WO2008089738A2 - Eisenoxid-bindende peptide - Google Patents

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Erik Blazek
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Definitions

  • the invention relates to diagnostic agents containing metal oxide particles, in particular iron oxide particles which are coated with binder peptides.
  • the binding peptides bind to the metal oxide particles with high affinity so that the peptide-coated metal oxide particles are suitable for medical applications, for example as contrast agents for magnetic resonance tomography.
  • SPIO Superparamagnetic iron oxide nanoparticles made of magnetite or maghemite are outstandingly suitable as contrast agents for magnetic resonance (MR) tomography because of their superparamagnetic properties.
  • the practicality of these nanoparticles is essentially determined by physicochemical parameters such as particle size, zeta potential, and surface hydrophobicity. The latter determine both in vitro stability as well as degradation behavior and distribution in vivo. For these reasons, colloidal preparations of iron oxides have in many cases already been provided with a chemical coating during the synthesis which gives the desired properties. Thus, all iron oxide nanoparticles (for parenteral use) which are already in clinical use are provided with a shell of dextran or dextran derivatives, eg WO 94/03501.
  • Silane compounds such as aminopropyltriethoxysilane (APTES)
  • APTES aminopropyltriethoxysilane
  • SPIO particles are generally broken down in the liver via the reticuloendothelial system (RES), the Kupffer cells, and can therefore be used initially for the imaging of this organ.
  • RES reticuloendothelial system
  • the half-life in the blood and the dependent uptake in the liver can be regulated by the choice of coating.
  • targeting molecules By coupling SPIO particles to targeting molecules, moreover, a so-called molecular imaging of clinically relevant target structures in the body, e.g. Tumors and inflammatory foci, sought.
  • candidate targeting molecules for this task include peptides (reviews [2]) and small molecules such as folic acid, in addition to antibodies and fragments that can be generated against any surface marker [3].
  • contrast agents e.g. the radioisotope-labeled peptide octreotide, which binds to a tumor-associated somatostatin receptor.
  • contrast agents e.g. the radioisotope-labeled peptide octreotide
  • a weakly binding coating material such as
  • Dextran / carboxydextran is hardly suitable as carrier for the targeting molecules.
  • a replacement in the course of the formation of the binding equilibrium would not only lead to the loss of these sometimes very expensive molecules, but it is also expected a signal attenuation by blocking the target structures.
  • some strategies for more efficient coupling have already been developed, e.g. cross-linking of dextrans, covalent bonding via silanes or higher affinity-binding coating materials.
  • the object underlying the present invention was thus It is to find coating materials for metal oxide, which at least partially avoid the disadvantages of the prior art described above.
  • the coating materials should bind with high affinity and thus without appreciable loss of metal oxide particles and on the other hand have a high biocompatibility.
  • the present invention relates to metal oxide-binding peptides as coating materials and optionally as molecular anchors for targeting or target guidance molecules. According to the invention, it has been found that peptides with higher affinity can bind to metal oxides, such as iron oxide, than is the case with carbohydrates, such as dextran.
  • the metal oxide particle is preferably a magnetic particle, more preferably a superparamagnetic particle.
  • the metal oxide is, for example, an oxide of a transition metal such as cobalt, nickel, manganese, copper or / and iron.
  • the metal oxide is an iron oxide, e.g. Magnetite or maghemite.
  • the metal oxide particle is preferably a colloidal particle. The average diameter may be in the range of 1 nm-1 ⁇ m, preferably 1-100 nm, and more preferably 2-50 nm.
  • the surface of the metal oxide particle prior to coating with the binding peptide may optionally be modified, e.g. by silane compounds.
  • the binder peptide used to coat the metal oxide particle usually has a length of up to 100 building blocks, preferably a length of 5-50 building blocks, and more preferably a length of 5-25 building blocks.
  • the binding peptide is preferably composed of a linear sequence of amino acids.
  • the binding peptide may also contain one or more modifications of the classical peptide structure, such as the use of modified amino acid building blocks, changes in the peptide backbone, cyclization, etc.
  • the building blocks of the peptide may not consist of naturally occurring amino acids, ie, in particular, the genetically encoded amino acids natural, ie artificial non-genetically encoded amino acids, and combinations thereof are selected.
  • the building blocks are preferably L- ⁇ -aminocarboxylic acids, but other building blocks such as D- ⁇ -aminocarboxylic acids, ⁇ -aminocarboxylic acids, amino acid analogs, etc. may also be used.
  • Modifications of the backbone include, for example, replacing the amide linkage used to link building blocks with other linkages, eg, N-alkylamide, such as N-methylamide, ketomethylene, hydroxyethylene, (E) -ethylene, carba, ether, reduced amide, retro-inversoamide , Phosphonamide, phosphonate or phosphinate.
  • N-alkylamide such as N-methylamide, ketomethylene, hydroxyethylene
  • E -ethylene
  • carba, ether reduced amide, retro-inversoamide
  • Phosphonamide phosphonate or phosphinate.
  • the binding peptide is preferably purified by non-enzymatic synthesis, e.g. chemical solid phase synthesis on a suitable synthesis resin, prepared by known methods. In principle, however, an enzymatic synthesis, e.g. in an in vitro translation system or in a cell.
  • the binding peptide is selected to have sufficient affinity for the metal oxide particle to allow for diagnostic application.
  • the experiments described in the present application have shown that the binding of peptides to metal oxide particles does not depend on the presence of a specific amino acid sequence.
  • the binding peptide contains a partial sequence from an iron-binding protein, such as ferritin, IscA, ceruloplasmin, etc., or a modification of such sequence, eg, one, two, three, four or more amino acids deleted, added, or / and other building blocks can be replaced.
  • the binding peptide may also have an artificial sequence. Also combinations of naturally occurring and artificial sequences are possible.
  • Binding peptides containing at least one basic building block i. a building block with a side chain containing a basic group, e.g. contains an amino or guanidino group, such as arginine (R) or / and lysine (K), may have a particularly high affinity for metal oxide particles. Therefore, preferred are binding peptides containing one, two, three, four, five or more basic amino acid building blocks. It is further preferred that the binding peptide additionally contains at least one acidic moiety, i. a building block with a side chain containing an acidic group, e.g. contains a carboxylic acid group, such as glutamic acid (E) or / and aspartic acid (D).
  • the binding peptide contains one, two, three, four, five or more acidic (amino acid) building blocks.
  • the ratio of basic (amino acid) building blocks to acidic (amino acid) building blocks in the binding peptide is preferably less than 1: 2, i. There are less than two acidic building blocks per basic building block. Most preferably, the ratio is less than 1: 1.5.
  • the peptide comprises one or more hydrophilic (amino acid) building blocks, i. Building blocks with a side chain containing hydrophilic groups, e.g. OH, containing, such as serine (S), contains.
  • the isoelectric point of the binding peptide (pI) is typically> 5.0, preferably ⁇ 5.5, more preferably> 6.0, even more preferably> 6.5, even more preferably ⁇ 7.0 and most preferably> 8, 0th
  • the binding peptide contains both acidic and basic building blocks, for example an alternating sequence of positively and negatively charged (amino acid) building blocks, which has a particularly high affinity for the surface of the metal oxide particle, which also has alternating positive and negative charges.
  • Particular preference is therefore given to using a binding peptide which contains a sequence:
  • each B is independently a basic (amino acid) building block, such as K or R,
  • Each independently is an acidic (amino acid) building block such as E or D
  • n and m are each independently 1, 2 or 3
  • r is a natural number ⁇ 1, preferably ⁇ 2 and more preferably ⁇ 3.
  • peptides containing an alternating sequence of one basic (amino acid) building block and one acidic (amino acid) building block are preferred.
  • the binding peptide may contain, in addition to the above-described binding sequence required for binding to the metal oxide particle, further components, such as spacer molecules, labeling groups, such as dyes, or / and targeting molecules.
  • spacer molecules can be coupled to the peptide chain. This coupling can occur during or after the peptide synthesis by known methods.
  • Preferred examples of spacer molecules are macromolecules, for example hydrophilic polymers such as polyalkylene glycols and / or polyalkylene glycol esters, in particular polyethylene glycol and / or polyethylene glycol esters, oligosaccharides or polysaccharides, polyalcohols such as polyvinyl alcohol, etc.
  • the molecular weight of the spacer molecules is preferably in the range from 500 to 30,000 Da, more preferably from 3000 to 5000 Da.
  • the metal oxide particles can be sterically stabilized against aggregation, ie the spacer molecules act as spacers between the individual particles.
  • suitable molecules such as polyethylene glycol
  • a target recognition molecule is coupled to the binding molecule (see FIG. 1B).
  • Targeting molecules are molecules that specifically recognize a target structure in the body, e.g. certain tissue or cell types, e.g. Tumor cells or cells of blood vessels that supply a tumor.
  • the target recognition molecules themselves may be peptide sequences whose sequences can already be added during the synthesis of the binding peptide.
  • Other examples of targeting molecules are polypeptides such as antibodies including antibody fragments, aptamers or low molecular weight compounds. Such molecules can be subsequently linked by known reactions with reactive groups of the binding peptide.
  • Couplings to SH groups can be made, for example, using maleimide reagents and amine groups using active esters such as N-hydroxysuccinimide esters.
  • the targeting molecules are coupled to the binding peptide via a spacer molecule, such as polyethylene glycol (see Figure 1B). Suitable coupling methods are described, for example, in the review article [4].
  • binding peptides may be used which include hydrophilic amino acids such as serine or / and negatively charged ones Amino acids, such as glutamic or aspartic acid included.
  • the dissociation constant of the binding peptide from the metal oxide particles is preferably 1 CT 6 M or less, more preferably 10 '9 M or less.
  • interactions may occur. For example, form hydrogen bonds between polymer chains, which cause an additional anchorage, which can additionally enhance the affinity of the coating.
  • the metal oxide particle may be coated with other materials in addition to the binding peptide, e.g. with classic coating materials such as carbohydrates, e.g. Carboxyldextran, polyalkylene glycols such as PEG, polyacrylic or -methycrylklaren, fatty acids, silica or / and silanes, etc.
  • classic coating materials such as carbohydrates, e.g. Carboxyldextran, polyalkylene glycols such as PEG, polyacrylic or -methycrylklaren, fatty acids, silica or / and silanes, etc.
  • the metal particle surface is initially partially with peptides, optionally to further components as indicated above, e.g. Targeting molecules are coupled, coat and then apply to the remaining metal oxide other coating materials.
  • the metal oxide particles according to the invention are preferably used as a diagnostic agent. Particularly preferred is the use as a contrast agent, in particular for magnetic resonance tomography.
  • the particles can be used both in veterinary medicine and in human medicine.
  • a diagnostic application in magnetic resonance imaging for example, 0.001-0.1 millimole of metal, e.g. Iron, administered per kg of body weight to a patient. More preferably, about 0.01 mmol of iron per kg of body weight is administered.
  • the administration is preferably intravenous.
  • the distribution of the particles in the body is then determined after predetermined times by magnetic resonance or optionally by other suitable methods. Corresponding methods are known to the person skilled in the art.
  • the invention relates to a method for producing a with a binder peptide-coated metal oxide particle comprising:
  • iron oxide-binding peptides 40 different peptides were synthesized by chemical synthesis as an array on a membrane in one experiment. Artificial sequences of amino acids or sequences of proteins of iron metabolism were used. Through the absorption of iron oxide particles (more detailed information on the preparations) to the membrane, the peptide bond was detected.
  • Figure 2 shows the result of such an experiment. It can be seen that peptides 2-25, 27, 29 and 31-40 cause binding of iron oxide particles to the membrane, as evidenced by the dark coloration.
  • the peptides 2-21 contain artificial sequences of negatively charged or 8 000118
  • the peptides 26-41 include natural sequences from the proteins ferritin, IscA and ceruloplasmin or modifications of such sequences, in which, for example, cysteine is replaced by serine. These sequences also show efficient binding to iron oxide, especially if they have an isoelectric point ⁇ 5 and in particular ⁇ 5.5.
  • AK Gupta, M Gupta Synthesis and surface engineering of iron oxide nanoparticles for biomedical applications. Biomaterials 2005, 26: 3995-
  • JC Reubi Peptide receptors as molecular targets for cancer diagnosis and therapy. EndocrRev 2003, 24: 389-427. [3] Y Zhang, N Kohler, M Zhang: Surface modification of superparamagnetic magnetite nanoparticles and their intracellular uptake. Biomaterials 2002,

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Abstract

Die Erfindung betrifft diagnostische Mittel, enthaltend Metalloxidpartikel, insbesondere Eisenoxidpartikel, die mit Bindepeptiden beschichtet sind. Die Bindepeptide binden mit hoher Affinität an die Metalloxidpartikel, so dass die Peptid-beschichteten Metalloxidpartikel für medizinische Anwendungen, beispielsweise als Kontrastmittel für die Magnetresonanztomografie, geeignet sind.

Description

Eisenoxid-bindende Peptide
Beschreibung
Die Erfindung betrifft diagnostische Mittel, enthaltend Metalloxidpartikel, insbesondere Eisenoxidpartikel, die mit Bindepeptiden beschichtet sind. Die Bindepeptide binden mit hoher Affinität an die Metalloxidpartikel, so dass die Peptid-beschichteten Metalloxidpartikel für medizinische Anwendungen, beispielsweise als Kontrastmittel für die Magnetresonanztomografie, geeignet sind.
Superparamagnetische Eisenoxid-Nanopartikel (SPIO) aus Magnetit oder Maghemit eignen sich aufgrund ihrer superparamagnetischen Eigenschaften hervorragend als Kontrastmittel für die Magnetresonanz (MR)-Tomografie.
Über die magnetischen Eigenschaften hinaus wird die Praxistauglichkeit dieser Nanopartikel im Wesentlichen durch physikochemische Parameter, wie die Partikelgröße, das Zetapotenzial und die Hydrophobizität der Oberfläche, bestimmt. Letztere entscheiden sowohl über die Stabilität in vitro als auch über Abbauverhalten und Verteilung in vivo. Aus diesen Gründen wurden kolloidale Präparationen von Eisenoxiden in vielen Fällen bereits während der Synthese mit einer chemischen Beschichtung versehen, die die gewünschten Eigenschaften vermittelt. So sind alle Eisenoxid-Nanopartikel (für parenterale Anwendung), die sich bereits in der klinischen Anwendung befinden, mit einer Hülle aus Dextran oder Dextranderivaten ausgestattet, z.B. WO 94/03501. Darüber hinaus wurden eine Vielzahl organischer und anorganischer Beschichtungen untersucht (Übersicht in [1]), z.B. Dextran, PEG, Chitosan, Polyacrylsäure, Fettsäuren, Silane, Silica etc. Silanverbindungen, wie Aminopropyltriethoxysilan (APTES), können kovalent an Eisenoxid binden, alle anderen Beschichtungen sind über die so genannte Physisorption (oder Chemisorption) mit den Partikeln assoziiert. Diese nicht-kovalente Interaktion führt dabei letztlich zur Ausbildung eines Gleichgewichts zwischen gebundenem und ungebundenem Material in Abhängigkeit von der Bindungsstärke, d.h. ein Teil der Beschichtung geht nach Verdünnung verloren.
SPIO-Partikel werden generell über das reticuloendotheliale System (RES), die Kupffer-Zellen, in der Leber abgebaut und können daher zunächst für die Bildgebung dieses Organs eingesetzt werden. Die Halbwertszeit im Blut und die davon abhängige Aufnahme in die Leber lassen sich dabei über die Wahl der Beschichtung regulieren.
Durch Kopplung von SPIO-Partikeln an Zielführungs- bzw. Targetingmoleküle wird darüber hinaus eine so genannte molekulare Bildgebung klinisch relevanter Zielstrukturen im Körper, wie z.B. Tumoren und Entzündungsherde, angestrebt. Infrage kommende Targeting-Moleküle für diese Aufgabe sind neben Antikörpern und -fragmenten, die sich gegen jeden beliebigen Oberflächenmarker generieren lassen, auch Peptide (Übersichtsartikel [2]) und kleine Moleküle, wie Folsäure [3]. In der PET- Diagnostik gibt es bereits solche Kontrastmittel, so z.B. das mit einem Radioisotop markierte Peptid Octreotide, das an einen Tumor-assoziierten Somatostatin-Rezeptor bindet. In der MR-Diagnostik gibt es noch kein vergleichbares Präparat in der klinischen Anwendung. Dies liegt weitgehend in der aufwand igen Kopplung der Targeting-Moleküle begründet.
Ein schwach bindendes Beschichtungsmaterial, wie
Dextran/Carboxydextran, eignet sich kaum als Träger für die Targeting- Moleküle. Eine Ablösung im Zuge der Ausbildung des Bindungsgleichgewichts würde nicht nur zum Verlust dieser bisweilen sehr teuren Moleküle führen, sondern es ist auch eine Signalabschwächung durch Blockade der Zielstrukturen zu erwarten. Im Laufe der Jahre wurden bereits einige Strategien für eine effizientere Kopplung erarbeitet, so z.B. die Quervernetzung von Dextranen, die kovalente Bindung über Silane oder mit höherer Affinität bindende Beschichtungsmaterialien.
Die der vorliegenden Erfindung zugrunde liegende Aufgabe bestand somit darin, Beschichtungsmaterialien für Metalloxidpartikel zu finden, welche die zuvor geschilderten Nachteile des Standes der Technik zumindest teilweise vermeiden. Insbesondere sollten die Beschichtungsmaterialien mit hoher Affinität und somit ohne nennenswerte Verlust an Metalloxidpartikel binden und andererseits eine hohe Biokompatibilität aufweisen.
Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst durch die Bereitstellung eines diagnostischen Mittels, das ein mit einem Bindepeptid beschichtetes Metalloxidpartikel enthält. Des Weiteren betrifft die vorliegende Erfindung Metalloxid bindenden Peptide als Beschichtungsmaterialien und gegebenenfalls als molekulare Anker für Targeting- bzw. Zielführungsmoleküle. Erfindungsgemäß wurde festgestellt, dass Peptide mit höherer Affinität an Metalloxide, wie etwa Eisenoxid, binden können, als dies bei Kohlenhydraten, wie etwa Dextran, der Fall ist.
Das Metalloxidpartikel ist vorzugsweise ein magnetisches Partikel, besonders bevorzugt ein superparamagnetisches Partikel. Das Metalloxid ist beispielsweise ein Oxid eines Übergangsmetalls wie Cobalt, Nickel, Mangan, Kupfer oder/und Eisen. Vorzugsweise ist das Metalloxid ein Eisenoxid, z.B. Magnetit oder Maghemit. Das Metalloxidpartikel ist vorzugsweise ein kolloidales Partikel. Der mittlere Durchmesser kann im Bereich von 1 nm- 1 μm liegen, vorzugsweise von 1-100 nm und besonders bevorzugt von 2- 50 nm.
Die Oberfläche des Metalloxidpartikels vor Beschichtung mit dem Bindepeptid kann gegebenenfalls modifiziert sein, z.B. durch Silanverbindungen.
Das zur Beschichtung des Metalloxidpartikels verwendete Bindepeptid hat üblicherweise eine Länge von bis zu 100 Bausteinen, vorzugsweise eine Länge von 5-50 Bausteinen und besonders bevorzugt eine Länge von 5- 25 Bausteinen. Das Bindepeptid ist vorzugsweise aus einer linearen Abfolge von Aminosäuren aufgebaut. Das Bindepeptid kann jedoch auch eine oder mehrere Abwandlungen der klassischen Peptidstruktur enthalten, wie etwa die Verwendung von modifizierten Aminosäurebausteinen, Veränderungen in der Peptidhauptkette, Cyclisierung etc. So können die Bausteine des Peptids aus natürlich vorkommenden Aminosäuren, d.h. insbesondere den genetisch kodierten Aminosäuren, aus nicht-natürlichen, d.h. artifiziellen nicht genetisch kodierten Aminosäuren, und Kombinationen davon ausgewählt werden. Die Bausteine sind vorzugsweise L-α-Aminocarbonsäuren, es können jedoch auch andere Bausteine, wie etwa D-α-Aminocarbonsäuren, ß-Aminocarbonsäuren, Aminosäureanaloga etc., verwendet werden. Abwandlungen der Hauptkette umfassen beispielsweise ein Ersetzen der für die Verknüpfung von Bausteinen verwendeten Amidbindung durch andere Bindungen, z.B. N-Alkylamid, wie etwa N-Methylamid, Ketomethylen, Hydroxyethylen, (E)-Ethylen, Carba, Ether, reduziertes Amid, Retro- Inversoamid, Phosphonamid, Phosphonat oder Phosphinat. Weitere Beispiele für mögliche Abwandlungen der Peptidstruktur finden sich bei Böhm et al., „Wirkstoffdesign", 1996, Spektrum akademischer Verlag Heidelberg, insbesondere Kapitel 10.
Das Bindepeptid wird vorzugsweise durch nicht-enzymatische Synthese, z.B. chemische Festphasensynthese an einem geeigneten Synthese harz, nach bekannten Methoden hergestellt. Prinzipiell ist jedoch eine enzymatische Synthese, z.B. in einem in v/ϊro-Translationssystem oder in einer Zelle, möglich.
Das Bindepeptid wird so ausgewählt, dass es eine ausreichende Affinität zu dem Metalloxid partikel aufweist, um eine diagnostische Anwendung zu ermöglichen. Durch die in der vorliegenden Anmeldung beschriebenen Experimente wurde gezeigt, dass die Bindung von Peptiden an Metalloxidpartikel nicht vom Vorhandensein einer spezifischen Aminosäuresequenz abhängt. In einer bevorzugten Ausführungsform enthält das Bindepeptid eine Teilsequenz aus einem eisenbindenden Protein, wie etwa Ferritin, IscA, Ceruloplasmin etc., oder eine Modifikation einer solchen Sequenz, wobei z.B. eine, zwei, drei, vier oder mehr Aminosäuren deletiert, hinzugefügt oder/und durch andere Bausteine ersetzt sein können. Andererseits kann das Bindepeptid jedoch auch eine artifizielle Sequenz besitzen. Auch Kombinationen von natürlich vorkommenden und artifiziellen Sequenzen sind möglich.
Bindepeptide, die mindestens einen basischen Baustein enthalten, d.h. einen Baustein mit einer Seitenkette, die eine basische Gruppe, z.B. eine Amino- oder Guanidinogruppe enthält, wie etwa Arginin (R) oder/und Lysin (K), können eine besonders hohe Affinität für Metalloxidpartikel aufweisen. Bevorzugt sind daher Bindepeptide, die eine, zwei, drei, vier, fünf oder mehr basische Aminosäurebausteine enthalten. Weiterhin ist bevorzugt, dass das Bindepeptid zusätzlich mindestens einen sauren Baustein enthält, d.h. einen Baustein mit einer Seitenkette, die eine saure Gruppe, z.B. eine Carbonsäuregruppe enthält, wie etwa Glutaminsäure (E) oder/und Asparaginsäure (D). Vorzugsweise enthält das Bindepeptid eine, zwei, drei, vier, fünf oder mehr saure (Aminosäure)-Bausteine. Das Verhältnis von basischen (Aminosäure)-Bausteinen zu sauren (Aminosäure)- Bausteinen im Bindepeptid ist vorzugsweise kleiner als 1:2, d.h. pro basischem Baustein sind weniger als zwei saure Bausteine vorhanden. Besonders bevorzugt ist das Verhältnis kleiner als 1:1,5. Weiterhin ist bevorzugt, dass das Peptid eine oder mehrere hydrophile (Aminosäure)- Bausteine, d.h. Bausteine mit einer Seitenkette, die hydrophile Gruppen, z.B. OH, enthalten, wie etwa Serin (S), enthält.
Der isoelektrische Punkt des Bindepeptids (pl) ist typischerweise > 5,0, vorzugsweise ≥ 5,5, besonders bevorzugt > 6,0, noch stärker bevorzugt > 6,5, noch stärker bevorzugt ≥ 7,0 und am meisten bevorzugt > 8,0. Auch extrem basische Peptide mit einem isoelektrischen Punkt von bis zu 13 oder höher können mit hoher Effizienz an Metalloxidpartikel binden. Günstigerweise enthält das Bindepeptid sowohl saure als auch basische Bausteine, z.B. eine alternierende Abfolge aus positiv und negativ geladenen (Aminosäure)-Bausteinen, die eine besonders hohe Affinität für die Oberfläche des Metalloxid Partikels, auf der ebenfalls alternierende positive und negative Ladungen vorliegen, besitzt. Besonders bevorzugt wird daher ein Bindepeptid verwendet, das eine Sequenz enthält:
(BnSm)r oder (SmBn)r wobei B jeweils unabhängig ein basischer (Aminosäure)-Baustein, wie etwa K oder R ist,
S jeweils unabhängig ein saurer (Aminosäure)-Baustein, wie etwa E oder D ist, n und m jeweils unabhängig 1 , 2 oder 3 bedeuten und r eine natürliche Zahl ≥ 1, vorzugsweise ≥ 2 und besonders bevorzugt ≥ 3 bedeutet.
Am meisten bevorzugt sind Peptide, die eine alternierende Abfolge von jeweils einen basischen (Aminosäure)-Baustein und einen sauren (Aminosäure)-Baustein enthalten.
Das Bindepeptid kann neben der zuvor beschriebenen, für die Bindung an das Metalloxidpartikel erforderlichen Bindesequenz noch weitere Komponenten, wie etwa Spacermoleküle, Markierungsgruppen, wie etwa Farbstoffe, oder/und Zielführungs- bzw. Targetingmoleküle enthalten.
In einer ersten Ausführungsform (siehe Figur 1A) können Spacermoleküle an die Peptidkette angekoppelt werden. Diese Kopplung kann während oder nach der Peptidsynthese durch bekannte Methoden erfolgen. Bevorzugte Beispiele für Spacermoleküle sind Makromoleküle, beispielsweise hydrophile Polymere wie etwa Polyalkylenglycole oder/und Polyalkylenglycolester, insbesondere Polyethylenglycol oder/und Polyethylenglycolester, Oligo- oder Polysaccharide, Polyalkohole wie Polyvinylalkohol etc. Das Molekulargewicht der Spacermoleküle liegt vorzugsweise im Bereich von 500 bis 30000 Da, besonders bevorzugt von 3000 bis 5000 Da. Durch Ankopplung von Spacermolekülen lassen sich die Metalloxidpartikel sterisch gegen Aggregation stabilisieren, d.h. die Spacermoleküle wirken als Abstandhalter zwischen den einzelnen Partikeln. Darüber hinaus lässt sich durch Beschichtung mit geeigneten Molekülen, wie etwa Polyethylenglycol, die Biokompatibilität oder/und die Zirkulationsdauer der Partikel in der Blutbahn erhöhen.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird ein Zielerkennungsmolekül an das Bindemolekül gekoppelt (siehe Figur 1 B). Zielerkennungsmoleküle sind Moleküle, die spezifisch eine Zielstruktur im Körper erkennen, z.B. bestimmte Gewebe- oder Zelltypen, z.B. Tumorzellen oder Zellen von Blutgefäßen, die einen Tumor versorgen. Die Zielerkennungsmoleküle können einerseits selbst Peptidsequenzen sein, deren Sequenzen bereits während der Synthese des Bindepeptids hinzugefügt werden können. Andere Beispiele für Zielerkennungsmoleküle sind Polypeptide, wie etwa Antikörper einschließlich Antikörperfragmenten, Aptamere oder niedermolekulare Verbindungen. Solche Moleküle können nachträglich durch bekannte Reaktionen mit reaktiven Gruppen des Bindepeptids verknüpft werden. Kopplungen an SH-Gruppen können beispielsweise unter Verwendung von Maleimidreagenzien und an Amingruppen unter Verwendung von Aktivestern, wie etwa N- Hydroxysuccinimidestern, erfolgen. Vorzugsweise werden die Zielerkennungsmoleküle über ein Spacermolekül, wie etwa Polyethylenglycol (siehe Figur 1B), an das Bindepeptid gekoppelt. Geeignete Kopplungsmethoden sind beispielsweise im Übersichtsartikel [4] beschrieben.
Durch Auswahl geeigneter Bindepeptidsequenzen kann darüber hinaus Biokompatibilität und die Pharmakokinetik des Metalloxidpartikels beeinflusst werden (siehe Figur 1C). So können - um die Biokompatibilität und die Zirkulationsdauer zu erhöhen - Bindepeptide verwendet werden, die hydrophile Aminosäuren, wie Serin, oder/und negativ geladene Aminosäuren, wie Glutamin- oder Asparaginsäure, enthalten.
Die Dissoziationskonstante des Bindepeptids von dem Metalloxidpartikel ist vorzugsweise 1 CT6 M oder kleiner, besonders bevorzugt 10'9 M oder kleiner. Bei Kombination von Bindepeptiden mit hydrophilen Polymeren können sich Wechselwirkungen. z.B. Wasserstoffbrückenbindungen zwischen Polymerketten ausbilden, die eine zusätzliche Verankerung bewirken, die die Affinität der Beschichtung zusätzlich verstärken kann.
Das Metalloxidpartikel kann zusätzlich zum Bindepeptid mit weiteren Materialien beschichtet werden, z.B. mit klassischen Beschichtungsmaterialien wie Kohlenhydraten, z.B. Carboxyldextran, Polyalkylenglycolen wie PEG, Polyacryl- oder -methycrylsäuren, Fettsäuren, Silica oder/und Silanen etc. So kann man die Metallpartikeloberfläche zunächst teilweise mit Peptiden, die gegebenenfalls an weitere Komponenten wie oben angegeben, z.B. Zielführungsmoleküle, gekoppelt sind, beschichten und anschließend auf die verbleibende Metalloxidoberfläche andere Beschichtungsmaterialien aufbringen.
Die erfindungsgemäßen Metalloxidpartikel werden vorzugsweise als diagnostisches Mittel eingesetzt. Besonders bevorzugt ist die Verwendung als Kontrastmittel, insbesondere für die Magnetresonanztomografie. Die Partikel können sowohl in der Veterinärmedizin als auch in der Humanmedizin eingesetzt werden. Für eine diagnostische Anwendung in der Magnetresonanztomografie werden beispielsweise 0,001-0,1 mmol Metall, z.B. Eisen, pro kg Körpergewicht einem Patienten verabreicht. Besonders bevorzugt werden etwa 0,01 mmol Eisen pro kg Körpergewicht verabreicht. Die Verabreichung erfolgt vorzugsweise intravenös. Die Verteilung der Partikel im Körper wird dann nach vorbestimmten Zeiten durch Magnetresonanz oder gegebenenfalls durch andere geeignete Methoden bestimmt. Entsprechende Verfahren sind dem Fachmann bekannt.
Schließlich betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines mit einem Bindepeptid beschichteten Metalloxidpartikels, umfassend:
(a) Synthetisieren eines Bindepeptids,
(b) gegebenenfalls Anfügen eines Spacermoleküls oder/und eines Zielerkennungsmoleküls und (c) Inkontaktbringen des Bindepeptids mit einem Metalloxidpartikel unter Bedingungen, bei denen eine Beschichtung erfolgen kann.
Weiterhin wird die Erfindung durch das nachfolgende Beispiel erläutert:
Beispiel
Um Eisenoxid-bindende Peptide zu ermitteln, wurden in einem Experiment 40 verschiedene Peptide durch chemische Synthese als Array auf einer Membran synthetisiert. Dabei wurden künstliche Abfolgen von Aminosäuren oder Sequenzen aus Proteinen des Eisenstoffwechsels verwendet. Über die Absorption von Eisenoxidpartikeln (genauere Angaben zu den Präparationen) an die Membran wurde die Peptidbindung nachgewiesen.
Es wurden kommerziell verfügbare Partikel (Resovist, Schering AG, Deutschland - Fluidmag-CT, Chemicell AG, Deutschland) verwendet bzw. es wurden Partikel mittels alkalischem Schock (Standardmethoden) hergestellt und unstabilisiert oder mit Trimethylammoniumhydroxid stabilisiert verwendet. Die Partikel wurden auf eine Eisenkonzentration von 5 mM in
Wasser verdünnt und bei Raumtemperatur 10-20 min mit dem Peptidarray inkubiert. Die Bindung von Eisenoxid wurde visuell erst direkt und dann über
Anfärbung des Eisens als Berliner Blau bestimmt.
Figur 2 zeigt das Ergebnis eines solchen Experiments. Es ist zu erkennen, dass die Peptide 2-25, 27, 29 und 31-40 eine Bindung von Eisenoxidpartikeln an die Membran bewirken, was an der dunklen Färbung erkennbar ist.
Die Peptide 2-21 enthalten künstliche Abfolgen von negativ geladenen bzw. 8 000118
- 10 - sauren und positiv geladenen bzw. basischen Aminosäuren und sind daher zwitterionisch. Ausgehend von Peptid 2 wurde die Sequenz modifiziert und vereinfacht bis hin zu Peptiden, bestehend aus einer alternierenden Abfolge von Lys (K) und GIu (E), welche ebenfalls Eisenoxid binden.
Die Peptide 26-41 beinhalten natürliche Sequenzen aus den Proteinen Ferritin, IscA und Ceruloplasmin bzw. Modifikationen solcher Sequenzen, bei den beispielsweise Cystein durch Serin ersetzt ist. Auch diese Sequenzen zeigen - insbesondere, wenn sie einen isoelektrischen Punkt ≥ 5 und insbesondere ≥ 5,5 aufweisen - eine effiziente Bindung an Eisenoxid.
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Claims

Ansprüche
1. Diagnostisches Mittel, enthaltend ein mit einem Bindepeptid beschichtetes Metalloxidpartikel.
2. Mittel nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Metalloxidpartikel ein magnetisches Partikel ist.
3. Mittel nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Partikel ein supraparamagnetisches Partikel ist.
4. Mittel nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass das Metalloxidpartikel ein Eisenoxidpartikel ist.
5. Mittel nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass das Metalloxidpartikel einen mittleren Durchmesser von 1 nm bis 1 μm, vorzugsweise von 1-100 nm aufweist.
6. Mittel nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass das Bindepeptid eine Länge von 5-100 (Aminosäure)-Bausteine aufweist.
7. Mittel nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass das Bindepeptid natürliche (Aminosäure)-Bausteine, nichtnatürliche (Aminosäure)-Bausteine und Kombinationen davon enthält.
8. Mittel nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass das Bindepeptid mindestens einen basischen (Aminosäure)- Baustein, insbesondere Arg (R) oder/und Lys (K) enthält.
9. Mittel nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass das Bindepeptid weiterhin mindestens einen sauren (Aminosäure)- Baustein, insbesondere GIu (E) oder/und Asp (D) enthält.
10. Mittel nach Anspruch 8 oder 9, dadurch gekennzeichnet, dass das Verhältnis von basischen (Aminosäure)-Bausteinen zu sauren (Aminosäure)-Bausteinen im Bindepeptid kleiner als 1:2 und vorzugsweise kleiner als 1 ; 1 ,5 ist.
11. Mittel nach einem der Ansprüche 8 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass das Bindepeptid weiterhin mindestens einen hydrophilen (Aminosäure)-Baustein, insbesondere Ser (S), enthält.
12. Mittel nach einem der Ansprüche 1 bis 11 , dadurch gekennzeichnet, das Bindepeptid einen isoelektrischen Punkt ≥ 5,0, vorzugsweise ≥ 6,0, besonders bevorzugt ≥ 7,0 und am meisten bevorzugt > 8,0 aufweist.
13. Diagnostisches Mittel nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass ein Spacermolekül an das Bindepeptid gekoppelt ist.
14. Diagnostisches Mittel nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass das Spacermolekül ein hydrophiles Polymer, z.B. ein Polyalkylenglycol oder ein Polyalkylenglycolester, insbesondere ein Polyethylenglycol oder ein Polyethylenglycolester, ein Oligo- oder Polysaccharid oder ein Polyalkohol ist.
15. Diagnostisches Mittel nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass das Spacermolekül ein Molekulargewicht von 500 bis 30000 Da aufweist.
16. Diagnostisches Mittel nach einem der Ansprüche 1 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass ein Zielerkennungsmolekül an das Bindepeptid gekoppelt ist.
17. Diagnostisches Mittel nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass das Zielerkennungsmolekül ausgewählt ist aus Peptiden, Polypeptiden, wie etwa Antikörpern, Aptameren oder niedermolekularen Verbindungen.
18. Mittel nach einem der Ansprüche 1 bis 17, dadurch gekennzeichnet, dass das Bindepeptid eine Teilsequenz aus einem eisenbindenden
Protein, wie etwa Ferritin, Isc A oder Ceruloplasmin oder eine
Modifikation einer solchen Sequenz enthält.
19. Mittel nach einem der Ansprüche 1 bis 18, dadurch gekennzeichnet, dass das Bindepeptid eine artifizielle Sequenz enthält.
20. Mittel nach einem der Ansprüche 1 bis 19, dadurch gekennzeichnet, dass das Bindepeptid mindestens eine Teilsequenz enthält: (BnSm)r oder (SmBn)r wobei B jeweils unabhängig ein basischer (Aminosäure)-Baustein ist, S jeweils unabhängig eine saurer (Aminosäure)-Baustein ist, n und m jeweils unabhängig 1 , 2 oder 3 bedeuten und r eine natürliche Zahl > 1 , vorzugsweise ≥ 2 und besonders bevorzugt ≥ 3 bedeutet.
21. Mittel nach einem der Ansprüche 1 bis 20, dadurch gekennzeichnet, dass die Dissoziationskonstante des Bindepeptids von dem Metalloxidpartikel 10"δ M oder kleiner ist.
22. Mittel nach einem der Ansprüche 1 bis 21, dadurch gekennzeichnet, dass das Metalloxidpartikel zusätzlich zum Bindepeptid mit weiteren Materialien beschichtet ist.
23. Mittel nach einem der Ansprüche 1 bis 22 zur Anwendung als Kontrastmittel, insbesondere für die Magnetresonanztherapie.
24. Metalloxidpartikel, beschichtet mit einem Bindepeptid.
25. Verfahren zur Herstellung eines mit einem Bindepeptid beschichteten Metalloxidpartikels, umfassend: (a) Synthetisieren eines Bindepeptids, (b) gegebenenfalls Anfügen eines Spacermoleküls oder/und eines
Zielerkennungsmoleküls und
(c) Inkontaktbringen des Bindepeptids mit einem Metalloxidpartikel unter Bedingungen, bei denen eine Beschichtung erfolgen kann.
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