WO2008029807A1

WO2008029807A1 - Nouveau polypeptide ayant une cytotoxicité contre le cancer, procédé pour cribler le polypeptide et utilisation du polypeptide

Info

Publication number: WO2008029807A1
Application number: PCT/JP2007/067229
Authority: WO
Inventors: Kinji Matsuura; Taizo Uda
Original assignee: Japan Science And Technology Agency
Priority date: 2006-09-06
Filing date: 2007-09-04
Publication date: 2008-03-13
Also published as: JPWO2008029807A1

Description

明細書

癌に対する傷害性を有する新規ポリペプチドおよびそのスクリーニング方法、ならびにこれらの利用

技術分野

[0001] 本発明は、癌に対する傷害性を有する新規ポリペプチドおよびそのスクリーニング方法、ならびにこれらの利用に関するものである。

背景技術

[0002] 一般に癌（腫瘍）の治療として、化学療法、外科療法、放射線療法、免疫療法などが行われている。化学療法は、抗癌剤を用いる治療法である。抗癌剤としては種々の物質が開発されており、 DNA合成阻害などの細胞代謝拮抗剤、チロシンキナーゼ阻害剤などの分子標的治療が行われている。しかし、従来の抗癌剤は、正常細胞と癌細胞との間の選択性が低ぐ薬剤の種類によっては、強い副作用を伴うこともある。そのため、さらなる好適な抗癌剤の開発が期待されている。

[0003] 抗体 (免疫グロブリン)でありかつ酵素作用を示すタンパク質である抗体酵素は、抗体触媒、 catalytic antibody, abzymeとも呼ばれている。特定の化学反応の中間体に特異的に結合するように作製された抗体酵素は、当該化学反応を触媒すること力 Sできる。また、抗体酵素は天然においても存在しており、天然の抗体酵素は、生体内に存在する抗体から L鎖または H鎖のみが分離して生成され特定の酵素活性を発揮する。

[0004] 天然の抗体酵素として、抗原を分解するものが知られている。現在、このような抗体酵素を利用した、医薬分野に応用する為の研究（例えば、 Helicobacter pyloriに起因する胃疾患、関節リウマチ、 HIVなどの治療に関する研究）が行われており、種々の医療分野における抗体酵素の利用が期待されて!/、る。

[0005] また、さらなる天然の抗体酵素としては、ヒト免疫グロブリン軽鎖であるベンスジョ一ンズタンパク質が挙げられる。ベンスジヨーンズタンパク質は、骨髄腫患者の尿中に存在するモノクローナル免疫グロブリンの L鎖の単量体または二量体であり、骨髄腫細胞で合成された過剰の L鎖が腎糸球体にて速やかにろ過されて尿中に出現したものである（特許文献 1などを参照のこと）。

特許文献 1 :日本国公開特許公報「特開 2004— 41143号公報 (公開日：平成 16年 2 月 12日）」

発明の開示

[0006] 抗体酵素は癌細胞に対する傷害性を有している力、もしれない。特許文献 1には、抗体酵素であるべンスジヨーンズタンパク質が抗癌剤として用いることができる力、もしれないことが示唆されている。しカゝし、公知の手法では、ベンスジヨーンズタンパク質が抗癌作用を有しているか否かを知ることはできなかった。このために、現在までに、癌に対する傷害性を示す抗体酵素は得られて!/、なレ、。

[0007] 本発明は、上記の問題点に鑑みてなされたものであり、正常細胞には影響を与えることなく癌細胞を特異的に傷害する物質をスクリーニングする方法を提供し、新たな抗癌剤を提供することを目的とする。

[0008] 本発明者らは、鋭意検討を行った結果、独自の培地条件で培養した癌細胞を用いれば、癌細胞に対する傷害性を有している物質を効率よく検出し得ることを見出したことにより、抗癌作用を有する新規ポリペプチドを見出し、本発明を完成するに至った

[0009] すなわち、本発明に係るポリペプチドは、（A)または（B)のアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、肺癌由来の細胞を特異的に傷害する活性を有することを特徴としている：（A)配列番号 1に示されるアミノ酸配列；または、（B)配列番号 1で示されるァミノ酸配列中の 1個もしくは数個のアミノ酸が置換、付加もしくは欠失された、アミノ酸配列。

[0010] 本発明に係るポリヌクレオチドは、上記ポリペプチドをコードすることを特徴としている。また、本発明に係るポリヌクレオチドは、（A)〜（C)のいずれか 1つの塩基配列からなるポリヌクレオチドであって、肺癌由来の細胞を特異的に傷害する活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであってもよい：（A)配列番号 2に示される塩基配列；（B)配列番号 2に示される塩基配列中の 1個もしくは数個のヌクレオチドが置換、付加もしくは欠失された、塩基配列；または、（C)配列番号 2に示される塩基配列の相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダィズする、塩基配列。 [0011] 本発明に係るベクターは、上記ポリヌクレオチドを含んでいることを特徴としている。

[0012] 本発明に係る形質転換体は、上記ポリヌクレオチドが導入されていることを特徴としている。

[0013] 本発明に係る抗体は、上記ポリペプチドと特異的に結合することを特徴としている。

[0014] 本発明に係る治療用組成物は、肺癌を治療するために上記ポリペプチドを含んでいることを特 ί毁としている。

[0015] 本発明に係る治療用キットは、肺癌を治療するために上記ポリペプチドを備えていることを特 ί毁としている。

[0016] 本発明に係る治療法は、肺癌を治療するために上記ポリペプチドを生体内に投与する工程を包含することを特徴として!/、る。

[0017] 本発明に係る検出方法は、肺癌由来の細胞を検出するために、上記ポリペプチドを細胞とインキュベートする工程を包含することを特徴としており、インキュベートした後の上記細胞の生存状態を評価する工程をさらに包含することが好ましい。

[0018] 本発明に係る検出用キットは、肺癌由来の細胞を検出するために、上記ポリぺプチドを備えていることを特徴としており、細胞の生存率を測定するための試薬をさらに備えていることが好ましい。

[0019] 本発明に係る検出用組成物は、肺癌由来の細胞を検出するために、上記ポリぺプチドを含んで!/、ることを特徴として!/、る。

[0020] 本発明に係るスクリーニング方法は、癌細胞を傷害する因子をスクリーニングするために、血清濃度が 2%以下の培地にて癌細胞を培養する工程、および候補因子を癌細胞とともにインキュベートする工程を包含することを特徴としている。本発明に係るスクリーニング方法は、インキュベートした後の上記癌細胞の生存状態を評価するェ程をさらに包含してもよい。

[0021] 本発明に係るスクリーニング方法において、上記因子は抗体酵素であることが好ましく、上記癌細胞は肺癌由来であることが好ましレ、。

[0022] また、本発明に係るスクリーニング方法において、上記培地は CaClを含んでいる

2

ことが好ましい。

[0023] 本発明に係ることを特徴とする癌細胞を傷害する因子は、上記のスクリーニング方法によって得られたことを特徴として!/、る。

[0024] 本発明に係る治療用組成物は、癌を治療するために、上記スクリーニング方法によつて得られた因子を含んで!/、ることを特徴として!/、る。

[0025] 本発明に係る治療用キットは、癌を治療するために、上記スクリーニング方法によつて得られた因子を備えてレ、ることを特徴として!/、る。

[0026] 本発明に係る治療法は、癌を治療するために、上記スクリーニング方法によって得られた因子を生体内に投与する工程を包含することを特徴としている。

[0027] 本発明に係る治療用組成物は、癌を治療するために、抗体酵素を含んでいることを特徴としている。

[0028] 本発明に係る治療用キットは、癌を治療するために、抗体酵素を備えていることを特徴としている。

[0029] 本発明に係る治療法は、癌を治療するために、抗体酵素を生体内に投与する工程を包含することを特徴としてレ、る。

[0030] 本発明の他の目的、特徴、および優れた点は、以下に示す記載によって十分分かるであろう。また、本発明の利点は、添付図面を参照した次の説明で明白になるであろう。

図面の簡単な説明

[0031] [図 1(a)]多発性骨髄腫の患者の尿サンプルから superosel2カラムにて分画した BJP

(YAG)のピークを示す図である。

[図 1(b)]多発性骨髄腫の患者の尿サンプルから superosel2カラムにて分画した BJP

(YAG)の画分を SDS— PAGEに供した結果を示す図である。

[図 2]多発性骨髄腫の患者から採取した BJP (YAG)のアミダーゼ活性を示す図であ

[図 3]培地の血清濃度を変化させたときの、 A549細胞の生存率を示す図である。

[図 4]A549細胞の形態を示す図であり、（a)は、 BJP (YAG)を培地に添加した場合を示し、（b)は、無添加の状態を示す。

[図 5]培地の血清濃度を変化させた際の、 BJP (YAG)の A549細胞への傷害性を示す図である。 [図 6]BJP (YAG)を培地に添加した際の A549細胞の生存率を示す図である。

[図 7]培地に添加する CaCl濃度を変化させた際の、 BJP (YAG)の A549細胞への

2

傷害性を示す図である。

[図 8]DFP結合型 BJP (YAG)のアミダーゼ活性を示す図である。

[図 9]DFP結合型 BJP (YAG)を培地に添加した際の A549細胞の形態を示す図である。

[図 10]DFP結合型 BJP (YAG)を培地に添加した際の A549細胞の生存率を示す図である。

[図 l l(a)]superosel2カラムにて分画した組換え体 BJP (YAG)のピークを示す図である。

[図

12カラムにて分画した組換ぇ体¾1？ (YAG)の画分を SDS— PA

GEに供した結果を示す図である。

[図 12]組換え体 BJP (YAG)のアミダーゼ活性を示す図である。

[図 13]組換え体 BJP (YAG)を添加した場合の種々の培養細胞の形態を示す図であ

[図 14]組換え体 BJP (YAG)を添加した際の A549細胞の生存率を示す図である。発明を実施するための最良の形態

[0032] 〔1 :ポリペプチド〕

1つの局面において、本発明は、肺癌由来の細胞を特異的に傷害し得るポリぺプチドを提供する。本明細書中で使用される場合、「肺癌由来の細胞」は、原発部位が肺である癌細胞が意図され、原発ガンおよび転移ガンの細胞ならびに生体から単離された細胞を含む。また、「肺癌由来の細胞を特異的に傷害する活性」は、他の細胞、例えば、肺以外を原発部位とする癌細胞や肺の正常細胞を傷害することなく肺癌由来の細胞のみを傷害する活性が意図される。

[0033] 本明細書中で使用される場合、用語「ポリペプチド」は、「ペプチド」または「タンパク質」と交換可能に使用される。また、ポリペプチドの「フラグメント」は、当該ポリぺプチドの部分断片が意図される。本発明に係るポリペプチドはまた、天然供給源より単離されても、化学合成されてもよい。 [0034] 用語「単離された」ポリペプチドまたはタンパク質もしくは細胞は、その天然の環境力も取り出されたポリペプチドまたはタンパク質もしくは細胞が意図される。例えば、宿主細胞中で発現された組換え産生されたポリペプチドおよびタンパク質は、任意の適切な技術によって実質的に精製されている天然または組換えのポリペプチドおよびタンパク質と同様に、単離されていると考えられる。

[0035] 一実施形態において、本発明に係るポリペプチドは、配列番号 1に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドある!/、はその変異体が好ましレ、。

[0036] 本明細書中においてタンパク質またはポリペプチドに関して用いられる場合、用語「変異体」は、目的のポリペプチドが有する特定の活性を保持したポリペプチドが意図され、「配列番号 1に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの変異体」は、肺癌由来の細胞を特異的に傷害する活性を有するポリペプチドが意図される。なお、本明細書を読んだ当業者は、本発明に係るポリペプチドの変異体が肺癌由来の細胞を特異的に傷害する活性を有するか否力、を容易に決定することができる。

[0037] ポリペプチドを構成するアミノ酸配列中のいくつかのアミノ酸力 S、このポリペプチドの構造または機能に有意に影響することなく容易に改変され得ることは、当該分野において周知である。さらに、人為的に改変させるだけではぐ天然のタンパク質において、当該タンパク質の構造または機能を有意に変化させない変異体が存在することもまた周知である。

[0038] 当業者は、周知技術を使用してポリペプチドのアミノ酸配列において 1または数個のアミノ酸を容易に変異させることができる。例えば、公知の点変異導入法に従えば、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの任意の塩基を変異させることができる。また、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの任意の部位に対応するプライマーを設計して欠失変異体または付加変異体を作製することができる。

[0039] 好まし!/、変異体は、保存性または非保存性アミノ酸置換、欠失、または付加を有する。これらは、本発明に係るポリペプチドの肺癌由来の細胞を特異的に傷害する活性を変化させない。

[0040] このように、本実施形態に係るポリペプチドは、肺癌由来の細胞を特異的に傷害する活性を有するポリペプチドであって、（1)配列番号 1に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、または、（2)配列番号 1に示されるアミノ酸配列において、 1個もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失もしくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチド、であることが好ましい。

[0041] 本発明に係るポリペプチドは、天然の精製産物、化学合成手順の産物、および原核生物宿主または真核生物宿主 (例えば、細菌細胞、酵母細胞、高等植物細胞、昆虫細胞、および哺乳動物細胞を含む）力組換え技術によって産生された産物を含む。組換え産生手順において用いられる宿主に依存して、本発明に係るポリぺプチドは、グリコシル化され得る力、、または非グリコシル化され得る。さらに、本発明に係るポリペプチドはまた、いくつかの場合、宿主媒介プロセスの結果として、開始の改変メチォニン残基を含み得る。

[0042] 本発明に係るポリペプチドは、アミノ酸がペプチド結合しているポリペプチドであればよいが、これに限定されるものではなぐポリペプチド以外の構造を含む複合ポリぺプチドであってもよい。本明細書中で使用される場合、「ポリペプチド以外の構造」としては、糖鎖およびイソプレノイド基等を挙げることができるが、特に限定されない。

[0043] また、本発明に係るポリペプチドは、付加的なポリペプチドを含むものであってもよい。付加的なポリペプチドとしては、例えば、 His, Myc、 Flag等のェピトープ標識ポリペプチドが挙げられる。

[0044] 他の局面において、本発明は、肺癌由来の細胞を特異的に傷害する活性を有するポリペプチドの生産方法を提供する。

[0045] 一実施形態において、本発明に係るポリペプチドの生産方法は、当該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むベクターを用いることを特徴とする。

[0046] 本実施形態の 1つの局面において、本実施形態に係るポリペプチドの生産方法は、上記ベクターが組換え発現系において用いられることが好ましい。組換え発現系を用いる場合、本発明に係るポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを組換え発現べクタ一に組み込んだ後、公知の方法により発現可能な宿主に導入し、宿主内で翻訳されて得られるポリペプチドを精製するとレ、う方法などを採用することができる。組換え発現ベクターは、プラスミドであってもなくてもよぐ宿主に目的ポリヌクレオチドを導入することができればよい。好ましくは、本実施形態に係るポリペプチドの生産方法は、上記ベクターを宿主に導入する工程を包含する。

[0047] このように宿主に外来ポリヌクレオチドを導入する場合、発現ベクターは、外来ポリヌクレオチドを発現するように宿主内で機能するプロモーターを組み込んであることが好ましい。組換え的に産生されたポリペプチドを精製する方法は、用いた宿主、ポリペプチドの性質によって異なる力 S、タグの利用等によって比較的容易に目的のポリペプチドを精製することが可能である。

[0048] 本実施形態に係るポリペプチドの生産方法は、当該ポリペプチドを含む細胞または組織の抽出液から当該ポリペプチドを精製する工程をさらに包含することが好ましい。ポリペプチドを精製する工程は、周知の方法 (例えば、細胞または組織を破壊した後に遠心分離して可溶性画分を回収する方法）で細胞や組織から細胞抽出液を調製した後、この細胞抽出液から周知の方法 (例えば、硫安沈殿またはエタノール沈殿、酸抽出、陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ァフィ二ティークロマトグラフィー、ヒドる工程が好ましいが、これらに限定されない。最も好ましくは、高速液体クロマトグラフィー（「HPLC」 )が精製のために用いられる。

[0049] 本実施形態の他の局面において、本実施形態に係るポリペプチドの生産方法は、上記ベクターが無細胞タンパク質合成系にお!/、て用いられることが好まし!/、。無細胞タンパク質合成系を用いる場合、種々の市販のキットが用いられ得る。好ましくは、本実施形態に係るポリペプチドの生産方法は、上記ベクターと無細胞タンパク質合成液とをインキュベートする工程を包含する。

[0050] 無細胞タンパク質合成系は細胞内 mRNAやクローニングされた cDNAにコードされているさまざまなタンパク質の同定等に広く用いられる手法であり、無細胞タンパク質合成系（無細胞タンパク質合成法、無細胞タンパク質翻訳系とも呼ぶ）に用いられるのが無細胞タンパク質合成液である。

[0051] 無細胞タンパク質合成系としては、コムギ胚芽抽出液を用いる系、ゥサギ網状赤血球抽出液を用いる系、大腸菌 S30抽出液を用いる系、および植物の脱液胞化プロトプラストから得られる細胞成分抽出液が挙げられる。一般的には、真核生物由来遺伝子の翻訳には真核細胞の系、すなわち、コムギ胚芽抽出液を用いる系またはゥサギ網状赤血球抽出液を用いる系のいずれかが選択される力翻訳される遺伝子の由来 (原核生物/真核生物)や、合成後のタンパク質の使用目的を考慮して、上記合成系から選択されればよ!/、。

[0052] 別の実施形態において、本発明に係るポリペプチドの生産方法は、当該ポリぺプチドを天然に発現する細胞または組織から当該ポリペプチドを精製することが好ましい。本実施形態に係るポリペプチドの生産方法は、後述する抗体またはオリゴヌタレォチドを用いて本発明に係るポリペプチドを天然に発現する細胞または組織を同定する工程を包含することが好ましい。また、本実施形態に係るポリペプチドの生産方法は、当該ポリペプチドを精製する工程をさらに包含することが好ましい。

[0053] さらに他の実施形態において、本発明に係るポリペプチドの生産方法は、本発明に係るポリペプチドを化学合成することを特徴とする。当業者は、本明細書中に記載される本発明に係るポリペプチドのアミノ酸配列に基づいて周知の化学合成技術を適用すれば、本発明に係るポリペプチドを化学合成できることを、容易に理解する。

[0054] 本発明に係るポリペプチドを生産する方法によって取得されるポリペプチドは、天然に存在する変異ポリペプチドであっても、人為的に作製された変異ポリペプチドであってもよい。

[0055] このように、本発明に係るポリペプチドの生産方法は、少なくとも、当該ポリペプチドのアミノ酸配歹 IJ、または当該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの塩基配列に基づいて公知慣用技術を用いればよいといえる。つまり、上述した種々の工程以外の工程を包含する生産方法も本発明の技術的範囲に属することに留意しなければならない。

[0056] 〔2 :ポリヌクレオチド〕

1つの局面において、本発明は、肺癌由来の細胞を特異的に傷害する活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。

[0057] 本明細書中で使用される場合、用語「ポリヌクレオチド」は、「遺伝子」、「核酸」または「核酸分子」と交換可能に使用され、ヌクレオチドの重合体が意図される。本明細書中で使用される場合、用語「塩基配列」は、「核酸配歹 IJ」または「ヌクレオチド配列」とと交交換換可可能能にに使使用用さされれ、、デデォォキキシシリリボボヌヌククレレオオチチドド ((AA、、 GG、、 CCおおよよびび TTとと省省略略さされれるる））のの配配列列ととししてて示示さされれるる。。

[0058] 一一実実施施形形態態ににおおいいてて、、本本発発明明にに係係るるポポリリヌヌククレレオオチチドドはは、、本本発発明明にに係係るるポポリリペペププチチドドををココーードドすするるポポリリヌヌククレレオオチチドドででああるる。。特特定定ののポポリリペペププチチドドののアアミミノノ酸酸配配列列がが得得らられれたた場場合合、、当当業業者者はは、、当当該該ポポリリペペププチチドドををココーードドすするるポポリリヌヌククレレオオチチドドのの塩塩基基配配列列をを容容易易にに設設計計すするるこことと力力ででささるる。。

[0059] 他他のの実実施施形形態態ににおおいいてて、、本本発発明明にに係係るるポポリリヌヌククレレオオチチドドはは、、配配列列番番号号 22にに示示さされれるる塩塩基基配配列列かかららななるるポポリリヌヌククレレオオチチドドああるるいいははそそのの変変異異体体ででああるる。。

[0060] 本本明明細細書書中中ににおおいいててポポリリヌヌククレレオオチチドドにに関関ししてて用用いいらられれるる場場合合、、用用語語「「変変異異体体」」はは、、特特定定ののポポリリペペププチチドドのの活活性性とと同同じじ活活性性をを保保持持ししてていいるるポポリリペペププチチドドををココーードドすするるポポリリヌヌククレレオオチチドドがが意意図図さされれ、、「「配配列列番番号号 22にに示示さされれるる塩塩基基配配列列かかららななるるポポリリヌヌククレレオオチチドドのの変変異異体体」」はは、、肺肺癌癌由由来来のの細細胞胞をを特特異異的的にに傷傷害害すするる活活性性をを有有すするるポポリリペペププチチドドををココーードドすするるポポリリヌヌククレレオオチチドドがが意意図図さされれるる。。すすななわわちち、、本本明明細細書書中中でで使使用用さされれるる場場合合、、ポポリリヌヌククレレオオチチドドのの観観点点ににおおけけるる変変異異体体はは、、肺肺癌癌由由来来のの細細胞胞をを特特異異的的にに傷傷害害すするる活活性性をを有有

'配列番号 2に示される塩基配列において、 1または数個の塩基が置換、欠失または付加されて!/、る塩基配列からなるポリヌクレオチド；ある!/、は

•配列番号 2に示される塩基配列の相補配列と、ストリンジェントな条件下でハイプリダイズし得るポリヌクレオチド

であり得る。

[0061] 本発明に係るポリヌクレオチドは、 RNA (例えば、 mRNA)の形態、または DNAの形態（例えば、 cDNAまたはゲノム DNA)で存在し得る。 DNAは、二本鎖または一本鎖であり得る。一本鎖 DNAまたは RNAは、コード鎖（センス鎖としても知られる）であり得る力、、または、非コード鎖（アンチセンス鎖としても知られる）であり得る。

[0062] 本明細書中で使用される場合、用語「オリゴヌクレオチド」は、ヌクレオチドが数個ないし数十個結合したものが意図され、「ポリヌクレオチド」と交換可能に使用される。ォリゴヌクレオチドは、短いものはジヌクレオチド（二量体）、トリヌクレオチド（三量体）と V、われ、長!/、ものは 30マーまたは 100マーと!/、うように重合して!/、るヌクレオチドの数で表される。オリゴヌクレオチドは、より長いポリヌクレオチドのフラグメントとして生成されても、化学合成されてもよい。

[0063] 本発明に係るポリヌクレオチドはまた、その 5 '側または 3 '側で上述のタグ標識 (タグ配列またはマーカー配歹 IJ)をコードするポリヌクレオチドに融合され得る。

[0064] ノヽイブリダィゼーシヨンは、 Sambrookら、 Molecular Cloning, A Laboratory

Manual, 2d Ed. , Cold Spring Harbor ： Laboratory (1989)に記載されている方法のような周知の方法で行うことができる。通常、温度が高いほど、塩濃度が低いほどストリンジエンシーは高くなり（ノ、イブリダィズし難くなる）、より相同なポリヌクレオチドを取得すること力 Sできる。適切なハイブリダィゼーシヨン温度は、塩基配列やその塩基配列の長さによって異なり、例えば、アミノ酸 6個をコードする 18塩基からなる DNAフラグメントをプローブとして用いる場合、 50°C以下の温度が好ましい。

[0065] 本明細書中で使用される場合、用語「ストリンジェントなハイブリダィゼーシヨン条件」は、ハイブリダィゼーシヨン溶液（50%ホルムアミド、 5 X SSC (150mMの NaCl、 1 5mMのクェン酸三ナトリウム）、 50mMのリン酸ナトリウム（pH7. 6)、 5 Xデンハート液、 10%硫酸デキストラン、および 20

中にて 42°Cでー晚インキュベーションした後、約 65°Cにて 0. 1 X SSC中でフィルターを洗浄することが意図される。ポリヌクレオチドの「一部」にハイブリダィズするポリヌクより好ましくは少なくとも約 20nt、さらにより好ましくは少なくとも約 30nt、そしてさらにより好ましくは約 30ntより長いポリヌクレオチドにハイブリダィズするポリヌクレオチド（ DNAまたは RNAのいずれ力が意図される。このようなポリヌクレオチドの「一部」に詳細に考察されるような検出用プローブとしても有用である。

[0066] 以上のように、本発明に係るポリヌクレオチドは、肺癌由来の細胞を特異的に傷害する活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであって、以下のいずれかであることが好まし!/、： (1)配列番号 1に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、または配列番号 1に示されるアミノ酸配列において 1個もしくは数個のアミノ酸が置換、付加もしくは欠失されたアミノ酸配列からなるポリぺプチドでありかつ肺癌由来の細胞を特異的に傷害し得ることを特徴とするポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；（2)配列番号 2に示される塩基配列からなるポリヌクレォチド；（3)配列番号 2に示される塩基配列において、 1個もしくは数個の塩基が置換、欠失もしくは付加された塩基配列からなるポリヌクレオチド；あるいは、（4)配列番号 2に示される塩基配列において、 1個もしくは数個の塩基が置換、欠失もしくは付加された塩基配列の相補配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下で

[0067] 本発明に係るポリヌクレオチドは、非翻訳領域 (UTR)の配列またはベクター配列（発現ベクター配列を含む）などの配列を含むものであってもよレ、。

[0068] なお、本発明に係るベクターは、周知の遺伝子組換え技術により、本発明に係るポリヌクレオチドを所定のベクターに揷入することにより作製することができる。上記べクターとしては、これに限定されるものではないが、後述する組換え発現ベクターの他に、クローニングベクターを用いることができる。

[0069] 本発明に係るポリヌクレオチドの生産方法も特に限定されるものではない。例えば、配列番号 2に示す塩基配列等に基づいて、 DNAシンセサイザ一により合成してもよい。当業者は、 200塩基以下のポリヌクレオチドであれば、 DNAシンセサイザ一によつて合成し得ることを容易に理解する。また、当業者は、 200塩基以下のポリヌクレオチドどおしを周知の方法を用いて連結し得るので、 200塩基以上のポリヌクレオチドを容易に取得し得る。ポリヌクレオチドは、取得されたポリヌクレオチドを铸型として P CR等により増幅することで大量に生産することができる。また、取得した上記ポリヌクレオチドを含むベクターを用いて大腸菌等を形質転換して、増幅したポリヌクレオチドを回収することによつても大量に生産することができる。

[0070] このように、本発明に係るポリヌクレオチドの生産方法は、少なくとも、当該ポリヌクレォチドの塩基配列に基づいて公知慣用技術を用いればよいといえる。つまり、上述した種々の工程以外の工程を包含する生産方法も本発明の技術的範囲に属することに留意しなければならなレ、。

[0071] 〔3 :ベクター〕

本発明は、肺癌由来の細胞を特異的に傷害する活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含んでいるベクターを提供する。本発明に係るベクターは、周知の遺伝子組換え技術により、本発明に係るポリヌクレオチドを所定のベクターに揷入することにより作製すること力 Sできる。上記ベクターとしては、組換え発現べクタ一の他にクローニングベクターが挙げられる力 S、これらに限定されない。

[0072] 〔4 :形質転換体〕

本発明は、肺癌由来の細胞を特異的に傷害する活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが導入された形質転換体を提供する。本明細書中で使用される場合、「形質転換体」は、細胞、組織または器官だけでなぐ生物個体を含む。

[0073] 形質転換体の作製方法（生産方法）としては、特に限定されな!/、が、例えば、組換えベクターを宿主に導入して形質転換する方法が挙げられる。また、形質転換の対象となる生物としても、特に限定されないが、各種微生物、植物および動物が挙げられる。

[0074] 遺伝子が導入されたか否かの確認は、 PCR法、サザンハイブリダィゼーシヨン法、ノーザンハイブリダィゼーシヨン法などによって行なうことができる。例えば、形質転換体から DNAを調製し、 DNA特異的プライマーを設計して PCRを行なう。 PCRは、前記プラスミドを調製するために使用した条件と同様の条件で行なうことができる。その後は、増幅産物についてァガロースゲル電気泳動、ポリアクリルアミドゲル電気泳動またはキヤピラリー電気泳動などを行い、臭化工チジゥム、 SYBR Green液などによつて染色し、そして増幅産物を 1本のバンドとして検出することによって、形質転換されたことを確認すること力 Sできる。また、予め蛍光色素などによって標識したプライマ一を用いて PCRを行い、増幅産物を検出することもできる。さらに、マイクロプレートなどの固相に増幅産物を結合させ、蛍光または酵素反応などによって増幅産物を確認する方法も採用することができる。

[0075] 本発明に係るポリヌクレオチドがゲノム内に組み込まれた形質転換体がいったん得られれば、当該生物体の有性生殖または無性生殖によって子孫を得ることができる。したがって、本発明には、本発明に係るポリヌクレオチドが発現可能に導入された生物体、もしくは、当該生物体と同一の性質を有する当該生物体の子孫、またはこれら由来の組織も含まれる。 [0076] このように、本発明に係る形質転換体は、少なくとも、本発明に係るポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが導入されていればよいといえる。すなわち、組換え発現べクタ一以外の手段によって生成された形質転換体も、本発明の技術的範囲に含まれる点に留意すべきである。

[0077] つまり、本発明の目的は、本発明に係るポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが導入されている形質転換体を提供することにあるのであって、本明細書中に具体的に記載した個々のベクター種および導入方法に存するのではない。したがって、上記以外のベクター種および生物種、ならびにベクター作製方法および細胞導入方法を用いて取得した形質転換体も本発明の技術的範囲に属することに留意しなければならない。

[0078] 〔5 :抗体〕

本発明は、肺癌由来の細胞を特異的に傷害する活性を有するポリペプチドと特異的に結合する抗体を提供する。本発明に係る抗体は、上記ポリペプチドと特異的に結合し得るものであればよく、当該ポリペプチドに対するポリクローナル抗体等でもよいが、当該ポリペプチドに対するモノクローナル抗体であることが好ましい。モノクローナル抗体は、性質が均一で供給しやすい、ハイプリドーマとして半永久的に保存ができるなどの利点を有する。

[0079] 本明細書中で使用される場合、用語「抗体」は、免疫グロブリン (IgA、 IgD、 IgE、 I gG、 IgMおよびこれらの Fabフラグメント、 F (ab' ) フラグメント、 Fcフラグメント）を意

2

味し、例としては、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、単鎖抗体および抗イディォタイプ抗体が挙げられるがこれらに限定されない。なお、「抗体」は、種々の公知の方法に従えば作製され得る。

[0080] Fabおよび F (ab' ) ならびに本発明に係る抗体の他のフラグメントが、種々の公知

2

の方法に従って使用され得ることは、当業者には明白である。このようなフラグメントは、代表的には、パパイン (Fabフラグメントを生じる）またはペプシン (F (alD ' ) フラグ

2 メントを生じる）のような酵素を使用するタンパク質分解による切断によって産生され得る。あるいは、本発明に係るポリペプチドに結合するフラグメントは、組換え DNA技術の適用または化学合成によって産生され得る。 [0081] このように、本実施形態に係る抗体は、本発明に係るポリペプチドと特異的に結合するフラグメント（例えば、 Fabフラグメントおよび F (ab' ) フラグメント）を備えていれ

2

ばよく、異なる抗体分子の Fcフラグメントとからなる免疫グロブリンも本発明に含まれることに留意すべきである。

[0082] つまり、本発明の目的は、本発明に係るポリペプチドと特異的に結合する抗体およびその利用を提供することにあるのであって、本明細書中に具体的に記載した個々の免疫グロブリンの種類 (IgA、 IgD、 IgE、 IgGまたは IgM)、抗体作製方法等に存するのではない。したがって、上記各方法以外によって取得される抗体も本発明の範囲に属することに留意しなければならない。

[0083] [6：癌を治療するための方法、組成物およびキット〕

本発明はさらに、肺癌を治療するための方法、組成物およびキットを提供する。本発明に係る治療用組成物は、本発明に係るポリペプチドを含んで!/、ることを特徴としており、本発明に係る治療用キットは、本発明に係るポリペプチドを備えていることを特徴としている。なお、本明細書中で使用される場合、用語「治療」は、症状を軽減または排除することが意図され、予防的 (発症前)または治療的 (発症後）に行われ得るものの!/、ずれもが包含される。

[0084] 本明細書中で使用される場合、「組成物」は各種成分が一物質中に含有されている形態であること力意図される。また、本明細書中で使用される場合、「キット」は各種成分の少なくとも 1つが別物質中に含有されている形態であることが意図される。

[0085] 一般に、組成物は「二種以上の成分が全体として均質に存在し、一物質として把握されるもの」が意図され、主成分としての物質 A単独を含有する組成物、主成分としての物質 Aと物質 Bとを含有する単一の組成物であり得る。これらの組成物は、物質 A および物質 B以外に他の成分 (例えば、薬学的に受容可能なキャリア）を含有してもよい。本発明に係る組成物は、物質 Aとして上述した本発明に係るポリペプチドを含有して!/、ることを特徴として!/、るので、本発明に係るポリペプチドを含有する組成物を他の組成物と併用する場合は、これらを全体として一組成物として認識し得な!/、が、この場合は、後述する「キット」の範疇に入り得、組成物としてではなくキットとして提供され得ることを当業者は容易に理解する。 [0086] 本発明に係る治療用組成物としての医薬品は、上記ポリペプチドを含んでおり、かつ、経口投与または非経口投与が都合よく行われるものであればどのような剤形のものであってもよい。本発明に係る医薬品の剤形としては、例えば注射液、輸液、用液剤、懸濁剤、乳剤、シロップ剤、外用液剤等の液体製剤;散剤、顆粒剤、錠剤、カブセル剤、腸溶剤、トローチ等の固形製剤；内湿布剤、点鼻剤、点耳剤、点眼剤、吸入剤、軟膏剤、ローション剤、坐剤等が挙げられる。また、本発明においては、症状に応じて、上記剤形の医薬品をそれぞれ単独で、または組み合わせて用いることができる。

[0087] 上記医薬品においては、目的に応じて、医薬の製剤技術分野において通常使用し得る公知の添加剤を添加することができる。このような添加剤としては、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、矯味剤、安定化剤等を挙げることができるが、特に限定されるものではない。より具体的には、上記医薬品が固形製剤の場合には、例えば、乳糖、ブドウ糖、ショ糖、マンニットなどの賦形剤;澱粉、アルギン酸ソーダなどの崩壊剤;ステアリン酸マグネシウム、タルクなどの滑沢剤；ポリビニールアルコール、ヒドロキシプ口ピルセルロース、ゼラチンなどの結合剤；脂肪酸エステルなどの界面活性剤；グリセリンなどの可塑剤などの添加剤を製剤中に含有させることができる。

[0088] また、上記医薬品が液体製剤の場合には、例えば、水、ショ糖、ソルビット、果糖などの糖類；ポリエチレングリコール、プロピレングリコール等のグリコール類；ごま油、ォリーブ油、大豆油などの油類； p—ヒドロキシ安息香酸エステル類などの防腐剤などの添加剤を製剤中に含有させることができる。また、液体製剤の場合、上記医薬品は有効成分である上記ポリペプチドを用時溶解させる形態の製剤であってもよい。

[0089] 上記医薬品の投与経路は特に限定されるものではなぐ経口投与または非経口投与の!/、ずれでもよレ、。服用の容易性の点から経口投与が可能であることが好ましレ、。また、上記医薬品の投与量は、投与経路、剤形、患者の症状の重篤度、年齢もしくは体重などによって適宜設定されるものであり特に限定されるものではない。

[0090] 本発明が治療用組成物ではなく治療用キットとして提供される場合は、その構成物の一つとして本発明に係るポリペプチドを備えていればよぐ当該ポリペプチドの使用方法は、本発明に係る治療用組成物におけるポリペプチドの使用方法に準ずる。他の構成物の使用方法については、その目的に応じて適宜選択されればよい。

[0091] 本明細書中において使用される場合、用語「キット」は、特定の材料を内包する容器 (例えば、ボトル、プレート、チューブ、ディッシュなど）を備えた包装が意図される。好ましくは該材料を使用するための指示書を備える。本明細書中においてキットの局面において使用される場合、「備えた (備えている）」は、キットを構成する個々の容器のいずれかの中に内包されている状態が意図される。また、本発明に係るキットは、複数の異なる組成物を 1つに梱包した包装であり得、ここで、組成物の形態は上述したような形態であり得、溶液形態の場合は容器中に内包されていてもよい。本発明に係るキットは、物質 Aおよび物質 Bを同一の容器に混合して備えても別々の容器に備えてもよい。「指示書」は、紙またはその他の媒体に書かれていても印刷されていてもよぐあるいは磁気テープ、コンピューター読み取り可能ディスクまたはテープ、 CD— ROMなどのような電子媒体に付されてもよい。本発明に係るキットはまた、希釈剤、溶媒、洗浄液またはその他の試薬を内包した容器を備え得る。さらに、本発明に係るキットは、癌（好ましくは肺癌）の治療に適用するために必要な器具をあわせて備えてあよい。

[0092] 上述したように、本発明に係るポリペプチドは、肺癌由来の細胞を特異的に傷害する活性を有している。従って、上記ポリペプチドを生体内に取り込ませることにより、当該生体内の肺癌細胞または肺癌由来の細胞を特異的に傷害することができ、その結果、肺癌細胞または肺癌由来の細胞の増殖を抑える力、、または減少させることができる。また、本発明に係る肺癌を治療するための方法は、上記ポリペプチドを生体内に投与する工程を包含している。本発明に係るポリペプチドは、正常な細胞を傷害することなく肺癌由来の細胞を特異的に傷害し得るので、上記方法を用いれば、肺癌由来の細胞を傷害して肺癌を治療することができる。

[0093] 〔7 :肺癌由来の細胞を検出するための方法、組成物およびキット〕

本発明はさらに、肺癌由来の細胞を検出するための方法を提供する。本発明に係る肺癌由来の細胞を検出する方法は、本発明に係るポリペプチドを細胞とインキュべートする工程を包含してレ、ることを特徴として!/、る。

[0094] 上述したように、本発明に係るポリペプチドは、肺癌由来の細胞を特異的に傷害する活性を有している。よって、本発明に係るポリペプチドとともにインキュベートされることにより細胞が傷害された場合は、当該細胞が肺癌由来の細胞であると判別し得る。一実施形態において、本発明に係る方法は、インキュベートした後の細胞の生存状態を評価する工程をさらに包含することが好ましい。

[0095] 細胞は、培養細胞として提供されても、生物学的サンプルとして提供されてもよい。

本明細書中において使用される場合、「生物学的サンプル」は、供給源としての生物材料 (例えば、個体、体液、細胞株、組織培養物もしくは組織切片）から得られる、任意の調製物が意図される。生物学的サンプルとしては、体液 (例えば、血液、唾液、歯垢、血清、血漿、尿、滑液、および随液）および組織供給源が挙げられる。好ましい生物学的サンプルは、被験体サンプルである。好ましい被験体サンプルは、被験体から得た病変部であり得、哺乳動物から組織を得るための方法は、当該分野で周知であり、例えば、穿刺による生検、内視鏡又は気管支鏡を用いた組織採取が挙げられる力 S、これらに限定されない。

[0096] 一つの局面において、本発明に係る方法において、細胞の生存状態を評価するェ程は、細胞の形態変化を観察することによって行われ得る。肺癌由来の細胞は上記ポリペプチドとインキュベートされることにより萎縮/縮小するので、細胞の形態変化を観察することにより、肺癌由来の細胞であるか否かを判定することができる。

[0097] また、他の局面において、本発明に係る方法において、細胞の生存状態を評価する工程は、細胞の生存率を測定することによって行われ得る。上記ポリペプチドとインキュペートした細胞の生存率を測定することによって、肺癌由来の細胞であるか否かを判定すること力できる。また、上記ポリペプチドとインキュベートした細胞と、上記ポリペプチドを添加せずにインキュベートした細胞（コントロール）とを比較すれば、当該細胞が肺癌由来であるか否かをより容易に判定することができる。すなわち、本発明に係る方法において、細胞の生存状態を評価する工程は、上記ポリペプチドとインキュペートした細胞の生存率と、上記ポリペプチドを添加せずにインキュベートした細胞の生存率とを比較することによって行われることがなお好ましい。

[0098] 細胞の生存率の測定には、細胞数を計数しても、 MTT法等の周知の比色法等を用いてもよい。 MTT法では、細胞に黄色のテトラゾリゥム塩である MTT (3, [4, 5— dimethylthiazol— 2— yl]—2, 5— diphenyltetrazoliumbromide)を添カロし、生存している細胞のミトコンドリア酵素によって MTTが紫色のホルマザンに変換された量を吸光度に基づいて測定することにより、細胞の生存率を測定することができる。

[0099] 本発明はさらに、肺癌由来の細胞を検出するための組成物およびキットを提供する。本発明に係る肺癌由来の細胞を検出するための組成物は、本発明に係るポリぺプチドを含んでいればよぐ本発明に係る肺癌由来の細胞を検出するためのキットは、本発明に係るポリペプチドを備えてレ、ればよ!/、。

[0100] 本発明に係る組成物およびキットは、本発明に係るポリペプチドを有して!/、るので、肺癌由来の細胞を検出するために使用することができる。また、本発明に係る肺癌由来の細胞を検出するためのキットは、細胞の生存率の測定に用いる試薬を備えていること力 S好ましい。上記試薬としては、細胞の生存率を測定するのに用いることができる試薬であればよぐ上述の MTT法関連試薬が挙げられる力これに限られない。

[0101] 〔8 :癌細胞を傷害する因子のスクリーニング方法〕

1つの局面において、本発明は、癌細胞を傷害する因子をスクリーニングする方法を提供する。本発明に係るスクリーニング方法は、血清濃度が 2%以下の培地にて癌細胞を培養する工程、および候補因子を癌細胞とインキュベートする工程を包含する特徴としている。インキュベート中の培地の血清濃度もまた 2%以下であることが好ましい。

[0102] 上記癌細胞としては、 HepG2 (肝臓癌由来の細胞）、 DLD— 1 (大腸癌由来の細胞）、 ACHN (腎臓癌由来の細胞）、 Hela (子宮頸癌由来の細胞）、および、 A549 ( 肺癌由来の細胞）の癌細胞株が挙げられる力これらに限定されず、標的とする癌細胞の種類に応じて適宜選択されればよい。なお、コントロール実験を行う場合は、正常細胞（例えば、 LLC PK1 (正常な腎臓の上皮細胞）、 L 5 (正常な肺の上皮細胞）など）を用いることができる力これらに限られない。

[0103] 培養温度および培養時間については、用いる細胞に応じて適宜設定されればよい。また、本発明者らは。独自の観点に基づいて、癌細胞を傷害する効果を首尾よく検出するためには、培地中の血清濃度が重要であることを見出した。よって、本発明に係るスクリーニング方法においては、培地中の血清濃度を適宜変更することが好ましい。なお、血清中の夾雑物による影響を考慮すべき場合は、血清濃度は低いことが好ましい。

[0104] 本発明に係るスクリーニング方法を用いる対象が抗体酵素である場合は、 CaClを

2 添加することにより、抗体酵素の癌細胞に対する傷害性をより顕著に観察することができるので、培地中に CaClが含まれていることが好ましぐ最終濃度 0. 25-0. 75

2

Mの CaClが含まれていることがより好ましい。

2

[0105] 一実施形態において、本発明に係るスクリーニング方法は、インキュベートした後の細胞の生存状態を評価する工程をさらに包含することが好ましい。

[0106] 一つの局面において、本発明に係るスクリーニング方法において、細胞の生存状態を評価する工程は、細胞の形態変化を観察することによって行われ得る。癌細胞は傷害されることにより萎縮/縮小するので、候補因子とインキュベートした細胞の形態変化を観察することにより、候補因子が癌細胞を傷害するか否力、を判定することができる。

[0107] 他の局面において、本発明に係るスクリーニング方法において、細胞の生存状態を評価する工程は、細胞の生存率を測定することによって行われ得る。候補因子とインキュペートした細胞の生存率を測定することによって、候補因子が癌細胞を傷害するか否かを判定することができる。細胞の生存率の測定には、細胞数を計数しても、 M TT法等の周知の比色法等を用いてもよい。また、本発明に係るスクリーニング方法において、候補因子とインキュベートした特定の癌細胞の生存率と、候補因子とインキュペートした当該癌細胞とは別の細胞の生存率とを比較する工程をさらに包含する。これにより、特定の癌細胞を特異的に傷害する因子を得ることができる。

[0108] 本発明はさらに、上記スクリーニング方法によって得られた因子を用いた、癌を治療するための方法、組成物およびキットを提供する。上記スクリーニング方法によって得られた因子は、本発明に係るポリペプチドと同様の特性を有しているので、本明細書を読んだ当業者は、当該因子が上述した治療法、治療用組成物および治療用キットに適用され得ることを、容易に理解する。

[0109] 以下、実施例および比較例により、本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらにより何ら限定されるものではない。尚、本発明は上述した各実施形態に限定されるものではなぐ請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。

[0110] また、本明細書中に記載された学術文献および特許文献の全てが、本明細書中において参考として援用される。

実施例

[0111] 〔実施例 1 : BJP (YAG)の精製〕

本発明に係るポリペプチド（ベンスジヨーンズタンパク質： BJP (YAG) )を、多発性骨髄腫患者の尿から精製した。具体的には、最終濃度 0. 45Mとなるように NaClを添加した多発性骨髄腫患者の尿を、静置した後にろ過して、沈殿を回収した。回収した沈殿を、 50mM Tris-HCl (pH7. 4) + 1M硫酸アンモニゥムによって平衡化ライし、 50mM Tris— HClバッファー（ρΗ7· 4)を用いて溶出した。この溶出液に 7 0%飽和硫酸アンモニゥムを添加して塩析した。沈殿を 50mM Tris— HC1バッファ一で溶解し、セフアデックス G— 75 (GEヘルスケア）のカラムを用いて、 BJP (YAG) の二量体と単量体との混合液を精製した。この混合液を、 superosel2カラム（GEへルスケア）にアプライし、 50mM Tris-HCl (pH7. 4) + 0. 15M NaClを用いて溶出することにより、 BJP (YAG)の二量体 (A)と単量体 (B)とを分離した（図 1 (a)および図 1 (b) )。

[0112] 図 1 (a)は、 superosel2カラムからのタンパク質の溶出を示す図である。示すように、 2つのピーク (Aおよび B)が得られた。それぞれのピークに対応する溶出画分 Aおよび Bの SDS— PAGEを行い、ゲルをクーマシーブリリアントブルー（CBB)によって染色した（図 1 (b) )。示すように、画分 Aのタンパク質の見かけの分子量は約 51. Ok Da、画分 Bのタンパク質の見かけの分子量は約 25. OkDaであった。

[0113] 〔実施例 2： BJP (YAG)のアミダーゼ活性の測定〕

BJP (YAG)が抗体酵素としての機能を有して!/、るかを確認するために、 BJP (YA G)のアミダーゼ活性を測定した。

[0114] アミダーゼ活性の測定を、クロモザィムトライ（Chromozym TRY、 Roche)を用いて行った。クロモザィムトライとは、 z—val— Gly—Arg— pNAで示されるアミノ酸配歹 IJからなるポリペプチドである。クロモザィムトライを加えた試料がアミダーゼ活性を有する場合、当該クロモザィムトライは分解され、 pNA (パラ二トロア二リド； p— nitroani lide)が生成する。従って、 pNAの生成量を測定することにより、試料のアミダーゼ活性を測定することができる。本実施例において、 pNAの生成量は、波長 405nmにおける吸光度を測定することにより測定した。

[0115] 実施例 1で得られた画分 Aおよび画分 Bの各々 200mlに、最終濃度 lOOmMのクロモザィムトライを添加し、 37°Cで 18時間インキュベートした。また、コントロールとして、 superosel 2カラムでの溶出溶液（50mM Tris-HCl (pH7. 4) + 0. 15M N aCl)に、最終濃度 lOOmMのクロモザィムトライを添加し、 37°Cで 18時間インキュべートした。その後、各試料の波長 405nmにおける吸光度を測定した（図 7)。

[0116] 図 7は、波長 405nmにおける吸光度の測定結果を示すグラフである。示すように、画分 Aは、高い吸光度を示した。すなわち、 BJP (YAG)の二量体 (A)が単量体 (B) よりも抗体酵素としての活性が高いことが示された。

[0117] 〔実施例 3： BJP (YAG)の癌細胞に対する傷害性の観察〕

HepG2 (肝臓癌由来の細胞）、 DLD 1 (大腸癌由来の細胞）、 ACHN (腎臓癌由来の細胞）、 Hela (子宮頸癌由来の細胞）および A549 (肺癌由来の細胞）の癌細胞株と、 LLC-PK1 (正常な腎臓の上皮細胞）および L 5 (正常な肺の上皮細胞）の正常細胞株に BJP (YAG)二量体を添加した後の細胞を観察することにより、 BJP ( YAG)二量体の効果を調べたが、通常の血清濃度（10%)で細胞を培養した場合は、いずれの細胞においても何ら変化がなかった（示さず）。これにより、 BJP (YAG)二量体が癌細胞に対する傷害性を有してレ、な!/、と考えられた。

[0118] しかし、本発明者らは独自の観点に基づき、血清中に含まれる夾雑物が BJP (YA G)二量体の効果が妨げたと考え、培地中の夾雑物がない系において癌に対する BJ P (YAG)二量体の効果を調べることにした。ただし、 HepG2、 DLD— 1、 ACHN, Hela, LLC— PK1および L— 5については、無血清培地を用いて培養し得る力 S、 A5 49は無血清培地では生存し得な!/、ので、通常濃度（10%)の血清をどれだけ低減させても A549の生育に影響が出な!/、のかを予め検討した（図 3)。 [0119] 種々の濃度の牛血清を含有する培地を用いて A549を 24時間培養した。図 3は、 1 0%牛血清含有培地にて A549を培養した後の細胞数に対する、各濃度の牛血清含有培地にて A549を培養した後の細胞数の比率を示すグラフである。示すように、血清濃度が 0%〜0. 75%の培地を用いた場合は、 A549が死滅した力 1 %以上の血清濃度であれば A549の生育に何ら影響を与えないことがわかった。

[0120] 次!/、で、サブコンフルェントな状態になるまで無血清培地を用いて培養した HepG 2、 DLD— 1、 ACHN、 Hela、 LLC— PK1および L— 5、ならびに 1 %の牛血清を加えた培地を用いて培養した A549に、最終濃度 1 H Mの BJP (YAG)二量体および最終濃度 0. 75Mの CaClを添加し、 18時間インキュベートした後の細胞を観察した

2

(図 4)。その結果、 BJP (YAG)二量体を A549に添加した場合、細胞が縮小/萎縮していた（図 4の（a) )。し力、し、何も添加しな力、つたコントロール（図 4の（b) )および他の細胞株 (示さず）では形態変化が認められなかった。このことより、 BJP (YAG)二量体が A549を特異的に傷害することがわかった。

[0121] さらに、 BJP (YAG)二量体の癌傷害活性が血清濃度依存的に観察されたことを裏付けるために、また、 BJP (YAG)二量体が癌傷害活性を示す至適血清濃度を検討するために、種々の濃度の血清を含有する培地を用いて培養した A549に BJP (YA G)二量体を添加し、インキュベートした後の細胞生存率を、 WST法を用いて測定した（図 5)。示すように、血清濃度が 2%を超えると BJP (YAG)二量体の細胞への傷害性が認められず、 1〜2%の血清濃度において、 BJP (YAG)二量体が効率よく作用することがわかった。なお、 WST法とは、 MTT法を改良した方法であり、テトラゾリゥム塩として、 MTTの代わりに WST (water— soluble tetrazolium,商品名 cell counting kit 8、 Doj in)を用いる方法である。

[0122] さらに、 BJP (YAG)二量体を添加した後の細胞生存率を、 WST法を用いて測定した。具体的には、以下の手順に従った。まず、 96穴マイクロプレートの各ゥエルに播種した A549 (5 X 10⁴cells)を、 16時間培養した。引き続き、最終濃度 0. 75Mの Ca C1とともに、最終濃度 1、 2、 3またはの BJP (YAG)二量体を培地に添加した

2

後に、 37°Cで 24時間培養した。次いで、培地に WSTを添加した後に、細胞をさらに 4時間インキュベートした。インキュベートした後の培地について、波長 450nmにおける吸光度を測定した（図 6)。示すように、 BJP (YAG)二量体は、濃度依存的に A5 49に対する傷害性を示した。

[0123] 〔実施例 4： BJP (YAG)二量体の癌細胞傷害性に対する CaClの影響〕

2

BJP (YAG)二量体の癌細胞傷害性を検討する際に、本発明者らの独自の観点に基づいて最終濃度 0. 75Mの CaClを BJP (YAG)二量体と同時に添加していたが、

2

次いで、 BJP (YAG)二量体の癌細胞傷害性に対する CaClの影響の有無を確認し

2

た。具体的には、 1 %血清を含有する培地を用いて培養した A549に対し、最終濃度 0mM〜2mMの CaCl、および最終濃度 0 μ Μ〜4 μ Μの BJP (YAG)二量体を添

2

加し、さらにインキュベートした後に WST法により細胞生存率を測定した（図 7)。示すように、最終濃度 0. 75mMの CaClを加えたとき、 BJP (YAG)二量体による癌細

2

胞傷害性は最大であった。しかし、 CaClの最終濃度が 2mMを超える場合は、 CaC

2

1 自体が細胞を傷害した。このように、 BJP (YAG)二量体が癌細胞傷害性を示すた

2

めには、適切な濃度の CaClが必要であることがわかった。

2

[0124] 〔実施例 5 :抗体酵素としての活性と癌細胞を傷害する活性との相関性〕

ジイソプロピルフルォロリン酸（DFP)は、セリンプロテアーゼなどの特異的拮抗剤であり、活性中心のセリン残基に結合することにより酵素を失活させる。すなわち、 D FP結合型の BJP (YAG)二量体は抗体酵素としての酵素活性を失って!/、ること力 S期待される。そこで、 DFP結合型 BJP (YAG)二量体を作製した。具体的には、 BJP (Y AG)二量体に過剰量のジイソプロピルフルォロリン酸 (DFP)を加え、 5分間静置した。その後、静置した溶液を 50mM Tris -HCl (pH7. 4) + 0. 15M NaClによって透析して、 DFP結合型 BJP (YAG)二量体を得た。

[0125] 作製した DFP結合型 BJP (YAG)二量体（100ml)に、最終濃度 lOOmMのクロモザィムトライを加えて反応させた後、波長 405nmにおける吸光度を測定した（図 8)。示すように、 DFP結合型 BJP (YAG)二量体は酵素活性を失っていた。

[0126] 次!/、で、 DFP結合型 BJP (YAG)二量体の癌細胞傷害性を確認した。 1 %血清含有培地中にてサブコンフルェントな状態になるまで培養した A549に、最終濃度 lm Mの DFP結合型 BJP (YAG)を、最終濃度 0. 75Mの CaClとともに添カロし、さらに 1

2

8時間インキュベートした後の細胞の形態を観察した（図 9)。示すように、 DFP結合型 BJP (YAG)二量体は、 A549を傷害する活性を失って!/、た。

[0127] DFP結合型 BJP (YAG)二量体が癌細胞傷害活性を失って!/、たことを検証するために、 DFP結合型 BJP (YAG)二量体を添加した後の細胞生存率を、 WST法を用いて測定した。具体的には、以下の手順に従った。まず、 96穴マイクロプレートの各ゥエルに播種した A549 (5 X 10⁴cells)を、 16時間培養した。引き続き、最終濃度 0. 75Mの CaClとともに、最終濃度 1、 2、 3または 4 Mの BJP (YAG)二量体を培地

2

に添加した後に、 37°Cで 24時間培養した。次いで、培地に WSTを添加した後に、細胞をさらに 4時間インキュベートした。インキュベートした後の培地について、波長 4 50nmにおける吸光度を測定した（図 10)。示すように、 BJP (YAG)二量体は、 A54 9を傷害する活性を失って!/、た。

[0128] このように、 BJP (YAG)二量体の有する酵素活性および癌細胞傷害性のいずれも、 DFPにより失われた。すなわち、 BJP (YAG)二量体は、セリンプロテアーゼであると考えられるとともに、抗体酵素としての活性と癌細胞を傷害する活性とが相関すると考免られる。

[0129] 〔実施例 6：組換え体 BJP (YAG)の作製〕

BJP (YAG)二量体溶液に約 1/50量のリシルエンドぺプチダーゼ、トリプシンまたはプロテアーゼ V8を添加した後、 37°Cで 24時間インキュベートし、溶液を HPLC逆相カラム（C18、 Brown Lee)により分画した。各画分をアミノ酸シークェンサ一（型番 492TH、 Applied biosystems)により解析し、 BJP (YAG)の可変部位および定常部のアミノ酸配列を得た (配列番号 1)。さらに得られた、 BJP (YAG)をコードする塩基配列（配列番号 2)の両端に制限酵素部位 (NcoI、 Xhol)を付加した塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを合成し、このオリゴヌクレオチドを、 C末端に Hisタグ配列を有する pET20b ( + ) (Novagen)のマルチクローニングサイトに揷入した。得られたプラスミドを用いて形質転換した大腸菌を用いて組換え体 BJP (YAG)を発現させた。組換え体 BJP (YAG)を発現した大腸菌から得た抽出液を、 Ni— agaroseカラム（商品名 Ni— NTA agarose, Qiagen)にアプライし、酸性の緩衝液を用いてカラムを洗浄した後、 1M Tris溶液を加えて中性にした溶出液を用いて、 Ni— agarose力ラム力、ら組換え体 BJP (YAG)を溶出した。この溶出液を superosel2カラムを用いて分画し、組換え体 BJP (YAG)の二量体と単量体とに分離した。

[0130] 図 11 (a)は、 superosel2カラムからのタンパク質の溶出を示す図である。実施例 1

(図 1)と同様に、 2つのピーク (Aおよび B)が得られた。また、それぞれのピークに対応する溶出画分 Aおよび Bの SDS— PAGEを行い、ゲルをクーマシーブリリアントブルー（CBB)によって染色した（図 11 (b) )。示すように、画分 Aのタンパク質の見かけの分子量は約 51. OkDa、画分 Bのタンパク質の見かけの分子量は約 25. OkDaであった。

[0131] 〔実施例 7：組換え体 BJP (YAG)のアミダーゼ活性の測定〕

組換え体 BJP (YAG)が抗体酵素としての機能を有して!/、るかを確認するために、実施例 2と同様に、組換え体 BJP (YAG)のアミダーゼ活性を測定した。

[0132] 実施例 6で得られた画分 Aおよび画分 Bの各々 200mlに、最終濃度 lOOmMのクロモザィムトライを添加し、 37°Cで 18時間インキュベートした。また、コントロールとして、 superosel 2カラムでの溶出溶液（50mM Tris-HCl (pH7. 4) + 0. 15M N aCl)に、最終濃度 lOOmMのクロモザィムトライを添加し、 37°Cで 18時間インキュべートした。その後、各試料の波長 405nmにおける吸光度を測定した（図 12)。

[0133] 図 12は、波長 405nmにおける吸光度の測定結果を示すグラフである。示すように、画分 Aは、高い吸光度を示した。すなわち、組換え体 BJP (YAG)は、多発性骨髄腫の患者力も採取した BJP (YAG)と同様に抗体酵素としての活性を有していることカゎカゝつた。

[0134] 〔実施例 8：組換え体 BJP (YAG)の癌細胞に対する傷害性の観察〕

実施例 3と同様に、組換え体 BJP (YAG)の癌細胞に対する傷害性を観察した。具体的には、サブコンフルェントな状態になるまで無血清培地を用いて培養した LLC PK 1および L 5、ならびに 1 %の牛血清を加えた培地を用レ、て培養した A549に、最終濃度 1 β Μの組換え体 BJP (YAG)二量体および最終濃度 0. 75Mの CaCl

2 を添加し、 18時間インキュベートした後の細胞を観察した（図 13)。その結果、組換え体 BJP (YAG)二量体を正常細胞である L— 5 (図 13の（a) )および LLC PK1 (図 1 3の（b) )に添加しても細胞の形態変化が認められな力、つた力組換え体 BJP (YAG) 二量体を A549に添加した場合は、細胞が縮小/萎縮していた（図 13の（c) )。このことより、組換え体 BJP (YAG)二量体もまた、多発性骨髄腫の患者から採取した BJP (YAG)と同様に A549を特異的に傷害することがわかった。

[0135] さらに、組換え体 BJP (YAG)二量体を添加した後の細胞生存率を、 WST法を用いて測定した。具体的には、以下の手順に従った。まず、 96穴マイクロプレートの各ゥエルに播種した A549 (5 X 10⁴cells)を、 16時間培養した。引き続き、最終濃度 0. 75Mの CaClとともに、最終濃度 1、 2、 3または 4 Mの組換え体 BJP (YAG)二量

2

体を培地に添加した後に、 37°Cで 24時間培養した。次いで、培地に WSTを添加した後に、細胞をさらに 4時間インキュベートした。インキュベートした後の培地について、波長 450nmにおける吸光度を測定した（図 14)。示すように、組換え体 BJP (YA G)二量体は、多発性骨髄腫の患者から採取した BJP (YAG)と同様に、濃度依存的に A549に対する傷害性を示した。

[0136] 以上のように、多発性骨髄腫の患者から採取した BJP (YAG)二量体および組換え体 BJP (YAG)二量体は、肺癌由来の細胞である A549にのみ傷害性を示した。このことから、 BJP (YAG)二量体は肺癌治療に有効な抗癌剤として利用することができると考えられる。また、上記傷害性が A549に特異的なものであり、正常細胞および他の癌細胞に対しては何ら影響を示さないことから、副作用が少ない抗癌剤として有用であると考えられる。

[0137] 本発明を用いれば、癌細胞を特異的に傷害することができる治療薬および治療方法を提供すること力できる。

[0138] 発明の詳細な説明の項においてなされた具体的な実施形態または実施例は、あくまでも、本発明の技術内容を明らかにするものであって、そのような具体例にのみ限定して狭義に解釈されるべきものではなぐ本発明の精神と次に記載する請求の範囲内で、レ、ろ!/、ろと変更して実施することができるものである。

産業上の利用可能性

[0139] 本発明に係るポリペプチドは、標的細胞に特異的かつ効果的に作用するので、本発明を用いれば、副作用の少ない癌治療のための治療薬を提供することができる。このように、本発明は、医学分野および製薬分野において非常に有用である。

Claims

請求の範囲

[1] (A)または（B)のアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、肺癌由来の細胞を特異的に傷害し得ることを特徴とするポリペプチド：

(A)配列番号 1に示されるアミノ酸配列；または

(B)配列番号 1に示されるアミノ酸配列にお!/、て 1個もしくは数個のアミノ酸が置換、付加もしくは欠失された、アミノ酸配列。

[2] 請求の範囲第 1項に記載のポリペプチドをコードすることを特徴とするポリヌクレオチド。

[3] (A)〜（C)のいずれか 1つの塩基配列からなるポリヌクレオチドであって、肺癌由来の細胞を特異的に傷害する活性を有するポリペプチドをコードすることを特徴とするポリヌクレオチド：

(A)配列番号 2に示される塩基配列；

(B)配列番号 2に示される塩基配列において 1個もしくは数個のヌクレオチドが置換、付加もしくは欠失された、塩基配列；または

(C)配列番号 2に示される塩基配列の相補配列とストリンジェントな条件下でハイプリダイズし得る、塩基配列。

[4] 請求の範囲第 2項または第 3項に記載のポリヌクレオチドを含んで!/、ることを特徴とするベクター。

[5] 請求の範囲第 2項または第 3項に記載のポリヌクレオチドが導入されて!/、ることを特徴とする形質転換体。

[6] 請求の範囲第 1項に記載のポリペプチドと特異的に結合することを特徴とする抗体

[7] 請求の範囲第 1項に記載のポリペプチドを含んでいることを特徴とする肺癌を治療するための治療用組成物。

[8] 請求の範囲第 1項に記載のポリペプチドを備えていることを特徴とする肺癌を治療するための治療用キット。

[9] 請求の範囲第 1項に記載のポリペプチドを生体内に投与する工程を包含する肺癌を治療する方法。

[10] 請求の範囲第 1項に記載のポリペプチドを細胞とインキュベートする工程を包含することを特徴とする肺癌由来の細胞を検出するための検出方法。

[11] インキュベートした後の上記細胞の生存状態を評価する工程をさらに包含することを特徴とする請求の範囲第 10項に記載の検出方法。

[12] 請求の範囲第 1項に記載のポリペプチドを備えていることを特徴とする肺癌由来の細胞を検出するための検出用キット。

[13] 細胞の生存率を測定するための試薬をさらに備えていることを特徴とする請求の範囲第 12項に記載の検出用キット。

[14] 請求の範囲第 1項に記載のポリペプチドを含んでいることを特徴とする肺癌由来の細胞を検出するための検出用組成物。

[15] 癌細胞を傷害する因子をスクリーニングする方法であって、血清濃度が 2%以下の培地にて癌細胞を培養する工程、および候補因子を癌細胞とともにインキュベートする工程を包含することを特徴とするスクリーニング方法。

[16] インキュベートした後の上記癌細胞の生存状態を評価する工程をさらに包含することを特徴とする請求の範囲第 15項に記載のスクリーニング方法。

[17] 上記因子が抗体酵素であることを特徴とする請求の範囲第 15項に記載のスクリーユング方法。

[18] 上記癌細胞が肺癌由来であることを特徴とする請求の範囲第 15項に記載のスクリ一ユング方法。

[19] 上記培地が CaClを含んでいることを特徴とする請求の範囲第 15項に記載のスクリ

2

一ユング方法。

[20] 請求の範囲第 15項に記載のスクリーニング方法によって得られたことを特徴とする癌細胞を傷害する因子。

[21] 請求の範囲第 15項に記載のスクリーニング方法によって得られた因子を含んでいることを特徴とする癌を治療するための治療用組成物。

[22] 請求の範囲第 15項に記載のスクリーニング方法によって得られた因子を備えていることを特徴とする癌を治療するための治療用キット。

[23] 請求の範囲第 15項に記載のスクリーニング方法によって得られた因子を生体内に投与する工程を包含することを特徴とする癌を治療する方法。

[24] 抗体酵素を含んで!/、ることを特徴とする癌を治療するための治療用組成物。

[25] 抗体酵素を備えて!/、ることを特徴とする癌を治療するための治療用キット。

[26] 抗体酵素を生体内に投与する工程を包含することを特徴とする癌を治療する方法