WO2008020744A2 - Procédé permettant d'extraire le facteur de croissance du tissu nerveux du venin de v.lebetina linnaeus - Google Patents
Procédé permettant d'extraire le facteur de croissance du tissu nerveux du venin de v.lebetina linnaeus Download PDFInfo
- Publication number
- WO2008020744A2 WO2008020744A2 PCT/MN2006/000006 MN2006000006W WO2008020744A2 WO 2008020744 A2 WO2008020744 A2 WO 2008020744A2 MN 2006000006 W MN2006000006 W MN 2006000006W WO 2008020744 A2 WO2008020744 A2 WO 2008020744A2
- Authority
- WO
- WIPO (PCT)
- Prior art keywords
- solution
- column
- chromatography
- venom
- sodium acetate
- Prior art date
Links
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/56—Materials from animals other than mammals
- A61K35/58—Reptiles
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
Definitions
- the invention relates to the industry of bioactive substances and can be used in biotechnological industries, medicine and the pharmaceutical industry, namely the production of medicines and diagnostic preparations from snake venom.
- FRNT Nerve tissue growth factor
- obtaining FRNT from animal tissues is very time-consuming and does not ensure the purity of the product, since the sources of the drug are a multicomponent mixture of various protein and non-protein components, the separation of which is a difficult task.
- the most effective source of PSF is snake poisons, which contain only protein components and have a stable composition.
- the composition of the poison of various snakes varies, this is due to the species specificity of the poisons, as well as to the habitat and living conditions.
- obtaining FRNT methods developed on the poisons of these snakes is not suitable when working with poisons of others.
- Purificapofepofefoftofibf -Race spake (Agkistrodop asiti) Vepom., Tohisop. -1999. -V.37, N7. -P.999-1013); from Agistrodop asitis poison, in which the poison dissolved in the buffer is subjected to separation of a DEAE Sephadex A-50 anion exchanger, then chromatographed twice on Sephadex G-200 (Quatg C, Hong J. et al. Aspirates Vpom apd its comraritiop with bvipe thrombi., Thiomb.Diath.haemorrth -1971.
- the objective of the invention is to develop a method for isolating nerve growth factor from V. Lebipa s poison, allowing, by conducting ion-exchange chromatography in 2 stages, prior to separation by size chromatography, properties and physicochemical stability, to increase the profitability of the production process, to reduce the time of isolation of PSF and increase its purity.
- the problem is solved in a method of isolating the growth factor of nerve tissue from the poison z V.
- Lebieta Lippaea including the dissolution of the poison in a buffer solution followed by centrifugation; size separation chromatography; ion exchange chromatography; collecting fractions containing the biological activity of FRNT; and freeze-drying, in which, according to the invention, ion-exchange chromatography is carried out before size-separation chromatography and is carried out in two stages on a column with Source 15S host, using in the first stage as a buffer solution 0.19-0.2 IM sodium acetate solution with pH 6.4- 6.6, and the specified solution with a concentration of 0.31-O.
- the resulting eluate is diluted 4-5 times with distilled water and rechromatographed on a column with the same support, but 10 times smaller in volume, using as buffer a solution of 0.045-0.055M sodium acetate solution with a pH of 5.0-5.2, and the same solution with a concentration of 0.95-1.05M and a pH of 6.4-6.6 is used as eluent; then carry out size-separation chromatography of the obtained eluate on Sierrdex 75 with 0.19-0.2 IM solution of ammonium bicarbonate at pH 6.4-6.6.
- the implementation of the invention is diluted 4-5 times with distilled water and rechromatographed on a column with the same support, but 10 times smaller in volume, using as buffer a solution of 0.045-0.055M sodium acetate solution with a pH of 5.0-5.2, and the same solution with a concentration of 0.95-1.05M and a pH of 6.4-6.6 is used as eluent; then carry out size
- the problem is solved by the proposed method, when the parameters of the process of allocation of the growth factor of nerve tissue are in the range specified in the claims. When the parameters are changed in the direction of increasing or decreasing, the characteristics of the resulting preparation worsen.
- the proposed method has the following advantages over the prototype.
- the physicochemical stability of carriers such as Source 15S and Sierrdex 75 is much higher than that of cellulose KM-52 and Sherhadeh G-100, which allows for a greater number of production cycles without noticeable changes the characteristics of the column and, along with a reduction in the time of allocation and consumables, significantly increase the profitability of production.
- giurza poison To 4.0mg of giurza poison, add 80ml of a 0.2M sodium acetate solution with a pH of 6.5, the mixture is stirred for 30 minutes at 4 ° C. The dissolved poison is centrifuged at 5,000 rpm at 4 ° C for 15 minutes. The precipitate is discarded, and an equal volume of a solution of 0.2M sodium acetate with a pH of 6.5 is added to the supernatant, mixed and used for ion exchange chromatography. The poison solution is applied to a column of Soyce 15S balanced with a 0.2M sodium acetate solution (pH 6.5) (column size 5x3 cm, volume 60 ml).
- the protein peak containing the PSF activity is collected (90 ml), diluted 5 times with distilled water, adjusted to pH 5.0 and applied to a concentration column with Soyce 15S (column size l.bhzcm, volume-bml), equilibrated with a 0.05M sodium acetate solution , pH 5.0 at a rate of ZOOcm / h (Yuml / min).
- the optical density is recorded continuously using a flow monitor UV-I (firm "GE Biociences AB"). 20 ml of a 0.05M sodium acetate solution with a pH of 5.0 are passed through the column.
- a 1.5 L 0.2 M sodium acetate solution with a pH of 6.4 is passed through the column.
- the rate of application and elution ZOsm / hour (Yuml / min).
- the optical density is recorded continuously using a flow monitor UV-I (firm "GE BIOSeps AB").
- the main part of proteins (over 85%) under these conditions is not adsorbed on the cation exchanger, and the PSF, which has an isoelectric point higher than 9.2, binds to Soyce 15S and is eluted with a stepwise ionic strength gradient of 0.3 IM sodium acetate with pH 6.4.
- the protein peak containing the PSF activity is collected (93 ml), diluted 4.5 times with distilled water, adjusted to pH 5.1 and applied to a concentration column with Soyce 15S (column size l.bhzcm, volume-bml) balanced with a 0.055M sodium acetate solution , pH 5.1 with a speed of ZOOcm / h (Yuml / min).
- the optical density is recorded continuously using a flow monitor UV-I (firm "GE BIOSeps AB"). 20 ml of a 0.055M sodium acetate solution with a pH of 5.1 are passed through the column.
- the entire protein is adsorbed on the carrier and is eluted with a stepwise gradient b 1.05M sodium acetate solution with a pH of 6.6.
- the entire protein peak (6.9 ml) is collected and used for size-separation chromatography. Size separation chromatography was carried out on a column with Sierrdex 75 (2.6x96cm) balanced with a 0.21M solution of ammonium bicarbonate (pH 6.6).
- the column is eluted with 0.2 IM ammonium bicarbonate solution at a rate of 10 cm / h (50 ml / h).
- the optical density is recorded continuously using a flow monitor UV-I (firm "GE BIOSeps AB").
- a protein peak containing biological activity is collected (24 ml) and dried by lyophilization. Characteristic Yield, mg 53.90 mg (1.31% protein)
- Example 3 To 3.9 mg of giurza poison, add 80 ml of a 0.21M sodium acetate solution with a pH of 6.6, the mixture is stirred for 30 minutes at 4 ° C. The dissolved venom is centrifuged at 5000 rpm at 4 ° C for 15 minutes, mixed and used for ion exchange chromatography. The poison solution is applied to a column with Soyce 15S balanced with a 0.21M sodium acetate solution (pH 6.5) (column size 5x3 cm, volume 60 ml). A 1.5 L of a 0.21M sodium acetate solution with a pH of 6.6 is passed through the column. The rate of application and elution ZOsm / hour (Yuml / min).
- the optical density is recorded continuously using a flow monitor UV-I (firm "GE BIOSeps AB").
- the main part of proteins (over 85%) under these conditions is not adsorbed on the cation exchanger, and the PSF, which has an isoelectric point higher than 9.2, binds to Soyce 15S and is eluted with a stepwise gradient of the ionic strength O.
- the protein peak containing the PSF activity is collected (86 ml), diluted 4 times with distilled water, adjusted to pH 5.0 and applied to a concentrating column with Soyce 15S (column size l.bhzcm, volume-bml), balanced with a 0.045M sodium acetate solution , pH 5.2 with a speed of ZOOcm / h (Yuml / min).
- the optical density is recorded continuously using a flow monitor UV-I (firm "GE BIOSeps AB"). Pass through the column 20 ml of 0.045M sodium acetic acid solution with pH 5.2.
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Neurosurgery (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Neurology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Description
Название изобретения:
Способ выделения фактора роста нервной ткани из яда V.Lеbеtiпа Ыппаеиs I Меthоd fоr рrоduсtiоп оf пеrvе grоwth fасtоr frоm vепоm V.Lеbеtiпа Ыппаеиs
МПК: А 61 К 35/588
Область техники к которой относится изобретения
Изобретение относится к промышленности биоактивных веществ и может быть использовано в биотехнологических производствах, медицине и фармацевтической промышленности, а именно к производству лекарственных и диагностических препаратов из яда змей.
Уровень техники
Фактор роста нервной ткани (ФРНТ) усиливает рост и дифференцировку симпатических и эмриональных нервных клеток.
Однако, получение ФРНТ из тканей животных очень трудоемко и не обеспечивает чистоту продукта, так как источники препарата представляет собой многокомпонентную смесь различных белковых и небелковых компонентов, разделение которых является сложной задачей. Наиболее эффективным источником ФРНТ являются змеиные яды, которые содержат только белковые компоненты и имеют стабильный состав. Состав яда различных змеи варьируют, это связано с видовой специфичностью ядов, а также с местом обитания и условиям существования. В связи с этим получение ФРНТ методами, разработанными на ядах оних змей, не пригодно при работе с ядами других.
Известены некоторые способы получения активных ферментов из яда змеи.
Например из яда змеи Тriтеrеsиrиs окiпаvепsis путем фракционирования растворенного буфером яда на Сефадексе G-IOO, хроматографии на СМ-Тоуореаrl 650M в два этапа и заключительной очистки на Mono Q геле. (Nоsе S., Shimоhigаshi Y. еt аl. Рurifiсаtiоп апd сhаrасtеrizаtiоп оf а соаgulапt епzуmе, оkiпахоbiп II, frоm Тriтеrеsиrиs оkiпаvепsis (Нiтеhаbи sпаке) vепоm whiсh rеlеаsеs fibriпорерtidеs А апd В., Тохiсоп., -1994. -V.32, -P.1509-1520); из сырого яда змей рода Аgkistrоdоп sахаtilis, в котором сырый яд, растворенный в буфере, подвергается поэтапному фракцированию на Q-сефарозе,
Сефадексе G-75 и Mono Q геле (Коh.Y., Chung K., Кim.D. Вiосhеmiсаl сhаrасtеrizаtiоп оf а thrоmbiп-likе епzуmе апd а fibriпоlуtiс serine protease frоm sпаkе (Аgкistrоdоп sахаtillis) vепоm., Тохiсоп. -2001. -V.39, N4. -P.555-560); из яда Аgкistrоdоп асиtиs, в котором, растворенный в буфере яд подвергают хроматографии на DЕАЕ-Сефарозе, Сефакриле S-200 и СМ-Сефарозе (Нuапg Q., Teng M., Niu L.Рurifiсаtiоп апd сhаrасtеrizаtiоп оf twо fibriпоgеп-сlоttiпg епzуmеs from fϊvе-расе sпаkе {Аgкistrоdоп асиtиs) vепоm., Тохiсоп. -1999. -V.37, N7. -P.999-1013); из яда Аgкistrоdоп асиtиs, в котором, растворенный в буфере яд подвергают разделению анионообменнике DEAE Сефадексе A-50, затем дважды хроматографируют на Сефадексе G-200 (Quуапg С, Hong J. еt аl. Рurifiсаtiоп апd рrореrtiеs оf thе trоmbiп-likе рriпсiрlе оf Аgкistrоdоп асиtиs vепоm апd its соmраritiоп with bоviпе thrоmbiп., ТhiOmb.Diаth.hаеmоrrth -1971. -V.26 -P.224-234); из сырого яда змей рода Аgкistrоdоп асиtиs, в котором растворенный в буфере (рН 7.2), яд подвергают последовательной хроматографии на Сефадексе G-75, анионообменнике DЕАЕ-Сефадексе A-50 с градиентомд хлорида натрия 0.01-0.6M, сорбенте Гепарин-Сефарозе CL-6B (градиент хлорида натрия NaCl 0.1-0.3; 0.5M) и в отдельном случае дополнительно на Сефадексе G- 100. (Коmоri Y., Nikаi Т.еt аl. А соmраrаtivе studу оf сlоttiпg fасtоrs frоm thе vепоm оf Аgкistrоdоп асиtиs соllесtеd iп сhiпа апd Таiwап., Соmр.Вiосhеm.Рhуsiоl. -1987. -V.88B, N2. -P643-649); из сырого яда змей Воthrорs аtrох, заключающийся в выделении тромбиноподобной фракции, способной вызывать коагуляцию фибриногена. (Ноllеmап W.H., Wеiss L.J., thе thrоmbiп-likе епzуmе frоm Воthrорs аtrох аmiпоbепzаmidiпе-substitutеd аgаrоsе. J Вiоl.Сhеm. 1976, Маг. -25. -251(6). -P.1663-1669); кроме того известен способ, храктеризующий тем, что растворенный в буферном растворе яд подвергают поэтапной хроматографии на Сефадексе G- 100, на катионообменнике СМ-Тоуореаrl 650M с линейным градиентом концентрации хлорида натрия и полным объёмом градиента, обеспечивающими наиболее полное выявление и раздельное элюирование тромбиноподобных ферментов, затем проводят раздельную рехроматографию этих ферментов, задавая линейные градиенты концентрации хлорида натрия из условий элюирования соответствующего тромбоподобного фермента на предыдущем этапе при одновременном увеличении полных объемов этих градиентов до уровня, обеспечивающего дополнительное разделение соседных тромбиноподобных ферментов и получают целевой продукт в гомогенном состоянии после раздельной
очистки тромбиноподобных ферментов на сорбенте ABA-TSK. (RU 2271219 Cl (2004123274/15, 28.07.2004) 10.03.2006 Бюл.7., Способ получения тромбиноподобных ферментов из яда змеи).
Известны способы выделения ФРНТ из тканей животных, например, слюнной железы или плаценты (Апgеlеtti R.H., Вrаdshаw R.А. Nеrvе grоwth fасtоr fiгаm mоusе submахillаrу glапd: аmiпоасid sеquепсе.-Рrос.Nаtl.Асаd.Sсi., U.S., 1971, 68, 2417-2420).
Наиболее близким к изобретению по технической сущности является "Способ выделения фактора роста нервной ткани из змеиного яда" (RU 1055732, Бюл. No 43, 1980). Этот способ предусматривает растворение яда гюрзы {Viреrа Lеbеtiпа) в буферном растворе уксуснокислого аммония (рН 6.4-6.6) с последующим центрифугированием, разделяющуюу по размерам хроматографию полученной надосадочной жидкости на Sерhаdех G- 100 в присутствии того же буферного раствора и ионообменную хроматографию на колонке с карбоксиметилцеллюлозой KM-52 с использованием линейного градиента с повышающейся ионнной силой 0.95-1.05M уксуснокислого аммония рН 6.4-6.6, сбор фракции, содержащих биологическую активность фактора роста нервной ткани и лиофильную сушку. Получает препарат ФРНТ с биологической активности 5x10"8 г/мл и выходом 1.5% по белку.
Однако, использование разделяющей по размерам хроматографии на первом этапе хроматографической очистки и применеие таких носителей как сверхтонкий Sерhаdех G- 100 и карбоксиметилцеллюлоза KM-52 при значительных затратах времени и реактивов, применение линейного градиента с повышающейся ионной силой, требующего дополнительного оборудования, делает процесс выделения относительно дорогим, а производство низко рентабельным.
Сущность изобретения В основу изобретения поставлена задача разработать способ выделения фактора роста нервной ткани из яда V.Lеbеtiпа Liппаеиs, позволяющий путём проведения ионообменной хроматографии в 2 стадии перед разделяющей по размерам хроматографией свойствами и физико-химической стабилностью, повысить рентабельность производственного процесса, сократить время выделения ФРНТ и повысить его чистоту. Поставленная задача решается в способе выделения фактора роста нервной ткани из яда з
V.Lеbеtiпа Liппаеиs, включающем растворение яда в буферном растворе с последующим центрифугированием; разделяющую по размерам хроматографию; ионообменную хроматографию; сбор фракции, содержащих биологическую активность ФРНТ; и лиофильную сушку, в котором, согласно изобретению, ионнообменную хроматографию проводят перед разделяющей по размерам хроматографией и осуществляют ее в две стдии на колонке с ностителем Sоurсе 15S, используя на первой стадии в качестве буферного раствора 0.19-0.2 IM раствор уксуснокислого натрия с рН 6.4-6.6, и указанный раствор с концентрацией 0.31-O.ЗЗM, в качестве элюента, полученный элюат разбавляют в 4-5 раз дистилированной водой и повторно хроматографируют на колонке с тем же носителем, но в 10 раз меньшей по объему, используя в качестве буферного раствора 0.045-0.055M раствор уксуснокислого натрия с рН 5.0-5.2, а качестве элюента тот же раствор с концентрацией 0.95-1.05M и рН 6.4-6.6; после чего проводят разделяющую по размерам хроматографию полученного элюата на Sиреrdех 75 с 0.19-0.2 IM раствором бикарбоната аммония при рН 6.4-6.6. Осуществление изобретения
Поставленная задача решается предлагаемым способом, когда параметры процесса выделения фактора роста нервной ткани находятся в переделах, указанных в формуле изобретения. При изменении параметров в сторону увеличения или уменьшения характеристики получаемого препарата ухудшаются. Предлагаемый способ имеет следующие преимущества перед прототипом.
1. Проведение ионнообменной хроматографии в 2 стадии перед разделяющей по размерам хроматографией на колонке с ноститеем Sоurсе 15S позволяет максимально очистить и сконцентрировать ФРНТ в минимальном объеме, что предлагает использование на стадии разделяющей по размерам хроматографией колонки с Sиреrdех 75 меньшего размера, увеличение скорости элюции и, как следствие, сокращает время производственного цикла с 5-6 суток в прототипе до 22 часов в предлагаемом способе. Кроме того достигается, как минимум, двукратное сокращение количества исдользуемых буферных растворов.
2. Физико-химическая стабильность носителей типа Sоurсе 15S и Sиреrdех 75 гораздо выше, чем у целлюлозы KM-52 и Sерhаdех G-100, что позволяет проводит большее количество производственных циклов без заметных изменении
характеристик колонки и наряду с сокращением времени выделения и расходных материалов значительно повысить рентабельность проиводства.
3. Способ применения элюента с повышенной ионной силой требует более простого оборудования, по сравнению с использованием линейного градиента с повышающейся ионной силой, что также повышает рентабельность производства.
4. Предлагаемый способ обеспечивает более высокую степень очистки ФРНТ. Изобретение иллюстрируется примерами 1-3 конкретного осуществления. Пример.1
К 4.0мг яда гюрзы добавляют 80мл 0.2M раствора уксуснокислого натрия с рН 6.5, смесь перемешивают 30 минут при 40C. Растворенный яд центрифугируют при 5000oб/мин при 40C в течение 15 минут. Осадок отбрасывают, а к надосадочной жидкости добавляют равный объем раствора 0.2M уксуснокислого натрия с рН 6.5, перемешивают и используют для ионообменной хроматографии. Раствор яда наносят на уравновешенную 0.2M раствором уксуснокислого натрия (рН 6.5) колонку с Sоиrсе 15S (размер колонки 5x3 см, объем 60мл). Через колонку пропускают 1.5л 0.2M раствора уксуснокислого натрия с рН 6.5. Скорость нанесения и элюции ЗОсм/час (Юмл/мин). Оптическую плотность регистрируют непрерывно с помощью проточного монитора UV-I (фирма "GE Biociences AB"). Основная часть белков (свыше 85%) в данных условиях не адсорбируется на катионообменнике, а ФРНТ, имеющий изоэлектрическую точку выше 9.2, связывается с Sоиrсе 15S и его элюируют ступенчатым градиентом ионной силы 0.32M уксуснокислого натрия с рН 6.5. Белковый пик, содержащий активность ФРНТ, собирают (90мл), разбавляют в 5 раз дистилированной водой, доводят рН до значения 5.0 и наносят на концентрирующую колонку с Sоиrсе 15S (размер колонки l.бхЗсм, объем-бмл), уравновешенную 0.05M раствором уксуснокислого натрия, рН 5.0 со скоростью ЗООсм/час (Юмл/мин). Оптическую плотность регистрируют непрерывно с помощью проточного монитора UV-I (фирма "GE Biociences AB"). Через колонку прорпускают 20 мл 0.05M раствора уксуснокислого натрия с рН 5.0. В выбранных условиях весь белок адсорбируется на носителе е его элюируют ступенчатым градиентом 0.95M раствора уксуснокислого натрия с рН 6.5. Весь белковый пик (7.1мл) собирают и используют для разделяющей по размерам хроматографии. Разделяющую по размерам хроматографию проводят на колонке с Sиреrdех 75 (2.6x96cм), уравновешенной 0.2M
раствором бикарбоната аммония (рН 6.5). Колонку элюируют 0.2M раствором бикарбоната аммония со скоростью Юсм/час (50мл/чac). Оптическую плотность регистрируют непрерывно с помощью проточного монитора UV-I (фирма "GE Вiосiепсеs AB"). Белковый пик, содержащий биологическую активность, собирают (26мл) и высушивают лиофилизацией. Характеристика
Выход, мг 53.20 мг (1.33% по белку)
Выход по активности 96.7%
Биологическая активность 4.2x10'8 г/мл Степень очистки, раз 75.2
Пример 2.
К 4.1мг яда гюрзы добавляют 80мл 0.2M раствора уксуснокислого натрия с рН 6.4, смесь перемешивают 30 минут при 40C. Растворенный яд центрифугируют при 5000oб/мин при 40C в течение 15 минут. Осадок отбрасывают, а к надосадочной жидкости добавляют равный объем раствора 0.2M уксуснокислого натрия с рН 6.4, перемешивают и используют для ионообменной хроматографии. Раствор яда наносят на уравновешенную 0.19M раствором уксуснокислого натрия (рН 6.4) колонку с Sоиrсе 15S (размер колонки 5x3 см, объем 60мл). Через колонку пропускают 1.5л 0.2M раствора уксуснокислого натрия с рН 6.4. Скорость нанесения и элюции ЗОсм/час (Юмл/мин). Оптическую плотность регистрируют непрерывно с помощью проточного монитора UV-I (фирма "GE Вiосiепсеs AB"). Основная часть белков (свыше 85%) в данных условиях не адсорбируется на катионообменнике, а ФРНТ, имеющий изоэлектрическую точку выше 9.2, связывается с Sоиrсе 15S и его элюируют ступенчатым градиентом ионной силы 0.3 IM уксуснокислого натрия с рН 6.4. Белковый пик, содержащий активность ФРНТ, собирают (93мл), разбавляют в 4.5 раза дистилированной водой, доводят рН до значения 5.1 и наносят на концентрирующую колонку с Sоиrсе 15S (размер колонки l.бхЗсм, объем-бмл), уравновешенную 0.055M раствором уксуснокислого натрия, рН 5.1 со скоростью ЗООсм/час (Юмл/мин). Оптическую плотность регистрируют непрерывно с помощью проточного монитора UV-I (фирма "GE Вiосiепсеs AB"). Через колонку прорпускают 20 мл 0.055M раствора уксуснокислого натрия с рН 5.1. В выбранных условиях весь белок адсорбируется на носителе е его элюируют ступенчатым градиентом б
1.05M раствора уксуснокислого натрия с рН 6.6. Весь белковый пик (6.9мл) собирают и используют для разделяющей по размерам хроматографии. Разделяющую по размерам хроматографию проводят на колонке с Sиреrdех 75 (2.6x96cм), уравновешенной 0.21M раствором бикарбоната аммония (рН 6.6). Колонку элюируют 0.2 IM раствором бикарбоната аммония со скоростью Юсм/час (50мл/чac). Оптическую плотность регистрируют непрерывно с помощью проточного монитора UV-I (фирма "GE Вiосiепсеs AB"). Белковый пик, содержащий биологическую активность, собирают (24мл) и высушивают лиофилизацией. Характеристика Выход, мг 53.90 мг (1.31% по белку)
Выход по активности 97%
Биологическая активность 4.OxIO"8 г/мл
Степень очистки, раз 76.1
Пример 3. К 3.9мг яда гюрзы добавляют 80мл 0.21M раствора уксуснокислого натрия с рН 6.6, смесь перемешивают 30 минут при 40C. Растворенный яд центрифугируют при 5000oб/мин при 40C в течение 15 минут перемешивают и используют для ионообменной хроматографии. Раствор яда наносят на уравновешенную 0.21M раствором уксуснокислого натрия (рН 6.5) колонку с Sоиrсе 15S (размер колонки 5x3 см, объем 60мл). Через колонку пропускают 1.5л 0.21M раствора уксуснокислого натрия с рН 6.6. Скорость нанесения и элюции ЗОсм/час (Юмл/мин). Оптическую плотность регистрируют непрерывно с помощью проточного монитора UV-I (фирма "GE Вiосiепсеs AB"). Основная часть белков (свыше 85%) в данных условиях не адсорбируется на катионообменнике, а ФРНТ, имеющий изоэлектрическую точку выше 9.2, связывается с Sоиrсе 15S и его элюируют ступенчатым градиентом ионной силы О.ЗЗМ уксуснокислого натрия с рН 6.5. Белковый пик, содержащий активность ФРНТ, собирают (86мл), разбавляют в 4 раза дистилированной водой, доводят рН до значения 5.0 и наносят на концентрирующую колонку с Sоиrсе 15S (размер колонки l.бхЗсм, объем-бмл), уравновешенную 0.045M раствором уксуснокислого натрия, рН 5.2 со скоростью ЗООсм/час (Юмл/мин). Оптическую плотность регистрируют непрерывно с помощью проточного монитора UV-I (фирма "GE Вiосiепсеs AB"). Через колонку прорпускают 20
мл 0.045M раствора уксуснокислого натрия с рН 5.2. В выбранных условиях весь белок адсорбируется на носителе е его элюируют ступенчатым градиентом 1.0M раствора уксуснокислого натрия с рН 6.4. Весь белковый пик (6.8мл) собирают и используют для разделяющей по размерам хроматографии. Разделяющую по размерам хроматографию проводят на колонке с Sиреrdех 75 (2.6x96cм), уравновешенной 0.19M раствором бикарбоната аммония (рН 6.4). Колонку элюируют 0.2M раствором бикарбоната аммония со скоростью Юсм/час (50мл/чac). Оптическую плотность регистрируют непрерывно с помощью проточного монитора UV-I (фирма "GE Biociences AB"). Белковый пик, содержащий биологическую активность, собирают (25мл) и высушивают лиофилизацией. Характеристика
Выход, мг 52.60 мг (1.35% по белку)
Выход по активности 96.5%
Биологическая активность 4.3xlO'8 г/мл
Степень очистки, раз 74.0 Из таблицы следует, что в прототипе производственный цикл рассчитан на 6-дневную рабочую неделю. В предлагаемом способе он составляет менее суток. Это позволяет за равный промежуток времени, используя более простое обрудование, получить больше, чем 4 раза конечного продукта, что значительно повышает рентабельность производства. Кроме того, степень очистки ФРНТ в предлагаемом способе выше, чем в прототипе, при этом выход по активности практически идентичен. Таблица
* - в предлагаемом способе — время, затраченное на две стадии ионообменной хроматографии ** - пересчет на 80% полного объема колонки
Claims
формула изобретения
Способ выделения фактора роста нервной ткани из яда V.LеЪеtiпа Liппаеиs, включающий растворение яда в буферном растворе с последующим центрифугированием, разделяющую по размерам хроматографию, ионнообменную хроматографию, с использовании элюента с повышенной ионной силой, сбор фракций, содержащих биологическую активность фактора роста нервной ткани, лиофилизацию отличающийся тем, что ионообменную хроматографию проводят перед разделяющей по размерам хроматографией и осуществляют ее в две стадии на колонке с носителем Sоиrсе 15S, используя на первой стадии в качестве буферного раствора 0.19-0.21M раствор уксуснокислого натрия с рН 6.5-6.6 и указанный раствор с концентрацией 0.31-O.ЗЗM в качестве элюента, полученный элюат разбавляют в 4-5 раз дистилированной водой и повторно хроматографируют на колонке с тем же носителем, но в 10 раз меньшей по объему, используя в качестве буферного раствора 0.045-0.055M раствор уксуснокислого натрия с рН 5.0-5.2 а в качестве элюента, тот же раствор с концентрацией 0.95-1.05M и рН 6.4-6.6, после чего проводят разделяющую по размерам хроматографию полученного элюата на Sиреrdех 75 с 0.19-0.2 IM раствором бикарбоната аммония при рН 6.4-6.6.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| MN3813 | 2006-08-16 | ||
| MN381306 | 2006-08-16 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| WO2008020744A2 true WO2008020744A2 (fr) | 2008-02-21 |
| WO2008020744A3 WO2008020744A3 (fr) | 2008-07-10 |
Family
ID=39082467
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PCT/MN2006/000006 WO2008020744A2 (fr) | 2006-08-16 | 2006-08-30 | Procédé permettant d'extraire le facteur de croissance du tissu nerveux du venin de v.lebetina linnaeus |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| WO (1) | WO2008020744A2 (ru) |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| SU1055732A1 (ru) * | 1982-03-31 | 1983-11-23 | Институт Химической И Биологической Физики Ан Эсср | Способ выделени фактора роста нервной ткани из змеиного да |
| CN1074448A (zh) * | 1992-09-29 | 1993-07-21 | 中国医科大学 | 从蛇毒中分离纯化神经生长因子的方法 |
| CN1285357A (zh) * | 1999-08-20 | 2001-02-28 | 郝文学 | 蛇毒酶神经生长因子 |
| CN1470528A (zh) * | 2003-06-17 | 2004-01-28 | 郝文学 | 治疗糖尿病合并周围神经病变并发症的蛇毒酶神经生长因子 |
-
2006
- 2006-08-30 WO PCT/MN2006/000006 patent/WO2008020744A2/ru active Application Filing
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| SU1055732A1 (ru) * | 1982-03-31 | 1983-11-23 | Институт Химической И Биологической Физики Ан Эсср | Способ выделени фактора роста нервной ткани из змеиного да |
| CN1074448A (zh) * | 1992-09-29 | 1993-07-21 | 中国医科大学 | 从蛇毒中分离纯化神经生长因子的方法 |
| CN1285357A (zh) * | 1999-08-20 | 2001-02-28 | 郝文学 | 蛇毒酶神经生长因子 |
| CN1470528A (zh) * | 2003-06-17 | 2004-01-28 | 郝文学 | 治疗糖尿病合并周围神经病变并发症的蛇毒酶神经生长因子 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2008020744A3 (fr) | 2008-07-10 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Thompson et al. | Characterization of cyclic nucleotide phosphodiesterases of rat tissues | |
| Seegers et al. | Further studies on the purification of thrombin | |
| Grant et al. | Studies on porcine elastase and proelastase | |
| Ouyang et al. | Purification and properties of the thrombin-like principle of Agkistrodon acutus venom and its comparison with bovine thrombin | |
| EP0257003B1 (en) | An enzyme preparation capable of degrading glycosaminoglycan, and a method for producing said preparation | |
| ESTBORN | Separation of phosphatase isoenzymes by gelfiltration | |
| CN100386433C (zh) | 白眉蛇毒血凝酶及其提取方法与应用 | |
| Chen et al. | Collagenase digestion down-regulates the density of CD27 on lymphocytes | |
| US20210393501A1 (en) | Preparation method and application of recombinant mutant collagenase | |
| US4027012A (en) | Process for the extraction of components having anticoagulant activity "in vivo" from snake venoms and products obtained | |
| CN113789319B (zh) | 从蝇蛆中分离蛆激酶的方法及应用 | |
| WO2008020744A2 (fr) | Procédé permettant d'extraire le facteur de croissance du tissu nerveux du venin de v.lebetina linnaeus | |
| Board et al. | Purification and properties of γ-glutamylcyclotransferase from human erythrocytes | |
| Schnatz et al. | Separation and further characterization of human adipose tissue neutral and alkaline lipolytic activities | |
| JPS61162184A (ja) | 新規な線溶酵素およびその取得法 | |
| Fiddler et al. | Enzyme therapy: Differential in vivo retention of bovine hepatic, renal, and splenic β-glucuronidases and evidence for enzyme stabilization by intermolecular exchange | |
| WO2008020741A2 (fr) | Procédé permettant d'extraire la phospholipase a2 du venin d'agkistrodon blomhoffii ussuriensis | |
| JPS6251589B2 (ru) | ||
| CN103396472A (zh) | 一种具有溶栓活性的全蝎提取物 | |
| CN102242098A (zh) | 一种来源于矛头蝮蛇毒凝血酶原激活物的提取方法 | |
| CN100515432C (zh) | 预防和治疗脓毒症的蛇毒提取物 | |
| KR100261657B1 (ko) | 룸부로키나제의 제조방법 | |
| RU2271219C1 (ru) | Способ получения тромбиноподобных ферментов из яда змеи | |
| WO2008020739A2 (fr) | PROCÉDÉ PERMETTANT D'EXTRAIRE UNE ENZYME DE TYPE THROMBINE α SPÉCIFIQUE DU VENIN D'AGKISTRODON BLOMHOFFII USSURIENSIS | |
| CN102212513A (zh) | 由冬虫夏草菌中分离得到的蛋白水解酶及其纯化方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| 121 | Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application |
Ref document number: 06799436 Country of ref document: EP Kind code of ref document: A2 |
|
| NENP | Non-entry into the national phase in: |
Ref country code: DE |
|
| NENP | Non-entry into the national phase in: |
Ref country code: RU |
|
| 122 | Ep: pct application non-entry in european phase |
Ref document number: 06799436 Country of ref document: EP Kind code of ref document: A2 |