WO2008017586A2 - Spezielle carbonylbisimino-verbindungen zur behandlung von immunerkrankungen - Google Patents

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WO2008017586A2
WO2008017586A2 PCT/EP2007/057592 EP2007057592W WO2008017586A2 WO 2008017586 A2 WO2008017586 A2 WO 2008017586A2 EP 2007057592 W EP2007057592 W EP 2007057592W WO 2008017586 A2 WO2008017586 A2 WO 2008017586A2
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Matthias Kassack
Sabine Meis
Darunee Hongwiset
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Rheinische Friedrich-Wilhelms Universität Bonn
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Definitions

  • the invention relates to the use of specific carbonyl bisimino compounds for the treatment of diseases selected from the group comprising immune diseases, cardiovascular diseases, disorders associated with impaired erythropoiesis and / or for immunization.
  • Immune disorders which represent an undesirable immune reaction or immune response of the organism, are increasingly leading to serious diseases.
  • the frequency of immune reactions to harmless foreign bodies such as pollen, animal hair or food components in the population increases and often leads to sensitization, which can lead to permanent diseases.
  • Other unwanted immune diseases are rejection reactions against organ or tissue transplants, which are recognized as foreign by the body's own immune system and repelled.
  • Other diseases of the immune system are the so-called autoimmune diseases in which the body's own tissue, cells, antigens or proteins are mistakenly regarded as foreign and trigger an immune response.
  • Immunosuppressive agents are commonly used to prevent organ and tissue transplant rejection, such as anti-inflammatory glucocorticoids, non-steroidal anti-inflammatory drugs, immunosuppressive cytokines or cytotoxic agents. Another group of serious illnesses is cardiovascular disease, which remains a serious and common health problem despite multiple therapeutic successes.
  • carbonyl bisimino compounds show further effects, as a result of which they are suitable for therapeutic use as immunosuppressants or adjuvants for immunization for inducing immune tolerance or agents having a positive inotropic action.
  • Z 1 has the following general formula (2):
  • Z 2 has the following general formula (3):
  • R, 1, r R> 2 are each independently selected from the group comprising H, F, Cl, C 1 -C 8 -alkyl, C 1 -C 5 -alkyloxy, CF 3 and / or CN,
  • W 1 has the following general formula (5):
  • W 2 has the following general formula (6):
  • R 3 , R 4 , R 5 , R 6 are each independently selected from the group comprising H, -PO 3 H 2 and / or -CH 2 -PO 3 H 2 , and
  • n, m are each independently of one another O or 1,
  • a great advantage of the compounds which can be used according to the invention is provided by the fact that the compounds which can be used according to the invention preferably have only slight or negligible toxicity.
  • a further advantage of the compounds which can be used according to the invention is that they have good metabolic stability.
  • the compounds which can be used according to the invention can in particular have a structure according to the general formula (7) as indicated below:
  • R 1 , R 2 are each independently selected from the group comprising H, F, Cl, C 1 -C 8 -alkyl, C 1 -C 5 -alkyloxy, CF 3 and / or CN
  • R 3 , R 4 , R 5 , R 6 are each independently selected from the group comprising H, -PO 3 H 2 and / or -CH 2 -PO 3 H 2
  • R 3 , R 4 , R 5 , R 6 are each independently selected from the group comprising H, -PO 3 H 2 and / or -CH 2 -PO 3 H 2 , and
  • n, m are each independently 0 or 1.
  • compounds useful according to have the substituents selected from the group consisting of Z 1, Z 2, QW 1 and / or QW 2 each meta or para position with respect to the nitrogen substituents of the respective benzene ring on.
  • At least one substituent R 3 , R 4 , R 5 or R 6 is a phosphonic acid group selected from the group consisting of -PO 3 H 2 and / or -CH 2 -PO 3 H 2 , preferably at least two substituents selected from the group comprising R 3 , R 4 , R 5 and / or R 6 a phosphonic acid group selected from the group comprising -PO 3 H 2 and / or -CH 2 - PO 3 H 2 .
  • R 3 or R 4 and R 5 or R 6 is a phosphonic acid group selected from the group consisting of -PO 3 H 2 and / or -CH 2 -PO 3 H 2 , wherein in these embodiments R 3 or R 4 and R 5 or R 6 are preferably identical phosphonic acid groups selected from the group consisting of -PO 3 H 2 and / or -CH 2 -PO 3 H 2 .
  • R 3 , R 4 , R 5 and R 6 are each a phosphonic acid group selected from the group consisting of - PO 3 H 2 and / or -CH 2 -PO 3 H 2 , R are 3 , R 4 , R 5 and R 6 are preferably identical phosphonic acid groups.
  • At least two substituents R 3 or R 4 and R 5 or R 6 are a phosphonic acid group selected from the group consisting of -PO 3 H 2 and / or -CH 2 -PO 3 H 2 and have meta- Position with respect to the nitrogen substituent of each Benzene ring on.
  • the substituents R 3 , R 4 , R 5 and R 6 are phosphonic acid groups selected from the group consisting of -PO 3 H 2 and / or -CH 2 -PO 3 H 2 have the substituents R 3 and R 4 and R 5 and R 6 are preferably ortho and para with respect to the nitrogen substituent of the respective benzene ring.
  • the substituents R 3 , R 4 , R 5 and R 6 each have meta position with respect to the nitrogen substituent of the respective benzene ring.
  • R 1 and / or R 2 are C 1 -C 8 -alkyl selected from the group comprising methyl, ethyl, isopropyl and / or tert-butyl, or C 1 -C 8 -alkyloxy selected from the group comprising O-methyl, -O-ethyl, -O-isopropyl and / or -O-tert-butyl.
  • R 1 and / or R 2 are C 1 -C 3 -alkyl, preferably methyl, or C 1 -C 3 -alkyloxy, preferably -O-methyl.
  • R 1 and R 2 are selected from the group consisting of F, Cl, C 1 -C 5 -alkyl, C 1 -C 5 -alkyloxy, CF 3 and / or CN, R 1 is and R 2 are preferably identical substituents.
  • R 1 and R 2 independently of one another have ortho or meta positions relative to the nitrogen substituent of the benzene ring; in particularly preferred embodiments of the compounds which can be used according to the invention, R 1 and R 2 are ortho the nitrogen substituent of the benzene ring.
  • m and n are each equal to 0 or 1.
  • m and n are each equal to 0.
  • the compound according to the general formula (8) is also referred to as 3,3 '- (carbonylbis (imino-4, 1-phenylene) carbonylimino) bis (benzenesphosphonic acid).
  • a particular advantage of the compound according to the invention which can be used according to the general formula (8), whose enantiomers, diastereomers and pharmaceutically acceptable esters or salts thereof, is that the compounds are preferably not overdosettable.
  • Another advantage of the compound according to the general formula (8), whose enantiomers, diastereomers and their pharmaceutically acceptable esters or salts is that these compounds may have a particularly low or negligible toxicity. In particular, these compounds are useful in medicines without serious side effects to be expected.
  • Further particularly preferred embodiments of the compounds which can be used according to the invention have the following general formula (9) and / or their enantiomers, diastereomers and pharmaceutically acceptable esters or salts thereof:
  • Preferred embodiments of the compounds which can be used according to the invention also have the following general formula (10) and / or their enantiomers, diastereomers and pharmaceutically acceptable esters or salts thereof:
  • the compounds can be prepared by customary synthesis methods.
  • a particular advantage of the compounds which can be used according to the invention results from the fact that preferably no side effects occur.
  • side effects have not been observed so far.
  • the compounds useful in this invention to be used prophylactically, for example, after organ transplantation before rejection reactions or as adjuvants for immunization to induce immune tolerance.
  • this allows a safe use, for example, in cardiovascular diseases in conjunction with a treatment with other drugs.
  • an application over a longer period or a continuous application is made possible.
  • prophylactic treatment also means that the compounds which can be used according to the invention can be administered prophylactically before symptoms of a disease occur.
  • the compounds useful in the invention are useful in the form of a pharmaceutically acceptable phosphonate salt.
  • Useful hydrogen phosphonates or phosphonates are preferably selected from the group comprising alkali metal phosphonate salts, alkaline earth metal phosphonate salts, ammonium phosphonate salts, their Monohydrogenphosphonate and / or mixtures thereof.
  • Preferred pharmaceutically acceptable salts of the groups R 3 , R 4 , R 5 and / or R 6 are suitably selected from the group consisting of -PO 3 HNa, -PO 3 Na 2 , -CH 2 -PO 3 HNa and / or -CH 2 -PO 3 Na 2 , more preferably selected from the group comprising -PO 3 Na 2 and / or -CH 2 -PO 3 HNa.
  • the compounds which can be used according to the invention are present in the form of pharmaceutically acceptable salts selected from the group consisting of di-sodium salts and / or tetra-sodium salts.
  • esters of the compounds which can be used according to the invention are selected from the group comprising mono- or bis (alkyl) phosphonic acid esters, in particular mono- or bis (C 1 -C 5 -alkyl) phosphonic acid esters, mono- or bis (acyloxyalkyl) - Phosphonic acid esters, in particular mono- or bis (Ci-C5-acyloxy-Ci-Cs-alkyl) phosphonic acid esters, mono- or bis-Isopropyloxycarbonyloxymethyl esters (disoproxil esters), mono- or bis (thioalkenyl) phosphonic acid esters, especially mono - or bis (Ci-C 5 -thioalkenyl) phosphonic acid ester and / or mono- or bis- Pivaloyloxymethylester.
  • mono- or bis (alkyl) phosphonic acid esters in particular mono- or bis (C 1 -C 5 -alkyl) phosphonic acid esters,
  • pharmaceutically acceptable mono- or bis- (C 1 -C 5 -acyloxy-C 1 -C 6 -alkyl) phosphonic acid esters of the compounds which can be used according to the invention are selected from the group comprising mono- or bis (C 1 -C 5 -acyloxymethyl) -phosphonic acid esters and / or mono- or bis (C 1 -C 5 -acyloxyethyl) phosphonic acid ester, preferably selected from the group comprising bis (pivaloyloxymethyl) phosphonic acid esters and / or bis (pivaloyloxyethyl) phosphonic acid esters.
  • pharmaceutically acceptable mono or bis (Ci-C 5 -alkyl) -phosphon acid esters are selected from the group comprising methyl, ethyl, propyl and / or isopropyl phosphonic.
  • Preferred pharmaceutically acceptable esters of the groups R 3 , R 4 , R 5 and / or R 6 are correspondingly selected from the group comprising -PO (OCHs) 2 and / or -PO (OCH 2 CH 3 ) 2 .
  • esters can provide improved bioavailability.
  • esters of the compounds which can be used according to the invention are orally administrable.
  • Preferably usable solvents are selected from the group comprising dimethyl sulfoxide (DMSO), alcohols, preferably ethanol and / or water, wherein an addition of pharmaceutically usable surfactants may be preferred.
  • DMSO dimethyl sulfoxide
  • alcohols preferably ethanol and / or water
  • the compounds which can be used according to the invention are for the treatment of immune disorders, in particular selected from the group comprising autoimmune diseases, rheumatoid arthritis, multiple sclerosis, diabetes mellitus (Typl), psoriasis, Crohn's disease, ulcerative colitis, allergies, rejection reactions and / or for immunization can lead to an immune tolerance, usable.
  • immune disorders in particular selected from the group comprising autoimmune diseases, rheumatoid arthritis, multiple sclerosis, diabetes mellitus (Typl), psoriasis, Crohn's disease, ulcerative colitis, allergies, rejection reactions and / or for immunization can lead to an immune tolerance, usable.
  • immune disorders refers to diseases which are associated with a disturbed function of the immune system, in particular diseases selected from the group comprising autoimmune diseases, rheumatoid arthritis, multiple sclerosis, diabetes mellitus (Typl), psoriasis, and morbus Crohn's disease, ulcerative colitis, allergies and / or rejection.
  • Autoimmune diseases are preferably selected from the group comprising autoimmune hepatitis, chronic gastritis, Churg-Strauss syndrome, autoimmune thrombocytopenias, glomerulonephritis, Guillain-Barre syndrome, Hashimoto's thyroiditis, lichen sclerosus, lupus erythematosus, in particular systemic or chronic lupus Erythematosus, Graves' Disease, Ankylosing Spondylitis, Myasthenia Gravis, PANDAS (Pediatric Autoimmune Neuropsychiatric Disorders Associated with Streptococcal Infections), Rheumatic fever, Sarcoidosis (Boeck's disease), Sjogren's syndrome, Stiff-Man's syndrome, scleroderma, Wegener's granulomatosis, vitiligo, autoimmune enteropathy , Goodpasture syndrome, dermatomyositis and / or polymyositis.
  • autoimmune diseases are selected from the group comprising autoimmune hepatitis, autoimmune thrombocytopenia, glomerulonephritis, Guillain-Barre syndrome, lichen sclerosus, chronic lupus erythematosus, myasthenia gravis and / or rheumatic fever.
  • treatable organs and / or tissues are, for example, selected from the group comprising pancreas, liver, stomach, vessels, in particular inflammation of the vessels, in particular of the kidneys, lungs and / or the ear, nose and throat, digestive tract especially thin and Large intestine or rectum, kidneys, myelin sheath of the nerves, thyroid, skin, central nervous system, especially myelin sheaths of the central nervous system, joints, thyroid, spine, iris, acetylcholine receptors on the motor end plate, connective tissue, especially connective tissue of the joints and / or connective tissue under the skin, Heart tissue, basal ganglia of the brain, lymph nodes, lungs, salivary glands, lacrimal glands, back muscles, lungs and / or muscles.
  • treatable organs and / or tissues are, for example, selected from the group liver, digestive tract, in particular small and large intestine or rectum, kidneys, myelin sheath of the nerves, skin, central nervous system, in particular myelin sheaths of the central nervous system, joints, acetylcholine receptors on the motor end plate, joints, Connective tissue of the joints Heart tissue and / or basal ganglia of the brain.
  • treatable cells are in particular melanocytes and / or platelets.
  • the compounds which can be used according to the invention are not useful for the treatment of diseases selected from the group comprising rheumatoid arthritis, diabetes mellitus (Typl) and / or psoriasis.
  • the compounds which can be used according to the invention are suitable for immunosuppression, for example in organ transplantation for the prevention of organ or tissue rejection or for immunization. Also, use as adjuvants for immunization to obtain immune tolerance is possible.
  • An advantage of the compounds which can be used according to the invention may be that they may have an immunosuppressive effect.
  • an advantage of the compounds which can be used according to the invention can be that they can inhibit lipopolysaccharide (LPS) -induced release of the proinflammatory and immune-activating interleukin 12 (IL-12).
  • LPS lipopolysaccharide
  • the compounds which can be used according to the invention are preferably usable for the therapeutic and / or prophylactic treatment in ulcerative colitis, Crohn's disease and / or multiple sclerosis.
  • the compounds which can be used according to the invention are particularly preferably suitable for therapeutic and / or prophylactic treatment in allergies, in rejection reactions, as immunosuppressant and / or as adjuvants for immunization. With very particular preference the compounds which can be used according to the invention can be used as immunosuppressants.
  • treatable rejection reactions are excessive transfusion reactions or organ transplantation rejection reactions, for example host-versus-graft-type graft rejection reactions (host-versus-host). Graft versus host type) or graft versus host type (graft versus recipient disease).
  • the compounds which can be used according to the invention are useful for the therapeutic and / or prophylactic treatment of rejection after organ and / or tissue transplantation, for example of the skin, bone marrow or kidney.
  • Cardiovascular diseases are preferably selected from the group comprising peripheral arterial occlusive diseases, coronary heart disease, inflammatory coronary vessels, myocarditis, myocardial infarction, unstable and stable angina pectoris, and / or cardiac insufficiency.
  • the compounds which can be used according to the invention are preferably usable in cardiac insufficiency.
  • Disorders associated with impaired erythropoiesis may be selected, in particular, from the group comprising anemias in tumors, malignant lymphomas, leukemias, renal anemias and / or hemolytic anemias.
  • the compounds useful in the invention are useful for activating erythropoiesis.
  • the compounds which can be used according to the invention can be administered according to conventional methods, for example by oral, dermal or enteral administration or by injection. Preferred is oral administration and / or administration by injection, more preferred is oral administration. In particular, oral administration of the esters of the compounds useful in the invention is preferred.
  • the compounds which can be used according to the invention may have only slight or negligible toxicity during administration. This allows the administration of high doses, for example after organ transplantation or when an immune disease occurs. This also allows, for example, a long-term administration, in particular a daily administration. This also allows prophylactic administration, especially to humans. Administration may be in one or more doses per day.
  • the dosage of the compounds which can be used according to the invention is in the range of> 0.1 mg / day / kg of body weight to ⁇ 1 g / day / kg of body weight, preferably in the range of> 0.2 mg / day / kg of body weight to ⁇ 10 mg / day / kg of body weight, preferably in the range of> 0.5 mg / day / kg of body weight to ⁇ 5 mg / day / kg of body weight
  • the compounds useful in the invention can activate the P2Yn receptor.
  • This receptor belongs to a group of G-protein coupled receptors whose ligand is adenosine triphosphate (ATP).
  • ATP adenosine triphosphate
  • a particular advantage of the compounds which can be used according to the invention can be provided by the fact that the compounds can selectively activate the P2Yn receptor. This is particularly advantageous over nonspecific activators since the compounds which can be used according to the invention can be used to selectively activate the P2Yn receptor without producing side effects by activating further subtypes of the receptor family.
  • the compounds which can be used according to the invention have a half-maximal stimulation or activation concentration (EC 50 ) for the P2Yn receptor, which is lower than that of the natural ligand ATP.
  • EC 50 half-maximal stimulation or activation concentration
  • the compounds which can be used according to the invention have EC 50 values for the activation of the P2Yn receptor in the range of> 1 nM to ⁇ 1000 nM, preferably in the range of> 20 nM to ⁇ 800 nM, more preferably in the range of> 30 nM to ⁇ 350 nM, preferably in the range from> 40 nM to ⁇ 100 nM, particularly preferably in the range from> 50 nM to ⁇ 80 nM.
  • the compounds can lead to an allosteric activation of the P2Yn receptor.
  • the compound according to the general formula (8), 3,3 '- (carbonylbis (imino-4, 1-phenylene) carbonylimino) bis (benzenephosphonic acid) and its sodium salts leads to an allosteric activation of the P2Yn - Lead the receptor.
  • the allosteric activation can provide the particular advantage that the compounds which can be used according to the invention, in particular the compound of the formula (8), 3,3 '- (carbonylbis (imino-4, 1-phenylene) carbonylimino) bis (benzenesulphonic acid ) and their sodium salts, preferably not overdosettable.
  • a further advantage of the compounds which can be used according to the invention is that the compounds have good metabolic stability.
  • the compounds which can be used according to the invention have a higher metabolic stability than the natural ligand ATP.
  • the compounds which can be used according to the invention have higher hydrolytic stability than ATP.
  • the compounds useful in the invention are capable of effecting immunosuppression, effecting a positive inotropic effect, and / or stimulating erythropoiesis.
  • a further subject matter relates to the use of the compounds according to the invention for the preparation of an immunosuppressant and / or adjuvant for immunization, a cardiac and / or erythropoietic suitable for the therapeutic and / or prophylactic treatment of by selective P2Y ⁇ receptor activation, preferably by selective allosteric P2Y ⁇ receptor - Activation of treatable disease states.
  • the compound according to the invention which can be used according to the formula (8) 3,3 '- (carbonylbis (imino-4, 1-phenylene) carbonylimino) bis (benzenesphosphonic acid) is a new allosteric Uses the binding site of the P2Yn receptor.
  • a further subject relates to the use of compounds which can be used according to the invention for the preparation of a P2Yn receptor-selective, preferably allosteric, agonist.
  • Yet another object relates to a P2Yn receptor selective, preferably allosteric, agonist based on a compound of the invention suitable for therapeutic and / or prophylactic treatment of by selective, preferably allosteric P2Yn receptor activation of treatable disease states, preferably of at least one disease selected from the group consisting of immune disorders, cardiovascular diseases, diseases associated with impaired erythropoiesis, and / or for immunization.
  • Fig. 1 shows a concentration-effect curve of ATP ⁇ S and the compound according to the formula
  • Figure 2 A concentration-effect curve of the compound of formula (12) as an agonist at the P2Yn receptor recombinantly expressed in 132 INI cells as determined in the cAMP luciferase reporter gene assay.
  • Fig. 5 Effect of the compounds according to formulas (12), (13) and (14) on the release of thrombospondin-1 (TSP-I) from monocyte-derived dendritic Cells. Data are reported as the mean ⁇ standard deviation of three independent experiments.
  • the cell line 1321N1-P2Yn used in the experiments was prepared by stably transfecting the 132-INI cell line, an astrocytoma cell line (ECACC No. 86030402, Salisbury, UK) from the human brain, with a plasmid containing the sequence of the human P2Y n receptor (GenBank ACC # AY449733).
  • DMEM Dulbecco's Modified Eagle Medium
  • glucose 4500 mg / l
  • sodium pyruvate and pyridoxine supplemented with 10% fetal bovine serum, 5 mM L-glutamine and 100 U / ml penicillin G, 100 ⁇ g / ml streptomycin (all Sigma-Aldrich, Taufkirchen) and 400 ⁇ g / ml G418 (Carl Roth, Düsseldorf).
  • This fluorescence-based assay was performed using a fluorescence microplate reader with pipettor system; performed (NovoStar ® BMG LabTech, Offenburg), as in Kassack et al, "functional screening of G protein-coupled receptors by measuring intracellular calcium with a. fluorescence microplate reader ", J.Biomol.Screen. 7: 233-246, 2002, unless otherwise described below.
  • 1321Nl-P2Yn cells were detached from the culture flask with the aid of trypsin / EDTA (0.05% trypsin / 0.02% EDTA, Sigma-Aldrich, Taufkirchen) and transferred into a centrifuge tube using the nutrient medium described above. After centrifugation The cells were taken up in fresh medium and incubated for 20 min at 37 ° C, 5% CO 2 and 96% humidity.
  • the cells were then washed twice with Krebs-HEPES buffer (118 mM NaCl, 4.7 mM KCl, 1.2 mM MgSO 4 , 1.2 mM KH 2 PO 4 , 4.2 mM NaHCO 3 , 11.7 mM D Glucose, 1.3 mM CaCl 2 (all from Merck, Darmstadt), 10 mM HEPES (Sigma-Aldrich, Taufkirchen), pH 7.4).
  • Krebs-HEPES buffer 118 mM NaCl, 4.7 mM KCl, 1.2 mM MgSO 4 , 1.2 mM KH 2 PO 4 , 4.2 mM NaHCO 3 , 11.7 mM D Glucose, 1.3 mM CaCl 2 (all from Merck, Darmstadt), 10 mM HEPES (Sigma-Aldrich, Taufkirchen), pH 7.4).
  • the cells were loaded with the fluorescent dye Oregon-Green 488 BAPTA-1 / AM (3 ⁇ M, Molecular Probes / Invitrogen, Eugene, Oregon, USA) supplemented with 1% Pluronic F-127 (Sigma-Aldrich, Taufkirchen) were incubated for 45 min at room temperature and with constant shaking with the dye. After this incubation, cells were washed twice with Krebs-HEPES buffer. The cell suspension was diluted to a cell count of 50,000-100,000 cells / well and seeded in a 96 well microtiter plate (Greiner bio-one, Frickenhausen).
  • Concentration-effect curves were recorded by comparing the solutions of different concentration of the agonist according to the formula (12) tetrasodium 3,3 '- (carbonylbis (imino-4, 1-phenylene) carbonylimino) bis (benzene-phosphonic acid) and of ATP ⁇ S were injected to the cells and the fluorescence of the cells was measured.
  • the excitation wavelength was 485 nm ( ⁇ 12 nm) and the fluorescence intensity was determined at 520 nm ( ⁇ 35 nm) for 30 s with an interval of 0.4 s.
  • the measurements were recorded in 6 independent experiments with triplicate determinations. Non-stimulated cells injected with NaCl solution were used as controls.
  • tetrasodium 3,3 '- (carbonylbis (imino-4, l-phenylene) carbonylimino) bis (benzene-phosphonic acid) acts as an agonist of the P2Y ⁇ receptor, as can be seen from FIG. Furthermore, it was found that tetrasodium 3,3'- (carbonylbis (imino-4, 1-phenylene) carbonylimino) bis (benzene-phosphonic acid) had an ECso value of 65 nM, whereas ATP ⁇ S had an ECso value of 55 nM had, as also shown in FIG. 1 can be seen. Meanwhile, the physiological agonist ATP had an ECso value of 160 nM.
  • 1321Nl-P2Yn cells were transiently transfected with the pCRE-luc plasmid, a cAMP-inducible luciferase-expressing plasmid. To this end, 2.5 million cells were grown overnight in a 10 cm cell culture vessel. The following day, the cells were transfected according to the manufacturer's protocol with 30 ug of plasmid DNA (Polyfect, Fa. Qiagen, Hilden).
  • the cells were harvested and placed in two white 96-well microtiter plates (Greiner bio-one, Frickenhausen) in DMEM with glucose (4500 mg / l), sodium pyruvate and pyridoxine with the addition of 10% fetal bovine serum, 5 mM L-glutamine and 100 U / ml penicillin G, 100 ⁇ g / ml streptomycin (all from Sigma-Aldrich, Taufkirchen) and 400 ⁇ g / ml G418 (Carl Roth, Düsseldorf) seeded.
  • the cells were freed from the medium and dissolved in phenol red-free Dulbecco's modified Eagle Medium Nutrient Mixture F-12 urine (DMEM / F-12 1: 1 mixture) without the addition of fetal bovine serum, with 5 mM L-glutamine. 100 U / ml penicillin G, 100 ⁇ g / ml streptomycin (all from Sigma-Aldrich) incubated.
  • adenosine 5'-O- (3-thiotriphosphate) (ATP ⁇ S, Sigma-Aldrich), an ATP-analogous compound less readily hydrolysable as ATP, and the compound of formula (12), tetrasodium 3,3 '- (Carbonylbis (imino-4,1-phenylene) carbonylimino) bis (benzene-phosphonic acid) were dissolved in phenol red-free Dulbecco's modified Eagle Medium Nutrient Mixture F-12 urine (DMEM / F-12 1: 1 Mixture ) without addition of fetal bovine serum, diluted with 5 mM L-glutamine, 100 U / ml penicillin G, 100 ⁇ g / ml streptomycin (all from Sigma-Aldrich, Taufkirchen) in concentrations of 10 nM to 1 mM (10 ⁇ stock solutions) ,
  • the cells were then incubated for 3 h at 37 ° C, 5% CO 2 and 96% humidity. After stimulation, the supernatant medium was removed and the cells were washed with the aid of a lysis buffer (8 mM Tricin (Merck, Darmstadt), 2 mM EDTA (Sigma-Aldrich, Taufkirchen), 1 mM DTT (dithiothreitol, Fa AppliChem, Darmstadt), 5% Triton-X (Sigma-Aldrich, Tauf Wegn), pH 7.8) (100 ⁇ l / well).
  • a lysis buffer 8 mM Tricin (Merck, Darmstadt), 2 mM EDTA (Sigma-Aldrich, Taufmaschinen), 1 mM DTT (dithiothreitol, Fa AppliChem, Darmstadt), 5% Triton-X (Sigma-Aldrich, Taufmaschinen), pH 7.8) (100 ⁇ l / well).
  • luciferase activity was monitored by addition of 100 ⁇ l of a luciferase assay reagent (30 mM tricine, 10 mM MgSO 4 (both from Merck, Darmstadt), 10 mM DTT (AppliChem, Darmstadt), 0.5 mM EDTA , 0.5 mM ATP, 0.5 mM Coenzyme A (Sigma-Aldrich, Taufkirchen), 0.5 mM D-luciferin (Molecular Probes / Invitrogen, Eugene, Oregon, USA or Fa. Synchem, Felsberg / Altenburg), pH 7.8) to each well by measuring the luminescence in a luminescence microplate reader (LUMIstar®, BMG LabTech, Offenburg).
  • a luciferase assay reagent 30 mM tricine, 10 mM MgSO 4 (both from Merck, Darmstadt), 10 mM DTT (AppliChem, Darmstadt), 0.5 m
  • Concentration-effect curves of the agonist tetrasodium 3,3 '- (carbonylbis (imino-4, 1-phenylene) carbonylimino) bis (benzene-phosphonic acid) were recorded in the absence or in the presence of increasing concentrations of 10 nM, 31.6 nM and 100 nM of the P2Y ⁇ antagonist according to formula (14) below:
  • the fluorescence based assay was performed as described under "Example 1". It was found that the compound according to the formula (13) acts as an orthosteric agonist of the P2Yn receptor, as shown in FIG. 4. Furthermore, it was found that the compound according to the formula (13) had an ECso value of 542 nM, while ATP ⁇ S had an ECso value of 55 nM, as also shown in FIG.
  • Immature dendritic cells were generated from adherent peripheral blood monocytes.
  • monocytes were isolated from leukocyte films of healthy volunteers as described in Romani et al., J Exp Med 180: pp 83-93 (1994), unless otherwise stated below.
  • the cells were incubated for five days in the presence of 800 U / ml granulocyte macrophage colony stimulating factor (GM-CSF, Invitrogen) and 500 U / ml IL-4 (Invitrogen) at 37 ° C, under 5% CO 2 atmosphere and cultivated at a humidity of 96%.
  • GM-CSF granulocyte macrophage colony stimulating factor
  • Invitrogen 500 U / ml IL-4
  • the cells were incubated at 10 6 cells / ml, 1 ml / well, in 24 well plates in RPMI-1640 supplemented with 10% fetal bovine serum, 5 mM L-glutamine and 100 U / ml penicillin G, 100 ⁇ g / ml streptomycin (all from Sigma-Aldrich, Taufkirchen) with 800 U / ml GM-CSF and 500 U / ml IL-4 for 5 days.
  • RPMI-1640 supplemented with 10% fetal bovine serum, 5 mM L-glutamine and 100 U / ml penicillin G, 100 ⁇ g / ml streptomycin (all from Sigma-Aldrich, Taufkirchen) with 800 U / ml GM-CSF and 500 U / ml IL-4 for 5 days.
  • the obtained dendritic cells were incubated for 24 hours with 100 ⁇ M of the compound of the formula (13), 10 ⁇ M of the compound of the formula (12) Tetrasodium 3,3 '- (carbonylbis (imino-4,1-phenylene) carbonylimino) bis (benzenesulphonic acid), 100 ⁇ M ATP ⁇ S or 100 ⁇ M ATP ⁇ S and 100 ⁇ M of the compound of formula (14).
  • thrombospondin human thrombospondin
  • ELISA enzyme-linked immunosorbent assay
  • Thrombospondin is an immunomodulator and can cause cell migration, cell adhesion and activation of T cells.
  • Non-stimulated cells which were incubated with nutrient medium instead of ATP ⁇ S or a compound of the formulas (12), (13) or (14) served as control. Measurements were taken in three independent experiments.
  • thrombospondin-1 release was caused by an activation of the P2Yn receptor, since the signal of ATP ⁇ S could be inhibited by the P2Yn-selective antagonist of the compound according to the formula (14) at the control level.

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Abstract

Die Erfindung betrifft die Verwendung von speziellen Carbonylbisimino-Verbindungen und/oder deren Enantiomere, Diastereomere sowie deren pharmazeutisch verträgliche Ester und/oder Salze zur Herstellung eines Arzneimittels zur therapeutischen und/oder prophylaktischen Behandlung von Erkrankungen ausgewählt aus der Gruppe umfassend Immunerkrankungen, kardiovaskuläre Erkrankungen, Erkrankungen, die mit einer gestörten Erythropoese in Zusammenhang stehen und/oder zur Immunisierung.

Description

Spezielle Carbonylbisimino-Verbindungen zur Behandlung von Immunerkrankungen
Die Erfindung betrifft die Verwendung von speziellen Carbonylbisimino-Verbindungen zur Behandlung von Erkrankungen ausgewählt aus der Gruppe umfassend Immunerkrankungen, kardiovaskuläre Erkrankungen, Erkrankungen, die mit einer gestörten Erythropoese in Zusammenhang stehen und/oder zur Immunisierung.
Immunerkrankungen, die eine unerwünschte Immunreaktion bzw. Immunantwort des Organismus darstellen, führen immer häufiger zu ernsthaften Erkrankungen. So ist es bekannt, dass die Häufigkeit von Immunreaktionen gegenüber harmlosen Fremdkörpern wie Pollen, Tierhaaren oder Nahrungsbestandteilen in der Bevölkerung zunimmt und vielfach zu einer Sensibilisierung führt, die zu dauerhaften Erkrankungen führen können. Weitere unerwünschte Immunerkrankungen sind Abstoßungsreaktionen gegen Organ- oder Gewebetransplantate, die vom körpereigenen Immunsystem als fremd erkannt und abgestoßen werden. Weitere Erkrankungen des Immunsystems stellen die sogenannten Autoimmunerkrankungen dar, wobei körpereigenes Gewebe, Zellen, Antigene oder Proteine fälschlicherweise als fremd angesehen werden und eine Immunantwort auslösen.
Zur Verhinderung der Abstoßungsreaktionen von Organ- und Gewebetransplantaten werden üblicherweise immunsuppressive Substanzen verwendet, beispielsweise entzündungshemmende Glukokortikoide, nichtsteroidale Antirheumatika, immunsuppressive Zytokine oder Zytostatika. Eine weitere Gruppe schwerwiegender Erkrankungen stellen kardiovaskuläre Erkrankungen dar, die trotz vielfacher Therapieerfolge ein ernstes und häufiges Gesundheitsproblem bleiben.
In der US 6096730 werden Carbonylbisimino-Phosphonsäureverbindungen offenbart, die als Inhibitoren der Angiogenese und zur Behandlung von Tumoren geeignet sind.
Überraschenderweise wurde nun gefunden, dass Carbonylbisimino-Verbindungen weitere Effekte zeigen, aufgrund dessen sie für eine therapeutische Anwendung als Immunsuppressiva oder Adjuvanzien zur Immunisierung zur Induktion von Immuntoleranz oder Mittel mit positiv inotroper Wirkung geeignet sind.
Es bestand daher die Aufgabe, neue Indikationen für die Verwendung von Carbonylbisimino- Verbindungen, insbesondere Carbonylbisimino-Phosphonsäure -Verbindungen, zur Verfügung zu stellen.
Diese Aufgabe wird gelöst durch die Verwendung von Verbindungen gemäß der allgemeinen Formel (1) wie nachstehend angegeben:
Figure imgf000004_0001
worin:
Z1 weist die nachstehende allgemeine Formel (2) auf:
Figure imgf000005_0001
Z ?2 weist die nachstehende allgemeine Formel (3) auf:
Figure imgf000005_0002
worin:
R , 1 , r R> 2 sind jeweils unabhängig voneinander ausgewählt aus der Gruppe umfassend H, F, Cl, Ci-Cs-Alkyl, Ci-C5-Alkyloxy, CF3 und/oder CN,
Q weist die nachstehende allgemeine Formel (4) auf:
Figure imgf000005_0003
(4) - A -
W1 weist die nachstehende allgemeine Formel (5) auf:
Figure imgf000006_0001
W2 weist die nachstehende allgemeine Formel (6) auf:
Figure imgf000006_0002
worin:
R3, R4, R5, R6 sind jeweils unabhängig voneinander ausgewählt aus der Gruppe umfassend H, -PO3H2 und/oder -CH2-PO3H2, und
n, m sind jeweils unabhängig voneinander O oder 1,
und/oder deren Enantiomere, Diastereomere sowie deren pharmazeutisch verträgliche Ester und/oder Salze zur Herstellung eines Arzneimittels zur therapeutischen und/oder prophylaktischen Behandlung von Erkrankungen ausgewählt aus der Gruppe umfassend Immunerkrankungen, kardiovaskuläre Erkrankungen, Erkrankungen, die mit einer gestörten Erythropoese in Zusammenhang stehen und/oder zur Immunisierung. Vorteilhafte Ausgestaltungen der erfϊndungsgemäß verwendbaren Verbindungen sind in den Unteransprüchen angegeben.
Es wurde überraschend gefunden, dass die erfindungsgemäß verwendbaren Verbindungen die überraschende Eigenschaft besitzen, nur geringe oder vernachlässigbare Nebenwirkungen zu bewirken.
Ein großer Vorteil der erfϊndungsgemäß verwendbaren Verbindungen wird dadurch zur Verfügung gestellt, dass die erfϊndungsgemäß verwendbaren Verbindungen vorzugsweise eine nur geringe oder vernachlässigbare Toxizität aufweisen. Ein weiterer Vorteil der erfϊndungsgemäß verwendbaren Verbindungen liegt darin, dass diese eine gute metabolische Stabilität aufweisen.
Die erfϊndungsgemäß verwendbaren Verbindungen können insbesondere eine Struktur gemäß der allgemeinen Formel (7) wie nachstehend angegeben aufweisen:
Figure imgf000007_0001
worin:
R1, R2 sind jeweils unabhängig voneinander ausgewählt aus der Gruppe umfassend H, F, Cl, Ci-Cs-Alkyl, Ci-C5-Alkyloxy, CF3 und/oder CN, R3, R4, R5, R6 sind jeweils unabhängig voneinander ausgewählt aus der Gruppe umfassend H, -PO3H2 und/oder -CH2-PO3H2, und
n, m sind jeweils unabhängig voneinander 0 oder 1.
In bevorzugten Ausführungsformen der erfindungsgemäß verwendbaren Verbindungen weisen die Substituenten ausgewählt aus der Gruppe umfassend Z1, Z2, Q-W1 und/oder Q-W2 jeweils meta- oder para-Stellung in Bezug auf den Stickstoffsubstituenten des jeweiligen Benzolrings auf.
In besonders bevorzugten Ausführungsformen der erfindungsgemäß verwendbaren Verbindungen ist wenigstens ein Substituent R3, R4, R5 oder R6 eine Phosphonsäuregruppe ausgewählt aus der Gruppe umfassend -PO3H2 und/oder -CH2-PO3H2, vorzugsweise sind wenigstens zwei Substituenten ausgewählt aus der Gruppe umfassend R3, R4, R5 und/oder R6 eine Phosphonsäuregruppe ausgewählt aus der Gruppe umfassend -PO3H2 und/oder -CH2- PO3H2. Vorzugsweise ist wenigstens R3 oder R4 und R5 oder R6 eine Phosphonsäuregruppe ausgewählt aus der Gruppe umfassend -PO3H2 und/oder -CH2-PO3H2, wobei in diesen Ausführungsformen R3 oder R4 und R5 oder R6 vorzugsweise gleiche Phosphonsäuregruppen ausgewählt aus der Gruppe umfassend -PO3H2 und/oder -CH2-PO3H2 sind. Wenn in Ausführungsformen der erfindungsgemäß verwendbaren Verbindungen vorgesehen ist, dass R3, R4, R5 und R6 jeweils eine Phosphonsäuregruppe ausgewählt aus der Gruppe umfassend - PO3H2 und/oder -CH2-PO3H2 sind, sind R3, R4, R5 und R6 bevorzugt gleiche Phosphonsäuregruppen.
In besonders bevorzugten Ausführungsformen der erfindungsgemäß verwendbaren Verbindungen sind wenigstens zwei Substituenten R3 oder R4 und R5 oder R6 eine Phosphonsäuregruppe ausgewählt aus der Gruppe umfassend -PO3H2 und/oder -CH2-PO3H2 und weisen meta-Stellung in Bezug auf den Stickstoffsubstituenten des jeweiligen Benzolrings auf. Sind in Ausführungsformen der erfmdungsgemäß verwendbaren Verbindungen die Substituenten R3, R4, R5 und R6 Phosphonsäuregruppen ausgewählt aus der Gruppe umfassend -PO3H2 und/oder -CH2-PO3H2 weisen die Substituenten R3 und R4 sowie R5 und R6 vorzugsweise ortho- und para-Stellung in Bezug auf den Stickstoffsubstituenten des jeweiligen Benzolrings auf. In anderen Ausführungsformen der erfindungsgemäß verwendbaren Verbindungen kann vorgesehen sein, dass die Substituenten R3, R4, R5 und R6 jeweils meta-Stellung in Bezug auf den Stickstoffsubstituenten des jeweiligen Benzolrings aufweisen.
In weiterhin bevorzugten Ausführungsformen der erfindungsgemäß verwendbaren Verbindungen sind R1 und/oder R2 Ci-Cs-Alkyl ausgewählt aus der Gruppe umfassend Methyl, Ethyl, Isopropyl und/oder tert-Butyl, oder Ci-Cs-Alkyloxy ausgewählt aus der Gruppe umfassend -O-Methyl, -O-Ethyl, -O-Isopropyl und/oder -O-tert-Butyl. In weiterhin besonders bevorzugten Ausführungsformen der erfindungsgemäß verwendbaren Verbindungen sind R1 und/oder R2 Ci-C3-Alkyl, vorzugsweise Methyl, oder Ci-C3-Alkyloxy vorzugsweise -O-Methyl. Wenn in Ausführungsformen der erfindungsgemäß verwendbaren Verbindungen vorgesehen ist, dass R1 und R2 ausgewählt sind aus der Gruppe umfassend F, Cl, C1-C5-AIlCyI, Ci-Cs-Alkyloxy, CF3 und/oder CN, sind R1 und R2 vorzugsweise gleiche Substituenten.
In bevorzugten Ausführungsformen der erfindungsgemäß verwendbaren Verbindungen weisen R1 und R2 unabhängig voneinander ortho- oder meta -Stellung in Bezug auf den Stickstoffsubstituenten des Benzolrings auf, in besonders bevorzugten Ausführungsformen der erfindungsgemäß verwendbaren Verbindungen weisen R1 und R2 ortho-Stellung in Bezug auf den Stickstoffsubstituenten des Benzolrings auf. In vorteilhaften Ausführungsformen der erfmdungsgemäß verwendbaren Verbindungen sind m und n jeweils übereinstimmend gleich 0 oder 1. Bevorzugt sind m und n jeweils übereinstimmend gleich 0.
In besonders bevorzugten Ausführungsformen der erfindungsgemäß verwendbaren Verbindungen weisen diese die nachstehende allgemeine Formel (8) auf und/oder sind deren Enantiomere, Diastereomere, deren pharmazeutisch verträgliche Ester oder Salze:
Figure imgf000010_0001
Die Verbindung gemäß der allgemeinen Formel (8) wird auch als 3,3'-(Carbonylbis(imino- 4,l-phenylen)carbonylimino)bis(benzolphosphonsäure) bezeichnet. Ein besonderer Vorteil der erfindungsgemäß verwendbaren Verbindung gemäß der allgemeinen Formel (8), deren Enantiomere, Diastereomere sowie deren pharmazeutisch verträgliche Ester oder Salze ist, dass die Verbindungen vorzugsweise nicht überdosierbar sind. Ein weiterer Vorteil der Verbindung gemäß der allgemeinen Formel (8), deren Enantiomere, Diastereomere sowie deren pharmazeutisch verträgliche Ester oder Salze ist, dass diese Verbindungen eine besonders geringe oder vernachlässigbare Toxizität aufweisen können. Insbesondere sind diese Verbindungen in Arzneimitteln verwendbar, ohne dass schwerwiegende Nebenwirkungen zu erwarten sind. Weiterhin besonders bevorzugte Ausfuhrungsformen der erfmdungsgemäß verwendbaren Verbindungen weisen die nachstehende allgemeine Formel (9) auf und/oder sind deren Enantiomere, Diastereomere sowie deren pharmazeutisch verträgliche Ester oder Salze:
Figure imgf000011_0001
Auch bevorzugte Ausführungsformen der erfindungsgemäß verwendbaren Verbindungen weisen die nachstehende allgemeine Formel (10) auf und/oder sind deren Enantiomere, Diastereomere sowie deren pharmazeutisch verträgliche Ester oder Salze:
Figure imgf000011_0002
Noch bevorzugte Ausführungsformen der erfindungsgemäß verwendbaren Verbindungen weisen die nachstehende allgemeine Formel (11) auf und/oder sind deren Enantiomere, Diastereomere sowie deren pharmazeutisch verträgliche Ester oder Salze:
Figure imgf000012_0001
Die Verbindungen sind nach üblichen Synthesemethoden darstellbar.
Ein besonderer Vorteil der erfindungsgemäß verwendbaren Verbindungen ergibt sich hierbei daraus, dass vorzugsweise keine Nebenwirkungen auftreten. Vorteilhafter Weise wurden Nebenwirkungen bislang nicht beobachtet. Dies ermöglicht, dass die erfindungsgemäß verwendbaren Verbindungen auch prophylaktisch, beispielsweise nach einer Organtransplantation bevor Abstoßungsreaktionen auftreten oder als Adjuvanzien zur Immunisierung zur Induktion von Immuntoleranz, verwendbar sind. Weiterhin wird hierdurch eine unbedenkliche Anwendung beispielsweise bei kardiovaskulären Erkrankungen in Verbindung mit einer Behandlung mit anderen Medikamenten ermöglicht. Insbesondere wird eine Anwendung über einen längeren Zeitraum oder eine Daueranwendung ermöglicht.
Unter dem Begriff "prophylaktische Behandlung" wird im Sinne der vorliegenden Erfindung auch verstanden, dass die erfindungsgemäß verwendbaren Verbindungen prophylaktisch verabreicht werden können, bevor Symptome einer Erkrankung auftreten.
Vorzugsweise sind die erfindungsgemäß verwendbaren Verbindungen in Form eines pharmazeutisch verträglichen Phosphonatsalzes verwendbar. Verwendbare Hydrogenphosphonate oder Phosphonate sind vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe umfassend Alkaliphosphonatsalze, Erdalkaliphosphonatsalze, Ammoniumphosphonatsalze, deren Monohydrogenphosphonate und/oder Mischungen davon. Bevorzugt verwendbar sind Phosphonatsalze ausgewählt aus der Gruppe umfassend Natriumhydrogenphosphonat, Dinatriumphosphonat, Kaliumhydrogenphosphonat, Dikaliumphosphonat und/oder Mischungen davon.
Bevorzugte pharmazeutisch verträgliche Salze der Gruppen R3, R4, R5 und/oder R6 sind entsprechend ausgewählt aus der Gruppe umfassend -PO3HNa, -PO3Na2, -CH2-PO3HNa und/oder -CH2-PO3Na2, besonders bevorzugt ausgewählt aus der Gruppe umfassend -PO3Na2 und/oder -CH2-PO3HNa.
Besonders bevorzugt verwendbar sind Natriumhydrogenphosphonate und Dinatrium- phosphonate. Vorzugsweise liegen die erfmdungsgemäß verwendbaren Verbindungen in Form von pharmazeutisch verträglichen Salzen ausgewählt aus der Gruppe umfassend Di- Natrium-Salze und/oder Tetra-Natrium- Salze vor.
Insbesondere bevorzugt ist das Tetranatrium-Salz der 3,3'-(Carbonylbis(imino-4,l- phenylen)carbonylimino)bis(benzolphosphonsäure), C27H2ON4OgP2Na4, gemäß der nachstehenden allgemeinen Formel (12)
Figure imgf000013_0001
Weiterhin bevorzugt ist das Natriumhydrogenphosphonat-Salz der Verbindung gemäß der Formel (9) entsprechend der nachstehenden allgemeinen Formel (13)
Figure imgf000014_0001
In weiter bevorzugten Ausführungsformen der erfindungsgemäß verwendbaren Verbindungen liegen diese in Form ihrer pharmazeutisch verträglichen Ester vor. Vorzugsweise sind pharmazeutisch verträgliche Ester der erfmdungsgemäß verwendbaren Verbindungen ausgewählt aus der Gruppe umfassend Mono- oder Bis-(alkyl)Phosphonsäureester, insbesondere Mono- oder Bis-(Ci-C5-alkyl)-Phosphonsäureester, Mono- oder Bis- (acyloxyalkyl)-Phosphonsäureester, insbesondere Mono- oder Bis-(Ci-C5-acyloxy-Ci-Cs- alkyl)-Phosphonsäureester, Mono- oder Bis-Isopropyloxycarbonyloxymethyl-Ester (Disoproxil-Ester), Mono- oder Bis(thioalkenyl)-Phosphonsäureester, insbesondere Mono- oder Bis-(Ci-C5-thioalkenyl)-Phosphonsäureester und/oder Mono- oder Bis- Pivaloyloxymethylester.
Vorzugsweise sind pharmazeutisch verträgliche Mono- oder Bis-(Ci-C5-acyloxy-Ci-Cs- alkyl)-Phosphonsäureester der erfindungsgemäß verwendbaren Verbindungen ausgewählt aus der Gruppe umfassend Mono- oder Bis-(Ci-C5-acyloxymethyl)-Phosphonsäureester und/oder Mono- oder Bis-(Ci-C5-acyloxyethyl)-Phosphonsäureester, bevorzugt ausgewählt aus der Gruppe umfassend Bis-(Pivaloyloxymethyl)-Phosphonsäureester und/oder Bis- (Pivaloyloxyethyl)-Phosphonsäureester.
Vorzugsweise sind pharmazeutisch verträgliche Mono- oder Bis-(Ci-C5-alkyl)-Phosphon- säureester ausgewählt aus der Gruppe umfassend Methyl-, Ethyl-, Propyl- und/oder Isopropyl-Phosphonsäureester. Bevorzugte pharmazeutisch verträgliche Ester der Gruppen R3, R4, R5 und/oder R6 sind entsprechend ausgewählt aus der Gruppe umfassend -PO(OCHs)2 und/oder -PO(OCH2CH3)2.
Ein Vorteil der pharmazeutisch verträglichen Phosphonsäureester ergibt sich daraus, dass die Ester eine verbesserte Bioverfügbarkeit zur Verfügung stellen können. Insbesondere ist von Vorteil, dass die Ester der erfindungsgemäß verwendbaren Verbindungen oral verabreichbar sind.
Bevorzugt verwendbare Lösemittel sind ausgewählt aus der Gruppe umfassend Dimethylsulfoxid (DMSO), Alkohole, vorzugsweise Ethanol und/oder Wasser, wobei ein Zusatz von pharmazeutisch einsetzbaren Tensiden bevorzugt sein kann.
Vorteilhafter Weise sind die erfindungsgemäß verwendbaren Verbindungen zur Behandlung von Immunerkrankungen, insbesondere ausgewählt aus der Gruppe umfassend Autoimmunerkrankungen, Rheumatoide Arthritiden, Multiple Sklerose, Diabetes mellitus (Typl), Psoriasis, Morbus Crohn, Colitis ulcerosa, Allergien, Abstoßungsreaktionen und/oder zur Immunisierung, die zu einer Immuntoleranz führen kann, verwendbar.
Unter dem Begriff "Immunerkrankungen" sind im Sinne dieser Erfindung Erkrankungen zu verstehen, die mit einer gestörten Funktion des Immunsystems in Zusammenhang stehen, insbesondere Erkrankungen ausgewählt aus der Gruppe umfassend Autoimmunerkrankungen, Rheumatoide Arthritiden, Multiple Sklerose, Diabetes mellitus (Typl), Psoriasis, Morbus Crohn, Colitis ulcerosa, Allergien und/oder Abstoßungsreaktionen.
Autoimmunerkrankungen sind vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe umfassend Autoimmunhepatitis, Chronische Gastritis, Churg-Strauss-Syndrom, Autoimmun- Thrombozytopenien, Glomerulonephritis, Guillain-Barre-Syndrom, Hashimoto-Thyreoiditis, Liehen sclerosus, Lupus erythematodes insbesondere systemischer oder chronischer Lupus erythematodes, Morbus Basedow, Morbus Bechterew, Myasthenia gravis, PANDAS (Pediatric Autoimmune Neuropsychiatric Disorders Associated with Streptococcal Infections), Rheumatisches Fieber, Sarkoidose (Morbus Boeck), Sjögren-Syndrom, Stiff- Man-Syndrom, Sklerodermie, Wegenersche Granulomatose, Vitiligo, Autoimmunenteropathie, Goodpasture-Syndrom, Dermatomyositis und/oder Polymyositis. Besonders bevorzugte Autoimmunerkrankungen sind ausgewählt aus der Gruppe umfassend Autoimmunhepatitis, Autoimmun-Thrombozytopenien, Glomerulonephritis, Guillain-Barre- Syndrom, Liehen sclerosus, chronischer Lupus erythematodes, Myasthenia gravis und/oder Rheumatisches Fieber.
Im Rahmen von Autoimmunerkrankungen behandelbare Organe und/oder Gewebe sind beispielsweise ausgewählt aus der Gruppe umfassend Pankreas, Leber, Magen, Gefäße insbesondere Entzündung der Gefäße insbesondere der Nieren, Lungen und/oder des Hals- Nasen-Ohren-Bereichs, Verdauungstrakt insbesondere Dünn- und Dickdarm oder Mastdarm, Nieren, Myelinschicht der Nerven, Schilddrüse, Haut, Zentralnervensystem, insbesondere Myelinscheiden des zentralen Nervensystems, Gelenke, Schilddrüse, Wirbelsäule, Iris, Acetylcholinrezeptoren an der motorischen Endplatte, Bindegewebe, insbesondere Bindegewebe der Gelenke und/oder Bindegewebe unter der Haut, Herzgewebe, Basalganglien des Gehirns, Lymphknoten, Lunge, Speicheldrüsen, Tränendrüsen, Rückenmuskulatur, Lungen und/oder Muskeln. Bevorzugt behandelbare Organe und/oder Gewebe sind beispielsweise ausgewählt aus der Gruppe Leber, Verdauungstrakt insbesondere Dünn- und Dickdarm oder Mastdarm, Nieren, Myelinschicht der Nerven, Haut, Zentralnervensystem, insbesondere Myelinscheiden des zentralen Nervensystems, Gelenke, Acetylcholinrezeptoren an der motorischen Endplatte, Gelenke, Bindegewebe der Gelenke Herzgewebe und/oder Basalganglien des Gehirns. Im Rahmen von Autoimmunerkrankungen behandelbare Zellen sind insbesondere Melanozyten und/oder Thrombozyten. In bevorzugten Ausführungsformen sind die erfindungsgemäß verwendbaren Verbindungen nicht zur Behandlung von Erkrankungen ausgewählt aus der Gruppe umfassend Rheumatoide Arthritiden, Diabetes mellitus (Typl) und/oder Psoriasis verwendbar.
Insbesondere sind die erfindungsgemäß verwendbaren Verbindungen zur Immunsuppression, beispielsweise in der Organtransplantation zur Verhütung einer Organ- oder Gewebeabstoßung oder zur Immunisierung verwendbar. Ebenfalls ist eine Verwendung als Adjuvanzien zur Immunisierung zur Erlangung einer Immuntoleranz möglich.
Ein Vorteil der erfindungsgemäß verwendbaren Verbindungen kann darin bestehen, dass diese eine immunsuppressive Wirkung aufweisen können. Insbesondere kann ein Vorteil der erfindungsgemäß verwendbaren Verbindungen darin bestehen, dass diese eine durch Lipopolysaccharid (LPS) induzierte Freisetzung des proinflammatorischen und immunaktivierenden Interleukin 12 (IL- 12) inhibieren können.
Bevorzugt sind die erfindungsgemäß verwendbaren Verbindungen zur therapeutischen und/oder prophylaktischen Behandlung bei Colitis ulcerosa, Morbus Crohn und/oder Multiple Sklerose verwendbar.
Besonders bevorzugt sind die erfindungsgemäß verwendbaren Verbindungen zur therapeutischen und/oder prophylaktischen Behandlung bei Allergien, bei Abstoßungsreaktionen, als Immunsuppressivum und/oder als Adjuvanzien zur Immunisierung verwendbar. Ganz besonders bevorzugt sind die erfindungsgemäß verwendbaren Verbindungen als Immunsuppressivum verwendbar.
Insbesondere behandelbare Abstoßungsreaktionen sind überschießende Transfusionsreaktionen oder Abstoßungsreaktionen bei Organtransplantationen beispielsweise Transplantabstoßungsreaktionen vom "Host-versus-Graft"-Typ (Wirt-gegen- Transplantat-Reaktion) oder "Graft-versus-Host"-Typ (Transplantat-gegen-Empfänger- Krankheit).
In bevorzugten Ausführungsformen sind die erfindungsgemäß verwendbaren Verbindungen zur therapeutischen und/oder prophylaktischen Behandlung von Abstoßungsreaktion nach Organ- und/oder Gewebetransplantationen beispielsweise von Haut, Knochenmark, oder Nieren verwendbar.
Kardiovaskuläre Erkrankungen sind vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe umfassend periphere arterielle Verschlusskrankheiten, koronare Herzkrankheiten, entzündliche Herzkranzgefässe, Myokarditis, Myokardinfarkt, instabile und stabile Angina pectoris, und/oder Herzinsuffizienz. Bevorzugt sind die erfmdungsgemäß verwendbaren Verbindungen bei Herzinsuffizienz verwendbar.
Erkrankungen, die mit einer gestörten Erythropoese in Zusammenhang stehen, können insbesondere ausgewählt sein aus der Gruppe umfassend Anämien bei Tumoren, malignen Lymphomen, Leukämien, renale Anämien und/oder hämolytische Anämien.
Vorzugsweise sind die erfindungsgemäß verwendbaren Verbindungen zur Aktivierung einer Erythropoese verwendbar.
Die erfmdungsgemäß verwendbaren Verbindungen sind entsprechend üblichen Methoden verabreichbar, beispielsweise durch eine orale, dermale oder enterale Verabreichung oder durch Injektion. Bevorzugt ist eine orale Verabreichung und/oder eine Verabreichung mittels Injektion, besonders bevorzugt ist eine orale Verabreichung. Insbesondere ist eine orale Verabreichung der Ester der erfindungsgemäß verwendbaren Verbindungen bevorzugt. Vorteilhafter Weise können die erfϊndungsgemäß verwendbaren Verbindungen eine nur geringe oder vernachlässigbare Toxizität bei der Verabreichung aufweisen. Dies ermöglicht die Verabreichung von hohen Dosen, beispielsweise nach einer Organtransplantation oder bei Auftreten einer Immunerkrankung. Dies ermöglicht beispielsweise auch eine langfristige Verabreichung, insbesondere eine tägliche Verabreichung. Dies ermöglicht auch eine prophylaktische Verabreichung, insbesondere an Menschen. Eine Verabreichung kann in einer oder mehreren Dosen pro Tag erfolgen.
Ein Vorteil der erfindungsgemäß verwendbaren Verbindungen liegt darin, dass diese Verbindungen in geringen Konzentrationen verwendbar sind. In bevorzugten Ausführungsformen liegt die Dosierung der erfindungsgemäß verwendbaren Verbindungen, im Bereich von > 0,1 mg/Tag/kg Körpergewicht bis ≤ 1 g/Tag/kg Körpergewicht, vorzugsweise im Bereich von > 0,2 mg/Tag/ kg Körpergewicht bis ≤ 10 mg/Tag/kg Körpergewicht, bevorzugt im Bereich von > 0,5 mg/Tag/ kg Körpergewicht bis ≤ 5 mg/Tag/kg Körpergewicht
Ohne auf eine bestimmte Theorie festgelegt zu sein, wird angenommen, dass die erfϊndungsgemäß verwendbaren Verbindungen den P2Yn-Rezeptor aktivieren können. Dieser Rezeptor gehört zu einer Gruppe G-Protein gekoppelter Rezeptoren, deren Ligand Adenosintriphosphat (ATP) ist. Ein besonderer Vorteil der erfϊndungsgemäß verwendbaren Verbindungen kann dadurch zur Verfügung gestellt werden, dass die Verbindungen selektiv den P2Yn -Rezeptor aktivieren können. Dies ist insbesondere gegenüber unspezifischen Aktivatoren von Vorteil, da durch die erfϊndungsgemäß verwendbaren Verbindungen der P2Yn -Rezeptor selektiv aktiviert werden kann, ohne dass durch eine Aktivierung weiterer Subtypen der Rezeptorfamilie Nebenwirkungen erzeugt werden.
Überraschender Weise wurde in Zellkulturversuchen festgestellt, dass die erfϊndungsgemäß verwendbaren Verbindungen eine halbmaximale Stimulations- bzw. Aktivierungs- konzentration (EC50) für den P2Yn -Rezeptor aufweisen können, die niedriger ist als die des natürlichen Liganden ATP. Ein weiterer Vorteil der erfindungsgemäß verwendbaren Verbindungen, insbesondere der Verbindung gemäß der Formel (8), 3,3'-(Carbonylbis(imino- 4,l-phenylen)carbonylimino)bis(benzolphosphonsäure) und deren Natriumsalze, ergibt sich daraus, dass die Verbindungen einen ECso-Wert aufweisen, der eine Verwendung im physiologisch einsetzbaren Bereich ermöglicht.
In bevorzugten Ausführungsformen weisen die erfmdungsgemäß verwendbaren Verbindungen EC50- Werte für die Aktivierung des P2Yn -Rezeptors im Bereich von > 1 nM bis ≤ 1000 nM, bevorzugt im Bereich von > 20 nM bis ≤ 800 nM, weiter bevorzugt im Bereich von > 30 nM bis ≤ 350 nM, vorzugsweise im Bereich von > 40 nM bis ≤ 100 nM, besonders bevorzugt im Bereich von > 50 nM bis ≤ 80 nM auf.
In besonders bevorzugten Ausführungsformen der erfindungsgemäß verwendbaren Verbindungen können die Verbindungen zu einer allosteren Aktivierung des P2Yn -Rezeptors führen. Insbesondere wurde überraschend im Zellkulturmodell gefunden, dass die Verbindung gemäß der allgemeinen Formel (8), 3,3'-(Carbonylbis(imino-4,l-phenylen)carbonylimino)- bis(benzolphosphonsäure) und deren Natriumsalze zu einer allosteren Aktivierung des P2Yn- Rezeptors führen. Die allostere Aktivierung kann den besonderen Vorteil zur Verfügung stellen, dass die erfmdungsgemäß verwendbaren Verbindungen, insbesondere die Verbindung gemäß der Formel (8), 3,3'-(Carbonylbis(imino-4,l-phenylen)carbonylimino)bis(benzol- phosphonsäure) und deren Natriumsalze, vorzugsweise nicht überdosierbar sind.
Ein weiterer Vorteil der erfmdungsgemäß verwendbaren Verbindungen ist, dass die Verbindungen eine gute metabolische Stabilität aufweisen. Insbesondere weisen die erfmdungsgemäß verwendbaren Verbindungen eine höhere metabolische Stabilität als der natürliche Ligand ATP auf. Beispielsweise weisen die erfindungsgemäß verwendbaren Verbindungen gegenüber ATP eine höhere hydrolytische Stabilität auf. Ohne auf eine bestimmte Theorie festgelegt zu sein, wird angenommen, dass die erfmdungsgemäß verwendbaren Verbindungen geeignet sind eine Immunsuppression zu bewirken, einen positiv inotropen Effekt zu bewirken und/oder die Erythropoese zu stimulieren.
Ein weiterer Gegenstand betrifft die Verwendung der erfmdungsgemäß verwendbaren Verbindungen zur Herstellung eines Immunsuppressivums und/oder Adjuvans zur Immunisierung, eines Kardiakums und/oder Erythropoetikums geeignet zur therapeutischen und/oder prophylaktischen Behandlung von durch selektive P2Yπ-Rezeptor-Aktivierung vorzugsweise durch selektive allostere P2Yπ -Rezeptor- Aktivierung behandelbaren Krankheitszuständen.
Ohne auf eine bestimmte Theorie festgelegt zu sein, wird weiterhin vermutet, dass die erfmdungsgemäß verwendbare Verbindung gemäß der Formel (8), 3,3'-(Carbonylbis(imino- 4,l-phenylen)carbonylimino)bis(benzolphosphonsäure) eine neue allostere Bindungsstelle des P2Yn -Rezeptors nutzt. Dies eröffnet vorteilhafter Weise weiterhin die Möglichkeit einer pharmazeutischen Charakterisierung von P2Yn-Rezeptoren in rekombinanten und nativen Zellsystemen mit Hilfe der erfmdungsgemäß verwendbaren Verbindungen, insbesondere der Verbindung gemäß der Formel (8).
Ein weiterer Gegenstand betrifft die Verwendung von erfindungsgemäß verwendbaren Verbindungen zur Herstellung eines P2Yn-Rezeptor-selektiven vorzugsweise allosteren Agonisten.
Ein noch weiterer Gegenstand betrifft einen P2Yn-Rezeptor-selektiven vorzugsweise allosteren Agonist basierend auf einer erfindungsgemäßen Verbindung geeignet zur therapeutischen und/oder prophylaktischen Behandlung von durch selektive vorzugsweise allostere P2Yn -Rezeptor- Aktivierung behandelbaren Krankheitszuständen, vorzugsweise von wenigstens einer Erkrankung ausgewählt aus der Gruppe umfassend Immunerkrankungen, kardiovaskuläre Erkrankungen, Erkrankungen, die mit einer gestörten Erythropoese in Zusammenhang stehen und/oder zur Immunisierung.
Beispiele und Figuren, die der Veranschaulichung der vorliegenden Erfindung dienen, sind nachstehend angegeben.
In den Figuren zeigt:
Fig. 1 Eine Konzentrations-Effekt-Kurve von ATPγS und der Verbindung gemäß der Formel
(12) als Agonisten am P2Yπ -Rezeptor, rekombinant exprimiert in 132 INI -Zellen, bestimmt im Calcium- Assay.
Fig. 2 Eine Konzentrations-Effekt-Kurve der Verbindung gemäß der Formel (12) als Agonist am P2Yn-Rezeptor, rekombinant exprimiert in 132 INI -Zellen, bestimmt im cAMP- Luciferase-Reportergen- Assay.
Fig. 3 Eine Konzentrations-Effekt-Kurve für den Effekt der Verbindung gemäß der Formel (12) auf die intrazelluläre [Ca2+] in 1321Nl-P2Yπ-Zellen in Abwesenheit und in Gegenwart von steigenden Konzentrationen des P2Yπ -Antagonisten gemäß der Formel (14).
Fig. 4 Konzentrations-Effekt-Kurve von ATPγS und der Verbindung gemäß der Formel (13) als Agonisten am P2Yn-Rezeptor, rekombinant exprimiert in 132 INI -Zellen, bestimmt im Calcium-Assay.
Fig. 5 Wirkung der Verbindungen gemäß der Formeln (12), (13) und (14) auf die Freisetzung von Thrombospondin-1 (TSP-I) aus von Monozyten-abgeleiteten dendritischen Zellen. Die Daten sind angegeben als Mittelwert ± Standardabweichung von drei unabhängigen Experimenten.
Zellkultur und Zelllinien
Die in den Versuchen verwendete Zelllinie 1321Nl-P2Yn wurde hergestellt, indem die 132 INI -Zelllinie, eine Astrozytoma-Zelllinie (ECACC-Nr: 86030402, Salisbury, UK) aus dem menschlichen Gehirn, mit einem Plasmid stabil transfϊziert wurde, das die Sequenz des humanen P2Yn -Rezeptors trug (GenBank ACC# AY449733).
Diese Zellen wurden bei 37°C, unter 5%iger Cθ2-Atmosphäre und einer Luftfeuchte von 96% inkubiert. Als Nährmedium wurde Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) mit Glukose (4500 mg/1), Natriumpyruvat und Pyridoxin unter Zusatz von 10% fetalem Rinderserum, 5 mM L-Glutamin und 100 U/ml Penicillin G, 100 μg/ml Streptomycin (alles Fa. Sigma- Aldrich, Taufkirchen) und 400 μg/ml G418 (Fa. Carl Roth, Karlsruhe) verwendet.
Beispiel 1
Bestimmung des EC50-Wertes für die Aktivierung des P2Yn -Rezeptors durch die Verbindung gemäß der Formel (12) mittels Calcium- Assay
Dieser Fluoreszenz basierte Assay wurde mit Hilfe eines Fluoreszenz-Microplate-Readers mit Pipettor-System (NOVOstar®; BMG LabTech, Offenburg) durchgeführt, wie in Kassack et al., "Functional Screening of G protein-coupled receptors by measuring intracellular calcium with a fluorescence microplate reader", J.Biomol.Screen. 7: 233-246, 2002, beschrieben, wenn im folgenden nicht abweichend beschrieben.
Dazu wurden 1321Nl-P2Yn-Zellen mit Hilfe von Trypsin/EDTA (0,05% Trypsin/ 0,02% EDTA, Fa. Sigma-Aldrich, Taufkirchen) von der Kulturflasche abgelöst und mittels des oben beschriebenen Nährmediums in ein Zentrifugenröhrchen überführt. Nach der Zentrifugation wurden die Zellen in frischem Medium aufgenommen und 20 min bei 37°C, 5% CO2 und 96% Luftfeuchte inkubiert. Danach wurden die Zellen zweimal mit Krebs-HEPES-Puffer (118 mM NaCl, 4,7 mM KCl, 1,2 mM MgSO4, 1,2 mM KH2PO4, 4,2 mM NaHCO3, 11,7 mM D-Glukose, 1,3 mM CaCl2 (alles Fa. Merck, Darmstadt), 10 mM HEPES (Fa. Sigma-Aldrich, Taufkirchen), pH 7,4) gewaschen.
In diesem Puffer wurden die Zellen mit dem Fluoreszenz-Farbstoff Oregon-Green 488 BAPTA- 1/AM beladen (3 μM; Fa. Molecular Probes/ Invitrogen, Eugene, Oregon, USA), wobei sie unter Zusatz von 1% Pluronic F- 127 (Fa. Sigma-Aldrich, Taufkirchen) 45 min bei Raumtemperatur und unter ständigem Schütteln mit dem Farbstoff inkubiert wurden. Nach dieser Inkubation wurden die Zellen zweimal mit Krebs-HEPES-Puffer gewaschen. Die Zellsuspension wurde auf eine Zellzahl von 50.000-100.000 Zellen/well verdünnt und in eine 96 well Mikro titerplatte (Fa. Greiner bio-one, Frickenhausen) ausgesät.
Die Verbindung gemäß der Formel (12), Tetranatrium-3,3'-(Carbonylbis(imino-4,l- phenylen)carbonylimino)bis(benzol-phosphonsäure), wurde in Wasser gelöst (Milli-Q- Qualität), um eine 10 mM Lösung zu erhalten. Die Lösungen wurden in 0,9%iger NaCl- Lösung verdünnt, da physiologische Kochsalzlösung kein Ca2+-Signal ergibt, und Konzentrationen von 10 nM bis 1 mM hergestellt.
Konzentrations-Effekt-Kurven wurden aufgenommen, indem die Lösungen verschiedener Konzentration des Agonisten gemäß der Formel (12) Tetranatrium-3,3'-(Carbonylbis(imino- 4,l-phenylen)carbonylimino)bis(benzol-phosphonsäure) und von ATPγS zu den Zellen injiziert wurden und die Fluoreszenz der Zellen gemessen wurde.
Die Exzitations-Wellenlänge lag bei 485 nm (±12 nm) und die Fluoreszenz-Intensität wurde bei 520 nm (± 35 nm) für 30 s mit einem Intervall von 0,4 s bestimmt. Die Messungen wurden in 6 unabhängigen Experimenten mit je Dreifachbestimmungen aufgenommen. Als Kontrolle dienten nicht stimulierte Zellen, die NaCl-Lösung injiziert erhielten.
Es konnte festgestellt werden, dass Tetranatrium-3,3'-(Carbonylbis(imino-4,l- phenylen)carbonylimino)bis(benzol-phosphonsäure) als Agonist des P2Yπ-Rezeptors wirkt, wie aus Fig. 1 zu entnehmen ist. Weiterhin konnte festgestellt werden, dass Tetranatrium-3,3'- (Carbonylbis(imino-4, 1 -phenylen)carbonylimino)bis(benzol-phosphonsäure) einen ECso-Wert von 65 nM aufwies, während ATPγS einen ECso-Wert von 55 nM aufwies, wie ebenfalls der Fig. 1 zu entnehmen ist. Der physiologische Agonist ATP wies indessen einen ECso-Wert von 160 nM auf.
Dies zeigt, dass die Verbindung gemäß der Formel (12), Tetranatrium-3,3'-(Carbonyl- bis(imino-4,l-phenylen)carbonylimino)bis(benzol-phosphonsäure) einen ECso-Wert aufweist, der im physiologischen Bereich liegt.
Beispiel 2
Bestimmung des ECso-Wertes für die Aktivierung des P2Yn -Rezeptors der Verbindung gemäß der Formel (12) mittels cAMP-Luciferase-Reportergen-Assay
1321Nl-P2Yn-Zellen wurden transient mit dem pCRE-luc-Plasmid, einem durch cAMP indizierbaren Luciferase-exprimierenden Plasmid, transfiziert. Dazu wurden 2,5 Millionen Zellen über Nacht in einem 10 cm-Zellkulturgefäß anwachsen gelassen. Am folgenden Tag wurden die Zellen entsprechend des Herstellerprotokolls mit 30 μg Plasmid-DNA transfiziert (Polyfect, Fa. Qiagen, Hilden). 24 Stunden nach der Transfektion wurden die Zellen abgeerntet und in zwei weiße 96 well-Mikrotiterplatten (Fa. Greiner bio-one, Frickenhausen) in DMEM mit Glukose (4500 mg/1), Natriumpyruvat und Pyridoxin unter Zusatz von 10% fetalem Rinderserum, 5 mM L-Glutamin und 100 U/ml Penicillin G, 100 μg/ml Streptomycin (alles Fa. Sigma-Aldrich, Taufkirchen) und 400 μg/ml G418 (Fa. Carl Roth, Karlsruhe) ausgesät. 72 Stunden nach der Transfektion wurden die Zellen vom Medium befreit und in Phenolrot- freiem Dulbecco's modified Eagle Medium Nutrient Mixture F- 12 Harn (DMEM/F-12 1 :1 Mixture) ohne Zusatz von fetalem Rinderserum, mit 5 mM L-Glutamin, 100 U/ml Penicillin G, 100 μg/ml Streptomycin (alles Fa. Sigma-Aldrich) inkubiert.
Lösungen von Adenosin-5'-O-(3-thiotriphosphat) (ATPγS, Fa. Sigma-Aldrich), einer ATP- analogen Verbindung, die weniger leicht als ATP hydrolysierbar ist, und der Verbindung gemäß der Formel (12), Tetranatrium-3,3'-(Carbonylbis(imino-4,l-phenylen)carbonylimino)- bis(benzol-phosphonsäure) wurden in Phenolrot- freiem Dulbecco's modified Eagle Medium Nutrient Mixture F- 12 Harn (DMEM/F-12 1 : 1 Mixture) ohne Zusatz von fetalem Rinderserum, mit 5 mM L-Glutamin, 100 U/ml Penicillin G, 100 μg/ml Streptomycin (alles Fa. Sigma-Aldrich, Taufkirchen) in Konzentrationen von 10 nM bis 1 mM verdünnt (10x- Stammlösungen).
Zur Stimulation der Zellen wurden diese mit verschiedenen Konzentrationen der zu testenden Substanzen stimuliert, wobei bei jeweils 90 μl des Mediums pro well vorgelegt und 10 μl der 10x Stammlösungen der Substanzen dazu pipettiert wurden.
Die Zellen wurden anschließend 3 h bei 37°C, 5% CO2 und 96% Luftfeuchte inkubiert. Nach der Stimulation wurde das überstehende Medium abgenommen und die Zellen wurden mit Hilfe eines Lyse-Puffers (8 mM Tricin (Fa. Merck, Darmstadt), 2 mM EDTA (Fa. Sigma- Aldrich, Taufkirchen), 1 mM DTT (Dithiothreitol, Fa. AppliChem, Darmstadt), 5 % Triton-X (Fa. Sigma-Aldrich, Taufkirchen), pH 7.8) lysiert (100 μl/well).
Die Mikrotiterplatten wurden anschließend 20 min bei 4°C im Dunklen inkubiert. Die Luciferase-Aktivität wurde durch Zugabe von 100 μl eines Luciferase-Assay-Reagenz (30 mM Tricin, 10 mM MgSO4 (beides Fa. Merck, Darmstadt), 10 mM DTT (Fa. AppliChem, Darmstadt), 0,5 mM EDTA, 0,5 mM ATP, 0,5 mM Coenzyme A (Fa. Sigma-Aldrich, Taufkirchen), 0,5 mM D-Luciferin (Fa. Molecular Probes/Invitrogen, Eugene, Oregon, USA bzw. Fa. Synchem, Felsberg/ Altenburg), pH 7,8) zu jedem well durch Messung der Lumineszenz in einem Lumineszenz Microplate-reader (LUMIstar®; BMG LabTech, Offenburg) bestimmt.
Als Kontrolle dienten nicht stimulierte Zellen, die statt ATPγS oder der Verbindung gemäß der Formel (12), Tetranatrium-3,3'-(Carbonylbis(imino-4,l-phenylen)carbonylimino)- bis(benzol-phosphonsäure) mit Nährmedium inkubiert wurden. Die Lumineszenz wurde auf gleiche Weise bestimmt. Die Messungen wurden in neun unabhängigen Versuchen mit Dreifachbestimmung aufgenommen.
Es konnte festgestellt werden, dass die Verbindung Tetranatrium-3,3'-(Carbonylbis(imino- 4,l-phenylen)carbonylimino)bis(benzol-phosphonsäure) als Agonist des P2Yn-Rezeptors wirkt und einen ECso-Wert von 74 nM aufwies, wie aus Figur 2 zu entnehmen ist.
Dies zeigt, dass die Verbindung gemäß der Formel (12), Tetranatrium-3,3'- (Carbonylbis(imino-4, 1 -phenylen)carbonylimino)bis(benzol-phosphonsäure) einen ECso-Wert aufweist, der im physiologischen Bereich liegt.
Beispiel 3
Bestimmung der allosteren Aktivierung des P2Yn-Rezeptors durch die Verbindung gemäß der Formel (12) Tetranatrium-3,3'-(Carbonylbis(imino-4,l-phenylen)carbonylimino)- bis(benzol-phosphonsäure) mittels Calcium-Assay
Der Fluoreszenz basierte Assay wurde durchgeführt wie oben unter "Beispiel 1 " beschrieben.
Konzentrations-Effekt-Kurven des Agonisten Tetranatrium-3,3'-(Carbonylbis(imino-4,l- phenylen)carbonylimino)bis(benzol-phosphonsäure) wurden aufgenommen in Abwesenheit oder in Gegenwart steigender Konzentrationen von 10 nM, 31,6 nM und 100 nM des P2Yπ- Antagonisten gemäß der nachstehenden Formel (14):
Figure imgf000028_0001
Wie auch der Figur 3 entnommen werden kann, konnte festgestellt werden, dass die intrinsische Aktivität der Konzentrations-Effekt-Kurven des Tetranatrium-Salz der Verbindung gemäß der Formel (12), Tetranatrium-3,3'-(Carbonylbis(imino-4,l- phenylen)carbonylimino)bis(benzol-phosphonsäure) in Gegenwart steigender Konzentrationen des gegenüber ATP kompetitiven P2Yπ -Antagonisten gemäß der Formel (14) kontinuierlich abnimmt. Dies weist neben der orthosteren ATP-Bindungsstelle, an die auch der Antagonist gemäß der nachstehenden Formel (14) bindet, auf eine zweite allostere Bindungsstelle für die Verbindung gemäß der Formel (12), Tetranatrium-3,3'- (Carbonylbis(imino-4,l-phenylen)carbonylimino)bis(benzol-phosphonsäure), am P2Yπ- Rezeptor hin.
Beispiel 4
Bestimmung des ECso-Wertes für die Aktivierung des P2Yπ -Rezeptors durch die Verbindung gemäß der Formel (13) mittels Calcium- Assay
Der Fluoreszenz basierte Assay wurde durchgeführt wie unter "Beispiel 1" beschrieben. Es konnte festgestellt werden, dass die Verbindung gemäß der Formel (13) als orthosterer Agonist des P2Yn -Rezeptors wirkt, wie aus Fig. 4 zu entnehmen ist. Weiterhin konnte festgestellt werden, dass die Verbindung gemäß der Formel (13) einen ECso-Wert von 542 nM aufwies, während ATPγS einen ECso-Wert von 55 nM aufwies, wie ebenfalls der Fig. 4 zu entnehmen ist.
Dies zeigt weiterhin, dass die Verbindung gemäß der Formel (13) einen ECso-Wert aufweist, der im physiologischen Bereich liegt.
Beispiel 5
Bestimmung der Aktivierung des P2Yπ -Rezeptors durch die Verbindung gemäß der Formeln
(12) und (13) in dendritischen Zellen in vivo
Unreife dendritische Zellen wurden von adhärenten Monozyten aus dem peripheren Blut generiert. Hierzu wurden Monozyten aus Leukozytenfilmen von gesunden Probanden isoliert wie in Romani et al., J Exp Med 180: pp 83-93 (1994) beschrieben, wenn im Folgenden nicht abweichend angegeben. Die Zellen wurden fünf Tage in Gegenwart von 800 U/ml Granulozyten-Makrophagen Kolonie stimulierender Faktor (GM-CSF, Invitrogen) und 500 U/ml IL-4 (Invitrogen) bei 37°C, unter 5%iger Cθ2-Atmosphäre und einer Luftfeuchte von 96% kultiviert.
Danach wurden die Zellen in einer Konzentration von 106 Zellen/ml, 1 ml/well, in 24 well- Platten in RPMI- 1640 unter Zusatz von 10% fetalem Rinderserum, 5 mM L-Glutamin und 100 U/ml Penicillin G, 100 μg/ml Streptomycin (alles Fa. Sigma-Aldrich, Taufkirchen) mit 800 U/ml GM-CSF und 500 U/ml IL-4 während 5 Tagen inkubiert.
Anschließend wurden die erhaltenen dendritischen Zellen für 24 Stunden mit 100 μM der Verbindung gemäß der Formel (13), 10 μM der Verbindung gemäß der Formel (12) Tetranatrium-3,3'-(Carbonylbis(imino-4,l-phenylen)carbonylimino)bis(benzol- phosphonsäure), 100 μM ATPγS oder 100 μM ATPγS und 100 μM der Verbindung gemäß der Formel (14) stimuliert.
Die Überstände der behandelten Zellen wurden gesammelt und der Gehalt an humanem Thrombospondin (TSP-I) durch ein enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) Kit (ChemiKine™ Thrombospondin- 1, Competitive ELISA, (Katalog-Nr: CYT 168), Chemicon International, Hamshire, Großbritannien) nach Herstellerangaben bestimmt. Thrombospondin ist ein Immunmodulator und kann die Zellmigration, Zelladhäsion und Aktivierung von T- Zellen hervorrufen. Als Kontrolle dienten nicht stimulierte Zellen, die statt ATPγS oder einer Verbindung gemäß der Formeln (12), (13) oder (14) mit Nährmedium inkubiert wurden. Messungen wurden in drei unabhängigen Versuchen aufgenommen.
Es wurde festgestellt, dass 100 μM ATPγS an den von humanen Monozyten abgeleiteten dendritischen Zellen eine Thrombospondin- 1 Sekretion von 2000 ng/ml hervorrief und die Verbindung gemäß der Formel (13) in einer Konzentrationen von 100 μM eine vergleichbare Sekretion von Thrombospondin- 1 wie ATPγS hervorrief. Die Verbindung gemäß der Formel (12) Tetranatrium-3,3'-(Carbonylbis(imino-4,l-phenylen)carbonylimino)bis(benzol- phosphonsäure) bewirkte in einer Konzentration von 10 μM eine im Vergleich zu ATPγS auf ca. 60% reduzierte Sekretion von Thrombospondin- 1, wie aus Figur 5 zu entnehmen ist.
Weiterhin konnte gezeigt werden, dass die Thrombospondin- 1 Ausschüttung durch eine Aktivierung des P2Yn-Rezeptors hervorgerufen wurde, da das Signal von ATPγS durch den P2Yn-selektiven Antagonisten der Verbindung gemäß der Formel (14) auf Kontrollniveau inhibiert werden konnte.
In diesem physiologischen Expressionssystem konnte somit gezeigt werden, dass die Verbindung gemäß der Formeln (12) Tetranatrium-3,3'-(Carbonylbis(imino-4,l- phenylen)carbonylimino)bis(benzol-phosphonsäure) und (13) die Sekretion des immunmodulierenden Proteins Thrombospondin-1 in vivo über eine Modulation des P2 Y11- Rezeptors beeinflussen kann. Somit kann die Verbindung gemäß der Formeln (12) und (13) die Immunantwort in vivo modulieren.
Weiter konnte gezeigt werden, dass die Verbindung gemäß der Formel (12) Tetranatrium- 3,3'-(Carbonylbis(imino-4,l-phenylen)carbonylimino)bis(benzol-phosphonsäure) einen partialagonistischen Charakter gegenüber dem P2 Yn-Rezeptor in vivo aufweist.

Claims

PATENTANSPRÜCHE
1. Verwendung von Verbindungen gemäß der allgemeinen Formel (1) wie nachstehend angegeben:
Figure imgf000032_0001
worin:
Z1 weist die nachstehende allgemeine Formel (2) auf:
Figure imgf000032_0002
Z2 weist die nachstehende allgemeine Formel (3) auf:
Figure imgf000032_0003
(3) worm:
weist die nachstehende allgemeine Formel (4) auf:
Figure imgf000033_0001
W1 weist die nachstehende allgemeine Formel (5) auf:
Figure imgf000033_0002
W τ2 weist die nachstehende allgemeine Formel (6) auf:
Figure imgf000033_0003
worin: R1, R2 sind jeweils unabhängig voneinander ausgewählt aus der Gruppe umfassend H, F, Cl, Ci-Cs-Alkyl, Ci-C5-Alkyloxy, CF3 und/oder CN,
R3, R4, R5, R6 sind jeweils unabhängig voneinander ausgewählt aus der Gruppe umfassend H, -PO3H2 und/oder -CH2-PO3H2, und
n, m sind jeweils unabhängig voneinander 0 oder 1,
und/oder deren Enantiomere, Diastereomere sowie deren pharmazeutisch verträgliche Ester und/oder Salze zur Herstellung eines Arzneimittels zur therapeutischen und/oder prophylaktischen Behandlung von Erkrankungen ausgewählt aus der Gruppe umfassend Immunerkrankungen, kardiovaskuläre Erkrankungen, Erkrankungen, die mit einer gestörten Erythropoese in Zusammenhang stehen und/oder zur Immunisierung.
2. Verwendung von Verbindungen nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass wenigstens zwei Substituenten ausgewählt aus der Gruppe umfassend R3, R4, R5 und/oder R6 eine Phosphonsäuregruppe ausgewählt aus der Gruppe umfassend -PO3H2 und/oder -CH2- PO3H2 sind.
3. Verwendung von Verbindungen nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Substituenten ausgewählt aus der Gruppe umfassend Z1, Z2, Q-W1 und/oder Q-W2 jeweils meta- oder para-Stellung in Bezug auf den Stickstoffsubstituenten des Benzolrings aufweisen.
4. Verwendung von Verbindungen nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass R1 und/oder R2 Ci-Cs-Alkyl sind ausgewählt aus der Gruppe umfassend Methyl, Ethyl, Isopropyl und/oder tert-Butyl, oder Ci-Cs-Alkyloxy ausgewählt aus der Gruppe umfassend -O-Methyl, -O-Ethyl, -O-Isopropyl und/oder -O-tert-Butyl.
5. Verwendung von Verbindungen nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass m und n gleich 0 sind.
6. Verwendung von Verbindungen nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Verbindung die nachstehende allgemeine Formel (8) aufweist:
Figure imgf000035_0001
7. Verwendung von Verbindungen nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Verbindung die nachstehende allgemeine Formel (9) aufweist:
Figure imgf000035_0002
8. Verwendung von Verbindungen nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Verbindung die nachstehende allgemeine Formel (10) aufweist:
Figure imgf000036_0001
9. Verwendung von Verbindungen nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Verbindung die nachstehende allgemeine Formel (11) aufweist:
Figure imgf000036_0002
10. Verwendung von Verbindungen nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das pharmazeutisch verträgliche Salz ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend Natriumhydrogenphosphonat, Dinatriumphosphonat, Kaliumhydrogenphosphonat, Dikaliumphosphonat und/oder Mischungen davon, insbesondere bevorzugt ist das Tetranatrium- S alz der 3,3'-(Carbonylbis(imino-4,l-phenylen)carbonylimino)bis(benzol- phosphonsäure).
11. Verwendung von Verbindungen nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der pharmazeutisch verträgliche Ester ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend Mono- oder Bis-(alkyl)-Phosphonsäureester, Mono- oder Bis-(acyloxyalkyl)- Phosphonsäureester, Mono- oder Bis-Isopropyloxycarbonyloxymethyl-Ester (Disoproxil- Ester), Mono- oder Bis-(thioalkenyl)-Phosphonsäureester und/oder Mono- oder Bis- Pivaloyloxymethylester.
12. Verwendung von Verbindungen nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Immunerkrankungen ausgewählt sind aus der Gruppe umfassend Autoimmunerkrankungen, Rheumatoide Arthritiden, Multiple Sklerose, Diabetes mellitus (Typl), Psoriasis, Morbus Crohn, Colitis ulcerosa, Allergien und/oder Abstoßungsreaktionen.
13. Verwendung von Verbindungen nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die kardiovaskulären Erkrankungen ausgewählt sind aus der Gruppe umfassend periphere arterielle Verschlusskrankheiten, koronare Herzkrankheiten, entzündliche Herzkranzgefässe, Myokarditis, Myokardinfarkt, instabile und stabile Angina pectoris, und/oder Herzinsuffizienz.
14. Verwendung von Verbindungen nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Erkrankungen, die mit einer gestörten Erythropoese in Zusammenhang stehen ausgewählt sind aus der Gruppe umfassend Anämien bei Tumoren, malignen Lymphomen, Leukämien, renale Anämien und/oder hämolytische Anämien
15. Verwendung von Verbindungen nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Dosierung der erfindungsgemäß verwendbaren Verbindungen im Bereich von > 0,1 mg/Tag/kg Körpergewicht bis ≤ 1 g/Tag/kg Körpergewicht, vorzugsweise im Bereich von > 0,2 mg/Tag/ kg Körpergewicht bis ≤ 10 mg/Tag/kg Körpergewicht, bevorzugt im Bereich von > 0,5 mg/Tag/ kg Körpergewicht bis ≤ 5 mg/Tag/kg Körpergewicht liegt.
16. Verwendung von Verbindungen nach einem der vorherigen Ansprüche zur Herstellung eines Immunsuppressivums und/oder Adjuvans zur Immunisierung, eines Kardiakums und/oder Erythropoetikums geeignet zur therapeutischen und/oder prophylaktischen Behandlung von durch selektive vorzugsweise allostere P2Yn-Rezeptor- Aktivierung behandelbaren Krankheitszuständen.
17. Verwendung von Verbindungen nach einem der vorherigen Ansprüche zur Herstellung eines P2Yπ-Rezeptor-selektiven vorzugsweise allosteren Agonisten.
18. P2Yi i-Rezeptor-selektiver Agonist basierend auf einer Verbindung nach einem der vorherigen Ansprüche geeignet zur therapeutischen und/oder prophylaktischen Behandlung von durch selektive vorzugsweise allostere P2Yn-Rezeptor- Aktivierung behandelbaren Krankheitszuständen, vorzugsweise von wenigstens einer Erkrankung nach Anspruch 1.
PCT/EP2007/057592 2006-08-11 2007-07-24 Spezielle carbonylbisimino-verbindungen zur behandlung von immunerkrankungen WO2008017586A2 (de)

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