WO2008006974A2 - Utilisation de ligands du recepteur h4 de l'histamine pour proteger les progeniteurs hematopoïetiques contre la toxicite hematologique des agents chimiotherapeutiques. - Google Patents

Utilisation de ligands du recepteur h4 de l'histamine pour proteger les progeniteurs hematopoïetiques contre la toxicite hematologique des agents chimiotherapeutiques. Download PDF

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Definitions

  • the present invention relates to the field of medicaments for reducing or even canceling certain side effects of treatments used in anticancer chemotherapy. More particularly, the invention proposes a novel approach for protecting hematopoietic progenitors (or precursors) by blocking their cell cycle by administering an H4 receptor agonist of the staminate.
  • chemotherapy remains the basis of treatment for the majority of malignant diseases.
  • the toxicity of anticancer drugs remains a limiting factor in their use. This deleterious effect is manifested against all rapidly proliferating tissues: bone marrow, digestive tract, skin and integuments, gonads.
  • Hematologic toxicity is the side effect most commonly associated with chemotherapy. It is determinant in the usable dosage or the possible combination of several drugs with different mechanism of action. This toxicity, a consequence of the rapid turnover of hematopoietic cells, can affect either all three hematopoietic lineages (red blood cells, polynuclear cells, platelets) or only one or two lines, depending on the type of chemotherapeutic agent and the dose used. It appears frequently during the chemotherapy of solid tumors and exposes the treated subjects to side effects of the infectious and / or haemorrhagic type, sometimes very serious.
  • Multipotent progenitor cells have a more limited potential for development and self - renewal than totipotent hematopoietic stem cells, in that they differentiate either into lymphoid cells (lymphoid progenitors) or into myeloid cells (myeloid progenitors).
  • the hematopoietic progenitors concerned in the present invention are the myeloid progenitors able to differentiate into red blood cells, polynuclear and platelets, as well as lymphoid progenitors.
  • Another possibility to reduce the hematotoxicity of chemotherapy is to administer one or more hematopoietic growth factors, such as G-CSF (Gabrilove, 2001) to combat neutropenia, erythropoietin to counteract, before or during anti-cancer treatment.
  • G-CSF Gabrilove, 2001
  • anemia Gabrilove, 2001
  • SCF SCF to protect erythroid precursors
  • histamine H2 receptor agonists such as histamine or 4-methylhistamine
  • ORMs reactive oxygen metabolites
  • the present invention uses this approach precisely, since it aims to reduce the toxic effects of these treatments by preventing the hematopoietic progenitors from entering the cell cycle.
  • the inventors have in fact demonstrated the myeloprotective properties of a new class of molecules, the histamine H4 (H4R) receptor agonists. This receptor is expressed preferentially in the bone marrow, whereas human non-hematopoietic cells (Liu et al., 2001a) or tumoral cells (JURKAT, UT7, results not shown) are devoid of it.
  • This characteristic therefore makes it possible to envisage a new therapeutic strategy aimed at specifically protecting hematopoietic progenitors against the toxic effects of antimitotic chemotherapies, while increasing the effectiveness of treatment and limiting the duration of post-therapeutic aplasia.
  • the present invention thus relates, in the first place, to the use of a histamine H4 receptor agonist, for the preparation of a pharmaceutical composition intended to protect the hematopoietic progenitors against the toxic effects of active drugs on the cells. in proliferation used in antitumor chemotherapy.
  • a histamine H4 receptor agonist according to the present invention is preferably specific for said receptor.
  • histamine H4 receptor specific agonist is meant a product having predominant histamine H4 receptor agonist activity with respect to one or possibly other activity (s) of said agonist. (eg, histamine H1, H2 or H3 agonist or antagonist activity).
  • the specificity of an agonist for the H4 receptor is, of course, a function of the doses at which it is used.
  • a histamine H4 receptor agonist may have an activity (agonist, antagonist or other) on a histamine receptor that is not the H4 receptor (ie, H1, H2 or H3); however, its histamine H4 agonist activity must be predominant at a given dose (or concentration) relative to its activity on another histamine receptor.
  • a histamine H4 receptor agonist according to the present invention also exhibits an H2 receptor agonist activity
  • this agonist is used at a dose not inducing agonist activity of the H2 receptor.
  • the expression "at a dose not inducing H2 receptor agonist activity” means the dose (or concentration) at which the histamine H4 receptor agonist activity of a compound is preponderant to its H2 receptor agonist activity.
  • the determination of this dose can be carried out by techniques known to those skilled in the art, such as for example by the in vitro method described below for the identification of a histamine H4 receptor agonist having no no histamine H2 receptor agonist activity.
  • histamine H2 receptor is expressed by hematopoietic stem cells (CFU-S) (Byron, 1977).
  • CFU-S hematopoietic stem cells
  • agonist activity on the histamine H2 receptor is meant a significant agonist activity on the histamine H2 receptor, resulting notably in the initiation of the cell cycle of the cells expressing the H2 receptor of the histamine. histamine.
  • the histamine H4 receptor agonist has no histamine H2 receptor agonist activity.
  • an H4 receptor agonist not exhibiting histamine H2 receptor agonist activity can be carried out by techniques known to those skilled in the art; for example by the in vitro method comprising the following steps: a) separately subcloning the cDNA encoding H2 and H4 receptors into two appropriate expression vectors, b) transfection of an appropriate cell line not expressing the H2 and H4 receptors by one of the vectors obtained in step b) (for example using lipofectamine), c) selection of the permanently transfected cells (for example by selecting antibiotic-resistant cells whose gene has also been cloned in said vector), d) assay for cAMP (adenosine monophosphate-3 ', 5' cyclic) intracellular in receptor activation assays:
  • the intracellular cAMP concentration decreases in response to H4 receptor stimulation by an H4R agonist, e) optionally, determining the dose (or concentration) at which the agonist exhibits agonist activity of the H2 and / or H4 receptor.
  • H4 receptor agonists of histamine there may be mentioned for example:
  • H4 receptor clobenpropit which has the advantage of being devoid of any effect on the H2 receptor and of being easily soluble in physiological media.
  • the latter was initially designed as a histamine H3 receptor antagonist, which was at that time its only known pharmacological target. Therefore, it is not completely specific for the H4 receptor, which could complicate its administration in vivo, because it should take into account possible side effects caused by its binding to the H3 receptor, even if this receptor is not expressed in the bone marrow; 4-methylhistamine (Lim et al., 2005) which is a non-specific agonist of the H4 receptor since it also exhibits an H2 receptor agonist activity; however, since there is a factor 100 between the dose inducing H2 receptor agonist activity and the dose inducing agonist activity of the H4 receptor, this product could be used if it was formulated so as to obtain mainly the expression of its H4 receptor agonist activity.
  • Alkylating agents whose principal agents are cyclophosphamide, melphalan, chloraminophene, nitrosoureas and busulfan. They have one or more electrophilic groups that bind to regions rich in electrons purine and pyrimidine bases of DNA 5 I 1 which results in the creation of breaks, mutations or abnormal bonds between DNA strands.
  • antimetabolites including methotrexate (which inhibits thymidine synthesis), 5-fluorouracil (a precursor of 5-FdUMP that inhibits thymidilate synthetase and a precursor of FUTP incorporated in RNA and inhibits its function), and cytosine arabinoside (precursor of ARA-CTP which inhibits DNA polymerase).
  • the mitotic spindle poisons whose main agents are docetaxel, vincristine, vinblastine, vindesine, and navelbine. They inhibit the polymerization of tubulin, the main protein of the mitotic spindle.
  • Topoisomerase 2 inhibitors including vespeside and teniposide.
  • Topoisomerase 2 ensures the relaxation of the DNA helix during its synthesis, its translation into RNA or its repair.
  • intercalants whose main agents are doxorubicin and other anthracyclines, mitoxantrone and actinomycin D. They intercalate in the DNA molecule by disrupting its structure, its replication and its translation into RNA. They inhibit DNA polymerase and topoisomerase 2.
  • Bleomycin causes breaks in the DNA.
  • Mitomycin C is an alkylating agent and an intercalant.
  • Cisplatin is a bifunctional alkylating agent that creates bonds between DNA strands.
  • Asparaginase destroys an amino acid, asparagine, which is necessary for the metabolism of lymphoblasts.
  • the protective effect against hematopoietic progenitors is due to the fact that the histamine H4 receptor agonist blocks their cell cycle in G0 / G1 phase, thus preventing their proliferation. Its protective action will thus exert a priori regardless of the type of antineoplastic agent used for chemotherapy. In particular, this effect has been demonstrated in vivo during treatment with cyclophosphamide and 5-fluorouracil (5-FU) and in vitro with docetaxel.
  • the present invention is particularly useful for the preparation of a pharmaceutical composition for administration to patients with solid tumors, especially when subjected to treatment with cyclophosphamide, 5-FU, and / or docetaxel.
  • the H4 receptor agonist used according to the invention can be used, for example, at a concentration of between 5 mg / kg and 60 mg / kg, preferably between 10 mg / kg and 30 mg / kg per dose.
  • the pharmaceutical composition prepared according to the invention has been administered by intraperitoneal injection in mice, but it can advantageously be formulated for administration by intravenous injection or orally.
  • the present invention also relates to a method of treating cancer, particularly solid tumors, comprising administering a histamine H4 receptor agonist prior to and / or concurrently with the administration of a chemotherapeutic agent.
  • a histamine H4 receptor agonist prior to and / or concurrently with the administration of a chemotherapeutic agent.
  • the sequence of administration of the products is defined by the clinician. By way of non-limiting example, mention may be made of the following sequence: two injections or oral doses of the agonist on D-1, another 4 hours before chemotherapy and one last at D1.
  • Another aspect of the invention is a carrier drug comprising, as an active ingredient, a histamine H4 receptor agonist.
  • carrier drug is meant here a drug which is usually administered together with another drug, in order to alleviate the side effects.
  • Another medicament which is the subject of the present invention is an anticancer drug which comprises a combination of at least one molecule chosen from antineoplastic agents that can be used in chemotherapy, and a histamine H4 receptor agonist.
  • antineoplastic agents that may be part of a drug according to this aspect of the invention, there may be mentioned cyclophosphamide, 5-FU, and docetaxel.
  • the histamine H4 receptor agonist present in a medicament according to the invention may be clobenpropit (a drug used until now in animal experiments only), which has no activity. H2 receptor agonist of histamine.
  • a more specific agonist of the H4 receptor will be used at a dose which does not induce H2 receptor agonist activity, such as, for example, VUF 8430, (-) - 2-Cyano-1-methyl-3 - ⁇ (2R, 5R) -5- [1H-imidazol-4 (5) -yl] tetrahydrofuran-2-yl ⁇ methylguanidine, imbutamine, immepip, clozapine or OUP-16.
  • a cocktail of several different agonists including or not clobenpropit and / or imetit and / or 4-methylhistamine and / or VUF 8430 and / or (-) - 2-Cyano-1-methyl- 3 - ⁇ (2H, 57R) -5- [1H-imidazol-4 (5) -yl] tetrahydrofuran-2-yl ⁇ methylguanidine and / or imbutamine and / or immepip and / or clozapine and / or OUP-16, at an inducing dose no H2 receptor agonist activity, can also be introduced into a drug according to the invention.
  • the antineoplastic agent and the histamine H4 receptor agonist may be present as a mixture or, preferably, in two separate formulations. These two separate formulations may be intended to be extemporaneously mixed prior to administration. They may also be intended for sequential administration or simultaneous administration, but by different routes.
  • the present invention therefore also relates to products containing at least one histamine H4 receptor agonist which preferably has no histamine H2 receptor agonist activity, and a drug active on the proliferating cells used in antitumor chemotherapy, as a combined preparation for simultaneous, separate or spread over time, to protect the hematopoietic progenitors against the toxic effects of said drug.
  • the present invention also relates to a method for screening a product (for example an H4R agonist) capable of preventing hematopoietic progenitors from entering the cell cycle comprising the following steps: i) obtaining a mammalian cell expressing the H4 receptor of histamine, said cell not expressing naturally said receptor (such a cell can be obtained by performing steps a) to c) described above relating to the identification of a specific agonist of the receptor H4), ii) contacting a product to be screened with the cell obtained in step i), and iii) measuring the intracellular concentration of cAMP (the concentration decreases in response to stimulation of the H4 receptor by a H4R agonist) and / or detecting the cell cycle of said cell.
  • a product for example an H4R agonist
  • this method makes it possible to screen a product (for example an H4R agonist) to protect the hematopoietic progenitors against the toxic effects of active drugs on the proliferating cells used in antitumour chemotherapy.
  • a product for example an H4R agonist
  • Figure 1 Inhibitory effect of clobenpropit (CB) and imitit on the formation of colonies in methylcellulose. Clonogenic assay in methylcellulose (CFU-C) with IL-3 as the sole growth factor during 7 days of culture, with or without CB (10 "5-10" 7 M).
  • Figure 2 Clobenpropit does not induce apoptosis of bone marrow hematopoietic progenitors. Apoptosis was measured by annexin V-FlTC labeling which recognizes phosphatidylserine residues exposed on apoptotic cell membranes (panel A). The percentage of dead cells is then determined by staining with propidium iodide, which enters cells with damaged membranes (panel B). The experiment was performed with medullar populations enriched in undifferentiated cells (Lin) grown for 72 h with a cocktail of growth factors (IL-3, IL-6, SCF).
  • IL-3, IL-6, SCF cocktail of growth factors
  • FIG. 4 The CB inhibits proliferation of bone marrow cells Lin "c-kit + induced by growth factors Bone marrow cells Lin.” Were incubated for 3 days in StemSpan medium (StemCell Technologies), supplemented with factors growth (IL-3, IL-6, SCF) in the presence of CFSE (to). The fluorescence of Lin cells "c-kit + was analyzed.
  • FIG. 5 CB maintains c-kit expression in Lin ' bone marrow cells by inhibiting growth factor-induced proliferation / differentiation.
  • Lin bone marrow cells “were incubated for 3 days in StemSpan medium (StemCell Technologies), supplemented with growth factors (IL-3, IL-6, SCF) in the presence or not of CB and antagonist H4 receiver.
  • StemSpan medium StemCell Technologies
  • growth factors IL-3, IL-6, SCF
  • FIG. 6 Cell cycle blockade by CB is reversible. Cells were incubated for 72h in the growth factor cocktail with or without CB. They were then washed and restimulated for 24 hours with the growth factors, before analyzing their distribution in the cell cycle.
  • FIG. 7 CB inhibits the expression of cyclin D3 at the protein level.
  • Cells were incubated for 24 h in the growth factor cocktail with or without CB prior to staining with FITC-conjugated anti-cyclin D3 antibody and staining of propidium iodide DNA.
  • FIG 8 CB inhibits the proliferation of several subpopulations of myeloid progenitors, ranging from CFU-Mix to BFU-E.
  • HALO-Hemogenix test luminescence cell viability assay (ATP / luciferin) after 5 days of culture in the presence of different growth factor cocktails with or without CB.
  • Figure 9 CB inhibits colony formation of common lymphoid progenitors (CLP). Bone marrow cells were cultured in methylcellulose supplemented with recombinant human IL-7 (10 ng / ml), recombinant murine SCF (100 ng / ml) and recombinant murine Flt-3L (20 ng / ml). The colonies were counted at day 7.
  • Figure 10 Inhibition of CFU-C by histamine. Bone marrow cells Lin “were pretreated for 24 h in medium StemSpan supplemented with IL-3 with different doses of histamine, before planting in methylcellulose with IL-3 for 7 days. Two separate experiments are Figure 11: Scheme of the protocol for evaluating in vivo the protective effect of CB against cyclophosphamide-induced myeloablation.
  • Figure 12 In vivo CB treatment protects medullary CFU-C and accelerates peripheral hematopoietic reconstitution.
  • the treatments with CB and cyclophosphamide were carried out according to the protocol above.
  • D2 and D5 the bone marrow and spleen cells, respectively, were evaluated for their hematopoietic progenitor content in the different experimental conditions.
  • FIG. 13 CB protects Scal + c-kit + progenitors in bone marrow and increases their frequency in the spleen.
  • the frequency of the primitive cells identified by the simultaneous expression of Seal and c-kit was determined, respectively, 2 and 5 days after treatment in the bone marrow and in the spleen.
  • the protocol is that shown in FIG. 1 1.
  • FIG. 14 CB does not protect mature bone marrow granulocytes (characterized by the concomitant expression of CD11b / Grl) against the cytotoxicity of cyclophosphamide.
  • the protocol is that of FIG. 11.
  • Figure 15 In vivo CB inhibits entry of cells Lin "bone marrow cell cycle 30 mg / kg of CB was injected to mice 48 hours, 24 hours and 4 hours prior to sacrifice..
  • FIG. 16 CB provides partial protection against the decrease in docetaxel-induced CFU-C formation. Bone marrow cells were incubated for 24 hours with or without CB in the presence of IL-3, before treatment with docetaxel at different concentrations, for 30 minutes. The cells were then washed and evaluated for their ability to form colonies in response to P1L-3.
  • FIG 17 CB inhibits colony formation from CD34 + human cells in a 14-day methylcellulose culture in the presence of IL-3.
  • CD34 + cells were purified from cord blood and inoculated into methylcellulose at a concentration of 1000 cells per ml.
  • Figure 18 CB inhibits the proliferation of IL-3-induced CD34 + hematopoietic precursors. The cells were cultured for 6 days in StemSpan medium supplemented with 10 ng / ml of recombinant human IL-3, starting from a concentration of 10 5 cells / ml.
  • Figure 19 CB maintains the expression of CD34 on hematopoietic precursors.
  • CD34 + cells purified from umbilical cord blood were cultured for 6 days with 10 ng / ml IL-3, with or without CB. Cells were then labeled with anti-CD34 antibody.
  • Figure 20 The H4 receptor is involved in the inhibitory effect of clobenpropit on the cell cycle of bone marrow cells.
  • FIG. 21 The H4 receptor is involved in the inhibitory effect of histamine on the cycling of CFU-C. EXAMPLES Materials and Methods Clonogenic Tests
  • the frequency of different types of progenitors in the bone marrow and spleen of control mice or during chemotherapy with or without CB injection was determined in the conventional methylcellulose test (StemCell Technologies), in response to IL-3 alone, in the presence of a cocktail of growth factors.
  • a technique developed by Hemogenix based on luminescence measurements in an ATP / luciferin system was used according to the manufacturer's recommendations.
  • different subpopulations of progenitors can thus be quantified after 7 days of culture in conventional methylcellulose and after 5 days of culture in the Hemogix test.
  • H4R ligands were evaluated either during semi-solid culture or after preincubation with drugs for 24 h.
  • concentration of hematopoietic cells cultured depends on the estimated frequency of hematopoietic progenitors and can range from 1000 to 10 6 cells / ml.
  • a human cell-adapted methylcellulose (StemCell Technologies) was used for experiments with human CD34 + progenitors purified from umbilical blood by positive magnetic selection according to the method marketed by Miltenyi.
  • Bone marrow cells are incubated with an antibody cocktail (StemCell Technologies) against surface antigens specific for mature lines (CD5, CD45R, CD1 Ib 5 TER19, Ly-6G, 7). -4) in PBS, 2% FCS, 1 mM EDTA at 10 s cells / ml for 20 min, either manually or automatically by RoboSep from StemCell Technologies. Positive cells are then removed using the SpinSep technique after coupling with dense particles or magnetic selection with RoboSep, respectively. Cell cycle analysis of hematopoietic progenitors
  • hematopoietic progenitors are incubated for 1-3 days with a cocktail of growth factors (rmIL-3 10 ng / ml, rhIL-6 10 ng / ml, rmSCF 50 ng / ml) in StemSpan medium. serum free with or without CB in the presence or absence of an H4R antagonist. The cells are then stained with propidium iodide (PI) for the analysis of the cycle according to the following protocol:
  • H4R receptor is expressed almost exclusively in the bone marrow (Liu et al., 2001a).
  • the inventors have thus benefited from the fact that certain drugs initially characterized as H3 receptor antagonists also recognize the H4 type, to test their effect on hematopoietic progenitors which form colonies in methylcellulose.
  • Figure 1 shows that Clobenpropit (CB), which behaves as an H4R agonist, exerts a significant inhibitory effect on colony formation in humans. methylcellulose (between 10 " -10 " 7 M), during 7 days of culture with P1L-3 as sole growth factor.
  • H3 and H4 agonist also inhibits colony formation to a lesser extent.
  • H3 receptor antagonists that do not recognize the H4 type do not share this effect
  • CB is not toxic to bone marrow hematopoietic progenitors as evidenced by the absence of apoptosis (assessed by expression of membrane phosphatidylserine revealed by Annexin V-FITC) in populations enriched in undifferentiated cells (Lin " ) grown for 72 h in a cocktail of growth factors (IL-3, IL-6, SCF) ( Figure 2).
  • a cytometric method for determining the different phases of the cell cycle by their DNA content measured by the fluorescence intensity of propidium iodide (P1) was used. Since CFU-C are very small in the bone marrow, incorporation of PI in DNA has been associated with membrane labeling of c-kit, which is expressed on immature cells previously enriched by elimination of the population. mature.
  • the CB significantly increases the percentage of cells Lin "+ c-kit in G0 / G1 phase and decreases as the G2 / M phase after three days of culture in presence of a cocktail of factors
  • This effect is also demonstrated by a technique that allows dividing cells to be traced by carboxyfluorescein diacetate, succinimidyl ester (CFSE), a fluorescent dye that is incorporated into cells and whose fluorescence intensity decreases. to As they divide.
  • CFSE carboxyfluorescein diacetate
  • the inventors have sought to know whether clobenpropit preferentially affects the proliferation of certain types of hematopoietic progenitors.
  • a clonogenic assay recently developed by Hemogenix was used.
  • the HALO-Hemogenix kit measures the proliferation (rather than differentiation) of distinct progenitor subpopulations in response to different growth factor cocktails. In this case, the colonies are no longer counted by optical microscopy, but the proliferation is measured after 5 days of culture by a chemiluminescence ATP assay.
  • this process concluded that BC did not specifically target a particular subpopulation of progenitors, but affected CFU-GEMM, CFU-GM and BFU -E in the same way ( Figure 8).
  • CB inhibits lymphoid colony formation, assessed as methylcellulose supplemented with IDF-7, SCF, and FIt-L (a standard assay for lymphoid progenitors).
  • docetaxel is active in vitro, which has been used to test in vitro the myeloprotective effect of CB against this drug.
  • Example 8 CB inhibits human CFU-C and decreases proliferation of CD34 + cells
  • CD34 + human cells purified from cord blood or cytapheresis
  • results similar to those obtained in mice . Indeed, a decrease in the number of colonies formed from CD34 + cells in methylcellulose in response to a cocktail of growth factors (SCF + IL-6 + IL-3) in the presence of CB (FIG. an inhibition of their proliferation in a liquid medium (FIG. 18). In both cases, the H4R JNJ antagonist abolishes the effect.

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Abstract

La présente invention concerne le domaine des médicaments destinés à réduire, voire annuler certains effets secondaires de traitements utilisés en chimiothérapie anticancéreuse. Plus particulièrement, l'invention propose une nouvelle approche pour protéger les précurseurs hématopoïétiques, en bloquant leur cycle cellulaire, par l'administration d'un agoniste du récepteur H4 de l'histamine. L'invention propose également des compositions pharmaceutiques comportant un agoniste du récepteur H4 de l'histamine, notamment des médicaments de support pour les patients soumis à des chimiothérapies anticancéreuses.

Description

UTILISATION DE LIGANDS DU RECEPTEUR H4 DE LΗISTAMINE POUR PROTEGER LES PROGENITEURS HEMATOPOÏETIQUES CONTRE LA TOXICITE HEMATOLOGIQUE DES AGENTS CHIMIOTHERAPEUTIQUES. La présente invention concerne le domaine des médicaments destinés à réduire, voire annuler certains effets secondaires de traitements utilisés en chimiothérapie anticancéreuse. Plus particulièrement, l'invention propose une nouvelle approche pour protéger les progéniteurs (ou précurseurs) hématopoïétiques, en bloquant leur cycle cellulaire, par l'administration d'un agoniste du récepteur H4 de l'hi staminé. <- Malgré de nombreux progrès dans la compréhension de la physiopathologie des maladies tumorales et l'utilisation de thérapeutiques plus ciblées, la chimiothérapie reste la base du traitement de la majorité des pathologies malignes. Or, la toxicité des drogues anticancéreuses demeure un facteur limitant de leur utilisation. Cet effet délétère se manifeste contre tous les tissus à prolifération rapide : moelle osseuse, tube digestif, peau et phanères, gonades.
La toxicité hématologique est l'effet secondaire le plus fréquemment associé à la chimiothérapie. Elle est déterminante dans la posologie utilisable ou l'association éventuelle de plusieurs médicaments à mécanisme d'action différent. Cette toxicité, conséquence du renouvellement rapide des cellules hématopoïétiques, peut affecter soit l'ensemble des trois lignées hématopoïétiques (hématies, polynucléaires, plaquettes), soit une ou deux lignées seulement, selon le type d'agent chimiothérapeutique et la dose utilisée. Elle apparaît fréquemment au cours de la chimiothérapie des tumeurs solides et expose les sujets traités à des effets secondaires de type infectieux et/ou hémorragiques parfois gravissimes.
Les cellules progénitrices multipotentes ont un potentiel de développement et d 'autorenouvellement plus limité que les cellules souches hématopoïétiques totipotentes, dans la mesure où elles se différencient soit en cellules lymphoïdes (progéniteurs lymphoïdes), soit en cellules myéloïdes (progéniteurs myéloïdes). Les progéniteurs hématopoïétiques concernés dans la présente invention sont les progéniteurs myéloïdes aptes à se différencier en hématies, polynucléaires et plaquettes, ainsi que les progéniteurs lymphoïdes.
La protection des progéniteurs hématopoïétiques contre les effets toxiques de la chimiothérapie a fait depuis longtemps l'objet d'une recherche active. Parmi les moyens qui sont d'ores et déjà mis en œuvre pour atténuer l'aplasie médullaire consécutive à ce traitement, on peut citer l 'autogreffe de cellules souches périphériques isolées du sang du patient, soit en sortie d'aplasie après chimiothérapie, soit après injection de facteurs de croissance (Filip et al., 2001). Dans ce cas, les cellules prélevées sont congelées et le produit décongelé est transfusé au patient qui a reçu les jours précédents une chimiothérapie myéloablative. Cette technique permet une réduction de la durée d'aplasie post-greffe significative, diminuant ainsi l'incidence des infections et le nombre de jours d'hospitalisation. Néanmoins, son application est loin d'être simple, sans compter que chez certains malades, on ne parvient pas à mobiliser les cellules souches, en particulier chez ceux qui ont déjà subi d'autres chimiothérapies.
Une autre possibilité pour réduire l' hématotoxicité de la chimiothérapie consiste à administrer avant ou pendant le traitement anti cancéreux, un ou plusieurs facteurs de croissance hématopoïétiques, comme le G-CSF (Gabrilove, 2001) pour combattre la neutropénie, l'érythropoïétine pour pallier l'anémie (Gabrilove, 2001) ou le SCF pour protéger les précurseurs érythroïdes (Zeuner et al., 2003). Bien qu'efficaces, ces molécules sont coûteuses, délicates à manier et non dénuées d'effets secondaires.
Parmi les approches visant à protéger spécifiquement les cellules souches hématopoïétiques sans empêcher l'effet anti-tumoral, on peut citer les travaux effectués avec le tétrapeptide AcSDKP (Cashman et al., 1994; Masse et al., 1998). Il s'agit d'une molécule produite de manière endogène dans la moelle osseuse, au même titre que le TGFβ qui est également un régulateur négatif de l'hématopoïèse. L'AcSDKP agit de manière préférentielle sur les cellules souches ou CFU-S par un mécanisme qui n'est pas clairement défini, mais qui pourrait impliquer sa capacité de stimuler l'angiogénèse (Liu et al., 2003). Plus récemment, il a été proposé de protéger les cellules souches du patient avant chimiothérapie en y introduisant un ou plusieurs gènes de résistance tel que le MDRl , une approche qui a abouti à des résultats encourageants dans des modèles murins (Banerjee and Bertino, 2002). Par ailleurs, il faut mentionner les effets radio- et chimioprotecteurs de l'amofostine, qui diminue la toxicité des traitements anti -cancéreux en captant les radicaux libres produits dans ces conditions (Santini, 2001 ).
En dehors des traitements par les facteurs de croissance et l'autogreffe qui ne protègent pas les cellules hématopoïétiques au cours de la chimiothérapie mais diminuent la phase consécutive d'aplasie, aucun des procédés cités plus haut n'est employé couramment en clinique. L'amifostine a fait l'objet d'essais cliniques en phase 1 et a été approuvée comme drogue radioprotectrice dans le traitement des cancers touchant le cou et la tête et comme complément au cours de chimiothérapies à base de cisplatine (Santini, 2001). Néanmoins, cette drogue ne cible pas spécifiquement les progéniteurs hématopoïétiques mais agit de manière plus large en captant les radicaux libres. Quant au AcSDK, son effet spécifique sur la mise en cycle a suscité beaucoup d'espoir, mais son efficacité n'est pas entièrement prouvée chez l'homme, probablement à cause de son instabilité in vivo due à une dégradation rapide par le "angiotensin I-convβrting enzyme" (ACE) (Charrier et al., 2004). Quant aux procédés faisant appel aux cellules souches transfectées, il s'agit là des techniques lourdes qui nécessitent encore un développement technologique. D'autres procédés proposent l'utilisation de cellules souches transfectées, mais leur mise en oeuvre fait appel à des technologies sophistiquées qui ne sont pas entièrement maîtrisées à l'heure actuelle. 11 est aussi connu de l'art antérieur (Demandes Internationales WO
00/10600 et WO 2006/039545) d'utiliser des agonistes du récepteur H2 de l'histamine, telles que l'histamine ou la 4-méthylhistamine, pour inhiber la production ou la libération de métabolites réactifs de l'oxygène (MRO) lors de traitements du cancer. Dans cette utilisation, les agonistes du récepteur H2 de l'histamine ne sont absolument pas utilisés pour leurs effets agonistes du récepteur H4 de l 'histamine.
Une approche alternative pour réduire l'hématotoxicité de la chimiothérapie consisterait à protéger spécifiquement les cellules souches hématopoïétiques contre l'effet des drogues, tout en maintenant leur efficacité anti-tumorale. Ceci peut être obtenu en bloquant de façon réversible Ie cycle cellulaire des progéniteurs hématopoïétiques. Or à ce jour, il n'existe aucun procédé efficace connu pour bloquer spécifiquement la prolifération des progéniteurs hématopoïétiques, qui prolifèrent activement, et sont donc très sensibles aux effets toxiques d'une chimiothérapie.
La présente invention utilise justement cette approche, puisqu'elle vise à diminuer les effets toxiques de ces traitements en empêchant les progéniteurs hématopoïétiques d'entrer en cycle cellulaire. Les inventeurs ont en effet mis en évidence des propriétés myéloprotectrices d'une nouvelle classe de molécules, les agonistes du récepteur histaminergique H4 (H4R). Ce récepteur est exprimé préférentiellement dans la moelle osseuse, alors que les cellules humaines non-hématopoïétiques (Liu et al., 2001 a) ou tumorales (JURKAT, UT7, résultats non montrés) en sont dépourvus. Cette caractéristique permet donc d'envisager une nouvelle stratégie thérapeutique visant à protéger de façon spécifique les progéniteurs hématopoïétiques des effets toxiques des chimiothérapies antimitotiques, tout en augmentant l'efficacité du traitement et en limitant la durée de l'aplasie post-thérapeutique.
La présente invention porte donc, en premier lieu, sur l'utilisation d'un agoniste du récepteur H4 de l'histamine, pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée à protéger les progéniteurs hématopoïétiqυes contre les effets toxiques de médicaments actifs sur les cellules en prolifération utilisés en chimiothérapie antitumorale.
Un agoniste du récepteur H4 de l'histamine selon la présente invention est de préférence spécifique dudit récepteur. Par "agoniste spécifique du récepteur H4 de l'histamine", on entend un produit ayant une activité agoniste du récepteur H4 de l'histamine prépondérante par rapport à une ou d'éventuelle(s) autre(s) activité(s) dudit agoniste (par exemple une activité agoniste ou antagoniste du récepteur Hl, H2 ou H3 de l'histamine). La spécificité d'un agoniste pour le récepteur H4 est bien entendu fonction des doses auxquelles il est utilisé. En effet, un agoniste du récepteur H4 de l'histamine peut avoir une activité (agoniste, antagoniste ou autre) sur un récepteur de l'histamine qui n'est pas le récepteur H4 (i.e., Hl, H2 ou H3) ; toutefois, son activité agoniste du récepteur H4 de l'histamine doit être prépondérante à une dose (ou concentration) donnée par rapport à son activité sur un autre récepteur de l'histamine.
De préférence, lorsqu'un agoniste du récepteur H4 de l'histamine selon la présente invention présente aussi une activité agoniste du récepteur H2, cet agoniste est utilisé à une dose n'induisant pas d'activité agoniste du récepteur H2. L'expression "à une dose n'induisant pas d'activité agoniste du récepteur H2", signifie la dose (ou concentration) à laquelle l'activité agoniste du récepteur H4 de l'histamine d'un composé est prépondérante par rapport à son activité agoniste du récepteur H2. La détermination de cette dose peut s'effectuer par des techniques connues de l'Hommes du métier, telles que par exemple par la méthode in vitro décrite ci-dessous pour l'identification d'un agoniste du récepteur H4 de l'histamine ne présentant pas d'activité agoniste du récepteur H2 de l'histamine. En effet, le récepteur H2 de Fhistamine est exprimé par les cellules souches hématopoïétiques (CFU-S) (Byron, 1977). L'administration in vivo d'un agoniste du récepteur H4 qui aurait aussi une activité agoniste du récepteur H2 aurait pour effet, d'initier la mise en cycle cellulaire de ces cellules, et de favoriser leur prolifération. Par "activité agoniste sur le récepteur H2 de l'histamine" on entend une activité agoniste significative sur le récepteur H2 de l'histamine, se traduisant notamment par l'initiation de la mise en cycle cellulaire des cellules exprimant le récepteur H2 de l'histamine.
De préférence encore, l'agoniste du récepteur H4 de l'histamine n'a pas d'activité agoniste sur le récepteur H2 de l'histamine.
L'identification d'un agoniste du récepteur H4 ne présentant pas d'activité agoniste du récepteur H2 de l'histamine peut s'effectuer par des techniques connues de l'Homme du métier ; par exemple par la méthode in vitro comprenant les étapes suivantes : a) sous-clonage séparément de l'ADNc codant les récepteurs H2 et H4 dans deux vecteurs d'expression appropriés, b) transfection d'une lignée cellulaire appropriée n'exprimant pas les récepteurs H2 et H4 par l'un des vecteurs obtenus lors de l'étape b) (par exemple en utilisant la lipofectamine), c) sélection des cellules transfectées de manière permanente (par exemple en sélectionnant les cellules résistantes à un antibiotique dont le gène a aussi été clone dans ledit vecteur), d) dosage de l'AMPc (adénosine monophosphate-3', 5' cyclique) intracellulaire lors de tests d'activation des récepteurs :
- dans les cellules exprimant uniquement le récepteur H2 de l'histamine, la concentration intracellulaire d'AMPc augmente en réponse à une stimulation du récepteur H2 par un agoniste de H2R (voir pour revue Del Valle and Gantz, 1997) et par conséquent, un agoniste du récepteur H4 de l'histamine n'induira pas une augmentation de la concentration intracellulaire d'AMPc,
- dans les cellules exprimant uniquement le récepteur H4 de l'histamine, la concentration intracellulaire d'AMPc diminue en réponse à une stimulation du récepteur H4 par un agoniste de H4R, e) optionnellement, détermination de la dose (ou concentration) à laquelle l' agoniste présente une activité agoniste du récepteur H2 et/ou H4.
Parmi les agonistes du récepteur H4 de l'histamine, on peut citer par exemple :
- le clobenpropit, qui a l'avantage d'être dépourvu d'effet sur le récepteur H2 et d'être facilement soluble dans les milieux physiologiques. Ce dernier a été conçu initialement comme un antagoniste du récepteur H3 de l'histamine, qui était à ce moment-là sa seule cible pharmacologique connue. Par conséquent, il n'est pas complètement spécifique du récepteur H4, ce qui pourrait compliquer son administration in vivo, car il faudrait tenir compte d'éventuels effets secondaires occasionnés par sa liaison au récepteur H3, même si ce récepteur n'est pas exprimé dans la moelle osseuse ; - la 4-méthylhistamine (Lim et al., 2005) qui est un agoniste non spécifique du récepteur H4 puisqu'il présente aussi une activité agoniste du récepteur H2 ; toutefois, dans la mesure où il existe un facteur 100 entre la dose induisant une activité agoniste du récepteur H2 et la dose induisant une activité agoniste du récepteur H4, ce produit pourrait être mis en œuvre s'il était formulé de manière à obtenir principalement l'expression de son activité d'agoniste du récepteur H4.
- le composé VUF 8430 (S-(2-guanidyléthyl)-isothiourea) (Lim et al., 2006), la (-)-2-Cyano-l-méthyl-3-{(2Λ,5J?)-5- [lH-imidazol-4(5)-yl]tétrahydrofuran-2- yl}méthylguanidine (Ηashimoto et al., 2003), l'imbutamine, l'immepip, la clozapine ou POUP-16 (Zhang et al., 2006) à une dose n'induisant pas d'activité agoniste du récepteur Η2. Par "médicaments actifs sur les cellules en prolifération utilisés en chimiothérapie antitumorale", on entend essentiellement les agents antinéoplasiques utilisés en chimiothérapie. Ces agents se divisent en plusieurs classes suivant leur mécanisme d'action. On peut notamment citer :
• les alkylants dont les principaux agents sont le cyclophosphamide, le melphalan, le chloraminophène, les nitroso-urées, le busulfan. Us possèdent un ou plusieurs radicaux électrophiles qui se lient aux régions riches en électrons des bases puriques et pyrimidiques de I1ADN5 ayant pour conséquence la création de cassures, de mutations ou de liaisons anormales entre les brins d'ADN.
• les antimétabolites dont le méthotrexate (qui inhibe la synthèse de la thymidine), le 5-fluorouracile (précurseur du 5-FdUMP qui inhibe la thymidilate synthétase et précurseur du FUTP qui s'incorpore dans l'ARN et inhibe ses fonctions) et le cytosine arabinoside (précurseur de l'ARA-CTP qui inhibe l'ADN polymérase).
• les poisons du fuseau mitotique dont les principaux agents sont le docetaxel, la vincristine, la vinblastine, la vindésine, et la navelbine. Ils inhibent la polymérisation de la tubuline, principale protéine du fuseau mitotique. « les inhibiteurs de la topo-isomérase 2 dont le vépéside et le téniposide.
La topoisomérase 2 assure la relaxation de l'hélice d'ADN au cours de sa synthèse, de sa traduction en ARN ou de sa réparation.
• les intercalants dont les principaux agents sont la doxorubicine et d'autres anthracyclines, le mitoxantrone et l'actinomycine D. Ils s'intercalent dans la molécule d'ADN en perturbant sa structure, sa réplication et sa traduction en ARN. Us inhibent l'ADN polymérase et la topoisomérase 2.
• les agents divers. La bléomycine provoque des cassures de l'ADN. La mitomycine C est un alkylant et un intercalant. Le cisplatine est un alkylant bifonctionnel créant des liaisons entre les brins d'ADN. L'asparaginase détruit un acide aminé, l'asparagine, qui est nécessaire au métabolisme des lymphoblastes.
Comme montré dans la partie expérimentale ci-dessous, l'effet protecteur vis-à-vis des progéniteurs hématopoïétiques est dû au fait que l'agoniste du récepteur histaminergique H4 bloque leur cycle cellulaire en phase G0/G1, empêchant ainsi leur prolifération. Son action protectrice s'exercera donc a priori quel que soit le type d'agent antinéoplasique utilisé pour la chimiothérapie. En particulier, cet effet a été démontré in vivo au cours d'un traitement par le cyclophosphamide et le 5-fluorouracil (5-FU) et in vitro par le docetaxel.
La présente invention est particulièrement utile pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée à être administrée à des patients atteints de tumeurs solides, notamment lorsqu'ils sont soumis à un traitement par le cyclophosphamide, le 5-FU, et/ou le docetaxel. L'agoniste du récepteur H4 utilisé selon l'invention peut être employé, par exemple, à une concentration comprise entre 5 mg/kg et 60 mg/kg, de préférence entre 10 mg/kg et 30 mg/kg par dose.
La composition pharmaceutique préparée selon l'invention a été administrée par injection intra-péritonéale chez la souris, mais elle peut avantageusement être formulée pour une administration par injection intraveineuse ou par voie orale.
La présente invention porte également sur une méthode de traitement du cancer, en particulier des tumeurs solides, comprenant l'administration d'un agoniste du récepteur H4 de l'histamine préalablement et/ou simultanément à l'administration d'un agent chimiothérapeutique. Bien entendu, les spécifications décrites plus haut s'appliquent également à cet aspect de l'invention. La séquence d'administration des produits est définie par le clinicien. A titre d'exemple non limitatif, on peut citer la séquence suivante : deux injections ou prises orales de l'agoniste à J-I, une autre 4 h avant la chimiothérapie et une dernière à Jl . Un autre aspect de l'invention est un médicament de support comprenant, à titre de principe actif, un agoniste du récepteur H4 de l'histamine. Par "médicament de support", on entend ici un médicament qui est habituellement administré conjointement avec un autre médicament, afin d'en atténuer les effets secondaires.
Un autre médicament objet de la présente invention est un médicament anticancéreux qui comporte une association d'au moins une molécule choisie parmi les agents antinéoplasiques utilisables en chimiothérapie, et d'un agoniste du récepteur H4 de l'histamine. A titre d'exemples non limitatifs d'agents antinéoplasiques qui peuvent faire partie d'un médicament selon cet aspect de l'invention, on peut citer le cyclophosphamide, le 5-FU, et le docetaxel. L'agoniste du récepteur H4 de l'histamine présent dans un médicament selon l'invention (médicament de support ou anticancéreux) peut être le clobenpropit (drogue utilisée jusqu'à présent en expérimentation animale exclusivement), qui n'a pas d'activité agoniste du récepteur H2 de l'histamine. De façon préférée, on utilisera un agoniste plus spécifique du récepteur H4 à une dose n'induisant pas d'activité agoniste du récepteur H2 tel que par exemple, le VUF 8430, la (-)-2-Cyano-l-méthyl-3-{(27?,5i?)-5- [lH-imidazol-4(5)- yl]tétrahydrofuran-2-y]}rnéthylguanidine, l'imbutamine, l'immepip, la clozapine ou l'OUP- 16.
Bien entendu, un cocktail de plusieurs agonistes différents, incluant ou non le clobenpropit et/ou l'imetit et/ou la 4-méthylhistamine et/ou le VUF 8430 et/ou la (-)-2- Cyano-l-méthyl-3-{(2i?,57?)-5- [lH-imidazol-4(5)-yl]tétrahydrofuran-2-yl}méthylguanidine et/ou l'imbutamine et/ou l'immepip et/ou Ia clozapine et/ou l'OUP-16, à une dose n'induisant pas d'activité agoniste du récepteur H2, peut également être introduit dans un médicament selon l'invention.
Dans un médicament anticancéreux selon l'invention, l'agent antinéoplasique et l'agoniste du récepteur H4 de l'histamine peuvent être présents sous forme d'un mélange ou, de façon préférée, dans deux formulations séparées. Ces deux formulations séparées peuvent être destinées à être mélangées de façon extemporanée avant l'administration. Elles peuvent également être destinées soit à une administration séquentielle, soit à une administration simultanée, mais par des voies différentes.
La présente invention a donc aussi pour objet des produits contenant au moins un agoniste du récepteur H4 de l'histamine qui n'a, de préférence, pas d'activité agoniste du récepteur H2 de l'histamine, et d'un médicament actif sur les cellules en prolifération utilisé en chimiothérapie antitumorale, en tant que préparation combinée pour utilisation simultanée, séparée ou étalée dans le temps, pour protéger les progéniteurs hématopoïétiques contre les effets toxiques dudit médicament. La présente invention a également pour objet une méthode de criblage d'un produit (par exemple un agoniste de H4R) susceptible d'empêcher les progéniteurs hématopoïétiques d'entrer en cycle cellulaire comprenant les étapes suivantes : i) obtention d'une cellule de mammifère exprimant le récepteur H4 de l'histamine, ladite cellule n'exprimant pas naturellement ledit récepteur (une telle cellule peut être obtenue en réalisant les étapes a) à c) décrites ci-dessus relatives à l'identification d'un agoniste spécifique du récepteur H4), ii) mise en contact d'un produit à cribler avec la cellule obtenue à l'étape i), et iii) mesure de la concentration intracellulaire d'AMPc (la concentration diminue en réponse à une stimulation du récepteur H4 par un agoniste de H4R) et / ou détection de la mise en cycle cellulaire de ladite cellule.
Selon un mode de mise en œuvre préféré, cette méthode permet de cribler un produit (par exemple un agoniste de H4R) pour protéger les progéniteurs hématopoïétiques contre les effets toxiques de médicaments actifs sur les cellules en prolifération utilisés en chimiothérapie antitumorale.
Outre les dispositions qui précèdent, l'invention comprend encore d'autres dispositions, qui ressortiront des exemples expérimentaux ci-dessous, et des figures annexées.
Figure 1 : Effet inhibiteur du clobenpropit (CB) et de l'imetit sur la formation des colonies en méthylcellulose. Essai clonogénique en méthylcellulose (CFU-C) avec PIL-3 comme seul facteur de croissance pendant 7 jours de culture, avec ou sans CB (10" 5 à 10"7M). Figure 2 : Le clobenpropit n'induit pas l'apoptose des progéniteurs hématopoïétiques de la moelle osseuse. L'apoptose a été mesurée par un marquage à l'annexine V-FlTC qui reconnaît les résidus phosphatidylserine exposés sur les membranes des cellules en apoptose (panneau A). Le pourcentage de cellules mortes est ensuite déterminé par une coloration avec l'iodure de propidium, qui pénètre dans les cellules dont la membrane est endommagée (panneau B). L'expérience a été réalisée avec des populations médullaires enrichies en cellules indifférenciées (Lin) cultivées pendant 72 h avec un cocktail de facteurs de croissance (IL-3, IL-6, SCF).
Figure 3 : Le CB augmente le pourcentage de cellules de moelle osseuse Lin" c-kit+ en phase G0/G1. Des cellules Lin" de moelle osseuse ont été incubées pendant 3 jours en milieu StemSpan (milieu sans sérum, StemCell Technologies), additionné de facteurs de croissance (IL-3, 1L-6, SCF). Après coloration avec l'iodure de propidium, le contenu en ADN de ces cellules a été analysé (* p = 0.013 ; **p = 0.004; n = 7 ; Test Mann-Whitney).
Figure 4 : Le CB inhibe la prolifération des cellules de moelle osseuse Lin" c-kit+ induite par les facteurs de croissance. Des cellules de moelle osseuse Lin" ont été incubées pendant 3 jours en milieu StemSpan (StemCell Technologies), additionné de facteurs de croissance (IL-3, IL-6, SCF), en présence de CFSE (to). La fluorescence des cellules Lin" c-kit+ a été analysée.
Figure 5 : Le CB maintient l'expression de c-kit dans les cellules de moelle osseuse Lin' en inhibant la prolifération/différenciation induite par les facteurs de croissance. Des cellules de moelle osseuse Lin" ont été incubées pendant 3 jours en milieu StemSpan (StemCell Technologies), additionné de facteurs de croissance (IL-3, IL-6, SCF), en présence ou non de CB et d'un antagoniste du récepteur H4.
Figure 6 : Le blocage du cycle cellulaire par Ie CB est réversible. Les cellules ont été incubées pendant 72h dans le cocktail de facteurs de croissance avec ou sans CB. Elles ont ensuite été lavées et restimulées pendant 24h avec les facteurs de croissance, avant d'analyser leur distribution dans le cycle cellulaire.
Figure 7 : Le CB inhibe l'expression de la cycline D3 au niveau protéique. Les cellules ont été incubées pendant 24h dans le cocktail de facteurs de croissance avec ou sans CB avant marquage avec un anticorps anti-cycline D3 conjugué au FITC et coloration de F ADN au iodure de propidium.
Figure 8 : Le CB inhibe Ia prolifération de plusieurs sous-populations de progéniteurs myéloïdes, allant du CFU-Mix au BFU-E. Test HALO-Hemogenix : essai de viabilité cellulaire par luminescence (ATP/luciférine) après 5 jours de culture en présence de différents cocktails de facteurs de croissance avec ou sans CB. Figure 9 : Le CB inhibe Ia formation de colonies de progéniteurs lymphoïdes communs (CLP). Des cellules de moelle osseuse ont été cultivées en méthylcellulose additionnée d'IL-7 humaine recombinante (10 ng/ml), de SCF murin recombinant (100 ng/ml) et de Flt-3L murin recombinant (20 ng/ml). Les colonies ont été comptées au jour 7.
Figure 10 : Inhibition de CFU-C par l'histamine. Les cellules de moelle osseuses Lin" ont été prétraitées pendant 24h en milieu StemSpan additionné d'IL-3 avec différentes doses d'histamine, avant de les planter en méthylcellulose avec de l'IL-3 pendant 7- jours. Deux expériences séparées sont représentées. Figure 11 : Schéma du protocole pour évaluer in vivo l'effet protecteur du CB contre la myéloablation induite par le cyclophosphamide.
Figure 12 : Le traitement in vivo au CB protège les CFU-C médullaires et accélère la reconstitution hématopoïétique périphérique. Les traitements avec le CB et le cyclophosphamide ont été effectués selon le protocole ci-dessus. A J2 et J5 les cellules de moelle osseuse et de rate, respectivement, ont été évaluées pour leur contenu en progéniteurs hématopoïétiques dans les différentes conditions expérimentales.
Figure 13 : Le CB protège les progéniteurs Scal+ c-kit+ dans la moelle osseuse et augmente leur fréquence dans la rate. La fréquence des cellules primitives identifiées par l'expression simultanée de Seal et c-kit a été déterminée, respectivement, 2 et 5 jours après le traitement dans la moelle osseuse et dans la rate. Le protocole est celui représenté dans la Fig. 1 1.
Figure 14 : Le CB ne protège pas les granulocytes matures de la moelle osseuse (caractérisés par l'expression concomitante de CDllb/Grl) contre la cytotoxicité du cyclophosphamide. Le protocole est celui de la Fig. 11. Figure 15 : In vivo, le CB inhibe l'entrée des cellules Lin" de la moelle osseuse dans le cycle cellulaire. 30 mg/kg de CB ont été injectés aux souris 48h, 24h et 4h avant le sacrifice.
Figure 16 : Le CB exerce une protection partielle contre la diminution des la formation des CFU-C induite par Ie docetaxel. Des cellules de moelle osseuse ont été incubées pendant 24h avec ou sans CB en présence d'IL-3, avant traitement par le docetaxel à différentes concentrations, pendant 30 minutes. Les cellules ont ensuite été lavées et évaluées pour leur capacité à former des colonies en réponse à P1L-3.
Figure 17 : Le CB inhibe la formation des colonies à partir de cellules humaines CD34+ dans une culture de 14 jours en méthylcellulose en présence d'IL-3. Les cellules CD34+ont été purifiées à partir de sang de cordon et ensemencées en méthylcellulose à une concentration de 1000 cellules par ml. Figure 18 : Le CB inhibe la prolifération des précurseurs hématopoïétiques CD34+ induite par I'IL-3. Les cellules ont été cultivées pendant 6 jours dans un milieu StemSpan complémenté avec 10 ng/ml d'lL-3 humaine recombinante, en partant d'une concentration de 105 cellules/ml. Figure 19 : Le CB maintient l'expression de CD34 sur les précurseurs hématopoïétiques. Des cellules CD34+ purifiées à partir de sang de cordon ombilical, ont été cultivées pendant 6 jours avec 10 ng/ml d'lL-3, avec ou sans CB. Les cellules ont été marquées ensuite avec un anticorps anti-CD34.
Figure 20 : Le récepteur H4 est impliqué dans l'effet inhibiteur du clobenpropit sur le cycle cellulaire des_cellules de moelle osseuse.
Figure 21 : Le récepteur H4 est impliqué dans l'effet inhibiteur de l'histamine sur Ia mise en cycle des CFU-C. EXEMPLES Matériels et méthodes Tests clonogéniques
La fréquence de différents types de progéniteurs dans la moelle osseuse et la rate des souris témoins ou au cours d'une chimiothérapie avec ou sans injection de CB a été déterminée dans le test classique en méthylcellulose (StemCell Technologies), soit en réponse à l'IL-3 seule, soit en présence d'un cocktail de facteurs de croissance. Dans certaines expériences, une technique développée par HémoGenix et basée sur des mesures de luminescence dans un système ATP/luciférine a été utilisée selon les recommandations du fabricant. En fonction de la composition du cocktail de facteurs de croissance, différentes sous-populations de progéniteurs peuvent ainsi être quantifiées après 7 jours de culture en methylcellulose classique et après 5 jours de culture dans le test HémoGenix. Pour les expériences in vitro, l'effet des ligands du H4R a été évalué soit au cours de la culture en milieu semi-solide, soit après une préincubation avec les drogues pendant 24 h. La concentration des cellules hématopoïétiques mises en culture dépend de la fréquence estimée en progéniteurs hématopoïétiques et peut aller de 1000 à 106 cellules/ml. Une méthylcellulose adaptée aux cellules humaines (StemCell Technologies) a été utilisée pour les expériences avec les progéniteurs CD34+ humains purifiés à partir de sang ombilical par sélection magnétique positive selon le procédé commercialisé par Miltenyi.
Préparation de populations médullaires enrichies en progéniteurs hématopoiétiques Les cellules de moelle osseuse sont incubées avec un cocktail d'anticorps (StemCell Technologies) contre les antigènes de surface spécifiques de lignées matures (CD5, CD45R, CDl Ib5 TERl 19, Ly-6G, 7-4) dans le PBS, 2% SVF, 1 mM EDTA à 10scellules/ml pendant 20 min, soit manuellement, soit automatiquement par le RoboSep de StemCell Technologies. Les cellules positives sont ensuite éliminées en utilisant la technique SpinSep après couplage avec des particules denses ou la sélection magnétique avec le RoboSep, respectivement. Analyse du cycle cellulaire des progéniteurs hématopoïétiques
Les populations enrichies en progéniteurs hématopoïétiques sont incubées pendant 1-3 jour(s) avec un cocktail de facteurs de croissance (rmIL-3 10 ng/ml, rhIL-6 10 ng/ml, rmSCF 50 ng/ml) dans le milieu StemSpan sans sérum avec ou sans CB, en présence ou absence d'un antagoniste du H4R. Les cellules sont ensuite colorées à l'iodure de propidium (PI) pour l'analyse du cycle selon le protocole suivant:
- Marquage avec CDl 17-FITC (2 x 10δcellules/ml pendant 20 min) dans le PBS - Lavage dans PBS
- Fixation dans le PBS 1% formaldéhyde sans méthanol à 4°C pendant 5 min
- Lavage dans PBS
- 1 ml de PI/TritonXIOO + RNAse A sans DNAse (0,2 microg/ml), PI (20 microg/ml) dans le PBS pendant 30 min à température ambiante - Analyse au FACS (FL2-area/FL2-width pour l'analyse du cycle et FLl pour le marquage de surface Coloration au CFSE
- Incuber 106 cellules enrichies en progéniteurs hématopoïétiques dans 2 ml de CFSE 5 mM dans le PBS pendant 10 min à 37 0C - Arrêter la réaction par l'addition de PBS froid en excès (5x) et centrifuger 5 min à 1700 rpm
- Resuspendre les cellules dans le milieu StemSpan sans sérum et stimuler avec le cocktail de facteurs de croissance
- Analyser au FACS (FLl) après 72 h de culture Traitement in vitro au docetaxel Les cellules de moelle osseuse totales sont incubées pendant 24 h dans le milieu StemSpan en présence d'IL-3 (1 ng/ml) Le docetaxel est ensuite ajouté à des concentrations allant de 106 à 10s pendant 30 min. Après lavage, les cellules sont ensemencées en méthylcellulose et la fréquence des CFU-C est évaluée après 7 jours de culture en IL-3 Exemple 1 : Le clobenpropit inhibe la prolifération des CFU-C en les bloquant en phase G0/G1 du cycle cellulaire
Le récepteur H4R est exprimé quasi-exclusivement dans la moelle osseuse (Liu et al., 2001a). Les inventeurs ont donc tiré parti du fait que certaines drogues initialement caractérisées comme antagonistes du récepteur H3 reconnaissent également le type H4, pour tester leur effet sur les progéniteurs hématopoïétiques qui forment de colonies en méthylcellulose. La figure 1 montre que le clobenpropit (CB), qui se comporte comme un agoniste du H4R, exerce un effet inhibiteur significatif sur la formation des colonies en méthylcellulose (entre 10" -10"7 M), au cours de 7 jours de culture avec P1L-3 comme seul facteur de croissance. L'imetit, un agoniste des récepteurs H3 et H4 de l'histamine (Ling et al., 2004; Liu et al., 2001b), inhibe aussi la formation des colonies, à un degré moindre. En revanche, les antagonistes du récepteur H3 qui ne reconnaissent pas le type H4 ne partagent pas cet effet
Des résultats similaires ont été obtenus en prétraitant les cellules de moelle osseuse uniquement avec le CB aux mêmes doses pendant 24 h avant la culture en méthylcellulose. On observe une inhibition semblable quand le test clonogénique est réalisé en présence d'un cocktail de facteurs de croissance plutôt qu'en IL-3 seule (résultats non montrés).
Exemple 2 ; Confirmation de l'implication spécifique du récepteur H4 dans l'effet inhibiteur du clobenpropit
Pour prouver que l'effet inhibiteur du clobenpropit impliquait spécifiquement le récepteur H4, le produit JNJ7777120 (disponible commercialement chez TOCRIS, Ellisville, USA), un antagoniste hautement spécifique (Jablonowski et al., 2003; Thurmond et al., 2004), développé par Johnson & Johnson et fourni par UCB-Pharma, a été utilisé.
Les CFU-C (10"6/ml) ont été exposées au produit JNJ7777120 (10"5 M) 10 minutes avant l'addition de clobenpropit (10~5 M) et ensemencées dans le milieu MethoCult supplémenté avec 1 ng/ml d'IL3. Après 7 jours de culture, ce produit (noté ici JNJ) inhibe totalement l'effet du CB alors qu'il n'a pas d'effet en tant que tel (figure 20). Exemple 3 ; Analyse de l'effet du clobenpropit sur le cycle cellulaire des progéniteurs hématopoïétiques
Le CB n'est pas toxique pour les progéniteurs hématopoïétiques de la moelle osseuse comme l'atteste l'absence d'apoptose (évaluée par l'expression de phosphatidylserine membranaire révélée par l'Annexine V-FITC) dans les populations enrichies en cellules indifférenciées (Lin") cultivées pendant 72 h dans un cocktail de facteurs de croissance (IL-3, IL-6, SCF) (figure 2).
Pour expliquer l'inhibition de la formation de colonies en méthylcellulose, les inventeurs ont fait l'hypothèse que l'activation du H4R sur les progéniteurs hématopoïétiques par son agoniste affectait leur cycle cellulaire. Pour vérifier cette hypothèse, les deux techniques classiques pour déterminer le pourcentage de cellules en cycle ont été utilisées. Ces techniques consistent en un traitement à l'hydoxy-urée ou la thymidine tritiée, qui toutes les deux tuent les cellules qui prolifèrent. Il s'est avéré qu'une préincubation des cellules médullaires avec le CB (10"5 M, pendant 24 h en présence d'IL-3) réduisait sensiblement le pourcentage des CFU-C en cycle (résultats non montrés). Pour confirmer ce résultat, une méthode cytométrique permettant de déterminer les différentes phases du cycle cellulaire par leur contenu en ADN mesuré par l'intensité de fluorescence en iodure de propidium (Pl) a été utilisée. Etant donné que les CFU-C sont très minoritaires dans la moelle osseuse, l'incorporation du PI dans l'ADN a été associée avec un marquage membranaire de c-kit, qui est exprimé sur les cellules immatures préalablement enrichies par élimination de la population mature. Comme le montre la figure 3, le CB augmente nettement le pourcentage des cellules Lin" c-kit+ en phase G0/G1 et diminue d'autant la phase G2/M, après trois jours de culture en présence d'un cocktail de facteurs de croissance. Cet effet est également mis en évidence par une technique qui permet de tracer les cellules en division par le carboxyfluorescein diacetate, succinimidyl ester (CFSE), un colorant fluorescent qui s'incorpore dans les cellules et dont l'intensité de fluorescence diminue à fur et à mesure qu'elles se divisent. Comme l'illustre la figure 4, le nombre de divisions effectuées par les cellules Lin"c-kit+ est clairement diminué par l'agoniste du H4R. De même, le clobenpropit augmente le nombre de cellules c-kit+ présentes après 3 jours d'incubation de cellules Lin" avec un cocktail de facteurs de croissance (figure 5), ce qui reflète un blocage de la différenciation cellulaire. L'inhibition de la progression du cycle cellulaire est également étayée par des critères morphologiques, les populations générées en présence de CB contenant davantage de cellules immatures que celles incubées avec de l'IL-3 seule. La figure 6 montre que cet effet inhibiteur est réversible, puisqu'il tend à disparaître après 24h d'incubation suivant l'élimination du CB du milieu de culture.
Une analyse détaillée des modifications de l'expression des gènes impliqués dans le cycle cellulaire, en réponse au CB, a été effectuée en utilisant une puce à ADN et des oligonucléotides permettant de mettre en évidence une centaine de gènes impliqués dans le cycle cellulaire (SuperArray, Inc.). Ces expériences ont été réalisées avec de l'ARNm de cellules BMC Lin" fraîchement isolées, ou après 24h d'incubation avec des facteurs de croissance, en présence ou en absence de CB. Le traitement des progéniteurs hématopoïétiques avec le cocktail de facteurs de croissance induit l'expression de la plupart des transcrits codant pour des protéines du cycle, tandis que le CB la réduit d'une manière drastique. Bien que la diminution de l'expression de l'ARNm de la cycline D3 soit moins marquée que celle d'autres transcrits, le niveau d'expression de cette protéine, particulièrement importante dans l'initiation de la phase S du cycle cellulaire, a été analysé par FACS5 en utilisant un anticorps fluorescent. Il a ainsi été montré que l'augmentation de la cycline D3 induite dans les cellules Lin" c-kit+ par le cocktail de facteurs de croissance dans la phase G0/G1 du cycle était clairement moindre quand le CB était présent au cours des 24 h d'incubation (figure 7). Exemple 4 ; Evaluation de l'effet anti-prolifératif du clobenpropit sur des lignées particulières de progéniteurs
Les inventeurs ont cherché à savoir si le clobenpropit affectait préférentiellement la prolifération de certains types de progéniteurs hématopoïétiques. Pour cela, un essai clonogénique récemment développé par Hemogenix a été utilisé. Le kit HALO- Hemogenix, contrairement aux essais clonogéniques standards, mesure la prolifération (plutôt que la différentiation) de sous-populations distinctes de progéniteurs, en réponse à différents cocktails de facteurs de croissance. Dans ce cas, les colonies ne sont plus comptées en microscopie optique, mais la prolifération est mesurée après 5 jours de culture par un dosage d'ATP en chimioluminescence. Grâce à l'utilisation de cocktails de facteurs de croissance appropriés fournis par le fabricant, ce procédé a permis de conclure que le CB ne ciblait pas spécifiquement une sous-population particulière de progéniteurs, mais affectait les CFU- GEMM, CFU-GM et BFU-E de la même façon (figure 8).
De plus, comme montré dans la figure 9, le CB inhibe la formation de colonies lymphoïdes, évaluée en méthylcellulose supplémentée avec de FIL-7, du SCF et du FIt-L (essai classique pour les progéniteurs lymphoïdes).
En conclusion, ces résultats indiquent que l'agoniste du H4R cible une gande variété de progéniteurs ayant des potentiels de différenciation distincts. Exemple 5 : Evaluation de l'histamine pour sa capacité d'inhiber la mise en cycle des CFU-C en réponse à l'IL-3, par l'intermédiaire du récepteur H4
Comme montré dans la figure 10, une inhibition des CFU-C similaire à celle obtenue avec du CB a été observée lorsque des cellules de moelle osseuse enrichies en progéniteurs ont été pré-incubées avec de l'histamine, dans un milieu dépourvu de sérum
(pour éviter sa dégradation par l'histaminase présente dans le SVF). Cette observation apporte un argument supplémentaire en faveur de l'implication du H4R dans cette activité biologique.
Ce résultat est confirmé par le fait que l'effet inhibiteur de l'histamine (10"5 M) a été annulé lorsque les cellules ont été prétraitées avec l'antagoniste spécifique du récepteur H4, JNJ7777120 (K)"5 M) (figure 21).
Exemple 6 : in vivo, le clobenpropit protège les souris contre l'effet hématotoxique du cyclophosphamide
L'administration de clobenpropit avant et au cours d'un traitement chimiothérapeutique, selon le protocole expérimenta] résumé dans la figure 1 1, protège les CFU-C contre l'effet myéloablatif du cyclophosphamide et aboutit à une reconstitution hématopoïétique plus rapide. Les résultats de trois expériences réalisées dans ces conditions sont présentés dans la figure 12. Ils montrent d'une part que deux jours après injection i.p. de cyclophosphamide, le nombre de CFU-C était significativement plus élevé dans la moelle osseuse des souris ayant reçu le clobenpropit que dans les témoins. D'autre part, la reconstitution extramédullaire 5 jours après le début du traitement était plus importante dans la rate des souris ayant reçu du CB. Pour expliquer ce dernier point, on peut imaginer qu'en plus de leur effet protecteur vis-à-vis des progéniteurs hématopoïétiques dans la moelle osseuse, les agonistes du récepteur H4 exerceraient aussi un effet chimiotactique sur les progéniteurs, qui les mobiliseraient en plus grand nombre et contribuerait ainsi à la reconstitution extramédullaire. Cette hypothèse fait l'objet d'une investigation par un essai en chambre de Boyden.
L'analyse phénotypique de l'expression conjointe de Seal et c-kit, qui identifie les cellules souches dans la moelle osseuse et la rate, donne des résultats cohérents avec l'effet protecteur du CB sur les progéniteurs hématopoïétiques et leur mobilisation accrue vers la rate, puisque l'expression de ces antigènes est augmentée dans les deux organes après traitement au CB. Ces résultats sont résumés dans la figure 13. 11 apparaît au contraire que les granulocytes matures Macl+/Grl+ ne sont pas protégés de la myélotoxicité du cyclophosphamide (figure 14).
L'arrêt du cycle cellulaire des progéniteurs hématopoïétiques, observé in vitro en réponse au CB, a également été étudié in vivo. Pour assurer un effet optimal du traitement, la dose a été augmentée à 30 mg/kg deux fois par jour (j°ur -2, jour -1 , et 4h avant le sacrifice). Aucun effet secondaire n'a été observé. En revanche, une augmentation du pourcentage de cellules en G0/G1, similaire à celle observée in vitro, a été mise en évidence (figure 15).
Exemple 7 : Evaluation de l'effet protecteur du clobenpropit contre l'effet hématotoxique du docetaxel
Contrairement au cyclophosphamide, le docetaxel est actif in vitro, ce qui a permis de tester in vitro l'effet myéloprotecteur du CB contre cette drogue. Les résultats obtenus, présentés dans la figure 16, montrent une protection partielle des CFU-C contre la cytotoxicité du docetaxel.
Exemple 8 : Le CB inhibe les CFU-C humains et diminue la prolifération des cellules CD34+ Les expériences réalisées sur les cellules humaines CD34+, purifiées à partir de sang de cordon ou de cytaphérèse, donnent des résultats similaires à ceux obtenus chez la souris. En effet, on observe une diminution du nombre de colonies formées à partir de cellules CD34+ en méthylcellulose en réponse à un cocktail de facteurs de croissance (SCF + IL-6 + IL-3) en présence de CB (figure 17) ainsi qu'une inhibition de leur prolifération en milieu liquide (figure 18). Dans les deux cas, l'antagoniste du H4R JNJ abolit l'effet. Des données préliminaires, montrant le maintien d'une population immature identifiée par l'expression de CD34 en présence de CB (figure 19), alors que les cellules témoin se différencient, indiquent que cet effet serait également dû à un blocage du cycle cellulaire dont le mécanisme exact reste à préciser.
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Claims

REVENDICATIONS
1. Utilisation d'un agoniste du récepteur H4 de l'histamine, pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée à protéger les progéniteurs hématopoïétiques contre les effets toxiques de médicaments actifs sur les cellules en prolifération utilisés en chimiothérapie antitumorale.
2. Utilisation selon la revendication 1, pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée à être administrée à des patients atteints de tumeurs solides.
3. Utilisation selon la revendication 1 ou la revendication 2, pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée à être administrée à des patients traités par le cyclophosphamide, le 5-FU, le docetaxel ou d'autres drogues anti -cancéreuses.
4. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que ledit agoniste du récepteur H4 de l'histamine est le clobenpropit.
5. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que ledit agoniste du récepteur H4 de l'histamine est un agoniste spécifique de ce récepteur.
6. Utilisation selon la revendication 5, caractérisée en ce que ledit agoniste spécifique du récepteur H4 de l'histamine est utilisé à une dose n'induisant pas d'activité agoniste du récepteur H2 de l'histamine.
7. Utilisation selon la revendication 6, caractérisée en ce que ledit agoniste spécifique du récepteur H4 de l'histamine est le VUF 8430, la (-)-2-Cyano-l-méthyl-3- {(2i?,5i?)-5- [lH-imidazol-4(5)-yl]tétrahydrofuran-2-yl}méthylguanidine, l 'imbutamine, l'immepip, la clozapine, l'OUP-16 ou la 4-méthylhi staminé.
8. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisée en ce que l'agoniste du récepteur Η4 est utilisé à une concentration comprise entre 5 mg/kg et
60 mg/kg, de préférence entre 10 mg/kg et 30 mg/kg par dose.
9. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisée en ce que la composition pharmaceutique est administrable par injection intra-péritonéale, intraveineuse, ou par voie orale.
10. Médicament anticancéreux, caractérisé en ce qu'il comporte une association d'au moins une molécule choisie parmi les agents antinéoplasiques, et au moins un agoniste du récepteur H4 de l'histamine à une dose n'induisant pas d'activité agoniste du récepteur H2 de l'histamine.
1 1. Médicament selon la revendication 10, caractérisé en ce qu'il comporte une association d'au moins une molécule choisie parmi le cyclophosphamide, le 5-FU, et le docetaxel, et au moins un agoniste du récepteur H4 de l'histamine à une dose n'induisant pas d'activité agoniste du récepteur H2 de l'histamine.
12. Médicament selon la revendication 10 ou la revendication 1 1, dans lequel l'agent antinéoplasique et l'agoniste du récepteur H4 de l'histamine sont présents dans deux formulations distinctes.
13. Médicament selon l'une quelconque des revendications 10 à 12, caractérisé en ce que ledit agoniste du récepteur H4 de l'histamine est le clobenpropit, le VUF 8430, la (-)-2-Cyano-l-méthyl-3-{(27?,5i?)-5- []H-imidazol-4(5>yl]tétrahydrofuran-2- yljméthylguanidine, l'imbutamine, l'immepip, la clozapine ou l'OUP-16.
14. Produits contenant au moins un agoniste du récepteur Η4 de l'histamine à une dose n'induisant pas d'activité agoniste du récepteur H2 de l'histamine, et d'un médicament actif sur les cellules en prolifération utilisé en chimiothérapie antitumorale, en tant que préparation combinée pour utilisation simultanée, séparée ou étalée dans le temps, pour protéger les progéniteurs hématopoïétiques contre les effets toxiques dudit médicament.
15. Méthode de criblage d'un produit susceptible d'empêcher les progéniteurs hématopoïétiques d'entrer en cycle cellulaire, caractérisée ne ce qu'elle comprend les étapes suivantes : i) obtention d'une cellule de mammifère exprimant le récepteur H4 de l'histamine, ladite cellule n'exprimant pas naturellement ledit récepteur, ii) mise en contact d'un produit à cribler avec la cellule obtenue à l'étape i), iii) mesure de la concentration intracellulaire d'AMPc et / ou détection de la mise en cycle cellulaire de ladite cellule.
16. Méthode selon la revendication 15, caractérisée en ce qu'elle permet de cribler un produit pour protéger les progéniteurs hématopoïétiques contre les effets toxiques de médicaments actifs sur les cellules en prolifération utilisés en chimiothérapie antitumorale.
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