KR20230124425A - 분자 영상 진단을 위한 나노입자 및 그 제조방법 - Google Patents

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KR20230124425A
KR20230124425A KR1020220021751A KR20220021751A KR20230124425A KR 20230124425 A KR20230124425 A KR 20230124425A KR 1020220021751 A KR1020220021751 A KR 1020220021751A KR 20220021751 A KR20220021751 A KR 20220021751A KR 20230124425 A KR20230124425 A KR 20230124425A
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박정훈
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한국원자력연구원
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Abstract

본 발명은 분자 영상 진단을 위한 나노입자로서, 음의 표면전하를 가지는 금속 산화물의 미립자, 방사성 동위원소의 양이온 및 상기 금속 산화물의 미립자와 상기 방사성 동위원소의 양이온을 연결하는 리간드 유래의 음이온을 포함하는 코어층; 상기 코어층 위에 배치된, 양전하성 고분자를 포함하는 제1 쉘층; 및 상기 제1 쉘층 위에 배치된, 중성 전하를 띠는 제2 쉘층;을 포함하는, 나노입자 및 그 제조방법에 관한 것이다.

Description

분자 영상 진단을 위한 나노입자 및 그 제조방법{Nanoparticles for Molecular Imaging Diagnosis and Manufacturing Methods Thereof}
본 발명은 분자 영상 진단을 위한 나노입자 및 그 제조방법에 관한 것이다.
분자 영상 진단이란 세포 내에서 일어나는 여러 분자수준의 변화, 즉 유전자의 발현, 생화학적 현상 및 생물학적 변화들을 생체 내에서 영상화하여 그 특성을 규명하고 정량화하는 기법으로서, 영상화된 부위의 암 또는 질병의 발병 여부를 판정할 수 있도록 하여 적절한 조기 치료 및 비수술적인 치료의 과정을 조직 생검 없이 비침습적으로 모니터링 할 수 있게 하는 장점이 있어 질병 진단 방법으로서 각광받고 있다.
나노입자는 암조직의 비정상적인 모세혈관을 선택적으로 투과하며, 동시에 퇴화된 림프관으로의 효과적인 배설이 이루어지지 못하여 암조직에 축적되는 현상 인 투과 및 체류증진(EPR: Enhanced Permeability and Retention Effects) 효과를 보여, 나노입자를 활용하여 체내 암 세포의 위치를 발견할 수 있어, 분자 영상 진단을 위한 조영제로서 사용되고 있다. 특히, 자성나노입자(magnetic nanoparicles)는 기본적으로 일반적인 나노입자가 갖고 있는 특징들, 즉, 단위부피 당 표면적이 넓어서 소량의 대상 물질도 감지할 수 있다는 장점을 갖고 있는 것 외에, 다른 나노입자에 비해 화학적 안정성이 우수하고 바이오프로브로 사용될 때 자기장에 의해 위치 조작이 가능하다는 장점이 있다. 이 중 산화철 나노입자는 자화되는 특성을 가지고 있어서 생의학적으로 매우 큰 활용가치를 가지고 있다.
나노입자를 활용한 약물전달분야에서 생체 내 실험을 진행할 때는 형광을 방출하는 분자 또는 감마선을 방출하는 방사성동위원소를 도입하여 나노입자의 거동을 분석한다. 특히 방사성동위원소에서 방출되는 감마선은 형광보다 투과력이 높아 생체 내 실험에서 더 효과적이다.
이를 위해 방사성동위원소를 나노입자에 도입하기 위한 다양한 표지 방법들이 존재한다. 그 중 대부분 방사성동위원소와 결합력이 높은 킬레이트 화합물을 나노입자 표면에 붙인 후 표지하는 방법과 나노입자 표면에 단순히 방사성동위원소를 흡착시켜 표지하는 방법이 사용되고 있다. 하지만 킬레이트를 활용하여 표지하는 경우 킬레이트에 의해 나노입자의 생체 내 거동이 달라질 수 있고 다른 작용기를 가지는 생리활성물질들을 도입하는데 효과적이지 못하다. 또한, 나노입자 표면에 단순히 흡착 시키는 표지 방법은 생체 내 안정성이 낮아 생물학적 평가에 있어 정확한 분석에 어려움이 따른다.
한편, 나노입자의 생리적, 화학적 특성에 따라 생체 내 거동이 달라지고, 이에 따라 암 세포에 대한 표적 효과가 달라지는데, 나노입자 표면의 화학 성분, 구조, 전하 등을 변화시켜 나노입자와 생체 내 구성 요소간의 상호작용을 제어할 수 있다.
따라서 방사성동위원소를 나노입자 내부에 견고하게 결합시켜 나노입자의 생체 내 안정성을 높이고, 동시에 나노입자의 표면 특성을 제어하여 생체 내 약물전달 효과를 높일 수 있는 기술이 필요하다.
본 발명은 상술한 문제를 해결하기 위한 것으로서, 나노입자 내부에 리간드를 이용하여 방사성 동위원소를 안정적으로 도입하고, 나노입자의 표면 특성을 제어하기 위해 상기 리간드와 방사성 동위원소를 포함하는 코어층, 양전하성 고분자를 포함하는 제1 쉘층 및 중성 전하를 띠는 제2 쉘층를 포함하는 나노입자를 제조하여 분자 영상 진단에 활용할 수 있는 나노입자 및 그 제조방법을 제공한다.
본 발명의 일 실시형태에 따르면, 분자 영상 진단을 위한 나노입자로서, 음의 표면전하를 가지는 금속 산화물의 미립자, 방사성 동위원소의 양이온 및 상기 금속 산화물의 미립자와 상기 방사성 동위원소의 양이온을 연결하는 리간드 유래의 음이온을 포함하는 코어층; 상기 코어층 위에 배치된, 양전하성 고분자를 포함하는 제1 쉘층; 및 상기 제1 쉘층 위에 배치된, 중성 전하를 띠는 제2 쉘층;을 포함하는, 나노입자를 제공한다.
또한 본 발명의 다른 일 실시형태에 따르면, 분자 영상 진단을 위한 나노입자의 제조방법으로서, 음의 표면전하를 가지는 금속 산화물의 미립자, 방사성 동위원소 함유 화합물 및 리간드를 혼합하고 가열하여, 상기 금속 산화물의 미립자, 상기 방사성 동위원소의 양이온 및 상기 금속 산화물의 미립자, 상기 방사성 동위원소의 양이온을 연결하는 리간드 유래의 음이온을 포함하는 코어층을 형성하는 단계; 상기 코어층 위에 양전하성 고분자를 포함하는 제1 쉘층을 형성하는 단계; 상기 제1 쉘층 위에 중성 전하를 띠는 제2 쉘층을 형성하는 단계;를 포함하는, 나노입자의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 분자 영상 진단을 위한 나노입자 및 그 제조방법에 따르면, 나노입자에 방사성 동위원소를 안정적으로 도입하고 나노입자의 표면 전하 제어를 통해 생체 내 안정성을 높임으로써, 나노입자의 생체 내 축적을 방지하고 나노입자가 효과적으로 암세포에 도달할 수 있도록 하며, 동시에 나노입자의 생체 내 거동을 정확히 추적할 수 있는 분자 영상 진단을 위한 조영제를 제공할 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시형태에 따른 분자 영상 진단을 위한 나노입자의 제조방법을 나타낸 개략도이다.
도 2a 및 도 2b는 각각 제조예 1 및 비교 제조예 2에 따른 나노입자의 TEM 이미지를 나타낸 도시이다.
도 2c 및 도 2d는 각각 제조예 1 및 비교 제조예 2에 따른 나노입자의 IR 스펙트럼을 나타낸 도시이다.
도 3a는 제조예 1, 비교 제조예 1 및 비교 제조예 2에 따른 나노입자의 유체역학적 직경(hydrodynamic diameter)를 나타낸 도시이다.
도 3b는 제조예 1, 비교 제조예 1 및 비교 제조예 2에 따른 나노입자의 제타 전위(zeta potential)를 나타낸 도시이다.
도 4는 89zr 방사성 동위원소를 함유한 산화철 나노입자의 제조 후 89zr 방사성 동위원소의 표지율을 나타낸 도시이다.
도 5는 제조예 1, 비교 제조예 1 및 비교 제조예 2에 따른 나노입자의 암 세포 근처의 혈관에서의 거동을 나타낸 도시이다.
도 6a는 제조예 1, 비교 제조예 1 및 비교 제조예 2에 따른 나노입자의 각기 다른 용액에서의 유체역학적 직경을 나타낸 도시이다.
도 6b는 제조예 1, 비교 제조예 1 및 비교 제조예 2에 따른 나노입자의 혈청에서 방사성 동위원소 표지 안정성을 나타낸 도시이다.
도 7a는 제조예 1, 비교 제조예 1 및 비교 제조예 2에 따른 나노입자의 혈청 단백질과의 상호작용을 나타낸 도시이다.
도 7b는 제조예 1, 비교 제조예 1 및 비교 제조예 2에 따른 나노입자의 혈청 수용액에서 SDS-PAGE 결과를 나타낸 도시이다.
도 8a 내지 도 8c는 제조예 1, 비교 제조예 1 및 비교 제조예 2에 따른 나노입자의 세포 내화율을 나타낸 도시이다.
도 9a 내지 도 9c는 제조예 1, 비교 제조예 1 및 비교 제조예 2에 따른 나노입자의 생체 내 거동에 따른 PET 이미지를 나타낸 도시이다.
도 10은 제조예 1, 비교 제조예 1 및 비교 제조예 2에 따른 나노입자의 간, 비장, 종양에서의 ROI 값을 나타낸 도시이다.
도 11a 내지 도 11c는 제조예 1, 비교 제조예 1 및 비교 제조예 2에 따른 나노입자를 생체 내 주입한 후 일정 시간 경과 후의 생체 내 분포를 나타낸 도시이다.
도 11d는 제조예 1, 비교 제조예 1 및 비교 제조예 2에 따른 나노입자의 근육에 대한 종양 비율을 나타낸 도시이다.
도 11e는 제조예 1, 비교 제조예 1 및 비교 제조예 2에 따른 나노입자의 시간 경과에 따른 혈액에서의 그램 당 주입량(ID/g %) 비율을 나타낸 도시이다.
도 11f는 제조예 1, 비교 제조예 1 및 비교 제조예 2에 따른 나노입자의 정맥 주사 이후 96 시간 이후 추출한 폐, 간, 비장 및 종양의 PET 이미지를 나타낸 도시이다.
이하, 첨부한 도면을 참고로 하여 본 발명인 분자 영상 진단을 위한 나노입자 및 그 제조방법에 대해 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 상세히 설명한다.
본 발명의 일 실시형태에 따른 분자 영상 진단을 위한 나노입자는 음의 표면전하를 가지는 금속 산화물의 미립자, 방사성 동위원소의 양이온 및 상기 금속 산화물의 미립자와 상기 방사성 동위원소의 양이온을 연결하는 리간드 유래의 음이온을 포함하는 코어층; 상기 코어층 위에 배치된, 양전하성 고분자를 포함하는 제1 쉘층; 및 상기 제1 쉘층 위에 배치된, 중성 전하를 띠는 제2 쉘층;을 포함하는, 나노입자를 제공한다.
나노입자는 일반적으로 원자보다 크고 세포보다 작은 크기로서 지름이 1-100 nm 사이의 입자로서, 전자 전이에 필요한 에너지가 물질의 크기에 따라 변화되는 양자크기 제한현상(quantum confinement effect) 및 넓은 비표면적으로 인하여 벌크 상태의 물질과는 전혀 다른 강도, 촉매활성, 광학적, 전기적, 자기적 특성을 나타낼 수 있다.
나노 물질은 다음과 같은 장점들로 인하여, 분자 영상 진단에 활용될 수 있다. 첫번째로, 입자의 크기 조절 및 다양한 조성을 가진 나노입자의 제조가 가능하기 때문에 모든 분자 영상 진단에 사용될 수 있다. 두번째로 여러 특성이 혼합된 하이브리드 분자 영상을 위한 프로브의 경우, 대부분 나노 물질이 지닌 고유의 다기능적 특성으로 인하여 개발하기가 쉽다는 장점이 있다. 세번째로 용도별 맞춤 합성을 통해 준비된 나노 물질은, 이를 활용한 영상 추적자 또는 리간드가 도입된 경우에, 체내에서의 약물동력학과 같은 중요한 매개변수를 미세하게 조정할 수 있다는 것이다.
분자 영상 진단에 나노입자를 활용하기 위해서는 나노입자가 생체 내에서 안정적으로 존재할 수 있어야 하는데, 나노입자의 생체 내 거동은 입자 크기, 모양 및 표면 전하에 의해서 달라질 수 있다.
나노입자의 크기는 분자 진단 영상에 나노입자가 활용됨에 있어 중요한 요소 중 하나인데, 일반적으로 200㎚ 이상의 나노입자는 세망내피계(RES)에 의해 주로 간, 비장, 폐 등에 축적되고, 200㎚ 보다 작은 사이즈의 나노입자는 투과 및 체류 증진 효과(EPR)에 기초하여 맥관 구조를 통해 더 오랫동안 순환하며 종양이 있는 곳에 머무를 수 있다. EPR 효과란, 비정상적으로 빠른 성장속도를 가진 암조직으로 인해 조직 주변의 혈관구조가 성기게 구성되어 나노입자가 잘 축적될 수 있는 환경이 조성되는 동시에, 조직의 유체가 잘 빠져나갈 수 있게 하여 체액의 순환이 잘 일어나도록 하는 림프관이 제대로 형성되지 않아, 한번 축적된 나노입자들이 조직내에서부터 쉽게 빠져나가지 못하게 될 때 나타나는 현상을 의미할 수 있다.
나노입자의 모양 역시 생체 내 분산, 혈액 체류 시간, 세포막 흡수 등에 영향을 미칠 수 있다. 막대 형상 또는 타원형과 같은 길게 늘어진 형태의 나노입자는 구형의 나노입자보다 암세포에 의한 섭취 효율이 더 높을 수 있다.
나노입자의 표면 전하, 소수성 등의 표면 특성 역시 나노입자의 생체 내 거동에 있어서 중요한 역할을 할 수 있다. 음전하 또는 양전하가 강하게 나타나는 나노입자의 경우 생체 내 단백질과의 정전기적 인력으로 응집되어 수력학적 크기가 증가하게 되고, 대식세포에 의해 간으로 이동하게 되며 축적되는 문제가 있을 수 있다.
본 발명에 따른 분자 영상 진단용 나노입자는 음의 표면전하를 가지는 금속 산화물의 미립자를 포함할 수 있고, 상기 금속 산화물은 산화철(Ⅲ)(Fe2O3), 이산화규소(SiO2), 이산화티탄(TiO2), 산화알루미늄(Al2O3), 산화아연(ZnO), 산화세륨(CeO2) 및 산화지르코늄(ZrO2)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 1종을 포함하는 것일 수 있다. 예를 들어 상기 분자 영상 진단용 나노입자는 산화철(Ⅲ) 미립자를 포함할 수 있다.
일반적으로 생체 내에 존재하는 전이 금속인 철 원자는 산소 원자와 반응하여 산화철을 형성할 수 있다. 상기 산화철(Ⅲ)은 무독성이고 쉽게 합성할 수 있는 것으로 알려져 있다. 또한, 산화철(Ⅲ) 미립자를 포함하는 나노입자는 표면에 존재하는 산소 원자에 의해서 생체 내 환경에서 음전하성일 수 있다.
산화철은 철 원자와 산소 원자 사이의 위치에 기초하여 적철석(α-Fe2O3), 마그헤마이트(γ-Fe2O3) 및 자철석으로 분류될 수 있다. 그 중에서 적철석 나노입자는 촉매, 약물 전달 등에 널리 사용되고 있다. 또한, 적철석 나노입자는 생물학적 환경에서 매우 안정하면서도 다양한 형태로 용이하게 합성될 수 있다.
한편, 방사성 동위원소의 고감도, 고투과력 등의 우수한 특성을 활용하여 생체 내에서의 미세한 변화에 대한 관찰 및 분석이 가능하므로, 나노입자를 방사성 동위원소로 표지하여 분자 진단 영상에 활용할 수 있다. 구체적으로, 방사성 동위원소로 표지된 나노입자를 체내에 투여하여 조직이나 병소에 따라 차별적으로 방출되는 방사선량을 검출기로 측정 및 영상화하여 종양의 위치를 찾아내거나 종양의 체내 분포를 정확하고 정량적으로 평가 할뿐만 아니라, 생체 내에서 일어나는 생물학적 현상에 대한 정보를 제공할 수 있다.
이는 방사성 물질이 체내에서 조직이나 병소의 특성에 따라 차별적으로 분포하는 성질을 이용하는 것으로, 생체 내부의 방사성 동위원소가 표지된 나노입자의 분포를 비침습적이면서도 실시간으로 영상을 얻을 수 있다.
나노입자를 방사성 동위원소로 표지하는 방법으로는 두개 이상의 작용기를 가진 킬레이트를 활용하는 방법이 기존에는 주로 사용되었다. 그러나 킬레이트를 활용하는 표지법은 나노입자의 표면 특성에 영향을 주는 문제가 있을 수 있다. 즉, 생체 내 환경에서 나노입자에 결합된 킬레이트에 의해 나노입자 크기, 입자 표면 전하, 입자의 소수성 등이 변화될 수 있고, 이에 따라 생체 내 안정성이 낮아질 수 있다.
이러한 측면에서 분자 영상 진단을 위한 나노입자에 방사성 동위원소를 효과적으로 연결하거나 결합하기 위해 리간드를 사용할 수 있다. 즉. 킬레이트를 사용하지 않고 나노입자에 방사성 동위원소를 표지함으로써 나노입자의 표면 특성을 변형시키는 것과 같은 문제를 발생시키지 않아 분자 영상 진단에 있어서 유용하게 활용될 수 있다.
상기 리간드는 적어도 양 말단에 음이온성 관능기를 갖는 화합물을 포함하는 것일 수 있다. 상기 음이온성 관능기는 카복실기, 설페이트기, 인산기를 포함할 수 있고, 바람직하게는 카복실기일 수 있다.
상기 리간드는 L-글루탐산, 에틸렌디아민 N,N,N',N'-테트라아세트산(EDTA), 글루탐산-N,N-다이아세트산(GLDA), 메틸글리신다이아세트산(MGDA), 폴리아스파르트산(DS), 이미노다이숙신산(IDS), 다이하이드록시 에틸글리신(DHEG) 및 다이하이드록시에틸아스파르테이트(DHEA)로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나를 포함하는 것일 수 있고, 바람직하게는 L-글루탐산일 수 있다. L-글루탐산은 양쪽 말단에 두 개의 카르복실기를 통해 상기 음의 표면전하를 가지는 금속 산화물의 미립자와 방사성 동위원소를 연결해주는 역할을 할 수 있고, 이에 따라 방사성 동위원소의 표지율을 증가시키고 계층적 구조의 나노클러스터를 형성할 수 있다. 이에 따라 상기 나노클러스터에 대한 방사성 동위원소의 결합을 강화시킬 수 있다.
본 발명에 따른 분자 영상 진단용 나노입자는 방사성 동위원소의 양이온을 포함할 수 있는데, 상기 방사성 동위원소의 양이온은 89Zr, 124I, 64Cu, 67Cu, 68Ga, 86Y, 90Y, 99mTc, 111In, 177Lu, 및 188Re로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나를 포함하는 방사성 동위원소로부터 유래된 것일 수 있고, 바람직하게는 89Zr으로부터 유래된 것일 수 있다.
89Zr는 78.41시간의 긴 반감기 및 395.5 keV의 낮은 양전자 에너지를 가져 분자 영상 진단용 조영제로서 가장 촉망받는 방사성 동위원소 중 하나이다. 89Zr의 물리적 반감기는 양전자를 방출하는 다른 방사성 동위원소들보다 장기간의 분자 영상 진단에 더 적합할 수 있다. 특히 89Zr로부터 유래된 89Zr4+는 매우 강한 루이스 산이고 산소와 같은 강한 염기와 높은 결합력을 가져, 산소를 포함하는 금속 산화물 나노입자의 내부에 쉽게 결합할 수 있다.
본 발명에 따른 분자 영상 진단을 위한 나노입자는 음의 표면전하를 가지는 금속 산화물의 미립자, 방사성 동위원소의 양이온 및 상기 금속 산화물의 미립자와 상기 방사성 동위원소의 양이온을 연결하는 리간드 유래의 음이온을 포함하는 코어층을 포함하는데, 상기 코어층은 방사성 동위원소를 금속 산화물 나노입자에 결합시키기 위해 별도의 킬레이트를 필요로 하지 않아, 킬레이트를 활용하여 분자 영상 진단을 위한 나노입자에 방사성 동위원소를 도입하는 기술을 적용하는 경우 발생할 수 있는 문제를 피할 수 있고, 나노입자의 표면 특성을 유지하면서 방사성 동위원소를 나노입자에 표지할 수 있다. 따라서 생체 상기 나노입자의 거동 추적 및 정확한 암 진단이 가능할 수 있다.
한편, 생체 내에서 나노입자는 다양한 전해질 및 단백질에 의해 쉽게 응집 될 수 있다. 나노입자가 실제 생체 내 환경 예를 들어, 혈류, 조직 유체(interstitial fluid), 세포외 조직(extracellular matrix)에 노출될 경우, 단백질들이 나노입자 표면에 비특이적으로 흡착되면서, 나노입자의 실제 크기, 콜로이드 안정성, 표면 성질, 세포 내입 정도, 세포 내 분포, PK, 체내 조직 분포, 독성 등을 결정할 수 있다. 결국, 나노입자와 방사성 동위원소와 같은 표지 인자가 접합된 복합체의 경우 생체 내 단백질의 흡착으로 인해 나노입자의 표면 성질이 바뀌어 표적하는 암 세포에 도달하지 못하고 간이나 비장에 축적되는 등 표지 능력이 저해될 수 있다.
특히, 본 발명에 따른 분자 영상 진단을 위한 나노입자와 같이 음의 표면전하를 가지는 금속 산화물의 미립자를 포함하는 나노입자는 표면이 소수성이기 때문에 이를 용액 내 분산시키기 위해서는 친수화 과정이 필요하다. 또한, 생체 내 주입된 음의 표면전하를 가지는 금속 산화물의 미립자를 포함하는 나노입자는 대부분 폐, 간, 비장 등의 세망내피계에 의해 빠르게 탐식되어 혈액으로부터 제거되어 이들 기관에 축적됨으로써 조영제로서 기능을 하지 못할 수 있다. 따라서, 음의 표면전하를 가지는 금속 산화물의 미립자를 포함하는 나노입자가 상기 세망내피계에 의해 탐식되어 제거되는 정도를 감소시키기 위해서는 상기 나노입자의 표면의 개질이 중요한 인자라 할 수 있다.
따라서 음의 표면전하를 가지는 금속 산화물의 미립자, 방사성 동위원소의 양이온 및 상기 금속 산화물의 미립자와 상기 방사성 동위원소의 양이온을 연결하는 리간드 유래의 음이온을 포함하는 코어층위에 양전하성 고분자를 포함하는 제1 쉘층 및 상기 제1 쉘층 위에 배치된 중성 전하를 띠는 제2 쉘층을 형성함으로써 방사성 동위원소로 표지된 나노입자의 표면 특성을 중성에 가깝게 변화시킬 수 있고, 이에 따라 생체 내에서 상기 나노입자가 분산 안정성을 가질 수 있다.
상기 제1 쉘층의 양전하성 고분자는 분자 내에 적어도 하나 이상의 아미노 관능기 또는 암모늄 관능기를 포함하는 것일 수 있다. 아미노 관능기는 양성자와 결합하여 양전하를 띠는 양이온이 될 수 있고, 암모늄 관능기는 자체적으로 양이온을 띠고 있으며, 상기 아미노 관능기 또는 암모늄 관능기는 질소 원자가 가지고 있는 비공유 전자쌍 때문에 친핵체로 작용할 수 있다.
아미노 관능기 또는 암모늄 관능기를 포함함으로써 친수성 고분자의 특성을 가질 수 있고, 상기 제1 쉘층의 강한 양전하 표면은 막이 음전하를 띠는 세포 내부의 세포질에서 고도로 내재화(internalization)될 수 있다. 따라서 양전하성 고분자를 포함하는 제1 쉘층은 음의 표면전하를 가지는 금속 산화물의 미립자, 방사성 동위원소 및 상기 음의 표면전하를 가지는 금속 산화물의 미립자와 상기 방사성 동위원소의 양이온을 연결하는 리간드 유래의 음이온을 포함하는 코어층과 정전기적 상호작용에 의해 결합하여 이를 운반하는 역할을 할 수 있다.
또한, 상기 제1 쉘층은 상기 코어층의 표면에 제2 쉘층을 안정적으로 균일하게 형성하는 역할을 할 수 있다. 구체적으로, 상기 음의 표면전하를 가지는 금속 산화물의 미립자를 포함하는 코어층의 표면상에 제2 쉘층을 직접 형성할 수 없기 때문에 상기 코어층과 제2 쉘층 사이에 제1 쉘층을 형성함으로써 제2 쉘층의 상기 나노입자에 대한 결합력을 더욱 높일 수 있다.
상기 제1 쉘층의 양전하성 고분자는 폴리에틸렌이민(Poly(ethylenimine)), 키토산(Chitosan), 폴리L-라이신(Poly(L-lysine)), 폴리디알릴디메틸염화암모늄(Poly(diallyldimethyl ammonium chloride)), 폴리알릴아민(Poly(allylamine)), 폴리오르니틴(Poly-ornithine), 폴리비닐아민염산염(Poly(vinylamine)hydrochloride), 폴리2-디메틸아미노에틸메탈크릴레이트(Poly(2-(dimethylamino)ethyl methacrylate)), 폴리아미도아민(Poly(amido amine)) 및 젤라틴(Gelatin)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나를 포함하는 것일 수 있다.
상기 제2 쉘층은 수소결합을 형성할 수 있는 고분자를 포함하는 것일 수 있다. 상기 수소결합을 형성할 수 있는 고분자는 분자 내에 카보닐기, 아미드기, 에스터기 및 니트릴기로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나를 포함하는 것일 수 있다. 이에 따라 상기 제2 쉘층은 정전기적 상호작용과 수소 결합에 의해 상기 제1 쉘층과 결합할 수 있다. 상기 음전하를 가지는 코어층 및 양전하를 가지는 제1 쉘층을 포함하는 나노입자에 제2 쉘층을 더 포함함으로써 상기 나노입자는 중성 전하를 가질 수 있다. 상기 나노입자가 중성 전하를 가짐으로써 생체 내 혈청 단백질과의 상호작용을 억제하여 나노입자 표면 특성이 유지되는 효과를 가질 수 있다.
상기 수소결합을 형성할 수 있는 고분자는 구체적으로, 폴리비닐피롤리돈(PVP), 폴리메틸메타크릴레이트(PMMA), 폴리카프로락톤(PCL), 폴리아크릴로니트릴(PAN)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나를 포함하는 것일 수 있고, 바람직하게는 폴리비닐피롤리돈(PVP)일 수 있다.
PVP는 범용 고분자 중의 하나로 PVP의 단량체는 카보닐기와 삼차 아민기가 이웃한 삼차 아미드 작용기를 가지고 있으며, 생체 친화적이다. PVP는 상기 카보닐기와 삼차 아미드 작용기로 인해 매우 친수성이며, 생체 내에서 혈액 단백질과의 상호작용 및 혈액 단백질의 나노입자로의 접근을 방해할 수 있다. PVP는 피롤리돈 고리에 있는 카보닐기를 통해 상기 제1 쉘층에 물리적으로 코팅될 수 있다.
상기 분자 영상 진단용 나노입자의 평균 직경(D50)은 180 내지 210 ㎚인 것일 수 있고, 바람직하게는 185 내지 200㎚, 더 바람직하게는 188 내지 195 ㎚인 것일 수 있다. 상기 분자 영상 진단용 나노입자의 평균 직경(D50)은 유체역학적 직경(hydrodynamic diameter)을 의미하는 것일 수 있고, 구체적으로 나노입자 자체의 직경에 더해 나노입자 표면에 흡착된 분자층의 두께 및 나노입자와 함께 움직이는 반대이온을 포함하는 용매화 층(solvation layer)의 두께를 포함하는 지름을 의미할 수 있다. 상기 분자 영상 진단용 나노입자의 평균 직경(D50)이 상기 수치범위 내의 값을 가지는 경우, 나노입자의 체내 응집이 억제되어 정상장기에 축적될 가능성이 낮아지고, 나노입자가 신장으로 빠르게 이동하여 소변을 통해 제외로 배출되는 효과를 가진다. 한편, 상기 나노입자의 평균 직경이 상기 수치범위의 상한치를 초과하는 경우 상기 나노입자가 세망내피계(RES)에 의해 주로 간, 비장, 폐 등에 축적되는 문제가 있을 수 있다.
상기 분자 영상 진단용 나노입자의 제타 전위는 0 내지 0.2mV인 것일 수 있고, 바람직하게는 0.1 내지 0.16mV인 것일 수 있다. 분자 영상 진단용 나노입자의 제타 전위가 상기 수치범위 내의 값을 가지는 경우, 상기 나노입자가 중성에 가까운 전하를 가져 생체 내에서 혈청 단백질과의 결합을 방해하여 표면 특성의 변화 없이 암 표적 효율을 높일 수 있다.
본 발명의 다른 일 실시형태에 따른 분자 영상 진단을 위한 나노입자의 제조방법은 음의 표면전하를 가지는 금속 산화물의 미립자, 방사성 동위원소 함유 화합물 및 리간드를 혼합하고 가열하여, 상기 금속 산화물의 미립자, 상기 방사성 동위원소의 양이온 및 상기 금속 산화물의 미립자와 상기 방사성 동위원소의 양이온을 연결하는 리간드 유래의 음이온을 포함하는 코어층을 형성하는 단계; 상기 코어층 위에 양전하성 고분자를 포함하는 제1 쉘층을 형성하는 단계; 상기 제1 쉘층 위에 중성 전하를 띠는 제2 쉘층을 형성하는 단계;를 포함하는, 나노입자의 제조방법을 제공한다.
상기 코어층 형성 단계에서 pH는 중성으로 조절되어 수행되는 것일 수 있고, 바람직하게는 pH 5 내지 pH 8, 더 바람직하게는 pH 6 내지 pH 8에서 수행되는 것일 수 있다. pH가 중성인 조건하에서 코어층을 형성함으로써 나노입자에 대한 방사성 동위원소의 표지율을 높일 수 있다. 한편, 상기 코어층 형성 단계에서의 가열은 120 내지 160℃에서 22 내지 26시간 동안 수행되는 것일 수 있다.
상기 제1 쉘층은 상기 코어층과의 정전기적 상호작용에 의해 형성되는 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 코어층은 음의 표면전하를 가지는 금속 산화물의 미립자의 산소 원자에 의해 음전하를 띠며, 상기 제1 쉘층은 분자 내에 적어도 하나 이상의 아미노 관능기 또는 암모늄 관능기를 포함하는 양전하성 고분자를 가져 양전하를 띠는 바, 상기 코어층과 상기 제1 쉘층은 정전기적 상호작용에 의해 결합되는 것일 수 있다.
한편, 상기 제2 쉘층은 상기 제1 쉘층과의 정전기적 상호작용 및 수소결합에 의해 형성되는 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 제2 쉘층의 음전하를 띠는 작용기, 예를 들어 카보닐기의 산소 원자가 양전하를 띠는 제1 쉘층과 정전기적 인력으로 결합할 수 있고, 이와 동시에 제1 쉘층에 포함된 아미노 관능기 또는 암모늄 관능기의 수소 원자와 제2 쉘층에 포함된 작용기, 즉 카보닐기, 아미드기, 에스터기 및 니트릴기로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 작용기의 산소 원자 간의 수소결합으로 인해 상기 제2 쉘층이 상기 제1 쉘층에 더욱 견고히 결합되는 것일 수 있다.
이하, 실시예를 통해 본 발명을 보다 구체적으로 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명의 이해를 돕기 위한 것일 뿐 어떠한 의미로든 본 발명의 범위가 이들 실시예로 한정되는 것은 아니다.
<제조예 1> 제1 쉘층(PEI) 및 제2 쉘층(PVP)으로 코팅된 분자 영상 진단용 나노입자의 제조
나노입자의 코어층은 산화철 나노입자를 기본으로, 방사성 동위원소인 89Zr을 도입한 산화철 나노입자(89Zr-IONC)를 열수반응을 이용하여 제조하였다.
먼저, 0.2M의 염화철(FeCl3) 수용액 20㎕와 0.02M의 L-글루탐산 수용액 200㎕를 혼합하였다. 이후 트리에틸아민(TEA)를 첨가하여 혼합 용액의 pH를 7로 조정한다. 그 다음, 상기 혼합 용액에 5 밀리퀴리(mCi)의 89ZrCl를 첨가함과 동시에 0.1M Na2CO3를 첨가하여 pH를 7로 맞췄다. 상기 89Zr를 함유한 혼합 용액을 30분 동안 섞은 다음, 테플론 라이닝 스테인리스 스틸 열수 반응기로 상기 혼합 용액을 옮기고 밀봉한다. 140℃에서 24 시간 동안 가열 후 다시 상온에서 냉각시킨다. 적갈색 침전물을 포함하는 용액을 13000rpm에서 3회 원심분리하여 정제하여 89Zr-IONC을 얻었다. 침전물(89Zr-IONC)은 희석수에 재분산시킨다.
상기와 같이 준비된 89Zr-IONC는 음전하를 띠고 있기 때문에 양전하를 띠는 가지형 폴리에틸렌이민(branched PEI)으로 먼저 코팅층(제1 쉘층)을 형성하였다. PEI 용액(1g/㎖) 10㎕를 합성된 89Zr-IONC와 혼합하고, 열수 반응기를 이용하여 1000rmp에서 10분 동안 혼합 용액을 흔들었다. PEI가 코팅된 89Zr-IONC(89Zr-IONCs@PEI)는 10000rpm에서 5분동안 원심분리하는 과정을 3회 반복하여 정제하였다.
정제된 89Zr-IONCs@PEI는 다시 희석수 1㎖에 재분산시키고, 여기에 PVP 용액(50mg/㎖) 200㎕를 첨가하여 PEI 코팅층과의 정전기적 상호작용을 통해 추가적인 코팅층(제2 쉘층)이 형성되도록 하였다. 혼합 용액 내 과량의 PVP를 제거하기 위해 89Zr-IONCs@PEI와 PVP 수용액의 혼합물은 1000rpm에서 10분 동안 원심분리하여 혼합하였다. 마지막으로, PEI 코팅층 및 PVP 코팅층이 형성된 나노입자(89Zr-IONCs@ PVP)는 생리식염수(0.9% NaCl 포함)에 재분산되었다.
<비교 제조예 1> 코팅층을 포함하지 않는 분자 영상 진단용 나노입자의 준비
상기 제조예 1에서의 PEI 코팅층 및 PVP 코팅층이 형성되기 전의 89Zr-IONC을 준비하였다.
<비교 제조예 2> 제1 쉘층(PEI)으로 코팅된 분자 영상 진단용 나노입자의 제조
PVP 코팅층을 추가적으로 형성하지는 않는 것을 제외하고, 제조예 1과 동일한 방법으로 하여서, PEI 코팅층(제1 쉘층)만 포함하는 89Zr-IONCs@PEI를 제조하였다.
<실시예 1> 제조예 1 및 비교 제조예 2에 따른 나노입자의 TEM 이미지
도 2a 및 도 2b는 각각 제조예 1 및 비교 제조예 2에 따른 나노입자의 TEM 이미지를, 도 2c 및 도 2d는 각각 제조예 1 및 비교 제조예 2에 따른 나노입자의 IR 스펙트럼을 나타낸다. IR 분석은 Bruker instrument를 통해 이루어졌다.
도 2a에는 제조예 1에 따른 나노입자(89Zr-IONCs@ PVP)가 PEI로 코팅된 나노입자가 다시 PVP로 완전히 덮여있는 형태로 되어 있음을 확인할 수 있다. 도 2c에는 89Zr-IONCs@ PVP의 IR 스펙트럼이 나타나 있는데, 1260, 1340 및 1650 ㎝-1 에서 피크를 보이고 있다. 이는 PVP의 C-C, C-N 및 C=O 관능기에 대한 것으로 PVP 코팅층으로 제2 쉘층이 형성되었음을 의미한다.
도 2b를 보면 89Zr-IONC이 PEI로 코팅되어 제1 쉘층을 형성한 모습을 확인할 수 있고, 도 2d를 보면 비교 제조예 2에 따른 나노입자(89Zr-IONCs@PEI)의 IR 스펙트럼은 2500 ㎝-1 부터 3000 ㎝-1 까지 NH2 피크를 나타냈는데, 이는 PEI가 나노입자에 결합됨으로써 발생한 것이다.
<실시예 2> 제조예 1, 비교 제조예 1 및 비교 제조예 2에 따른 나노입자의 유체역학적 직경 및 표면 전하의 측정
제조예 1, 비교 제조예 1 및 비교 제조예 2에 따른 나노입자를 각각 증류수에 분산시키고 Zeta nanosizer instrument (ZS-90, Malvern)를 통해 유체역학적 직경 및 표면 전하를 측정하였다.
도 3a를 보면, 비교 제조예 1에 따른 나노입자(89Zr-IONC)의 유체역학적 직경은 140㎚, 비교 제조예 2에 따른 나노입자(89Zr-IONCs@PEI)는 172㎚를 보였다.
한편, 도 3b를 보면 89Zr-IONC의 표면 제타 전위는 -42 mV, 89Zr-IONCs@PEI의 표면 제타 전위는 18 mV임을 확인할 수 있다.
한편, 제조예 1에 따른 나노입자(89Zr-IONCs@PVP)의 경우는 유체역학적 직경이 191㎚, 표면 제타 전위는 중성 전하에 가까운 0.13 mV로 증가함을 확인할 수 있었다.
<실시예 3> 나노입자에 대한 방사성 동위원소의 표지율 측정
나노입자에 대한 방사성 동위원소의 표지율을 측정하기 위해, 비교 제조예 1에 따른 나노입자(89Zr-IONC)에 대해 50mM DTPA 전개용매를 사용하여 방사능 박층 크로마토그래피(Radio-TLC)를 수행하였다.
도 4를 보면, 89Zr-IONC에서의 89Zr 표지율은 90% 이상으로 나타났다. 이는 89Zr가 산소 친화적 금속 양이온이자 루이스 강산이 되어 산화철 나노입자의 산소 원자에 쉽게 결합하기 때문인 것으로 추측된다.
<실시예 4> 나노입자의 생물학적 환경에서의 콜로이드 안정성 측정
제조예 1, 비교 제조예 1 및 비교 제조예 2에 따른 나노입자를 물, 인산 완충 생리식염수(PBS), 세포 배양액 및 혈청에 37℃에서 7일동안 담근 후 DLS를 이용하여 유체역학적 직경을 측정하여 다양한 생물학적 환경에서의 콜로이드 안정성을 확인하였다(도 6a).
물과 세포 배양액에서는 모든 나노입자들은 안정하였고 각 입자의 유체역학적 직경이 200㎚ 이하로 유지된 반면, 코팅이 없는 비교 제조예 1의 나노입자(89Zr-IONC)는 PBS 및 혈청 용액에서 그 직경이 각각 689㎚ 및 1183㎚으로 증가하였다. 89Zr-IONC이 PBS 및 혈청 용액에서 응집하는 경향은 염분 및 생체 내 물질이 나노입자와 강한 상호작용을 하기 때문이다.
반면, 코팅된 나노입자들(89Zr-IONCs@PEI 및 89Zr-IONCs@PVP)은 PBS 및 혈청 용액에서 구조적 특성과 정전기적 반발에 의해 그 유체역학적 직경을 유지하였다. 결과적으로 PEI 및 PVP가 혈액 순환을 통한 나노입자의 분산 과정에서 콜로이드 안정성에 대한 우수한 효과를 발휘함을 알 수 있다. 즉, PEI 및 PVP 코팅이 염도가 높은 생물학적 환경에서도 산화철 나노입자의 응집을 막아주어 산화철 나노입자를 안정화시킬 수 있는 것이다.
또한, 제조예 1, 비교 제조예 1 및 비교 제조예 2에 따른 나노입자를 이틀 동안 혈청 용액에 담가두어 방사성 동위원소 표지 안정성을 측정한 결과를 도 6b에 나타내었다. 89Zr의 표지율은 95% 이상으로 나타났다. 89Zr는 산화철 나노입자의 코어층에 강력하게 결합되기 때문에 고분자를 사용한 표면층의 코팅에 영향을 받지 않는다. 따라서 산화철 기반의 나노입자는 생체 환경에서 상당히 안정적이다.
<실시예 5> 옵소닌작용의 체외(in vitro) 실험
SDS-PAGE 분석을 사용하여 나노입자의 표면이 혈청 단백질의 흡착에 어떻게 영향을 미치는지 체외(in vitro) 평가를 통해 실험하였다. SDS-PAGE 분석은 나노입자에 대한 단백질의 흡착을 정량화하기 위해 제조예 1, 비교 제조예 1, 비교 제조예 2에 따른 각 나노입자를 50%의 혈청 용액과 각각 혼합하여 37℃에서 24시간 동안 담가 두었다.
24시간 경과 후, 혈청 용액에 있는 나노입자를 원심분리하고, 나노입자에 흡착된 단백질을 정량 분석 및 정성 분석하기 위해 SDS-PAGE 분석을 수행하였다. 각 준비된 샘플 용액은 LDS 버퍼, 환원제 및 희석수에 용해시키고, 85℃로 2분 동안 가열하여 단백질을 변성시켰다.
탱크에 1배수 러닝 버퍼 및 4-12%의 비스-트리스 단백질 겔을 채웠다. 겔에 로딩된 단백질이 변성된 샘플은 전기영동(220V, 32분)에 의해 이동시켰다. 겔은 SimplyBlue SateStain (20 mL)로 염색했고 100 mL 물로 3회 세척하였다. 표시된 밴드는 iBrightCL1000 (Thermal Fisher Scientific)로 분석되었다.
도 7a 및 도 7b를 참고하면, 일부 혈장 단백질만이 표면 전하가 음전하인 비교 제조예 1에 따른 나노입자(89Zr-IONC)에 흡착된 반면, 양전하를 띠는 비교 제조예 2에 따른 나노입자(89Zr-IONCs@PEI)에는 다양한 혈장 단백질이 풍부하게 흡착되었다. 이는 대부분의 혈액내 단백질이 단백질을 구성하는 카복실기, 히드록시기 및 아미노기에 포함된 아미노산에 의해 전하를 가지기 때문에 나노입자의 혈액 순환 과정에서 나노입자의 높은 표면 전하와 상호작용하여 다양한 단백질을 끌어들일 수 있음을 나타낸다.
그러나 중성에 가까운 표면 전하를 가진 제조예 1에 따른 나노입자(89Zr-IONCs@PVP)의 경우는 혈장 단백질의 흡착이 현저하게 감소되었다. 카보닐기와 삼차 아미노기를 가져 고도로 친수성인 PVP의 화학적 구조는 혈액 단백질의 나노입자에 대한 접근 및 상호작용을 방해하기 때문이다. PVP 코팅은 나노입자의 혈액순환 과정에서 옵소닌작용을 피할 수 있는 가능성을 보여주었고 EPR 효과에 의해 우수한 암 표적 효과를 제공할 수 있다.
<실시예 6> 세포 내화의 체외(in vitro) 실험
표면 개질 상태에 따른 나노입자의 표적 세포 내화에 미치는 영향을 평가하기 위해 나노입자들에 대한 식세포작용이 일어난다고 알려진 CT-26(쥐 대장암 세포주)와 RAW 264.7(쥐 대식 세포주)에 대해 제조예 1, 비교 제조예 1 및 비교 제조예 2에 따른 나노입자들의 세포 내화에 대한 체외 실험을 진행하였다. 두 세포주 모두 일반 세포 배양과정으로 배양되었고 well당 1 Х 104 세포를 24 well 플레이트에서 24시간 동안 배양하였다.
DMEM 세포 배양액에 제조예 1, 비교 제조예 1, 비교 제조예 2에 따른 각 나노입자를 분산시켰다. 100 ㎕ 배양액 당 89Zr 5μCi 농도를 가진 각 샘플이 기 배양된 CT-26과 RAW 264.7에 첨가하고, 37℃에서 1, 2, 4, 24시간 동안 배양되었다. 각 시간 포인트 당 처리된 세포의 배양을 완료하였고, 세포에 내화되지 못한 나노입자들의 제거를 위해 배지를 소량 수집한 후에 나머지 배양액이 제거되었다. 세포는 저온의 PBS로 2회 세척한 후 트립신 처리하였고, 각 세포 수를 계산하였다. 부유하는 세포들은 1500rpm으로 3분 동안 원심분리하였고, 상층액은 제거하였다. pH 2에서 1M 시트르산 나트륨을 cell pellet에 첨가하고 15분 동안 상온에 두었다. 한번 더 원심분리를 수행하고 상층액을 제거하였다. 남은 펠릿은 0.5% 황산도데실 나트륨에 용해했고 gamma-counter를 사용하여 방사성을 측정하였다.
세포에 내화된 방사성 동위원소로 표지된 나노입자의 활동성은 다음 식을 통해 계산되었다.
[세포 내화율(%) = 마지막 단계 이후 용해된 cell pellet의 활동성 / 배양액에 담긴 처리된 세포의 전체 활동성 X 100]
도 8a에는 비교 제조예 1에 따른 나노입자(89Zr-IONC)의 경우의 세포 내화 경향을 보여주는데, 두 세포주 모두에서 4시간 내에 세포막으로 급격히 침투해들어가고 세포 내화율이 86%까지 지속해서 증가하는 비슷한 세포 내화 패턴을 나타냈다. 이는 표면에 음전하를 가진 89Zr-IONC가 암 세포 및 대식세포의 세포막과 강하게 상호작용함을 의미하는 것이다.
도 8b를 보면, 표면에 강한 양전하를 가진 비교 제조예 2에 따른 나노입자(89Zr-IONCs@PEI)도 두 세포주 모두에서 세포 내화를 보였다. 그러나 89Zr-IONC와는 달리 CT-26 암 세포주에서보다 대식 세포에서 더욱 많이 세포 내화가 진행되었다. 세포 내화의 패턴에 따르면 대식 세포는 표면 양전하에 더욱 반응성이 좋은 것으로 나타났다.
한편, 도 8c를 보면, 중성 표면 전하를 가진 제조예 1에 따른 나노입자(89Zr-IONCs@PVP)는 두 세포주에 대한 세포 내화 패턴이 완전히 바뀌었다. 즉, RAW 264.7 대식세포에서보다 CT-26 암 세포주에서 더욱 세포 내화되었다. 이는 PVP 코팅이 대식 세포의 섭식을 감소시키고 체내 옵소닌 작용을 피하는데 도움이 될 수 있음을 의미한다.
상기 결과는 강한 양전하 및 음의 표면 전하를 가지는 나노입자들은 대식 세포에 의해 세포 내화되는 경향을 보였고, 중성 표면 전하를 가지는 나노입자들은 식세포 작용과 관련한 단백질의 흡착을 방해하기 때문에 이러한 경향을 감소시킬 수 있음을 보여준다.
<실시예 7> PET 이미지를 통한 나노입자의 생체 내(in vivo) 거동 파악
방사성 동위원소가 표지된 나노입자의 생체 내 거동 파악을 위해 사용되는 실험용 쥐는 국내의 Orientbio로부터 공급받았다. CT-26 고형 종양 모델은 인산 완충 생리식염수(PBS)에 분산된 CT-26 세포 50 μL를 쥐의 오른쪽 허벅지에 주입함으로써 준비했다. 종양은 2주 동안 성장시켜 종양의 크기는 대략 50㎜까지 이르렀다. 꼬리에 있는 혈관을 통해 정맥 주사로 방사성 동위원소 표지된 제조예 1, 비교 제조예 1 및 비교 제조예 2에 따른 각 나노입자(50μCi/50μL in saline)를 주입하였고, 마취(GENISYS 4, SOFIE Bioscience) 후 초기, 2시간, 24시간, 96시간 이후마다 PET 이미지를 얻었다. 측정된 DICOM 이미지는 AMIDE 소프트웨어에 의해 얻어졌다.
89Zr을 나노입자에 도입하여 하루 이상 나노입자의 생체 내 거동을 PET 이미지를 통해 관찰하여 제조예 1, 비교 제조예 1, 비교 제조예 2에 따른 각 나노입자의 암 표적 효과 및 쥐 생체 내에서 어떻게 분산되는지를 확인하였다.
비교 제조예 1에 따른 나노입자(89Zr-IONC)는 음전하를 가지고 나노입자의 가장 바깥쪽 표면에 산소 원자가 분산되어 있는데, 도 9a를 보면, 89Zr-IONC을 정맥 주사한 이후 양전하를 가지는 혈액 단백질과 옵손화 작용에 의해 간과 비장에 즉시 도달하였고, 96 시간에 이르렀을 때 여전히 간에 머무르고 있었다.
비교 제조예 2에 따른 나노입자(89Zr-IONCs@PEI)는 표면이 구조상 암모늄 양이온을 많이 함유하여 양전하를 가지기 때문에 혈청에서 콜로이드상으로 안정하고 간과 비장에 흡수되는 경향이 있다(도 9b). 그러므로, 혈청에 포함된 음전하를 띤 단백질이 양전하를 띤 나노입자의 표면에 흡착되고 혈액 순환 과정에서 의도치 않게 간 제거가 일어날 수 있다.
89Zr-IONC과 비교하여 89Zr-IONCs@PEI이 더 많이 비장에 남아 있었다. 간에 축적된 일부 남아있는 나노입자는 간 혈관을 통해 비장으로 이동되었다. 그럼에도 간과 비장에 머무르는 시간이 긴 경향이 있었다.
제조예 1에 따른 나노입자(89Zr-IONCs@PVP)의 경우, 생체 내 거동이 완전히 바뀌었고, 간과 비장에서 흡수됨과 함께 암 영역에서 축적되었다. 24시간 후, 간 흡수는 감소하는데(도 9c), 이는 카보닐기와 삼차 아민을 포함하는 PVP의 화학 구조로 인해 표면 전하가 중성으로 바뀌기 때문이다. 따라서 주입된 혈액(89Zr-IONCs@PVP 단백질과 함께 옵소닌 작용하는 것은 PVP 코팅에 의해 감소한다.
PET 이미지를 통해 생체 내 안정성을 확인할 수 있다. 89Zr4+는 뼈에 축적되는 경향이 있으나, 비교 제조예 1 및 비교 제조예 2, 제조예 1에 따른 나노입자는 생체 내 주입 후 뼈에서 어떠한 강도를 나타내지 않았고, 이는 89Zr가 산화철 나노입자에 강하게 결합되어 나노입자의 화학적 구조를 유지하며 체내 주입 후 장시간 분해되지 않는 것을 의미한다. 즉, 모든 나노입자의 표면의 생체 내 안정성은 우수하다.
주요한 RES 장기(간, 비장, 폐)와 종양에 대한 관심 영역(Region of Interest, ROI)은 비교 제조예 1(89Zr-IONC) 및 비교 제조예 2(89Zr-IONCs@PEI), 제조예 1에 따른 나노입자(89Zr-IONCs@PVP)에 대해 정량적으로 측정되었다(도 10). ROI 측정은 PET 이미지 측정 후, 의료용 영상 소프트웨어 프로그램 Amide를 이용하여 PET 이미지 상에서 각 나노입자가 축적된 장기나 측정하고자 하는 곳의 위상에 ROI 측정 범위를 설정하여 그 부분에 대한 표준 섭취계수를 측정함으로써 수행되었다.
89Zr-IONCs@PVP의 경우 간에서 흡수는 89Zr-IONC 및 89Zr-IONCs@PEI과 대비하여 상대적으로 감소하였고, 이는 PET 이미지와 일치하는 결과이다.
비장에서의 ROI 값을 보면 흡수 순서는 89Zr-IONCs@PVP, 89Zr-IONCs@PEI, 89Zr-IONC 순이었다. 89Zr-IONCs@PVP 또한 투여 후 간에서 비장으로 이동하였다. 89Zr-IONCs@PVP에서의 ROI 값은 감소하지 않았으나, 89Zr-IONCs@PEI 및 89Zr-IONC은 혈청 단백질의 흡착 또는 면역 시스템으로 인해 응집하게 된 결과, 증가된 입자 크기로 인해 간에 더욱 갇혀 있었다.
종양에 대한 ROI 값을 보면, 89Zr-IONCs@PVP은 다른 나노입자들보다 높은 흡수를 보여주고 혈액 순환 과정을 통해 종양이 있는 영역(2% 이상의 ROI)에 가장 먼저 도달한다.
따라서 PVP 코팅으로 인해 나노입자의 주입 후 세망내피계(RES)에서의 흡수를 피하면서 혈액 순환 시간의 증가 및 높은 종양 흡수를 기대할 수 있다. 89Zr-IONCs@PEI 및 89Zr-IONC은 혈액에 있는 면역 시스템에 의한 영향으로 종양이 있는 곳에 도달하지 못한다.
<실시예 8> 나노입자의 생체 내(in vivo) 분포
나노입자의 생체 내 분포를 파악하기 위해 실시예 7에서와 같이 방사성 동위원소로 표지된 제조예 1, 비교 제조예 1 및 비교 제조예 2에 따른 각 나노입자(50μCi/50μL in saline)를 CT-26 종양이 있는 쥐의 꼬리에 있는 혈관을 통해 정맥 주사로 주입하였다. 24 시간 경과 후, 방사성 동위원소로 표지된 각 나노입자를 주입한 쥐는 안락사하였고, 주요 장기(간, 비장, 폐)와 종양을 수집했다. 추출된 장기와 종양에서 각 나노입자에 의해 방출되는 방사능을 감마 계수기(gamma-counter, PerkinElmer)를 이용하여 측정하였다. 이후, 측정된 방사선 세기, 각 장기 또는 종양에 남아있는 나노입자 양 및 각 장기의 무게를 사용하여 장기 또는 종양의 무게당 잔존하는 나노입자의 양을 백분율로 계산하였다.
도 11a를 보면 비교 제조예 1에 따른 나노입자(89Zr-IONC)는 간, 비장, 폐에 대부분 분포되어 있었으나 종양에는 나타나지 않았음을 확인할 수 있다. 89Zr-IONC 의 폐에서의 흡수는 점차 감소하는 반면, 간에서의 흡수는 시간에 따라 증가함을 보였다.
도 11b에는 비교 제조예 1에 따른 나노입자(89Zr-IONCs@PEI)의 경우의 생체 내 분포를 나타냈다. 89Zr-IONCs@PEI는 간, 비장, 폐에 도달했고, 폐에서의 흡수는 점차 감소하는 반면, 간과 비장에서의 흡수는 96시간까지 증가하였다.
제조예 1에 따른 나노입자(89Zr-IONCs@PVP)는 주입 후 초기에는 간과 비장에 대부분 도달하였다(도 11c). 그러나 간에서의 흡수는 점차 감소하였고(57%에서 26% ID/g), 비교 제조예 1 및 비교 제조예 2의 나노입자의 경우와 달리 추가적인 흡수가 종양이 있는 곳에서 발생했다. 특히, 89Zr-IONCs@PVP 정맥 주사 1시간 경과 후 2.7 ID%/g의 종양 흡수가, 정맥 주사 24시간 경과 후 3.5 ID%/g가 관찰되었고, 96시간 경과할때까지 이 수치가 유지되었다.
나노입자의 생체 내 분포 결과를 통해, PVP 코팅으로 인해 나노입자는 표면에 중성 전하를 가지게 되고 이에 따라 혈청 단백질의 흡착을 최소화하면서 혈관을 이동하여 나노입자 고유의 특성을 유지할 수 있기 때문에 암 표적 효과와 더불어 간에서의 나노입자 흡수가 감소됨을 알 수 있다.
89Zr-IONCs@PVP의 높은 종양에서의 흡수는 89Zr-IONC 및 89Zr-IONCs@PEI과 대비한 근육 대비 종양 비율을 통해 명백히 나타나는데, 그 수치는 대략 14 정도의 차이를 보인다(도 11d).
89Zr-IONCs@PVP는 체내 주입 후 48 시간 경과 후에 89Zr-IONC 및 89Zr-IONCs@PEI의 경우보다 더 많이 혈액에 남아있게 된다(도 11e). 이는 PVP 코팅이 나노입자의 응집과 혈청 단백질 흡착을 방해하여 혈액 순환 과정에서 옵소닌 작용 또는 면역 시스템에 의한 대식작용을 지연시킬 수 있음을 의미한다.
각 나노입자의 정맥 주사 이후 96 시간 경과 후 주요 장기(간, 비장, 폐)와 종양을 추출하여 PET 이미지 촬영을 하여 전체 PET 생체 분포 이미지와의 상관관계를 확인하였다(도 11f).
89Zr-IONC는 주로 폐와 간에 축적되었고, 89Zr-IONCs@PEI는 폐, 간, 비장에 머물러 있었다. 그러나 89Zr-IONC 및 89Zr-IONCs@PEI 모두 종양에는 도달하지 못하였는데, 이는 면역 시스템에 의한 clearance 때문이다.
89Zr-IONCs@PVP는 주로 비장에 축적되었고, 폐와 간에 대한 체외 PET 이미지의 강도가 약한 것으로 보아 폐와 간으로부터 이동한 것으로 나타났다. 이와 동시에 정맥 주사 후 96시간 경과 후에도 종양에 89Zr-IONCs@PVP가 남아있는 것을 확인했다. 이는 PVP 코팅이 나노입자를 이용한 암 표적에 있어서 효과적인 물질임을 의미하는 결과이다.

Claims (20)

  1. 분자 영상 진단을 위한 나노입자로서,
    음의 표면전하를 가지는 금속 산화물의 미립자, 방사성 동위원소의 양이온 및 상기 금속 산화물의 미립자와 상기 방사성 동위원소의 양이온을 연결하는 리간드 유래의 음이온을 포함하는 음전하의 코어층;
    상기 코어층 위에 배치된, 양전하성 고분자를 포함하는 양전하의 제1 쉘층; 및
    상기 제1 쉘층 위에 배치된, 중성 전하를 띠는 제2 쉘층;
    을 포함하는, 나노입자.
  2. 청구항 1에 있어서,
    상기 금속 산화물은 산화철(Ⅲ)(Fe2O3), 이산화규소(SiO2), 이산화티탄(TiO2), 산화알루미늄(Al2O3), 산화아연(ZnO), 산화세륨(CeO2) 및 산화지르코늄(ZrO2)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 1종을 포함하는 것인, 나노입자.
  3. 청구항 1에 있어서,
    상기 방사성 동위원소는 124I, 64Cu, 67Cu, 68Ga, 86Y, 90Y, 89Zr, 99mTc, 111In, 177Lu, 및 188Re로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나를 포함하는 것인, 나노입자.
  4. 청구항 1에 있어서,
    상기 리간드는 적어도 양 말단에 음이온성 관능기를 갖는 화합물을 포함하는 것인, 나노입자.
  5. 청구항 1에 있어서,
    상기 리간드는 L-글루탐산, 에틸렌디아민 N,N,N',N'-테트라아세트산(EDTA), 글루탐산-N,N-다이아세트산(GLDA), 메틸글리신다이아세트산(MGDA), 폴리아스파르트산(DS), 이미노다이숙신산(IDS), 다이하이드록시 에틸글리신(DHEG) 및 다이하이드록시에틸아스파르테이트(DHEA)로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나를 포함하는 것인, 나노입자.
  6. 청구항 1에 있어서,
    상기 제1 쉘층의 양전하성 고분자는 분자 내에 적어도 하나 이상의 아미노 관능기 또는 암모늄 관능기를 포함하는 것인, 나노입자.
  7. 청구항 6에 있어서,
    상기 제1 쉘층의 양전하성 고분자는 폴리에틸렌이민(Poly(ethylenimine)), 키토산(Chitosan), 폴리L-라이신(Poly(L-lysine)), 폴리디알릴디메틸염화암모늄(Poly(diallyldimethyl ammonium chloride)), 폴리알릴아민(Poly(allylamine)), 폴리오르니틴(Poly-ornithine), 폴리비닐아민염산염(Poly(vinylamine)hydrochloride), 폴리2-디메틸아미노에틸메탈크릴레이트(Poly(2-(dimethylamino)ethyl methacrylate)), 폴리아미도아민(Poly(amido amine)) 및 젤라틴(Gelatin)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나를 포함하는 것인, 나노입자.
  8. 청구항 1에 있어서,
    상기 제2 쉘층은 수소결합을 형성할 수 있는 고분자를 포함하는 것인, 나노입자.
  9. 청구항 8에 있어서,
    상기 수소결합을 형성할 수 있는 고분자는 분자 내에 카보닐기, 아미드기, 에스터기 및 니트릴기로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나를 포함하는 것인, 나노입자.
  10. 청구항 8에 있어서,
    상기 수소결합을 형성할 수 있는 고분자는 폴리비닐피롤리돈(PVP), 폴리메틸메타크릴레이트(PMMA), 폴리카프로락톤(PCL), 폴리아크릴로니트릴(PAN)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나를 포함하는 것인, 나노입자.
  11. 청구항 1에 있어서,
    상기 나노입자의 평균 직경(D50)은 180 내지 210 ㎚인, 나노입자.
  12. 청구항 1에 있어서,
    상기 나노입자의 제타 전위는 0 내지 0.2mV인, 나노입자.
  13. 분자 영상 진단을 위한 나노입자의 제조방법으로서,
    음의 표면전하를 가지는 금속 산화물의 미립자, 방사성 동위원소 함유 화합물 및 리간드를 혼합하고 가열하여, 상기 금속 산화물의 미립자, 상기 방사성 동위원소의 양이온 및 상기 금속 산화물의 미립자와 상기 방사성 동위원소의 양이온을 연결하는 리간드 유래의 음이온을 포함하는 코어층을 형성하는 단계;
    상기 코어층 위에 양전하성 고분자를 포함하는 제1 쉘층을 형성하는 단계;
    상기 제1 쉘층 위에 중성 전하를 띠는 제2 쉘층을 형성하는 단계;
    를 포함하는, 나노입자의 제조방법.
  14. 청구항 13에 있어서,
    상기 코어층 형성 단계에서의 가열은 120 내지 160℃에서 22 내지 26시간 동안 수행되는 것인, 나노입자의 제조방법.
  15. 청구항 13에 있어서,
    상기 제1 쉘층은 상기 코어층과의 정전기적 상호작용에 의해 형성되고, 상기 제2 쉘층은 상기 제1 쉘층과의 정전기적 상호작용 및 수소결합에 의해 형성되는 것인, 나노입자의 제조방법.
  16. 청구항 13에 있어서,
    상기 제2 쉘층을 형성하는 단계는 상기 제1 쉘층이 형성된 코어층을 수소결합을 형성할 수 있는 고분자와 반응시켜 수행되는 것인, 나노입자의 제조방법.
  17. 청구항 13에 있어서,
    상기 방사성 동위원소는 124I, 64Cu, 67Cu, 68Ga, 86Y, 90Y, 89Zr, 99mTc, 111In, 177Lu, 및 188Re로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나를 포함하는 것인, 나노입자의 제조방법.
  18. 청구항 13에 있어서,
    상기 리간드는 적어도 양 말단에 음이온성 관능기를 갖는 화합물을 포함하는 것인, 나노입자의 제조방법.
  19. 청구항 13에 있어서,
    상기 리간드는 L-글루탐산, 에틸렌디아민 N,N,N',N'-테트라아세트산(EDTA), 글루탐산-N,N-다이아세트산(GLDA), 메틸글리신다이아세트산(MGDA), 폴리아스파르트산(DS), 이미노다이숙신산(IDS), 다이하이드록시 에틸글리신(DHEG) 및 다이하이드록시에틸아스파르테이트(DHEA)로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나를 포함하는 것인, 나노입자의 제조방법.
  20. 청구항 13에 있어서,
    상기 제1 쉘층의 양전하성 고분자는 분자 내에 적어도 하나 이상의 아미노 관능기 또는 암모늄 관능기를 포함하는 것인, 나노입자의 제조방법.
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