WO2008049335A1

WO2008049335A1 - Un régulateur de croissance de plantes contenant de l'hémine

Info

Publication number: WO2008049335A1
Application number: PCT/CN2007/003031
Authority: WO
Inventors: Wenbiao Shen; Liqin Huang; Jinliang Shen; Tengfang Ling; Wei Xuan; Sheng Xu; Maobing Ye; Suning Shao; Benkai Huang; Keyu Gu; Kaili Liu; Yahui Liu; Zeyu Cao; Zhisheng Sa; Yi Han; Yanjie Xie; Hui Liu
Original assignee: Nanjing Agricultural University
Priority date: 2006-10-24
Filing date: 2007-10-24
Publication date: 2008-05-02
Also published as: CN100428884C; AU2007308582A1; CN1934944A

Description

一种含有氯化血红素的植物生长调节剂技术领域

本发明涉及一种含有氯化血红素的植物生长调节剂，属于植物生长调节物质的开发与利用领域，专用于包括农用化学品开发、农田化学调控、种源农业、组培、果蔬贮藏以及切花保鲜等领域。技术背景

植物的生长发育进程通常受植物内源激素的调控，同时也经常受到各种不良环境条件（包括许多非生物 /生物胁迫等逆境因素）的制约，往往导致生长速率和产量的下降，其中与人类生活最密切的是农艺性状的下降，而植物各组织和部位的代谢功能下调以及导致的抗氧化能力下降是其中的最主要诱因之一。已经证实，通过改善农业环境、选育抗 /耐逆性强的作物品种以及开发转基因作物确实可以达到增产和增收的目的，但其往往成本较高，而且开发年限也较长，甚至还可能带来其它副效应，例如转基因作物的风险性评估以及潜在的安全性问题。另一方面，尽管目前已经有不少发明专利可以用于提高植物的耐 /抗逆性和改善各种农艺性状，但是上述发明专利往往是将几种大量 /微量元素和（或）植物激素或人工合成的衍生物按一定比例配合。由于成份复杂，作用机理不明确，使用方法也不易被生产者所掌握，而且有些植物激素的价格比较昂贵，在使用过程中也存在有一定的副作用，因此使用效果往往不稳定。

已经知道，当植物受到各种不良环境的胁迫时，往往体内 ABA 和 H₂O₂等内源信号分子的含量和分布会发生改变的趋势，表明 ^八和1¾0₂ 作为重要的信号因子能够参与对不同环境因子的交叉耐受和适应；同时，若用其中一种因子 (ABA和 H₂O₂等）诱导胁迫植物，则可抵抗接下来相同种类或不同种类的胁迫。最近的研究已经发现，作为植物生长调节 /信号分子的一氧化氮（Nitric oxide, NO) 可以广泛参与各种生理过程，尤其在植物生长发育及其对逆境的响应等方面起着重要的调节作用，并与植物的生长发育进程和 NO的处理浓度有关。例如低浓度外源 NO (μΜ浓度范围）能显著提高植物的耐盐性，并与其能增加各组织抗氧化能力有关，同时也与其能调节植物离子平衡相关，并有 Ca²⁺信使和 H₂0₂等信号分子的参与；但高浓度 NO处理则有明显的伤害效应（Ruan等， Chin Sci Bull, 2002； Uchida等， Plant Sci， 2002； Zhao等， Plant Physiol, 2004)。此夕卜，植物 NO功能还与 ABA以及其它激素 /植物生长调节物质的交互作用有关 (Beligni和 Lamattina, Planta, 2000； Delledonne, Curr Opin Plant Biol, 2005 )。 1999年 11月，阿根廷科学家 Lamattina等申请了与植物 NO功能开发利用相关的美環专禾 (Method of enhancing the metabolic function and the growing conditions of plants and seeds,专禾 !j申请号： 450192)，并在 2001 年 6月正式获得专利（美国专利号： 6242384)。

另一方面，与 NO同为双原子气态分子的一氧化碳（CO) —直被认为是一种有毒气体。从化学特性看， CO纯品为无色、无臭、无刺激性的气体，分子量 28.01，密度 0.967 g/L，冰点为 -207Ό , 沸点为 -190°C , 在水中的溶解度较低，但易溶于氨水，空气混合爆炸极限为 13〜74%。通常，当含碳的物质不完全燃烧时，都可产生 CO气体，例如在工业生产中接触 CO的作业不下 70余种，如冶金工业中的炼焦、炼铁、锻冶、铸造和热处理生产，化学工业中合成氨、丙酮、光气、甲醇的生产，矿井放炮和煤矿瓦斯爆炸事故，碳素石墨电极制造以及生产金属羰化物如羰基镍、羰基铁等过程，或生产使用含 CO的可燃气体（如水煤气含 CO达 40%，高炉与发生炉煤气中含 30%，煤气中则含 5〜15%的 CO)，都可能接触或产生 CO气体，使用柴油、汽油的内燃机废气中也含 CO约 1〜8%。此外， Hemin (氯化血红素， C₃₄H₃₂ClFeN₄O₄，分子量为 651.94)、 Hematin (高铁血红素， C₃₄H₃₃N₄O₅Fe，分子量为 633.49) 和 CORM-3等也是常用的能释放 CO气体的人工供体，而通过浓硫酸与甲酸共热的加热反应也可以产生人工 CO气体。

Hemin的化学结构式

已经知道， CO也是许多国家引起意外生活性中毒中致死人数最多的毒物，急性 CO中毒的发生与接触 CO的浓度及时间有关。已经知道 CO 之所以能引起煤气中毒，是因为 CO被人吸进肺中，跟血液里血红蛋白结合。由于碳氧血红蛋白的存在，使人体血液的携氧功能发生障碍，造成机体急性缺氧。当 CO浓度较高时，还可与细胞色素氧化酶中的铁结合，从而抑制组织细胞的呼吸过程，阻碍其对氧的利用。由于中枢神经系统对缺氧最敏感，当吸入 CO的量不等时便可能产生不同的中毒现象。例如，当 CO在空气中浓度为 0.4%时，将危及人的生命。

最近的大量研究已经证实 CO也是动物体内重要的细胞间信使，属于活性碳（Reactive carbon species, RCS) 范畴，参与调节动物体内各种生理和病理过程，并与动物中 NO的功能相类似（Verma等， Science, 1993 )。在动物体内，血红素氧合酶（Heme oxygenase, HO) 是一种催化血红素降解为 CO、 Fe和胆红素的起始酶和限速酶，有着重要的生物学作用，而 CO的细胞信使作用已引起人们的普遍关注。例如， CORM-3 (可溶性液态 CO供体）可以促进心脏细胞生长从而有效治疗患者的心脏病发作，在患者心脏病发作期间， CORM-3释放出的 CO气体能有效地预防心脏细胞的受压和缺氧；同时， CORM-3 还可增强移植器官的生理机能，降低人体机能对移植器官的排斥性。因此，英国谢菲尔德综合大学 Brian Mann 教授称， "根据实验结果可以看出， CO分子在医疗应用中有巨大的潜力， CO 的生理活动性将应用至更广阔的领域"。有意思的是，在心血管系统中， CO具有的维持血管张力和保护心肌细胞的作用与 NO的功能相类似。通常， CO与 NO在动物体内都可以通过结合可溶性鸟苷酸环化酶（sGC) 活性中心的 Fe²⁺从而改变 sGC的构象，导致酶活性的增强，从而提高细胞内 cGMP的浓度，发挥舒张内皮细胞的作用。另外， CO和 NO的生成和调节系统也有较大的相似性。例如， HO和一氧化氮的重要合成酶一氧化氮合酶（Nitric oxide synthase, NOS) 都有两种形式：组成型和诱导型 (iHO/iNOS), HO也分为 HO-1 (iHO) 和 HO-2/3 (组成型 HO， cHO)，而 HO对 iNOS的一些刺激因素如内毒素、细胞因子、活性氧也有应答效应。此外， NOS和 HO系统的产物均对血红素分子有很高的亲和力，并在调节胞内 cGMP浓度的功能上有互补的关系。总之，动物的研究表明 CO与 NO在分子结构、生理功能、信号转导途径、合成酶系统等方面都存在许多相似之处。

与上述相对应的是，植物中的研究也已经初步发现 HO具有体内合成 CO气体的能力（Muramoto等， Plant Physiol, 2002 )。此外，在植物种子萌发和幼苗生长过程中也往往伴随着 CO生成的现象（一般 1000 ppm)，其中产生的最高浓度则为 6000 ppm，并初步推测与光呼吸作用、光合作用以及呼吸代谢作用有关（Wilks, Science, 1959; Siegel 等， Science, 1962)。这一发现表明 CO可能也是植物代谢的天然副产物，同时也为 CO 对植物生长发育调控作用的发现和利用提供了相应的现实基础和思路。发明内容技术问题

本发明的目的在于克服现有技术中使用各种大量 /微量元素以及植物激素 /生长调节物质（包括 NO等）来提高植物抗 /耐逆性以及改善各种农艺性状的效果往往不稳定或具有一定伤害作用以及价格昂贵的缺陷，通过氯化血红素（Hemin，也是 HO-1的活性诱导剂）来逐步提高植物内源 CO 的含量，从而提供一种能促进植物生长发育和形态建成，增强各种代谢能力，增加产量和改善品质等各种农艺性状，以及提高植物抗 /耐逆性和上调植物抗氧化能力的方法。技术方案

一种含有氯化血红素的植物生长调节剂，其特征是，该植物生长调节剂含有氯化血红素，配制成溶液后氯化血红素的有效终浓度为 0.001〜1000 μ Μ。该植物生长调节剂还含有配制成溶液后终浓度为 0~1000 μΜ的 Ca²⁺ 或终浓度为 0~1000 μΜ的水杨酸或 0〜1000 μΜ的其它农用化学品。该植物生长调节剂能诱导植物体内逐步释放总浓度 1000 ppm CO的气体。上述一种含有氯化血红素的植物生长调节剂的应用，其特征在于：采用含有氯化血红素的楨物生长调节剂对植株、植物组织或种子进行灌溉、喷洒、浸泡或浸种处理，或者直接加进包含上述植物材料的培养基，以改善各种农艺性状或代谢功能以及非生物或生物胁迫耐受性或抗性；连续处理 1-60天，每天 1~3次。

所述植株、植物组织和种子，包括种植在大田和温室等地方的单子叶植物、双子叶植物或裸子植物以及经遗传修饰生物体（Genetically modified organisms, GMO) 的植株、组织和种子；

各种非生物胁迫，包括盐害、渗透胁迫、干旱和渍水胁迫、冷害、热激、紫外线照射、臭氧、创伤、金属（铁、铜、铅、锰、铝和汞等）毒害、除莠剂（包括 Paraquat和 Diquat等诱发活性氧过量产生的除草剂等）的过量或错误使用等，而生物胁迫包括各种虫害和病原菌侵染；

所述各种农艺性状和代谢功能以及非生物 /生物胁迫耐受 /抗性，是指在播种、萌发、生根、生长、移栽、枝插、分蘖、开花、果实形成与成熟、组织培养等各种发育与生产阶段，以及各种天然或人为导致的生物与非生物胁迫条件下，包括诱导 α 13淀粉酶活性从而缓解各种胁迫对种子萌发的抑制以及提高正常条件下种子萌发率以及打破休眠、延缓老化和衰老进程、延长货架期、诱导侧根和不定根的发生、上调各种抗氧化酶基因表达和合成以及酶活性的提高、下调各种活性氧产生系统的运转速度、延缓脂质过氧化产物的生成、诱导植物叶片的气孔关闭以及保绿作用、提高地上 /地下部组织的干鲜重以及伸长 /生长速率、增加农作物产量和改善品质、增强植物的抗病性和抗虫性、重金属抗性以及诱导脯氨酸、黄酮类化合物以及植保素等各种保护物质的合成等。

氯化血红素用于植物生长调节的方法，其特征是，

1 )配制含有氯化血红素的植物生长调节剂溶液：该溶液中氯化血红素有效终浓度为 0.001~1000 μ Μ; 此外，还含有终浓度为 0〜1000 μΜ的 Ca2+或水杨酸或 0~1000 μΜ的其它农用化学品；

2) 用上述含有氯化血红素的植物生长调节剂溶液对植株、植物组织或种子进行灌溉、喷洒、浸泡或浸种处理，或者直接加进包含上述植物材料的培养基，以改善各种农艺性状或代谢功能以及非生物或生物胁迫耐受性或抗性；连续处理 1~60天，每天 1~3次。有益效果

尽管已经有报道发现低浓度 CO气体和 Hematin可以提高植物种子的萌发（Dekker和 Hargrove, Am J Bot, 2002； Xu等， J Integr Plant Biol, 2006),但是由于是直接采用 CO气体处理，容易引起对人体的不良反应；同时，与增加了 C1原子的 Hemin相比，高铁的 Hematin化学性质不稳定，而且价格昂贵。与它们所不同的是，本发明所用的是能直接诱导体内释放低浓度 CO气体的含有氯化血红素（Hemin) 的植物生长调节剂，由于化学性质稳定的氯化血红素可以直接诱导植物 HO-1 (属于 iHO) 的活性，从而逐次产生 CO气体，并被植株、植物组织和种子所直接吸收，因此可以有效的避免 CO气体对人体的直接伤害效应；而植株、植物组织和种子体内中产生的 CO也可以进一步诱导 NO的合成，从而协同改善植株、植物组织和种子的各种农艺性状，提高各种代谢功能以及非生物 /生物胁迫耐受 /抗性。

植物中的研究已经表明，高浓度的 CO气体（>6000 ppm，相当于大于 0.6% (V/V)的 CO气体）可以明显抑制植物生长和发育。本发明是一种以能释放低浓度 CO气体的含有氯化血红素（Hemin) 的植物生长调节剂来改善植株、植物组织和种子农艺性状以及提高代谢功能的方法，包括可以促进植物生长发育和形态建成，加快种子萌发，提高抗氧化能力以及改善各种非生物 /生物胁迫耐受 /抗性。

本发明进一步证实 CO供体 HO-1的活性诱导剂氯化血红素（Hemin) 与 NO相类似，也能提高植物的抗 /耐逆性和改善农艺性状以及上调各种代谢功能，其作用的机理涉及 CO作为信号 /还原分子来提高植物耐 /抗逆性以及代谢功能、或通过与 NO、 H₂O₂信号分子以及 ABA、 IAA和 GA 等植物激素的互作，而相关的调节功能则包括诱导植物正常或胁迫条件下的侧根和不定根发生以及组培条件下的生根、缓解各种胁迫条件对植物种子萌发的抑制和提高正常条件下萌发率以及打破种子休眠、诱导叶片的气孔关闭和保绿作用、提高地上 /地下部组织的干鲜重以及伸长速率、增强植物的抗病 /虫性、延缓老化和衰老以及上调植物各组织的抗氧化能力等，由于 CO也是植物生理代谢的内源副产物，因此上述研究结果表明 CO或相关供体也可能是新型的植物生长调节物质，并能在作物逆境或正常生长条件下行使有效的调节作用。

由于 NO本身是一自由基，因此在使用过程中容易引起氧化伤害，而 CO不是一个自由基，则不太容易引发氧化损伤。此外，本发明中所采用的 Hemin诱导释放的 CO浓度远低于人体敏感浓度 (例 CO气体对人的致死剂量至少为 4000 ppm，而本发明所涉及的浓度为 1000 ppm)，且由于是采用能逐次诱导植物体内释放 CO气体的 Hemin溶液，因此更不会对人体产生直接的明显影响。另一方面，本发明中的 CO供体 Hemin来源广泛（Hemin通常是动物血液的深加工产品），价格便宜。因此，采用 CO 供体 Hemin来提高作物的抗 /耐逆性、农艺性状和代谢功能，与传统的基因工程和其它化学调控方法相比更具有优良的性价比和环保优势。总之，本发明不仅可以为作物发育生理和逆境生理研究提供实践依据，而且也为动物血液的合理深加工产品开发提供新的实践思路。

本发明所提供的一种含有 Hemin的植物生长调节剂来改善植物和种子农艺性状以及提高代谢功能的方法，还具有以下优点：

1 ) 无污染、环保

由于 CO 本身不是一个自由基，为植物内源代谢产物（浓度通常 1000 ppm), 所有植物体内也都含有 CO降解代谢机制，包括能通过氧化生成 0₂或通过血红蛋白清除；同时， Hemin本身也是来源于各种动物血液，通常用于食品行业的补血剂，因此在农田和温室等各种实践条件下使用低浓度的 CO供体 Hemin溶液也不会对生态环境造成不利影响；此外， Hemin.溶液的使用浓度（ 1000 μΜ)也不会引起人体健康安全问题，由于诱导植物体内释放 CO气体也是逐次产生的，因而也是一种无毒无污染的技术，符合绿色农业的需要；

2) 低成本

本方法采用的 CO供体 Hemin本身是各种动物血液的深加工产品，价格便宜，因此使用成本也较低；

3 ) 稳定性高

与高铁的 Hematin相比，增加了 C1原子的 Hemin化学性质比较稳定，使用起来也比较方便；

4) 应用范围广

本方法专用于包括农用化学品开发、农田化学调控、种源农业的无公害生产、组培、果蔬贮藏以及切花保鲜等领域，其中 Hemin溶液诱导产生的 CO 能够作为信号 /还原分子来提高植物耐 /抗逆性、改善各种农艺性状以及上调各种代谢功能，因此与其它化学调节物质相比还具有多效性的特点。附图说明

图 1 为含有氯化血红素的植物生长调节剂可以缓解渗透胁迫对小麦种子萌发的抑制。

图 2 为含有氯化血红素的植物生长调节剂溶液对黄瓜不定根发生的诱导作用。其中图 1中的 CK为小麦种子在蒸馏水处理 2天时的萌发照片 (对照）， P为 25%的 PEG-6000来模拟干旱胁迫， P+Hm0. P+Hml.O 和 P+HmlO.O分别为 25%的 PEG-6000和 0.1、 1.0以及 10.0 μΜ Hemin的组合处理，表明 CO供体 Hemin可以以浓度依赖性的形式缓解渗透胁迫 2 天对小麦种子萌发的抑制，其中 1.0 μΜ Hemin的效果最好；图 2表明与对照（蒸馏水， CK)相比，不同浓度的 CO供体 Hemin (0.1、 1.0 和 10.0 μΜ) 处理 5天后均可以诱导黄瓜不定根的发生（标尺示为 5 mm)。具体实施方式

本发明所提供的是一种含有氯化血红素（Hemin)的植物生长调节剂来改善植株、植物组织和种子（包括经遗传修饰生物体等）的农艺性状以及提高各种代谢功能和非生物 /生物胁迫耐受 /抗性的方法，其特征在于，配制能释放低浓度 CO气体（ 1000 ppm，采用 GC-MS检测 CO气体释放， Anderson等， J Agric Food Chem, 2005；或血红蛋白比色法检测， Chalmers, Clin Chem, 1991 ) 的终浓度为 0.001〜1000 μΜ的氯化血红素 (Hemin)溶液，并加入 0〜1000 μΜ的 Ca²⁺或 0〜1000 μΜ的水杨酸或 0〜 1000 μΜ的其它农用化学品从而配制成混合溶液；采用上述溶液对植株、植物组织和种子进行灌溉、喷洒、浸泡或浸种等各种处理，包括直接加进包含上述材料的培养基；连续处理 1〜60天，每天 1〜3次。

实施例 1

以青海 9号蚕豆的表皮条为实验材料，采用脱落酸（ABA) 和聚乙二醇（PEG-6000)模拟干旱胁迫作为阳性对照，运用 Hemin (Fluka公司生产）处理蚕豆表皮条 3小时，与对照（缓冲液）相比，发现 Hemin具有与 ABA和 PEG-6000相类似的功能，可以明显诱导气孔关闭，其有效浓度大约在 0.01〜1.0 μΜ之间， Hemin的最佳浓度分别为 0.1和 1.0 μΜ (释放低浓度的 CO气体， 1000 ppm,采用 GC-MS检测 CO气体释放， Anderson等， J Agric Food Chem, 2005 )，暗示低浓度的 Hemin可以参与调节植物对干旱胁迫的应答，诱导气孔关闭，从而增强植物的耐旱性；进一步采用不同稀释倍数的 CO气体饱和水溶液处理蚕豆表皮条，发现 0.1% 和 0.01%饱和度的 CO溶液也能诱导蚕豆叶片气孔的关闭（ 1000 ppm的 CO, 采用血红蛋白比色法检测， Chalmers, Clin Chem, 1991 )。

实施例 2

以 25% (W/V) 的 PEG-6000对 "扬麦 158"小麦种子进行渗透胁迫处理，并通过添加不同浓度（0.1、 1.0和 10.0 μΜ) 的 Hemin (上海鸿儒科技发展有限公司生产）研究外源 Hemin对渗透胁迫下小麦种子萌发的影响（附图 1 )。结果发现，渗透胁迫下的小麦种子萌发受到不同程度的抑制（与正常水分条件下相比，萌发滞后 1〜2天）。 1.0和 10.0 μΜ的 Hemin 促进了渗透胁迫早期（处理 2天内）小麦种子的萌发，其中 1.0 μΜ 的 Hemin处理（P+Hml.O)效果最为明显，表现在处理 2天时萌发率和根长都明显提高（P<0.05或 0.01，表 1 )，另外芽长（数据未列）亦明显高于单独渗透胁迫处理（P)。与单独渗透胁迫处理（P)相比， 1.0 μΜ的 Hemin

(P+Hml.O) 还明显提高了淀粉酶活性（包括 α / β -淀粉酶）（Ρ<0.05，表 2)，促进了淀粉的降解，还原糖的含量也明显上升，同时也显著提高了可溶性糖含量（Ρ<0.05，表 2)。 CO合成抑制剂 ΖηΡΡΙΧ (50 μΜ)和清除剂血红蛋白（Hb， 1 mg/ml) 单独处理对小麦种子萌发无显著影响（图片未列），却逆转了 1.0 μΜ的 Hemin (P+Hml.O)对渗透胁迫下小麦种子萌发的促进作用，包括不同程度上降低了淀粉酶活性和还原糖以及可溶性糖的含量，提高了淀粉含量（表 2)，表明 Hemin促进萌发的有效物质确实是 CO。为了证实上述结果，进一步采用不同稀释倍数的 CO气体饱和溶液处理渗透胁迫下的小麦种子。发现不同浓度的 CO气体饱和溶液均可缓解渗透胁迫对种子萌发的抑制效应。其中， 0.1%的 CO 气体饱和溶液

(P+0.1%CO， CO气体实际浓度 1000 ppm) 的效果最为明显。与渗透胁迫（P) 相比， P+0.1%CO处理后的小麦种子萌发率和根长都有显著的提高（具体数据未列）。

实施例 3

"露丰 "黄瓜种子（江苏省农科院提供）经水浸泡后，播种于铺有 2~ 3层白色纱布的搪瓷盘中，加双蒸水保持湿润。先在 25土 Γ〇的光照下（光照强度为 200 μ mol · m"² · s"¹ , 光周期为光 14小时 /暗 10小时）培养 5 天后切除主根，并放进不同浓度的 CO供体 Hemin溶液中培养 5天，最后量取 >lmm的不定根数目，发现与对照（蒸馏水， CK) 相比， 0.1、 1.0 和 10.0 μΜ 的 Hemin处理均可以显著诱导黄瓜不定根的发生（附图 2，标尺示为 5 mm

实施例 4

Hemin (用 Hm表示）购至上海鸿儒科技发展有限公司。挑选大小一致的水稻 "武育粳 3号"种子，用 0.1%的 KMnO4表面消毒 3分钟，冲洗干净，清水浸种 24小时后于 30°C下暗处催芽，每个培养皿中放置 50 粒，并设置如下处理：对照（CK)， O.lM NaCl; Hm 10.0， O.lMNaCl +10.0 μΜ Ηπι + 1.0 M CaCl₂; Hml.0, 0.1M NaCl +1.0 μΜ Hm + 1.0 μΜ CaCl₂; Hm O.l , 0.1M NaCl +0.1 μΜ Hm + 1.0 μΜ CaCl₂, 各处理溶液每天更换一次。结果表明，一定浓度范围的 Hm能促进盐胁迫下水稻种子的萌发，其中以 Hm 1.0和 Hm O.l的效果最为明显。例如，盐胁迫下水稻种子经 Hm 1.0处理 36小时便开始萌发，比对照提前约 6小时；处理 48小时后，种子的根长、根数和芽长均明显超过对照。与对照相比，经 Hm 1.0和 Hm O.l 处理 48小时后，水稻种子的发芽势分别提高了 59.2%和 39.4%，发芽率分别提高了 33.3% 和 23.8%，发芽指数也分别提高了 50.4% 和 34.8% (表 3和表 4)。此外， Hm 1.0处理还显著提高了盐胁迫下水稻种子萌发过程中淀粉酶的活性，增加了还原糖与可溶性总糖的含量（表 5 )。

实施例 5

采用 1.0 μΜ 的 Hemin处理 O.lM NaCl盐胁迫下的 "武育粳 3号"水稻幼苗 2天时，发现 Hemin能够增强叶片的保绿水平，延缓叶绿素的降解速率，减少根系和叶片膜脂过氧化水平，降低丙二醛（MDA) 的积累，并且该浓度的 Hemin (+Hm) 可以通过增强水稻幼苗的抗氧化能力来行使其对盐胁迫下植物细胞氧化损伤的保护作用。例如叶片 CAT (过氧化氢酶）、 APX (抗坏血酸过氧化物酶）、 POD (过氧化物酶）和 SOD (超氧化物歧化酶）等抗氧化酶的活性分别比对照（无 Hemin的有盐培养液， -Hm)提高了 263.5%、 45.9%、 170.0%和 78.5% (表 6A),而根系的 APX、 POD和 SOD活性分别提高了 150.4%、 108.9%和 145.7% (表 6B：)。

实施例 6

试材为切花月季 "影星"购于南京市的园艺场。在 1 小时内运回实验场所，复水 2 小时，挑选开花级数为 2的鲜花，处理前修剪枝叶，只保留两片复叶，花枝长 30 cm。每瓶插 5枝，每组处理 30枝，重复 3次，瓶插液 250 mL，室温为 25〜30°C，相对湿度 35〜60 %，并在散射光下进行实验。各种瓶插液处理设置如下： CK (对照）：蒸馏水； HmO. l : 0.1 μ Μ Hemin; HmO.01 : 0.01 μ M Hemin; HmO.001 : 0.001 μ M Hemin; SA: 1.0 μΜ 水杨酸（切花保鲜剂中常见的抗氧化剂）； Hm0.01+ SA: 0.01 μ M Hemin +1.0 μΜ 水杨酸； HmO.OO SA: 0.001 μ Μ Hemin +1.0 μΜ 水杨酸。所用化学试剂均直接添加到瓶插液中，且对瓶插液所用的瓶子进行密封处理。结果发现， HmO.O SA处理的效果最好，比对照（6.1天）平均延长切花瓶插寿命 4.4 天，并与处理 6 天后开花级数的缓慢增长相一致，但对花径增大率则没有明显影响； HmO.01的处理效果也比较好，与对照相比平均延长了 4.1天（表 7)，表明低浓度的 Hemin和 SA的组合处理（Hm0.01+ SA) 可以作为切花保鲜剂。

实施例 7

将 Hemin配制成不同浓度（0.1、 1.0和 10.0 μ M) 的溶液，在上海大棚甜瓜种植区进行 Hemin灌溉试验，品种为西薄洛托，试验小区面积为 100m²。 Hemin处理是连续 60天，每天 1〜3次。结果表明， Hemin处理明显促进甜瓜产量的提高，并改善果实品质。与对照（CK) 相比，上述 Hemin浓度的处理小区平均单产分别增加 21.5%， 37.1%和 16.4%，果实可溶性固形物增加 7.2%, 12.7%和 -1.2% (表 8)。

实施例 8

供试番茄砧木品种为 LS-89(江苏省农科院提供）。番茄砧木采用 50 孔穴盘育苗，按常规方法管理。育苗期间的平均昼夜温度为 25.6'C/15.8°C。幼苗长至 8 叶 1心时，移入光强 300 mol « m'² - s- 光周期 12小时 /12 小时的光照培养箱内，先在昼夜温度为 15°C/10'C的条件下预处理 2天，再置于昼夜温度为 10°C/5°C下进行处理。处理过程中，每隔 3天取样一次，每品种每次取 10株，重复 3次。另 Hemin配制成不同浓度（0.1、 1.0和 10.0 U M) 的溶液。与对照（CK)相比，第 12天上述 Hemin浓度处理番茄砧木后的冷害指数分别比对照下降 21.7%， 38.4%和 20.2% (表 9)。

实施例 9

采用江苏省广泛栽培的优质粳稻品种 "武育粳 7号"，取成熟饱满的水稻种子去颖壳，用 75 %酒精浸泡 30 秒，再用 20 % NaClO₄ 灭菌 30分钟，无菌水清洗 7〜8次，最后用无菌水浸泡 4〜5小时，将种子置于无菌滤纸上吹 30分钟，取胚接种在诱导培养基上，待 3周后诱导出米黄色的愈伤组织，取愈伤组织接种在分化培养基上一定的时间后用于生根培养。同时在生根培养基中加入 Hemin，使其终浓度分别为 0.1、1.0和 10.0 μ M。结果发现：与对照相比，上述 Hemin处理的水稻愈伤组织，其生根率分别增加 20.9%、 28.4%和 5.7%，同时前两种浓度处理显著地提前了水稻愈伤组织发根，分别提前了 1.9天和 3.7天（表 10)。

实施例 10

将 Hemin配制成不同浓度（0.1、 1.0和 10.0 μ M) 的溶液，并与 "灭铃皇（10克 /公顷）" 复配杀虫剂配制成混合溶液。通过不同浓度的 Hemin 溶液的喷雾处理来研究转 Bt基因棉对棉铃虫幼虫的抑制生长作用，实验品种为美国 Monsanto公司的抗虫棉品种 "保铃棉 32B"。对 3龄幼虫抗性测定结果表明，取食 32B嫩叶 3天后， Hm0.1、 Hml.O和 HmlO.O处理的幼虫取食量、体重比、相对生长率及粗生长效率较取食对照棉（CK，泗棉 3号）后有明显以处理浓度依赖性的形式减退。上述结果表明， Hemin 处理后转 Bt基因棉对棉铃虫的抑制生长作用增强（表 11 ), 表明 Hemin 可以有效地作为杀虫剂的增效剂。实施例 11

试验地点在云南省华宁县，供试品种为云烟 87，防治对象为烟草花叶病毒病（TMV)。对照用清水喷施，将 Hemin配制成不同浓度（0.1、 1.0和 10.0 μ Μ) 的溶液为其它处理，分别记作 CK、 HmO. Hml.O和 HmlO.O。在烟苗移栽后还苗时开始施第一次药剂，以后每隔 8天施一次药，连续用药 3次。调查各小区的全部烟株。按病害严重度 0〜4级分级标准，分别记载各处理的总株数、各级病株数，并计算病情指数和防治效果。在施药后第 8、 16和 24天调查各处理烟株药害情况。大田结果显示，不同浓度的 Hm处理液可以有效的提高烟草抗烟草花叶病毒的能力，其中以 HmO.l处理最为显著，第 24天的防治效果高达 76.1% (表 12)，同时黄酮类化合物含量也明显升高（具体数据未列）。

实施例 12

将 Hemin配成浓度为 0.1、 1.0和 10.0 μΜ的溶液。在山东省潍坊市高密市豌豆种植区进行 Hemin应用试验，豌豆品种箭舌 ^1豆 881 由山东省农科院提供，试验小区面积为 100 m²。结果表明，豌豆幼苗叶片的 SOD 活性对低浓度 Hg具有应激性诱导效应，在 10 M HgCl₂浓度下活性升高 12.8%, 加入 Hemin (0.1和 1.0 μΜ) 后其活性随 Hemin浓度升高而进一步上升。此外，与单独 Hg 处理（对照）相比，超氧阴离子产生速率、丙二醛含量和细胞膜透性在一定范围内随 Hemin的浓度升高而下降，其中 1.0 μΜ 的 Hemin处理（Hml.O) 效果最好（表 13 )。

实施例 13

配制浓度为 O.lM NaCl的 0.6%琼脂溶液，分别装于 100 ml的玻璃烧杯中，每个处理重复 3次。待琼脂溶液冷却并凝固后，将分别用 0.1、 1.0 和 ΙΟ.θ μΜ 的 Hemin (Hm, Fluka公司生产，均包含 100 μΜ 的 CaCl₂) 溶液浸种 48小时的 "武育粳 3号"水稻种子随机选出，插入琼脂中，每个烧杯放置 12粒种子，接着将烧杯放入周转箱中，在人工气候箱（温度

30°C，湿度 70%) 中生长。盐胁迫 5天后，水稻幼苗的生长受到明显抑制，表现为生长速率下降，株高降低，发根数减少、根长变短；而采用 0.1和 1.0 μΜ的 Hm浸种可以不同程度的缓解盐胁迫对水稻幼苗生长造成的抑制作用，促进幼苗株高的增加、幼叶形成以及根的生长和伸长，而 10.0 μΜ 的 Hm处理相对不明显。例如， 1.0 μΜ 的 Hm处理后的幼苗地下部和地上部的干重以及根冠比分别比对照增加了 48.1%、 25.8%和 17.8%。另一方面， 1.0 μΜ Ηπι处理的幼苗籽粒质量也明显下降，暗示低浓度的 Hm也可以加速水稻种子贮藏物质的降解，上述结果表明低浓度的 Hm处理可以提高水稻幼苗的耐盐性。

实施例 14

取三叶一心的小麦 (扬麦 158)植株的第 2片叶片，先用 0.01和 0.1 μΜ 的 Hemin以及蒸馏水（对照）在 25Ό黑暗条件下预处理 24小时，再用 10 mg L 的 Paraquat (百草枯）或 150 mM的 H₂O₂在 25°C黑暗条件下处理 3小时。发现，对照样品产生明显的氧化损伤，而 Hemin处理的叶片受损较轻或几乎不受损伤。同时， 0.01和 0.1 μΜ Hemin处理的叶绿素含量比对照高出了 12.15%和 26.10%；小麦叶片中 CAT、 POD、 APX和 SOD 的活性明显升高， MDA含量也明显降低，说明 Hemin预处理有效提高了小麦叶片的抗氧化能力， Hemin可以作为包括 Paraquat和 Diquat等诱发活性氧过量产生类型除草剂的保护剂。

实施例 15

蕃茄在 0.5%的次氯酸钠中浸泡 20分钟，冲洗后在水中培养 3天。种子根长至 2〜3 mm 时移至含滤纸和 4 ml不同处理液的培养皿（60 mm直径）中培养，并进一步在 25 ± 1 °C和 14 小时 /10小时（L:D)光周期， 200 μ mol · m_² · s'¹光强条件下培养。经过 5天的处理后，测量主根长和侧根数（以侧根长 >lmm作为相关的指标）。结果发现， Hemin在 1〜40 μ Μ 浓度范围内均能诱导番茄侧根发生，与清水处理（对照， CK) 相比有显著的促根效应，尤其是浓度为 1.0 μ Μ的 Hemin处理后的番茄，其侧根的数目是对照（CK)的两倍；而在浓度超过 50 μ Μ后， Hemin则对侧根生长有明显的抑制现象。供试材料为 "玉露"桃果实，采自浙江省奉化市，在果实底色转白期 (约 7成熟）采收。采收当天运回实验室，挑选大小均匀的果实进行处理，每一处理果实 60公斤。各种处理如下：（1 )水浸果 5分钟作为对照；（2 ) 1.0 μ Μ 的 Hemin 浸果 5分钟作为处理。处理后贮藏于 20°C下，定期测定果实的成熟进程及其相关生理指标。结果发现 Hemin处理可以延缓桃果实老化进程，降低采后果实细胞膜透性的增加速率，果实的硬度比对照要提高 30%以上，延迟乙烯的释放，同时 ACC合成酶活性和 ACC的累积也被明显抑制（P<0.05 ); 此外，电子传递链的活性也被明显抑制，从而有效降低活性氧的产生。上述结果表明，一定低浓度的 Hemin可以作为水果贮藏的保鲜剂，适当延长货架期。

实施例 17

在长安 10号板栗雄花序长出 7〜10支（最长的花序约 5〜6 cm ) 时喷布终浓度分别为 1000 μ M 的 Hemin和 CaCl₂的混合溶液，结果率增加 48%〜202%，魁栗增产 165%; 同时处理 60天后使雄花数量减少而且变短，使原采后再形成的幼果（俗称二次果）能提前正常发育，形成产量；叶片中的叶绿素含量增加 26.7%以上，光合作用强度从 7.19 mol CO₂ m'². 增加到 17.11 μ πιοΐ CO₂ m ². ^l , 从而提高了光合生产能力；板栗叶片中形成的光合产物如可溶性总糖、蔗糖和淀粉的速率分别比对照（喷布水）提高了 59.0%、 240%和 93.0%。

实施例 18

用 Hemin控制蔬菜花性别，提高产量。在秋大棚黄瓜品种 "津优 11 号" 的 4片真叶时，用 1000 μ Μ 的 Hemin喷洒叶面，能明显地增加雌花数，提高瓜秧的抗病、抗冻能力。由于雌花数增加，早期产量和总产量可以分别增加 43%以上。在人头南瓜有 3〜4片真叶时，用 1000 μ Μ 的 Hemin溶液喷洒植株，每 10〜15天喷 1次，共喷 3次，可以增加雌花数，并提早成熟 10〜20天，总产增加 30%左右。

- 16 - 表' 1. 不同浓度的 Hemin对渗透胁迫下小麦种子萌发率及根长的影响

( *和 **分别代表与处理 ( P) 相比差异达到显著以及极显著水平，尸 <0.05或 PO.01 )

萌发率（％) /根长（_cm)

1天 2天 3天 4天 5天未检测， 93.7±3.79/ 95.7±2.89/ 96.7±2.08/ 98.3±0.58/

CK

下同 2.88±0.66 7.00±0.99 7.44±0.78 8.88±0.81

34.0±3.61/ 54.0±1.73/ 57.3±2.52/ 59.0±1.00/

P

1.35±0.42 3.17±1.03 5.45±0.81 6.33±0.72

38.0±3.46/ 53.3±3.06/ 55.7±2.52/ 57.7±1.58/

P+Hm0.1

1.40±0.37 3.38±0.98 6.13±0.82 7.09±0.81

45.3±1.53**/ 57.0±1.00*/ 58.3±0.58/ 58.7±0.58/

P+Hml .O

1.98±0.17* 3.84±0.94 6.51 ±0.76 7.84±0.86

41.0±4.58*/ 51.7±5.13/ 55.7±3.21/ 58.0±2.00/

P+HmlO.O

1.31 ±0.32 3.55±0.87 5.76±0.74 7.60±0.98

2. CO供体 Hemin及其合成抑制剂 ZnPPIX、清除剂 Hb对渗透胁迫 2天时的小麦种子萌发过程中储藏物质降解及淀粉酶活性的影响

(*表示与处理（P) 相比达到 Ρ< 0.05的差异显著水平)

~ Ζ 储藏物质降解及淀粉酶活性（10² mg/g DW)

可溶性糖含量还原糖含量淀粉含量淀粉酶活性

CK 1.71 ±0.04 1.57±0.06 2.09±0.03 32.97±0.03

P 0.91 ±0.05 0.83±0.10 3.54±0.11 24.00±0.34

P+Hml .O 1.51 ±0.04* 1.20±0.04* 2.53±0.06* 40.01±0.35*

Hml .O 2.03±0.10 1.74±0.12 1.95±0.11 31.08±0.14

ZnPPIX50 1.35±0.16 1.23±0.09 2.76±0.01 31.80±0.21

Hbl .O 1.56±0.03 1.35±0.04 3.14±0.12 18.52±0.31

P+Hml .0+ZnPPIX50 0.89±0.02 0.79±0.00 3.95±0.21 * 28.49±0.45

P+Hml .O+Hbl .O 1.04±0.09* 0.93±0.00* 3.81±0.00* 29.68±0.26

表 3. Hemin处理 2天对盐胁迫下水稻种子萌发的影响

处理发芽势（％) 发芽率（％) 发芽指数 (%)

CK 28.4±0.83 67.3±1.24 52.8±2.06 ~~

HmlO.O 27.2±1.30 72.6±0.47* 60.1±1.32*

Hml.O 45.2±1.67** 89.7±0.94** 79.4±2.56**

Hm 0.1 39.6±0.84** 83.3±0.56** 71.2±1.16** 分别代表与 CK相比差异达到显著以及极显著水平，或尸 <0.01, 表 4和 5

表 4. Hemin处理 2天对盐胁迫下水稻幼苗生长的影响

处理根数（个）根长（cm) 芽长（cm)

CK 3.49±0.23 2.16±0.12 2.65±0.26 HmlO.O 4.08±0.78 2.21±0.27 2.50±0.11 Hml.O 5.03±0.81* 2.62±0.11* 3.02±0.17* Hm 0.1 4.31±0.86 2.42±0.26 2.89±0.18

5. Hemin (处理 2天）对盐胁迫下水稻种子萌发过程中淀粉酶活性、还原糖和可溶性总糖含量的影响

淀粉酶活性还原糖含量可溶性总糖含量处理.

(10² mg/gDW) (10mg/gDW) (10mggDW)

CK 11.09±0.55 4.64±0.54 7.74±0.84

HmlO.O 12.13±0.81 5.96±0.89 10.32±1.08**

Hml.O 18.63±0.93** 7.29±0.88** 14.12±1.02**

Hm 0.1 13.02±0.85* 5.79±0.63 10.61±0.53** 表 6. 1.0 μΜ 的 Hemin对盐胁迫 2天时水稻叶片（A ) 和根系（B ) 抗氧化酶活性 ( SOD活性为 U«g— 'DW, 其它为 μπιοΐ· min '.g-' DW) 的影响

(A)

处理 CAT APX POD SOD

- Hm 56.16±5.36 2.68±0.44 19.43±0.81 70.1 ±4.6

+Hm 204.13±12.93** 3.91±0.57* 52.47±4.28** 125.1±6.4**

(B)

处理 APX POD SOD

- Hm 2.78±0.14 81.45±0.65 44.0±2.2

+Hm 6.96±0.28** 170.13±11.17** 108.1±5.8** 分别代表与- Hm处理相比差异达到显著以及极显著水平，或 /><0.01

表 7. 不同浓度的 Hemin处理对切花月季 "影星"瓶插寿命的影响处理瓶插寿命 (天）较对照增加 (％)

CK 6.1±0.1 ―

HmO.l 5.4±0.2 -11.5

HmO.Ol 10.2±0.1 ** 67.2

HmO.001 8.6±0.3** 41.0

SA 8.2±0.3** 34.4

HmO.Ol +SA 10.5±0.1** 72.1

Hm0.001+SA 9.0±0.2** 47.5

**代表与对照（CK) 处理相比差异达到极显著水平，尸<0.01 表 8. 不同浓度的 Hemin处理对甜瓜产量及品质的影响亩产（kg/666.7m²) 可溶性固形物％

C 1 120 16.6

HmO.l 1361 17.8 Hml .O 1535 18.7 HmlO.O 1304 16.4

表 9. 不同浓度的 Hemin处理对番茄砧木冷害程度的影响处理天数冷害指数％

CK HmO. l Hml .O HmlO.O

0 0 0 0 0

3 2.3 2.0 1.6 1.9

6 10.0 8.9 6.9 8.8

9 13.1 10.6 8.1 11.4

12 20.3 15.9 12.5 16.2

表 10. 不同浓度的 Hemin处理对水稻愈伤组织生根的影响处理生根率％平均根长 cm 根形成时间（天)

C 70.4 3.8 15.1

HmlO.O 74.4 4.3 14.2

Hml .O 90.4 5.6 11.4

HmO. l 85.1 5.2 13.2 表 11. 不同浓度 Hemin处理转 Bt基因棉 32B对棉铃虫的抑制生长作用

取食量取食量体重比体重比相对生 PGR 粗生长 ECI减处理 (mg 减退率减退率长速率减退率效率退率

头） (%) (%) (PGR) (%) (ECI) (%)

C 198.0 - 2.54 - 0.28 - 24.12 -

HmlO 128.6 35.1 1.68 33.9 0.17 39.3 14.00 42.0

Hml .O 151.4 23.5 2.02 20.5 0.23 17.9 18.35 23.9

HmO.l 184.0 7.1 2.36 7.1 0.26 7.1 20.70 14.2

表 12. 不同浓度的 Hemin处理对大田烟草抗烟草花叶病毒（TMV) 能力的影响

8 天 16天 24天处理

病情指数防治效果（％) 病情指数防治效果（％) 病情指数防治效果（％)

CK 7.95 ― 12.35 一 18.65 ―

HmlO.O 7.55 5.03 10.24 17.1 11.33 39.2

Hml .O 6.23 21.6 6.41 48.1 6.50 65.1

HmO.l 3.21 59.6 4.12 66.6 4.45 76.1

表 13. 不同浓度的 Hemin处理 3天对 Hg胁迫下豌豆幼叶抗氧化能力的影响

CK HmO.l Hml .O HmlO.O

SOD活性 ΪΟΟ 122.2±9.1 142.3±5.2 126.9±9.2

/%

超氧阴离子产 100 84.3±2.0 65.3±4.2 90.2±1.7 生速率％

丙二醛 /% 100 87.4±5.3 64.7±3.2 91.2±4.3 细胞膜透性 /% 100 82.1±0.9 . 72.1 ±5.1 91.3±7.0

*超氧阴离子产生速率、丙二醛含量和细胞膜透性以对照（CK,单独 Hg处理）作为 100%

Claims

权利要求书

1. 一种含有氯化血红素的植物生长调节剂，其特征是，该植物生长调节剂含有氯化血红素，配制成溶液后氯化血红素的有效终浓度为 0.001~1000 μΜ。

2. 根据权利要求 1所述的一种含有氯化血红素的植物生长调节剂，其特征是，该植物生长调节剂配制成溶液后还含有终浓度为 0~1000 μΜ的 Ca²⁺ 或终浓度为 0~1000 μΜ的水杨酸或 0~1000 μΜ的其它农用化学品。

3. 根据权利要求 1或 2所述的一种含有氯化血红素的植物生长调节剂，其特征是，该植物生长调节剂能诱导植物体内逐步释放总浓度 1000 ppm 的一氧化碳气体。

4. 权利要求 1或 2所述一种含有氯化血红素的植物生长调节剂的应用，其特征在于：采用权利要求 1或 2所述的一种含有氯化血红素的植物生长调节剂对植株、植物组织或种子进行灌溉、喷洒、浸泡或浸种处理，或者直接加进包含上述植物材料的培养基，以提高非生物或生物胁迫耐受性或抗性，并改善各种农艺性状或代谢功能；连续处理 1~60天，每天 1-3次。

5. 根据权利要求 4所述的植物生长调节剂的应用，其特征是，所述植株、植物组织和种子，包括种植在大田和温室的单子叶植物、双子叶植物或裸子植物以及经遗传修饰生物体的植株、组织和种子；

各种非生物胁迫，包括盐害、渗透胁迫、干旱和渍水胁迫、冷害、热激、紫外线照射、臭氧、创伤、金属毒害、除莠剂的过量或错误使用，而生物胁迫包括各种虫害和病原菌侵染；

所述各种农艺性状和代谢功能以及非生物 /生物胁迫耐受 /抗性，是指在播种、萌发、生根、生长、移栽、枝插、分蘖、开花、果实形成与成熟、组织培养的各种发育与生产阶段，以及各种天然或人为导致的生物与非生物胁迫条件下，包括诱导 α I β淀粉酶活性从而缓解各种胁迫对种子萌发的抑制以及提高正常条件下种子萌发率以及打破休眠、延缓老化和衰老进程、延长货架期、诱导侧根和不定根的发生、上调各种抗氧化酶基因表达和合成以及酶活性的提高、下调各种活性氧产生系统的运转速度、延缓脂质过氧化产物的生成、诱导植物叶片的气孔关闭以及保绿作用、提高地上 /地下部组织的干鲜重以及伸长 /生长速率、增加农作物产量和改善品质、增强植物的抗病性和抗虫性、重金属抗性以及诱导脯氨酸、黄酮类化合物以及植保素的合成。

6. 一种氯化血红素用于植物生长调节的方法，其特征是，

1 ) 配制含有氯化血红素的植物生长调节剂溶液：该溶液中氯化血红素有效终浓度为 0.001~1000 μΜ;

2) 用含有氯化血红素的植物生长调节剂溶液对植株、植物组织或种子进行灌溉、喷洒、浸泡或浸种处理，或者直接加进包含上述植物材料的培养基，以改善各种农艺性状或代谢功能以及非生物或生物胁迫耐受性或抗性；连续处理 1~60天，每天 1〜3次。

7. 根据权利要求 6所述的氯化血红素用于植物生长调节的方法，其特征是，配制的含有氯化血红素的溶液中还含有终浓度为 0~1000 μΜ的 Ca²⁺ 或终浓度为 0~1000 μΜ的水杨酸或 0~1000 μΜ的其它农用化学品。