WO2007147389A1 - Zellkulturvorrichtung, verfahren zur herstellung der vorrichtung und zellkulturverfahren - Google Patents

Zellkulturvorrichtung, verfahren zur herstellung der vorrichtung und zellkulturverfahren Download PDF

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WO2007147389A1
WO2007147389A1 PCT/DE2007/001054 DE2007001054W WO2007147389A1 WO 2007147389 A1 WO2007147389 A1 WO 2007147389A1 DE 2007001054 W DE2007001054 W DE 2007001054W WO 2007147389 A1 WO2007147389 A1 WO 2007147389A1
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elastomer
cell culture
cells
resin
cross
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PCT/DE2007/001054
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Bernd Hoffmann
Bodo Borm
Rudolf Merkel
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Forschungszentrum Jülich GmbH
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/0068—General culture methods using substrates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M23/00—Constructional details, e.g. recesses, hinges
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M25/00—Means for supporting, enclosing or fixing the microorganisms, e.g. immunocoatings
    • C12M25/02—Membranes; Filters
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    • C12N2533/00—Supports or coatings for cell culture, characterised by material
    • C12N2533/30—Synthetic polymers

Definitions

  • Cell culture device method of making the device, and cell culture methods
  • the invention relates to a cell culture device, a method for producing the device and a cell culture method with such a device.
  • cell culture vessels and devices made of plastics, such as polypropylene, polystyrene or glass. These vessels or devices are available in a variety of designs and have been routinely used for many years, for example in the form of cell culture bottles, test tubes, multiwell plates, petri dishes and so on.
  • Polypropylene and polystyrene are thermoplastics. The substances are physiologically harmless and also approved for food packaging without restrictions.
  • the types of glass used for the cell culture are, for example, soda-lime glass or borosilicate glass.
  • the glasses are popular for laboratory use due to their optical properties and excellent resistance to chemicals and high temperatures. These surfaces allow the culture of cells, without which further chemical modifications of the surface would be mandatory.
  • the object of the invention is to provide a cell culture device which enables cell culture under in vivo similar conditions.
  • the cell culture device according to the invention is characterized by an unstructured surface of an elastomer.
  • the cell culture device thus has a flat surface made of an elastomer.
  • the elastic property of a cell culture surface in physical terms in the form of Young's modulus, is of crucial importance in the culture of cells under in vivo-like conditions.
  • the Young modulus is also known as modulus of elasticity or modulus of elasticity.
  • Elastomers have a reproducibly settable Young modulus, depending on the nature of the starting materials and on the production process.
  • Elastomers are advantageously much more suitable for culture of cells than the hard surface cell culture vessels used in the prior art. It depends less on the chemical composition of the elastomer, but rather on the physical property, expressed in the form of Young's modulus.
  • the elastomer advantageously allows quasi a culture of the cells under in situ or in vivo similar conditions.
  • the surface of the device according to the invention has a layer or a film of unstructured elastomer for receiving the cells. With this surface, the cells are brought into contact and adhere for culture either directly or through a culture-promoting layer.
  • Such an elastomer layer or film accordingly has a flat unstructured surface.
  • the layer or the film has no (micro) structures whatsoever.
  • the area of the unstructured elastomer is approximately at least one cm 2 . This is about the same as the surface of a cover glass.
  • the concept of the invention in its broadest embodiment encompasses a cell culture device with an unstructured elastomer as the surface for the cells, wherein each elastomer can be used as the surface of the cell culture device which is chemically stable and biocompatible for the cells used.
  • the elastomer used should advantageously also be reproducible in terms of elasticity.
  • the unstructured elastomer covers the part of the surface of the cell culture device which is intended to receive the cells in the form of a layer which z. B. is designed as a thin film.
  • the elastomer thus forms the background of the cells.
  • the elastomer is transparent in one embodiment of the invention.
  • the cells optionally adhering to the elastomer and the progress of the cell culture can be well observed.
  • the material of the cell culture vessel as such that is without the elastomer, is generally also transparent, it is advantageously possible to closely observe the cells through the outer wall of the device and through the elastomer surface on the inner wall of the device.
  • the surface of the device made of the elastomer has a refractive index in a range from about 1.3 to 1.5 and in particular a refractive index of 1.4.
  • the devices according to the invention together with elastomer are particularly suitable for receiving adherent cells, which include over 95% of all known animal cell types.
  • the Young modulus of the elastomer in the device according to the invention can be between 1
  • An elasticity of the elastomer down to 500 Pa is reproducibly adjustable.
  • the device according to the invention advantageously has an elastomer with a Poisson ratio or a Poisson's ratio in a range from about 0.3 to 0.5.
  • a Poisson ratio of 0.5 characterizes the elastomer as incompressible or volume constant. It is mathematically and physically accurately detectable.
  • the surface of the device comprises an elastomer which is not based on water.
  • the elastomer on the surface of the device according to the invention then advantageously remains permanently and has a correspondingly high shell life. It therefore does not shrink due to evaporation of the water, such.
  • the shell life of the elastomer is at least one year. By shell life is meant the time window in which the device can be stored after its manufacture without altering the elastomer until it is used.
  • the elastomer in the device according to the invention may advantageously be sterilized. By sterilization by z. B. gamma or UV irradiation, the elastomer is not affected.
  • the layer thickness of the elastomer in the cell culture device may be between about one hundred nanometers to several centimeters.
  • the layer thickness of the elastomer as well as the thickness of the transparent device should advantageously be adapted to each other and selected so that the cells can be examined by means of a microscope.
  • the maximum layer thickness of device and elastomer to be penetrated optimally for most objectives of light microscopes should not exceed about 250 ⁇ m.
  • elastomers a variety of different chemical substances from different groups are available and can be used according to the invention as the surface of the cell culture device.
  • elastomers from the groups of siloxane resins, butadiene resins and acrylate resins are listed. These resins have slightly hydrophobic properties and are basically suitable for the cell culture method according to the invention.
  • the resins regularly have reactive groups, which form a bond with each other and thereby can lead to crosslinking of the elastomer.
  • ground substance is used synonymously with the main constituent in the polymerized elastomer.
  • the reactive groups are present in more or less long unreactive chain segments.
  • the reactive groups of the siloxane resins like the reactive groups of the butadiene resins, can bond with each other without that a copolymer would have to be used. Copolymers additionally crosslink the reactive groups of the siloxane and butadiene resins.
  • Acrylate resins have only reactive groups, which are crosslinked alone or with the addition of copolymers.
  • the basic substance of the elastomer is thus composed of monomeric, oligomeric or polymeric constituents which are polymerized by crosslinking to superordinate structures.
  • crosslinking of the elastomer constituents of the matrix and cross-linking agent involves various techniques.
  • the term cross-linker and copolymer is used synonymously below.
  • the crosslinking is for example by suitable copolymers, by UV light, ozone or z. B. controlled by platinum catalysts at elevated temperatures. High temperatures usually increase the reaction rate during crosslinking.
  • Catalyst driven polymerizations are fast and efficient and are e.g. For example, for SiI xanharze with a platinum catalyst, eg. B. by means of platinum Divinyltetramethyldisoloxan, (SP 6830.0 the company. ABCR "a better choice for chemical reagents") performed.
  • a platinum catalyst eg. B. by means of platinum Divinyltetramethyldisoloxan, (SP 6830.0 the company. ABCR "a better choice for chemical reagents" performed.
  • Resins are available and can be used according to the invention, the basic constituents of which crosslink by themselves in air at room temperature without addition of copolymer.
  • each elastomer can be accurately and reproducibly adjusted by suitably selecting factors such as the ground substance chain length, the mixture ratio between the base substance and cross-linking agent (copolymer), or the addition of thinners.
  • the macromolecular structure of the matrix of polymerizable end group silicone resins causes a reduction in the rate of diffusion of the reactive species, e.g. As the vinyl groups and the concentration thereof.
  • the reactive species e.g. As the vinyl groups and the concentration thereof.
  • Reactive thinners have a dual function. In addition to lowering the viscosity of the starting product, they also increase the number of reactive groups per unit volume of resin.
  • Elastomers from the group of butadiene resins are suitable for a crosslinking reaction analogous to the vulcanization of rubber with sulfur. They are resins in which the main chains of the oligomeric constituents are crosslinked as the basic substance via reactive sites distributed throughout the chain by monomeric units of a crosslinker. These oligomer chains can be linked together directly without the addition of a cross-linking agent. However, the high viscosity of these oligomers can be reduced by reactive diluents and crosslinkers.
  • Elastomers which are formed from the group of acrylate resins, are preferably based on monomers as the basic substance of the resin component.
  • the resin consists of freely moving reactive groups. Thereby, a low viscosity with good diffusion and high concentration of reactive groups can be achieved.
  • Elastomers with particularly good cell culture properties are mixtures of a vinyl-substituted siloxane as the basic substance and a memylhydrosiloxane-dimethylsiloxane copolymer as cross-linking agent. After crosslinking, the PDMS can be used as a surface for the cell culture.
  • siloxanes such as hydroxysiloxane with chlorosilane are crosslinked directly with each other or else with the addition of a copolymer and are also used in the context of the invention as a support for cell culture.
  • Particularly advantageous PDMS elastomers according to the invention are formed from a matrix with oligomers having a molecular weight of 100 to 200,000.
  • a particularly suitable PDMS elastomer is made from the sylgard 184 kit (Dow Corning).
  • This kit comprises as a basic substance vinyl-terminated siloxane resin and methylhydrosiloxane-dimethylsiloxane copolymer cross-linking agent in separate units, which are mixed together and polymerized according to the desired elasticity in suitable mixing ratios.
  • DMS-V31 as the basic substance of a vinyl-terminated polydimethylsiloxane (ABCR) and HMS 301 as an example of a methylhydrosiloxane-dimethylsiloxane copolymer for a cross-linking agent (ABCR) are also outstandingly suitable for forming elastomers for cell culture.
  • ABCR vinyl-terminated polydimethylsiloxane
  • HMS 301 as an example of a methylhydrosiloxane-dimethylsiloxane copolymer for a cross-linking agent
  • the PDMS basic constituents ie the vinyl-terminated siloxane DMS-V31 and the methylhydrosiloxane-dimethylsiloxane copolymer as cross-linking agent (HMS-301) are both in a liquid state at room temperature.
  • the polymerization is preferably carried out in the presence of a platinum catalyst at preferably ⁇ 60 ° C.
  • DMS-T21 As a thinner for PDMS, DMS-T21 (ABCR) is exemplified as a polydimethylsiloxane. This is not reactive because there are no methylhydrosiloxane groups. They have a viscosity of 100 cSt. It can be mixed with up to 30% by volume in not cross-linked PDMS.
  • DMS-T22 As diluents for PDMS, by way of example also DMS-T22 (ABCR) is mentioned as a polydimethylsiloxane; this is not reactive because there are no methylhydrosiloxane groups. They have a viscosity of 200 cSt. They can be mixed into not yet cross-linked PDMS with up to 30 percent by volume.
  • the PDMS elastomers and the elastomers based on butadiene and acrylate resin can be reproducibly applied uniformly thick to the surface of the cell culture device in a simple and inexpensive manner.
  • siloxane resins of a base substance and a cross-linking agent depending on the position of the reactive groups, ie terminal position or within the chain, all known siloxane groups can be used both as a basic substance or as cross-linking agent.
  • Elastomers from the group of vinyl-functionalized siloxanes are cross-linkable with themselves by means of peroxides and by adjusting the temperature. However, they are also cross-linkable with hydride-functionalized siloxanes by suitable choice of platinum catalysts.
  • Elastomers from the group of the hydride-functionalized siloxanes are cross-linked with vinyl-functionalized siloxanes optionally with platinum catalysts. However, they are also cross-linkable with silanol-functionalized siloxanes by metal salt catalysts.
  • Elastomers from the group of silanol-functionalized siloxanes are cross-linkable with hydride-functionalized siloxanes by metal salt catalysts. But they are also cross-linkable with themselves by room temperature vulcanizations. They are also cross-linkable with amino-functionalized siloxanes v
  • Elastomers from the groups of the amino-functionalized siloxanes, the epoxy-functionalized siloxanes and the carbinol-functionalized siloxanes are likewise suitable siloxanes in the context of the invention, that is to say they can be used as a substrate for cells in cell culture devices.
  • Elastomers from the group of methacrylate / acrylate-functionalized siloxanes are cross-linkable with themselves by radical formers, including UV light.
  • Elastomers from the group of mercapto-functionalized siloxanes are also cross-linkable with themselves but also with vinyl-functionalized siloxanes by radical formers, including UV light.
  • Elastomers from the group of chorine / dimethylamine-functionalized siloxanes ( ⁇ , ⁇ - (methacryloxypiopropylethylsilyl) polydimethylsiloxanes, methacryloxypropyldimethylchlorosilanes) are cross-linked with hydride-functionalized siloxanes by hydrolyzing the chlorosilane bond.
  • Suitable diluents for the elastomers are, by way of example and not limitation, polydimethylsiloxanes without reactive groups and medium to low chain lengths, or siloxanes having reactive groups, but which do not participate in the reaction in the cross-linking reaction used.
  • Butadiene resins as a basic substance in the context of the invention are exemplary and not limiting nature of carboxy-terminated oligobutadienes.
  • Butadiene resins as crosslinkers or thinners are z. Hexanediol diacrylates, cyclohexyl methacrylates, methyl acrylates, ethylene glycol dimethacrylates, polyethylene glycol) monomethacrylates, linseed oil, styrenes, stearyl methacrylates, 2-hydroxyethyl acrylates, copolymers of n-butyl acrylates and t-butyl acrylates, n-hexyl methacrylates, 2-dimethylaminoethyl methacrylates, n- Decylmethacrylate.
  • An acrylate resin as a basic substance may, for. B. be 2-hydroxypropyl acrylates.
  • Acrylate resins as crosslinkers or thinners are z.
  • n-hexyl methacrylates ethylene glycol dimethacrylates
  • n-decyl methacrylates n-decyl methacrylates
  • Elastomers, copolymers and thinners which fall under one of the groups mentioned and / or are to be taken from the incorporated references, are expressly covered by the spirit of the invention.
  • a variety of slightly different elastomers can be formed from a single combination of base and cross-linker alone, e.g. From the sylgard 184 kit.
  • the Young's modulus in the abovementioned range can be varied, for example, by changing the mixing ratio between the basic substance and the cross-linking agent.
  • An unstructured surface of an elastomer can be applied very quickly to the surface of a suitable cell culture device by a suitable method.
  • industrial serial production of cell culture devices according to the invention from the known cell culture devices is advantageously possible.
  • the cell culture device covering layer of the elastomer is virtually arbitrarily adjustable by a person skilled in the art, provided that he has a suitable method, such.
  • B. applies a spin coating or a casting process.
  • the base substance and optionally copolymer (cross-linking agent) it is possible to reproducibly produce layer thicknesses of about 100 nanometers to a few centimeters.
  • the base substance and optionally a cross-linking agent and / or catalyst are mixed and evenly distributed in or on the cell culture device, so that the surface which is provided for receiving the cell, is formed from the unstructured elastomer.
  • the crosslinking to the elastomer takes place regularly after the application of the elastomer to the cell culture device.
  • elastomers comprising a cross-linking agent
  • this is added in advance to the basic substance and mixed with this, optionally a catalyst is added.
  • the device together with liquid elastomer is clamped, for example, in a spin-coater.
  • the device can also be held on a turntable by means of a vacuum.
  • the elastomer By rotation at z. B. 1000 rpm per minute, the elastomer is distributed as a very uniform unstructured film on the bottom of the cell culture vessel. The layer formed then serves to accommodate the cells in the cell culture process.
  • At least one elastomer from the group of siloxane resins retains its elastic properties over a virtually unlimited period of time and without any additional effort.
  • the resulting layer thickness is dependent on the viscosity and the amount of the still uncrosslinked elastomer, the rotational speed and the acceleration and process duration during spin coating.
  • a small amount of the uncrosslinked elastomer may be regularly applied and distributed to the surface of a desired device at about 1000 revolutions per minute by means of a spin coater.
  • An alternative to the rotation process is to cast the elastomer without subsequent rotation or coating, by means of which suitable layer thicknesses are applied to surfaces by means of a suitable apparatus or a rolling process in which the elastomer is rolled onto surfaces by means of a roll or a rolling process or a combination of these various methods a possible alternative to the rotation process.
  • petri dishes, microscope slides or coverslips with a corresponding surface can be produced from a surface facing out of the cell culture from one of the elastomers mentioned.
  • multiwell plates, cell culture bottles and other forms commonly used in cell culture according to the prior art are to be uniformly coated with an elastomer.
  • the idea of the invention can be applied to any hitherto known cell culture vessel or to any cell culture device.
  • a person skilled in the art can therefore coat any cell culture device which can be removed from the relevant laboratory and specialist catalogs with a surface made of an elastomer. It is thus particularly advantageous to provide a new class of cell culture vessels and devices.
  • a washing step of the cross-linked elastomer with isopropanol, especially pure isopropanol, increases the transparent properties of the elastomer.
  • a washing step with isopropanol causes non-cross-linked constituents to diffuse out of agglomerated bubbles of the layer.
  • the washing step thus improves the observability of the cells.
  • the surface of the cell culture device with the elastomer should look for better observability of the cells, preferably like that of glass.
  • the elastomer of the cell culture device can be activated in a very particularly advantageous embodiment of the invention by physisorption of biomolecules.
  • Physiosorption generally refers to a passive surface coating in which biomolecules settle out of an aqueous solution onto the underlying surface and build up a more or less uniform layer. This defines defined adhesion conditions for cells, which allow the analysis of very specific questions. By way of example, the study of biochemical aspects of cell-substrate interactions under defined conditions may be mentioned.
  • biomolecules such as fibronectin, laminin, collagen, tenascin or hyaluronic acid are first dissolved in buffer. The liquid together with biomolecule is applied to the already crosslinked elastomer. The biomolecule deposits passively on the elastomer as a thin layer. The residual liquid is then removed again.
  • the biomolecule for any elastomer is selected essentially on the basis of the question or the cells.
  • An inventive cell culture method provides cells z. B. from a preculture applied to an optionally modified elastomer of the device and to cultivate.
  • cell culture is broad in terms of the cells used. It includes prokaryotic and eukaryotic cells as well as multicellular structures. In particular for cells of eukaryotic origin, the devices according to the invention are advantageous, since these cells generally adhere.
  • cell culture includes, inter alia, the analysis of cells in drug discovery under natural elasticity.
  • the differentiation, the division rates and / or the migration behavior of the cells on the elastomer are of particular interest.
  • the necessary boundary conditions for the culture and for the elastomer must be adapted.
  • auxiliaries such as vitamins, the temperature or the shape of the culture vessel may be mentioned as boundary conditions.
  • the differentiation of the cell can be specifically controlled via the Young modulus of the elastomer during the cell culture process.
  • fibroblasts which have been applied to the elastomer are advantageously differentiable depending on the Young's modulus of the elastomer into various cell types such as cardiac fibroblasts or myofibroblasts. This in turn is of interest in drug analysis and the provision of new therapeutics.
  • the number of cell divisions per unit of time can also be controlled as a measure of the division rate of cells via the Young modulus of the elastomer surface of the cell culture vessel. Depending on the type of cell used, it increases on soft surfaces by up to 40% compared to devices according to the prior art.
  • Fig. 1 Schematic representation of the type of crosslinking of some resins (prior art) for cell culture devices according to the invention.
  • Fig. 2 Adherent fibroblasts after six days of culture in a Petri dish made of polypropylene (prior art) with a centrally arranged cover glass as a cell culture soil. a) Antibody labeling of the cytoskeleton. b) to a) corresponding Naturallichtaufhahme.
  • Fig. 3 Adherent fibroblasts after six days of culture in a Petri dish made of polypropylene with a centrally arranged cover glass and an elastic surface of PDMS arranged thereon with a Young modulus of 38 kPa as a cell culture soil. a) Antibody labeling of the cytoskeleton. b) to a) corresponding Naturallichtaufhahme.
  • FIG. 4 shows a confocal created side view of a cell culture device according to FIG. 3.
  • Fig. 1 shows schematically the type of crosslinking of three types of resin, which can serve according to the invention as an unstructured substrate for cells (prior art).
  • fibroblasts were isolated and plated at a concentration of about 5,000 cells per cm 2 on a PDMS surface made from a sylgard 184 kit.
  • the kit comprises vinyl-terminated siloxane as the basic substance and methylhydrosiloxane-dimethylsiloxane as copolymer and admixed Pt catalyst.
  • the mixture of siloxane and copolymer was prepared in a mixing ratio of 50: 1 to ground substance to crosslinker, mixed and degassed in Eksikator.
  • a cover glass measuring 25 x 75 mm and a thickness of -100 ⁇ m was mounted on the turntable of a spin coater of type Delta 10T from Süss Microtech and coated with 3 ml of the not yet crosslinked PDMS.
  • the rotation process was carried out for 30 seconds at 1000 revolutions per minute.
  • the underside of the coverslip was then cleaned of excess PDMS with n-heptane.
  • the curing took place in dust-protected containers at 60 ° C overnight, with an elasticity of about 25 kPa is achieved.
  • the elastomer was coated with a 2.5 ⁇ g / cm 2 fibronectin as an additional layer favoring adhesion of the cells. Fibronectin ensures adhesion of cells under near-natural and defined conditions. For this purpose, a corresponding small amount was applied and withdrawn after 20 minutes, the residual liquid again.
  • the elastomer was washed in 2-propanol with gentle shaking for 15 hours to wash out excess silicone oil which was not cross-linked. This causes in the specified PDMS Porymer with a Young's modulus of -25 kPa about a 40% volume reduction while improving the transparency and a post-curing to about 38 kPa.
  • the layer thickness of the elastomer produced after this step was about 40 ⁇ m at a Poisson ratio of about 0.5.
  • the coverslip was stuck over the elastomer from below to a centrally located hole in the bottom of a Petri dish. The connection between the PDMS surface and the cell culture vessel was made directly via the adhesive properties of the cross-linked PDMS already on the surface.
  • Embryonic myocardial fibroblasts were isolated and seeded as single cells on the elastomer ( Figure 3) or directly on the glass surface of the coverslip ( Figure 2).
  • the cells according to FIG. 3 like the cells in FIG. 2, were incubated for six days at 37 ° C. in a suitable nutrient solution. Subsequently, the cells were fixed with formaldehyde and labeled with an antibody against smouth muscle actin and incubated. Smouth muscle actin is a marker for the natural function of force generation of cells.
  • the corresponding fixing and labeling protocols can easily be found by a person skilled in the art from the corresponding specialist literature.
  • FIG. 2a The comparison between Fig. 2a) and Fig. 3a) shows that after 6 days of culture, only the fibroblasts on PDMS (Fig. 3a) had formed a distinct, dense and parallel oriented cytoskeleton. On the background of the comparison sample (FIG. 2 a) formed by the cover glass, however, this structure, which is absolutely essential for the function, of the parallel orientation of the cytoskeleton was not formed.
  • the corresponding transmitted light images show that cell counts on the PDMS surface (FIG. 3 b) compared with the glass surface (FIG. 2 b) increased by about 40%. This proves the increased cell division rate on PDMS towards glass and indicates a significantly lower cell stress when using an elastic surface.
  • the experiment shows that the morphology of the cells and thus their structure and function are positively influenced by the choice of an elastomer as substrate. The same applies to the cell number.
  • the resulting layer thickness of the elastomer 3 is about 40 microns, as shown in Fig. 4.
  • Layer 4 shows the adjacent air
  • layer 2 represents the cover glass
  • layer 1 the liquid arranged on the PDMS.

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Abstract

Die Erfindung betrifft eine Zellkulturvorrichtung für Zellen, gekennzeichnet durch eine Oberfläche aus einem unstrukturierten Elastomer. Damit können Zellen in Bezug auf ihre Umgebungselastizität unter naturnahen Bedingungen kultiviert werden. Ein Verfahren zur Herstellung einer erfindungsgemäßen Vorrichtung ist offenbart, ebenso ein Zellkulturverfahren mittels einer derartigen Vorrichtung.

Description

B e s c h r e i b u n g Zellkulturvorrichtung, Verfahren zur Herstellung der Vorrichtung und Zellkulturverfahren
Die Erfindung betrifft eine Zellkulturvorrichtung, ein Verfahren zur Herstellung der Vorrichtung und ein Zellkulturverfahren mit einer derartigen Vorrichtung.
Aus dem Stand der Technik bekannt sind Zellkulturgefäße und Vorrichtungen aus Kunststoffen, wie Polypropylen, Polystyrol oder auch aus Glas. Diese Gefäße bzw. Vorrichtungen sind in den verschiedensten Ausgestaltungen erhältlich und werden seit vielen Jahren routinemäßig verwendet, beispielsweise in Form von Zellkulturflaschen, Reagenzgläsern, Multiwell- Platten, Petrischalen und so weiter.
Polypropylen und Polystyrol sind thermoplastische Kunststoffe. Die Substanzen sind physiologisch unbedenklich und auch für Lebensmittelverpackungen uneingeschränkt zugelassen.
Bei den verwendeten Glassorten für die Zellkultur handelt es sich beispielsweise um Kalknat- ronglas oder um Borosilikatglas. Die Gläser werden aufgrund ihrer optischen Eigenschaften und ihrer hervorragenden Beständigkeit gegenüber Chemikalien und hohen Temperaturen gerne für den Laboreinsatz verwendet. Diese Oberflächen erlauben die Kultur von Zellen, ohne das weitere chemische Modifikationen der Oberfläche zwingend erforderlich wären.
Nachteilig erlauben die erwähnten Gläser und Kunststoffe aber keine langfristige Untersuchung und Kultur der Zellen unter in vivo ähnlichen Bedingungen.
Trotz dieses signifikanten Nachteils werden sie routinemäßig in vielen wissenschaftlich und wirtschaftlich relevanten Fragestellungen, etwa dem Wirkstoff-Screening oder in der Krebsforschung eingesetzt.
Aus Discher et al. (Discher D.E., Janmey P., Yu-Li Wang (2005). Tissue cells feel and respond to the stiffhess of their Substrate. Science, 310, 1139-1143) ist bekannt, dass Gewebezellen auf die Steifheit ihrer Substrate reagieren können.
Nachteilig sind auch die hieraus bekannten Substrate für langfristig angelegte Zellkulturen und für die Lagerung bzw. Aufbewahrung ungeeignet. Aufgabe der Erfindung ist es, eine Zellkulturvorrichtung bereit zu stellen, welche eine Zellkultur unter in vivo ähnlichen Bedingungen ermöglicht.
Die Aufgabe wird durch eine Vorrichtung gemäß Hauptanspruch und ein Verfahren zu deren Herstellung gemäß Nebenanspruch gelöst. Vorteilhafte Ausgestaltungen ergeben sich aus den darauf jeweils rückbezogenen Patentansprüchen.
Die Zellkulturvorrichtung ist erfindungsgemäß gekennzeichnet durch eine unstrukturierte Oberfläche aus einem Elastomer. Die Zellkulturvorrichtung weist demnach eine ebene Oberfläche aus einem Elastomer auf.
Im Rahmen der Erfindung wurde erkannt, dass der elastischen Eigenschaft einer Zellkulturoberfläche, physikalisch ausgedrückt in Form des Young-Modulus, eine entscheidende Bedeutung bei der Kultur von Zellen unter in vivo ähnlichen Bedingungen zukommt. Der Young-Modulus ist auch als E-Modul oder Elastizitätsmodul bekannt.
Elastomere weisen einen je nach Art der Ausgangssubstanzen und je nach Herstellungsverfahren bestimmten, reproduzierbar einstellbaren Young-Modulus auf.
Elastomere sind vorteilhaft zur Kultur von Zellen viel besser geeignet, als die nach Stand der Technik verwendeten Zellkulturgefäße mit harter Oberfläche. Dabei kommt es weniger auf die chemische Zusammensetzung des Elastomers an, als vielmehr auf die physikalische Eigenschaft, ausgedrückt in Form des Young-Modulus.
Es wurde erkannt, dass die elastische Oberfläche bezüglich der Weichheit und Elastizität als naturnah zu bezeichnen ist. Das Elastomer erlaubt vorteilhaft quasi eine Kultur der Zellen unter in situ bzw. in vivo ähnlichen Bedingungen.
Im Rahmen der Erfindung wurde weiterhin erkannt, dass die gemäß Stand der Technik häufig eingesetzten Materialien, wie Polypropylen oder Polystyrol, eine viel zu große Härte mit einem E-Modul von etwa 109 Pa aufweisen. Derartige Materialien sind in Bezug auf die Elastizität nicht als naturnah zu bezeichnen. Das Gleiche gilt auch für das ebenfalls häufig eingesetzte Kalknatronglas (E-Modul 7,3* 1010Pa, Poissonzahl: 0,22) und für Borosilikatglas (E-Modul 6,3*1010Pa, Poissonzahl: 0,2). Im Rahmen der Erfindung wurde zudem erkannt, dass die bisher angewendeten Kulturbedin- gungen und Oberflächen von Zellkulturvorrichtungen in Bezug auf deren Steifheit und Härte der natürlichen Umgebung von Zellen gegenüber stehen. Insbesondere die Zellen von Vielzellern stehen im Verbund mit deutlich weicheren und elastischeren Oberflächen in Kontakt, als dies mit den im Labor verwendeten Glas- oder Kunststoffsorten vorgegeben wird.
Die Oberfläche der erfindungsgemäßen Vorrichtung weist zur Aufnahme der Zellen eine Schicht oder einen Film aus unstrukturiertem Elastomer auf. Mit dieser Oberfläche werden die Zellen zwecks Kultur entweder unmittelbar oder über eine die Kultur begünstigende Schicht in Kontakt gebracht und adhärieren.
Eine derartige Elastomerschicht bzw. -Film weist demgemäß eine ebene unstrukturierte Oberfläche auf. Die Schicht bzw. der Film weist keine wie auch immer gearteten (Mikro-)Struk- turen auf.
Im Rahmen der Erfindung wurde erkannt, dass Strukturen, wie z. B. Gräben oder inselartige Erhebungen, von vielen Zelltypen erkannt werden und die Zellen so nachteilig an einer unbe- einflussten Entwicklung und Vermehrung und/oder Ausbreitung durch Zellteilung hindern. Durch eine ebene Oberfläche aus einem Elastomer wird demnach vorteilhaft die natürliche Entwicklung und Vermehrung der Zellen unterstützt.
Vorteilhaft beträgt die Fläche des unstrukturierten Elastomers etwa mindestens einen cm2. Dies ist in etwa der Fläche eines Deckglases gleich zu setzen.
Der Erfindungsgedanke in seiner breitesten Ausführung umfasst dabei eine Zellkulturvorrichtung mit einem unstrukturierten Elastomer als Oberfläche für die Zellen, wobei jedes Elastomer als Oberfläche der Zellkulturvorrichtung verwendet werden kann, welches chemisch beständig und biokompatibel für die verwendeten Zellen ist. Das eingesetzte Elastomer sollte vorteilhaft in Bezug auf die Elastizität auch reproduzierbar herstellbar sein.
Das unstrukturierte Elastomer bedeckt den Teil der Oberfläche der Zellkulturvorrichtung, welcher zur Aufnahme der Zellen vorgesehen ist in Form einer Schicht, welche z. B. als ein dünner Film ausgestaltet ist. Das Elastomer bildet somit den Untergrund der Zellen. Das Elastomer ist in einer Ausgestaltung der Erfindung transparent.
Dadurch lassen sich die gegebenenfalls auf dem Elastomer adhärierten Zellen sowie der Fortgang der Zellkultur gut beobachten.
Da auch das Material des Zellkulturgefäßes als solches, das heißt ohne das Elastomer, in der Regel ebenfalls transparent ist, ist vorteilhaft eine genaue Beobachtung der Zellen durch die Außenwand der Vorrichtung und durch die Elastomeroberfläche auf der Innenwand der Vorrichtung möglich.
Die Oberfläche der Vorrichtung aus dem Elastomer weist hierzu in einer weiteren vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung einen Brechungsindex in einem Bereich von etwa 1,3 bis 1,5 und insbesondere einen Brechungsindex von 1,4 auf.
Die erfindungsgemäßen Vorrichtungen nebst Elastomer sind insbesondere geeignet, adhärente Zellen, zu denen über 95% aller bekannten tierischen Zelltypen gehören, aufzunehmen.
Der Young-Modulus des Elastomers in der erfindungsgemäßen Vorrichtung kann zwischen 1
MPa bis unter 1 kPa, je nach Fragestellung eingestellt werden.
Eine Elastizität des Elastomers bis hinab zu 500 Pa ist reproduzierbar einstellbar.
Die erfindungsgemäße Vorrichtung weist vorteilhaft ein Elastomer mit einem Poissonverhält- nis bzw. einer Poissonzahl in einem Bereich von etwa 0,3 bis 0,5 auf. Ein Poissonverhältnis von 0,5 charakterisiert das Elastomer als inkompressibel bzw. volumenkonstant. Es ist mathematisch und physikalisch genau erfassbar.
In einer besonders vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung weist die Oberfläche der Vorrichtung ein Elastomer auf, welches nicht auf Wasserbasis beruht.
Das Elastomer auf der Oberfläche der erfindungsgemäßen Vorrichtung bleibt dann vorteilhaft dauerhaft erhalten und weist eine entsprechend hohe shell life auf. Es schrumpft somit nicht auf Grund von Verdunstung des Wassers, wie z. B. die bekannten und in diesem Zusammenhang nachteiligen Agar- oder Acryl-Oberflächen. Es ist besonders vorteilhaft, wenn die shell life des Elastomers mindestens ein Jahr beträgt. Mit der shell life ist dasjenige Zeitfenster gemeint, in dem die Vorrichtung nach ihrer Herstellung ohne Veränderung des Elastomers bis zur Anwendung gelagert werden kann.
Das Elastomer in der erfindungsgemäßen Vorrichtung kann vorteilhaft sterilisiert vorliegen. Durch eine Sterilisierung durch z. B. γ- oder UV-Bestrahlung wird das Elastomer nicht beein- flusst.
Die Schichtdicke des Elastomers in der Zellkulturvorrichtung kann zwischen etwa hundert Nanometern bis einigen Zentimeter betragen.
Die Schichtdicke des Elastomers sowie auch die Dicke der transparenten Vorrichtung sollten vorteilhaft so aneinander angepasst und ausgewählt werden, dass die Zellen mittels eines Mikroskops untersucht werden können.
Dann sollte die für die meisten Objektive von Lichtmikroskopen optimal zu durchdringende Gesamtschichtdicke aus Vorrichtung und Elastomer etwa 250 μm nicht überschreiten.
Als Elastomere sind eine Vielzahl verschiedener chemischer Substanzen aus unterschiedlichen Gruppen erhältlich und erfindungsgemäß als Oberfläche der ZelUculturvorrichtung einsetzbar. Nur beispielhaft und keineswegs einschränkend seien Elastomere aus den Gruppen der Siloxanharze, Butadienharze und Acrylatharze aufgeführt. Diese Harze weisen leicht hydrophobe Eigenschaften auf und sind grundsätzlich für das erfindungsgemäße Zellkulturverfahren geeignet.
Die Harze weisen regelmäßig reaktive Gruppen auf, welche miteinander eine Bindung eingehen und dadurch zur Vernetzung des Elastomers führen können.
Im Weiteren wird der Begriff Grundsubstanz synonym mit dem Hauptbestandteil im polyme- risierten Elastomer benutzt.
Ln Falle von Siloxanharzen und Butadienharzen liegen die reaktiven Gruppen in mehr oder weniger langen unreaktiven Kettensegmenten vor. Die reaktiven Gruppen der Siloxanharze können wie die reaktiven Gruppen der Butadienharze miteinander Bindungen eingehen, ohne dass ein Copolymer eingesetzt werden müsste. Copolymere vernetzen die reaktiven Gruppen der Siloxan- und der Butadienharze zusätzlich miteinander.
Acrylatharze weisen nur reaktive Gruppen auf, welche allein miteinander oder aber unter Zusatz von Copolymeren vernetzt werden.
Die Grundsubstanz des Elastomers ist somit aus monomeren, oligomeren oder polymeren Bestandteilen aufgebaut, welche durch Vernetzung zu übergeordneten Strukturen polymeri- siert werden.
Zur Kreuzvernetzung der Elastomerbestandteile Grundsubstanz und Kreuzvernetzer (Copolymer) kommen verschiedene Techniken in Betracht. Der Begriff Kreuzvernetzer und Copolymer wird im Weiteren synonym gebraucht.
Die Vernetzung wird beispielsweise durch geeignete Copolymere, durch UV-Licht, Ozon oder z. B. durch Platinkatalysatoren bei erhöhten Temperaturen gesteuert. Hohe Temperaturen erhöhen üblicherweise die Reaktionsgeschwindigkeit während der Vernetzung.
Katalysator getriebene Polymerisationen sind schnell und effizient und werden z. B. für SiIo- xanharze mit einem Platin-Katalysator, z. B. mittels Platinum-Divinyltetramethyldisoloxan, (SP 6830.0 der Fa. ABCR „a better choice for chemical reagents") durchgeführt.
Es sind Harze erhältlich und erfmdungsgemäß einsetzbar, deren Grundbestandteile sich von allein an Luft bei Raumtemperatur ohne Zugabe von Copolymer vernetzen.
Je länger die ausgewählte Kettenlänge der Grundsubstanz (unreaktives Kettensegment) des erfindungsgemäßen Elastomers ist, desto höher ist die Viskosität, das heißt, je niedriger entsprechend ist die Elastizität des Elastomers nach Zugabe eines geeigneten Kreuz vernetzers.
Umgekehrt gilt entsprechend, dass mit abnehmender Kettenlänge des Elastomers die Elastizität nach Vernetzung des Elastomers zunimmt. Hinsichtlich der Elastizität kann jedes Elastomer durch geeignete Wahl von Faktoren, wie der Kettenlänge der Grundsubstanz, des Mischungsverhältnisses zwischen Grundsubstanz und Kreuzvernetzer (Copolymer) oder der Zugabe von Verdünnern genau und reproduzierbar eingestellt werden.
Vor der Polymerisation bewirkt die makromolekulare Struktur der Grundsubstanz von SiIo- xanharzen mit polymerisierbaren Endgruppen im Vergleich zu einem Harz aus monomeren Bestandteilen eine Verringerung der Geschwindigkeit der Diffusion der reaktiven Spezies, z. B. der Vinyl-Gruppen sowie der Konzentration derselben. Diese Nachteile lassen sich durch Erniedrigen der Viskosität, beispielsweise über reaktive Verdünner sowie durch die Zugabe von Vernetzern beheben.
Reaktive Verdünner besitzen eine doppelte Funktion. Neben der Erniedrigung der Viskosität des Ausgangsprodukts bewirken sie auch eine Erhöhung der Zahl der reaktiven Gruppen je Volumeneinheit an Harz.
Elastomere aus der Gruppe der Butadienharze sind für eine Vernetzungsreaktion analog der Vulkanisation von Kautschuk mit Schwefel geeignet. Es sind Harze, bei denen die Hauptketten der oligomeren Bestandteile als Grundsubstanz über reaktive Stellen, die über die gesamte Kette verteilt sind, durch monomere Einheiten eines Vernetzers vernetzt werden. Diese Oligomerketten können direkt ohne Zugabe eines Kreuzvernetzers miteinander verknüpft werden. Die hohe Viskosität dieser Oligomere kann aber durch reaktive Verdünner und Vernetzer herabgesetzt werden.
Elastomere, welche aus der Gruppe der Acrylatharze gebildet werden, gehen bevorzugt von Monomeren als Grundsubstanz der Harzkomponente aus. Das Harz besteht aus frei beweglichen reaktiven Gruppen. Dadurch kann eine niedrige Viskosität mit guter Diffusion und hoher Konzentration an reaktiven Gruppen erreicht werden.
Auch für Elastomere aus Siloxanharzen reicht das Mischungsverhältnis an der Grundsubstanz zu einem Kreuzvernetzer von sehr hohen Konzentrationen an Kreuzvernetzer zur Herstellung geringer Elastizitäten bzw. hohen Young Moduli (> 1 MPa) bis hin zu Mischungsverhältnissen mit geringer Konzentration an Kreuzvernetzer zur Herstellung hoher Elastizitäten. Elastomere mit besonders guten Eigenschaften fϊir die Zellkultur sind Gemische aus einem vinylteπninierten Siloxan als Grundsubstanz sowie einem Memylhydrosiloxan-Dimethyl- siloxan-Copolymer als Kreuzvernetzer. Nach der Vernetzung ist das PDMS als Oberfläche für die Zellkultur einsetzbar.
Andere Siloxane, wie Hydroxysiloxan mit Chlorsilan werden direkt untereinander oder aber unter Zugabe eines Copolymers vernetzt und sind ebenfalls im Rahmen der Erfindung als Unterlage für die Zellkultur einsetzbar.
Besonders vorteilhafte PDMS-Elastomere im Sinne der Erfindung werden aus einer Grundsubstanz mit Oligomeren mit einem Molekulargewicht von 100 bis 200000 gebildet.
Ein ganz besonders geeignetes PDMS-Elastomer wird aus dem sylgard 184-Kit (Fa. Dow Corning) hergestellt. Dieses Kit umfasst als Grundsubstanz vinylterminiertes Siloxanharz und Methylhydrosiloxan-Dimethylsiloxan-Copolymer als Kreuzvernetzer in getrennten Einheiten, die je nach gewünschter Elastizität in geeigneten Mischungsverhältnissen miteinander vermengt und polymerisiert werden.
Auch DMS-V31 als Grundsubstanz eines vinylterminierten Polydimethylsiloxans (Fa. ABCR) und HMS 301 als Beispiel eines Methylhydrosiloxan-Dimethylsiloxan-Copolymer für einen Kreuzvernetzer (Fa. ABCR) sind hervorragend geeignet, um Elastomere für die Zellkultur zu bilden.
Die PDMS-Grundbestandteile, also das vinylterminierte Siloxan DMS-V31 sowie das Me- thylhydrosiloxan-Dimethylsiloxan-Copolymer als Kreuzvernetzer (HMS-301) liegen bei Raumtemperatur beide in flüssigem Zustand vor. Die Polymerisation erfolgt vorzugsweise in Gegenwart eines Platin-Katalysators bei vorzugsweise ~ 60° C.
Als Verdünner für PDMS sei beispielhaft DMS-T21 (ABCR) als ein Polydimethylsiloxan genannt. Dieses ist nicht reaktiv, da keine Methylhydrosiloxangruppen vorhanden sind. Sie weisen eine Viskosität von 100 cSt auf. Es ist in noch nicht kreuzvernetztes PDMS mit bis zu 30 Volumenprozent einmischbar. Als Verdünner für PDMS sei beispielhaft auch DMS-T22 (ABCR) als ein Polydimethylsilo- xan genannt; dieses ist nicht reaktiv, da keine Methylhydrosiloxangruppen vorhanden sind. Sie weisen eine Viskosität von 200 cSt auf. Sie sind in noch nicht kreuzvernetztes PDMS mit bis zu 30 Volumenprozent einmischbar.
Die PDMS-Elastomere und die Elastomere auf Butadien- und Acrylatharzbasis sind auf leichte und preiswerte Art reproduzierbar gleichmäßig dick auf die Oberfläche der Zellkulturvorrichtung aufbringbar.
Ein Fachmann wird hierzu eine geeignete Literaturstelle zur reproduzierbaren Herstellung von Elastomeren heranziehen.
In dieser Hinsicht wird Bezug genommen auf die nachfolgenden Literaturstellen und Homepages, deren Inhalt insbesondere in Bezug auf die dort angegebenen Elastomere, Kreuzver- netzer und Verdünner hiermit in diese Anmeldung aufgenommen wird:
■ W. NoIl, Chemistry and Technology ofSilicones, Academic Press, New York (1968).
T.C. Kendrick, B. Parbhoo, J.W. White, "Siloxane Polymers and Copolymers," in The Chemistry ofOrganic Silicon Compounds Pt2 (edited by S. Patai and Z. Rappoport), 21, p. 1289-1361, John Wiley, Chichester (1989).
■ SJ. Clarson, J.A. Semlyen, Siloxane Polymers, Prentice Hall, New Jersey (1993).
■ J.W. White, R.C. Treadgold, "Organofunctional Siloxanes," in Siloxane Polymers (edited by SJ. Clarson and J.A. Semlyen), 4, pl93-215, Prentice Hall, New Jersey (1993).
■ W. Gardiner, J.W. White, "Specialty Silicones as Building Blocks for Organic Polymer Modification," in High Value Polymers (edited by A.H. Fawcett), Royal Society of Chemistry, Cambridge (1990).
■ M. Brook, Silicon in Organic, Organometallic and Polymer Chemistry, John Wiley and Sons, New York (2000).
■ Dow Corning, Homepage, Silanes selection guide
■ ABCR, Homepage, Siloxane product list ■ M. Heger, Entwicklung eines Stereolithographieharzes für elastomere Produkte, Ph.D. thesis, Darmstadt, Germany (2001).
Für Siloxanharze aus einer Grundsubstanz und einem Kreuzvernetzer können, abhängig von der Lage der reaktiven Gruppen, das heißt endständiger Lage oder innerhalb der Kette, alle bekannten Siloxangruppen sowohl als Grundsubstanz oder aber als Kreuzvernetzer verwendet werden.
Nur beispielhaft und keineswegs einschränkender Natur seien einige wichtige Elastomere verschiedener Gruppen für erfindungsgemäße Zellkulturvorrichtungen nachfolgend zusam- mengefasst:
Elastomere aus der Gruppe der Vinyl-funktionalisierten Siloxane sind einerseits mit sich selbst mittels Peroxiden und über die Einstellung der Temperatur kreuzvernetzbar. Sie sind aber auch kreuzvernetzbar mit Hydrid-funktionalisierten Siloxanen durch geeignete Wahl von Platin-Katalysatoren.
Elastomere aus der Gruppe der Hydrid-funktionalisierten Siloxane werden mit Vinyl- funktionalisierten Siloxanen gegebenenfalls mit Platin-Katalysatoren kreuz vernetzt. Sie sind aber auch kreuzvernetzbar mit Silanol-funktionalisierten Siloxanen durch Metallsalz-Katalysatoren.
Elastomere aus der Gruppe der Silanol-funktionalisierten Siloxane sind kreuzvernetzbar mit Hydrid-funktionalisierten Siloxanen durch Metallsalz-Katalysatoren. Sie sind aber auch kreuzvernetzbar mit sich selbst durch Raumtemperatur- Vulkanisationen. Sie sind darüber hinaus kreuzvernetzbar mit Amino-funktionalisierten Siloxanenv
Elastomere aus den Gruppen der Amino-funktionalisierten Siloxane, der Epoxy-funkti- onalisierten Siloxane und der Carbinol-funktionalisierten Siloxane sind ebenfalls geeignete Siloxane im Sinne der Erfindung, das heißt als Untergrund für Zellen in Zellkulturvorrichtungen einsetzbar.
Elastomere aus der Gruppe der Methacrylat/Acrylat-funktionalisierten Siloxane sind kreuzvernetzbar mit sich selbst durch Radikalbildner, inklusive durch UV-Licht. Elastomere aus der Gruppe der Mercapto-fünktionalisierten Siloxane sind ebenfalls kreuzver- netzbar mit sich selbst aber auch mit Vinyl-funktionalisierten Siloxanen durch Radikalbildner, inklusive UV-Licht.
Elastomere aus der Gruppe der Chorine/Dimethylamin-funktionalisierten Siloxane (α, ω-(MethacryloxypiOpyldimethylsilyl)-Polydimethylsiloxane; Methacryloxypropyldi- methylchlorsilane) werden mit Hydrid-funktionalisierten Siloxanen durch Hydrolysierung der Chlorsilanbindung kreuzvernetzt.
Als Verdünner für die Elastomere kommen beispielhaft und nicht einschränkender Natur nach Polydimethylsiloxane ohne reaktive Gruppen und mittlerer bis niedriger Kettenlänge in Betracht, oder aber Siloxane mit reaktiven Gruppen, die aber in der verwendeten Kreuzvernetzungsreaktion nicht mit in die Reaktion mit eingehen.
Butadienharze als Grundsubstanz im Sinne der Erfindung sind beispielhaft und nicht einschränkender Natur nach carboxyterminierte Oligobutadiene.
Butadienarze als Kreuzvernetzer bzw. Verdünner sind z. B. Hexandioldiacrylate, Cyclohe- xylmethacrylate, Methylacrylate, Ethylenglycoldimethacrylate, Polyethylenglycol)mono- methacrylate, Leinöl, Styrole, Stearylmethacrylate, 2-Hydroxyethylacrylate, Copolymere aus n-Butylacrylaten und t-Butylacrylaten, n-Hexylmethacrylate, 2-Dimethylaminoethyl- methacrylate, n-Decylmethacrylate.
Ein Acrylatharz als Grundsubstanz kann z. B. 2-Hydroxypropylacrylate sein.
Acrylatharze als Kreuzvernetzer bzw. Verdünner sind z. B. n-Hexylmethacrylate, Ethylenglycoldimethacrylate, n-Decylmethacrylate.
Elastomere, Copolymer und Verdünner, welche unter einer der genannten Gruppen fallen und/oder den inkorporierten Literaturstellen zu entnehmen sind, fallen ausdrücklich unter den Erfmdungsgedanken. Es kann eine Vielzahl von geringfügig voneinander abweichenden Elastomeren allein aus einer einzigen Kombination von Grundsubstanz und Kreuzvernetzer gebildet werden, z. B. aus dem sylgard-184-Kit. Hierzu kann beispielsweise durch Änderung des Mischungsverhältnisses zwischen Grundsubstanz und Kreuzvernetzer der Young-Modulus im oben genannten Bereich variiert werden.
Selbstverständlich gilt dies auch für die übrigen oben genannten und in den Literaturstellen zitierten Elastomere. Derartige geringfügige Veränderungen fallen ebenfalls ausdrücklich mit unter den Erfmdungsgedanken.
Eine unstrukturierte Oberfläche aus einem Elastomer ist durch ein geeignetes Verfahren sehr schnell auf der Oberfläche einer geeigneten Zellkulturvorrichtung aufzubringen bzw. herstellbar. Dadurch ist vorteilhaft eine industrielle Serienfertigung erfindungsgemäßer Zellkulturvorrichtungen aus den bekannten Zellkulturvorrichtungen möglich.
Eine gleichmäßige, die Zellkulturvorrichtung bedeckende Schicht des Elastomers ist durch einen Fachmann quasi beliebig einstellbar, sofern er ein geeignetes Verfahren, wie z. B. eine Rotationsbeschichtung oder ein Gießverfahren anwendet.
Mit den zu verwendenden Mischungen aus Grundsubstanz und gegebenenfalls Copolymer (Kreuzvernetzer) sind Schichtdicken von etwa 100 Nanometer bis einigen Zentimeter reproduzierbar herstellbar. Hierzu werden die Grundsubstanz und gegebenenfalls ein Kreuzvernetzer und/oder Katalysator vermischt und in oder auf der Zellkulturvorrichtung gleichmäßig verteilt, so dass die Oberfläche, welche zur Aufnahme der Zelle vorgesehen ist, aus dem unstrukturierten Elastomer gebildet wird.
Die Quervernetzung zum Elastomer erfolgt regelmäßig erst nach dem Aufbringen des Elastomers auf der Zellkulturvorrichtung.
Zur Herstellung hochelastischer Oberflächen für die Zellkultur ist vorteilhaft ein Verfahren anzuwenden, durch das schnell im industriellen Sinne ein unstrukturierter, ebener Elastomerfilm reproduzierbar auf der Oberfläche der Vorrichtung herstellbar ist. Hierdurch wird die Serienfertigung an den erfmdungsgemäßen Zellkulturvorrichtungen ermöglicht. Besonders vorteilhaft für die Herstellung sehr dünner und gleichmäßiger Schichten des Elastomers sind Rotationsverfahren.
Dabei wird eine geringe Menge eines noch nicht vernetzten flüssigen Elastomers auf die Oberfläche der Vorrichtung gegeben und durch eine geeignete, eine Drehung ausübende Vorrichtung über Zentrifugalkraft verteilt.
Im Falle von Elastomeren, welche einen Kreuzvernetzer umfassen, wird dieser vorab zu der Grundsubstanz gegeben und mit dieser vermischt, gegebenenfalls wird ein Katalysator zugegeben.
Die Vorrichtung nebst flüssigen Elastomer wird beispielsweise in einem spin-coater eingespannt. Die Vorrichtung kann alternativ aber auch mittels Vakuum auf einem Drehteller gehalten werden.
Durch Rotation bei z. B. 1000 upm je Minute wird das Elastomer als ein sehr gleichmäßiger unstrukturierter Film auf dem Boden des Zellkulturgefäßes verteilt. Die gebildete Schicht dient dann der Aufnahme der Zellen im Zellkulturverfahren.
Nach der gegebenenfalls katalysatorgetriebenen Aushärtung behält zumindest ein Elastomer aus der Gruppe der Siloxanharze über einen nahezu unbegrenzten Zeitraum und ohne einen zusätzlichen Aufwand seine elastischen Eigenschaften bei.
Die resultierende Schichtdicke ist abhängig von der Viskosität und von der Menge des noch unvernetzten Elastomers, der Drehgeschwindigkeit und der Beschleunigung und Prozessdauer während der Rotationsbeschichtung.
Ein Fachmann ist ohne weiteres in der Lage, mit den angegebenen Verfahrensparametern verschiedenste Schichtdicken an Elastomeren reproduzierbar herzustellen.
Es kann z. B. regelmäßig eine geringe Menge des unvernetzten Elastomers mit etwa 1000 Umdrehungen je Minute mittels eines spin-coaters auf die Oberfläche einer gewünschten Vorrichtung aufgebracht und verteilt werden. Alternativ zum Rotationsverfahren ist ein Aufgießen des Elastomers ohne eine anschließende Rotation oder ein Streichverfahren, bei dem mittels einer geeigneten Apparatur gleichmäßige Schichtdicken auf Oberflächen aufgestrichen werden oder ein Rollverfahren, bei dem das Elastomer mittels einer Rolle auf Oberflächen aufgerollt wird oder ein Walzverfahren oder eine Kombination dieser verschiedenen Verfahren eine denkbare Alternative zum Rotationsverfahren.
Es sind insbesondere Petrischalen, Objektträger oder auch Deckgläschen mit einer entsprechenden Oberfläche aus einer zu der Zellkultur hingewandten Oberfläche aus einem der genannten Elastomere herstellbar. Darüber hinaus sind aber auch Multiwellplatten, Zellkulturflaschen und andere aus der Zellkultur gemäß Stand der Technik gebräuchliche Formen mit einem Elastomer gleichmäßig zu beschichten.
Der Erfindungsgedanke ist auf jedes bisher bekannt gewordene Zellkulturgefäß bzw. auf jede Zellkulturvorrichtung übertragbar.
Ein Fachmann kann daher jede aus den einschlägigen Labor- und Fachkatalogen entnehmbare Zellkulturvorrichtung mit einer Oberfläche aus einem Elastomer beschichten. Es wird so besonders vorteilhaft eine neue Klasse an Zellkulturgefäßen und -Vorrichtungen bereitgestellt.
Ein Waschschritt des kreuzvernetzten Elastomers mit Isopropanol, insbesondere reinem I- sopropanol, erhöht die transparenten Eigenschaften des Elastomers.
Dies ist bei einer unstrukturierten ebenen Oberfläche ausgesprochen wichtig. In der Regel ist hierfür ein Waschschritt in dem Alkohol von etwa 3 Stunden ausreichend.
Insbesondere bei höheren Elastizitäten des Elastomers der erfindungsgemäßen Vorrichtung mit Young-Moduli < 50 kPa bewirkt ein Waschschritt mit Isopropanol, dass nicht kreuzvernetzte Bestandteile aus agglomerierten Bläschen der Schicht hinaus diffundieren. Durch den Waschschritt wird also die Beobachtbarkeit der Zellen verbessert.
Es ist denkbar, hierzu eine andere Substanz bzw. Alkohol zu verwenden.
Die Oberfläche der Zellkulturvorrichtung mit dem Elastomer sollte jedenfalls zur besseren Beobachtbarkeit der Zellen, vorzugsweise wie die von Glas aussehen. Das Elastomer der Zellkulturvorrichtung kann in einer ganz besonders vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung durch Physisorption von Biomolekülen aktiviert vorliegen.
Mittels Physisorption werden spezielle Adhäsionsproteine an die Oberfläche der Vorrichtung aufgebracht. Die Physisorption bezeichnet im Allgemeinen eine passive Oberflächenbeschich- tung, bei der sich Biomoleküle aus einer wässrigen Lösung auf die darunter liegende Oberfläche absetzen und eine mehr oder weniger gleichmäßige Schicht aufbauen. Hierdurch werden definierte Adhäsionsbedingungen für Zellen vorgegeben, welche die Analyse sehr spezifischer Fragen ermöglichen. Nur beispielhaft sei die Untersuchung biochemischer Aspekte von Zell-Substrat-Interaktionen unter definierten Bedingungen genannt.
Zu diesem Zweck werden Biomoleküle wie z. B. Fibronektin, Laminin, Collagen, Tenascin oder Hyaluronsäure zunächst in Puffer gelöst. Die Flüssigkeit nebst Biomolekül wird auf das bereits vernetzte Elastomer aufgebracht. Dabei lagert sich das Biomolekül passiv als dünne Schicht an das Elastomer an. Die Restflüssigkeit wird sodann wieder entfernt.
Das Biomolekül für ein beliebiges Elastomer wird im Wesentlichen an Hand der Fragestellung bzw. der Zellen ausgewählt.
Dadurch wird ganz besonders vorteilhaft bewirkt, dass die hydrophobe Eigenschaft des Elastomers zumindest teilweise aufgehoben wird und gleichzeitig spezifische Wechselwirkungen unter in vivo-Bedingungen zwischen dem Protein als Biomolekül und den Zellen ennöglicht werden. Dadurch sind die Elastomere ganz besonders gut für Zellkulturverfahren geeignet.
Es ist aber auch denkbar, das erfindungsgemäße Zellkulturverfahren in einer erfindungsgemäßen Vorrichtung ohne derartige Veränderungen durchzufuhren, da einige Zelltypen auch ohne durch Physisorption veränderte Elastomere auskommen.
Die Vielzahl an Kombinationsmöglichkeiten in Bezug auf die Parameter Art des Elastomers, Elastizität und Art der Physisorption eröffnen, wie im Ausführungsbeispiel angegeben, in Bezug auf die Differenzierung von Zellen nach Zugabe von Therapeutika eine Vielzahl von Möglichkeiten, spezifische Fragestellungen zu bearbeiten, welchen mit den bisherigen ZeIl- kulturverfahren nicht nachgegangen werden konnte.
Es ist denkbar, für komplexe Fragestellungen in dem Elastomer gesonderte Stege als Struktur anzuordnen, um die Reaktion der Zellen auf Chemikalien oder Therapeutika nachzuweisen. Es ist möglich, auf diese Weise Chemotaxis im weitesten Sinne sowie auch das Teilungsverhalten unter diesen Bedingungen zu analysieren.
Es ist denkbar, komplexere Schichtenfolgen anzuordnen, z. B. durch Stempelung von Biomolekülen mittels Mikro- bzw. Nanokontaktstempel nach vorheriger Passivierung der Zwischenbereiche.
Ein erfindungsgemäßes Zellkulturverfahren sieht vor, Zellen z. B. aus einer Vorkultur auf ein gegebenenfalls verändertes Elastomer der Vorrichtung aufzubringen und zu kultivieren.
Der Begriff Zellkultur ist in Bezug auf die verwendeten Zellen weit gefasst. Er umfasst proka- ryotische und eukaryotische, vereinzelt vorliegende Zellen, als auch vielzellige Gebilde. Insbesondere für Zellen eukaryotischen Ursprungs sind die erfindungsgemäßen Vorrichtungen vorteilhaft, da diese Zellen in der Regel adhärieren.
Der Begriff Zellkultur umfasst unter anderem die Analyse von Zellen in der Wirkstoffforschung unter naturnaher Elastizität. Die Differenzierung, die Teilungsraten und/oder das Wanderungsverhalten der Zellen auf dem Elastomer sind dabei von besonderem Interesse.
In Abhängigkeit vom verwendeten Zelltyp sind hierfür die notwendigen Randbedingungen für die Kultur und für das Elastomer anzupassen.
Beispielhaft seien als Randbedingungen die Auswahl eines geeigneten synthetischen, flüssigen Nährmediums, Hilfsstoffe wie Vitamine, die Temperatur oder die Form des Kulturgefäßes genannt.
In einer ganz besonders vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung kann während des Zellkulturverfahrens die Differenzierung der Zelle über den Young-Modulus des Elastomers gezielt gesteuert werden. So sind vorteilhaft Fibroblasten, die auf das Elastomer aufgebracht wurden, in Abhängigkeit vom Young-Modulus des Elastomers in verschiedene Zelltypen wie cardiac Fibroblasten oder Myofibroblasten ausdifferenzierbar. Dies ist wiederum in der Wirkstoffanalyse und der Bereitstellung neuer Therapeutika von Interesse.
Im Rahmen der Erfindung wurde erkannt, dass auch die Anzahl der Zellteilungen je Zeiteinheit als Maß für die Teilungsrate von Zellen über den Young-Modulus der Elastomeroberfläche des Zellkulturgefaßes gesteuert werden kann. Je nach verwendeten Zelltyp nimmt sie auf weichen Oberflächen um bis 40% gegenüber Vorrichtungen gemäß Stand der Technik zu.
Im Weiteren wird die Erfindung an Hand von Ausführungsbeispielen und den beigefügten Figuren näher beschrieben.
Es zeigen:
Fig. 1 : Schemadarstellung des Vernetzungstypus einiger Harze (Stand der Technik) für erfindungsgemäße Zellkulturvorrichtungen.
Fig. 2: Adhärente Fibroblasten nach sechstägiger Kultur in einer Petrischale aus Polypropylen (Stand der Technik) mit einem zentral angeordneten Deckglas als Zellkulturboden. a) Antikörpermarkierung des Zytoskeletts. b) zu a) korrespondierende Durchlichtaufhahme.
Fig. 3: Adhärente Fibroblasten nach sechstägiger Kultur in einer Petrischale aus Polypropylen mit einem zentral angeordneten Deckglas und einer hierauf angeordneten elastischen Oberfläche aus PDMS mit einem Young-Modulus von 38 kPa als Zellkulturboden. a) Antikörpermarkierung des Zytoskeletts. b) zu a) korrespondierende Durchlichtaufhahme.
Fig. 4: Konfokal erstellte Seitenansicht einer Zellkulturvorrichtung gemäß Fig. 3.
Fig. 1 zeigt schematisch den Vernetzungstypus von drei Harzsorten, welche erfindungsgemäß als unstrukturierter Untergrund für Zellen dienen können (Stand der Technik). Für die Anordnung gemäß der Fig. 3 wurden Fibroblasten isoliert und in einer Konzentration von etwa 5000 Zellen je cm2 auf eine PDMS-Oberfläche, hergestellt aus einem sylgard 184- Kit, ausplattiert.
Das Kit umfasst vinylterminiertes Siloxan als Grundsubstanz sowie Methylhydrosiloxan- Dimethylsiloxan als Copolymer und beigemischten Pt-Katalysator.
Die Mischung aus Siloxan und Copolymer wurde im Mischungsverhältnis von 50:1 an Grundsubstanz zu Kreuzvernetzer angesetzt, gemischt und im Eksikator entgast.
Ein Deckglas mit den Maßen 25 x 75 mm und einer Dicke von -100 μm wurde auf den Drehteller eines Spincoaters vom Typ Delta 10T der Firma Süss Microtech montiert und mit 3 ml des noch nicht kreuzvernetzten PDMS überzogen. Das Rotationsverfahren erfolgte für 30 Sekunden bei 1000 Umdrehungen je Minute.'
Die Unterseite des Deckglases wurde sodann mit n-Heptan von überflüssigem PDMS gereinigt. Die Aushärtung erfolgte in staubgeschützten Behältnissen bei 60° C über Nacht, wobei eine Elastizität von etwa 25 kPa erzielt wird.
Nach der Vernetzung wurde das Elastomer mit einer 2,5 μg/cm2 Fibronektin als einer zusätzlichen, die Adhäsion der Zellen begünstigenden Schicht beschichtet. Fibronektin gewährleistet eine Adhäsion der Zellen unter naturnahen und definierten Bedingungen. Hierzu wurde eine entsprechende geringe Menge aufgebracht und nach 20 Minuten die Restflüssigkeit wieder abgezogen.
Das Elastomer wurde in 2-Propanol unter leichtem Schütteln für 15 Stunden gewaschen, um überschüssiges Silikonöl, welches nicht kreuzvernetzt wurde, auszuwaschen. Dies verursacht bei dem angegebenen PDMS-Porymer mit einem Young-Modul von -25 kPa eine etwa 40%- ige Volumenreduktion bei gleichzeitiger Verbesserung der Durchsichtigkeit sowie eine Nachhärtung auf etwa 38 kPa. Die erzeugte Schichtdicke des Elastomers betrug nach diesem Schritt etwa 40 μm bei einem Poisson- Verhältnis von etwa 0,5. Das Deckglas wurde über das Elastomer von unten an ein zentral angeordnetes Loch im Boden einer Petrischale geklebt. Die Verbindung zwischen der PDMS-Oberfläche und dem Zellkulturgefäß erfolgte direkt über die adhäsiven Eigenschaften des bereits auf der Oberfläche kreuzvernetzten PDMS.
Alternativ hierzu ist es möglich, durch Verwendung eines zusätzlich eingesetzten zellverträglichen Klebers die Adhäsion zu vergrößern.
Als Vergleichsprobe wurde ein identisches Deckglas ohne ein derartiges Elastomer an eine im Übrigen identische Petrischale geklebt.
Embyronale Herzmuskel-Fibroblasten wurden isoliert und als Einzelzellen auf das Elastomer (Fig. 3) oder unmittelbar auf die Glasoberfiäche des Deckglases (Fig. 2) ausgesät.
Die Zellen gemäß der Fig. 3 wurden wie die Zellen in Fig. 2 für sechs Tage bei 37 0C in einer geeigneten Nährlösung inkubiert. Anschließend wurden die Zellen mit Formaldehyd fixiert und mit einem Antikörper gegen smouth muscle actin markiert und inkubiert. Smouth muscle actin gilt als Marker für die naturnahe Funktion der Krafterzeugung von Zellen. Die entsprechenden Fixierungs- und Markierungsprotokolle kann ein Fachmann leicht der entsprechenden Fachliteratur entnehmen.
Der Vergleich zwischen den Fig. 2a) und Fig. 3a) zeigt, dass nach 6 Tagen Kultur nur die Fibroblasten auf PDMS (Fig. 3 a) ein deutlich ausgebildetes, dichtes und parallel orientiertes Zytoskelett ausgebildet hatten. Auf dem durch das Deckglas gebildeten Untergrund der Vergleichsprobe (Fig. 2a) wurde diese für die Funktion absolut essentielle Struktur der parallelen Orientierung des Zytoskeletts hingegen nicht ausgebildet.
Die korrespondierenden Durchlichtaufnahmen zeigen, dass auf der PDMS-Oberfläche (Fig. 3b) gegenüber der Glasoberfläche (Fig. 2b) um etwa 40% höhere Zellzahlen auftraten. Dies beweist die erhöhte Zellteilungsrate auf PDMS gegenüber Glas und deutet auf einen deutlich geringeren Zellstress bei Anwendung einer elastischen Oberfläche hin. Das Experiment verdeutlicht, dass die Morphologie der Zellen und somit ihre Struktur und Funktion bei Wahl eines Elastomers als Untergrund positiv beeinflusst wird. Selbiges gilt für die Zellzahl.
Die entstandene Schichtdicke des Elastomers 3 liegt bei etwa 40 μm, wie in Fig. 4 gezeigt. Dabei zeigen Schicht 4 die angrenzende Luft, Schicht 2 stellt das Deckglas dar und Schicht 1 die auf dem PDMS angeordnete Flüssigkeit.

Claims

P a t e n t a n s p r ü c h e
1. Zellkulturvorrichtung mit einer unstrukturierten Oberfläche zur Aufnahme von Zellen, dadurch gekennzeichnet, dass die Oberfläche aus einem Elastomer gebildet ist.
2. Zellkulturvorrichtung nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch ein transparentes Elastomer.
3. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, gekennzeichnet durch einen Brechungsindex des Elastomers in einem Bereich von etwa 1,3 bis 1,5, insbesondere 1,4.
4. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, gekennzeichnet durch ein Elastomer mit einem Young-Modulus von 1 MPa bis 500 Pa.
5. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Oberfläche des Elastomers eine die Adhäsion und Kultur der Zellen begünstigende Schicht aufweist.
6. Vorrichtung nach vorhergehendem Anspruch 5, gekennzeichnet durch eine begünstigende Schicht aus Fibronektin, Laminin, Collagen, Tenascin oder Hyalu- ronsäure.
7. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, gekennzeichnet durch ein Elastomer mit einer Poissonzahl in einem Bereich von etwa 0,3 bis 0,5.
8. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, gekennzeichnet durch ein Elastomer, das nicht auf Wasserbasis beruht.
9. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, gekennzeichnet durch ein Elastomer aus einer Grundsubstanz aus einem Siloxanharz, einem Butadienharz oder einem Acrylatharz.
10. Vorrichtung nach vorhergehendem Anspruch, gekennzeichnet durch ein vinylterminiertes Siloxanharz.
11. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, gekennzeichnet durch ein Elastomer, umfassend ein Methylhydrosiloxan-Dimethylsiloxan Copolymer als Kreuzvernetzer.
12. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, gekennzeichnet durch eine Petrischale, einen Objektträger, ein Deckglas, eine Multiwellplatte, eine Zellkulturflasche, einen Probenträger zur Untersuchung chemischer und/oder biologischer Proben im Allgemeinen, insbesondere einen Probenträger mit Stegen und Kanälen im Sinne eines mikrofluidischen Systems oder eine Zellkulturkammer.
13. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass diese ein für in situ-Hybridisierungen und/oder Antikörpermarkierungen der Zellen geeignetes Material umfasst.
14. Verfahren zur Herstellung einer Zellkulturvorrichtung, dadurch gekennzeichnet, dass eine zur Aufnahme von Zellen vorgesehene Oberfläche der Vorrichtung mit einer unstrukturierten Oberfläche aus einem Elastomer beschichtet wird.
15. Verfahren nach Anspruch 14, bei dem ein Elastomer aus einem Siloxanharz, Butadienharz oder Acrylatharz gewählt wird.
16. Verfahren nach Anspruch 15, gekennzeichnet durch
Wahl eines vinylterminierten Siloxanharzes.
17. Verfahren nach Anspruch 15 , gekennzeichnet durch
Wahl eines chloridterminierten Siloxanharzes.
18. Verfahren nach einem der Ansprüche 14 bis 17, bei dem das Harz mit einem Copolymer als Kreuzvernetzer und gegebenenfalls mit einem Katalysator vor der Beschichtung der Oberfläche der Vorrichtung vermischt wird.
19. Verfahren nach einem der Ansprüche 14 bis 18, bei dem ein transparentes Elastomer gebildet wird.
20. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche 14 bis 19, gekennzeichnet durch
Ausführung eines Rotationsverfahrens zur Beschichtung der Vorrichtung mit dem Elastomer.
21. Verfahren nach einem der Ansprüche 14 bis 19, gekennzeichnet durch
Ausführung eines Streichverfahrens, Rollverfahrens oder Gießverfahrens.
22. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche 14 bis 21 , gekennzeichnet durch Wahl einer Temperatur von etwa 60 ° bis 120 ° Celsius während der Kreuz Vernetzung des Elastomers.
23. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche 14 bis 22, gekennzeichnet durch eine Polymerisierung des Elastomers unter UV-Licht.
24. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche 14 bis 23, bei dem das polymerisierte Elastomer mit Isopropanol gewaschen wird.
25. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche 14 bis 24, gekennzeichnet durch eine Sterilisierung der Vorrichtung nach Aushärtung des Elastomers.
26. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche 14 bis 25, bei dem ein Young-Modulus des Elastomers von 1 MPa bis 500 Pa hergestellt wird.
27. Zellkulturverfahren, dadurch gekennzeichnet, dass
Zellen in einer Zellkulturvorrichtung auf einem unstrukturierten Elastomer kultiviert werden.
28. Zellkulturverfahren nach Anspruch 27, bei dem Zellen auf einem Siloxanharz, Butadienharz oder Acrylatharz kultiviert werden.
29. Zellkulturverfahren nach Anspruch 27 oder 28, bei dem während der Kultivierung die Differenzierung, und/oder die Teilungsrate und/oder das Wanderungsverhalten der Zellen über den Young-Modulus des Elastomers gesteuert wird.
30. Zellkulturverfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche 27 bis 29, bei dem Zellen unter Zugabe von Therapeutika auf dem ebenen Elastomer kultiviert werden.
31. Zellkulturverfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche 27 bis 30, bei dem Fibroblasten auf dem Elastomer kultiviert werden.
32. Zellkulturverfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche 27 bis 31 , bei dem ein PDMS umfassendes Kit als Elastomer verwendet wird.
33. Zellkulturverfahren nach einem der Ansprüche 27 bis 32, gekennzeichnet durch ein sylgard-184-Kit.
34. Zellkulturverfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche 27 bis 33, bei dem Zellen auf einem Elastomer mit einem Young-Modulus von 1 MPa bis 500 Pa kultiviert werden.
35. Zellkulturverfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche 27 bis 34, bei dem Zellen auf einem transparenten Elastomer kultiviert werden.
36. Zellkulturverfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche 27 bis 35, dadurch gekennzeichnet, dass die Zellen auf einem Elastomer mit einer die Adhäsion und Kultur der Zellen begünstigenden Schicht kultiviert werden, z. B. auf einer Schicht umfassend Fibronektin, Lami- nin, Collagen, Tenascin oder Hyaluronsäure.
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