WO2008037880A1 - Nouvelle classe de composes derives de terpene a activite antibiotique, compositions les contenant et utilisations - Google Patents

Nouvelle classe de composes derives de terpene a activite antibiotique, compositions les contenant et utilisations Download PDF

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WO2008037880A1
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Jean-Paul Leonetti
Maxime Gualtieri
Laurence Coulibeuf
Gaëtan HERBETTE
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Centre National De La Recherche Scientifique
Universite De Provence - Aix Marseille 1
Universite Paul Cezanne - Aix Marseille 3
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    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/07—Bacillus

Definitions

  • the present application relates to a new class of terpene-derived compounds, having an antibiotic activity, of formula (I) or (II)
  • A is selected from NR 1 , O, S, CR 2 R 3 or R- (CH 2 ) n -R 'wherein R and R' are, independently of one another, NH, O, S or CH 2 and R 1, R 2 and R 3 are substituents, and n is greater than or equal to 1, in particular 2.
  • Staphylococci which are among the most resistant bacteria (eg methicillin-resistant Staphylococcus aureus), as well as
  • Penicillin-resistant Streptococcus pneumoniae vancomycin-resistant enterococci, multidrug-resistant salmonella, and multidrug-resistant tuberculosis.
  • imbalances in the intestinal flora may occur following antibiotic treatment (antibiotic therapy) intended for to cure an infection. These imbalances themselves cause digestive infections (diarrhea), including digestive infections related to Clost ⁇ dium difficile (ICD, or CDAD for Clostridium difficile-associated disease).
  • ICD Clost ⁇ dium difficile
  • Clostridium difficile is a gram-positive, anaerobic bacillus that is the leading cause of nosocomial infectious diarrhea in adults
  • Antimicrobial impregnated catheters are the medical devices for which more data are available. There are essentially two combinations of molecules: chlorhexidine and silver sulfadiazine or minocycline and rifampicin. The in vivo efficacy of the former is controversial and would be limited in time ( ⁇ 10 days).
  • rifampicin is one of the few antibiotics active on slow-growing bacteria, especially on coagulase-negative Staphylococci which are the most common cause of infection of catheters, stents and vein grafts. In large multicentre studies, it is estimated that they reduce the risk of infection by 80%, and that their use would be beneficial.
  • the present application relates to a new class of compounds having antibiotic activity, more particularly broad-spectrum gram-positive antibacterial activity, on bacteria such as Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Enterococcus faecalis, Bacillus anthracis and Clostdium difficile.
  • the compounds of this class have a low molecular weight, are not toxic in vitro and in vivo and do not cross-react with known resistances.
  • this class of antibiotic compounds there is preferentially margaucine, which can be isolated from a culture supernatant of a bacterial strain.
  • the present invention relates to a compound of formula (I) or
  • A is selected from NR 1, O, S, CR 2 R 3 or R- (CH 2 ) n -R 'wherein R and R' are, independently of one another, NH, O, S or CH 2 , and R 1, R 2 and R 3 are substituents, and n is greater than or equal to 1, in particular 2.
  • constituent A atoms such as R 1, R 2 and R 3 ;
  • the carbon in the 1-position is a CH 2
  • the carbon in the 3-position is a CH
  • the carbon in the terminal position is a CH 3 .
  • A is selected from NH, O, S, CH 2 or R- (CH 2 ) 2 -R 'wherein
  • R and R ' are, independently of one another, NH, O, S or CH 2 .
  • the invention does not, as such, aim at the mixture chemically synthesized according to the method described by Schank et al. (Chemistry of free cyclic vicinal tricarbonyl compounds ('1,2,3-triones 1 ).) 2. Redox reactions of 1, 2,3-triones with ene-1,2-diols ('reductones'), 2-alkoxy -en-1-ols, ene-1, 2-diamines, and related species, Helvetica Chimica Acta (2002), 85 (5), 1295-1326), i.e.
  • the invention relates to the compounds produced by a bacterium and mixtures thereof, according to the process described hereinafter by way of example, and concerns the use of these compounds and mixtures irrespective of their production method (in particular by synthesis or by a bacterium), in particular margaucine, in compositions or applications of these compounds or mixtures described in the present application.
  • the present invention relates very particularly to a compound of formula (I) or (11):
  • A is selected from NR-1, O, S, CR 2 R 3 or R- (CH 2 ) n -R 'wherein R and R' are, independently of one another, N, O, S or C, and R 1, R 2 and R 3 are substituents and n is greater than or equal to 1, in particular equal to 2.
  • A is chosen from NH, O, S, CH 2 or R- (CH 2 ) 2 -R 'wherein R and R' are independently of each other, NH, O, S or CH 2.
  • compound of the invention is meant both the compound in its formula (I) or in its formula (II), that is to say taken individually regardless of its method of preparation.
  • the present invention relates to the compound of formula (I), as described in the context of the present application and in particular the compound of formula (I) produced by a bacterium, and its uses.
  • the invention also relates to mixtures of these two isomeric compounds, irrespective of the proportion of compounds (I) and (II), with the exception of the mixture obtained by chemical synthesis according to the method of Schank et al.
  • the mixtures can comprise the forms (I) and (II) even if the antibiotic activity of each of these two forms is not equivalent.
  • the mixture comprises the forms (I) and (II), wherein optionally only one form has an antibiotic activity.
  • the form (I) has an antibiotic activity.
  • the present invention also relates to a process for preparing a compound of formula (I) or (II), and more particularly a process for preparing margaucine, comprising (a) culturing a bacterial strain, and b) recovering, in particular purifying, the compound of formula (I) or (II) from the culture supernatant.
  • the bacterial strain used in the context of a process according to the invention is the strain JPL84 or JPL86, and the compound produced is the compound of formula
  • culturing is meant the maintenance of the bacterial strain, particularly the strain JPL84, or any derivative strain as defined in the present application, under conditions of culture allowing its survival and its multiplication.
  • the cultivation is also accompanied by the production of the antibiotic of formula (I) or (II) or of their mixture or promotes this production.
  • the term “cultivation” will be used interchangeably and according to the same definition as the term “fermentation”.
  • any liquid nutrient medium may be suitable for culturing the bacterial strain, strain JPL84, or derived strains, insofar as this medium contains a source of carbon, nitrogen and inorganic salts.
  • this medium contains a source of carbon, nitrogen and inorganic salts.
  • preference will be given to CYE (Casitone Yeast Extract) medium, an agar medium based on yeast extract, the composition of which is, for example, the following: peptone at 10 g / l, yeast extract at 1 g / l and CaCl 2 at 1 g / l.
  • the bacterial strain is cultured at a temperature between 0 and 45 ° C, preferably between 20 and 37 0 C, and even more preferably at 28 0 C, under agitation and aeration (aerobic culture).
  • the desired duration of the culture depends on the time at which the production of the desired antibiotic is optimal or maximum, and this duration is calculated with respect to the cultivation of the strain.
  • the culture time (period between culturing and stopping this culture) is about 15 to 24 hours, preferably between 18 and 20 hours.
  • purification is meant any technique for isolating the desired antibiotic from other constituents of the culture supernatant. For example, and without limitation, mention may be made of solvent extraction, precipitation, reverse phase chromatography (HPLC), ion exchange chromatography, or the combination of two or more of these techniques. .
  • the method of the invention may also comprise an optional step between step (a) of culturing and step (b) of purification, consisting of the separation of the culture supernatant from the cells and other cellular debris, for example by centrifugation.
  • the purified antibiotic may subsequently be converted to salts (salt forms), including pharmaceutically acceptable non-toxic salts, by standard reaction with organic or inorganic acids. These salts will be obtained, particularly when A is N.
  • the purified antibiotic, or salts thereof may be obtained in anhydrous form, by lyophilization.
  • the present invention also relates to a compound of formula (I) or (II) or a mixture thereof, as described above obtained by a method using a culture of bacteria, as described in this application.
  • a mixture of isomers of formulas (I) and (II) as described above can also be obtained by chemical synthesis, as for example that disclosed in the publication of Schank et al. (Chemistry of free cyclic vicinal tricarbonyl compounds ('1,2,3-triones'). Part 2. Redox reactions of 1,2,3-triones with ene-1,2-diols ('reductones'), 2-alkoxy -en-1-ol, ene-1, 2-diamines, and related species, Helvetica Chimica Acta (2002), 85 (5), 1295-1326). This synthesis results in the production of a mixture from which it is possible to isolate, if appropriate, one of the compounds of formula (I) or (II).
  • the compound of the invention When the compound of the invention is obtained by a method of culturing bacteria as described above, it retains a trace of its bacterial production and can be distinguished from the same compound produced by chemical synthesis, because of the difference observed in their respective ratios Ci 2 / C 13 .
  • the compound of formula (I) or the compound of formula (II) produced chemically has a different C 12 / C- 13 ratio.
  • the chemically produced margaucine has a C 12/3
  • composition comprising at least one compound of formula (I) or (II) as described above, with the exception of the mixture of compounds of formulas (I) and (II), when it is obtained by chemical synthesis according to the method published by Schank et al.
  • a composition according to the invention comprises at least one compound of formula (I) or (II) obtained by a method of production in a bacterium described above, particularly a composition comprising at least the compound of formula (I) obtained from the strain JPL84.
  • the invention relates to a composition which comprises at least one carrier and / or a carrier, and a compound of formula (I)
  • A is selected from NR-1, O, S, CR 2 R 3 or R- (Ch 1) n -R 'wherein R and R' are, independently of one another, NH, O, S or CH 2 , and
  • the composition comprises at least one carrier and at least one compound of formula (I), in particular margaucine (compound of formula III).
  • the compound is obtained by chemical synthesis or by a process comprising a culture of bacteria.
  • vehicle is meant any substance that allows the formulation of the antibiotic within a composition.
  • the vehicle is a physiologically acceptable substance or combination of substances, i.e., suitable for use of the composition in contact with a living being (e.g., a non-mammalian). -human, and preferably a human being), and is therefore preferentially nontoxic.
  • compositions of the invention are pharmaceutical compositions, that is to say they are formulated to be administered or applied to a living being for therapeutic or prophylactic purposes.
  • These pharmaceutical compositions contain pharmaceutically acceptable vehicles for systemic or local administration, particularly by injection, for application in contact with a living being, by ingestion, or use in a solid, gelatinous, liquid or aerosol form.
  • the compositions of the invention are applied to materials that will be in contact with a living being as defined above.
  • the composition comprises a pharmaceutically acceptable carrier and margaucine.
  • the invention also relates to a composition which comprises at least one compound of formula (I) or (II) as defined in the present application, if appropriate associated with a carrier and / or a vehicle as defined in the present application, and which further comprises at least a second molecule, different, active against microorganisms.
  • active molecule is meant a chemical or biological compound, especially a low molecular weight compound, for example a peptide, which has the capacity to destroy, neutralize the activity or prevent the proliferation of microorganisms.
  • This active molecule may be, for example, an antibiotic or a bactericide.
  • the active molecule is preferably chosen from a compound active against gram-negative bacteria and / or a fungicidal compound and / or the compounds listed in Table 3 below or the following compounds: silver salts, minocycline, chlorinexidine, sulfadiazine, rifampicin ....
  • a composition of the invention comprises at least two compounds of formula (I) or (II) as defined above, but which differ from each other by their structure, namely their composition in atoms or by the position of their different substituents.
  • the composition comprises at least two compounds of formula (I) which differ in the nature of element A, by the substituents on element A, and / or by the substituents at positions 1, 3 and / or 5.
  • Another composition according to the invention comprises at least two compounds of formula (II) which differ in the nature of the element A, by substituents on element A, and / or substituents at positions 1, 3 and / or 5.
  • the invention also relates to a composition which comprises at least one compound of formula (I) and a compound of formula (II), in which A is identical in the two compounds and is chosen from NH, S,
  • R and R' are, independently of one another, NH, O, S or CH 2 , that is to say comprises two isomers of same compound as to the position of the double bonds.
  • compositions according to the invention further comprise a vehicle or a transporter.
  • the present invention also relates to the use of a compound of formula (I) or (II) taken individually or as a mixture or of a composition as defined above, as a medicament, and especially as an antibiotic (which destroys or prevents the proliferation of micro-organisms) and / or bactericidal (which destroys or prevents the proliferation of bacteria).
  • the compound of formula (I) or (II) taken individually or as a mixture or the composition of the invention has a bactericidal activity against gram positive bacteria (gram stain) or bacteria having a wall a thin layer composed of several layers, one of which is lipidic, that is to say that the compound destroys the bacteria or slows down their growth.
  • gram positive bacteria gram stain
  • bacteria having a wall a thin layer composed of several layers, one of which is lipidic that is to say that the compound destroys the bacteria or slows down their growth.
  • the compound of formula (I) or (II) taken individually or as a mixture or the composition of the invention is used to treat infections caused by bacteria of the genus Clostridium. More particularly, the compound of formula (I) or (II) taken individually or as a mixture or the composition of the invention is used to treat infections caused by Clostridium difficile, and preferably Clostridium difficile-related digestive infections (CDI). such as simple diarrhea, post-antibiotic, or colitis Pseudomembranous (CPM).
  • CDI Clostridium difficile-related digestive infections
  • CPM colitis Pseudomembranous
  • the use as a medicament relates to the compound of formula (I) or that of formula (III).
  • the invention relates to a compound, a mixture or a composition according to the invention, particularly margaucine or a composition comprising it, for use as a medicament, preferably as antibiotic or bactericidal.
  • the ( s) compound (s), the mixture or composition (s) thereof may be in solid form (cachet, powder, capsule, pill, suppository, accelerated release tablet, enteric-coated tablet, sustained release tablet), gelatinous (gel, ointment, cream, ovum), liquid (syrup, solution for injection, eye drops) or aerosol (spray, steam, gas).
  • the compound, the mixture or the composition of the invention may be administered orally, transmucosa-oral, nasal, ophthalmic, otological (in the ear), vaginal, rectal, parenteral (intravenous, intramuscular or subcutaneous), transcutaneous (or transdermal or percutaneous) or cutaneous.
  • the doses administered are those conventionally used for other antibiotics or combinations of antibiotics.
  • doses ranging from 30 mg / kg / day to 100 mg / kg / day, depending on the age or weight of the patient, the severity or stage of infection, the number of daily administrations or the mode of administration, may be administered; in adults mainly, doses between 1 g / day and 10 g / day are usual.
  • the present invention also relates to the use of a compound of formula (I) or (II) taken individually or as a mixture, for the manufacture of a composition useful in the fight against bacterial infections, in the treatment or prophylaxis of bacterial infections, particularly antibiotic-resistant diseases administered to date.
  • Resistant diseases means any infection whose origin is wholly or partially bacterial. More particularly, the term “resistant diseases” as used in the present application encompasses infections of which at least one causative agent is sensitive to an antibiotic compound of the invention, whether used alone or in combination with another compound of the invention or another active molecule. For example, multidrug-resistant diseases (resistant to several classes of antibiotics) or all infections caused by gram-positive bacteria.
  • treatment includes both the curative effect (destruction of the microorganism), obtained with at least one compound of the invention or a composition of the invention, that the improvement of symptoms observed in the patient (and related to the presence of the microorganism (s)) or the improvement of the patient's condition.
  • Treatment applies to the point of primary or secondary infection (s), as well as to the symptoms arising from the infection.
  • the compounds, mixtures and compositions of the invention are particularly used in the treatment of nosocomial infections.
  • prophylaxis is meant any use of at least one compound, a mixture or a composition of the invention, as a preventive measure, that is to say in order to avoid the appearance of symptoms. after contamination or suspicion of contamination, or to prevent infection by a microorganism or its consequences, particularly in the case of an infection caused by a bacterium, more particularly a gram-positive bacterium, and even more particularly an infection due to a bacterium of the genus Clostridium such as digestive infections related to Clost ⁇ dium difficile.
  • the compounds, mixtures or compositions according to the invention are used in therapy and prophylaxis according to the galenic forms and modes of administration indicated above.
  • the compound used is margaucine, or any composition as defined in the present application, comprising at least margaucine.
  • the invention also relates to the use of compounds, mixtures or compositions of the invention in cosmetic, food or veterinary applications (domestic animals, poultry, pigs, sheep, cattle or pets).
  • the compound of formula (I) or (II) of the invention taken individually or as a mixture or a composition according to the invention is particularly effective against bacteria of the genus Clost ⁇ dium, especially the toxinogenic forms, such as, for example , Clostridium difficile, Clostridium perfringens, Clostiridum botulinum, Clostridium tetani, Clostridium novyi, Clostridium histolyticum, Clostridium butyricum, Clostridium septicum, Clostridium sordellii, Clostridium ramosum, Clostridium bifermentans, Clostridium paraperfringens, Clostridium cadaveris, Clostridium clostridiiforme, Clostridium innocuum, Clostridium limosum, Clostridium Paraputrificum, Clostridium sporogenes, Clostridium subterminal, Clostdium tertium, Clostridium bar
  • the invention aims to treat infections caused by toxigenic forms of C. difficile, such as the epidemic strain of PCR-ribotype 027. Due to its particularly effective action on bacteria of the genus Clostridium such as Clostridium difficile (MIC of 0.05 ⁇ g / ml) and its greater activity against Clostridium bacteria compared with other intestinal flora bacteria (30 time more active) on the other hand, the compound of formula (I) or (II) of the invention taken individually or as a mixture or a composition according to the invention, and in particular margaucine (III), is particularly advantageous for use for restoring the balance between different intestinal bacterial populations (microbial flora).
  • the present invention also relates to the use of the compound of formula (I) or (II) of the invention taken individually or as a mixture or a composition according to the invention, and in particular margaucine (III), for treating infections due to Clostridium bacteria, particularly C. difficile infections, such as CDI.
  • the compound of formula (I) or (II) of the invention taken individually or as a mixture or a composition according to the invention is used to treat DCIs consecutive to antibiotic therapy.
  • this compound is margaucine or the composition comprises margaucine (compound of formula III).
  • Particularly targeted by the therapeutic and prophylactic methods described in the present invention are patients with C. difficile infection, including (a) patients with CDI, (b) patients with severe CDI. (c) patients with recurrent CDI, recidivism being characterized by a new episode of CDI occurring within 8 weeks of the beginning of the previous episode, whether the strain of C. difficile is the same or different from that of the previous episode.
  • Therapeutic and prophylactic methods apply to nosocomial CDIs (hospitalized or non-hospitalized patient who have been discharged from a health facility for less than 4 weeks) than to community DCIs.
  • the invention also relates to the use of a compound of formula (I) or (II) taken individually or as a mixture or of a composition as defined above, for the impregnation of devices, among which medical devices (or biomaterial).
  • impregnation is meant the application of at least one compound, a mixture or a composition of the invention, and possibly its penetration (deep or superficial) on the device.
  • the invention also relates to devices impregnated with the compound (alone, in a mixture or composition) of the invention.
  • the devices are biomedical devices, that is to say devices for medical use, such as for example, and without limitation, catheters, dressings, bone cements, brain shunts
  • devices for medical use such as for example, and without limitation, catheters, dressings, bone cements, brain shunts
  • devices for biomedical use devices made of a polymeric material, such as polyethylene, polypropylene, polyvinylchloride, polycarbonate, polyurethane, acrylate and methacrylate or polyamide or the materials obtained by weaving, will be preferred.
  • these devices are biocompatible.
  • the impregnated device is a fabric for domestic or industrial use, such as wipes.
  • the invention also relates to bacterial strains that have the capacity to produce at least one compound of formula (I) or (II) according to the invention.
  • the strains produce compounds according to the invention under the fermentation conditions set forth in point A below (material and methods). These strains can produce a compound of formula (I) or (II), taken individually or as a mixture and in particular margaucine.
  • such a strain is the JPL84 strain deposited, for the purposes of the Budapest Treaty at the CNCM (National Collection of Cultures of Microorganisms, Institut Pasteur, 25, rue du Dondel Roux, 75724 Paris Cedex 15, France), the September 15, 2006, under number CNCM I-3669.
  • the bacterial strains are Bacillus strains.
  • the invention also relates to strains derived from the strains described above and in particular to any strain derived from the strain JPL84 or JPL86, characterized in that they retain the capacity to produce a compound of formula (I) or (II or a mixture, and more particularly in that they retain the ability to produce margaucine.
  • “Derivative” means any strain that is not found in the natural state, and obtained from natural strains by modification of its genetic heritage, in particular a strain obtained by recombination (recombinant strain), provided that it continues to produce a compound of formula (I) or (II) according to the invention.
  • the recombinant strain produces a greater quantity of compounds according to the invention than the natural strain.
  • Modification of the genetic inheritance may consist, inter alia, in the modification of the enzymes and other proteins involved in the production and secretion of the compound of the invention.
  • the invention also relates to a method for modulating the bacterial profile of a biological sample or a surface, comprising contacting this biological sample or this surface with at least one compound according to formula (I) or (II ) taken individually or as a mixture or a composition according to the invention, under conditions making it possible to modify the bacterial profile; the method may also comprise a second step of recognizing the modulation.
  • the expression "modulate the bacterial profile” means modifying the relationship existing between the different strains. bacterial present in the biological sample or on the surface, before and after contacting with the compound or composition of the invention.
  • the method of the invention is suitable for treating the surfaces of different objects, such as, for example, the surfaces of objects of the medical services (for example, in a hospital environment).
  • the expression "Modulating the bacterial profile” includes the neutralization of bacterial activity, and in particular the destruction of all bacteria, that is to say the elimination of any bacterial profile.
  • the expression "modulate the bacterial profile""Means to cause a modification of the ratio between the strains resistant to the compound of the invention and the most sensitive strains By way of example, the addition of a compound according to the invention results in a decrease in gram positive strains, which modifies the ratio of gram-positive strains to gram-negative strains.
  • the carbon in position 1 is a CH 2
  • the carbon in position 3 is a CH
  • the carbon in the terminal position is a CH 3
  • CM. National Collection of Culture of Microorganisms, Institut Pasteur, Paris, France), under number CNCM I-3669. Sequencing of the gene coding for 16S RNA has been performed; strain JPL84 could be a strain Bacillus sp. The strain is maintained at 4 ° C. on CYE agar medium (CYE agar), containing 10 g of casitone, 1 g of yeast extract, 1 g of CaCl 2 and 14 g of agar in 1 liter of water.
  • CYE agar medium containing 10 g of casitone, 1 g of yeast extract, 1 g of CaCl 2 and 14 g of agar in 1 liter of water.
  • the fermentation of this strain is carried out in a CYE medium containing 10 g / l of peptone, 1 g / l of yeast extract and 1 g / l of CaCl 2 .
  • the molecule was purified by reverse phase chromatography: acetonitrile (10% WV) and fixing beads (Amberlite XAD-16) were added to the culture. The whole is placed at 4 ° C., with stirring for 12 hours. The XAD-16 beads are separated from the culture, washed with water and a water / methanol mixture (50/50) and then eluted with methanol (100%). This eluate is concentrated by evaporation under vacuum. The margaucine is finally purified by reverse phase HPLC on a C18 preparative column using a linear gradient of H2 ⁇ / 0.1% TFA and acetonitrile / 0.1% TFA ranging from 20% to 80% acetonitrile / 0.1% TFA in 30 minutes. with a flow of 10 ml / min. After lyophilization, 30 mg of margaucine was obtained from 10L of culture.
  • the molecular formula was determined by a combination of spectroscopic techniques: one- and two-dimensional NMR (s) and mass spectrometry.
  • MIC minimal inhibitory concentrations
  • M07-A6 NCCLS medium Mueller Hinton Broth
  • MCF7 breast cancer cell line
  • ATCC HTB-22 TM approximately 10,000 cells / well
  • RPMI medium containing 10% fetal calf serum
  • t + 1 in days, relative to seeding
  • cytotoxicity is measured by incorporation of MTT 3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyl tetrazolium bromide), according to Heeg K et al. (J. Immunol Methods, 1985 Mar. 18, 77 (2): 237-46.)
  • the results of the cytotoxicity are shown in Table 4.
  • the molecule was tested on a Staphylococcus aureus septicemia model, after infection of OF1 mice by intraperitoneal injection of bacteria.
  • mice From a total of 11 female OF1 mice, 25g (Charles River), at TO, 3 mice received an intraperitoneal injection of 200 ⁇ l of LB + 5% mucin (control of rearing conditions), and 8 mice received intraperitoneal injection of 200 ⁇ l of a bacterial suspension of Staphylococcus aureus Smith (10 8 CFU / ml) in LB medium + 5% mucin (infected mice).
  • mice were divided into two lots: at t + 3 hours, 5 mice received a 12.5 mg / ml solution of margaucine in 10% methanol and 90% H 2 O (ie a dose of 100 mg / kg), while the other 3 mice did not receive margaucine (control of infection).
  • mice The survival of the mice was monitored at 24 and 48 hours.
  • the 1 H NMR shows two signal groups (Table 1): - a first group with 3 1 H signals (at 2.66, 3.63 and 5.81 ppm) corresponding to carbon-bound protons with a visible resonance on the spectrum 13 C, all these signals are singlets, and a second group with 2 1 H signals with a chemical shift almost identical to the first group, linked to carbon atoms with a non-visible resonance on the 13 C spectrum. They correspond to an alcohol form of margaucine. An unprotected methylene group at 3.63 ppm can be attributed to the presence in the ⁇ -position of an oxygen atom and a carbonyl group.
  • the COZY spectrum shows no correlation while the protons are in the ⁇ position of a quaternary carbon or a heteroatom.
  • the presence of two quaternary carbons (170.2 and 105 ppm), one methine (95.6 ppm), one methylene (71.6 ppm) and two methyl equivalent groups (40.4 ppm) was deduced from the DEPT spectrum (Table 1).
  • Table 1 1 H and 13 C NMR, DEPT, HMQC and HMBC data for margaucine in CD 3 OD
  • the combination of NMR data and mass information suggests a symmetrical molecule.
  • the MS / MS experiments carried out on the molecular ion at m / z 211 make it possible to obtain a set of fragments in perfect adequacy with the proposed structure figurai, (ions obtained: 193, 175, 169, 165, 153, 151, 147, 141, 133, 129,
  • bacterial wall (composed of several layers including a lipid in gram-negative bacteria whereas it is composed of a single thick layer of murein or peptidoglycan in gram-positive bacteria).
  • Table 2 shows that the molecule is effective against Gram + bacteria at concentrations as low as 3.125 ⁇ g / ml or even 0.05 ⁇ g / ml for Clostridium difficile. GRAM ORGANIZATION MIC ( ⁇ g / mi)
  • MIC Minimum inhibitory concentration
  • margaucine is also active against multiresistant gram-positive strains, such as various strains of Staphylococcus aureus (H1, H3, H4, H7, H9, H16 and H18) (Table 3).
  • Staphylococcus aureus H1, H3, H4, H7, H9, H16 and H18
  • Table 3 Susceptibility of different strains of Stapi hyloco ⁇ aureus to various antibiotics including margaucine.
  • Table 4 Cytotoxicity of margaucine on an MCF7 cell culture.
  • margaucine is not toxic to eukaryotic cells, both in vitro and in vivo, at concentrations as high as 100 mg / kg.
  • the molecule was tested on a model of infection by
  • Clostridium difficile after subcutaneous injection of clindamycin (10 mg / kg body weight) to induce colitis, in hamsters
  • a new compound with antibiotic activity, margaucine, produced by a bacterial strain has been identified.
  • This compound is structurally characterized and is of low molecular weight.
  • margaucine has a broad Gram-positive spectrum, is nontoxic, effective on animal models of infection and does not cross with any known resistance.
  • Other compounds of similar structure and having an antibiotic activity are also provided in the present application, to illustrate the interest of this class of compounds for antibiotic application purposes. Because of its particularly effective action on bacteria of the Clostridium genus such as Clostridium difficile, at low concentrations (MIC of the order of 0.05 ⁇ g / ml), the compounds or compositions of the invention, and more particularly the margaucine, represent a strong therapeutic potential against gastrointestinal infections related to C.
  • the compound or the composition of the invention is 30 times more active on C. difficile bacteria than on the other bacteria of the intestinal flora.
  • vancomycin used to treat the most severe cases (MIC of the order of 1 ⁇ g / ml on C. difficile); however, vancomycin is already used to treat other bacterial infections, including Staphylococcus, the most serious, and has led to the appearance of many strains resistance; its use is limited to the maximum by the medical community in order to avoid the spread of resistance and the emergence of new resistant strains; and
  • metronidazole used as first-line therapy but is inactive for 25% of patients and for which there is frequent relapse (25% of cases); moreover, while metronidazole is less expensive than vancomycin, it has more side effects.
  • Nitazoxanide Phase III Romark Laboratories LC which is a close molecule in its mechanism of action of metronidazole; however, this molecule is not recommended for pregnant or lactating women;
  • rifaximin (Xifaxan) (Salix Pharmaceuticals Phase III), a molecule derived from rifampicin; its minimum inhibitory concentration (MIC) is of the order of 0.08 to 0.2 ⁇ g / ml on C. difficile, and this molecule generates many spontaneous resistors; and
  • the compound of the invention or a composition comprising it, and particularly margaucine constitutes a seductive alternative proposal to therapeutic molecules already on the market or those in clinical trials, in the treatment of digestive tract infections.
  • C. difficile (ICD) C. difficile

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Abstract

La présente demande concerne une nouvelle classe de composés dérivés de terpène, possédant une activité antibiotique, de formules (I) ou (II) dans laquelle A est choisi parmi NR1, O, S, CR2R3 ou R-(CH2)n-R' dans lequel R et R' sont, indépendamment l'un de l'autre, NH, O, S ou CH2, et R1, R2 et R3 sont des substituants, et n est supérieur ou égal à 1, en particulier égal à 2. La demande concerne aussi bien le composé dans sa formule (I) ou dans sa formule (II) pris individuellement, que les mélanges de ces deux composés, ainsi que des compositions, notamment thérapeutiques, comprenant au moins un de ces composés ou ce mélange. Dans un mode de réalisation particulier, le composé (I) ou (II) pris individuellement, les mélanges de ces deux composés ainsi que les compositions de l'invention sont utilisés dans le traitement des infections digestives liées à C. difficile. Dans un mode de réalisation particulier, le composé de formule (I) est la margaucine, composé produit par une souche bactérienne.

Description

NOUVELLE CLASSE DE COMPOSES DERIVES DE TERPENE A ACTIVITE ANTIBIOTIQUE, COMPOSITIONS LES CONTENANT ET UTILISATIONS
La présente demande concerne une nouvelle classe de composés dérivés de terpène, possédant une activité antibiotique, de formules (I) ou (II)
Figure imgf000003_0001
dans laquelle A est choisi parmi NR1, O, S, CR2R3 ou R-(CH2)n-R' dans lequel R et R' sont, indépendamment l'un de l'autre, NH, O, S ou CH2, et Ri, R2 et R3 sont des substituants, et n est supérieur ou égal à 1 , en particulier égal à 2.
Les progrès apportés par les antibiotiques dans le domaine médical sont aujourd'hui remis en question par l'apparition et la propagation de germes résistants à ces antibiotiques. Ainsi, en France, un des pays où l'on consomme le plus d'antibiotiques, on observe de nombreuses bactéries i résistantes aux antibiotiques. La relation de cause à effet entre ces deux phénomènes semble claire, même si elle n'est pas rigoureusement démontrée. Parmi les exemples les plus importants, on retrouve les Staphylocoques qui sont parmi les bactéries les plus résistantes (comme par exemple le staphylocoque doré résistant à la méthicilline) ainsi que le
Streptococcus pneumoniae résistant à la pénicilline, les entérocoques résistants à la vancomycine, les salmonelles polypharmacorésistantes et la tuberculose à bacilles multirésistants.
De plus, des déséquilibres de la flore intestinale peuvent survenir suite à un traitement antibiotique (antibiothérapie) destiné à soigner une infection. Ces déséquilibres entraînent eux-mêmes des infections digestives (diarrhées), notamment des infections digestives liées à Clostήdium difficile (ICD, ou CDAD pour Clostridium difficile-associated disease). Clostridium difficile est un bacille, gram-positif, anaérobie qui est la première cause de diarrhées infectieuses nosocomiales chez l'adulte
(environ 15 à 25% des cas de diarrhées post-antibiotiques et plus de 95% des cas de colites pseudomembraneuses) (Hurley et al. Arch. Intern. Med 2002 ; 162 :2177-84), et est naturellement partiellement résistant à la majorité des antibiotiques utilisés en clinique. Des traitements oraux à base de metronidazole ou de vancomycine sont utilisés en première intention.
Les patients rechutent dans 25% des cas ce qui génère des traitements longs et coûteux. Ainsi aux seuls Etats-Unis, les cas de diarrhées survenant à la suite d'un traitement antibiotique sont estimés à 12,2 cas pour 10 000 patients/jour entre 1987 et 1998 ou 7 à 8 cas pour 1000 admissions (http://www.cdc.gov/ncidod/dhqp/pdf/infDis/Cdiff_CCJM02_06
.pdf). La France et l'Europe sont de plus en plus sensibilisées à cette infection par C. difficile puisque la souche la plus virulente se répand dans ces pays. Une épidémie de C. difficile provoquée par une souche très virulente a d'ailleurs eu lieu en France en mars 2006 (source Institut Français de Veille Sanitaire ; Euro Surveill. 2006 11 :E060914.1 ). Les personnes touchées par ce type d'infection meurent dans 0,6 à 1 % des cas. Ces chiffres sont en progression et le coût estimé aux Etats-Unis est de l'ordre de 3669 à 7234 $ par patient.
Par ailleurs, à l'heure actuelle, relativement peu de biomatériaux sont protégés par des antimicrobiens. Les cathéters imprégnés d'antimicrobiens sont les dispositifs médicaux pour lesquels on dispose du plus de données. On retrouve essentiellement deux combinaisons de molécules: la chlorhexidine et la sulfadiazine d'argent ou la minocycline et la rifampicine. L'efficacité in vivo des premiers est controversée et serait limitée dans te temps (<10 jours). De plus certains cas d'anaphylaxie liés à l'usage de cathéters protégés par ces molécules ont été décrits (Terazawa et al. Anesthesiology. 1998 Nov;89(5): 1296-8; Kluger Anaesth Intensive Gare. 2003 Dec;31(6):697-8; Stephens et al. Br J Anaesth. 2001 Aug;87(2):306-8). Une nouvelle génération de cathéters imprégnés par la chlorhexidine et la sulfadiazine d'argent, non plus sur la seule face extérieure du cathéter mais aussi sur la face interne (ou lumière) s'est révélée réduire la colonisation (Rupp ME et al. .Ann Intern Med. 2005 Oct 18;143(8):570-80). Mais l'étude n'a pu démontrer une diminution significative des cas de septicémie. Les cathéters traités avec la minocycline et Ia rifampicine semblent faire preuve d'une efficacité supérieure, mais leur usage est limité par le risque qu'une utilisation abusive, à titre préventif, n'entraîne l'apparition de bactéries résistantes et leur fasse perdre par conséquent leur place dans l'arsenal thérapeutique. Ce dernier point est d'autant plus préoccupant que la rifampicine est l'un des rares antibiotiques systémiques efficaces sur les infections des prothèses.
Plus de 150 millions de cathéters veineux sont posés chaque année aux Etats Unis dans les hôpitaux et les cliniques, dont 5 millions de cathéters veineux centraux. Dans ce même pays 800000 stents sont utilisés chaque année. Le marché du cathéter et des stents en 2004 est de 13,1 milliards de dollars et est en augmentation de 12,3 % par an
(http://www.marketresearch.com). Cette progression est supérieure a celle du médicament qui est de 7% (http://www.interphanna.ch/fr/l926.asp). On estime qu'en 2009 le marché atteindra environ 23 milliards de dollars. Il faut aussi remarquer qu'il y existe une forte demande pour des dispositifs médicaux tendant à réduire les risques. Les stents traités avec le tacrolimus qui diminue les risques de resténose ont une progression supérieure a celle des cathéters classiques. Des stents qui seraient traités avec des molécules limitant les infections devraient donc aussi trouver des débouchés. Le marché des greffes veineuses est de l'ordre de 500 millions de dollars par an (hors amérique du nord) (http://www.alpha- research.com/coinoanv.htmi). Ces données sont résumées dans une revue récente (Raad et al. Arch. Intern. Med 2002, 162 871-879):
- la rifampicine seule ou associée à la minocycline est fréquemment utilisée pour traiter les dispositifs médicaux. La combinaison de ces deux molécules est une méthode efficace, puisque la rifampicine est l'un des rares antibiotiques actifs sur des bactéries en croissance lente, notamment sur les Staphylocoques à coagulase négative qui sont la cause la plus fréquente d'infection des cathéters, des stents et des greffes veineuses. Dans de larges études multicentriques, on estime qu'ils diminuent de 80% le risque d'infection, et que leur utilisation ferait gagner
500000$ à un hôpital qui utilise 850 cathéters veineux centraux. Cependant, l'utilisation de ces cathéters est ralentie par Ia crainte de sélectionner des résistants à la rifampicine dans le cadre d'un traitement préventif ; - les sels d'argents qui ont un large spectre antimicrobien sont également utilisés pour le traitement de dispositifs médicaux. Ce traitement est décrit selon les études, comme inefficace ou relativement efficace dans la prévention de la colonisation de cathéters posés pour moins de 10 jours. Ils sont inopérants sur des cathéters posés pour plus longtemps. Il semblerait que le collagène chélate les sels d'argent et inhibe leur activité.
De plus ils peuvent être responsables de réactions d'hypersensibilités.
- l'association chlorexidine-sulfadiazine d'argent: le traitement de cathéters par cette association ne semble pas très efficace, et leur intérêt est très discuté sur le long terme.
La présente demande concerne une nouvelle classe de composés possédant une activité antibiotique, plus particulièrement une activité antibactérienne à large spectre gram-positif, sur des bactéries telles que Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Enterococcus faecalis, Bacillus anthracis et Clostήdium difficile. Les composés de cette classe présentent de plus un faible poids moléculaire, ne sont pas toxiques in vitro et in vivo et ne présentent pas de réaction croisée avec les résistances connues. Parmi cette classe de composés antibiotiques, on citera préférentiellement la margaucine, qui peut être isolée à partir d'un surnageant de culture d'une souche bactérienne.
DESCRIPTION DES DESSINS
Figure 1 : Formule développée de la margaucine ;
DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION
La présente invention concerne un composé de formule (I) ou
Figure imgf000007_0001
dans laquelle A est choisi parmi NRi, O, S, CR2R3 ou R-(CH2)n-R' dans lequel R et R' sont, indépendamment l'un de l'autre, NH, O, S ou CH2, et R-i, R2 et R3 sont des substituants, et n est supérieur ou égal à 1 , en particulier égal à 2.
Les formules (I) et (II), telles que décrites dans l'ensemble de cette demande, englobent les formules présentant d'éventuels substituants
- sur les atomes constituant A (tels que R-i, R2 et R3) ; et/ou
- sur les carbones en positions 1 et/ou 3 et/ou 5 (position terminale), tels que X1, X'-i, X2, X3 et X'3
Figure imgf000008_0001
Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, A est choisi parmi NH, O, S, CH2 ou R-(CH2)n-R' dans lequel R et R' sont, indépendamment l'un de l'autre, NH, O, S ou CH2 et n=2.
Dans un mode de réalisation particulier, dans les formules ci- dessus, le carbone en position 1 est un CH2, le carbone en position 3 est un CH, le carbone en position terminale est un CH3.
Ainsi, la présente invention concerne un composé de formule (I) OU (II) :
Figure imgf000008_0002
dans laquelle A est choisi parmi NH, O, S, CH2 ou R-(CH2)2-R' dans lequel
R et R' sont, indépendamment l'un de l'autre, NH, O, S ou CH2.
Dans un mode de réalisation particulier, l'invention ne vise pas, en tant que tel, le mélange synthétisé chimiquement selon le procédé décrit par Schank et al. (Chemistry of free cyclic vicinal tricarbonyl compounds ('1 ,2,3-triones1). Part 2. Redox reactions of 1 ,2,3-triones with ene-1 ,2-diols ('reductones'), 2-alkoxy-en-1-ols, ene-1 ,2-diamines, and related species. Helvetica Chimica Acta (2002), 85(5), 1295-1326), c'est-à- dire que l'invention n'a pas pour objet le mélange des composés de formules (III) et (IV) selon :
Figure imgf000009_0001
dans laquelle le carbone en position 1 est un CH2, le carbone en position 3 est un CH, le carbone en position terminale est un CH3, synthétisé dans les conditions de Schank et al.. En revanche, l'invention vise les composés produits par une bactérie et leurs mélanges, selon le procédé décrit ci- après à titre d'exemple, et concerne l'utilisation de ces composés et mélanges quel que soit leur mode de production (notamment par synthèse ou par une bactérie), en particulier la margaucine, dans des compositions ou les applications de ces composés ou mélanges décrits dans la présente demande. La présente invention concerne tout particulièrement un composé de formule (I) ou (11) :
Figure imgf000009_0002
dans laquelle A est choisi parmi NR-i, O, S, CR2R3 ou R-(CH2)n-R' dans lequel R et R' sont, indépendamment l'un de l'autre, N, O, S ou C, et R-i, R2 et R3 sont des substituants et n est supérieur ou égal à 1 , en particulier égal à 2. De préférence A est choisi parmi NH, O, S, CH2 ou R-(CH2)2-R' dans lequel R et R' sont, indépendamment l'un de l'autre, NH, O, S ou CH2.
Les modes particuliers quant à la présence ou l'absence d'éventuels substituants sur les atomes constituant A et à la présence ou l'absence d'éventuels substituants sur les carbones en positions 1 et/ou 3 et/ou 5 peuvent être combinés de façon indépendante.
Par composé de l'invention, on entend aussi bien le composé dans sa formule (I) ou dans sa formule (II), c'est-à-dire pris individuellement quel que soit son mode de préparation. Dans un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne le composé de formule (I), tel que décrit dans le cadre de la présente demande et en particulier le composé de formule (I) produit par une bactérie, et ses utilisations.
L'invention concerne également les mélanges de ces deux composés isomères, quelle que soit la proportion des composés (I) et (II), à l'exception du mélange obtenu par synthèse chimique selon le procédé de Schank et al. Les mélanges peuvent comprendre les formes (I) et (II) même si l'activité antibiotique de chacune de ces deux formes n'est pas équivalente. Ainsi, dans un mode de réalisation particulier, le mélange comprend les formes (I) et (II), dans lequel éventuellement une seule forme à une activité antibiotique. Dans un mode de réalisation particulier d'un mélange selon l'invention, la forme (I) a une activité antibiotique.
La présente invention vise également un procédé de préparation d'un composé de formule (I) ou (II), et plus particulièrement un procédé de préparation de la margaucine, comprenant (a) la mise en culture d'une souche bactérienne, et (b) la récupération, en particulier la purification, du composé de formule (I) ou (II) à partir du surnageant de culture. Dans un mode de réalisation particulier, la souche bactérienne utilisée dans le cadre d'un procédé selon l'invention est la souche JPL84 ou JPL86, et le composé produit est le composé de formule
(I)-
Par « mise en culture », on entend le fait de maintenir la souche bactérienne, particulièrement la souche JPL84, ou toute souche dérivée telle que définie dans la présente demande, dans des conditions de culture permettant sa survie et sa multiplication. Dans un mode de réalisation particulier, la mise en culture s'accompagne également de la production de l'antibiotique de formule (I) ou (II) ou de leur mélange ou favorise cette production. Le terme « mise en culture » sera utilisé indifféremment et selon la même définition que le terme « fermentation ».
Ainsi, tout milieu nutritif liquide peut convenir à la culture de la souche bactérienne, de la souche JPL84, ou de souches dérivées, dans la mesure où ce milieu contient une source de carbone, d'azote et de sels inorganiques. Dans un mode de réalisation, on préférera le milieu CYE (Casitone Yeast Extract), un milieu agar à base d'extrait de levure, dont la composition est par exemple la suivante : peptone à 10g/l, extrait de levure à 1 g/l et CaCI2 à 1 g/l.
D'autres conditions de culture connues de l'homme du métier peuvent également être modifiées, telles que la température, l'agitation ou non de la culture, et l'aération ou non de la culture. Dans un mode réalisation particulier, la souche bactérienne, particulièrement la souche JPL84, ou des souches dérivées, est cultivée à une température comprise entre 0 et 45°C, préférentiellement entre 20 et 370C, et encore plus préférentiellement à 28 0C, sous agitation et aération (culture aérobie). La durée recherchée de la culture, dans les conditions ci- dessus, dépend du moment auquel la production de l'antibiotique recherché est optimale ou est maximale, et cette durée est calculée par rapport à la mise en culture de la souche. Ainsi, la durée de culture (période entre la mise en culture et l'arrêt de cette culture) est d'environ 15 à 24 heures, préférentiellement entre 18 et 20 heures.
Par « purification », on entend toute technique permettant d'isoler l'antibiotique recherché des autres constituants du surnageant de culture. Par exemple, et de façon non limitative, on peut citer l'extraction par solvants, la précipitation, la chromatographie en phase inverse (HPLC), la chromatographie échangeuse d'ions ..., ou la combinaison de deux ou plusieurs de ces techniques. Le procédé de l'invention peut également comprendre une étape, optionnelle, entre l'étape (a) de mise en culture et l'étape (b) de purification, consistant en la séparation du surnageant de culture des cellules et autres débris cellulaires, par exemple par centrifugation. De façon optionnelle, l'antibiotique purifié peut par la suite être converti en sels (formes salifiées), incluant des sels non toxiques pharmaceutiquement acceptables, par une réaction standard avec des acides organiques ou inorganiques. Ces sels seront obtenus, particulièrement lorsque A égal N. De plus, l'antibiotique purifié, ou des sels de celui-ci, peuvent peut être obtenu sous forme anhydre, par lyophilisation.
La présente invention vise aussi un composé de formule (I) ou (II) ou leur mélange, tel que décrit ci-dessus obtenu par un procédé mettant en œuvre une culture de bactéries, tel que décrit dans cette demande.
Un mélange d'isomères de formules (I) et (II) tel que décrit ci- dessus peut également être obtenu par synthèse chimique, comme par exemple celle divulguée dans la publication de Schank et al. (Chemistry of free cyclic vicinal tricarbonyl compounds ('1 ,2,3-triones'). Part 2. Redox reactions of 1 ,2,3-triones with ene-1 ,2-diols ('reductones'), 2-alkoxy-en-1- ols, ene-1 ,2-diamines, and related species. Helvetica Chimica Acta (2002), 85(5), 1295-1326). Cette synthèse aboutit à la production d'un mélange à partir duquel on peut isoler, si approprié, l'un des composés de formule (I) ou (II).
Lorsque le composé de l'invention est obtenu par un procédé de culture de bactéries tel que décrit ci-dessus, il conserve une trace de sa production bactérienne et peut être distingué du même composé produit par synthèse chimique, du fait de la différence observée dans leurs rapports Ci2/C13 respectifs. Ainsi, le composé de formule (I) ou le composé de formule (II) produits chimiquement possède un rapport C12/C-13 différent du composé de formule (I) ou composé de formule (II), obtenu par un procédé bactérien, et particulièrement différent du composé de formule (I) ou composé de formule (II) obtenu à partir des bactéries citées dans la présente demande. Dans un mode de réalisation particulier, la margaucine produite chimiquement possède un rapport C12/Ci3 différent de la margaucine obtenue par un procédé bactérien, et particulièrement différent de la margaucine obtenue à partir des bactéries citées dans la présente demande.
Entre aussi dans le cadre de la présente invention une composition comprenant au moins un composé de formule (I) ou (II) tel que décrit ci-dessus, à l'exception du mélange de composés de formules (I) et (II), lorsque celui-ci est obtenu par synthèse chimique selon la méthode publiée par Schank et al.
Dans un mode de réalisation particulier, une composition selon l'invention comprend au moins un composé de formule (I) ou (II) obtenu par un procédé de production dans une bactérie décrit ci-dessus, particulièrement une composition comprenant au moins le composé de formule (I) obtenu à partir de la souche JPL84.
De plus, l'invention concerne une composition qui comprend au moins un transporteur et/ou un véhicule, et un composé de formule (I)
OU (II) :
Figure imgf000013_0001
dans laquelle A est choisi parmi NR-i, O, S, CR2R3 ou R-(Ch^)n-R' dans lequel R et R' sont, indépendamment l'un de l'autre, NH, O, S ou CH2, et
R1, R2 et R3 sont des substituants, et n est supérieur à 1 , de préférence égal à 2. Dans un mode de réalisation particulier, la composition comprend au moins un véhicule et au moins le composé de formule (I), en particulier la margaucine (composé de formule III). Dans cette composition, le composé est obtenu par synthèse chimique ou par procédé comprenant une culture de bactéries. Par « véhicule», on entend toute substance qui permet la formulation de l'antibiotique au sein d'une composition. Dans un mode de réalisation préféré, le véhicule est une substance ou une combinaison de substances physiologiquement acceptable(s), c'est-à-dire approprié pour l'utilisation de la composition en contact avec un être vivant (par exemple un mammifère non-humain, et préférentiellement un être humain), et est donc préférentiellement non toxique. De tels véhicules physiologiquement acceptables sont par exemple de l'eau, une solution saline, des solvants miscibles dans l'eau, des sucres, des lieurs, des excipients, des pigments, des huiles végétales ou minérales, des polymères solubles dans l'eau, des agents tensio-actifs, des agents épaississants ou gélifiants, des agents cosmétiques, des agents conservateurs, des agents alcalinisants ou acidifiants .... Des compositions particulières de l'invention sont des compositions pharmaceutiques, c'est-à-dire qu'elles sont formulées pour être administrées ou appliquées à un être vivant, à des fins thérapeutiques ou prophylactiques. Ces compositions pharmaceutiques contiennent des véhicules pharmaceutiquement acceptables pour une administration par voie systémique ou locale, particulièrement par injection, pour une application en contact avec un être vivant, par ingestion, ou utilisation sous une forme solide, gélatineuse, liquide ou en aérosol. Alternativement, les compositions de l'invention sont appliquées sur des matériaux qui seront en contact avec un être vivant tel que défini ci-dessus. Dans un mode de réalisation particulier, la composition comprend un véhicule pharmaceutiquement acceptable et la margaucine.
L'invention concerne également une composition qui comprend au moins un composé de formule (I) ou (II) tel que défini dans la présente demande, le cas échéant associé à un transporteur et/ou un véhicule tel que défini dans la présente demande, et qui comprend en plus au moins une deuxième molécule, différente, active contre des microorganismes. Par « molécule active », on entend, un composé chimique ou biologique, notamment un composé de faible poids moléculaire, par exemple un peptide, qui a la capacité de détruire, de neutraliser l'activité ou d'empêcher la prolifération des microorganismes. Cette molécule active peut être, à titre d'exemple, un antibiotique ou un bactéricide. La molécule active est préférentiellement choisie parmi un composé actif contre les bactéries gram-négatives et/ou un composé fongicide et/ou les composés listés dans le tableau 3 ci-après ou les composés suivants : les sels d'argents, la minocycline, la chlorexidine, la sulfadiazine, la rifampicine ....
Dans un mode de réalisation particulier, lorsque le composé de l'invention, seul ou en mélange ou lorsqu'une composition selon l'invention est utilisé pour traiter les infections digestives liées à C. difficile
(ICD), il n'est pas nécessaire de prévoir de l'administrer en combinaison avec un autre antibiotique, tel que par exemple ceux cités dans le tableau 6. En effet, dans le traitement des ICD, le composé de l'invention a une activité bactéricide contre C. difficile sans pour autant perturber la flore intestinale ; la co-administration d'autres antibiotiques pourrait annuler l'effet surprenant du composé de l'invention vis-à-vis de la préservation de la flore intestinale.
Dans un autre mode de réalisation, une composition de l'invention comprend au moins deux composés de formule (I) ou (II) tels que définis ci-dessus, mais qui diffèrent l'un de l'autre par leur structure, à savoir leur composition en atomes ou par la position de leurs différents substituants. Par exemple, la composition comprend au moins deux composés de formule (I) qui diffèrent par la nature de l'élément A, par les substituants situés sur l'élément A, et/ou par les substituants aux positions 1 , 3 et/ou 5. Une autre composition selon l'invention comprend au moins deux composés de formule (II) qui diffèrent par la nature de l'élément A, par les substituants situés sur l'élément A, et/ou par les substituants aux positions 1 , 3 et/ou 5.
L'invention vise également une composition qui comprend au moins un composé de formule (I) et un composé de formule (II), dans laquelle A est identique dans les deux composés et est choisi parmi NH, S,
CH2 ou R-(CH2)2-R' dans lequel R et R' sont, indépendamment l'un de l'autre, NH, O, S ou CH2, c'est-à-dire comprend deux isomères du même composé quant à la position des doubles liaisons.
Dans un mode de réalisation particulier, les compositions selon l'invention comprennent en plus un véhicule ou un transporteur.
La présente invention porte également sur l'utilisation d'un composé de formule (I) ou (II) pris individuellement ou en mélange ou d'une composition telle que définie ci-dessus, comme médicament, et tout particulièrement comme antibiotique (qui détruit ou empêche la prolifération de micro-organismes) et/ou bactéricide (qui détruit ou empêche la prolifération des bactéries).
Dans un mode de réalisation particulier, le composé de formule (I) ou (II) pris individuellement ou en mélange ou la composition de l'invention possède une activité bactéricide contre des bactéries gram positives (coloration de gram) ou des bactéries possédant une paroi fine composée de plusieurs couches dont une lipidique, c'est-à-dire que le composé détruit les bactéries ou ralentit leur croissance.
Dans un mode de réalisation particulier, le composé de formule (I) ou (II) pris individuellement ou en mélange ou la composition de l'invention est utilisé pour traiter les infections causées par des bactéries du genre Clostridium. Plus particulièrement, le composé de formule (I) ou (II) pris individuellement ou en mélange ou la composition de l'invention est utilisé pour traiter les infections causées par Clostridium difficile, et de préférence les infections digestives liées à Clostridium difficile (ICD) telles que les diarrhées simples, post-antibiotiques, ou les colites pseudomembraneuses (CPM). De préférence, l'utilisation comme médicament concerne le composé de formule (I) ou celui de formule (III).
Ainsi, l'invention concerne un composé, un mélange ou une composition selon l'invention, tout particulièrement la margaucine ou une composition la comprenant, pour l'utilisation comme médicament, préférentiellement comme antibiotique ou bactéricide.
Dans ses utilisations thérapeutiques ou méthodes thérapeutiques [qui comprennent l'administration à un être vivant d'au moins un composé de formule (I) ou (II) pris individuellement ou en mélange ou d'une composition selon l'invention], le(s) composé(s), le mélange ou la composition le (ou les) comprenant, peut être sous forme solide (cachet, poudre, gélule, pilule, suppositoire, comprimé à libération accélérée, comprimé gastrorésistants, comprimé à libération prolongée), gélatineuse (gel, pommade, crème, ovule), liquide (sirop, solution injectable, collyre) ou en aérosol (spray, vapeur, gaz). Ainsi, suivant sa forme galénique, le composé, le mélange ou la composition de l'invention peut être administré par voie orale, transmuqueuse-buccale, nasale, ophtalmique, otologique (dans l'oreille), vaginale, rectale, parentérale (intraveineuse, intramusculaire ou sous-cutanée), transcutanée (ou transdermique ou percutanée) ou cutané. Une administration ou une forme galénique permettant de favoriser l'activité bactéricide du composé de formule (I) ou (II) pris individuellement ou en mélange ou d'une composition selon l'invention, au niveau de l'intestin, constitue un mode de réalisation particulier de l'invention. Les doses administrées sont celles conventionnellement utilisées pour les autres antibiotiques ou combinaisons d'antibiotiques. A titre indicatif, des doses variant de 30 mg/kg/jour à 100 mg/kg/jour, suivant l'âge ou le poids du patient, la sévérité ou le stade de l'infection, le nombre d'administrations quotidiennes ou le mode d'administration, peuvent être administrées ; chez l'adulte principalement, des doses entre 1 g/jour et 10 g/jour sont habituelles. La présente invention concerne également l'utilisation d'un composé de formule (I) ou (II) pris individuellement ou en mélange, pour Ia fabrication d'une composition utile dans la lutte contre les infections bactériennes, dans le traitement ou la prophylaxie des infections bactériennes, plus particulièrement de maladies résistantes aux antibiotiques administrés jusqu'à ce jour.
Par « maladies résistantes », on entend toute infection dont l'origine est entièrement ou partiellement bactérienne. Plus particulièrement, l'expression « maladies résistantes » telle qu'employée dans le cadre de la présente demande englobe les infections dont au moins un agent responsable est sensible à un composé antibiotique de l'invention, qu'il soit utilisé seul ou en combinaison avec un autre composé de l'invention ou une autre molécule active. On peut citer par exemples les maladies multirésistantes (résistantes à plusieurs classes d'antibiotiques) ou toutes les infections causées par des bactéries gram positives.
Le terme « traitement » englobe aussi bien l'effet curatif (destruction du microorganisme), obtenu avec au moins un composé de l'invention ou une composition de l'invention, que l'amélioration des symptômes observés chez le patient (et liés à la présence du ou des microorganisme(s)) ou l'amélioration de l'état du patient. Ainsi, le terme
« traitement » s'applique au point d'infection principal ou secondaire(s), tout comme aux symptômes découlant de l'infection.
Les composés, mélanges et compositions de l'invention sont particulièrement utilisés dans le traitement des infections nosocomiales. Par le terme « prophylaxie », on entend toute utilisation d'au moins un composé, un mélange ou une composition de l'invention, à titre préventif, c'est-à-dire dans le but d'éviter l'apparition des symptômes après la contamination ou une suspicion de contamination, ou de prévenir l'infection par un microorganisme ou ses conséquences, particulièrement dans le cas d'une infection due à une bactérie, plus particulièrement une bactérie à gram-positif, et encore plus particulièrement une infection due à une bactérie du genre Clostridium telle que les infections digestives liées à Clostήdium difficile.
Les composés, mélanges ou compositions selon l'invention sont utilisés en thérapie et en prophylaxie selon les formes galéniques et modes d'administration indiqués ci-dessus. Dans un mode de réalisation particulier, Ie composé utilisé est la margaucine, ou toute composition, telle que définie dans la présente demande, comprenant au moins la margaucine.
L'invention porte également sur l'utilisation des composés, mélanges ou compositions de l'invention dans des applications cosmétiques, alimentaires ou vétérinaires (animaux domestiques, volaille, porcs, ovins, bovins ou animaux de compagnie).
Le composé de formule (I) ou (II) de l'invention pris individuellement ou en mélange ou une composition selon l'invention est particulièrement efficace contre les bactéries du genre Clostήdium, notamment les formes toxinogènes, telle que, à titre d'exemple, Clostridium difficile, Clostridium perfringens, Clostiridum botulinum, Clostridium tetani, Clostridium novyi, Clostridium histolyticum, Clostridium butyricum, Clostridium septicum, Clostridium sordellii, Clostridium ramosum, Clostridium bifermentans, Clostridium paraperfringens, Clostridium cadaveris, Clostridium clostridiiforme, Clostridium innocuum, Clostridium limosum, Clostridium paraputrificum, Clostridium sporogenes, Clostridium subterminale, Clostήdium tertium, Clostridium baratii, Clostridium argentinense, Clostridium chauvoei, Clostridium haemolyticum ou Clostridium spp. En relation avec les bactéries Clostridium difficile, l'invention vise le traitement des infections causées par des formes toxinogènes de C. difficile, telle que la souche épidémique de PCR-ribotype 027. Du fait de son action particulièrement efficace sur les bactéries du genre Clostridium telle que Clostridium difficile (CMI de l'ordre de 0,05 μg/ml) d'une part, et de sa plus grande activité vis-à-vis des bactéries du genre Clostridium par rapport aux autres bactéries de la flore intestinale (30 fois plus active) d'autre part, le composé de formule (I) ou (II) de l'invention pris individuellement ou en mélange ou une composition selon l'invention, et en particulier la margaucine (III), est particulièrement intéressant pour une utilisation à des fins de restauration de l'équilibre entre différentes populations bactériennes intestinales (flore microbienne). Ainsi, la présente invention vise également l'utilisation du composé de formule (I) ou (II) de l'invention pris individuellement ou en mélange ou une composition selon l'invention, et en particulier la margaucine (III), pour traiter des infections dues à des bactéries du genre Clostridium, plus particulièrement les infections dues à C. difficile, telles que les ICD. Dans un mode de réalisation particulier, le composé de formule (I) ou (II) de l'invention pris individuellement ou en mélange ou une composition selon l'invention est utilisé pour traiter les ICD consécutives à une antibiothérapie. Dans un mode de réalisation préféré, ce composé est la margaucine ou la composition comprend la margaucine (composé de formule III).
Sont particulièrement visés par les méthodes thérapeutiques et prophylactiques décrites dans la présente invention, les patients présentant une infection causée par C. difficile, et notamment (a) les patients atteints d'une ICD, (b) les patients atteints d'une ICD sévère, (c) les patients atteints d'une récidive d'ICD, la récidive étant caractérisée par un nouvel épisode d'ICD survenant dans les 8 semaines suivant le début du précédent épisode, que la souche de C. difficile soit la même ou différente de celle de l'épisode précédent. Les méthodes thérapeutiques et prophylactiques s'appliquent aussi bien aux ICD nosocomiales (patient hospitalisé ou patient non-hospitalisé sorti d'un établissement de santé depuis moins de 4 semaines) qu'aux ICD communautaires. Ces méthodes visent donc particulièrement les patients des établissements de santé, des maisons de retraite ou des établissements médico-sociaux, et tous les patients présentant des facteurs de risque vis-à-vis des ICD, à savoir les patients sous antibiothérapie (plus de 90% des cas), les personnes âgées de plus de 65 ans, les personnes atteintes de maladie sous-jacente sévère, les patients ayant subi une intubation nasogastrique, les patients ayant reçu des médicaments anti-ulcéreux et les patients en séjour hospitalier prolongé.
L'invention concerne également l'utilisation d'un composé de formule (I) ou (II) pris individuellement ou en mélange ou d'une composition telle que définie ci-dessus, pour l'imprégnation de dispositifs, parmi lesquels des dispositifs médicaux (ou biomatériel). Par « imprégnation », on entend l'application d'au moins un composé, d'un mélange ou d'une composition de l'invention, et éventuellement sa pénétration (profonde ou superficielle) sur le dispositif. Ainsi, l'invention vise aussi des dispositifs imprégnés du composé (seul, en mélange ou en composition) de l'invention. Dans un mode de réalisation particulier, les dispositifs sont des dispositifs biomédicaux, c'est-à-dire des dispositifs à usage médical, tels que par exemple, et sans être limitatif, des cathéters, des pansements, des ciments osseux, des shunts cérébraux, des valves cardiaques .... Parmi les dispositifs à usage biomédical, on préférera les dispositifs réalisés en matériau polymère, tel que polyéthylène, polypropylène, polychlorure de vinyle, polycarbonate, polyuréthane, acrylate et méthacrylate ou polyamide ou les matériaux obtenus par tissage. Dans un mode de réalisation particulier, ces dispositifs sont biocompatibles.
Dans un autre mode de réalisation, le dispositif imprégné est un tissu à usage domestique ou industriel, tel que les lingettes.
L'invention porte également sur des souches bactériennes qui ont la capacité de produire au moins un composé de formule (I) ou (II) selon l'invention. Dans un mode de réalisation particulier, les souches produisent des composés selon l'invention dans les conditions de fermentation exposées au point A ci-dessous (matériel et méthodes). Ces souches peuvent produire un composé de formule (I) ou (II), pris individuellement ou en mélange et en particulier la margaucine. A titre d'exemple, une telle souche est la souche JPL84 déposée, aux fins du Traité de Budapest auprès de la C. N. C. M. (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes ; Institut Pasteur ; 25, rue du Docteur Roux ; 75724 Paris Cedex 15 ; France), le 15 septembre 2006, sous le numéro CNCM I- 3669. Dans un mode de réalisation, en combinaison ou non avec les précédents, les souches bactériennes sont des souches Bacillus.
L'invention porte également sur des souches dérivées des souches décrites ci-dessus et en particulier sur toute souche dérivée de la souche JPL84 ou JPL86, caractérisées en ce qu'elles conservent la capacité de produire un composé de formule (I) ou (II) ou un mélange, et plus particulièrement en ce qu'elles conservent la capacité de produire la margaucine. Par « dérivé », on entend toute souche qui n'est pas retrouvée à l'état naturel, et obtenue à partir des souches naturelles par modification de son patrimoine génétique, en particulier une souche obtenue par recombinaison (souche recombinante), à condition qu'elle continue à produire un composé de formule (I) ou (II) selon l'invention. Dans un mode de réalisation particulier, la souche recombinante produit une plus grande quantité de composés selon l'invention que la souche naturelle. La modification du patrimoine génétique peut consister, entre autres, en la modification des enzymes et autres protéines impliquées dans la production et la sécrétion du composé de l'invention.
L'invention concerne également un procédé de modulation du profil bactérien d'un échantillon biologique ou d'une surface, comprenant la mise en contact de cet échantillon biologique ou de cette surface avec au moins un composé selon la formule (I) ou (II) pris individuellement ou en mélange ou une composition selon l'invention, dans des conditions permettant de modifier Ie profil bactérien ; le procédé peut également comprendre une seconde étape de constatation de la modulation. Dans le cadre de l'invention, l'expression « moduler le profil bactérien » signifie modifier le rapport existant entre les différentes souches bactériennes présentes dans l'échantillon biologique ou sur la surface, avant et après la mise en contact avec le composé ou la composition de l'invention.
Le procédé de l'invention est approprié pour traiter les surfaces de différents objets, comme par exemple les surfaces d'objets des services médicaux (par exemple, en milieu hospitalier).
Ainsi, lorsque l'échantillon biologique ou la surface ne contient que des bactéries sensibles au composé de l'invention, ou que les souches contenues dans l'échantillon biologique ou sur la surface sont sensibles à une composition de l'invention, l'expression « moduler le profil bactérien » englobe la neutralisation de l'activité bactérienne, et en particulier la destruction de l'ensemble des bactéries, c'est-à-dire l'élimination de tout profil bactérien.
En revanche, lorsque l'échantillon ou la surface comprennent d'une part des souches résistantes ou moins sensibles au composé ou composition selon l'invention et d'autre part des souches sensibles à ce même composé, l'expression « moduler le profil bactérien » signifie entraîner une modification du rapport entre les souches résistantes au composé de l'invention et les souches les plus sensibles. A titre d'exemple, l'addition d'un composé selon l'invention entraîne une diminution des souches gram positives, ce qui modifie le rapport souches gram positives / souches gram négatives.
EXEMPLES
A. MATÉRIEL ET MÉTHODES
Souche JPL84
La margaucine qui est le composé de formule (III),
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dans laquelle le carbone en position 1 est un CH2, le carbone en position 3 est un CH et le carbone en position terminale est un CH3, est produite par la souche JPL84, une souche isolée en 2005 d'un sol de la région d'Agout, France. Cette souche a été déposée le 15 septembre 2006, auprès de la
CN. CM. (Collection Nationale de Culture de Microorganismes ; Institut Pasteur ; Paris ; France), sous le numéro CNCM I-3669. Un séquençage du gène codant pour l'ARN 16S a été réalisé ; la souche JPL84 pourrait être une souche Bacillus sp. La souche est maintenue à 4°C sur un milieu CYE en gélose inclinée (CYE agar), contenant 10g de casitone, 1g d'extrait de levure, 1g de CaCI2 et 14g de gélose, dans 1 litre d'eau.
Fermentation ou mise en culture
La fermentation de cette souche est réalisée dans un milieu CYE contenant 10g/l de peptone, 1 g/l d'extrait de levure et 1 g/l de CaCI2.
Afin de produire la margaucine, la fermentation a été réalisée dans 10L de milieu CYE tel que défini ci-dessus, à 28°C sous agitation et aération. Le début de la production de la margaucine intervient au bout de 14h de fermentation pour atteindre son pic entre 18 et 2Oh. La production d'antibiotique a été contrôlée et quantifiée par un test de diffusion sur gélose contre Staphylococcus aureus (CIP 76.25) et par chromatographie en phase liquide sous haute pression (HPLC) analytique.
Purification La molécule a été purifiée par chromatographie en phase inverse : de l'acétonitrile (10% WV) ainsi que des billes fixatrices (Amberlite XAD-16) sont ajoutés à la culture. L'ensemble est placé à 4°C, sous agitation pendant 12h. Les billes XAD-16 sont séparées de la culture, lavées avec de l'eau et un mélange eau/méthanol (50/50) puis éluées avec du méthanol (100%). Cet éluat est concentré par évaporation sous vide. La margaucine est finalement purifiée par HPLC phase inverse sur colonne préparative C18 en utilisant un gradient linéaire d'H2θ/0.1 % TFA et d'acétonitrille/0.1 % TFA allant de 20% à 80% d'acétonitrile/0.1 % TFA en 30 mn avec un flux de 10 ml/mn. Après lyophilisation, 30 mg de margaucine ont été obtenus à partir de 10L de culture.
Détemination de la structure
La formule moléculaire a été déterminée par une combinaison de techniques spectroscopiques: RMN à une et deux dimension(s) et spectrométrie de masse.
Les analyses 13C, DEPT, 1H, COSY, HMQC et HMBC qui ont été réalisées en milieu CD3OD avec un Bruker Avance DPX-300 équipé d'une sonde directe QNP 5mm fonctionnant à 300 MHz pour 1H et à 75 MHz pour 13C sont présentées dans le Tableau 1.
Propriétés biologiques
a. Détermination des concentrations minimales inhibitrices (CMI), et test sur des bactéries multirésistantes Les concentrations minimales inhibitrices (CMI) ont été évaluées sur des souches de référence, par microdilution dans le milieu Mueller Hinton Broth (MHB) selon les normes CLSI/NCCLS (National Committee for Clinical Laboratory Standards. (2003). Methods for Dilution Antimicrobial Susceptibility Tests for Bacteria that Grow Aerobically — Sixth Edition: Approved Standard M07-A6. NCCLS, Villanova, PA, USA). La CMI a été déterminée comme étant la plus petite concentration de margaucine qui inhibe toute culture visible d'une souche bactérienne, après 18 heures de culture à 37°C.
L'activité antimicrobienne de la margaucine est présentée dans les Tableaux 2 et 3.
b. Evaluation de la toxicité in vitro de la margaucine
La toxicité de. la margaucine in vitro a été déterminée sur une lignée cellulaire du cancer du sein (MCF7) ; brièvement, une boite de culture 96 puits est ensemencée avec des cellules MCF7 (ATCC HTB- 22™, environ 10000 cellules/puit), dans un milieu RPMI contenant 10% de sérum de veau fœtal (t=0). A t+1 (en jours, par rapport à l'ensemencement), la molécule à tester est ajoutée. A t+2, la cytotoxicité est mesurée par incorporation de MTT 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5- diphenyl tetrazolium bromide), selon Heeg K et al. (J Immunol Methods. 1985 Mar 18;77(2):237-46.). Les résultats de la cytotoxicité sont présentés dans le tableau 4.
c. Evaluation de la toxicité in vivo de la margaucine
Trois (3) souris femelles OF1 de 25g (Charles River) ont reçu, par Injection intra péritonéale 200μl d'une solution de margaucine à 12,5 mg/ml dans 10% de méthanol et 90% d'H2O (soit une dose de 100mg/kg).
Le contrôle de la survie des souris à été réalisé à T24, T48, T72 et T96
(temps en heures) d. Détermination de l'efficacité de la margaucine in vivo sur une infection bactérienne
La molécule a été testée sur un modèle de septicémie à Staphylococcus aureus, après infection de souris OF1 par injection intraperitonéale de bactéries.
Sur un total de 11 souris femelles OF1 , 25g (Charles River), à TO, 3 souris ont reçu une injection intra péritonéale de 200μl de LB + 5% de mucine (contrôle des conditions d'élevage), et 8 souris ont reçu une injection intraperitonéale de 200μl d'une suspension bactérienne de Staphylococcus aureus Smith (108 CFU/ml) dans du milieu LB + 5% mucine (souris infectées).
Les 8 souris infectées ont été divisées en deux lots : à t+3heures, 5 souris ont reçu une solution de margaucine à 12,5 mg/ml dans 10% de méthanol et 90% d'H2O (soit une dose de 100mg/kg), tandis que les 3 autres souris n'ont pas reçu de margaucine (contrôle de l'infection).
La survie des souris a été contrôlée à 24 et 48 heures.
B. RESULTATS
Structure
Les analyses structurales ont permis de démontrer que la formule brute de la margaucine est Ci2H18O3.
L'analyse ESI-MS a permis de déterminer que la masse moléculaire de la margaucine est de 210 Da. La RMN du 13C montre 5 signaux (40.4, 71.6, 95.6, 105.0 et
170.2) et la RMN du1 H montre deux groupements de signaux (Tableau 1 ) : - un premier groupe avec 3 signaux 1H (à 2.66, 3.63 et 5.81 ppm) correspondant à des protons liés à des carbones avec une résonance visible sur le spectre 13C, tous ces signaux sont des singulets, et - un second groupe avec 2 signaux 1H avec un shift chimique presque identique au premier groupe, liés à des carbones avec une résonance non visible sur le spectre du 13C. Ils correspondent à une forme alcool de la margaucine. Un groupement méthylène non protégé a 3.63 ppm peut être attribué à la présence en position α d'un atome d'oxygène et d'un groupement carbonyle.
Le spectre COSY ne montre aucune corrélation alors que les protons sont en position α d'un carbone quaternaire ou d'un hétéroatome. La présence de deux carbones quaternaires (170.2 et 105 ppm), un methine (95.6 ppm), un méthylène (71.6 ppm) et deux groupements méthyl équivalents (40.4 ppm) a été déduite du spectre DEPT (Tableau 1 ).
L'attribution des protons liés à ces carbones par une liaison 13C-1H est obtenue grâce au spectre HMQC. La structure de la margaucine est confirmée par le spectre HMBC et ses interactions scalaires longues distances avec des pics liés C1/H3, C2/H3 et C2/H5 (Tableau 1 ).
Carbone n° 513C/ppm DEPT/HMQC δ 1H/ppm I* HMBC
1 170,2 C - - C1/H3
2 105,0 C C2/H3;
3 95,6 CH 5,81 S
5,79
71 ,6 CH2 33,,6633 SS C4/H4
3,62
5 40,4 CH3 22,,6666 SS C5/H5
6 33 CH3 2,63 S
Tableau 1 : Données 1H et 13C NMR, DEPT, HMQC et HMBC de la margaucine dans CD3OD La combinaison des données de RMN et des informations de masse suggère une molécule symétrique. Les expériences de MS/MS réalisées sur l'ion moléculaire à m/z 211 permettent l'obtention d'un ensemble de fragments en parfaite adéquation avec la structure proposée figurai , (ions obtenus : 193, 175, 169, 165, 153, 151 , 147, 141 , 133, 129,
123, 119, 111 , 109, 105, 95, 93, 91 , 85, 83, 81 , 79, 71 , 69, 67, 65, 57, 55, 43). Le spectre d'absorption UV montre deux maximum - λmax: 269 et 330. La structure de la margaucine est divulguée à la Figure 1 , et est dénommée 1 ,1'-Oxybis [4-méthylpent-3-en-2-on].
Concentrations minimales inhibitrices (CMI) Les CMI de la margaucine vis à vis de différentes bactéries gram-positives ou gram négatives, ainsi que de levures ont été déterminées et reprises dans le Tableau 2. Ainsi, la margaucine est active uniquement contre les bactéries gram positives, mais ne présente pas d'activité antibiotique vis-à- vis des bactéries gram négatives ni d'activité antifongique vis-à-vis de Candida alhicans (levure). De façon tout à fait intéressante, la présente expérience démontre également que la souche E. coli tolC (bactérie gram négative) est sensible à la margaucine. Cette souche tolC est déficiente au niveau d'un système de pompes à efflux, ce qui permet de faire l'hypothèse que la cause de l'inactivité de la margaucine vis-à-vis des bactéries gram négatives est liée au problème de la pénétration de la paroi bactérienne (composée de plusieurs couches dont une lipidique chez les bactéries gram-négatives alors qu'elle est composée d'une seule couche épaisse de muréine ou peptidoglycane chez les bactéries gram-positives). De plus, le Tableau 2 montre que la molécule est efficace contre des bactéries à Gram+, à des concentrations aussi faibles que 3,125 μg/ml, voire 0,05 μg/ml pour Clostridium difficile. ORGANISME GRAM CMI (μg/mi)
Bactérie
Clostridum difficile DSM1296 + 0,05 Staphylococcus aureus CIP 76.25 + 3,125 Staphylococcus epidermidis CIP 68.21 + 3,125 Staphylococcus aureus H1 + 3,125 Staphylococcus aureus H3 + 3,125 Staphylococcus aureus H4 + 1,563 Staphylococcus aureus Hl + 3,125 Staphylococcus aureus H9 + 3,125 Staphylococcus aureus H16 + 3,125 Staphylococcus aureus H18 + 3,125 Enterococcus faecalis H + 3,125 Bacillus anthracis + 3,125 Bacillus subtilis ATCC 27370 + 6,25 Escherichia coli CIP 76.24 - > 100 Escherichia coli ToIC - 3,125 Salmonella typhi - > 100 Serratia marcescens - > 100 Pseudomonas aeruginosa CIP 76.110 _ > 100 Levure
Candida albicans nja. > 100
Tableau 2. Concentration Minimale lnhibitrice (CMI) de la margaucine vis- à-vis de différentes souches bactériennes gram positives (+) ou gram négatives (-) et de Candida albicans. (n.a : non-applicable ; CIP : Collection Institut Pasteur ; ATCC : American Type Culture Collection).
Enfin, il a été démontré que la margaucine était également active contre des souches gram positives multirésistantes, telles que différentes souches de Staphylococcus aureus (H1 , H3, H4, H7, H9, H16 et H18) (Tableau 3). Staphylococcus aureus
H1 H3 H4 H7 H9 H16 H18
Pénicilline G R R R R R R R
Amoxicilline R R R R R R R
Piperacilline R R R R R R R
Oxacilline S S R S S R R
Cefazoline S S R S S R R
Tobramycine S S R S S R R
Amikacine s s R s s R R
Gentamicien s s S s s R S
Tetracycline s s S - - R -
Doxycycline s s S s s L S
Erythromycine s R s R R R R
Clindamycine s R s R S R R
Pristinamycine s S s S s L S
Co-trimoxazole s s s s s S S
Pefloxacine - - R R s - R
Ofloxacine s R R R s R R
Norfloxacine s R R R s R R
Ciprofloxacine - - R R s - R
Rifampicine s S S S s R S
Acide fusidique s S S S R S S
Fosfomycin s s s s S R R
Vancomycine s s s s s S R
Teicoplanine s s s s s L R
Margaucine* 3,125 3,125 3,125 1 ,563 3,125 3,125 3,125
Tableau 3 : Susceptibilité de différentes souches de Stapi hylocoα aureus à divers antibiotiques dont la margaucine.
(R : souche résistante à l'antibiotique concerné ; S : souche sensible à l'antibiotique concernée ; L : souche dont la résistance est intermédiaire à l'antibiotique concerné ; - : non testé ; * : CMI déterminée selon la méthode décrite ci-dessus).
Il n'a été observé aucune résistance croisée avec des antibiotiques commerciaux ; de plus, aucune souche résistante spontanée n'a été isolée, même après mutagenèse aléatoire. Toxicité in vitro et in vivo
Avant d'envisager l'utilisation de la margaucine in vivo pour lutter contres les bactéries gram positives, des tests de toxicité aussi bien in vitro (culture cellulaire) qu'/π vivo (animal) ont été réalisés.
Dans un premier temps et comme démontré au tableau 4 aucune cytotoxicité n'a été mesurée sur une culture cellulaire de cellules MCF7 traitée avec la margaucine à une concentration variant de 1 jusqu'à 100 mg/ml. En effet, le nombre de cellules dans une culture traitée par la margaucine est identique à celui d'une culture contrôle (n'ayant pas reçu d'antibiotique).
Figure imgf000032_0001
Tableau 4 : Cytotoxicité de la margaucine sur une culture de cellules MCF7.
De plus, l'injection de margaucine à une dose de 100 mg/kg d'animal n'a entraîné aucune toxicité sur les 3 souris, qui étaient vivantes à 96 heures. Ces résultats confirment donc l'innocuité de la margaucine in vivo.
Par conséquent, la margaucine n'est pas toxique sur des cellules eucaryotes, aussi bien in vitro qu'/n vivo, à des concentrations aussi élevées que 100 mg/kg.
Efficacité in vivo
L'efficacité de la margaucine a enfin été évaluée in vivo sur un modèle murin de septicémie à Staphylococcus aureus. Les résultats sont repris dans le tableau 5. Survie
Souris Souris ayant Nombre infectées reçu de la de souris margaucine à 24 h à 48 h
- - 3 3 souris vivantes 3 souris vivantes
+ - 3 3 souris mortes /
+ + 3 souris vivantes 3 souris vivantes
5 2 mortes 2 mortes
Tableau 5 : Survie des souris à 24 et 48 heures post-infection (- : non ; + : oui).
Ces résultats démontrent que l'infection par Staphylococcus aureus est fatale chez 100% des souris n'ayant pas reçu d'antibiotique. En revanche, 3 des 5 souris ayant reçu 100 mg/kg de margaucine ont survécu à l'infection.
Par conséquent, ces résultats confirment, d'une part les tests de CMI réalisés in vitro, et d'autre part que la margaucine a une activité antibiotique in vivo contre des bactéries gram positives, telles que Staphylococcus.
Comparaison de la CMI de quelques molécules sur C. difficile Le tableau 6, ci-après, résume la concentration minimale inhibitrice (en μg/ml) déterminée sur C. difficile, d'autres molécules actuellement utilisées ou en cours d'essai clinique (phase III).
Figure imgf000033_0001
Tableau 6: comparaison de l'activité de différentes molécules sur C. difficile Efficacité in vivo de la marqaucine sur les infections par C. difficile
La molécule a été testée sur un modèle d'infection par
Clostridium difficile, après injection sous-cutanée de clindamycine (10 mg/kg de masse corporelle) pour induire une colite, chez des hamsters de
Syrie dorés de 60 à 80g (lots de 20 animaux). Simultanément à l'injection de clindamycine ou 24 heures après cette injection, les hamsters ont été inoculés par voie orale avec une souche clinique virulente de C. difficile f105 souches par animal). Alternativement, la souche virulente de C. difficile est la souche ATCC 43255.
Une heure après l'inoculation de C. difficile, les hamsters ont été traités avec la margaucine par gavage (10 à 200 mg/kg de masse corporelle). Ce traitement a été répété pendant 3 jours, à raison d'une fois par jour et avec la même quantité de margaucine. Des contrôles avec des lots de 20 animaux, non infectés par
C. difficile et/ou non traités avec la margaucine ont été effectués, dans les mêmes conditions.
Les expériences sont actuellement en cours ; les animaux sont observés sur une période de 30 jours, et les animaux moribonds sont comptés puis sacrifiés.
Conclusion
Un nouveau composé possédant une activité antibiotique, la margaucine, produit par une souche bactérienne a été identifié. Ce composé est caractérisé d'un point de vue structural et est de faible poids moléculaire. De plus, la margaucine est à large spectre Gram positif, est non toxique, efficace sur des modèles d'infection animaux et ne croise avec aucune résistance connue. D'autres composés de structure analogue, et présentant une activité antibiotique, sont également proposés dans la présente demande, pour illustrer l'intérêt de cette classe de composés à des fins d'application antibiotique. Du fait de son action particulièrement efficace sur les bactéries du genre Clostridium telle que Clostridium difficile, à de faibles concentrations (CMI de l'ordre de 0,05 μg/ml), les composés ou compositions de l'invention, et plus particulièrement la margaucine, représentent un fort potentiel thérapeutique contre les infections digestives liées à C. difficile, et plus particulièrement les infections intestinales consécutives à une antibiothérapie et dues à C. difficile. De plus et contrairement aux antibiotiques commerciaux, le composé ou la composition de l'invention est 30 fois plus actif sur les bactéries C. difficile que sur les autres bactéries de la flore intestinale. Ces résultats font des composés ou compositions de l'invention un antibiotique de choix dans le traitement des infections par C. difficile par rapport aux antibiotiques commerciaux.
A titre de comparaison, les molécules utilisées actuellement pour traiter les infections par C. difficile sont :
(a) la vancomycine utilisée pour traiter les cas les plus graves (CMI de l'ordre de 1 μg/ml sur C. difficile) ; cependant, la vancomycine est déjà utilisée pour traiter d'autres infections bactériennes, notamment à Staphylocoque, les plus graves, et a entraîné l'apparition de nombreuses souches résistances ; son utilisation est limitée au maximum par la communauté médicale afin d'éviter la dissémination des résistances et l'émergence de nouvelles souches résistantes ; et
(b) le métronidazole utilisée en première intention mais qui est inactif sur 25% des patients et pour lequel on enregistre de fréquentes rechutes (25% des cas) ; de plus bien que le métronidazole soit moins chère que la vancomycine, il présente plus d'effets secondaires.
D'autres molécules actuellement en essai clinique peuvent également être comparées au composé de l'invention :
(a) le Nitazoxanide (phase III Romark Laboratories L. C.) qui est une molécule proche dans son mécanisme d'action du métronidazole ; cependant, cette molécule est déconseillée à la femme enceinte ou allaitante ;
(b) la rifaximin (Xifaxan) (phase III Salix Pharmaceuticals), une molécule dérivée de la rifampicine ; sa concentration minimale inhibitrice (CMI) est de l'ordre de 0,08 à 0,2 μg/ml sur C. difficile, et cette molécule génère de nombreux résistants spontanés ; et
(c) la lipiarmycin (OPT-80) (phase III Optimer Pharmaceuticals), dont la concentration minimale inhibitrice (CMI) est de l'ordre de 0,06 à 2 μg/ml sur C. difficile (Αntimicrob Agents Chemother. 2004 Dec; 48(12):4898-902).
Par conséquent, le composé de l'invention ou une composition le comprenant, et particulièrement la margaucine, constitue une proposition alternative séduisante aux molécules thérapeutiques déjà sur le marché ou à celles en cours d'essais cliniques, dans le traitement des infections digestives liées à C. difficile (ICD).

Claims

REVENDICATIONS:
1. Composé de formule (I) ou (II)
Figure imgf000037_0001
dans laquelle A est choisi parmi NR-i, S, CR2R3 ou R-(CHa)n-R' dans lequel R et R' sont, indépendamment l'un de l'autre, NH, O, S ou CH2, et R1, R2 et R3 sont des substituants, et n est supérieur ou égal à 1 , en particulier égal à 2.
2. Composé de formule (I) ou (II) selon la revendication 1 , dans laquelle A est choisi parmi NH, S, CH2 ou R-(CH2)2-R' dans lequel R et R' sont, indépendamment l'un de l'autre, NH1 O, S ou CH2
3. Procédé de préparation d'un composé de formule (I) ou (II) selon
Figure imgf000037_0002
dans laquelle A est choisi parmi NH, S, O, CH2 ou R-(CH2)2-R' dans lequel R et R' sont, indépendamment l'un de l'autre, NH, O, S ou CH2, comprenant : a. mettre en culture une souche bactérienne, et b. purifier le composé de formule (I) ou (II) à partir du surnageant de culture.
4. Procédé de préparation selon la revendication 3, dans lequel la souche bactérienne est la souche JPL84 déposée le 15 septembre 2006, auprès de la CN. CM., sous le numéro CNCM I-3669.
5. Procédé de préparation selon la revendication 3 ou 4, dans lequel le composé produit à la formule suivante :
Figure imgf000038_0001
6. Composé de formule (I) ou (II)
Figure imgf000038_0002
dans laquelle A est choisi parmi NH, S, O, CH2 ou R-(CH2)2-R' dans lequel R et R' sont, indépendamment l'un de l'autre, NH, O, S ou CH2, obtenu par un procédé comprenant : a. mettre en culture une souche bactérienne, et b. purifier le composé de formule (I) ou (II) à partir du surnageant de culture.
7. Composé selon la revendication 6, dans lequel la souche bactérienne est la souche JPL84 déposée le 15 septembre 2006, auprès de la CN. CM., sous le numéro CNCM I-3669.
8. Composé selon la revendication 6 ou 7, qui possède la formule suivante :
Figure imgf000039_0001
9. Composé selon la revendication 8, caractérisé en ce que le carbone en position 1 est un CH2, le carbone en position 3 est un CH et le carbone en position terminale est un CH3.
10. Composé selon l'une quelconque des revendications 6 à 9, qui possède un rapport Ci2/C-ι3 différent du même composé produit chimiquement.
11. Composition comprenant a) un composé de formule (I) ou (II) ou un mélange de ces composés
Figure imgf000039_0002
dans laquelle A est choisi parmi NH, S, O, CH2 ou R-(CH2)2-R' dans lequel R et R' sont, indépendamment l'un de l'autre, NH, O, S ou CH2 ; et b) au moins un véhicule pharmaceutiquement acceptable.
12. Composition comprenant : a) un composé de formule (I) ou (II) ou un mélange de ces composés
Figure imgf000040_0001
dans laquelle A est choisi parmi NH, S, O, CH2 ou R-(CH2)2-R' dans lequel R et R' sont, indépendamment l'un de l'autre, NH, O, S ou CH2 ; et b) au moins une deuxième molécule active contre des microorganismes, et de façon optionnelle un véhicule pharmaceutiquement acceptable.
13. Composition selon la revendication 12, caractérisée en ce que la au moins deuxième molécule active contre des microorganismes est un antibiotique.
14. Composition selon la revendication 13, caractérisée en ce qu'elle comprend un composé de formule (I) et un composé de formule (II), dans laquelle A est identique dans les deux composés et est choisi parmi NH, S,
CH2 ou R-(CH2)2-R' dans lequel R et R' sont, indépendamment l'un de l'autre, NH, O, S ou CH2.
15. Composé de formule (I) ou (II)
Figure imgf000040_0002
(I) (H) dans laquelle A est choisi parmi NH, S, O, CH2 ou R-(CH2)2-R' dans lequel R et R' sont, indépendamment l'un de l'autre, NH, O, S ou CH2, pour l'utilisation comme médicament.
16. Composé tel que défini dans la revendication 15, pour l'utilisation comme antibiotique ou bactéricide.
17. Composé tel que défini dans la revendication 15, pour l'utilisation dans le traitement ou la prophylaxie des infections bactériennes, de préférence à bactéries gram positives.
18. Composé selon la revendication 17, pour l'utilisation dans le traitement ou la prophylaxie des infections à bactéries du genre Clostridium, telle que les infections digestives liées à Clostridium difficile.
19. Composé selon la revendication 18, pour l'utilisation dans le traitement ou la prophylaxie des infections digestives liées à C. difficile consécutives à une antibiothérapie.
20. Composé selon Ia revendication 17 ou 18, pour l'utilisation dans la restauration de l'équilibre de la flore microbienne intestinale.
21. Composition choisie parmi une composition selon l'une quelconque des revendications 11 à 14 ou une composition comprenant un composé de formule (I) ou (II) selon
Figure imgf000041_0001
(I) (H) dans laquelle A est choisi parmi NH, S, O, CH2 ou R-(CH2)2-R' dans lequel R et R' sont, indépendamment l'un de l'autre, NH, O, S ou CH2, pour l'utilisation comme médicament.
22. Composition telle que définie dans la revendication 21 , pour l'utilisation comme antibiotique ou bactéricide.
23. Composition telle que définie dans la revendication 21 , pour l'utilisation dans le traitement ou la prophylaxie des infections bactériennes, de préférence des infections à bactéries gram positives.
24. Composition selon la revendication 23, pour l'utilisation dans le traitement ou la prophylaxie des infections à bactéries du genre Clostridium, telles que les infections digestives liées à Clostridium difficile.
25. Composition selon la revendication 24, pour l'utilisation dans le traitement ou la prophylaxie des infections digestives liées à C. difficile consécutives à une antibiothérapie.
26. Composition selon la revendication 23 ou 24, pour l'utilisation dans la restauration de l'équilibre de la flore microbienne intestinale.
27. Utilisation d'un composé de formule (I) ou (II) tel que défini dans la revendication 15 pour la fabrication d'une composition utile dans la lutte contre les infections bactériennes.
28. Utilisation d'un composé de formule (I) ou (II) tel que défini dans la revendication 15, pour l'imprégnation de dispositifs biomédicaux.
29. Utilisation d'une composition choisie parmi une composition selon l'une quelconque des revendications 11 à 14 ou une composition comprenant un composé de formule (I) ou (II) selon
Figure imgf000043_0001
dans laquelle A est choisi parmi NH, S, O, CH2 ou R-(CH2)2-R' dans lequel R et R' sont, indépendamment l'un de l'autre, NH, O, S ou CH2, pour l'imprégnation de dispositifs biomédicaux.
30. Dispositif biomédical imprégné d'un composé de formule (I) ou (II) :
Figure imgf000043_0002
dans laquelle A est choisi parmi NH, S, O, CH2 ou R-(CH2)2-R' dans lequel R et R' sont, indépendamment l'un de l'autre, NH, O, S ou CH2.
31. Dispositif biomédical imprégné d'une composition selon l'une quelconque des revendications 11 à 14, ou une composition comprenant un composé de formule (I) ou (II) selon
Figure imgf000044_0001
dans laquelle A est choisi parmi NH, S, O, CH2 ou R-(CH2)2-R' dans lequel R et R' sont, indépendamment l'un de l'autre, NH, O, S ou CH2.
32. Dispositif selon la revendication 30 ou 31 qui est un cathéter, un pansement, un ciment osseux, un shunt cérébral ou une valve cardiaque.
33. Souche bactérienne susceptible de produire un composé de formule (I) OU (II) :
Figure imgf000044_0002
dans laquelle A est choisi parmi NH, S, O, CH2 ou R-(CH2)2-R' dans lequel
R et R' sont, indépendamment l'un de l'autre, NH, O, S ou CH2.
34. Souche bactérienne selon la revendication 33 qui est la souche JPL84, déposée le 15 septembre 2006, auprès de la C. N. C. M., sous le numéro CNCM I-3669.
35. Souche dérivée d'une souche bactérienne selon la revendication 33 ou 34, caractérisée en ce qu'elle conserve la capacité de produire un composé de formule (I) ou (II).
36. Souche selon la revendication 35, caractérisée en ce qu'elle conserve la capacité de produire un composé de formule
Figure imgf000045_0001
dans laquelle A est choisi parmi NH, S, O1 CH2 ou R~(CH2)2-R' dans lequel R et R' sont, indépendamment l'un de l'autre, NH, O, S ou CH2, et le carbone en position 1 est un CH2, le carbone en position 3 est un CH, le carbone en position terminale est un CH3.
37. Procédé de modulation du profil bactérien d'un échantillon biologique ou d'une surface, comprenant la mise en contact de cet échantillon ou de cette surface avec au moins un composé selon la formule (I) ou (II) tel que défini dans la revendication 15, d'une composition selon l'une quelconque des revendications 11 à 14 ou d'une composition comprenant les composés de formule (I) ou (II).
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