WO2008086881A1 - Gentechnisch modifizierte bakteriophagen, insbesondere zur bekämpfung von pathogenen prokaryonten bzw. ihrer pathologischen wirkung, sowie deren verwendung und herstellung - Google Patents

Gentechnisch modifizierte bakteriophagen, insbesondere zur bekämpfung von pathogenen prokaryonten bzw. ihrer pathologischen wirkung, sowie deren verwendung und herstellung Download PDF

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WO2008086881A1 PCT/EP2007/011409 EP2007011409W WO2008086881A1 WO 2008086881 A1 WO2008086881 A1 WO 2008086881A1 EP 2007011409 W EP2007011409 W EP 2007011409W WO 2008086881 A1 WO2008086881 A1 WO 2008086881A1
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prokaryotes
pathogenic
phages
bacteriophage
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Markus Von Nickisch-Rosenegk
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Fraunhofer-Gesellschaft zur Förderung der angewandten Forschung e.V.
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    • C12N2830/001—Vector systems having a special element relevant for transcription controllable enhancer/promoter combination
    • C12N2830/002—Vector systems having a special element relevant for transcription controllable enhancer/promoter combination inducible enhancer/promoter combination, e.g. hypoxia, iron, transcription factor

Definitions

  • the present invention relates to genetically modified bacteriophages and their use in a method to, by means of a viral superinfection, by these genetically modified bacteriophages and their Transkriptions 1/3. Expression products to block the pathogenic or toxic effects of phage-infected prokaryotic pathogens.
  • the invention relates in one aspect to the use of eukaryotic transcription factors in the form of artificial zinc finger proteins in prokaryotic cells.
  • Pathogenic proteins e.g., toxins
  • pathogenic proteins producing bacteria are of tremendous medical and veterinary importance.
  • Examples include Salmonella, Shigella or Escherichia coli as the cause of diseases such as STEC or EHEC.
  • STEC Salmonella
  • EHEC Escherichia coli
  • Common to all these pathogens is the fact that their pathological effect derives from a viral genome, a bacteriophage, which has integrated into the genome of these bacteria after infection of a prokaryote. This is called lysogeny. Only by this annealed phage the bacteria become pathogens by, triggered by certain external factors (eg stress), the phage or its genome separated again from the bacterial genome and new infectious phage particles are formed. This is the beginning of a phytic lytic form that exponentially multiplies by infecting other bacteria.
  • the Metabolites and the toxins they may contain which, strictly speaking, are bacteriophage proteins. Often, these phage proteins have a direct toxic or otherwise pathogenic effect on the host of the bacteria. These manifest in diseases such as EHEC (human), the edema disease (domestic pig) or the bacterial dysentery (human).
  • the phage genome can be present as a plasmid in the bacterial host.
  • the phage genome can be released from the plasmid by analogous effects to the above-described sequence by external influences (for example stress) and form infectious phage particles.
  • Hagens et al., Antimicrob. Agents Chemother. 2004, Vol. 48, pp. 3817-3822) disclose a genetically engineered Pf3 phage carrying the gene for the restriction endonuclease BglII to kill the pathogenic Pseudomonas host by irreparably cleaving the host DNA.
  • C2H2 (Cys2His2) zinc fingers are eukaryotic binding motifs that influence RNA synthesis, called transcription factors. Their binding capacity to double-stranded DNA in in vivo artificial systems (Human zinc fingers as building blocks in the construction of artificial transcription factors. (2003) Kwang-Hae Bae et al., Nature Biotechnology
  • This method described here is, in the view of the inventors, the first and probably best way to apply coding sequences for the subsequent control of the RNA synthesis of selected proteins of prokaryotes by zinc fingers in prokaryotic pathogens, even with the aid of transgenic bacteriophages.
  • the main goal of this approach is to control or block the RNA synthesis of selected proteins in prokaryotes
  • DNA level by artificial transcription factors by means of an artificial carrier in the form of genetically modified bacteriophages, which the underlying foreign DNA for the coding of RNA synthesis-controlling zinc finger into the cells, that is, a bacteriophage (zinc finger phage) transfected with artificial zinc finger-coding DNA, whose expressed Zingfinger peptide inhibits the RNA synthesis of certain, selected protein products (eg virulence factors in bacterial pathogens) due to its artificial, specific sequence the coding DNA binds, specifically inhibits.
  • a bacteriophage zinc finger phage
  • Zingfinger peptide inhibits the RNA synthesis of certain, selected protein products (eg virulence factors in bacterial pathogens) due to its artificial, specific sequence the coding DNA binds, specifically inhibits.
  • the approach presented here for controlling the pathogenic prokaryotic germs is based on the same principle, whereby the bacteria themselves first develop their pathogenic effect, namely by infection with bacteriophages.
  • the difference here (invention) is based on an artificial infection of the bacteria with genetically modified viruses.
  • the disease-causing system is quasi beaten with its own weapons ("beat it with its own game").
  • suitable genetically modified bacteriophages are used to infect the pathogenic prokaryotes.
  • These recombinant phages serve as vehicles to produce in the corresponding bacteria proteins or nucleic acids capable of blocking the cell-internal physiological cascades involved in the pathogenesis.
  • infectious bacteriophages eg, phiVIO, lambda, STX phages, other examples, see below
  • infectious bacteriophages are genetically engineered by introducing a non-naturally occurring gene or gene fragment into these phages such that they are functional after induction
  • proteins such as zinc finger peptides express, the transcription factors essential genes of the pathogenic bacteriophage or genes of phage replication or blocking the synthesis of toxins or other pathogenic proteins or the synthesis of precursor genes and / or auxiliary proteins, or blocking the bacterial transcription machinery that occupies the original pathogenicity phage prior to infection with the recombinant phage of the present invention for its viral processes.
  • non-naturally occurring gene or gene fragment includes a fully synthetically produced or artificial gene or gene fragment having a desired sequence, one from another organism, eg, another microorganism (eg, virus , Bacterium, yeast), gene or gene fragment, or a gene or gene fragment derived from the same or another organism, in particular microorganism, but modified by mutation.
  • another microorganism eg, virus , Bacterium, yeast
  • gene or gene fragment eg, virus , Bacterium, yeast
  • a large number of zinc finger peptides from a number of organisms are known in the art and their amino acid and coding DNA sequences are described in the literature and contained in generally accessible databases (eg WO 2006/103106).
  • these known sequences can be incorporated into the genome of the starting bacteriophage as such or in a modified form as desired, for example by site-specific mutagenesis or PCR mutagenesis or by ligation of fully synthetic complementary hybridizing oligonucleotide fragments. This modification can go as far as the production of completely artificial sequences (eg taking into account consensus sequences).
  • the sequences depend on the target sequences of the particular genes or promoters to which they are to bind, and are adapted for binding thereto.
  • One specific non-limiting zinc finger peptide for the present invention is given in the following example.
  • the zinc finger genes are "switched on” in a timely manner or are activated by the secondary products that arise directly or indirectly from viral activity.
  • all bacteriophages which are capable of carrying out an Iy-so-called development course, ie d. H. can integrate into the prokaryotic genome, and / or exist as a plasmid in the bacterial host.
  • Specific, non-limiting examples are lambda, phloI phage, STX phage, M13, PM2, phi ⁇ , Mac-1, SSV-I, PRD-I, fd coliphage, MS2 coliphage, Qbeta coliphage, phiX174 coliphage , T4 coliphage, T7 coliphage, acholeplasma phage, spiroplasma phage, thermoproteus phage.
  • prokaryotes with an integrated (or present as plasmid) bacterium come as target prokaryotes.
  • Teriophages in particular pathogenic proteins (eg toxins or iminine defense debilitating proteins) forming bacteria such as Salmonella, Shigella, Escherichia coli, Staphylococcus, Lactobacillus, Helicobacter, Camphylobacter, Streptococcus, Legionella, Listeria, Borrelia, Yersinia, Bacillus and Vibrio in question.
  • pathogenic proteins eg toxins or iminine defense debilitating proteins
  • Salmonella Shigella, Escherichia coli, Staphylococcus, Lactobacillus, Helicobacter, Camphylobacter, Streptococcus, Legionella, Listeria, Borrelia, Yersinia, Bacillus and Vibrio in question.
  • a specific, non-limiting example is Shigatoxin-producing E. coli.
  • the genetically modified bacteriophages according to the invention can be used for controlling pathogenic phage-infected prokaryotes.
  • the bacteriophages of the invention may be used in the preparation of a medicament for the treatment or prevention of a disease caused by pathogenic phage-infected prokaryotes in a human or other vertebrate, e.g. a mammal such as pig, cattle, horse, sheep, dog, cat, etc. or a bird such as chicken, duck, goose, turkey, etc. are used.
  • prokaryotes are those listed in the previous paragraph.
  • diseases caused by such pathogenic prokaryotes and which may be considered for therapeutic or prophylactic treatment using the engineered bacteriophages of the present invention include EHEC, bacterial dysentery, lime disease, legionnaire's disease, and gastric ulcer in humans and edema disease. Piglet soot and anthrax in animals.
  • Fig. 1 The following basic example and the corresponding schematic representation in Fig. 1 are only to illustrate the present invention and should not be limited thereto in any way.
  • the lambda phage was chosen here because it is well established as a genetic safety vector in transgenic form within molecular biology and the function of this system is well known in the art.
  • One way to intervene according to the former principle involves the preparation of a double-stranded DNA sequence (eg, hybridized, complementary synthetic oligonucleotides) encoding a zinc finger peptide that blocks the promoter of the bacterial recA gene, and a cI- Repressor analogue that blocks the viral promoters L and R (see FIG. 1).
  • a double-stranded DNA sequence eg, hybridized, complementary synthetic oligonucleotides
  • a zinc finger peptide that blocks the promoter of the bacterial recA gene
  • a cI- Repressor analogue that blocks the viral promoters L and R
  • the above-mentioned double-stranded DNA fragments each with an additional (be minus the phage genome) prefixed R- or L-promoter of the lambda phage, integrated into the viral genome.
  • the modified (artificial) genome according to the invention rests in lysogenic form in the genome of the bacterial host cell parallel to the pathogenicity-inducing phage genome.
  • the viral cI repressor on the L and R promoters is digested and thus transcription also started on the artificial genes of the recombinant phage, i. H. proteins are expressed that block both recA production and substitute the previously digested cI repressors.
  • the cascade triggering the lytic virus cycle is suppressed.
  • the consequences are a failure of the exponential proliferation of the pathogenic germs along with the absence of pathological concomitants, d. H. a disease.
  • a zinc finger protein which binds to the repressor sequence of the promoter for recA or the associated DNA sequence to be cloned is, for example, as follows: TAC TGT ATG AGC ATA CAG TAT (from EcoCyc database: binding domain of the recA repressor in the promoter region of the gene: Nuclear Acids Research 33: D334-7 2005) (SEQ ID NO: 1).
  • the corresponding zinc finger consists of 7 ligated C2H2 zinc finger peptides, each of which binds to a DNA triplet.
  • the following figure shows individual zinc finger peptides with their specific recognition motifs (bold, underlined) for the respective nucleic acid triplet of the DNA sequence as a ligated peptide with a contiguous amino acid sequence (one-letter code).
  • the amino acids ren X which are not part of the respective recognition sequences or Zinkf inger consensus sequences can be replaced without loss of function by other amino acids.
  • the amino acid Z represents a hydrophobic amino acid (L, I, V, M, F, Y, W, C).
  • NNNNNNNNNNN (SEQ ID NO: 3)
  • the erp genes are encoded on a prophage genome of Borrelia burgdorferi.
  • the expression products are found in borellias as membrane proteins. These can be the so-called.
  • Factor H binds, which inhibits the complement system (part of the immune system). This is the mechanism by which "disguises” Borrelia in the host organism and so an immune defense, i. ultimately a phagocytosis, withdraws. Blocking the expression of the erp genes would make the pathogens in the host organism accessible to the immune system again and could be removed from the system by the body's own mechanisms.
  • Zinc finger is needed, which attaches to the DNA in the promoter region of the erp genes and thus prevents the polymerase from transcribing corresponding mRNA.
  • the as attachment regis- selected genomic DNA sequence for the specific zinc finger used herein is an 18 base pair fragment:
  • amino acids which are not part of the respective recognition sequences or zinc finger consensus sequences, can also be replaced by other amino acids without loss of function.
  • nucleic acid sequence e.g. as a 531 base pair fragment as follows:
  • the borellia-specific phage phiBB-1 is used.

Abstract

Die Erfindung betrifft gentechnisch veränderte Bakteriophagen, die für Zinkfingerproteine kodierende DNA enthalten, und deren Verwendung in einem Verfahren, um, mit Hilfe einer viralen Superinfektion, durch diese gentechnisch veränderten Bakteriophagen und deren Transkriptions- bzw. Expressions- produkte die pathogene bzw. toxische Wirkung von Phagen infizierten prokaryontischen Krankheitserregern zu blockieren.

Description

Gentechnisch modifizierte Bakteriophagen, insbesondere zur Bekämpfung von pathogenen Prokaryonten bzw. ihrer pathologi- sehen Wirkung, sowie deren Verwendung und Herstellung
Hintergrund der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft gentechnisch veränderte Bakteriophagen und deren Verwendung in einem Verfahren, um, mit Hilfe einer viralen Superinfektion, durch diese gentechnisch veränderten Bakteriophagen und deren Transkriptionsbzw. Expressionsprodukte die pathogene bzw. toxische Wirkung von Phagen-infizierten prokaryontischen Krankheitserregern zu blockieren. Die Erfindung betrifft in einem Aspekt die Ver- wendung von eukaryontischen Transkriptionsfaktoren in Form von artifiziellen Zinkfingerproteinen in prokaryontischen Zellen.
Pathogene Proteine (z.B. Toxine) bildende Bakterien sind von enormer medizinischer und veterinärmedizinischer Bedeutung.
Als Beispiele seien hier Salmonellen, Shigellen oder Escherichia coli als Verursacher von Krankheiten wie STEC oder EHEC genannt. All diesen Erregern gemein ist die Tatsache, dass ihre pathologische Wirkung von einem Virusgenom, einem Bak- teriophagen herührt, der sich nach einer Infektion eines Prokaryonten in das Genom dieser Bakterien integriert hat. Dies wird als Lysogenie bezeichnet. Erst durch diesen getemperten Phagen werden die Bakterien zu Krankheitserregern, indem, ausgelöst durch bestimmte äußere Faktoren (z. B. Stress), der Phage bzw. dessen Genom sich wieder aus dem Bakteriengenom separiert und neue infektiöse Phagenpartikel gebildet werden. Dies ist der Beginn einer lytischen Form des Phagen, der sich so, über die Infektion weiterer Bakterien, exponenziell vermehrt. Ebenso vermehren sich während dieses Geschehens die Stoffwechselprodukte und die darin eventuell enthaltenen Toxine, die, streng genommen, Proteine des Bakteriophagen sind. Oft besitzen diese Phagenproteine eine direkte toxische oder anderweitig pathogene Wirkung auf den Wirt der Bakterien. Diese manifestieren sich in Krankheiten wie beispielsweise EHEC (Mensch) , der Ödemkrankheit (Hausschwein) oder der Bakterienruhr (Mensch) .
Alternativ oder zusätzlich zu der oben beschriebenen Integra- tion des Phagengenoms in das bakterielle Genom ist es auch möglich, dass das Phagengenom als Plasmid im bakteriellen Wirt vorliegt. Auch hier kann das Phagengenom analog zum oben geschilderten Ablauf durch äußere Einflüsse (z.B. Stress) aus dem Plasmid freigesetzt werden und infektiöse Phagenpartikel bilden.
Schon früh nach der Entdeckung der Bakteriophagen durch F. Tword (1915) bzw. F. H. d'Herelle (1917) wurden Ansätze verfolgt, mit Hilfe solcher Bakteriophagen bakteriellen Erkran- kungen entgegen zu wirken. So konnten H. E. Morton und F. B. J. Engley (1945) eine Schutzwirkung durch Phagen an experimentell mit Shigellen infizierten Mäusen aufzeigen. Bis in die frühen vierziger Jahre mit dem Beginn der Antibiotika-Ära wurde eine sogenannte "Phagentherapie" auch kommerziell auf- gegriffen und verfolgt um eine Möglichkeit der Bekämpfung von Durchfallerkrankungen zu schaffen. Das Prinzip der "Phagentherapie" wurde auch in der damaligen Sowjetunion aufgegriffen (Babalova et al. 1968) und bis heute in Georgien weiterverfolgt .
In neuerer Zeit wird die sogenannte Phagentherapie wieder propagiert und erforscht (Chibani-Chennoufi et al., 2004) und teilweise medizinisch angewendet (Bruttin und Brüssow, 2005) Die dort angewandten Verfahren bringen jedoch bis heute nicht die gewünschten Erfolge und beruhen einzig auf dem Prinzip, natürlich vorkommende Phagen zu vermehren, um mit Hilfe einer großen Anzahl solcher Bakteriophagen pathogene Bakterien in ihren Wirten abzutöten.
In der internationalen Patentveröffentlichung WO 00/61 804 werden zur Bekämpfung pathogener Bakterien gentechnisch modifizierte Bakteriophagen offenbart, die eine Nukleinsäure- sequenz enthalten, welche ein für ein pathogenes Bakterium toxisches Agens codiert.
Hagens et al., Antimicrob. Agents Chemother. 2004, Bd. 48, S. 3817-3822), offenbaren einen gentechnisch veränderten Pf3- Phagen, der das Gen für die Restriktionsendonuklease BgIII trägt, zur Abtötung des pathogenen Pseudomonas-Wirts mittels irreparabler Spaltung der Wirts-DNA.
Bei der Verwendung solcher transgener Phagen, die für toxi- sehe Agentien codieren, besteht allerdings immer die Gefahr von Nebenwirkungen für das zu behandelnde Individuum.
Der vorliegenden Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, ein verbessertes Verfahren für eine solche Phagentherapie und entsprechende modifizierte Bakteriophagen bereitzustellen, welche (s) zur Bekämpfung einer Vielzahl pathogener Prokaryon- ten adaptiert werden kann/können, sehr effektiv und frei oder arm an Nebenwirkungen für das zu behandelnde Individuum ist/sind.
Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst durch die modifizierten Bakteriophagen gemäß Anspruch 1 und deren Verwendung gemäß den Ansprüchen 5 und 10 sowie das Superinfektionsverfahren gemäß Anspruch 12 und die Verwendung von Zinkfinger- proteinen nach Anspruch 14. Bevorzugte und spezielle Ausführungsformen der Erfindung sind Gegenstand der weiteren Ansprüche .
Im Gegensatz zu schon beschriebenen Verfahren zur Erzeugung transgener Phagen (siehe WO/00/61804 und Hagens et al., Anti- microb. Agents Chemother. 2004, Bd. 48, S. 3817-3822), stellen die hier durch gentechnische Veränderung des Phagengenoms erzeugten Proteine keine artifiziell exprimierten Proteine in Form von Antagonisten oder neutralisierende bzw. toxische Proteine (Peptid-/Proteinbinder, (Anti-) Toxine, Liganden, Nukleasen oder andere Enzyme) gegen die entsprechenden Toxine oder andere krankmachende Agenzien von Erregern dar und sind auch selbst keine Toxine, sondern sind artifizielle Trans- kriptionsfaktoren, spezieller artifizielle Zinkfingerpeptide, die intrazellulär an spezifischen Stellen der DNA in den Erregern binden und so bereits in einem sehr frühen Stadium der Proteinbiosynthese eingreifen und die Synthese der RNA entsprechender ausgewählter Proteine bzw. Toxine etc. blockie- ren, insbesondere auch solche RNA-Synthesen, die keiner direkten Transkriptionskontrolle unterliegen. Zinkfinger wie hier im Folgenden beschrieben gibt es natürlicherweise nur bei Eukaryonten, nicht jedoch bei Prokaryonten.
C2H2 (Cys2His2) -Zinkfinger sind eukaryontische Bindemotive, die eine RNA-Synthese beeinflussen, sogenannte Transkriptionsfaktoren. Ihre Bindefähigkeit an doppelsträngiger DNA in artifiziellen in-vivo-Systemen (Human zinc fingers as buil- ding blocks in the construction of artificial transcription factors. (2003) Kwang-Hae Bae et al. Nature Biotechnology
21:275-280) und außerhalb des eukaryontischen Systems konnte bereits anhand vollsynthetischer Zinkfinger in in-vitro- Versuchen auf Biochips gezeigt werden (Chemically synthesized zinc finger molecules as nano-addressable probes for double- stranded DNAs. (2005) Markus von Nickisch-Rosenegk et al. J Nanobiotechnology 3:5, 1-6).
Die Fähigkeit von artifiziell erzeugten, natürlich vorkommen- den Zinkfingern sowie vollkommen artifiziellen Zinkfingern (artifizielle Aminosäuresequenz und artifizielle Synthese) zur Transkriptionskontrolle wurde in unterschiedlichen Anwendungen bereits hinreichend beschrieben (Regulation of cancer- related growth factor expression by artificial zinc-finger proteins. (2006) Tomoaki Mori et al. Nucleic Acids Symposium Series No. 50:291-292; Artificial zinc finger fusions targeting Spl-binding sites and the trans-activator- responsive element potently repress transcription and replication of HIV-I. (2005) Kim YS et al. J Biol Chem 280(22) :21545-52.
Sie wurde allerdings noch nie in transgenen Bakteriophagen generiert, die anschließend als solche für eine Infektion von pathogenen Prokaryonten verwendet wurden, um dort spezifisch bestimmte RNA-Synthesen zu kontrollieren.
Dieses hier beschriebene Verfahren ist aus der Sicht der Erfinder der erste und wahrscheinlich beste Weg, kodierende Sequenzen für die anschließende Steuerung der RNA-Synthese aus- gewählter Proteine von Prokaryonten durch Zinkfinger in pro- karyontischen Krankheitserregern selbst mit Hilfe transgener Bakteriophagen zu applizieren.
Hauptziel dieser Ansatzes ist die Kontrolle bzw. Blockade der RNA-Synthese von ausgewählten Proteinen in Prokaryonten auf
DNA-Niveau, durch artifizielle Transkriptionsfaktoren mittels eines artifiziellen Carriers in Form von gentechnisch veränderten Bakteriophagen, welche die zu Grunde liegende Fremd- DNA für die Kodierung der RNA-Synthese-kontrollierenden Zink- finger in die Zellen schleusen, also ein mit artifizieller Zinkfinger-kodierender DNA transfizierter Bakteriophage (Zinkfingerphage) , dessen exprimiertes Zingfingerpeptid die RNA-Synthese bestimmter, gewählter Proteinprodukte (z.B. Vi- rulenzfaktoren bei bakteriellen Erregern) auf Grund seiner artifiziellen, spezifischen Sequenz, die an der kodierenden DNA bindet, spezifisch hemmt.
Der hier vorgestellte Ansatz zur Bekämpfung der pathogenen prokaryontischen Keime beruht auf dem gleichen Prinzip, wodurch die Bakterien selbst überhaupt erst ihre pathogene Wirkung entwickeln, nämlich durch eine Infektion mit Bakteriophagen. Der Unterschied hier (Erfindung) beruht auf einer ar- tifiziellen Infektion der Bakterien mit gentechnisch verän- derten Viren. Das krankmachende System wird quasi mit seinen eigenen Waffen geschlagen ("Beat it with its own game").
Hierfür werden geeignete gentechnisch modifizierte Bakteriophagen verwendet, um die pathogene Prokaryonten zu infizie- ren . Diese rekombinanten Phagen dienen als Vehikel, um in den entsprechenden Bakterien Proteine oder Nukleinsäuren zu erzeugen, die in der Lage sind, die zellinternen physiologischen Kaskaden, die an der Enstehung des pathogenen Geschehens beteiligt sind, zu blockieren.
In einer Ausführungsform der Erfindung werden infektiöse Bakteriophagen (z. B. phiVIO, Lambda, STX-Phagen, weitere Beispiele siehe unten) gentechnisch durch Einführung eines in diesen Phagen nicht natürlich vorkommenden Gens oder Genfrag- ments in der Weise verändert, dass sie nach Induktion in bekannter Weise (z.B. durch Stress wie Hitze oder Änderung anderer Umweltbedingungen) Proteine, z.B. Zinkfingerpeptide, exprimieren, die als Transkriptionsfaktoren essentielle Gene des pathogenen Bakteriophagen oder Gene der Phagenreplikation oder Synthese von Toxinen oder anderen pathogenen Proteinen oder die Synthese von Vorläufergenen und/-oder Hilfsproteinen blockieren bzw. die bakterielle Transkriptionsmaschinerie blockieren, die der ursprüngliche Pathogenitätsphage vor der Infektion mit dem erfindungsgemäßen rekombinanten Phagen für seine viralen Prozesse okkupiert.
Der Begriff „nicht natürlich vorkommendes Gen oder Genfragment" wie hier in der Beschreibung und den Ansprüchen verwen- det, umfasst ein vollständig synthetisch hergestelltes oder artifizielles Gen oder Genfragment mit einer gewünschten Sequenz, ein aus einem anderen Organismus, z.B. einem anderen Mikroorganismus (z.B. Virus, Bakterium, Hefe), stammendes Gen oder Genfragment, oder ein aus dem gleichen oder einem ande- ren Organismus, insbesondere Mikroorganismus, stammendes, jedoch durch Mutation modifiziertes Gen oder Genfragment.
Eine große Anzahl von Zinkfingerpeptiden aus einer Reihe von Organismen sind im Stand der Technik bekannt und ihre Amino- säure- und kodierenden DNA-Sequenzen sind in der Literatur beschrieben und in allgemein zugänglichen Datenbanken enthalten (z.B. WO 2006/103106) . Zur Herstellung der erfindungsgemäßen gentechnisch veränderten Bakteriophagen können diese bekannten Sequenzen als solche oder in einer nach Wunsch mo- difizierten Form, z.B. durch stellenspezifische Mutagenese oder PCR-Mutagenese oder durch die Ligation vollsynthetischer komplementär hybridisierender Oligonukleotid-Fragmente, in das Genom des Ausgangsbakteriophagen eingebaut werden. Diese Modifizierung kann bis zur Herstellung vollständig artifi- zieller Sequenzen (z.B. unter Berücksichtigung von Consensus- Sequenzen) gehen. Die Sequenzen richten sich nach den Zielsequenzen der jeweiligen Gene oder Promotoren, an die sie binden sollen, und werden bindungsfähig daran angepasst. Ein spezielles, nicht beschränkendes Zinkfingerpeptid für die vorliegende Erfindung ist im folgenden Beispiel angegeben.
Wichtig und/oder vorteilhaft ist in bestimmten Ausführungs- formen, dass die Zinkfinger-Gene zeitnah "eingeschaltet" werden oder durch die aus viraler Aktivität direkt oder indirekt entstehenden Folgeprodukte aktiviert werden.
Als Zielgene für die Blockierung durch die erfindungsgenäßen Bakteriophagen kommen prinzipiell alle essentiellen Gene des pathogenen Bakteriophagen, z.B. Gene der Phagenreplikation oder der Synthese von Toxinen oder anderen pathogenen (krank- heits-verursachenden) Proteinen, oder Gene von Hilfsproteinen oder Komponenten der bakteriellen Transkriptionsmaschinerie, die der ursprüngliche Pathogenitätsphage vor der Infektion mit dem erfindungsgemäßen rekombinanten Phagen für seine viralen Prozesse okkupiert, in Frage. Ein große Anzahl solcher geeigneten Zielgene ist im Stand der Technik bekannt, in der Literatur und allgemein zugänglichen Datenbanken beschrieben und kann vom Fachmann unschwer ermittelt werden.
Als erfindungsgemäße rekombinante Phagen kommen grundsätzlich alle Bakteriophagen in Frage, die in der Lage sind, einen Iy- sogenen Entwicklungsgang auszuführen, d. h. sich in das Pro- karyontengenom integrieren können, und/oder als Plasmid im bakteriellen Wirt existieren können. Spezielle, nicht-beschränkende Beispiele sind Lambda, phivlO-Phage, STX-Phage, M13, PM2, phiβ, Mac-1, SSV-I, PRD-I, fd-Coliphage, MS2- Coliphage, Qbeta-Coliphage, phiX174-Coliphage, T4-Coliphage, T7-Coliphage, Acholeplasma-Phage, Spiroplasma-Phage, Ther- moproteus-Phage .
Als Ziel-Prokaryonten kommen grundsätzlich alle Prokaryonten mit einem integrierten (bzw. als Plasmid vorliegenden) Bak- teriophagen, insbesondere pathogene Proteine (z.B. Toxine oder die Iminunabwehr schwächende Proteine) bildende Bakterien wie Salmonellen, Shigellen, Escherichia coli, Staphylococcus, Lactobacillus, Helicobacter, Camphylobacter, Streptococcus, Legionella, Listeria, Borrelia, Yersinia, Bacillus und Vibrio in Frage. Ein spezielles, nicht-beschränkendes Beispiel sind Shigatoxin bildende E. coli.
Die erfindungsgemäßen gentechnisch modifizierten Bakteriopha- gen können zur Bekämpfung von pathogenen Phagen-infizierten Prokaryonten eingesetzt werden. Insbesondere können die erfindungsgemäßen Bakteriophagen zur Herstellung eines Medikaments für die Behandlung oder Verhütung einer durch pathogene Phagen-infizierte Prokaryonten verursachten Krankheit bei ei- nem Menschen oder einem anderen Wirbeltier, z.B. einem Säugetier wie Schwein, Rind, Pferd, Schaf, Hund, Katze etc. oder einem Vogel wie Huhn, Ente, Gans, Truthahn etc., verwendet werden.
Einige nicht-beschränkende Beispiele für solche Prokaryonten sind die im vorherigen Absatz aufgeführten. Spezielle, nichtbeschränkende Beispiele für Krankheiten, die von solchen pathogen Prokaryonten verursacht werden und für eine therapeutische oder prophylaktische Behandlung unter Verwendung der erfindungsgemäßen gentechnisch modifizierten Bakteriophagen in Frage kommen, sind EHEC, Bakterienruhr, „Lime Disease", Legionärskrankheit und Magengeschwüre beim Menschen und Ödemkrankheit, Ferkelruß und Milzbrand bei Tieren.
Das folgende prinzipielle Beispiel und die entsprechende schematische Darstellung in Fig. 1 dienen nur zur Erläuterung der vorliegenden Erfindung und soll diese in keiner Weise darauf beschränken. Der Lambda-Phage wurde hier gewählt, da er als gentechnischer Sicherheitsvektor in transgener Form innerhalb der Molekularbiologie bestens etabliert ist und die Funktion dieses Systems in Fachkreisen allgemein bekannt ist.
Der geschulte Fachmann wird erkennen, dass die vorliegende Erfindung ein allgemeines Prinzip beschreibt und nicht auf bestimmte individuelle Beispiele von Genen, Mikroorganismen und Sequenzen beschränkt ist, da der Fachmann anhand der vor- liegenden technischen Lehre und seiner allgemeinen Fachkenntnis unschwer weitere Variationen der hier beschriebenen speziellen Ausführungsformen erkennen und in die Praxis umsetzen kann.
BEISPIEL 1
Artifizielle Repressoren (Zinkfingerpeptide) des bakteriellen recA-Genes und der viralen Promotoren R und L des Lambda-Phagen
Eine Möglichkeit, nach dem erstgenanntem Prinzip zu intervenieren, beinhaltet die Herstellung einer doppelsträngigen DNA-Sequenz (z. B. hybridisierte, komplementäre synthetische Oligonukleotide) , die für ein Zinkfingerpeptid kodiert, das den Promotor des bakteriellen recA-Genes blockiert, sowie ein cI-Repressor-Analogon, das die viralen Promotoren L und R blockiert (siehe Fig. 1). Diese DNA-Moleküle werden über entsprechende in den Oligonukleotiden festgelegte Schnittstellen auf bekannte Weise in das Genom von Phage-Lambda in- tegriert (Ligation) .
Hierzu stehen wieder diverse Möglichkeiten zur Verfügung. In einem speziellen Beispiel werden die obengenannten doppelsträngigen DNA-Fragmente, jeweils mit einem zusätzlichen (be- züglich des Phagengenoms) vorangestellten R- bzw. L-Promotor des Lambda-Phagen, in das virale Genom integriert. Nach erfolgter Infektion der pathogenen Bakterien ruht das erfindungsgemäß modifizierte (artifizielle) Genom parallel zu dem pathogenitätsauslösenden Phagengenom in lysogener Form im Genom der bakteriellen Wirtszelle.
Wird nun im Falle der Induktion durch äußere Faktoren die Produktion von recA im Bakteriengenom ausgelöst, wird der vi- rale cI-Repressor auf den L- und R-Promotoren abverdaut und somit die Transkription auch auf den artifiziellen Genen des rekombinanten Phagen gestartet, d. h. es werden Proteine exprimiert, die sowohl die recA-Produktion blockieren, als auch die zuvor abverdauten cI-Repressoren substituieren. Da- mit wird die den lytischen Virenzyklus auslösende Kaskade unterbunden. Die Folgen sind ein Unterbleiben der exponenziel- len Vermehrung der pathogenen Keime einhergehend mit dem Ausbleiben der pathologischen Begleiterscheinungen, d. h. einer Erkrankung.
Ein Zinkfingerprotein, das auf der Repressorsequenz des Promotors für recA bindet, bzw. die zugehörige zu klonierende DNA-Sequenz lautet beispielsweise wie folgt: TAC TGT ATG AGC ATA CAG TAT (aus EcoCyc-Datenbank: Bindedomä- ne des recA-Repressors in der Promotorregion des Genes: Nuc- leic Acids Research 33:D334-7 2005) (SEQ-ID-Nr. 1).
Der hier passende Zinkfinger besteht aus 7 aneinander ligier- ten C2H2-Zinkfingerpeptiden, die jeweils ein DNA-Triplett binden. In der folgenden Abbildung sind einzelne Zinkfinger- peptide mit ihren spezifischen Erkennungsmotiven (fett, unterstrichen) für das jeweilige Nukleinsäuretriplett der DNA- Sequenz als ligiertes Peptid mit einer zusammenhängenden Ami- nosäuresesequenz dargestellt (one-letter-code) . Die Aminosäu- ren X, die nicht Bestandteil der jeweiligen Erkennungssequenzen bzw. Zinkf inger-Consensussequenzen sind, können ohne Funktionsverlust durch andere Aminosäuren ersetzt werden. Die Aminosäure Z steht für eine hydrophobe Aminosäure (L, I, V, M, F, Y, W, C) .
X Z X C X X X C X X X Z X D S G N L Q T H X X X H X X X X
X Z X C X X X C X X X Z X E S S H L Q T H X X X H X X X X
X Z X C X X X C X X X Z X R S D S L Q N H X X X H X X X X
X Z X C X X X C X X X Z X D S S H L Q N H X X X H X X X X
X Z X C X X X C X X X Z X Q S D S L Q lT H X X X H X X X X
X Z X C X X X C X X X Z X R S G N L Q E H X X X H X X X X
X Z X C X X X C X X X Z X E S G N L Q T H X X X H X X X X
(SEQ-ID-Nr. 2)
Hieraus ergibt sich ein zu klonierendes DNA-Fragment von 609 Basenpaaren, die für 203 Aminosäuren kodieren, die dann als Zinkfinger exprimiert werden.
Die folgende Sequenz-Abbildung zeigt die Nukleinsäuresequenz des Zinkfingerproteins aus den DNA-Sequenzmotiven von 7 Zink- fingerpeptiden (N= G, A, T oder C) :
NNNTGTNNNTGTNNNNNNNNNTGTNNNNNNNNNTGTNNNGACAGTGGTAATCTTCAAACT- CACNNNNNNNNNCACNNNNNNNNNNNNNNNTGTNNNTGTNNNNNNNNNTGTNNNNNNNNN TGTNNNGAAAGTAGTCATCTTCAAACTCACNNNNNNNNNCACNNNNNNNNNNNNNNNTGT NNNTGTNNNNNNNNNTGTNNNNNNNNNTGTNNNCGTTCTGATTCTCTTCAAAATCACNNN NNNNNNCACNNNNNNNNNNNNNNNTGTNNNTGTNNNNNNNNNTGTNNNNNNNNNTGTNNN GATTCTTCTCATCTTCAAAATCACNNNNNNNNNCACNNNNNNNNNNNNNNNTGTNNNTGT NNNNNNNNNTGTNNNNNNNNNTGTNNNCAATCTGATTCTCTTCAAAATCACNNNNNNNNN- CACNNNNNNNNNNNNNNNTGTNNNTGTNNNNNNNNNTGTNNNNNNNNNTGTNNNCGTTCT GGTAATCTTCAAGAACACNNNNNNNNNCACNNNNNNNNNNNNNNNTGTNNNTGTNNNNNN NNNTGTNNNNNNNNNTGTNNNGAATCTGGTAATCTTCAAACTCACNNNNNNNNNCACNNN
NNNNNNNNN (SEQ-ID-Nr. 3)
Die entsprechenden Gensequenzen bzw. Aminosäuresequenzen der Zinkfingerproteine für die R- und L-Promotoren leiten sich analog zu o. g. Beispiel von ihrer jeweiligen DNA-Sequenz für den dort bindenden Zinkfinger logisch ab (vgl. EP 1707575 (Al)).
BEISPIEL 2
Artifizieller Zinkfinger als Transkriptionsfaktor für die Blockade der RNA-Synthese eines erp-Gens von Borrelia burgdorferi
Die erp-Gene sind auf einem Prophagengenom von Borrelia burgdorferi kodiert. Die Expressionsprodukte finden sich bei Bor- rellien als Membranproteine wieder. Diese können den sog.
Faktor-H binden, der das Complement-System (Teil des Immunsystems) inhibiert. Dies ist der Mechanismus mit dem sich Borrelia im Wirtsorganismus "tarnt" und so einer Immunabwehr, d.h. letztlich einer Phagozytose, entzieht. Durch die Blocka- de der Expression der erp-Gene wären die Erreger im Wirtsorganismus für die Immunabwehr wieder zugänglich und könnten so durch körpereigene Mechanismen wieder aus dem System entfernt werden.
Um die RNA-Synthese der erp-Gene zu blockieren, wird ein
Zinkfinger benötigt, der sich in der Promotorregion der erp- Gene an die DNA anheftet und so die Polymerase daran hindert, entsprechende mRNA zu transkribieren. Die als Anheftungsregi- on ausgewählte genomische DNA-Sequenz für den hier verwendeten spezifischen Zinkfinger ist ein 18-Basenpaarfragment :
Promotorsequenz von erpA aus B.burgdorferi (Zinkfingerbinde- stelle in Großbuchstaben, unterstrichen)
aaatcctctccttgaaggtgttacttttaaattaagtaaaagtaataaaaatagataaa- aatagtaatttatattgtaccaaaaacgaaaaattttagtcaaattttgtgagttct- cattgcatgagaaatttgggttgtagggaggctgttataaatagaatgggcattttct- gagggtgteggetaagaaagactacataetttagetaatatatageaaagaetttga- aatttaatttgtatgtgttttatagtcttttgtaatgagtagtgcatttgcaatggaga- gattttggggagttgtttaaaattacatttgcgttttgttaaaatgtaacagctgaatg- taacaaaattatatatttaAATCTTTGAAATATTGCAtttattatgtattgtggtatga ttaggacttatggagaaattt (SEQ-ID-Nr. 4)
Die sich hieraus ergebende Aminosäuresequenz für den artifi- ziellen Zinkfinger (Bindedomäne unterstrichen) stellt sich wie folgt dar:
MLEPGEKPYKCPECGKSFSQSGDLRRHQRTHTGEKPYKCPECGKSFSHKNALQNH QRTHTGEKPYKCPECGKSFSTTGNLTVHQRTHTGEKPYKCPECGKSFSQAGHLAS HQRTHTGEKPYKCPECGKSFSTTGALTEHQRTHTGEKPYKCPECGKSFSTTGNLTV HQRTHTGKKTS (SEQ-ID-NR. 5)
Die Aminosäuren, die nicht Bestandteil der jeweiligen Erkennungssequenzen bzw. Zinkfinger-Consensus-Sequenzen sind, können ohne Funktionsverlust auch durch andere Aminosäuren ersetzt werden.
Daraus ergibt sich die zu klonierende Nukleinsäuresequenz z.B. als ein 531-Basenpaarfragment wie folgt:
atgctggaaccgggtgaaaagccgtacaaatgtccggaatgtgggaaatcgttctcaca gtctggcgatttacgccgtcaccaacgcacccataccggtgagaaaccctacaaatgtc ccgaatgcggaaagagcttctctcacaaaaatgccctccagaaccatcagcgcacacat accggcgaaaagccgtataagtgcccagagtgtgggaagagcttctcaaccaccggcaa tctgacggttcaccagcggacacacaccggcgaaaaaccgtacaaatgcccggaatgtg gcaagagcttttcgcaagcaggtcatctggcgagtcatcagcgtactcacactggtgag aaaccgtataaatgcccagaatgcggtaaatcgtttagcaccactggtgctttgaccga acaccagcgtacccatacgggagagaaaccttataagtgccctgaatgcgggaaatcct tttccacgacaggcaacctgacggtgcatcaacgcactcatacgggcaagaaaacgagt (SEQ-ID-Nr. 6)
Für die Klonierung des erp-sequenzspezifischen Zinkfingers bzw. dessen kodierender DNA-Sequenz wird der Borellien- spezifische Phage phiBB-1 verwendet .

Claims

PATENTANSPRÜCHE
1. Gentechnisch veränderte Bakteriophagen, die mindestens ein in diesen Phagen nicht natürlich vorkommendes induzierbares Gen oder Genfragment enthalten, das für ein DNA-Sequenzspezifisches Zinkfinger-Protein kodiert, welches nach Einführung des Bakteriophagen in einen prokaryontischen Wirt intra- zellulär an DNA bindet, und so gezielt die Transkription bestimmter Gene eines in diesem Wirt lysogen oder als Plasmid vorliegenden anderen Phagen oder Gene der Wirtszelle auf DNA-Ebene als Transkriptionsfaktor blockiert.
2. Bakteriophagen nach Anspruch 1, wobei das Protein ein spezifischer Zinkfinger ist, der intrazellulär an virale und/oder prokaryontische Gene oder Promotoren oder andere funktionale genetische Bereiche bindet.
3. Bakteriophagen nach Anspruch 1 oder 2, die Zinkfinger exprimieren, welche nach Einführung des Bakteriophagen in einen prokaryontischen Wirt intrazellulär an virale und/oder prokaryontische Gene oder Promotoren binden, die am Transkriptionsgeschehen eines lysogenen (getemperten) oder als Plasmid vorliegenden anderen Phagengenoms in diesem Wirt beteiligt sind.
4. Bakteriophagen nach einem der Ansprüche 1 bis 3, bei denen es sich um Lambda-Phagen, STX-Phagen, phivlO-Phagen, M13, PM2, phiβ, Mac-1, SSV-I, PRD-I, fd-Coliphagen, MS2-Coli- phagen, Qbeta-Coliphagen, phiX174-Coliphagen, T4-Coliphagen, T7-Coliphagen, Acholeplasma-Phagen, Spiroplasma-Phagen oder Thermoproteus-Phagen handelt.
5. Verwendung der gentechnisch veränderten Bakteriophagen nach einem der Ansprüche 1 bis 4 zur Infektion von Prokaryon- ten.
6. Verwendung nach Anspruch 5 zur Infektion von Phagenplas- mid- oder Lysogen-tragenden Prokaryonten.
7. Verwendung nach einem der Ansprüche 5 bis 6 zur Infektion von Salmonellen, Shigellen, Escherichia coli, insbesondere Shigatoxin-bildenden Escherichia coli, Staphylococcus, Lacto- bacillus, Heliobacter, Camphylobacter, Streptococcus, Legionella, Listeria, Borrelia, Yersinia, Bacillus oder Vibrio.
8. Verwendung nach einem der Ansprüche 5 bis 7 zur Bekämpfung von pathogenen Phagen-infizierten Prokaryonten.
9. Verwendung nach Anspruch 8, wobei die pathogenen Prokaryonten Krankheiten bei Menschen oder anderen Wirbeltieren verursachen .
10. Verwendung der gentechnisch veränderten Bakteriophagen nach einem der Ansprüche 1 bis 4 zur Herstellung eines Medikaments für die Behandlung oder Verhütung einer durch patho- gene Phagen-infizierte Prokaryonten verursachten Krankheit bei einem Menschen oder einem anderen Wirbeltier.
11. Verwendung nach Anspruch 10, wobei es sich bei den pathogenen Phagen-infizierten Prokaryonten um Salmonellen, Shigellen, Escherichia coli, insbesondere Shigatoxin-bildende Escherichia coli, Staphylococcus, Lactobacillus, Helicobacter, Camphylobacter, Streptococcus, Legionella, Listeria, Borellia, Yersinia, Bacillus oder Vibrio handelt.
12. Verfahren zur viralen Superinfektion von Prokaryonten, die in das Wirtsgenom integrierte oder auf einem Plasmid vorliegende Gene mindestens eines weiteren Bakteriophagen enthalten, mit einem gentechnisch veränderten Bakteriophagen nach einem der Ansprüche 1 bis 4.
13. Verfahren nach Anspruch 12, wobei durch die virale Superinfektion die Expression integrierter oder auf einem Plasmid vorliegender Gene des mindestens einen weiteren Bakterio- phagen mit pathogener Wirkung für einen Wirt des Prokaryonten durch diesen Prokaryonten weitgehend oder vollständig verhindert wird.
14. Verwendung von eukaryontischen Transkriptionsfaktoren in Form von artifiziellen Zinkfingerproteinen in prokaryonti- schen Zellen.
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Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2945049B1 (fr) * 2009-04-30 2013-10-04 Pherecydes Pharma Modification du genome d'un bacteriophage lytique par immobilisation dudit bacteriophage dans sa bacterie hote

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2000061804A1 (en) * 1999-04-14 2000-10-19 Musc Foundation For Research Development Tissue-specific and pathogen-specific toxic agents and ribozymes
WO2002034892A1 (en) * 2000-10-25 2002-05-02 Intercell Biomedizinische Forschungs- Und Entwicklungs Ag Modified phage, comprising a non-lytic modification and expressing a kil-gene
JP2005052061A (ja) * 2003-08-04 2005-03-03 Nokodai Tlo Kk ジンクフィンガー蛋白質を用いる標的核酸の検出方法
US20050239203A1 (en) * 1999-01-12 2005-10-27 Case Casey C Regulation of endogenous gene expression in cells using zinc finger proteins
US20060111302A1 (en) * 2003-11-19 2006-05-25 The Scripps Research Institute & Achaogen, Inc. Compositions and methods to reduce mutagenesis

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB9929744D0 (en) * 1999-12-17 2000-02-09 Univ Nottingham Modifying micro-organisms

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20050239203A1 (en) * 1999-01-12 2005-10-27 Case Casey C Regulation of endogenous gene expression in cells using zinc finger proteins
WO2000061804A1 (en) * 1999-04-14 2000-10-19 Musc Foundation For Research Development Tissue-specific and pathogen-specific toxic agents and ribozymes
WO2002034892A1 (en) * 2000-10-25 2002-05-02 Intercell Biomedizinische Forschungs- Und Entwicklungs Ag Modified phage, comprising a non-lytic modification and expressing a kil-gene
JP2005052061A (ja) * 2003-08-04 2005-03-03 Nokodai Tlo Kk ジンクフィンガー蛋白質を用いる標的核酸の検出方法
US20060111302A1 (en) * 2003-11-19 2006-05-25 The Scripps Research Institute & Achaogen, Inc. Compositions and methods to reduce mutagenesis

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
HAGENS STEVEN ET AL: "Therapy of experimental Pseudomonas infections with a nonreplicating genetically modified phage", ANTIMICROBIAL AGENTS AND CHEMOTHERAPY, vol. 48, no. 10, October 2004 (2004-10-01), pages 3817 - 3822, XP002483597, ISSN: 0066-4804 *
JOUNG J KEITH ET AL: "A bacterial two-hybrid selection system for studying protein-DNA and protein-protein interactions", PROCEEDINGS OF THE NATIONAL ACADEMY OF SCIENCES OF USA, NATIONAL ACADEMY OF SCIENCE, WASHINGTON, DC, vol. 97, no. 13, 30 June 2000 (2000-06-30), pages 7382 - 7387, XP002211405, ISSN: 0027-8424 *
PARK KYUNG-SOON ET AL: "Phenotypic alteration and target gene identification using combinatorial libraries of zinc finger proteins in prokaryotic cells", JOURNAL OF BACTERIOLOGY, WASHINGTON, DC, US, vol. 187, no. 15, 1 August 2005 (2005-08-01), pages 5496 - 5499, XP002407917, ISSN: 0021-9193 *
WESTWATER CAROLINE ET AL: "Use of genetically engineered phage to deliver antimicrobial agents to bacteria: An alternative therapy for treatment of bacterial infections.", ANTIMICROBIAL AGENTS AND CHEMOTHERAPY, vol. 47, no. 4, April 2003 (2003-04-01), pages 1301 - 1307, XP002483598, ISSN: 0066-4804 *

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