizando un
Microscopio Eclipse Nikon E-900 para Fluorescencia (Tokyo, Japan) y las fotografías fueron tomadas con una Cámara Fotográfica Digital Nikon DN 100
(Tokyo, Japan). El análisis se llevó a cabo sin saber el observador a qué animal pertenecía Ia retina que estaba examinando
Análisis estadístico
Se llevó a cabo para comparar el promedio de núcleos de neovasos en cada grupo. El student T-test fue utilizado para determinar si había una diferencia significativa (p <0,05) en Ia angiogénesis retinal entre ratones inyectados con Suramina y aquellos expuestos a oxigenoterapia sin recibir Suramina.
Todos los animales fueron tratados según las normas de Ia Association for Research in Vision and Ophthalmology para el uso de animales en investigación oftalmológica.
1.2.2 Resultados
Inmunohistoquímica
Los receptores P2X2 y P2Y2 fueron encontrados con inmunoreactividad aumentada en un modelo de ratones de retinopatía inducida por oxígeno (Fig. 1).
La expresión del receptor P2X2 fue encontrada en Ia capa plexiforme interna de
Ia retina en ratones expuestos a oxigeno pero no en aquellos no expuestos a oxígeno (Fig 1).
Inmunoreactividad positiva fue observada en Ia capa plexiforme externa de ambos grupos. Había una densidad incrementada de Ia inmunoreactividad de los receptores P2Y2 en Ia capa de fibras de los animales expuestos a oxígeno (Fig
1). Las células tenían una morfología parecida a astrocitos y células guales.
Inmunoreactividad negativa fue hallada respecto a los receptores P2X1 y P2X3.
En Ia capa interna de Ia retina varias células con morfología parecida a células de Muller expresaban inmunoreactividad positiva al receptor P2Y2 mientras que Ia capa nuclear externa presentaba signos de reactividad al receptor P2X2 en células similares a las células de Muller.
Las retinas de animales expuestos a oxígeno mostraban brotes de neovascularización intravítrea. Inmunoreactividad positiva al receptor P2X2 fue
observada en Ia pared de los neovasos retínales. La localización de estos receptores en los neovasos fue confirmada por técnicas de inmunofluorescencia (Fig 2).
Neovascularización retinal patológica en ratones tratados con suramina y controles:
Un modelo de isquemia que induce angiogénesis retinal patológica fue usado para investigar Ia formación de núcleos de vasos de neoformación en el lado vitreo de Ia membrana limitante interna en ratones tratados y no tratados con suramina, expuestos a oxígeno. La angiogénesís retinal patológica identificada por Ia presencia de núcleos de células del neoendotelio vascular por encima de Ia limitante interna fue evidente en los ratones inyectados con suramina (5,7 ± 3,7) y controles (25,2 ± 3,7). La cantidad de núcleos de los neovasos era significativamente menor en el grupo con Suramina (p = < 0,008) que en el grupo control (Fig. 2)
1.2.3 Discusión y Conclusiones
En el presente estudio Ia suramina detuvo Ia neovascularización preretinal en un modelo de retinopatía inducida por oxígeno. Hemos mostrado evidencia de Ia expresión de los receptores P2 en Ia retina de este modelo animal. Inmunoreactividad al P2X2 fue observada en Ia retina neural y en las células endoteliales de los neovasos así como en células con morfología similar a las células de Muller. Inmunoreactividad al P2Y2 fue observada en astrocitos y en células guales con forma parecida a células de Muller.
Nuestros hallazgos sugieren un rol activo de los receptores purinérgicos en el desarrollo de Ia retinopatía del prematuro.
La suramina es un antagonista no-específico de los receptores purinérgico-P2. Se sabe también que Ia suramina es un potente inhibidor de Ia angiogénesis y tiene propiedades supresoras en el desarrollo de algunos tumores malignos, siendo utilizada en algunos tratamiento oncológicos (Kathir et al 2006). Se ha encontrado a Ia suramina bloqueando los receptores del VEGF (Waltenberger J et al 1996).
El efecto y modulación de los receptores P2X2 y P2Y2 en Ia retinopatía del prematuro eran desconocidos. Los receptores-P2 podrían ser considerados un blanco de terapia farmacológica para inhibir Ia neovascularización retinal, especialmente en Ia retinopatía del prematuro, Ia causa más importante de ceguera en Ia infancia.
Hay extensa evidencia del efecto de los receptores P2X y P2Y sobre neuronas y células guales en Ia fisiopatología de Ia isquemia cerebral in vitro y también in vivo (Franke H et al 2006). En un estudio de Ia expresión de receptores-P2 y de cambios funcionales en Ia hipoxia retinal de Ia microglía en Ia rata se encontró que Ia microglía proliferaba, liberaba interleukina-1 β y TNF-α , y además tenía una ¡nmunoreactividad positiva a los receptores purinérgicos (Morigiwa et al 2000).
II. CORNEA
IM Introducción
La córnea, ubicada en Ia parte anterior del ojo, es un tejido transparente y avascular. Algunas patologías oculares pueden causar pérdida de su avascularidad y transparencia,, produciendo disminución o pérdida de Ia visión. Se estima que en los Estados Unidos un millón y medio de pacientes desarrollan neovascularización corneal, algunos de ellos con pérdida de Ia visión, llamados pacientes ciegos por cornea (Brodovsky et al 2000). Las causas más frecuentes de Ia invasión de vasos en córnea
(neovascularización corneal) son: infecciones oculares como el virus herpes simple, secuelas de enfermedades como el Pénfigo y el Síndrome de Steven Johnson, Pterigion gigantes, y especialmente las quemaduras con álcalis. Las patologías mencionadas suelen cursar con daño severo o destrucción de las células troncales del limbo corneal (stem cells), las cuales tendrían Ia función de no permitir el ingreso de vasos sanguíneos a través de Ia periferia corneal (Dua H et al 2003).
El manejo de Ia neovascularización corneal continua siendo complejo, aunque se hayan logrado algunos avances en el tratamiento de esta patología. Casos que se podrían beneficiar de un transplante de cornea tienen mal pronóstico debido a Ia frecuente recurrencia de Ia neovascularización en el botón corneal transplantado. La experiencia demuestra que es necesario disminuir significativamente Ia neovascularización antes de realizar el transplante de córnea convencional (Garg P et al 2005; Whitcher JP et al 2002). Nuevos
tratamientos como por ejemplo el transplante de stem-cells de limbo corneal se encuentran en una etapa inicial de desarrollo. Sin embargo, en los pocos casos reportados es frecuente encontrar recurrencia de Ia neovascularización corneal.
Dado los resultados obtenidos en Ia angiogénesis retinal, y teniendo en cuenta Ia existencia de receptores purinérgicos en el parénquima corneal, nos hemos propuesto evaluar Ia eficacia de Ia suramina, antagonista purinérgico no específico, para inhibir o reducir Ia angiogénesis corneal en un modelo animal clásico de neovascularización corneal (Fujihara T et al 2001; Klepeis et al 2004)
11.2 Ejemplos
11.2.1 Material y Métodos
Modelo de Neovascularización corneal
Luego de anestesiar al conejo con una inyección intramuscular de midazolam y clorhidrato de Ketamina, realizar Ia instilación de proparacaína tópica (Anestalcon, Alcon, Argentina) en el ojo y se colocó un biefarostato en el ojo derecho. Durante 20 segundos se embebieron discos de papel de filtro Whatman de 7 mm de diámetro en solución de Na(OH) 1 N. Se colocó con una pinza el disco de papel sobre Ia parte central de Ia córnea dejándolo por 2 minutos. Inmediatamente después se lavó Ia zona lesionada con 15 mi de solución salina (0,9 % NaCI) durante un minuto. El mismo procedimiento se llevó a cabo en 9 conejos.
Score de Neovascularización
Cuantificamos Ia formación de neovasos dándole un valor de 0 a 4 a cada cuandrante según el grado de crecimiento centrípeto del vaso mas largo (en incrementos de 1mm, es decir, 0= Omm; 1= igual o menor de 1mm; 2= mayor de
1 y hasta 2 mm; 3= mayor de 2 y hasta 3mm; 4= mayor de 3 mm.). La suma de los cuatro cuadrantes nos dio el Índice de neovascularización (INV) de ese ojo.
La medición de los vasos se realizo sobre imágenes digitales tomadas con Ia cámara con Ia cámara Nikon Coolpix 5700 Digital Camera (Nikon, Tokyo, Japan) a los 9, 15, 21 y 35 días postlesión (Mei Zheng et al 2001).
Administración de Suramina y Bevacizumab (Avastin)
Treinta minutos después de realizar Ia lesión corneal se inyectó a través de una bomba de infusión endovenosa 20 mg/kg de suramina sódica (Biomol
International, PA, USA) disuelta en 5 mi de Cl Na (solución fisiológica) durante 20 minutos. El bevacizumab (Roche, Buenos Aires, Argentina) se administró de igual manera con una dosis de 5 mg/kg disuelta en 5 mi de CINa. Quedaron así constituidos tres grupos de tres animales cada uno: tratados con suramina, tratados con bevacizumab y sin tratamiento (controles).
Control postoperatorio
A las 24hs de realizar Ia lesión se realizó el primer examen clínico y luego se continuó cada tres días. Se llevó a cabo utilizando un microscopio operador o una lupa para cirugías y se tomaron fotos con una cámara digital Nikon Coolpix 5700. El registro del INV se realizó a los 9, 15, 21 y 35 días en todos los animales. El INV promedio de cada grupo se utilizó para realizar el análisis comparativo.
11.2.2 Resultados
El Avastin y Ia suramina tuvieron un efecto inhibidor de Ia neovascularización a Io largo de los 35 días. Se obtuvo una mayor inhibición de los neovasos en las dos primeras semanas utilizando bevacizumab (Avastin). Se observó un menor efecto inhibidor de Ia angiogénesis corneal en las dos primeras semanas con Ia suramina. Sin embargo, su grado de inhibición
neovascular se mantuvo estable a partir de los 15 días en adelante (Ver gráfico en Fig 4).
II.2.3 Discusión y Conclusiones
Hemos encontrado a Ia suramina administrada por vía endovenosa como agente eficaz para reducir Ia angiogénesis corneal en un modelo clásico de neovascularización corneal (Bocci G et al 1999; Zheng M et al 2001). En las primeras semanas de tratamiento tiene un efecto menor al bevacizumab (Avastin), pasando luego a tener un efecto superior a esa droga antiangiogénica.
La suramina actúa bloqueando los receptores purinérgicos. Sin embargo, también se Ia ha encontrado bloqueando otros receptores de moléculas angiogénicas como el FGF y el VEGF (Kathir KM 2006, Waltenberger et al 1996).
En cambio el bevacizumab inhibe Ia angiogénesis al unirse al péptido VEGF y de ese modo impide a esta molécula interactuar con sus receptores correspondientes (1996 - 2006 Productos Roche S.A.Q. e I, Buenos Aires,
Argentina).
La dosis de suramina utilizada en nuestro estudio ha sido señalada como no tóxica para el organismo humano según estudios realizados previamente (Villalona-Calero M et al 2003). Por otra parte Ia dosis de bevacizumab es Ia mínima dosis conocida con efectos antiangiogénicos en pacientes oncológicos
(1996 - 2006 Productos Roche S.A.Q. e I, Buenos Aires).
Claims
1.- EI uso de Ia suramina, o una sal farmacéuticamente aceptable de Ia misma, en Ia preparación de un medicamento para inhibir Ia neovascularización retinal y corneal en un paciente.
2.- El uso de acuerdo con Ia reivindicación 1 , caracterizado porque Ia sal farmacéuticamente aceptable de Ia suramina es Ia sal de sodio hexasódica.
3.- Un método para el tratamiento de Ia neovascularización retinal en un paciente en necesidad de tal tratamiento, caracterizado porque comprende administrar mediante inyección al paciente una cantidad efectiva de suramina, o una sal farmacéuticamente aceptable de Ia misma.
4.- Un método para el tratamiento de Ia neovascularización corneal en un paciente en necesidad de tal tratamiento, caracterizado porque comprende administrar mediante inyección al paciente una cantidad efectiva de suramina, o una sal farmacéuticamente aceptable de Ia misma.
5.- El método de acuerdo con las reivindicaciones 3 y 4, caracterizado porque Ia sal farmacéuticamente aceptable que se administra al paciente es Ia sal de sodio hexasódica de Ia suramina.
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2522387C1 (ru) * | 2013-05-15 | 2014-07-10 | федеральное государственное бюджетное учреждение "Межотраслевой научно-технический комплекс "Микрохирургия глаза" имени академика С.Н. Федорова" Министерства здравоохранения Российской Федерации | Способ лечения неоваскуляризации роговицы |
-
2007
- 2007-01-29 WO PCT/MX2007/000006 patent/WO2008094027A1/es active Application Filing
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
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