WO2008038329A1 - Appareil de mesure de la gélification et cuve à échantillon - Google Patents

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Yoshiaki Shirasawa
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Kowa Kabushiki Kaisha
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Definitions

  • the present invention relates to a gel wrinkle measuring apparatus and a sample cell for measuring the concentration in a sample to be measured such as endotoxin and ⁇ -D dulcan by detecting the gelation phenomenon process.
  • Endotoxin is a lipopolysaccharide (polymer complex of phospholipid and polysaccharide) that constitutes the cell wall of Gram-negative bacteria, and lipids and polysaccharide chains called lipid ⁇ are 2-keto -3- Lipopolysaccharide (LPS) linked via deoxyoctonic acid (KDO). It is released only after the cell wall is broken due to the death of bacteria. Endotoxin is a harmful substance that has various effects on the body, especially fever, fatal sepsis and shock, and is considered to be one of the triggers of DIC (disseminated intravascular coagulation group). ing.
  • DIC disspirinated intravascular coagulation group
  • a configuration is known in which the process of Limulus reagent reaction is optically measured, in particular, a measurement based on a turbidimetric method for measuring a change in transmitted light amount associated with a gelation reaction.
  • a configuration is known in which the endotoxin concentration of a specimen is measured by measuring the change in transmitted light intensity over time of a mixed solution in which a Limulus reagent is mixed (a patent document 1 below).
  • ⁇ -D glucan is a polysaccharide (polysaccharide) that forms a cell membrane characteristic of fungi.
  • ⁇ -D glucan By measuring ⁇ -D glucan, it is effective for screening a wide range of fungal infections including rare fungi as well as common clinical fungi such as Candida spp. and Talyptococcus. .
  • Measurement methods for endotoxin and ⁇ -D-dulcan have similarities. For example, using a similar measurement method and software, it is selective for endotoxin by removing the central factor G component of the blood extract component of horseshoe moth. Gelling reaction and color reaction can be measured, and the endotoxin in the sample is inactivated by pretreatment, so that the gelation reaction and color reaction selective to ⁇ -D dulcan can be measured.
  • Patent Document 1 Japanese Patent Laid-Open No. 2004-93536
  • the conventional limoless test has the following problems.
  • the gelation method is a method of measuring the time until a gel with low fluidity is formed by adding a sample to a Limulus reagent solution and allowing to stand at a constant temperature.
  • the turbidimetric method is also a method in which the turbidity change associated with the gelation reaction is treated as a change in the amount of transmitted light, and the time until the amount of transmitted light changes by a certain percentage from the start of the reaction is measured as the gelling time. is there.
  • the gelation method and the turbidimetric method cannot detect the exact gelation start time of the sensitivity, ⁇ ⁇ The amount of reaction is calculated from the time until completion, and a rough standard for gelling time is obtained. Therefore, both the gelation method and the turbidimetric method are not suitable for cases where urgent treatment is required or a large number of samples are measured. Furthermore, the turbidimetric method may cause nonspecific turbidity that is unrelated to endotoxin, resulting in poor measurement accuracy.
  • the measurement limit concentration of the gel method is 3 pg / ml, and the measurement limit concentration of the turbidimetric method is about lpg / ml.
  • the chromogenic synthetic substrate method has a measurement time as short as 30 minutes, compared with the gel moth method and the turbidimetric method, but a false positive reaction may occur, and measurement with high specificity can be performed. It is difficult and the measurement preparation is complicated, and the measurement limit concentration is 3pg / ml, which is inferior to the turbidimetric method.
  • An object of the present invention is to solve the above-mentioned problem and to make it possible to measure specifically and specifically the concentration of a substance such as endotoxin or ⁇ -D glucan that is measured by a gelation reaction in a short time. There is.
  • a light receiving element that receives the scattered light from the laser beam of each gel particle generated in the sample cell
  • Measuring means for measuring the diameter and number of gel particles in time series based on the scattered light detection output of the light receiving element
  • a configuration provided with means for displaying the measured scattered light intensity or diameter of gel particles and the number thereof was adopted.
  • a reagent that causes gelation of the substance to be measured, and a stirring means for stirring the sample after the sample is added and the solution of the reagent are sealed in advance.
  • a configuration constituted by a container sealed by a sealing member was adopted.
  • a container force in which a reagent that causes gelation of a substance to be measured in the sample cell, a sample after the sample is added, and a stirring unit that stirs the solution of the reagent are sealed in advance and sealed by a sealing member.
  • FIG. 1 is an explanatory diagram showing a configuration of a measuring apparatus employing the present invention.
  • FIG. 2 is an explanatory view showing an example of measuring endotoxin by the measuring apparatus of FIG.
  • FIG. 2 is an explanatory view showing an example of measuring endotoxin by the measuring apparatus of FIG.
  • FIG. 2C is an explanatory view showing an example of measuring endotoxin by the measuring apparatus of FIG.
  • FIG. 2D is an explanatory view showing an example of measuring endotoxin by the measuring apparatus of FIG.
  • FIG. 3 is an explanatory view showing an example of measuring endotoxin by the measuring apparatus of FIG.
  • FIG. 3 is an explanatory view showing an example of measuring endotoxin by the measuring apparatus of FIG.
  • FIG. 3C is an explanatory view showing an example of measuring endotoxin by the measuring apparatus of FIG. 1.
  • FIG. 5 is a waveform diagram showing a measurement signal obtained from the scattered light measurement system of the measurement apparatus of FIG.
  • FIG. 6 is an explanatory diagram showing a circuit of a scattered light measurement system of the measurement apparatus of FIG. 1.
  • FIG. 7 is an explanatory diagram showing the configuration of the sample cell of the measuring apparatus of FIG. 1.
  • FIG. 1 shows the configuration of a measuring apparatus employing the present invention.
  • the laser beam for measuring the intensity of scattered light that is also irradiated by the semiconductor laser 11 is reflected by the condensing lens 12. And is irradiated to the vicinity of the inner wall of the sample cell 13 (made of glass, for example). Further, in order to measure the transmitted light, the light of the light emitting diode (LED) 14 is irradiated to the sample cell 13 and the transmitted light is received by the photodiode 22.
  • LED light emitting diode
  • the sample solution 16 in the sample cell 13 is kept at a constant temperature of 37 ° C in order to generate fine and uniform gel particles, and is rotationally stirred at lOOOrpm by a stirrer bar (stirring bar) 25 and a magnetic stirrer 15 Is done.
  • Scattered light from the gel particles in the sample solution 16 is measured by the photodiode array 18 which also has the photodiode force of a plurality of light receiving elements via the light receiving lens 17, and the measurement result is output as an electric signal.
  • the photodiodes of the photodiode array 18 those having a light-receiving area capable of receiving scattered light having an observation area that can statistically measure only one gel particle are used.
  • the output of the photodiode array 18 is converted from current to voltage by an amplifier 19, then AD converted by an AD converter 20, and input to a computer 21.
  • the transmitted light detected by the photodiode 22 is also input to the computer 21 through the same amplification ZAD conversion (not shown).
  • the scattered light measurement signal converted into a digital signal is subjected to signal processing by a computer 21 configured using, for example, personal computer hardware.
  • the computer 21 is a network interface for inputting / outputting measurement results or measurement information to / from other devices, such as an operation device such as a keyboard and mouse (not shown), a display for displaying measurement results, or an output device such as a printer. Etc. are included.
  • FIG. 4 shows the configuration of the scattered light measurement system in FIG. 1 in detail.
  • the scattered light from the sample solution force is measured as an electrical signal by the photodiodes 18a to 18d of a plurality of light receiving elements constituting the photodiode array 18 via the lens 17 in FIG.
  • a pinhole 77 is arranged to receive scattered light from the observation region where only one gel particle to be measured can be measured.
  • the outputs of the photodiodes 18a to 18d are converted from current to voltage by the amplifier 19 and amplified, then AD converted by the AD converter 20 and input to the computer 21.
  • the size of one gel particle to be measured necessary for determining the size of each pinhole 77 can be determined by statistically calculating the force of measurement results obtained by intensive calculation.
  • the level of the scattered light intensity signal is identified by a plurality of comparators provided in accordance with the particle size of the gel particles, and the comparator force also has a predetermined particle size by counting the output signal with a counter. The number of gel particles is measured. In that case, the particle size of the gel particle, which is erroneously measured when a part of the gel particle passes through the edge of the pinhole 77, is calculated using a combination of statistical probability theory and standard particle measurement force. It is corrected by the measurement software of the data.
  • FIG. 5 shows a change state of the scattered light intensity signal measured by the photodiodes 18a to 18d of FIG. 4 in the gelation measurement process.
  • the scattered light of the gel particle force is measured as the peak signals 83a to 83d related to the particle size, and the scattered light of the other partial force of the sample solution is measured as the knock ground signals 84a to 84d.
  • the output signals from the photodiodes 18a and 18b of the two light receiving elements are respectively input to the operational amplifier 85 as shown in FIG. Subtracted.
  • the background signal is canceled and only the change in the intensity of scattered light due to the force of only the gel particles is measured, as shown at 86.
  • the signal from which the background signal has been removed is input to the absolute value circuit 87.
  • the output of the absolute value circuit 87 becomes a signal of only a peak signal without a background.
  • each comparator performs a level comparison corresponding to the particle size of the gel particles
  • each output of the comparator is a signal corresponding to the particle size of the gel particles. This signal is incremented by counters 91-1, 91-2,.
  • the counted data is input to the arithmetic circuit 92 (or directly to the computer 21) and used for the gel particle measurement process described later.
  • the computer 21 in Fig. 1 measures the scattered light intensity or diameter and the number of gel particles, and displays them on a display.
  • the time from when the total scattered intensity Xt above a certain level is measured TL (The concentration of the target substance is calculated by a computer based on the correlation between the delay time) and the amount (concentration) of the substance to be measured in the sample solution.
  • the concentration of the substance is calculated by a computer and displayed.
  • the concentration of the target substance is calculated by a computer based on the correlation between the maximum generation amount Xmax of the gel particles generated by the gelling reaction and the amount (concentration) of the substance to be measured in the sample liquid, and displayed.
  • Fig. 2A shows the measurement result of the sample containing endotoxin 0.00pg / ml
  • Fig. 2B shows the measurement result of the sample containing endotoxin 0.31pgZml
  • Fig. 2C shows the measurement result of the sample containing endotoxin 1.25pgZml
  • Fig. 2D shows the measurement results of the total scattered light intensity and transmittance of the sample containing endotoxin 5.00pgZml.
  • the computer 21 displays on the display a time-series change in the total scattering intensity Xt of the gel particles accompanying the gelling reaction.
  • the time TL until the total scattered intensity Xt above a certain level is measured, the maximum value Vmax of the gel particle generation rate Vmax, and the maximum generation amount Xmax of the gel particle generated by the gely reaction are calculated and displayed on the display.
  • the transmittance change of the sample is also measured, calculated and displayed on the display.
  • the transmittance gradually decreases in the sample not containing endotoxin. Therefore, in the conventional turbidimetric method for measuring transmittance, what is endotoxin? Irrelevant non-specific turbidity appears as a problem to be detected.
  • the total scattered light intensity measured with this device from the sample of FIG. 2A has not changed at all, and the laser particle scattering measurement of the present invention using the total scattered light intensity does not cause nonspecific turbidity. It turns out that it does not measure. Even in the measurement of each sample in Fig. 2B, Fig. 2C, and Fig. 2D, the non-specific turbidity as described above is detected through the decrease in transmittance in the turbidimetric method.
  • the turbidimetric method employs a method called turbidimetric time analysis, and the correlation between the time required for the transmittance to reach a certain value (the gelling threshold) and the endotoxin concentration.
  • the gelling threshold a certain value
  • the endotoxin concentration a certain value
  • the gelation judgment threshold is set low
  • the gelation judgment threshold is set large
  • nonspecific turbidity is erroneously measured as the amount of endotoxin and measured.
  • accuracy becomes worse. For example, in Fig.
  • the gelling threshold is set as small as 70% transmittance, it will be impossible to determine the measured value of low concentration of endotoxin 0.31 pgZml.
  • the turbidimetric time analysis method can be said to be a method in which accuracy and measurement time conflict.
  • FIGS. 3A to 3C show the measurement results of the delay time TL of the total scattering intensity Xt calculated and displayed in the endotoxin measurement and its inverse 1ZTL, the maximum production rate Vmax and the endotoxin concentration.
  • lag time TL and endotoxin concentration 0.031 pg / ml, 0.063 pg / m1, 0.125 pg / ml, 0.25 pg / ml, 0.50 pg / ml, 1. Opg / ml and 2.
  • the relationship with Opg / ml is a linear relationship with negative slope.
  • the reciprocal of the delay time 1ZTL and the endotoxin concentration have a positive slope.
  • the maximum production rate Vmax and endotoxin concentration of 0.31 pg / ml, 0.63 pg / ml, 1.25 pg / ml, 2.5 pgz ml, 5.
  • Opgz ml, 10 pg / ml The relationship is a linear relationship with a negative slope.
  • the measurement apparatus of the present invention can measure endotoxin at an extremely low concentration of 0.031 pgZml.
  • the measurement time of endotoxin 0.3 pgZml is about 30 minutes, and the measurement can be performed in one third of the time as compared with the conventional turbidimetric method. That is, according to the measurement technique of the present invention, it is possible to specifically measure the endotoxin concentration measured by gelling reaction with high sensitivity in a short time.
  • the measurement sensitivity of the present invention is about 10 times higher than that of the prior art, so it is necessary to devise a structure around the sample cell to increase the degree of endotoxin 'freeness. it is conceivable that.
  • endotoxins are usually present in a large amount in the environment, and there is inevitably a possibility that some endotoxins may be mixed in the sample cell during the reagent manufacturing process or measurement operation.
  • one end of the sample cell 13 is opened so that the Limulus reagent and the sample can be charged, and the endotoxin, which is assumed in the prior art, can be opened and closed.
  • the measurement apparatus of the present invention may detect endotoxin positivity due to the influence of endotoxin even in a sample not containing endotoxin.
  • a sample cell 13 is placed in a container 131 made of a glass such as a resin glass, and a stirrer bar (stirring bar) 25 and a necessary amount of Limulus reagent 133 are accommodated in the upper part. It is conceivable to have a configuration in which the is sealed with a sealing member 132.
  • the sealing member 132 has an arbitrary type of force. Of course, a member having such a specification that endotoxin is not mixed during transportation or handling is used. [0056] For introducing the measurement sample (specimen) into the sample cell 13, for example, a sealing member 132 may be perforated with an injection needle or the like and injected. In order to facilitate the introduction of the measurement sample (specimen), the sealing specification of the sealing member 132 is determined so that the inside of the sample cell 13 maintains a constant negative pressure level with respect to the atmospheric pressure! Moyo! /
  • sample cell 13 as shown in FIG. 7 can be assembled in a manufacturing environment that achieves a constant endotoxin “free” level.
  • the sample cell 13 configured as shown in FIG. 7 is an accessory of the measuring apparatus shown in FIGS. 1 and 4 to 6 as a product such as a measurement kit that forms part of the product family.
  • a measurement environment satisfying a predetermined endotoxin 'free' level can be easily formed, and measurement results can be stably achieved with high accuracy.
  • FIG. 7 a force that shows the configuration of a sample cell with only one specimen (sample) is integrated, and a product that can measure many specimens (samples) at the same time is configured. It is also easy. In that case, needless to say, the configuration on the measurement apparatus side shown in FIG.
  • the substance to be measured is considered to be endotoxin, but the same measurement hardware and the same or similar Limulus reagent are used to measure the 8-D glucan, etc. Needless to say, the present invention can be applied to the same measurement process for detecting the. Industrial applicability
  • the present invention is carried out in various measuring apparatuses that measure the concentration of a sample to be measured such as endotoxin or ⁇ -D dulcan using a Limulus reagent by detecting the process of gelling phenomenon. Can do.

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Description

明 細 書
ゲル化測定装置および試料セル
技術分野
[0001] 本発明は、エンドトキシンや β—Dダルカンなどの測定対象の試料中の濃度をゲル 化現象過程を検出することにより測定するゲルイ匕測定装置および試料セルに関する ものである。
背景技術
[0002] エンドトキシン (細胞内毒素）とは、グラム陰性菌の細胞壁を構成するリポポリサッカ ライド (リン脂質と多糖類の高分子複合体)でリピド Αと呼ばれる脂質と多糖鎖が 2-ケト -3-デォキシォクトン酸 (KDO)を介して結合したリポ多糖 (LPS)である。細菌の死など によって細胞壁が壊れてはじめて放出される。エンドトキシンは生体にさまざまな作 用をおよぼす、特に発熱や致死的な敗血症やショックを引き起こす有害物質であり、 さらに、 DIC (播種性血管内凝固症侯群)の誘因の一つであると考えられている。また 、医薬品（注射剤等)や医療用具 (血管カテーテル等）は内毒素による汚染がないこ と (パイロジェンフリー）が重要であり、細菌を用いて調製した医薬品 (組み換えタンパ ク質、遺伝子治療に用いる DNAなど)では内毒素を完全に除去することが不可欠とな つている。
[0003] このエンドトキシンの除去確認、あるいは救急医学における計測は、測定試料数の 多さばかりでなぐ救命治療という目的にかなった迅速性が求められている。
[0004] 1964年に Levinと Bang力 カブトガ二の血球抽出成分がエンドトキシンによって凝 固（ゲル凝固）することを発見した。この現象を利用したエンドトキシン検出法はリムル ステストと呼ばれ、さらにゲルィ匕現象を測定する手法としてはゲル凝固する検体溶液 の希釈倍率からエンドトキシン濃度を測定するゲル化法や、ゲル化反応に伴う濁度 変化よりエンドトキシン濃度を測定する比濁法が知られている。また、凝固過程にお ける凝固前駆物質 (コアギュロゲン)の代わりに発色合成基質 (Boc-Leu-Bly-Arg-p- 二トロアリニド）を加えることにより、その加水分解で p-二トロア-リンが遊離され、その 黄色発色の比色によりエンドトキシン濃度を測定する発色合成基質法なども知られて いる。
[0005] また、リムルス試薬反応の過程を光学的に測定する、特に、ゲル化反応に伴う透過 光量変化を測定する比濁法に基づく測定を行なう構成が知られており、たとえば、検 体とリムルス試薬を混合させた混合液の透過光強度の経時変化を測定して得られる 所定時間における変化量力 検体のエンドトキシン濃度を測定する構成が知られて いる（下記の特許文献 1)。
[0006] なお、同様のゲルィ匕反応を利用した測定技術は、エンドトキシンのみならず、 β Dグルカン（ D glucan)などの測定にも利用される。
[0007] β - Dグルカン ( β—D glucan)は真菌に特徴的な細胞膜を構成して 、るポリサッ カライド (多糖体)である。 β—Dグルカンを測定することにより、カンジダゃスペルギ ルス、タリプトコッカスのような一般の臨床でよく見られる真菌のみならず、稀な真菌も 含む広範囲で真菌感染症のスクリーニングなどに有効である。
[0008] β Dグルカンの測定においても、カブトガ二の血球抽出成分が β Dグルカンに よって凝固（ゲル凝固）することが利用されており、上記同様にゲル化法や比濁法、 発色合成基質法によって測定される。
[0009] エンドトキシンや β Dダルカンの測定手法には共通点があり、たとえば、ほぼ同様 の測定ノ、一ドウエアを用い、カブトガ二の血球抽出成分中力 Factor G成分を除く ことによりエンドトキシンに選択的なゲルィ匕反応や発色反応が測定でき、また、試料 中のエンドトキシンを前処理により不活ィ匕することにより、 β—Dダルカンに選択的な ゲル化反応や発色反応を測定することができる。
特許文献 1：特開 2004— 93536号公報
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0010] 従来のリムノレステストにおいては、次のような問題がある。
[0011] 上記のうち、ゲル化法は、リムルス試薬液に試料を加え一定温度で静置して流動性 の低いゲルが生成するまでの時間を測定する方法である。また、比濁法は同様にゲ ル化反応に伴う濁度変化を透過光量の変化としてとらえ、透過光量が反応開始から ある一定の割合だけ変化するまでの時間をゲルイ匕時間として測定する方法である。 [0012] 上記いずれの方法ともゲルが生成するのに約 90分という長時間を要する。すなわ ち、反応溶液のゲル化時間は、測定対象の物質の濃度に比例するが、ゲル化法お よび比濁法共に感度の点力 正確なゲルィ匕開始時間が検出できな 、ため、ゲルィ匕 終了までの時間から反応量を算出して、ゲルィ匕時間の目安を得ている。したがって、 ゲル化法および比濁法は共に救急を要する場合や多数の検体を測定するのに適し た方法ではない。さらに、比濁法ではエンドトキシンとは無関係の非特異的濁りが生 じることがあり、測定精度に欠ける。また、ゲルィ匕法の測定限界濃度は 3pg/ml、比濁 法の測定限界濃度は lpg/ml程度である。
[0013] 一方、発色合成基質法はゲルイ匕法および比濁法にくらべ測定時間は 30分と短時 間であるが、偽陽性反応が生じる場合があり、特異度の高い測定を行なうことが難し ぐまた、測定準備が煩雑であり、測定限界濃度も 3pg/mlと比濁法に劣る。
[0014] 本発明の課題は、上記問題を解決し、エンドトキシンや β—Dグルカンなど、ゲル 化反応により測定される物質の濃度を短時間で高感度に且つ、特異的に測定できる ようにすることにある。
課題を解決するための手段
[0015] 以上の課題を解決するため、本発明によれば、ゲル化反応によって試料中の目的 物質を測定するゲル化反応測定装置にお 、て、
測定目的の物質を含む検体とゲル化を生じる試薬を含む溶液を収容する試料セル と、
レーザ光源からレーザ光束を前記試料セルに照射する手段と、
前記試料セル中の溶液を攪拌して微小かつ均一なゲル粒子を生成させ、前記レー ザ光束中を通過させる手段と、
前記試料セル中で生成する個々のゲル粒子の前記レーザ光束による散乱光を受 光する受光素子と、
前記受光素子の散乱光検出出力に基づき、ゲル粒子の径と数を時系列的に計測 する計測手段と、
計測されたゲル粒子の散乱光強度あるいは径とその数を表示する手段とを備えた 構成を採用した。 [0016] また、本発明の試料セルにぉ ヽては、測定目的の物質のゲルィ匕を生じる試薬、お よび試料投入後の試料および前記試薬の溶液を攪拌する攪拌手段をあらかじめ封 入し、密閉部材により密閉された容器カゝら構成される構成を採用した。
発明の効果
[0017] 上記構成によれば、試料セル中で生成する個々のゲル粒子のレーザ光束による散 乱光を受光し、その散乱光検出出力に基づき、ゲル粒子の径と数を時系列的に計測 する構成を採用しており、透過光を用いた従来の比濁法に準ずる測定方式に比して 、エンドトキシンや —Dダルカンなど、ゲル化反応により測定される物質の濃度を短 時間で高感度に且つ、特異的に測定することができる。
[0018] また、試料セルを測定目的の物質のゲルィ匕を生じる試薬、および試料投入後の試 料および前記試薬の溶液を攪拌する攪拌手段をあらかじめ封入し、密閉部材により 密閉された容器力 構成することにより、運搬あるいは取り扱い中に測定目的の物質 が試料中に混入することにより測定誤差を生じる可能性を低減しつつ、上記の高感 度な測定を可能とする。
図面の簡単な説明
[0019] [図 1]本発明を採用した測定装置の構成を示した説明図である。
[図 2Α]図 1の測定装置によるエンドトキシンの測定例を示した説明図である。
[図 2Β]図 1の測定装置によるエンドトキシンの測定例を示した説明図である。
[図 2C]図 1の測定装置によるエンドトキシンの測定例を示した説明図である。
[図 2D]図 1の測定装置によるエンドトキシンの測定例を示した説明図である。
[図 3Α]図 1の測定装置によるエンドトキシンの測定例を示した説明図である。
[図 3Β]図 1の測定装置によるエンドトキシンの測定例を示した説明図である。
[図 3C]図 1の測定装置によるエンドトキシンの測定例を示した説明図である。
圆 4]図 1の測定装置の散乱光測定系の構成を示した説明図である。
[図 5]図 1の測定装置の散乱光測定系から得られる測定信号を示した波形図である。
[図 6]図 1の測定装置の散乱光測定系の回路を示した説明図である。
[図 7]図 1の測定装置の試料セルの構成を示した説明図である。
符号の説明 [0020] 11 半導体レーザ
12 集光レンズ
13 試料セル
14 発光ダイオード（LED)
15 マグネチックスターラー
16 試料溶液
17 受光レンズ
18 フォトダイ才ードアレイ
19 増幅器
20 AD変換器
21 コンピュータ
22 フォトダイオード
25 スターラーパー (攪拌棒）
77 ピンホーノレ
85 演算増幅器
87 絶対値回路
90_1、 90_2〜90_n ウィンドコンノ レータ
91_1、 91— 2〜91— n カウンタ
131 容器
132 密閉部材
133 リムノレス試薬
発明を実施するための最良の形態
[0021] 以下、本発明を実施するための最良の形態の一例として、エンドトキシンの濃度をリ ムルス試薬を用いたゲルィヒ反応を検出することにより測定する測定装置に関する実 施例を示す。
実施例 1
[0022] 図 1に本発明を採用した測定装置の構成を示す。図 1において、半導体レーザ 11 力も照射される散乱光強度測定のためのレーザ光は集光レンズ 12によってシート光 にコリメートされ、試料セル 13 (たとえばガラス製）内の内壁近傍に照射される。また、 透過光測定のため、発光ダイオード (LED) 14の光を試料セル 13に照射し、その透 過光をフォトダイオード 22により受光する。
[0023] 試料セル 13内の試料溶液 16は、微小かつ均一なゲル粒子を生成させるため、 37 °Cの一定温度に保たれスターラーバー (攪拌棒） 25およびマグネチックスターラー 15 によって lOOOrpmで回転攪拌される。
[0024] 試料溶液 16中のゲル粒子からの散乱光は、受光レンズ 17を介して複数の受光素 子のフォトダイオード力もなるフォトダイオードアレイ 18によって測定され、測定結果 は電気信号として出力される。
[0025] フォトダイオードアレイ 18のフォトダイオードには、統計学的にゲル粒子 1個のみが 測定できる観察領域力もの散乱光を受光できる受光面積のものを用いる。フォトダイ オードアレイ 18の出力は増幅器 19により電流電圧変換された後、 AD変換器 20によ り AD変換され、コンピュータ 21に入力される。また、フォトダイオード 22が検出する 透過光も不図示の同様の増幅 ZAD変換を経てコンピュータ 21に入力される。
[0026] デジタル信号に変換された散乱光測定信号は、たとえばパーソナルコンピュータの ハードウェアなどを用いて構成したコンピュータ 21により信号処理される。コンビユー タ 21は、不図示のキーボード、マウスなどの操作装置、測定結果表示用のディスプレ ィ、あるいはさらにプリンタなどの出力装置、他の装置と測定結果あるいは測定に関 する情報を入出力するネットワークインターフェースなどが含まれる。
[0027] 図 4は、図 1の散乱光測定系の構成を詳細に示している。
[0028] 試料溶液力ゝらの散乱光は図 1のレンズ 17を介してフォトダイオードアレイ 18を構成 する複数の受光素子のフォトダイオード 18a〜18dによって電気信号として測定され る。各々のフォトダイオードの前部には、測定対象のゲル粒子 1個のみが測定できる 観察領域からの散乱光を受光するためにピンホール 77が配置される。フォトダイォー ド 18a〜18dの出力は増幅器 19により電流電圧変換、増幅後、 AD変換器 20により AD変換されてコンピュータ 21に入力される。
[0029] なお、各ピンホール 77のサイズを決定するために必要な測定対象のゲル粒子 1個 のサイズはあら力じめ行なった測定結果力も統計的に演算して決定することができる [0030] コンピュータ 21では、ゲル粒子の粒径に応じて設けられた複数のコンパレータによ り散乱光強度信号のレベルが識別され、コンパレータ力も出力信号をカウンタにより 計数することにより所定の粒径のゲル粒子が何個あったかが測定される。その場合、 ゲル粒子の一部がピンホール 77の縁部を通過することにより誤って計測されるゲル 粒子の粒径は、統計的確率論と標準粒子の測定結果力 との式を用いたコンビユー タの測定ソフトによって補正される。
[0031] 図 5は、ゲル化測定過程において、図 4のフォトダイオード 18a〜18dで測定される 散乱光強度信号の変化状態を示す。ゲル粒子力 の散乱光は、粒子の大きさに相 関したピーク信号 83a〜83dとして測定され、試料溶液の他の部分力もの散乱光は ノ ックグランド信号 84a〜84dとして測定される。
[0032] そこでこのノックグランド信号の影響をなくするために、図 6に示すように、 2個の受 光素子のフォトダイオード 18a、 18bからの各々の出力信号がそれぞれ演算増幅器 8 5に入力され減算される。これによりバックグランド信号が相殺され、 86で示すように ゲル粒子のみ力 の散乱光強度変化のみが測定される。このバックグランド信号が除 去された信号は絶対値回路 87に入力される。絶対値回路 87の出力は符号 88に示 すように、バックグランドのな 、ピーク信号だけの信号となる。
[0033] この絶対値回路力 の出力信号はそれぞれウィンドコンパレータ 90— 1、 90—2. .
. 90— nに入力され、そのレベルが識別される。各コンパレータはゲル粒子の粒径に 対応したレベル比較を行なうので、コンパレータの各出力はゲル粒子の粒径に対応 した信号となっている。この信号がそれぞれカウンタ 91—1、 91—2. . . 91— nで力 ゥントされ、その粒径のゲル粒子の数が計数される。この計数されたデータは演算回 路 92に (あるいはコンピュータ 21に直接)入力され、後述のゲル粒子の測定処理に 用いられる。
[0034] 図 1のコンピュータ 21によりゲル粒子の散乱光強度あるいは径とその数を計測し、 ディスプレイに表示出力するとともに、式
X=∑ k'Pk) (1)
(ただし、 co kは散乱強度 Pkの粒子に付加する重み係数）により、時間当たりの総散 乱強度 Xtを演算し、不図示のディスプレイにより結果を表示する。
[0035] また、測定目的の物質を含む検体とゲルィ匕を生じる試薬を含む溶液を試料セル 13 に入れ、測定を開始した後、一定以上の総散乱強度 Xtが計測されるまでの時間 TL ( 遅延時間）と、この TLと試料液中の測定対象物質の量 (濃度)との相関より目的の物 質の濃度をコンピュータにより演算し、表示する。
[0036] さらに、ゲル化反応で生成するゲル粒子の生成速度 V (V=dXt/dt)の最大値 Vmax と、この Vmaxと試料液中の測定対象物質の量 (濃度）との相関より目的の物質の濃度 をコンピュータにより演算し、表示する。
[0037] また、ゲルィ匕反応で生成するゲル粒子の最大生成量 Xmaxと試料液中の測定対象 物質の量 (濃度)との相関より目的の物質の濃度をコンピュータにより演算し、表示す る。
[0038] 以下、本発明を採用した測定装置を用いたエンドトキシンの測定例を示す。
[0039] 図 2Aに、エンドトキシン 0.00pg/mlを含む試料の測定結果を、図 2Bにエンドトキ シン 0.31pgZmlを含む試料の測定結果を、図 2Cにエンドトキシン 1.25pgZmlを含 む試料の測定結果を、図 2Dにエンドトキシン 5.00pgZmlを含む試料の総散乱光 強度、および透過率の測定結果を示す。
[0040] この測定においては、図 1の装置の試料セル 13にエンドトキシンを含む試料とリム ルス試薬を投入し、撹拌を開始するとともに、その間、フォトダイオードアレイ 18〜増 幅器 19〜AD変換器 20〜コンピュータ 21により、散乱光測定を行なう。また、同一の 試料に対して、従来の比濁法における測定を検証するために、発光ダイオード (LE D) 14〜フォトダイオード 22を用いて透過光測定を行なう。
[0041] 測定期間中、コンピュータ 21は、ゲルィ匕反応に伴うゲル粒子の総散乱強度 Xtの時 系列的変化をディスプレイに表示する。また、一定以上の総散乱強度 Xtが計測され るまでの時間 TL、ゲル粒子の生成速度の最大値 Vmaxおよびゲルィ匕反応で生成す るゲル粒子の最大生成量 Xmaxとを演算し、ディスプレイに表示する。さらに、試料の 透過率変化も同時に測定、演算し、ディスプレイに表示する。
[0042] 図 2Aに見られるように、エンドトキシンを含まない試料において、透過率は徐々に 減少している。したがって、従来の透過率を測定する比濁法ではエンドトキシンとは 無関係の非特異的濁りが検出される問題となって現われる。その一方で、図 2Aの試 料から本装置で測定された総散乱光強度は全く変化しておらず、総散乱光強度を利 用する本発明のレーザ粒子散乱計測では、非特異的濁りを測定しないことが判る。 図 2B、図 2C、図 2Dの各試料の測定においても、上記のような非特異的濁りが比濁 法では透過率の減少を介して検出されてしまう。
[0043] 一般に、比濁法では比濁時間分析法という手法が採用されており、透過率がある 一定の値 (ゲルイ匕判定閾値）になるまでの時間（ゲル化時間）とエンドトキシン濃度の 相関より、試料中のエンドトキシン量を測定している。この手法の欠点は、ゲル化判定 閾値を小さく設定すると、低濃度のエンドトキシンの測定が不可能となり、また、ゲル 化判定閾値を大きく設定すると非特異的濁りをエンドトキシン量として誤って測定し、 測定精度が悪くなる問題がある。たとえば図 2Bにおいて、ゲルィ匕判定閾値を透過率 70%と小さく設定すると、低濃度のエンドトキシン 0. 31pgZmlの測定値を求めるこ とが不可能となる。或いは、透過率が 70%に達するまで測定時間を延長し、エンドト キシン濃度を求めることも可能であるが、測定に長時間を要する。
[0044] また、たとえば図 2Aにおいて、ゲル化判定閾値を透過率 90%と大きく設定すると、 低濃度のエンドトキシンを短時間に測定することができるが、非特異的濁りをエンドト キシン量として誤って測定してしまう。このように、比濁時間分析法は、精度と測定時 間が相反する手法であると 、える。
[0045] これに対して、本発明のように総散乱光強度を測定する手法を採用することで、非 特異的濁りの発生に影響されることなぐ短時間で精度の高いエンドトキシン測定を 実現することができる。
[0046] 図 3A〜図 3Cに上記エンドトキシン測定において演算、表示された総散乱強度 Xt の遅延時間 TLおよびその逆数 1ZTL、最大生成速度 Vmaxとエンドトキシン濃度と の測定結果を示す。
[0047] 図 3Aにおいて、遅延時間 TLとエンドトキシン濃度 0. 031pg/ml, 0. 063pg/m 1、 0. 125pg/ml、 0. 25pg/ml、 0. 50pg/ml、 1. Opg/mlおよび 2. Opg/mlと の関係は負の傾きの直線関係にある。
[0048] また、図 3Bに示すように遅延時間の逆数 1ZTLとエンドトキシン濃度は正の傾きの 直線関係にあり、さらに、図 3Cにおいて最大生成速度 Vmaxとエンドトキシン濃度 0. 31pg/ ml、 0. 63pg/ ml、 1. 25pg/ ml、 2. 5pgz ml、 5. Opgz ml、 10pg/ ml との関係は負の傾きの直線関係にある。
[0049] 以上に示したように、本発明の測定装置では、 0. 031pgZmlと極めて低濃度のェ ンドトキシンの測定が可能である。また、本発明の測定装置によれば、従来技術の比 濁法の最小測定感度が 0. 3pgZmlであるのに比して、 10倍の高感度測定が可能と なる。また、本発明の測定装置では、エンドトキシン 0. 3pgZmlの測定時間は約 30 分であり、従来技術の比濁法に比べ 3分の 1の短時間で測定ができる。すなわち、本 発明の測定技術によれば、ゲルィ匕反応により測定されるエンドトキシンの濃度を短時 間で高感度に且つ、特異的に測定することが可能となる。
[0050] なお、上記実施例では、試料セル 13にリムルス試薬と試料をそれぞれ投入する旨 説明した。
[0051] し力しながら、上述のように本発明では従来技術より約 10倍程度、測定感度が高い ため、試料セル廻りの構造を工夫してエンドトキシン'フリーの度合を高めておく必要 があると考えられる。
[0052] すなわち、エンドトキシンは通常環境中においても多く存在しており、試薬製造ェ 程中、あるいは測定操作中に幾許かのエンドトキシンが試料セル内に混入する可能 '性は決して否めない。
[0053] したがって、たとえば、試料セル 13の一端がリムルス試薬と試料をそれぞれ投入で きるように開放されて 、る、ある ヽは開閉可能となって 、るような従来技術で想定され ていたエンドトキシン.フリーのレベルでは、本発明の測定装置がエンドトキシンを含 まない検体でも混入したエンドトキシンの影響でエンドトキシン陽性を検出する可能 '性がある。
[0054] そこで、図 7に示すように、試料セル 13を、榭脂ゃガラスなどカゝら成る容器 131中に スターラーバー (攪拌棒） 25と、必要量のリムルス試薬 133を収容し、上部を密閉部 材 132で密閉した構成が考えられる。
[0055] 密閉部材 132の様式は任意である力 もちろん運搬中や取り扱いの過程でエンドト キシンが混入しな 、ような仕様の部材を用いる。 [0056] 試料セル 13内への測定試料 (検体)の導入は、たとえば密閉部材 132を注射針な どで穿孔して注入するなどの方式が考えられる。ある 、は測定試料 (検体)の導入を 容易にするため、試料セル 13内が大気圧に対して一定の負圧レベルを保つように密 閉部材 132の密閉仕様を決定してお!、てもよ!/、。
[0057] もちろん、図 7のような試料セル 13は、一定のエンドトキシン'フリ一'レベルを達成 した製造環境で組立てられるのは 、うまでもな 、。
[0058] 図 7に示すように構成した試料セル 13は、図 1、図 4〜図 6に示した測定装置の付 属品ゃ製品ファミリーの一部を構成するたとえば測定キットのような製品としてユーザ に供給することができ、その場合、所定のエンドトキシン 'フリー'レベルを満たした測 定環境を容易に形成することができ、精度の高 、測定結果を安定して達成すること ができる。
[0059] なお、図 7では、 1検体 (試料）ぶんのみの試料セルの構成を示した力 同様の構成 を多数、一体化し、多数の検体 (試料)を同時に測定できるような製品を構成すること も容易である。その場合、図 1に示した測定装置側の構成も複数の各試料セルに対 応した数、必要になるのはいうまでもない。
[0060] また、以上の実施例では、測定対象の物質をエンドトキシンと考えたが、同じ測定 ハードウェアを、同様ないし類似のリムルス試薬を用いた |8—Dグルカンの測定など 、ゲルィ匕現象過程を検出する同様の測定処理に応用できることはいうまでもない。 産業上の利用可能性
[0061] 本発明は、リムルス試薬を用いたエンドトキシンや β—Dダルカンなどの測定対象 の試料中の濃度をゲルイ匕現象過程を検出することにより測定する種々の測定装置に ぉ 、て実施することができる。

Claims

請求の範囲
[1] ゲル化反応によって試料中の目的物質を測定するゲル化反応測定装置において、 測定目的の物質を含む検体とゲル化を生じる試薬を含む溶液を収容する試料セル と、
レーザ光源からレーザ光束を前記試料セルに照射する手段と、
前記試料セル中の溶液を攪拌して微小かつ均一なゲル粒子を生成させ、前記レー ザ光束中を通過させる手段と、
前記試料セル中で生成する個々のゲル粒子の前記レーザ光束による散乱光を受 光する受光素子と、
前記受光素子の散乱光検出出力に基づき、ゲル粒子の径と数を時系列的に計測 する計測手段と、
計測されたゲル粒子の散乱光強度あるいは径とその数を表示する手段とを備えた ことを特徴とするゲル化反応測定装置。
[2] 前記受光素子が測定粒子のほぼ 1個力もの散乱光を受光するように構成されることを 特徴とする請求項 1に記載のゲル化反応測定装置。
[3] 複数個の受光素子が設けられ、その受光素子に対応した散乱光が同時に測定され ることを特徴とする請求項 1または請求項 2に記載のゲルィヒ反応測定装置。
[4] 前記受光素子の一対からの出力を減算して有効信号の割合を増大させることを特徴 とする請求項 3に記載のゲル化反応測定装置。
[5] 前記計測手段は、式
X=∑ k'Pk)
(ただし、 ω kは散乱強度 Pkの粒子に付加する重み係数)から時間 t当たりのゲル粒 子数 Xtを求めることを特徴とする請求項 1から請求項 4までのいずれか 1項に記載の ゲル化反応測定装置。
[6] 請求項 1〜5に記載のゲル化反応測定装置で用いられる前記試料セルにお 、て、測 定目的の物質のゲルィ匕を生じる試薬、および試料投入後の試料および前記試薬の 溶液を攪拌する攪拌手段をあらかじめ封入し、密閉部材により密閉された容器から 構成されることを特徴とする試料セル。 測定目的の物質の含有レベルが所定以下の環境にお!、て、前記試薬および前記攪 拌手段の封入が行なわれることを特徴とする請求項 6に記載の試料セル。
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