WO2007142277A1 - ヘパリン結合上皮細胞増殖因子様増殖因子に結合するモノクローナル抗体 - Google Patents

ヘパリン結合上皮細胞増殖因子様増殖因子に結合するモノクローナル抗体 Download PDF

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Ryo Iwamoto
Shingo Miyamoto
Kenya Shitara
Akiko Furuya
Kazuyasu Nakamura
Kumiko Takahashi
Hiroshi Ando
Kazuhiro Masuda
Yuka Sasaki
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Definitions

  • Monoclonal antibodies that bind to heparin-binding epidermal growth factor-like growth factor Monoclonal antibodies that bind to heparin-binding epidermal growth factor-like growth factor.
  • the present invention relates to a heparin-binding epidermal growth factor-like growth factor (hereinafter referred to as "HB-EG”), membrane-type HB-EGF, which is bound to the cell membrane. And a monoclonal antibody that binds to secretory HB-EGF and an antibody fragment thereof.
  • HB-EG heparin-binding epidermal growth factor-like growth factor
  • HB-EGF was purified and isolated from the culture supernatant of human macrophage-like cell line U-937 differentiated into macrophages by Higashiyama et al. In 1992 (Non-patent Document 1).
  • HB-EGF shares six cysteines that are conserved in the epidermal growth factor (EGF) family, and belongs to the EGF family and other proteins belonging to the EGF family. Similarly, it is synthesized as a type I membrane protein (Non-patent Documents 1 and 2).
  • Membrane-type HB-EGF is activated by a variety of physiological stimuli such as heat and osmotic stress, growth factors, cytodynamic in and G protein-coupled receptor (GPCR) agonist lysophosphatidic acid (LPA) It is converted to 14-22 kilodalton (hereinafter referred to as kDa) secreted HB-EGF by the meta-metabolized protease (Non-Patent Documents 1-3).
  • physiological stimuli such as heat and osmotic stress, growth factors, cytodynamic in and G protein-coupled receptor (GPCR) agonist lysophosphatidic acid (LPA) It is converted to 14-22 kilodalton (hereinafter referred to as kDa) secreted HB-EGF by the meta-metabolized protease (Non-Patent Documents 1-3).
  • Non-patent document 1 EGF receptor (EGFR / ErbBl) (Non-patent document 1), ErbB4 (Non-patent document 4) and N-arginine dibasic convertase (Non-patent document 5), and fibroblasts It has a proliferation promoting activity against smooth muscle cells (Non-patent document 1), keratinocytes (Non-patent document 6), hepatocytes (Non-patent document 7), and mesangial cells (Non-patent document 8).
  • Non-patent Documents 28, 29 and 31 organ formation such as heart valves (Non-patent Documents 28, 29 and 31), wound healing (Non-patent Documents 9 and 10), and smooth muscle cell hyperplasia caused by atherosclerosis (Non-patent Document 11) , Restenosis (Non-Patent Documents 12 and 13), pulmonary hypertension (Non-Patent Document 14), liver regeneration (Non-Patent Document 15), brain disorders (Non-Patent Document 16) and cancer (Non-Patent Documents 28 to 35) It is also known that HB-EGF is involved.
  • Non-patent Document 17 Membrane-type HB-EGF is known to form a complex with tetraspanins such as CD9 and integrin ⁇ 3
  • HB-EGF knockout mice Created HB-EGF knockout (KO) mice and analyzed the physiological functions of HB-EGF. As a result, HB-EGF KO mice showed signs of ventricular dilatation, decreased cardiac function, and heart valve hypertrophy. More than half died in the first few days of life. This indicates that HB-EGF is an essential protein for the development and function of the heart (Non-patent Document 24).
  • HB-EGF HB-EGF
  • HB Atm Two types of genes of HB-EGF
  • HB UC- expressing mice showed symptoms similar to HB-EGF KO mice, suggesting that secreted H B-EGF functions as an active protein. Most HB Atm- expressing mice died before or during the neonatal period. Furthermore, keratinocyte hyperplasia and ventricular hypertrophy from the neonatal period were observed in HB Atm / + mice in which the mutation was introduced into only one of the alleles. These symptoms were the opposite phenotype of HB-EGF KO mice and HBue expressing mice.
  • CRM197 Non-patent Document 26
  • Non-patent Document 26 known as a diphtheria toxin mutant, specifically inhibits the cell growth promoting activity of HB-EGF and does not penetrate the cell membrane.
  • the CRM197 is, hyperplasia and ventricular hypertrophy is a phenotype of HB Atm expressing mice since won suppressed, HB Atm generated in HB Atm expressing mice acts bind to receptors in the cell prior secretion However, it is presumed to act by binding to cell surface receptors after being secreted extracellularly. Therefore, the quantitative balance between membrane-type HB-EGF and secretory HB-EGF in vivo is essential for maintaining normal physiological functions, and membrane strength of HB-EGF is also converted to secretory in vivo. Process power is considered to be controlled. Higashiyama et al.
  • Non-patent Documents 28-31). it has been reported that HB-EGF is highly expressed in various cancers such as breast cancer, liver cancer, knee cancer, bladder cancer and the like. Recently, it was revealed that HB-EGF is an important factor for cancer growth (Non-patent Documents 32 and 33).
  • Mekokoro et al. Introduced HB-EGF small interference RNA (siRNA) into cancer cell lines, or transplanted cancer cell lines into mice. It was clarified that the administration of CRM197 shows a remarkable tumor growth inhibitory effect. Higashiyama et al.
  • HB-EGF vascular endothelial growth factor
  • VEGF vascular endothelial growth factor
  • cyclin D1 expression in vitro. It revealed that. In vivo, it was also reported that increased tumorigenicity and tumor angiogenesis were observed in nude mice. Such growth-promoting action is observed only when the membrane-type HB-EGF or secretory HB-EGF gene is expressed, and is observed when the protease-resistant membrane-type HB-EGF gene is forcibly expressed. I was helped. Therefore, it was suggested that secreted HB-EGF may be an important factor related to tumor growth in ovarian cancer and bladder cancer.
  • VEGF vascular endothelial growth factor
  • HB-EGF expression in clinical patients Mekaroda et al. Analyzed the expression level of HB-EG F mRNA in tumor tissues of ovarian cancer patients and the concentration of secreted HB-EGF protein in ascites. Among them, only HB-EGF has been reported to be upregulated (Non-patent Document 32). Furthermore, Enomoto et al. Reported that the prognosis of ovarian cancer patients with high expression of tumor HB-EGF mRNA was worse than that of patients with low expression (Non-patent Document 34).
  • Non-patent Document 35 Several polyclonal antibodies and one monoclonal antibody (both manufactured by R & D) are known as antibodies that bind to secreted HB-EGF and inhibit its activity.
  • Anti HB-EGF The reclonal antibody (manufactured by R & D) is a membrane surface type HB-EG expressed in COS-7 cells.
  • Non-patent Document 3 Binding to F has been reported. It is widely known that when a membrane protein is present on the surface of a cell such as cancer, a monoclonal antibody that binds to the protein can be a therapeutic agent that inhibits the proliferation of the cell (Non-patent Document 36). However, secretory HB-EGF, HB-EGF bound to cell membrane, and monoclonal antibody that binds to membrane HB-EGF have not been reported to date.
  • Non-patent literature l Science, Vol. 251, 936, 1991
  • Non-Patent Document 2 J. Biol. Chem. 267 (1992) 6205-6212
  • Non-Patent Document 3 Nature, Vol. 402, 884, 1999
  • Non-Patent Document 4 EMBO J.16 (1997) 1268-1278
  • Non-Patent Document 5 EMBO J.20 (2001) 3342-3350
  • Non-Patent Document 6 J. Biol. Chem. 269 (1994) 20060- 20066
  • Non-Patent Document 7 Biochem Biophys. Res. Commun. 198 (1994) 25-31
  • Non-Patent Document 8 J. Pathol. 189 (1999) 431-438
  • Non-Patent Document 9 Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90 (1993) 3889-3893
  • Non-Patent Document 10 J. Cell Biol. 151 (2000) 209-219
  • Non-Patent Document 11 J. Clin. Invest., 95, 404, 1995
  • Non-Patent Document 12 Arterioscler. Thromb. Vase. Biol. 16 (1996) 1524-1531
  • Non-Patent Document 13 J. Biol. Chem. 277 (2002) 37487-37491
  • Non-Patent Document 14 Am. J. Pathol. 143 (1993) 784-793
  • Non-Patent Document 15 Hepatology 22 (1995) 1584-1590
  • Non-Patent Document 16 Brain Res. 827 (1999) 130-138
  • Non-Patent Document 17 Biochem. Biophys. Acta., Vol. L333, F179, 1997
  • Non-Patent Document 18 J. Cell Biol. 128 (1995) 929-938
  • Non-Patent Document 19 J. Cell Biol. 129 (1995) 1691-1705
  • Non-Patent Document 20 Cytokine Growth Factor Rev., Vol.ll, 335, 2000
  • Non-Patent Document 21 Int. J. Cancer, Vol. 98, 505, 2002
  • Non-Patent Document 22 J. Histochem. Cytochem., Vol. 49, 439, 2001
  • Non-Patent Document 23 Cell, Vol. 69, 1051, 1992
  • Non-Patent Document 24 PNAS, Vol.l00,3221,2003
  • Non-Patent Document 26 J. Biol. Chem., Vol. 270, 1015, 1995
  • Non-Patent Document 27 Nat.Med., Vol.8,35,2002
  • Non-Patent Document 28 Breast Cancer Res. Treat., Vol. 67, 81, 2001
  • Non-Patent Document 30 Biochem. Biophys. Res. Commun., Vol. 202, 1705, 1994
  • Non-Patent Literature 36 Nat. Rev. Drug. Discov., Vol. 2, 52-62, 2003
  • the present invention relates to the following (1) to (24).
  • HB-EGF Heparin binding epidermal growth factor-like growth factor
  • membrane type HB-EGF membrane type HB-EGF
  • Complementarity determining region (hereinafter referred to as CDR) 1, CDR2 and CDR3 of antibody heavy chain variable region (hereinafter referred to as VH) are represented by SEQ ID NOs: 12, 13 and 14, respectively.
  • CDR1, CDR2, and CDR3 of the light chain variable region (hereinafter referred to as VL) of the antibody include the amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 15, 16, and 17, respectively (1) to (7) and (11), the monoclonal antibody or the antibody fragment thereof according to item 1.
  • the recombinant antibody is selected from a human chimeric antibody, a humanized antibody and a human antibody The antibody or antibody fragment thereof according to (13).
  • VH force of human chimeric antibody The human chimeric antibody or the human chimeric antibody according to (14), comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9, and VL comprising the amino acid sequence represented by (11) Its antibody fragment.
  • VH force of humanized antibody The 9th Ala of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 22 or the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 22 is set to Thr, the 20th Val is set to Leu, and the 30th Thr is set to Arg, 38th Arg to Lys, 41st Pro to Thr, 48th Met to lie, 67th Arg to Lys, 68th Val to Ala, 70th lie to Leu.
  • the ability to replace 95th Tyr with Phe and 1 18th Val with Leu which contains an amino acid sequence into which at least one selected alteration has been introduced, and
  • the VL of the humanized antibody is the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 23 or the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 23, 15th Leu to Val, 19th Ala to Val, 21st lie to Met
  • Antibody fragments are Fab, Fab ⁇ F (ab '), single chain antibody (scFv), dimerization V region (Diabod
  • dsFv disulfide-stabilized V region
  • the transformant according to (20) is cultured in a medium, and the antibody or antibody fragment thereof according to any one of (1) to (17) is produced and accumulated in the culture, The method for producing an antibody or antibody fragment thereof according to any one of (1) to (17), wherein the antibody or the antibody fragment is collected.
  • a medicament comprising the antibody or antibody fragment thereof according to any one of (1) to (17) as an active ingredient.
  • an antibody that binds to a cell membrane and binds to HB-EGF, membrane-type HB-EGF, and secretory HB-EGF.
  • FIG. 1-1 shows the reactivity of various anti-HB-EGF monoclonal antibodies in a binding ELISA.
  • the horizontal axis represents the concentration of each antibody, and the vertical axis represents the binding activity of each antibody.
  • ⁇ indicates monoclonal antibody KM511, country indicates monoclonal antibody KM3566, ⁇ indicates monoclonal antibody KM356 7, ⁇ indicates monoclonal antibody KM3579, and ⁇ indicates monoclonal antibody MAB259.
  • FIG. 1-2 shows the HB-EGF-EGFR binding inhibitory activity of anti-HB-EGF monoclonal antibodies KM3566, KM3567, KM3579 and MAB259.
  • the horizontal axis represents the concentration of each antibody, and the vertical axis represents the binding of piotin-labeled HB-EGF in terms of fluorescence intensity.
  • the horizontal line indicates the fluorescence intensity when piotin-labeled HB-EGF is added and without antibody, and the horizontal dotted line indicates the fluorescence intensity when piotin-labeled HB-EGF is not added and when no antibody is added.
  • ⁇ represents monoclonal antibody KM3566
  • X represents monoclonal antibody KM3567
  • ⁇ represents monoclonal antibody KM3579
  • country represents monoclonal antibody MAB259.
  • FIG. 2-1 shows the HB-EGF neutralizing activity of various anti-HB-EGF monoclonal antibodies.
  • the horizontal axis represents the concentration of each antibody, and the vertical axis represents the growth inhibition rate (%).
  • ⁇ represents monoclonal antibody KM511, ⁇ represents monoclonal antibody KM3566, ⁇ represents monoclonal antibody KM3579, and ⁇ represents monoclonal antibody MAB259.
  • FIG. 2-2 shows the HB-EGF neutralizing activity of various anti-HB-EGF monoclonal antibodies.
  • the horizontal axis shows the concentration of each antibody, and the vertical axis shows cell proliferation.
  • HB-EGF (+) indicates cell proliferation when HB-EGF is added and without antibody
  • HB-EGF ( ⁇ ) indicates cell proliferation when HB-EGF is not added and when antibody is not added.
  • the mouth represents the monoclonal antibody MAB259
  • the country represents the monoclonal antibody KM3567
  • the triangle represents the monoclonal antibody KM3566.
  • FIG. 3 shows the reactivity of various anti-HB-EGF monoclonal antibodies in FCM analysis.
  • the horizontal axis represents the concentration of each antibody, and the vertical axis represents the mean fluorescence intensity MFI value.
  • X represents the monoclonal antibody KM511
  • ⁇ represents the monoclonal antibody KM3566
  • the mouth represents the monoclonal antibody KM3579
  • ⁇ represents the monoclonal antibody MAB259.
  • FIG. 4 shows the reactivity of various anti-HB-EGF monoclonal antibodies against MDA-MB-231 cells in FCM analysis.
  • the solid line in each histogram is the negative control antibody KM511, and the broken line is the anti-antibody
  • HB-EGF antibody is shown.
  • A MAB529, (b) KM3566, (c) KM3567, (d) KM3579.
  • FIG. 5 shows a construction process of an anti-HB-EGF chimeric antibody expression vector pKANTEX3566.
  • FIG. 6 shows the electrophoresis pattern of the purified anti-HB-EGF chimeric antibody KM3966 on SDS-PAGE (using 5-20% gradient gel).
  • Lane 1 shows the molecular weight marker
  • lane 2 shows the anti-HB-EGF chimeric antibody KM3966 under reducing conditions
  • lane 3 shows non-reducing conditions.
  • a reactivity of 966 is shown.
  • the vertical axis represents the number of cells, and the horizontal axis represents the fluorescence intensity.
  • FIG. 8 shows the reactivity of anti-HB-EGF chimeric antibody KM3966 against human solid cancer cell lines treated with recombinant HB-EGF in flow cytometry.
  • the vertical axis represents the number of cells
  • the horizontal axis represents the fluorescence intensity.
  • FIG. 9 shows the neutralizing activity of anti-HB-EGF chimeric antibody KM3966 against human HB-EGF.
  • the vertical axis represents the absorbance value of O.D450 nm representing the number of viable cells, and the horizontal axis represents the antibody concentration. The country is negative. Control antibody human IgG mouth indicates KM3966.
  • HB-EGF (—) indicates that HB-EGF is not added, and HB-EGF (+) indicates that HB-EGF is added.
  • FIG. 10 shows antibody-dependent cytotoxic activity (ADCC activity) of anti-HB-EGF chimeric antibody KM3966 against human solid cancer cell line.
  • the vertical axis in the figure represents the cytotoxic activity rate (%), and the horizontal axis represents the antibody concentration of the anti-HB-EGF chimeric antibody KM3966.
  • the horizontal line shows the cytotoxic activity when no antibody was added.
  • FIG. 11 shows antitumor activity of anti-HB-EGF chimeric antibody KM3966 in an early cancer model.
  • the vertical axis in the figure represents the tumor volume, and the horizontal axis represents the number of days after cancer cell transplantation.
  • ⁇ indicates PBS administration group, ⁇ indicates KM3966 10 mg / kg administration group. Bars indicate standard deviation.
  • FIG. 12 shows antitumor activity of an anti-HB-EGF chimeric antibody KM3966 in an advanced cancer model.
  • the vertical axis in the figure represents the tumor volume, and the horizontal axis represents the number of days after cancer cell transplantation.
  • ⁇ indicates PBS administration group, ⁇ indicates KM3966 10 mg / kg administration group. Bars indicate standard deviation.
  • FIG. 13 shows the reactivity of anti-HB-EGF mouse antibody KM3566 to human blood cancer cell lines by flow cytometry.
  • the vertical axis represents the number of cells, and the horizontal axis represents the fluorescence intensity.
  • A represents an acute myeloid leukemia cell line, and B represents a T cell leukemia cell line.
  • FIG. 14 shows antibody-dependent cytotoxic activity (ADCC activity) of anti-HB-EGF chimeric antibody KM3966 against human hematological cancer cell lines.
  • the vertical axis in the figure represents the cytotoxic activity rate (%), and the horizontal axis represents the antibody concentration of the anti-HB-EGF chimeric antibody KM3966.
  • the horizontal line shows the cytotoxic activity when the antibody is not added.
  • FIG. 15 shows the reactivity of anti-HB-EGF monoclonal antibodies KM3566, KM3579, and chimeric antibody KM3966 against mutant HB-EGF-expressing cells.
  • the vertical axis of the figure shows the reactivity (%) of each antibody, and the horizontal axis shows the type of mutant HB-EGF.
  • the membrane-type HB-EGF has a transmembrane domain and binds to the cell membrane, and also includes a signal sequence, a pro region, a heparin-binding domain, an EGF-like domain, and a jaxtamen blend main
  • Specific examples include a polypeptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2.
  • secretory HB-EGF refers to an extracellular domain containing an EGF-like domain in which the membrane-binding site of membrane-type HB-EGF has been cleaved with a protease or the like.
  • HB-EGF bound to the cell membrane refers to HB-EGF that binds to the surface of the cell membrane due to its heteroprotein binding activity and electrostatic binding activity.
  • the substance to which secretory HB-EGF binds may be any substance that exists on the cell membrane and to which secretory HB-EGF binds. More preferred is glycosaminodarlican, and particularly preferred is heparan sulfate.
  • HB-EGF has an activity to bind to diphtheria toxin, EGF receptor ErbBl or ErbB4.
  • membrane-type HB-EGF include the following proteins (a), (b), and (c).
  • Examples of secreted HB-EGF include the following proteins (a), (b), and (c).
  • the number of amino acids to be deleted, substituted, inserted and / or added is one or more, and the number is not particularly limited. However, deletion, substitution, Or it is a number which can be added, for example, 1 to several tens, preferably 1 to 20, more preferably 1 to 10, and further preferably 1 to 5.
  • the protein to which diphtheria toxin, EGF receptor ErbBl or ErbB4 binds is at least 80% or more, preferably 85% or more, more preferably a protein having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, 3, 4 or 5.
  • the homology value is a value calculated using a homology search program known to those skilled in the art, and the base sequence is BLAST [Journal's ⁇ Biology (J. Mol. Biol), 215, 403 (1990)], the numerical values calculated using default parameters.
  • BLAST2 Nucleic Acid Res., 25, 3389 (1997)]; Genome Res., 7, Ri 49 (1997); http: // www.ncbi.nlm.nih.gov/Education/BLASinfo/infomation3.html includes numerical values calculated using default parameters.
  • the default parameters are 1 if G (Cost to open gap) is a base sequence, 11 if it is an amino acid sequence, 2 if -E (Cost to extend gap) is a base sequence, and 3 ⁇ 4r of the amino acid sequence.
  • Is 1, -q (penalty for nucleotide mismatch) force 3 one r (rewara for nucleotide match) is 1, -e (expect value) force 0, and -W (wordsize) is a base sequence, 11 residues, 3 residues for amino acid residues, 20 if -y (Dropoff (X) for blast extemsions in bits) is blastn, 25 for programs other than blastn (http: ⁇ www.ncbi.nlm .nih.gov / blastcg ihelp.html) o Examples of amino acid sequence analysis software include FASTA [Methods in Enzymology, 183, 63 (1990)].
  • the antibody of the present invention is a monoclonal antibody that binds to a cell membrane and binds to HB-EGF, membrane-type HB-EGF, and secretory HB-EGF, and HB-EGF bound to the cell membrane, It includes monoclonal antibodies that bind to epidermal growth factor-like domains (EGF-like domains) of membrane-type HB-EGF and secretory HB-EGF.
  • EGF-like domains epidermal growth factor-like domains
  • the EGF-like domain specifically includes a polypeptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 or 5.
  • the monoclonal antibody that binds to the EGF-like domain includes a monoclonal antibody that inhibits binding between secretory HB-EGF and HB-EG F receptor.
  • Examples of antibodies that inhibit the binding between secretory HB-EGF and HB-EGF receptor include monoclonal antibodies that bind to the binding region between secretory HB-EGF and HB-EGF receptor or diphtheria toxin. It is done.
  • the antibody of the present invention includes an antibody having neutralizing activity against secretory HB-EGF.
  • the neutralizing activity includes the activity of suppressing the biological activity of secreted HB-EGF, for example, the activity of suppressing cell growth of cells expressing the HB-EGF receptor. I can get lost.
  • a monoclonal antibody that binds to an epitope comprising at least one amino acid among amino acids 115 to 147 of the polypeptide having the amino acid represented by SEQ ID NO: 2, preferably A monoclonal antibody that binds to an epitope containing at least one amino acid from the 133rd to the 147th, more preferably the 115th, 122th, 124th, 125th, 127th, 129th, 133th, 135th, 141 A monoclonal antibody that binds to an epitope containing at least one amino acid among the amino acids 147 and 147, and more preferably at least the amino acids 133 and 135 of the 133, 135, and 147 amino acids.
  • Monoclonal antibodies that bind to the containing epitopes most preferably 133, 135 and And monoclonal antibodies that bind to epitopes containing the 147th amino acid.
  • Monoclonal antibodies produced by Hypridoma KM3566 (FERM BP-10490), Hypridoma KM35 67 (FERM BP-10573), and monoclonal antibodies produced by hybridoma KM3579 (FERM BP-10491).
  • Monoclonal antibodies that bind to the binding epitopes are exemplified as antibodies of the present invention.
  • an antibody having neutralizing activity is a monoclonal antibody that binds to an epitope containing the amino acids 133, 135, and 147 of the polypeptide having the amino acid represented by SEQ ID NO: 2.
  • Examples of the monoclonal antibody of the present invention include antibodies produced by hypridoma and recombinant antibodies.
  • hybridomas are monoclonals with the desired antigen specificity obtained by fusing B cells obtained by immunizing mammals other than humans with myeloma cells. A cell that produces an antibody.
  • the recombinant antibody includes antibodies produced by genetic recombination, such as human chimeric antibodies, humanized antibodies, human antibodies, or antibody fragments thereof. Recombinant antibodies having characteristics of monoclonal antibodies, low antigenicity and extended blood half-life are preferred as therapeutic agents.
  • recombinant antibody of the present invention include CDR1, CDR2 and CDR3 forces of VH of the antibody, amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 12, 13, and 14, respectively, and CDR1, CDR2 and CDR of antibody VL.
  • Examples include recombinant antibodies in which CDR3 includes the amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 15, 16, and 17, respectively.
  • the recombinant antibody of the present invention includes antibodies produced by genetic recombination, such as human chimeric antibodies, humanized antibodies, human antibodies or antibody fragments thereof.
  • a human chimeric antibody is an antibody comprising VH and VL of a non-human animal antibody and a heavy chain constant region (hereinafter referred to as CH) and a light chain constant region (hereinafter referred to as CL) of a human antibody.
  • CH heavy chain constant region
  • CL light chain constant region
  • the human chimeric antibody of the present invention can be prepared as follows. First, cDNAs encoding VH and VL are obtained from hybridomas that produce monoclonal antibodies that bind to cell membrane and bind to HB-EGF, secretory HB-EGF, and membrane HB-EGF. The obtained cDNA is inserted into an animal cell expression vector having genes encoding human antibody CH and CL, respectively, to construct a human chimeric antibody expression vector, introduced into an animal cell, and expressed. Human-type chimeric antibodies can be produced.
  • the CH of the human chimeric antibody may be any as long as it belongs to human immunoglobulin (hereinafter referred to as hlg), but is preferably of the hlgG class, and hIgGl, hIgG2 belonging to the hlgG class. Any of the subclasses such as hIgG3 and hIgG4 can be used.
  • the CL of the human chimeric antibody any of those belonging to hlg can be used, and those of ⁇ class or ⁇ class can be used.
  • the human chimeric antibody of the present invention includes a human key antibody comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9 of the antibody VH and the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 11 of the antibody VL. Examples include melaantibodies.
  • the VH of the antibody is the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9.
  • Specific examples of the human chimeric antibody whose antibody VL is represented by SEQ ID NO: 10 include human chimeric antibody KM3966.
  • a human rabbit antibody refers to an antibody obtained by grafting the VH and VL CDR amino acid sequences of a non-human animal antibody into an appropriate position of the VH and VL of a human antibody. ⁇ reshaped— with antibodies
  • the humanized antibody of the present invention can be prepared as follows. First, the VH and VL CDRs of HB-EGF, secreted HB-EGF, and secreted HB-EGF produced by Hypridoma that bind to cell membranes are optionally added. A cDNA encoding the variable region grafted on the VH and VL frameworks (hereinafter referred to as FR) of the human antibody is prepared. The prepared cDNA is inserted into animal cell expression vectors having genes encoding human antibody CH and CL to construct a humanized antibody expression vector. Next, the humanized antibody expression vector can be produced by introducing the prepared humanized antibody expression vector into animal cells to express the humanized antibody.
  • FR VH and VL frameworks
  • Any amino acid sequence of FRs of VH and VL of human antibodies can be used as long as the amino acid sequences of FRs of VH and VL of human antibodies.
  • VH and VL FR amino acid sequences of human antibodies registered in databases such as Protein Data Bank U, 7 sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept.Health and Human Services (1991 The common amino acid sequences of the subgroups of human antibody VH and VL FRs, etc., as described in), etc. are used.
  • the CH of the humanized antibody if it belongs to hlg! /, It may be something! /, But the hlgG class is preferable, and hIgGl, hIgG2, hIgG3, hIgG4 belonging to the hlgG class is also preferred. Any of these subclasses can be used.
  • the CL of human rabbit antibody may be any of those belonging to hlg, and those of ⁇ class or e class can be used.
  • the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 23, or the 15th Leu, 19th Ala, 21st Ile, 49th Pro and 84th Leu force in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 23 Humanized antibodies each containing an amino acid sequence in which at least one amino acid residue is replaced with another amino acid residue, and the like, but the number of modifications to be introduced is not particularly limited.
  • the VH of the antibody is represented by SEQ ID NO: 22 in the 20th Val, 30th Thr, 38th Arg, 48th Met, 67 Arg, 68th Val, 70th Ile, 95th Tyr, and 118th Val, preferably the 20th Val in the amino acid sequence in which the antibody VH is represented by SEQ ID NO: 22, 30th A humanized antibody having an amino acid sequence in which Thr, 48th Met, 68th Val, 70th Ile, 95th Tyr, and 118th Val are substituted with other amino acid residues.
  • a humanized antibody having an amino acid sequence in which 30th Thr, 68th Val, 70th Ile, and 95th Tyr are substituted with other amino acid residues.
  • a humanized antibody preferably having an amino acid sequence in which the 30th Thr, the 68th Val, and the 70th lie are substituted with other amino acid residues.
  • Preferred examples include humanized antibodies containing an amino acid sequence in which the 30th Thr and the 70th lie are substituted with other amino acid residues.
  • the amino acid sequence of the antibody VH obtained as a result of the above-mentioned amino acid modification is represented by the 9th Ala in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 22 as Thr, the 20th Val in Leu, and the 30th Thr to Arg, 38th Arg to Lys, 41st Pro to Thr, 48th Met to lie, 6th Arg to Lys, 68th Val to Ala, 70th lie
  • An amino acid sequence in which at least one modification is also introduced, in which the modification ability of substituting L to, 95th Tyr to Phe, and 118th Val to Leu is also selected.
  • the 9th Ala in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 22 is Thr
  • the 20th Val is Leu
  • 30th Thr To Arg 38th Arg to Lys
  • 41st Pro to Thr 48th Met to lie
  • 67th Arg to Lys 68th Val to Ala
  • 70th lie to Leu
  • the amino acid sequence in which 95th Tyr is substituted with Phe and 118th Val is replaced with Leu.
  • the 9th Ala in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 22 is Thr
  • the 20th Val is Leu
  • 30th Thr to Arg 38th Arg to Lys
  • 41st Pro to Thr
  • 48th Met to lie
  • 67th Arg to Lys 68th Val to Ala
  • 70th Amino acid sequences in which lie is replaced with Leu and 95th Tyr is replaced with Ph e.
  • the amino acid sequence of VH into which nine modifications have been introduced specifically, the 9th Ala in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 22 is Thr, the 20th Val is Leu, 30th Thr to A rg, 41st Pro to Thr, 48th Met to lie, 67th Arg to Lys, 68th Val to Ala, 70th lie to Leu, And amino acid sequence with 95th Tyr replaced with Phe, 20th Val to Leu, 30th Thr to Arg, 38th Arg to Lys, 48th Met to lie, 67th Arg The amino acid sequence is substituted with Lys, 68th Val with Ala, 70th lie with Leu, 95th Tyr with Phe, and 118th Val with Leu.
  • amino acid sequence of VH into which seven modifications have been introduced is specifically represented by SEQ ID NO: 22.
  • amino acid sequence of VH into which seven modifications have been introduced is specifically represented by SEQ ID NO: 22.
  • the 30th Thr is replaced with Arg
  • the 48th Met is replaced with lie
  • the 68th Val is replaced with Ala
  • the 70th lie is replaced with Leu
  • the 95th Tyr is replaced with Phe.
  • amino acid sequence of VH into which three modifications are introduced is the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 22.
  • amino acid sequence of VH into which one modification has been introduced is specifically represented by SEQ ID NO: 22.
  • amino acid sequence of VH into which one modification has been introduced is specifically represented by SEQ ID NO: 22.
  • amino acid sequence in which the 9th Ala is replaced with Thr an amino acid sequence in which the 20th Val is replaced with Leu, an amino acid sequence in which the 30th Thr is replaced with Arg, an amino acid sequence in which the 38th Arg is replaced with Lys, Amino acid sequence in which 41st Pro is replaced with Thr, amino acid sequence in which 48th Met is replaced with lie, amino acid sequence in which 67th Arg is replaced with Lys, and amino acid sequence in which 68th Val is replaced with Ala
  • An amino acid sequence in which the 70th lie is replaced with Leu
  • an amino acid sequence in which the 95th Tyr is replaced with Phe an amino acid sequence in which the 118th Val is replaced with Leu.
  • VL of the antibody for example, the amino acid sequence in which the 15th Leu, the 19th Ala, the 21st Ile, and the 84th Leu in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 23 are substituted. can give.
  • Preferred is an amino acid sequence in which 19th Ala, 21st Ile, and 84th Leu are substituted.
  • the 15th Leu in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 23 is Val
  • the 19th Ala is Val
  • the 21st lie is Met
  • Examples include amino acid sequences in which at least one modification selected from the modification in which the 49th Pro is replaced with Ser and the 84th Leu is replaced with Val is introduced.
  • the 15th Leu in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 23 is Val
  • the 19th Ala is Val
  • Examples include amino acid sequences in which the 21st lie is replaced by Met, the 49th Pro is replaced by Ser, and the 84th Leu is replaced by Val.
  • amino acid sequence of VL into which four modifications have been introduced is the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 23.
  • amino acid sequence of VL introduced with three modifications is the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 23.
  • amino acid sequence of VL into which one modification has been introduced is the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 23.
  • Amino acid sequence in which the 15th Leu is replaced with Val an amino acid sequence in which the 19th Ala is replaced with Val, an amino acid sequence in which the 21st lie is replaced with Met, an amino acid sequence in which the 49th Pro is replaced with Ser, And an amino acid sequence in which 84th Leu is substituted with Val, and the like.
  • humanized antibody of the present invention include a humanized antibody whose variable regions have the amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 22 and 23.
  • a human antibody originally refers to an antibody that naturally exists in the human body, but a human antibody phage library prepared by recent advances in genetic engineering, cell engineering, and developmental engineering. The antibody etc. which can also obtain transgenic animal power are also included.
  • the antibody present in the human body can be isolated and cultured, for example, by isolating human peripheral blood lymphocytes, immortalizing by infecting EB virus or the like, and cloning. The antibody can be purified from the culture supernatant.
  • the human antibody phage library inserts an antibody gene prepared for human B cell power into the phage gene. This is a library in which antibody fragments such as ab and scFv are expressed on the phage surface.
  • phages expressing an antibody fragment having a desired antigen-binding activity on the surface can be collected using the binding activity to the substrate on which the antigen is immobilized as an index.
  • the antibody fragment can be further converted into a human antibody molecule comprising two complete heavy chains and two complete light chains by genetic engineering techniques.
  • a human antibody-producing transgenic animal means an animal in which a human antibody gene is integrated into the genome gene of a host animal.
  • a human antibody-producing transgenic mouse can be produced by introducing a human antibody gene into mouse ES cells, and transplanting the ES cells into an early mouse embryo, followed by generation.
  • Human antibodies can be produced from human antibody-producing transgenic animals by obtaining and culturing human antibody-producing hybridomas and hybridomas by the conventional hyperidoma production method for animals other than humans. Human antibodies can be generated and accumulated during cleansing.
  • the number of amino acids to be deleted, substituted, inserted and Z or added is one or more, and the number is not particularly limited, but the molecular 'Crowing 2nd Edition, Current' Protocols 'in. Molecular' Biology, Nucleic Acids Research, 10, 6487 (1982), Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 79, 6409 (1982), Gene, 34, 315 (1985), Nucleic Acids Research, 13, 4431 (1985), Proc. Natl. Acad. Sci USA. 82, 488 (1985), etc.
  • the number is such that it can be deleted, substituted or added by known techniques such as site-directed mutagenesis. For example, it is 1 to several tens, preferably 1 to 20, more preferably 1 to 10, and further preferably 1 to 5.
  • Deletion, substitution, insertion or addition of one or more amino acid residues in the above-described antibody amino acid sequence indicates the following. It means that there is a deletion, substitution, insertion or attachment force S of one or more amino acid residues in any and one or more amino acid sequences in the same sequence. In addition, deletion, substitution, insertion or addition may occur simultaneously, and the amino acid residue to be substituted, inserted or added may be either a natural type or a non-natural type. .
  • Natural amino acid residues include L-alanine, L-asparagine, L-aspartic acid, L-glutamine, L-glutamic acid, glycine, L-histidine, L-isoleucine, L-leucine, L-lysine, L -Methionine, L-phenylalanine, L-proline, L-serine, L-threonine, L-tryptophan, L-tyrosine, L-parin and L-cysteine.
  • amino acid residues that can be substituted with each other are shown below.
  • the amino acid residues contained in the same group can be substituted for each other.
  • Group A Leucine, Isoleucine, Norleucine, Norin, Norpaline, Alanine, 2-Aminobutanoic acid, Methionine, 0-Methylserine, t-Butylglycine, t-Butylalanine, Cyclohexinolealanine
  • Group B aspartic acid, glutamic acid, isoaspartic acid, isoglutamic acid, 2-amino adipic acid, 2-aminosuberic acid
  • Group D lysine, arginine, ornithine, 2,4-dianaminobutanoic acid, 2,3-dianaminopropionic acid
  • Group E proline, 3-hydroxyproline, 4-hydroxyproline
  • Group F serine, threonine, homoserine
  • antibody fragment of the present invention examples include Fab, Fab ⁇ F (ab '), scFv, diabodv, dsFv and the like.
  • Fab is obtained by treating an IgG antibody molecule with the proteolytic enzyme papain.
  • the Fab of the present invention can be obtained by treating an antibody with the proteolytic enzyme papain.
  • the DNA encoding the Fab of the antibody is inserted into a prokaryotic expression vector or a eukaryotic expression vector, and the vector is introduced into a prokaryotic or eukaryotic organism to express the Fab. can do.
  • F (ab ') is a fragment obtained by treating an IgG antibody molecule with the proteolytic enzyme pepsin.
  • Antibody fragment (which is cleaved at the 234th amino acid residue of the H chain), whose Fab is slightly larger than that bound through the disulfide bond in the hinge region, and has an antigen binding activity of about 100,000 molecular weight It is.
  • the F (a) of the present invention can be obtained by treating an antibody with the proteolytic enzyme pepsin.
  • the following Fab ′ can be produced by thioether bond or disulfide bond.
  • Fab ' is an anti-antibody having a molecular weight of about 50,000, which is obtained by cleaving the disulfide bond in the hinge region of F (a).
  • the Fa of the present invention can be obtained by treating F (ab ′) with a reducing agent dithiothreitol.
  • the DNA encoding the Fab ′ fragment of the antibody is inserted into a prokaryotic expression vector or eukaryotic expression vector, and Fa is expressed by introducing the vector into a prokaryotic or eukaryotic organism. can do.
  • scFv is a VH-P-VL or VL-P-VH polypeptide in which one VH and one VL are linked using an appropriate peptide linker (hereinafter referred to as P).
  • P an appropriate peptide linker
  • the scFv of the present invention obtains cDNA encoding the antibody VH and VL, constructs a DNA encoding scFv, inserts the DNA into a prokaryotic expression vector or eukaryotic expression vector, and the expression vector ScFv can be expressed and produced by introducing into a prokaryotic or eukaryotic organism.
  • a diabody is an antibody fragment in which scFv is dimerized, and is an antibody fragment having a bivalent antigen-binding activity.
  • the bivalent antigen binding activity can be the same, or one can be a different antigen binding activity.
  • the diabody of the present invention obtains cDNA encoding the antibody VH and VL, constructs the DNA encoding scFv so that the length of the amino acid sequence of the linker is 8 residues or less, and the DNA is prokaryotic. By inserting the expression vector into a biological expression vector or eukaryotic expression vector, and introducing the expression vector into a prokaryotic or eukaryotic organism, the diabody can be expressed and produced.
  • dsFv is obtained by binding a polypeptide in which one amino acid residue in each of VH and VL is substituted with a cysteine residue via a disulfide bond between the cysteine residues.
  • the amino acid residue substituted for the cysteine residue was determined by the method described by Reiter et al. (Protein Enginee ring, 7, 697-704, 1994), and can be selected based on the prediction of the three-dimensional structure of the antibody.
  • the dsFv of the present invention obtains cDNA encoding the antibody VH and VL, constructs a DNA encoding the dsFv, inserts the DNA into a prokaryotic expression vector or eukaryotic expression vector, DsFv can be expressed and produced by introducing an expression vector into prokaryotes or eukaryotes.
  • the derivative of the antibody of the present invention is the N-terminal of the H chain or L chain of an antibody or antibody fragment that specifically binds to HB-EGF, membrane HB-EGF and secretory HB-EGF bound to the cell membrane.
  • the drug is bound to the side or C-terminal side, appropriate substituents or side chains in the antibody, and sugar chains in the antibody by chemical techniques (Introduction to Antibody Engineering, Osamu Kanmitsu, Jinshokan, 1994). It can be manufactured from a combination of cocoons.
  • ⁇ protein bound to a cell membrane and bound to DNA encoding the antibody or the antibody fragment that specifically binds to HB-EGF, membrane-type HB-EGF, and secretory-type HB-EGF It can also be produced by a genetic engineering technique in which DNA encoding a drug such as ligated is inserted into an expression vector, and the expression vector is introduced into a host cell.
  • a drug such as ligated
  • the expression vector is introduced into a host cell.
  • the drug include chemotherapeutic agents, antibody drugs, immunostimulants such as cyto force-in, radioactive equivalent elements, and immunoadjuvant.
  • the agent bound to the antibody or the antibody fragment may be in the form of a prodrug.
  • the prodrug in the present invention refers to a drug that is chemically modified by an enzyme or the like present in a tumor environment and converted into a substance having an action of damaging cancer cells.
  • Chemotherapeutic agents include alkylating agents, nitrosourea agents, antimetabolites, anticancer antibiotics, plant-derived alkaloids, topoisomerase inhibitors, hormone therapy agents, hormone antagonists, aromatase inhibitors, p-glycoprotein inhibitors, Any chemotherapeutic agent is included, such as platinum complex derivatives, M phase inhibitors, kinase inhibitors and the like.
  • Chemotherapeutic agents include amifostine (Ethiol), cisplatin, dacarbazine (DTIC), dactinomycin, metalloretamine (nitrogen mustard), streptozocin, cyclophosphamide, ifosfamide, carmustine (BCNU), oral mucin (CCNU) ), Doxorubicin (adriamycin), doki Sorbicin lipo (doxyl), epilubicin, gemcitabine (gemzar), daunorubicin, daunorubicin lipo (daunosome), procarbazine, mitomycin, cytarabine, etoposide, methotrexate, 5-fluorouracil, fluorouracil, vinblastinobu, myelin Estramustine, paclitaxel (taxinol), docetaxel (taxotere), aldesleukin, asparaginase, busulfan, carboplatin, oxa
  • a method of binding the chemotherapeutic agent and the antibody a method of binding between the amino group of the chemotherapeutic agent and the antibody via dartal aldehyde, an amino group of the chemotherapeutic agent via a water-soluble carpositimide Examples thereof include a method for binding a carboxyl group of an antibody.
  • Antibody drugs include antibodies against antigens whose apoptosis is induced by antibody binding, or antibodies against antigens involved in tumor pathogenesis such as tumor cell growth and metastasis, as well as antibodies that regulate immune function, lesion sites And antibodies that inhibit angiogenesis in the body.
  • Cluster of differentiation As an antigen whose apoptosis is induced by antibody binding, Cluster of differentiation
  • CD human leukocyte antigen
  • CD20 CD21, CD22, CD23, CD24, CD37, CD53, CD72, CD73, CD74, CDw75, CDw76, CD77, CDw78, CD79a, CD79b, CD80 (B7.1), CD81, CD82 CD83, CDw84, CD85, CD86 (B7.2), human leukocyte antigen (HLA) -Class II, EGFR, etc.
  • HLA human leukocyte antigen
  • Antibody antigens that regulate immune function include CD4, CD40, CD40 ligand, B7 family single molecule (CD80, CD86, CD274, B7-DC, B7-H2, B7-H3, B7-H4), B7 family molecules Ligand (CD28, CTLA-4, ICOS ⁇ PD-1, BTLA), OX-40, OX-40 ligand, CD137, tumor necrosis factor (TNF) receptor family molecule (DR4, DR5, TNFR1, TNFR2), T NF — Related apoptosis— inducing ligand receptor (TRAIL) family molecule, TRAIL family Single molecule receptor family (TRAIL-Rl, TRAIL-R2, TRAIL-R3, TRAIL-R4), recepto r activator of nuclear factor kappa B ligand (RANK ), RANK ligand, CD25, folate receptor 4, cyto force in (interleukin-1a (hereinafter referred to as interleukin), IL
  • Antigens of antibodies that inhibit angiogenesis at the lesion include vascular endothelial growth factor (VEGF), Angiopoietin, fibroblast growth factor (FGF, EGF, platelet-derived growth factor (PDGF), insulin-like growth factor) (IGF), erythropoietin (EPO), TGF ⁇ , IL-8, Ephilin, SDF-1, and the like and their receptors.
  • VEGF vascular endothelial growth factor
  • Angiopoietin fibroblast growth factor
  • FGF fibroblast growth factor
  • EGF platelet-derived growth factor
  • IGF insulin-like growth factor
  • EPO erythropoietin
  • TGF ⁇ IL-8
  • Ephilin Ephilin
  • SDF-1 and the like and their receptors.
  • Immunostimulators include sites that enhance cells such as NK cells, macrophages, and neutrophils Any force-in can be used, but specific examples include interferon (hereinafter referred to as INF) — ⁇ , INF—j8, INF— ⁇ , IL-2, IL-12, IL-15, IL— 18, IL-21, IL-23, granulocyte stimulating factor (G-CSF), granulocyte / macrophage stimulating factor (GM-CSF), macrophage stimulating factor (M-CSF) and the like.
  • INF interferon
  • G-CSF granulocyte stimulating factor
  • GM-CSF granulocyte / macrophage stimulating factor
  • M-CSF macrophage stimulating factor
  • drugs that enhance immunity include j8 (l ⁇ 3) dulcan (lentinan, schizophyllan), ⁇ -galactosylceramide (KRN7000), bacterial cells
  • examples include powder (picibanil, BCG) and cell extract (krestin).
  • the radioactive isotope can be directly bound to the antibody by the chloramine T method or the like.
  • a substance that chelates a radioisotope may be bound to the antibody.
  • the sharpening agent include methylbenzyldiethylene-tnaminepentaacetic acid, MX-DTPA) and the like.
  • the antibody of the present invention can be administered in combination with one or more other drugs, or radiation irradiation can be combined.
  • other drugs include the aforementioned chemotherapeutic agents, antibody drugs, and immunostimulants such as cytodynamic force.
  • antibody drugs include antibodies against antigens that can be the above targets, such as EG FR antibodies (Cetuximab, Panitumumab, Matuzumab, etc.) and the like.
  • Radiation irradiation includes photon (electromagnetic wave) irradiation such as X-ray and ⁇ -ray, particle beam irradiation such as electron beam, proton beam, and heavy particle beam.
  • the method of administration in combination may be simultaneous administration with the antibody of the present invention, or may be administered before or after administration of the antibody of the present invention.
  • An expression vector containing a cDNA encoding a secreted ⁇ -EGF or a partial length of a secreted ⁇ -EGF (hereinafter sometimes simply referred to as a secreted ⁇ - ⁇ GF) is used in Escherichia coli, yeast, insect cells, animal cells. Or the like and secreted HB-EGF or a secreted HB-EGF partial fragment can be obtained. Further, HB-EGF in the extracellular region can be purified from cells expressing HB-EGF by protease treatment. Secretory type It is also possible to purify secretory HB-EGF by expressing HB-EGF in a large amount and cultivating various human tumor cultured cells and human tissues. Furthermore, a synthetic peptide having a secretory HB-EGF partial sequence can be prepared and used as an antigen.
  • the secretory HB-EGF used in the present invention includes Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cola Spring Harbor Laooratory Press (1989), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons. (1987-1997) etc. can be used to produce a DNA encoding the same in a host cell by, for example, the following method.
  • a recombinant vector is prepared by inserting the full-length cDNA downstream of the promoter of an appropriate expression vector.
  • a DNA fragment of an appropriate length containing a portion encoding HB-EGF may be prepared based on the full-length cDNA, and the DNA fragment may be used in place of the full-length cDNA.
  • the recombinant vector is introduced into a host cell suitable for the expression vector, whereby a transformant producing HB-EGF can be obtained.
  • any strain can be used as long as it can express the target gene, such as Escherichia coli and animal cells.
  • An expression vector contains an appropriate promoter at a position where it can autonomously replicate in the host cell to be used or can be integrated into a chromosome and can transcribe DNA encoding secretory HB-EGF. Used.
  • the recombinant vector containing DNA encoding HB-EGF used in the present invention can be autonomously replicated in the prokaryote.
  • a vector comprising a promoter, a ribosome binding sequence, the DNA used in the present invention and a transcription termination sequence is preferred.
  • the recombinant vector may contain a gene that controls the promoter.
  • Examples of expression vectors include pBTrp2, pBTacl, pBTac2 (all manufactured by Roche Diagnostics), pKK233-2 (manufactured by Pharmacia), pSE280 (manufactured by Invitrogen), pGEMEX-1 (manufactured by Promega) , PQE-8 (manufactured by QIAGEN), pKYPIO (JP-A 58-110600), pKYP200 [Agricultural Biological Chemistry, 48, 669 (1984)], pLSAl [Agric. Biol. Chem., 53, 2 77 (1989)], pGELl [Proc. Natl. Acad. Sci.
  • Any promoter can be used as long as it can function in the host cell to be used.
  • promoters derived from Escherichia coli or phage such as trp promoter (Ptrp), lac promoter, PL promoter, PR promoter, T7 promoter and the like can be mentioned.
  • artificially modified promoters such as a tandem promoter, tac promoter, lacT7 promoter, let I promoter, etc. in which two Ptrps are connected in series can also be used.
  • Shine'Dalgarno which is a ribosome binding sequence is used.
  • a plasmid in which the distance between the sequence and the start codon is adjusted to an appropriate distance (eg, 6 to 18 bases).
  • the base sequence of the DNA encoding the secretory HB-EGF used in the present invention the base can be substituted so as to be an optimal codon for expression in the host.
  • the production rate of secretory HB-EGF can be improved.
  • a transcription termination sequence is not always necessary for gene expression in the above recombinant vector! However, it is preferable to place a transcription termination sequence immediately below the structural gene.
  • Examples of host cells include microorganisms belonging to the genus Escherichia, such as E. coli XL1-Blue, E. coli XL2-Blue, E. coli DH1, E. coli DH5 a, E. coli BL21 (DE3), E. coli MC1000, E. coli KY3276, E. coli W1485 E. coli JM109, E. coli HB101, E. coli No. 49, E. coli W3110, E. coli NY49 and the like.
  • microorganisms belonging to the genus Escherichia such as E. coli XL1-Blue, E. coli XL2-Blue, E. coli DH1, E. coli DH5 a, E. coli BL21 (DE3), E. coli MC1000, E. coli KY3276, E. coli W1485 E. coli JM109, E. coli HB101, E. coli No. 49,
  • any method can be used as long as it is a method for introducing DNA into the above host cell.
  • a method using calcium ions [Proc. Natl. Ac ad. Sci. USA, 69, 2110 (1972)], Gene, 17, 107 (1982) and Molecular & General Genetics, 168, 111 (1979).
  • examples of expression vectors include pcDNAU pcD M8 (commercially available from Funakoshi), pAGE107 [JP-A-3-22979; Cytotechnology, 3, 133, (19 90)], pAS3 -3 (JP-A-2-227075), pCDM8 [Nature, 329, 840, (1987)], pcDNAI / Amp (Invitrogen), pREP4 (Invitrogen), pAGE103 [J. Biochemistry, 101, 13 07 (1987)], pAGE210, pME18SFL3 and the like.
  • Any promoter can be used as long as it can function in animal cells.
  • a cytomegalovirus (CMV) IE (immediate early) gene promoter examples include promoters, retrovirus promoters, metallotine promoters, heat shock promoters, SRa promoters, and the like.
  • an enhancer of the IE gene of human CMV may be used together with a promoter.
  • Host cells include human cells such as Namalwa cells, monkey cells, COS cells, Chinese cells, CHO cells that are Muster cells, and HBT5637 (Japanese Patent Laid-Open No. 63-299). Etc.
  • any method for introducing the recombinant vector any method can be used as long as it is a method for introducing DNA into animal cells.
  • the electopore position method [Cytotechnology, 3, 133 (1990)]
  • the calcium phosphate method Japanese Patent Application Laid-Open No. Hei 9) 2-227075
  • ribofusion method Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 7413 (1987)] and the like.
  • gene expression methods include secretory production, fusion protein, and the like according to the method described in Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold bpnng Harbor Laboratory Press (1989). Expression or the like can be performed. When expressed in cells derived from eukaryotes, secreted HB-EGF to which sugars or sugar chains are added can be obtained.
  • the secreted HB-EGF is produced by culturing the transformant obtained as described above in a medium, producing and accumulating the HB-EGF in the culture, and collecting the transformant from the culture.
  • the method of culturing the transformant in a medium can be carried out according to a usual method used for culturing a host.
  • an inducer may be added to the medium as necessary.
  • isopropyl ⁇ D thiogalatatopyranoside or the like is used for culturing a microorganism transformed with a recombinant vector using the trp promoter.
  • Etc. may be added to the medium.
  • a medium for culturing a transformant obtained using animal cells as a host a commonly used RPMI 1640 medium [The Journal of the American Medical Association, 199, 519 (1967)], Eagle's MEM Medium [Science, 122, 501 (1952)], Dulbecco's modified MEM medium [V irology, 8, 396 (1959)], 199 medium [Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 73, 1 (1950)] or A medium obtained by adding fetal calf serum or the like to these mediums can be used. Cultivation is usually carried out for 1 to 7 days under conditions such as pH 6 to 8, 30 to 40 ° C, and 5% CO. Also, if necessary during culture
  • antibiotics such as kanamycin and penicillin may be added to the medium.
  • a transformant derived from a microorganism, an animal cell, or the like having a recombinant vector incorporating a DNA encoding the secretory HB-EGF used in the present invention is used in a normal culture method.
  • the secretory HB-EGF used in the present invention can be produced by culturing according to the above, producing and accumulating the HB-EGF, and collecting the HB-EGF from the culture.
  • gene expression methods include secretory production, fusion protein expression, etc. according to the methods described in ci in Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold bpnng Harbor Laboratory Press (1989). It can be carried out.
  • a method for producing secretory HB-EGF there are a method for producing it in a host cell, a method for producing it secreted outside the host cell, and a method for producing it on the outer membrane of the host cell. By changing the structure of the secreted HB-EGF to be produced, an appropriate method can be selected.
  • the production amount can also be increased using a gene amplification system using a dihydrofolate reductase gene or the like.
  • Secreted HB-EGF can be isolated and purified as follows, for example. When secreted HB-EGF is expressed in cells in a dissolved state, the cells are collected by centrifugation after culturing, suspended in an aqueous buffer solution, and then sonicated by an ultrasonic crusher, French press, or Manton Gaurin homogenate. The cells are crushed with dynomill or the like to obtain a cell-free extract.
  • an ordinary enzyme isolation and purification method that is, a solvent extraction method, a salting-out method using ammonium sulfate, a desalting method, a precipitation method using an organic solvent, Anion exchange chromatography using resin such as tilaminoethyl (DE AE) -Sepharose, DIAION HPA-75 (Mitsubishi Chemical), and cation using resin such as S-Sepharose FF (Pharmacia) Exchange chromatography method, hydrophobic chromatography method using resins such as butyl sepharose and ferrule sepharose, gel filtration method using molecular sieve, affinity mouthmatography method, chromatofocusing method, isoelectric focusing, etc.
  • a purified sample can be obtained by using a method such as electrophoresis method alone or in combination.
  • HB-EGF When secreted HB-EGF is expressed in the form of an insoluble substance in the cells, the cells are similarly collected, disrupted, and centrifuged to obtain a precipitate fraction of the HB-EGF. Collect insoluble material. The recovered insoluble matter of the protein is dissolved with a protein denaturant. By diluting or dialyzing the soluble solution, the protein is returned to a normal three-dimensional structure, and then a purified preparation of secreted HB-EGF can be obtained by the same isolation and purification method as described above.
  • the derivative such as HB-EGF or a sugar modified product thereof can be recovered from the culture supernatant. That is, a soluble fraction is obtained by treating the culture by a technique such as centrifugation as described above, and a purified sample is obtained from the soluble fraction by using the same isolation and purification method as described above. Obtainable.
  • the secretory HB-EGF used in the present invention can also be obtained by chemical synthesis methods such as the Fmoc method (fluorenylmethyloxycarbon method) and the tBoc method (t-butyloxycarbol method). Can be manufactured. Advanced ChemTech, Perkin 'Elma Company, Chemical synthesis can also be performed using peptide synthesizers such as Pharmacia, Protein Technology Instrument, Synthece U—Vega, PerSeptive, Shimadzu Corporation.
  • mice, rats, or hamsters 3 to 20 weeks old are immunized with the antigen prepared as described above, and antibody-producing cells in the spleen, lymph nodes, and peripheral blood of the animal are collected.
  • HB-EGF knockout mice are used as immunized animals when the immunogenicity is low and sufficient increase in antibody titer is not observed in the above animals.
  • Immunization is carried out by administering the antigen subcutaneously, intravenously or intraperitoneally with an appropriate adjuvant (for example, Freund's complete adjuvant, aluminum hydroxide gel and pertussis vaccine, etc.). Is administered.
  • an appropriate adjuvant for example, Freund's complete adjuvant, aluminum hydroxide gel and pertussis vaccine, etc.
  • the antigen is a partial peptide
  • a conjugate with a carrier protein such as BSA (Cushi serum albumin) or KLH (Keyhole Limpet Hemocyanin) is prepared and used as an immunogen.
  • BSA Cushi serum albumin
  • KLH Keyhole Limpet Hemocyanin
  • the antigen is administered 5 to 10 times every 1 to 2 weeks after the first administration. Three to seven days after each administration, blood is collected from the fundus venous plexus, and the serum reacts with the antigen by an enzyme immunoassay [Anti bodies-A Laboratory Manual, Cold bpnng Haroor Laboratory, 1988]. Mice, rats, or hamsters whose sera showed sufficient antibody titers against the antigen used for immunization are provided as a source of splenocytes.
  • the spleen When subjecting the spleen cells to myeloma cell fusion, 3 to 7 days after the final administration of the antigen substance, the spleen is removed from the immunized mouse, rat or hamster, and the spleen cells are collected. Shred spleen in MEM medium (Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.), loosen with tweezers, centrifuge (1200 rpm, 5 minutes), discard supernatant, Tris monosalt-ammum buffer Treat with (pH7.65) for 1-2 minutes to remove red blood cells, wash 3 times with MEM medium, and provide as splenocytes for fusion.
  • MEM medium Nasui Pharmaceutical Co., Ltd.
  • myeloma cells cell lines obtained from mice are used. For example, 8-azaguanine resistant mice (derived from BALB / c) myeloma cell line P3- X63Ag8- Ul (P3-U1) (Current Topics in Microbiology and Immunology, 18: 1-7, 1978), P3- NSl / 1- Ag41 (NS-1) (European J.
  • 8-Azagu Anin medium [RPMI-1640 medium glutamine (1.5 mM), 2-mercaptoethanol (5 X 10- 5 M), gentamicin (10 g / mL) and fetal calf serum (FCS ) Added to the medium (hereinafter referred to as the normal medium) and the medium supplemented with 8-azaguanine (15 g / mL)] Passed to the normal medium 3-4 days before cell fusion. Secure a cell count of at least 2 x 10 7 cells on the day of fusion.
  • MEM medium or PBS diisodium phosphate 1.83 g, monopotassium phosphate 0.21 g, sodium chloride 7.65 g, distilled water 1 L, pH 7.2.
  • myeloma cells 5-10:
  • cloning was repeated twice by the limiting dilution method (the first time using HT medium (the medium in which HAT medium power is also removed from aminopterin) and the second time using normal medium). Are selected as monoclonal antibody-producing hyperpridoma strains.
  • This mouse also collects ascites, centrifuged (3,000 rpm, 5 minutes) to remove solids, and then prayed with 40-50% ammonium sulfate, followed by force prillic acid precipitation, DEAE-Sepharose column, protein Purify with A-column or gel filtration column, collect IgG or IgM fractions, and use as purified monoclonal antibody.
  • the subclass of the antibody is determined by an enzyme immunoassay using a subclustering kit.
  • the amount of protein is quantified using the Raleigh method and absorbance at 280 ° C.
  • an antigen a gene-transferred cell obtained by introducing an expression vector containing cDNA encoding HB-EGF used in the present invention into Escherichia coli, yeast, insect cells, animal cells, etc. by the method described in (1).
  • a conjugate with a carrier protein such as BSA (Ushi Serum Albumin) or KLH (Keyhole Limpet Hemocyanin) is prepared and used.
  • HB-EGF and cell lines in which HB-EGF are bound to cells are dispensed into 96-well plates and solidified. Dispense the serum, the culture supernatant of a hyperidoma that produces monoclonal antibodies, or purified antibody to react. After washing well with PBS or PBS-0.05% Tween, anti-immunoglobulin antibody labeled with piotin, enzyme, chemiluminescent substance or radiation compound as a second antibody is dispensed and reacted. After washing well with PBS-Tween, perform the reaction according to the labeling substance of the second antibody.
  • a hybridoma or purified antibody that produces a monoclonal antibody reactive to any of HB-EGF, secretory HB-EGF, and membrane HB-EGF bound to the cell membrane by the method described above Can be selected.
  • the binding of secreted HB-EGF to the HB-EGF receptor is inhibited.
  • the harmful antibodies include monoclonal antibodies KM3566 produced by the hybridoma cell line KM3566, monoclonal antibodies KM3567 produced by the hyperidoma cell line KM3567, and monoclonal antibodies produced by the hyperidoma KM3579.
  • the Hypridoma cell line KM3579 was established on January 24, 2006 in accordance with the Budapest Treaty. The National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Patent Biological Deposit Center (1st, 1st, Tsukuba, Ibaraki, Japan, 1st, 6th) Deposited as BP-10491.
  • the cell used in the cell growth inhibition assay may be any cell as long as it has a receptor capable of binding to secretory HB-EGF.
  • the EGF receptor gene And a cell line obtained by introducing a mouse myeloid cell line 32D clone3 (ATCC No. CRL-11346).
  • the above cell line is prepared and cultured.
  • the cell growth inhibition rate can be determined.
  • a monoclonal antibody having a high cell growth inhibition rate can be selected as a monoclonal antibody having neutralizing activity.
  • monoclonal antibody having neutralizing activity of the present invention include monoclonal antibody KM3566 produced by Hypridoma cell line KM3566 and monoclonal antibody KM3567 produced by Hypridoma cell line KM3567.
  • Hypridoma cell lines KM3566 and KM3567 are registered with the Patent Organism Depositary (Tsukuba, Ibaraki, Japan) on January 24, 2006 and March 23, 2006, respectively, based on the Budapest Treaty. It is deposited as FERM BP-10490 and FERM BP-10573 at 1st, 1st East, 1st Central 6).
  • a humanized antibody expression vector may be any animal cell expression vector into which a gene encoding CH and Z or CL of a human antibody is incorporated! /.
  • a humanized antibody expression vector can be constructed by cloning a gene encoding human antibody CH and CL into an animal cell expression vector.
  • the C region of the human antibody can be CH and CL of any human antibody, for example, the C region of the IgGl subclass of the H chain of the human antibody (hereinafter referred to as hC y 1) and the human antibody. C region of the ⁇ class of the L chain (hereinafter referred to as “hC ⁇ ”). Exon and intron chromosomal DNA can be used as the gene encoding human antibody CH and CL, and cDNA can also be used.
  • Any expression vector for animal cells can be used as long as it can incorporate and express a gene encoding the C region of a human antibody.
  • pAGE107 (Cytotechnology, 3, 133-140, 1990)
  • pAGEl 03 (Journal of Biochemistry, 101, 1307-131 0, 1987)
  • pHSG274 (Gene, 27, 223-232, 1984)
  • pKCR Proceedings of The National Academy of Sciences of the United States of America, 78, 1527-1531, 1981
  • pSGl J8 d2-4 (Cytotechnology, 4, 173-180, 1990).
  • Promoters and enhancers used in animal cell expression vectors include SV40 early promoter and enhancer (Journal of Biochemistry, 101, 1307-1310, 1987), Morro-1 mouse leukemia quinores LTR promoter and enzyme. Junsaichi (Biochemical & Biophysical Research Com munications, 149, 960-968, 1987), Immunoglobulin heavy chain promoter (Cell, 41, 7 9-487, 1985) and Enhanser (Cell, 33, 717-728, 1983) ) Etc.
  • SV40 early promoter and enhancer Journal of Biochemistry, 101, 1307-1310, 1987
  • Morro-1 mouse leukemia quinores LTR promoter and enzyme Junsaichi (Biochemical & Biophysical Research Com munications, 149, 960-968, 1987), Immunoglobulin heavy chain promoter (Cell, 41, 7 9-487, 1985) and Enhanser (Cell, 33, 717-728, 1983) ) Etc.
  • the human chimeric antibody and the humanized antibody expression vector are a type in which the antibody H chain and L chain are on separate vectors, or a type on the same vector (hereinafter referred to as a tandem type).
  • the tandem humanized antibody expression vector is preferable in view of the equilibrium of the protein (Journal of Immunological Methods, 167, 271-2 78, 1994).
  • O The tandem humanized antibody expression vector is pKANTEX93. (W097 / 1 0354), pEE18 (Hybridoma, 17, 559-567, 1998).
  • Non-human animal antibodies for example, cDNAs encoding mouse antibody VH and VL can be obtained as follows.
  • mRNA is extracted from Hypridoma and cDNA is synthesized.
  • the synthesized cDNA is cloned into a vector such as a phage or plasmid to prepare a cDNA library.
  • a vector such as a phage or plasmid
  • a recombinant phage having a recombinant plasmid and cDNA encoding VL is isolated.
  • any animal can be used as long as it can produce a mouse hybridoma, such as a mouse, rat, nomstar, or rabbit.
  • kits for preparing mRNA from high-pridoma include Fast Track mRNA Isolation Kit (manufactured by Invitrogen) and wuick Prep mRNA Purincation Kit (manufactured by Pharmacia).
  • a vector into which cDNA synthesized by using the RNA extracted from Hypridoma macaque as a saddle is incorporated is a vector that can incorporate the cDNA! / Can also be used.
  • ZAP Express (Strategies, 5, 58-61, 1992), pBlue script II SK (+) (Nucleic Acids Research, 17,9494, 1989), ⁇ ⁇ II (Stratagene), ⁇ gtlO, ⁇ gtl l (DNA Cloning: A Practical Approach, I, 49, 1985), Lambda BlueM id (Clontech), ⁇ ExCell, pT7T3 18U (Pharmacia), pcD2 (Molecular & Cellular Biology, 3, 280-289, 1983) And phage or plasmid vectors such as pUC18 (Gene, 33, 103-119, 1985) are used.
  • cDNA clones encoding VH and VL of non-human animal antibodies from cDNA libraries is based on colonies using radioisotopes or fluorescently labeled probes. Or the plaque's hybridization method (Molecular, A Laboratory Manual, old bpnng Harbor Lab. Press New York, 1989).
  • a primer is prepared and a cDNA or cDNA library synthesized from mRNA is used as a saddle, Polymerase Chain Reaction (hereinafter referred to as PCR method; Molecular loning: A Laboratory Manual, Cold bpnng Harbor Lab. Press New York) 1989, Current Protocols in Molecular Biology, Supplement 1-34), and cDNAs encoding VH and VL can also be prepared.
  • the cDNA selected by the above method is cleaved with an appropriate restriction enzyme or the like, and then cloned into a plasmid vector such as pBluescript SK (-) (Stratagene), and a commonly used nucleotide sequence analysis method such as dideoxy (Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 74, 5463-5467, 1977), etc., and analysis using an automated base sequence analyzer ABI PRISM 377 (ABI) By doing so, the nucleotide sequence of the cDNA can be determined.
  • a plasmid vector such as pBluescript SK (-) (Stratagene)
  • a commonly used nucleotide sequence analysis method such as dideoxy (Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 74, 5463-5467, 1977), etc.
  • ABI PRISM 377 ABI PRISM 377
  • the length of the signal sequence and the N-terminal amino acid sequence can be estimated, and the subgroup to which they belong can be known, and the amino acid sequences of CDRs of VH and VL are also known. It can be found by comparing with the amino acid sequences of VH and VL of an antibody (Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human services, 1991).
  • the BLAST method Journal of Molecular Biology, 21 5, 403-410, 1990
  • SWISS-PROT and PIR-protein using the complete amino acid sequences of VH and VL.
  • the novelty of the sequence can be examined by performing a homology search of such sequences.
  • the cDNA encoding the VH and VL of the non-human animal antibody is cloned upstream of the gene encoding the human antibody CH and CL of the humanized antibody expression vector described in 2 (1) above.
  • Type chimeric antibody expression vectors can be constructed.
  • the cDNA encoding the VH and VL of a non-human animal antibody is obtained by using the nucleotide sequence of the VH and VL of the non-human animal antibody and the base of the CH5 and CL of the human antibody.
  • Each of which is linked to a synthetic DNA having a recognition sequence for an appropriate restriction enzyme at both ends, and each of these is linked to the human antibody CH and the humanized antibody expression vector described in 2 (1) above.
  • a human chimeric antibody expression vector can be constructed by cloning it so that it is expressed in an appropriate form upstream of the gene encoding CL.
  • a plasmid containing cDNA encoding VH and VL of an antibody from a non-human animal is used as a template, and VH and VL are obtained by PCR using a primer having an appropriate restriction enzyme recognition sequence at the 5 'end.
  • Antibody expression vectors can be constructed.
  • CDNAs encoding the humanized antibody VH and VL can be constructed as follows. First, the VH and VL CDR amino acid sequences of the target non-human animal antibody VH and VL CDR amino acid sequences are selected. Any amino acid sequence derived from a human antibody can be used as the amino acid sequence of FR of human antibody VH and VL.
  • VH and VL of human antibodies registered in databases such as Protein Data Bank, and common amino acids of subgroups of VH and VL of human antibodies ⁇ ti ⁇ U (Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept.Health and Human Services, 1991) .
  • VH and VH of non-human animal antibodies of interest It is desirable to select an amino acid sequence having as high a homology as possible (at least 60% or more) with the FR amino acid sequence of VL.
  • the VH and VL CDR amino acid sequences of the target non-human animal antibody are transplanted to the VH and VL FR amino acid sequences of the selected human antibody, and the humanized antibody VH and VL amino acid sequences are transferred.
  • the designed amino acid sequence is converted to a nucleotide sequence in consideration of the frequency of use of codons found in the nucleotide sequence of the antibody gene (Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services, 1991).
  • the nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of VH and VL is designed. Based on the designed nucleotide sequence, several synthetic DNAs with a length of around 150 bases are synthesized, and PCR is performed using them. In this case, it is preferable to design four synthetic DNAs for both VH and VL from the reaction efficiency in PCR and the length of DNA that can be synthesized.
  • the amplified product is cloned into a plasmid such as pBluescript SK (-) (Stratagene), the base sequence is determined by the method described in 2 (2) above, and the VH of the desired humanized antibody is determined. And a plasmid having a base sequence encoding the amino acid sequence of VL. To get.
  • a plasmid such as pBluescript SK (-) (Stratagene)
  • the base sequence is determined by the method described in 2 (2) above, and the VH of the desired humanized antibody is determined.
  • a plasmid having a base sequence encoding the amino acid sequence of VL To get.
  • Humanized antibodies can be obtained by transplanting only the VH and VL CDRs of the target non-human animal antibody into the VH and VL FRs of the human antibody, and their antigen-binding activity is comparable to that of the original non-human animal antibody. (BIO / TECHNOLOGY, 9, 266-271, 1991). This is because, in the VH and VL of the antibody of the original non-human animal, not only CDR but also some amino acid residues of FR are directly or indirectly related to antigen binding activity. It is considered that amino acid residues change to different amino acid residues of FR of VH and VL of human antibody with CDR grafting.
  • humanized antibodies interact directly with the amino acid residues involved in antigen binding or CDR amino acid residues in the VH and VL FR amino acid sequences of human antibodies. Or the amino acid residues that are indirectly involved in antigen binding by maintaining the three-dimensional structure of the antibody, and changing them to amino acid residues found in the antibody of the original non-human animal. It has been attempted to increase the antigen binding activity (BIO / TECHNOLOGY, 9, 266-271, 1991). In the production of humanized antibodies, the most important point is how efficiently to identify the amino acid residues of FRs involved in these antigen-binding activities.
  • Modification of the amino acid residues of VH and VL of human antibodies can be achieved by performing the PCR method described in 2 (4) above using synthetic DNA for modification. Determine the base sequence of the amplified product after PCR by the method described in 2 (2) above, and confirm that the target modification has been performed.
  • humanized antibody expression vector The humanized antibody VH and VL constructed in 2 (4) and (5) above are upstream of the gene encoding the human antibody CH and CL of the humanized antibody expression vector described in 2 (1) above.
  • the cDNA to be coded can be cloned and a humanized antibody expression vector can be constructed.
  • an appropriate restriction enzyme recognition sequence is placed at the 5 'end of the synthetic DNA located at both ends. When introduced, it can be cloned so that it is expressed in an appropriate form upstream of the gene encoding the CH and CL of the human antibody of the vector for human antibody expression described in 2 (1) above. it can.
  • the humanized antibody expression vectors described in 2 (3) and (6) above, or an expression vector modified from them are used.
  • transient expression of a humanized antibody can be performed.
  • the host cell into which the expression vector is introduced can be any host cell that can express human ⁇ antibody, but because of its high expression level, COS-7 cells (ATCC CRL1651) Commonly used (Methods in Nucleic Acids Research, CRC press, 283, 1991).
  • Methods for introducing expression vectors into COS-7 Itoda cysts include the DEAE-dextran method (Methods in Nucleic Acids Research, CRC press, 283, 1991) and the lipofuxion method (Proceedings of the Ratio Academy of Sciences of the United States). of America, 84. 7413-7417, 1987).
  • the expression level and antigen binding activity of the humanized antibody in the culture supernatant are determined by E LISA (Antibodies: ALaboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Chapter 14, 1988; Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press Limited , 19 96).
  • a transformed cell that stably expresses the humanized antibody By introducing the humanized antibody expression vector described in 2 (3) and (6) above into an appropriate host cell, a transformed cell that stably expresses the humanized antibody can be obtained.
  • Examples of the method for introducing an expression vector into a host cell include the electopore position method (Cytotechnology, 3, 133-140, 1990).
  • a host cell into which a humanized antibody expression vector is introduced Any host cell can be used so long as it is a host cell capable of expressing a human rabbit antibody.
  • mouse SP2 / 0-Agl4 cells (ATCC CRL1581), mouse P3X63-Ag8.653 cells (ATCC CRL1580), dihydrofolate reductase gene (hereinafter referred to as) CHO Itoda cyst (Proceedings of the National Academy of Sciences of tne United States of America, 77, 4216-4220, 1980), rat YB2 / 3HL.P2.G11.16Ag.20 cells (ATCC CRL1662, hereinafter referred to as YB2 / 0 cells), etc. It is done.
  • a transformant that stably expresses the humanized antibody is prepared by applying a drug such as G418 sulfate (hereinafter referred to as G418) according to the method disclosed in JP-A-2-257891. It can select by culturing with the animal cell culture medium containing.
  • Animal cell culture media include RPMI1640 medium (manufactured by Nissui Pharmaceutical), GIT medium (manufactured by Nippon Pharmaceutical), EX-CELL302 medium (manufactured by JRH), IMDM (GIBCO BRL), Hybridoma-SFM (GIBCO BRL) or a medium obtained by adding various additives such as FBS to these mediums can be used.
  • the humanized antibody By culturing the obtained transformed cells in a medium, the humanized antibody can be expressed and accumulated in the culture supernatant.
  • the expression level and antigen binding activity of the humanized antibody in the culture supernatant can be measured by ELISA.
  • the transformed cells can increase the expression level of the humanized antibody using a DHFR amplification system or the like according to the method disclosed in JP-A-2-257891.
  • Humanized antibodies can be purified from the culture supernatant of transformed cells using a protein A column (Antibodies: A Laboratory Manual, Cola Spring Harbor Laooratory, hap ter 8, 1988; Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press Limited, 1996) o
  • purification methods usually used in protein purification can be used. For example, it can be purified by combining gel filtration, ion exchange chromatography and ultrafiltration.
  • the molecular weight of the purified humanized antibody H chain, L chain, or whole antibody molecule can be determined by polyacrylamide gel electrophoresis (hereinafter referred to as PAGE: Nature, 227, 680-685, 1970) or Western blotting (Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, hapter 12, 1988; Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press Limited, 1996). (9) Evaluation of binding activity between humanized antibody and antigen
  • the evaluation of the binding activity between the humanized antibody and the antigen can be performed using the ELISA described above.
  • Antibody fragments can be prepared by genetic engineering techniques or tandem phylogenetic techniques based on the antibodies described in 1 and 2 above.
  • Examples of genetic engineering methods include constructing a gene encoding the target antibody fragment, and expressing and purifying it using an appropriate host such as animal cells, plant cells, insect cells, and E. coli.
  • proteologic methods include site-specific cleavage and purification using proteolytic enzymes such as pepsin and nopain.
  • Fab can be produced proteolytically by treating IgG with the proteolytic enzyme papain. After papain treatment, if the original antibody is an IgG subclass with protein A binding properties, it can be separated from IgG molecules and Fc fragments by passing through a protein A column and recovered as a uniform Fab (Monoclonal Antibodies: Principles an d Practice, third edition, 1995). In the case of IgG subclass antibodies that do not have protein A binding properties, the ion exchange chromatography shows that Fab is in the fraction that elutes at a low salt concentration [Monoclonal Antioodies: Principles and Practice, (third editio n, 1995) oFabs can be produced by genetic engineering, mostly using E.
  • DNA encoding the V region of the antibody described in 2 (2), 2 (4) and 2 (5) above can be cloned into a Fab expression vector to prepare a Fab expression vector.
  • Any Fab expression vector can be used as long as it can incorporate and express Fab DNA.
  • An example is pIT106 (Science, 240, 1041-1043, 1988).
  • a Fab expression vector can be introduced into an appropriate coli, and Fab can be produced and accumulated in inclusion bodies or periplasm. Enclosed The body can be made into an active Fab by the refolding method usually used for proteins, and when expressed in the periplasm, the active Fab leaks into the culture supernatant. After refolding or from the culture supernatant, a homogeneous Fab can be purified by using a force ram that binds the antigen (Antibody Engineering, A Practical Guide, WH Freemanana Company, 1992).
  • F (ab ') is proteinically processed by treating IgG with the proteolytic enzyme pepsin.
  • Fab ′ is obtained by treating F (a) described in 3 (2) above with a reducing agent such as dithiothreitol.
  • Fa can be produced by genetic engineering, mostly using E. coli, insect cells and animal cells.
  • DNA encoding the V region of the antibody described in 2 (2), 2 (4) and 2 (5) above can be cloned into a Fa expression vector to prepare a Fa expression vector.
  • Any Fa expression vector can be used as long as it can incorporate and express Fa DNA.
  • pAK19 BIO / TECHNOLOGY, 10, 163-167, 1992.
  • Fa expression vector can be introduced into appropriate E. coli and Fa can be produced and accumulated in inclusion bodies or periplasm. Inclusion bodies can be made into active Fa by the refolding method usually used for proteins.
  • Uniform Fa When expressed in periplasm, partial digestion with lysozyme, osmotic shock, and lysis The bacteria can be crushed by treatment such as, and recovered outside the cells. Uniform Fa can be purified after refolding or from bacterial lysates by using a protein G column (Antibod y Engineering, A Practical Approach, IRL PRESS, 199b.
  • scFv can be prepared by genetic engineering using phage or E. coli, insect cells, animal cells, and the like.
  • a DNA encoding the V region of the antibody described in 2 (2), 2 (4) and 2 (5) above can be cloned into an scFv expression vector to prepare an scFv expression vector.
  • the scFv expression vector any vector can be used as long as it can incorporate and express scFv DNA.
  • pCANTAB5E manufactured by Pharmacia
  • pHFA Human Antibodies & Hybridomas, 5, 48-56, 1994
  • scFv By introducing the scFv expression vector into appropriate Escherichia coli and infecting the helper phage, a phage expressing scFv fused to the phage surface protein can be obtained on the phage surface.
  • scFv can be generated and accumulated in inclusion bodies or periplasm of E. coli into which the scFv expression vector has been introduced. Inclusion bodies can be converted into active scFv by the refolding method usually used for proteins.
  • periplasm partial digestion with lysozyme, osmotic shock, and soak Bacteria can be crushed by treatment with Chillon and collected outside the cells. Uniform scFv can be purified by cation exchange chromatography after refolding or from bacterial lysates (Ant3 ⁇ 4ody Engineering, A Practical Approach, IRL PRESS, 1996).
  • diabodies can be prepared by using mostly Escherichia coli, insect cells and animal cells.
  • a DNA in which the VH and VL of the antibody described in 2 (2), 2 (4) and 2 (5) above are linked so as to be equal to or less than the amino acid residue strength residue encoded by the linker is prepared,
  • a diabody expression vector can be prepared by cloning into a diabody expression vector. Any diabody expression vector can be used as long as it can incorporate and express diabody DNA. Examples thereof include pCANTAB5E (manufactured by Pharmacia), pHFA (Human Antibodies Hybridomas, 5, 48, 1994) and the like. Diabodies can be generated and accumulated in inclusion bodies or periplasm of E.
  • coli introduced with a diabody expression vector.
  • the refolding method usually used for proteins Can be converted into active diabodies, and when expressed in the periplasm, crush the bacteria by treatment with partial digestion with lysozyme, osmotic shock, lysis, etc., and collect them outside the cells. Can do. Uniform diabodies can be purified after refolding or from bacterial crushing liquid by using cation exchange chromatography (Antibody Engineering, A Practical Approach, IRL PRESS, 1996).
  • dsFv can be produced mostly using E. coli, insect cells and animal cells.
  • mutations are introduced at appropriate positions in the DNA encoding the VH and VL of the antibody described in 2 (2), 2 (4) and 2 (5) above, and the encoded amino acid residue is changed to cysteine.
  • Make the substituted DNA Each of the prepared DNAs can be cloned into a dsFv expression vector to prepare VH and VL expression vectors.
  • Any dsFv expression vector may be used as long as it can incorporate and express dsFv DNA.
  • pULI9 Protein Engineering, 7, 697-704, 1994.
  • VH and VL expression vectors can be introduced into appropriate E.
  • coli and dsFv can be produced and accumulated in inclusion bodies or periplasm.
  • Inclusion bodies! /, Periplasma can also be obtained as active dsFv by obtaining and mixing VH and VL and then using the refolding method normally used for proteins. After refolding, it can be further purified by ion exchange chromatography and gel filtration (Protein Engine ering, 7, 697-704, 1994).
  • a medicament containing the monoclonal antibody of the present invention as an active ingredient can treat various diseases involving HB-EGF.
  • HB-EGF diseases involving HB-EGF include cancer, heart disease, arteriosclerosis and the like.
  • cancers examples include solid cancers such as breast cancer, liver cancer, knee cancer, bladder cancer, ovarian cancer, and ovarian germ cell tumor. Also included are continuity, hematogenous or lymphatic metastasis associated with any solid cancer, metastatic cancer due to peritoneal dissemination and the like. In addition, cancer types such as leukemia (acute myeloid leukemia, T-cell leukemia, etc.), lymphoma, myeloma-derived cancer (blood cancer, hematological cancer, blood cancer), etc.
  • a pharmaceutical comprising the antibody of the present invention or an antibody fragment thereof as an active ingredient is usually mixed together with one or more pharmacologically acceptable carriers, and any well known in the technical field of pharmaceutics. It is desirable to provide it as a pharmaceutical preparation produced by the method.
  • intravenous administration is desirable.
  • the dosage form include sprays, capsules, tablets, granules, syrups, emulsions, suppositories, injections, ointments, tapes and the like.
  • Suitable formulations for oral administration include emulsions, syrups, capsules, tablets, powders, granules and the like.
  • Liquid preparations such as emulsions and syrups include sugars such as water, sucrose, sorbitol, and fructose, Daricols such as polyethylene glycol and propylene glycol, oils such as sesame oil, olive oil and soybean oil, p- It can be produced using preservatives such as hydroxybenzoates, and flavors such as strawberry flavor and peppermint as additives.
  • lactose include lactose, glucose, sucrose, mannitol and other excipients, starches, disintegrants such as sodium alginate, lubricants such as magnesium stearate and talc, It can be produced using a binder such as bull alcohol, hydroxypropyl cellulose, gelatin, a surfactant such as fatty acid ester, and a plasticizer such as glycerin as additives.
  • a binder such as bull alcohol, hydroxypropyl cellulose, gelatin, a surfactant such as fatty acid ester, and a plasticizer such as glycerin as additives.
  • Suitable formulations for parenteral administration include injections, suppositories, sprays and the like.
  • An injection is prepared using a carrier comprising a salt solution, a glucose solution, or a mixture of both.
  • Suppositories are prepared using a carrier such as cacao butter, hydrogenated fat or carboxylic acid.
  • the spray is prepared using the antibody or peptide itself or a carrier that does not irritate the recipient's oral cavity and airway mucosa and that disperses the compound as fine particles to facilitate absorption.
  • Specific examples of the carrier include lactose and glycerin.
  • preparations such as aerosols and dry powders are possible.
  • the dose or number of administrations depends on the intended therapeutic effect, administration method, treatment period, age, body weight.
  • the force varies depending on the normal adult 10g / kg to 8mg / kg per day.
  • Recombinant secreted human HB-EGF (Catalog No. 259-HE / CF) manufactured by R & D Systems was dried and dissolved in Dulbecco's phosphate buffer (PBS) and used as an immunogen.
  • PBS Dulbecco's phosphate buffer
  • Example 1 Recombinant-secreting human HB-EGF prepared in (1) (25 ⁇ g) was treated with aluminum hydroxide-Ammununant LAntibomes-A Laboratory ManuaL, CoLd bpnng Harbor Laboratories, p99, 1988] 2 mg and pertussis vaccine (Chiba serum) Laboratory Ltd.) 1 X 10 9 cells together with the HB-EGF deficient mice (research Institute for microbial diseases, Osaka University cell function field laboratory from donor, PNAS, VOL.100, NO.100, 3221-3226 , administered to 2003) did. From 2 weeks after administration, only 25 g of the HB-EGF was administered once a week for a total of 4 times.
  • Partial blood was collected from the fundus vein of the mouse, and the serum antibody titer thereof was examined by the enzyme immunoassay shown below.
  • the spleen was removed 3 days after the final immunization from the mouse showing a sufficient antibody titer.
  • the spleen was shredded in a MEM (Minimum Essential Medium) medium (manufactured by Nissui Pharmaceutical), loosened with tweezers, and centrifuged (1200 rpm, 5 minutes).
  • Tris-monochloride-ammonium buffer (PH7.6) was added to the resulting precipitate fraction and treated for 1 to 2 minutes to remove erythrocytes.
  • the resulting precipitate fraction (cell fraction) was washed 3 times with MEM medium and used for cell fusion.
  • Example 1 dispense the recombinant human HB-EGF of Example 1 (1) into a 96-well ELISA plate (Greiner) at 0.5 g / mL, 50 L / well, and leave it at 4 ° C. Adsorbed one was used. After washing the plate, 1% bovine serum albumin (BSA) -PBS was left at 50 L / well for 1 hour at room temperature to block remaining active groups. After standing, discard 1% BS A-PBS, and immunize mouse antiserum and Hypridoma as primary antibody on the plate. The culture supernatant was dispensed at 50 ⁇ L / well and allowed to stand for 2 hours.
  • BSA bovine serum albumin
  • Tween-PBS polyoxyethylene (20) sorbitan monolaurate
  • Tween-PBS polyoxyethylene (20) sorbitan monolaurate
  • ABTS 2.2-azinobis (3-ethylbenzothiazole-6-sulfonic acid) ammonium] substrate solution [1 mmoL / L ABT S / 0.1 moL / L citrate buffer (PH4.2), 0.1% HO]
  • the absorbance at nm was measured using a plate reader (Emax; Molecular Devices).
  • mice spleen cells obtained in Example 1 (2) and the myeloma cells obtained in Example 1 (4) were mixed at 10: 1 and centrifuged (1200 rpm, 5 minutes). After loosening the cells of the resulting precipitate fraction, mix a mixture of 1 g of polyethylene glycol-1000 (PEG-1000), 1 mL of MEM medium, and 0.35 mL of dimethylsulfoxide at 37 ° C with stirring. 0.5 mL was added per 8 mouse spleen cells, and 1 mL of MEM medium was added several times to the suspension every 1 to 2 minutes, and then the MEM medium was added so that the total volume became 50 mL.
  • PEG-1000 polyethylene glycol-1000
  • MEM medium dimethylsulfoxide
  • the suspension was centrifuged (900 rpm, 5 minutes), and the cells of the obtained precipitate fraction were loosened gently. Then, the cells were gently sucked and sucked with a mespipette, and then gently added to HAT medium [10% fetus fetus. Medium supplemented with HAT Media Supplement (manufactured by Invitrogen) in RPMI1640 medium supplemented with serum] It was suspended in 100 mL. Dispense the suspension into a 96-well culture plate at 200 ⁇ L / well and add 5% CO incubator.
  • Example 1 Incubated at 37 ° C for 10-14 days. After culturing, the culture supernatant is examined by the enzyme immunoassay described in Example 1 (3), a well that reacts with recombinant human HB-EGF is selected, and clotting by limiting dilution is selected from the cells contained therein. Repeatedly, anti-HB-EGF monoclonal antibody-producing hybridoma strains KM3566, KM3567 and KM3579 were established.
  • the subclass of the monoclonal antibody was determined by ELISA using a sub-clustering kit.
  • the subclass of the monoclonal antibody KM3566 was IgG1
  • the subclass of KM3567 was IgG1
  • the monoclonal antibody KM3579 was IgG2b.
  • Primary antibodies include anti-HB-EGF monoclonal antibodies KM3566, KM3567, KM3579, commercial anti-HB-EGF monoclonal antibody MAB259 (R & D), and negative control antibody KM511 (anti-GCSF derivative monoclonal antibody).
  • the antibody produced was diluted stepwise from 10 g / mL at a 5-fold dilution. The results are shown in Figure 1-1.
  • Anti-HB-EGF monoclonal antibodies KM3566, KM3567, KM3579, and MAB259 all reacted with recombinant human HB-EGF, but did not react with BSA at all.
  • the membrane was thoroughly washed with Tween-PBS, and diluted peroxidase-labeled mouse immunoglobulin (Zymet) was reacted at room temperature for 1 hour.
  • the membrane was thoroughly washed with Tween-PBS, and the band was detected using ECL TM western blotting detection reagent s (manufactured by Amersham Fanolemacia).
  • ECL TM western blotting detection reagent s manufactured by Amersham Fanolemacia.
  • the anti-HB-EGF monoclonal antibodies KM3566, KM3567, KM3579, and MAB259 all have bands around 15-30 kilodaltons (hereinafter referred to as kDa) corresponding to the molecular weight of recombinant secreted human HB-EGF. Detected.
  • Anti-HB-EGF monoclonal antibodies KM3566, KM3567, KM3579 and MAB259 were tested for B and J using 32DZEGFR cells and piotin-labeled HB-EGF.
  • Recombinant secreted HB-EGF was labeled with vivid tin by a conventional method using EZ-Link Sulfo-NHS-Biotin (Pierce).
  • KM3566, KM3567, KM3579 and MAB259 were diluted stepwise from 10 g / mL at a 5-fold dilution, and dispensed into 96-well plates at 50 L / well. Thereafter, 32DZEGFR cells were dispensed at 1 ⁇ 10 4 cells / 50 L / well. In addition, 10 ⁇ L / well and 50 ⁇ L / well were diluted with 10 ⁇ L / well, respectively, of Piotin-labeled HB-E GF and Alexa 647-labeled streptavidin diluted to the optimal concentration, and then allowed to react for 3 hours in the dark at room temperature. . The wavelength of 650 nm to 685 nm excited by the laser beam 633 nm He / Ne was measured by 8200 Cellular Detection System (manufactured by Applied System).
  • KM3566, KM3567, KM3579, and MAB259 all inhibited the binding of Pyotin ⁇ ⁇ HB-EGF to EGFR in an antibody concentration-dependent manner. Therefore, it was revealed that all anti-HB-EGF monoclonal antibodies inhibit the binding of HB-EGF and EGFR.
  • Anti-HB-EGF monoclonal antibodies KM3566, KM3567, KM3579 and MAB259 were examined for HB-EGF neutralizing activity by cell growth inhibition assay using HB-EGF-dependent cells.
  • HB-EGF-dependent cell a cell line (hereinafter referred to as 32D / EGFR) constructed by introducing the EGFR gene into the mouse bone marrow-derived cell line 32D clone3 (ATC C CRL-11346) was used.
  • Anti-H B-EGF monoclonal antibodies KM3566, KM3567, KM3579, MAB259, and negative control antibody KM511 purified antibodies are diluted stepwise at a dilution of 3 to 4 from 20 g / mL. Dispense into 96-well plates at 0 ⁇ L / well. Next, 0.1 ⁇ g / mL recombinant human ⁇ -EGF (R & D) was dispensed at 10 L / well, mixed, and reacted on ice for 2 hours. Thereafter, 32D / EGFR cells were seeded at 1 ⁇ 10 4 cells / 40 ⁇ L / well and cultured for 36 hours. A living cell count reagent SF (Nacalai Testa) was added at 10 L / well, and after 2 hours, the absorbance at OD450 nm was measured using a plate reader (Emax; Molecular Devices).
  • Emax Molecular Devices
  • KM3567 had an activity of inhibiting HB-EGF-dependent cell proliferation, although its activity was weaker than that of KM3566.
  • Fig. 3 shows the mean fluorescence intensity (MFI value) in the case where the above monoclonal antibody was reacted at 20-fold dilution from 20 ⁇ g / mL to 28-28 and ES-2.
  • Figure 4 shows the human breast cancer cell line MDA-M.
  • B-231 shows a histogram when the above monoclonal antibody is reacted at 20 g / mL.
  • the MFI value of MAB259 was similar to that of the negative control antibody KM511 and the non-antibody added negative control, and there was almost no binding to the cells. From the above, it became clear that the monoclonal antibodies KM3566, KM3567 and KM3579 bind to HB-EGF bound to the membrane type and cell membrane of cancer cell lines.
  • PCR was performed using a mouse Ig ( ⁇ ) -specific primer having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 7 in place of the Ig (y) -specific primer to amplify the VL cDNA fragment.
  • PCR was heated at 94 ° C for 5 minutes, followed by 5 reaction cycles consisting of 94 ° C for 30 seconds, 72 ° C for 3 minutes, 94 ° C for 30 seconds, 70 ° C for 30 seconds, 72 ° C 5 reaction cycles for 3 minutes at 30 ° C, 30 seconds at 94 ° C, 30 seconds at 68 ° C, 30 minutes at 72 ° C and 3 minutes at 72 ° C, then 10 minutes at 72 ° C
  • PTC-200 DNA Engine manufactured by BioRad.
  • a plasmid was extracted from the obtained transformant using an automatic plasmid extractor (manufactured by Kurabo Industries Co., Ltd.), and reacted according to the attached instructions using BigDye Terminator Cycle sequencing FS Ready Reaction Kit (manufactured by PE noisy Suams).
  • the entire nucleotide sequence of VH is contained in SEQ ID NO: 8
  • the entire amino acid sequence of VH including the signal sequence deduced from the sequence is contained in SEQ ID NO: 9
  • the entire nucleotide sequence of the VL was shown in SEQ ID NO: 10
  • the entire amino acid sequence of the VL including the signal sequence deduced from the sequence was shown in SEQ ID NO: 11, respectively.
  • VH and VL CDRs of the anti-HB-EGF monoclonal antibody KM3566 were identified by comparing with the amino acid sequences of known antibodies.
  • an anti-HB-EGF chimeric antibody expression vector PKANTEX3566 was constructed as follows. .
  • Plasmid KM3566VH10G2 is used as a saddle and lOOng, and 10 X KOD buffer 10 ⁇ L, 2 mmol / L dNTP 10 ⁇ L, 25 mmol / L magnesium chloride in 2 ⁇ 10 ⁇ mol / L SEQ ID NO: 18 And a solution consisting of 100 L in total containing 1 ⁇ L of the primer having the base sequence of 19 and 1 ⁇ L of KOD polymeras e (manufactured by Toyobo Co., Ltd.) at 96 ° C.
  • a gene sequence encoding VL of KM3566 to which a restriction enzyme recognition sequence for insertion into PKANTEX93 was added was synthesized.
  • ethanol precipitation The plasmid pKM3566VH containing the gene sequence encoding VL of KM3566 and the plasmid PKM3566VL containing the gene sequence encoding VL are obtained by cloning into a pBluescriptll SK (-) vector that has been further purified, concentrated and digested with Smal. did.
  • the two fragments obtained were ligated using Ligation high (Toyobo Co., Ltd.) according to the attached instructions, and the resulting recombinant plasmid DNA solution was used for Escherichia coli DH5 ⁇ strain (Toyobo Co., Ltd.).
  • Each plasmid DNA was prepared from the clone of the transformant and confirmed by restriction enzyme treatment, and the plasmid ⁇ EX3566VL into which the target EcoRI-BsiWI fragment of about 0.43 kb was inserted was obtained.
  • the restriction enzyme Apal (TaKaRa) was added to the pKANTEX3566VL and pKM3566VH obtained above and reacted at 37 ° C for 1 hour, and then the restriction enzyme NotI (New England Biolabs) was further added. The reaction was carried out at 37 ° C for 1 hour. The reaction solution was fractionated by agarose gel electrophoresis, and an Apal-Notl fragment of about 13.2 kb pKANTEX3566VL and about 0.47 kb VH was recovered.
  • the two fragments obtained were ligated using Ligation High (Toyobo Co., Ltd.) according to the attached instructions, and Escherichia coli DH5a strain (Toyobo Co., Ltd.) was obtained using the resulting recombinant plasmid DNA solution. Transformed.
  • Each plasmid DNA was prepared from the clone of the transformed strain and confirmed by restriction enzyme treatment to obtain the plasmid pKANTEX3566 into which the target Apal-Notl fragment of about 0.47 kb was inserted.
  • the transformed strain ⁇ ⁇ 3966 obtained in (2) above is cultured by the usual culture method, and then the cell suspension is collected and centrifuged at 3000 rpm and 4 ° C for 10 minutes to obtain the culture supernatant. After being collected, it was sterilized by filtration through a 0.22 ⁇ m pore size Millex GV filter (manufactured by Millipore).
  • the anti-HB-EGF chimeric antibody KM3966 was purified from the obtained culture supernatant using a Protein A High-capacity resin (Milipore) column according to the attached instructions. The purity of the purified anti-HB-EGF chimeric antibody KM3966 and the expressed molecular size were confirmed by SDS-PAGE using a gradient gel (ATTO, E-T520L) according to the attached instructions. It was.
  • the results are shown in FIG.
  • the purified anti-HB-EGF chimeric antibody KM3966 showed one band around 150-200 kDa in molecular weight under non-reducing conditions, and two bands of about 50 kDa and about 25 kDa under reducing conditions. . These molecular weights are about 150 kDa under non-reducing conditions of IgG class antibody power.
  • the SS bond in the molecule is cleaved, and the H chain with a molecular weight of about 50 kDa and the molecular weight of about 25 kDa It is consistent with the report that it is broken down into L chains [Antibodies—A Laboratory Manuau and old Spring Harbor Laboratory ⁇ Chapter (4 (1988), Monoclonal Antibodies-Principles and Practice ⁇ Academic Press Limited (1996)]. Therefore, it was confirmed that the anti-HB-EGF chimeric antibody KM3966 was expressed as an antibody molecule with the correct structure.
  • Example 6 In order to evaluate the binding of the anti-HB-EGF chimeric antibody KM3966 obtained in Example 6 to a human solid cancer cell line, the fluorescent antibody method was examined as follows.
  • Human ovarian cancer cell lines MCAS (JCRB0240), RMG-1 (JCRB IF050315), ES-2 (CRL197 8), MDA-MB-231 (ATCC HTB-26), T47D (HTB-133), SK-BR-3 (ATCC HTB-30), ZR-75-1 (ATCC CRL-1500) of human breast cancer cell lines MKN-28 (HSRR B JCRB0253), a human gastric cancer cell line, was peeled off with 0.02% -EDTA Solution (Nacalai Testa), washed with PBS, and placed on a 96-well U-bottom plate (FALCON). , it was dispensed at 1 ⁇ 2 X 10 5 cells / 50 ⁇ L / ⁇ El minute.
  • An anti-HB-EGF chimeric antibody ⁇ 3966 solution prepared to 1 g / mL with 1% BSA-PBS was dispensed in 50 LZ wells, stirred with a plate mixer, and allowed to stand on ice for 30 minutes. After washing twice with PBS, the secondary antibody FITC-conjugated AffiniPure F) diluted 100-fold) 2 Fragment Rabbit Anti-Human IgG, H + L) Qacson Laboratories) The mixture was stirred and allowed to stand on ice for 30 minutes. After washing twice with PBS, the fluorescence intensity was measured using a flow cytometer EPICS XL System II v3.0 (manufactured by BECKMAN C OULTER). An anti-FGF8 chimeric antibody KM3034 (US2004-0253234) was used as a negative control antibody.
  • Biacore Biacore T-100
  • Human HB-EGF (R & D) prepared to 5 ⁇ g / mL using HBS-EP Buffer (Biacore) was added to a CM5 sensor chip (Biacore) 80RU (resonance unit) by the ammine coupling method. ) To form a solid layer.
  • the cell line was detached with 0.02% -EDTA Solution (manufactured by Nacalai Tester), washed with PBS, RPMI 1640 medium (GIBCO-BRL) was prepared, and centrifuged at 300 G for 5 minutes to remove the supernatant.
  • Recombinant human HB-EGF (manufactured by R & D) diluted with 0.1% BSA-PBS was added to the cells at 1 ⁇ g / mL and reacted at 37 ° C for 10 minutes. When recombinant human HB-EGF was not added, 0.1% BSA-PBS alone was added and reacted at 37 ° C for 10 minutes in the same manner.
  • Rabbit Anti-Human Igu H + L (Jackson Laboratories: ⁇ ) was added in 50 ⁇ LZ wells, stirred with a plate mixer, protected from light, and allowed to stand on ice for 30 minutes. After washing, the fluorescence intensity was measured with a flow cytometer EPICS XL System II v3.0 (manufactured by BECKMAN COULTER) An anti-FGF8 chimeric antibody (US2004-02 53234) was used as a negative control antibody.
  • the anti-HB-EGF chimeric antibody KM3966 of the present invention binds to both membrane type and HB-EGF bound to the cell membrane.
  • HB-EGF-dependent growth inhibitory activity was measured.
  • HB-EGF dependent cells HB-EGF positive human ovarian cancer cell line RMG-KJCRB IF050315
  • human gastric cancer cell line MKN-28 HSRRB JCRB
  • RMG-I is 2.5 X 10 3 cells Z50 mu LZ Ueru
  • MKN-28 were seeded into 96 ⁇ El plates at 1 X 10 4 cells / 50 mu LZ Ueru.
  • Recombinant human HB-EGF (R & D) diluted with 0.1% BSA-PBS, with a concentration of 3 ng / mL for RMG-I and 50 ng / mL for MKN-28 Add 50 mL of LZ well with the concentration of mL, dilute anti-HB-EGF chimeric antibody KM3966 10 times from 30 ⁇ g / mL in 4 steps, add 50 ⁇ L / well and mix did.
  • Human IgG (manufactured by Mitsubishi Wellpharma) was used as a negative control antibody. After culturing at 37 ° C for 72 hours, add 15 ⁇ LZ well of live cell counting reagent WST-1 (manufactured by Nacalai Testa), and after 2 hours, measure the absorbance at OD450 nm using a plate reader (E max; MoLecular Devices The measurement was performed using
  • ADCC activity Antibody-dependent cytotoxic activity
  • the ADCC activity of the anti-HB-EGF chimeric antibody KM3966 obtained in Example 6 was measured according to the method shown below.
  • Various cell lines were detached with 0.02% -EDTA Solut ion (Nacalai Testa) and RP MI1640 medium (Invitrogen) without phenol red containing 1% FCS JRH (hereinafter referred to as ADCC medium) After washing with, the target cell solution was prepared by adjusting to the optimal concentration in the same medium.
  • Peripheral blood mononuclear cells were isolated from normal human peripheral blood by the method described below. 50 mL of healthy human peripheral blood was collected with a syringe containing a small amount of sodium sodium injection N “Shimizu” (manufactured by Shimizu Pharmaceutical). The collected peripheral blood was diluted with the same amount of physiological saline (manufacturer) and stirred well.
  • the target cell total release value was obtained by adding target cell solution L and medium 80 L, and adding 9% Triton X-100 solution L 45 minutes before the end of the reaction. After the reaction, the plate was centrifuged, and the lactate dehydrogenase (LDH) activity in the supernatant was detected by measuring the absorbance according to the attached instruction using LDH-Cytotoxic Test (manufactured by Wako). ADCC activity was determined by the following formula.
  • ADCC activity (%) ([Absorbance of specimen] [Absorbance of spontaneous release of target cells and effector cells]) Z ([Absorbance of total release of target cells] [Absorbance of spontaneous release of target cells]) X 10 0
  • the results are shown in FIG.
  • the anti-HB-EGF chimeric antibody KM3966 exhibited cytotoxic activity against the HB-EGF-positive human solid cancer cell line in an antibody concentration-dependent manner.
  • evaluation was performed using human ovarian cancer, mouse xenograft early cancer of human breast cancer and advanced cancer model.
  • Tumor volume (mm 3 ) major axis X minor axis 2 X 0.5
  • Anti-HB-EGF chimeric antibody KM3966 significantly inhibited tumor growth of ovarian cancer cell lines MCAS and ES-2. Therefore, it was revealed that the anti-HB-EGF chimeric antibody KM3966 has an antitumor effect in an early stage cancer model. .
  • mice Human ovarian cancer cell lines MCAS and ES-2 and human breast cancer cell line MDA-MB-231 were removed with 0.02% -ED TA Solution (Nacalai Testa), washed with PBS, and then RPMI1640 medium (GIBCO-B RL) And centrifuged at 300 G for 5 minutes to remove the supernatant. After adding the same medium and washing by centrifugation, the cell suspension prepared to the optimum concentration was transplanted subcutaneously at 100 L to the right armpit of SCID mouse female 6-8 weeks old (Clea Japan). Observing the course, mice were selected when the tumor volume reached around 100 mm 3 and divided into groups so that the average tumor volumes of each group were equal.
  • the antibody administration group received an antibody solution diluted with PBS, and the control group received 100 L of PBS alone in the tail vein (6-7 mice per group). Administration was carried out twice a week for a total of 8 times, and the tumor diameter was measured with calipers at the time of antibody administration. Tumor volume was calculated by the following formula.
  • Tumor volume (mm 3 ) major axis X minor axis 2 X 0.5
  • anti-HB-EGF chimeric antibody KM3966 significantly inhibited tumor growth of ovarian cancer cell lines MCAS, ES-2 and breast cancer cell line MDA-MB-231. Therefore, it was revealed that the anti-HB-EGF chimeric antibody KM3966 has antitumor activity in an advanced cancer model.
  • ADCC activity Reactivity and antibody-dependent cytotoxic activity of anti-HB-EGF antibodies against human hematological cancer cell lines Evaluation (ADCC activity)
  • a 50 ⁇ LZ well (about 2 ⁇ 10 5 cells) was dispensed onto a U-bottom plate (FALCON).
  • Anti-HB-EGF mouse antibody 3566 solution prepared with 1% BS A-PBS to 20 ⁇ g / mL was dispensed with 50 ⁇ L Zwell, stirred with a plate mixer, and left on ice for 30 minutes. After washing twice with PBS, 50 L of secondary antibody Anti-mouse Igs / FITC Goat F (ab ') (DAKO) diluted 50-fold
  • the mixture was added by fuel, stirred with a plate mixer and kept on ice for 30 minutes with light shielding. After washing twice with S, the fluorescence intensity was measured using a flow cytometer EPICS XL System II v3.0 (manufactured by BECKMAN COULTE R). Mouse IgGl (manufactured by DAKO) was used as a negative control antibody.
  • the ADCC activity of the HB-EGF chimeric antibody KM3966 against the acute myeloid leukemia cell line in which HB-EGF expression was confirmed was measured according to the following method.
  • Human acute myeloid leukemia cell lines ML-1, MOLM-13, MV-4-ll, HL-60, NB-4 and KG-la were washed with PBS, washed with ADCC medium, then the same medium To prepare an optimal cell solution.
  • Peripheral blood mononuclear celhPBMC is derived from peripheral blood of healthy individuals. Separated by the method shown below. 50 mL of healthy human peripheral blood was collected with a syringe containing a small amount of sodium sodium injection N “Shimizu” (manufactured by Shimizu Pharmaceutical). The collected peripheral blood was diluted by adding the same amount of physiological saline (manufactured by Otsuka Pharmaceutical) and stirred well. On a polymorphprep (manufactured by NYCOMED) dispensed approximately 6.5 mL each into a 15 mL tube (Greiner), the same volume of diluted terminal blood is gently layered and centrifuged at room temperature for 800 G for 30 minutes to mononuclear. The sphere layer was separated. After washing twice with ADCC medium, it was adjusted to the optimum concentration with the same medium and used as an effector cell solution.
  • the target cell total release value was obtained by adding 50 L of target cell solution and 80 L of medium, and adding 20 L of 9% Triton X-100 solution 45 minutes before the end of the reaction. After the reaction, the plate was centrifuged, and the lactate dehydrogenase (LDH) activity in the supernatant was detected by measuring the absorbance using LDH-Cytotoxic Test (manufactured by Wako) according to the attached instructions. ADCC activity was determined by the following formula.
  • ADCC activity (%) ([Absorbance of specimen] [Absorbance of spontaneous release of target cells and effector cells]) Z ([Absorbance of total release of target cells] [Absorbance of spontaneous release of target cells]) X 10 0
  • the results are shown in FIG.
  • the anti-HB-EGF chimeric antibody KM3966 exhibited cytotoxic activity against the HB-EGF-positive human blood cancer cell line in an antibody concentration-dependent manner. Therefore, the anti-EB-EGF monoclonal antibody and the recombinant antibody HB-EGF of the present invention are expressed, and not only solid cancer such as ovarian cancer but also blood cancer such as acute myeloid leukemia and T cell leukemia It was suggested that it may be effective for Example 9
  • VH amino acid sequence of the anti-HB-EGF humanized antibody was designed as follows.
  • Rikibata et al. Classified VH of various known human antibodies into three subgroups (HSG ⁇ to ⁇ ) based on the homology of their amino acid sequences, and reported common sequences for each subgroup. [SEQUENCES of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services (1991)]. Since these consensus sequences may be less immunogenic in humans, the amino acid sequence of the VH of the anti-HB-EGF humanized antibody was designed based on these consensus sequences.
  • the anti-HB-EGF mouse was selected from the FR amino acid sequences of the consensus sequence of the three subgroups of human antibody VH.
  • the amino acid sequence of FR having the highest homology with the FR amino acid sequence of VH of antibody KM3566 was selected.
  • the VH CDR amino acid sequence of the anti-HB-EGF mouse antibody KM3566 was transplanted to the appropriate position of the FR amino acid sequence of the consensus sequence of VH subgroup I of the human antibody.
  • the 74th Lys in the amino acid sequence of VH of KM3566 set forth in SEQ ID NO: 9 is most frequently used at the site corresponding to the amino acid sequence of the human antibody FR mentioned by Kinomoto et al. Since amino acid residues that are not amino acid residues are amino acid residues that are used relatively frequently, amino acid residues that are found in the amino acid sequence of KM3566 described above were used.
  • the amino acid sequence HV0 of VH of the anti-HB-EGF human rabbit antibody represented by SEQ ID NO: 22 was designed.
  • amino acid sequence of VL of the anti-HB-EGF human antibody was designed as follows.
  • the highest amino acid sequence of FR of VL of anti-HB-EGF mouse antibody KM3566 is the highest.
  • the amino acid sequence of FR with homology was selected.
  • the homology of HSGI, HSGII, HSGIII and HSGIV was 75.0%, 75.0%, 71.3% and 81.3%, respectively. Therefore, the amino acid sequence of FR of VL of KM3566 had the highest homology with subgroup IV.
  • the VL CDR amino acid sequence of the anti-HB-EGF mouse antibody KM3566 was transplanted to the appropriate position of the FR amino acid sequence of the consensus sequence of subgroup IV of the human antibody VL.
  • the 110th Leu in the amino acid sequence of VL of KM3566 shown in SEQ ID NO: 11 is the most frequently used amino acid at the site corresponding to the amino acid sequence of the human antibody FR mentioned by Rikibat et al. Since amino acids that are not residues are amino acid residues that are used relatively frequently, amino acid residues that are found in the amino acid sequence of KM3566 described above were used.
  • the amino acid sequence LV0 of the VL of the anti-HB-EGF human rabbit antibody represented by SEQ ID NO: 23 was designed.
  • VH amino acid sequence HV0 and VL amino acid sequence LV0 of the above-designed anti-HB-EGF human rabbit antibody is the FR amino acid sequence of the selected human antibody and the CDR amino acid sequence of anti-HB-EGF mouse antibody KM3566 It is the arrangement which transplanted only.
  • the binding activity is often lowered only by transplanting the amino acid sequence of the CDR of the mouse antibody to the FR of the human antibody.
  • amino acid residues that are thought to affect binding activity are transferred to the CDR amino acid sequence.
  • changes are being made. Therefore, also in this example, FR amino acid residues that are thought to affect the binding activity were identified as follows.
  • the amino acid sequences HV0 and VL of the VH of the anti-HB-EGF human rabbit antibody designed above The three-dimensional structure of the antibody V region (HV0LV0) consisting of the amino acid sequence LVO was constructed using a computer modeling technique. For 3D structure coordinate creation, use the software AbM (Ox ford Molecular), and for 3D structure display, use the software Pro- Explore (Oxford Molecular) or ViewerLite (Accelrys). Followinged the instructions for use.
  • a computer model of the three-dimensional structure of the V region of the anti-HB-EGF mouse monoclonal antibody KM3566 was also constructed in the same manner.
  • the amino acid residue that is different from anti-HB-EGF mouse antibody KM3566 is selected and changed to the amino acid residue of anti-HB-EGF mouse antibody KM3566
  • the amino acid sequence was prepared, and a three-dimensional structural model was constructed in the same manner. By comparing the three-dimensional structures of the V regions of these anti-HB-E GF mouse antibodies KM3566 and HV0LV0 and variants, amino acid residues that are predicted to affect the binding activity of the antibodies were identified.
  • At least one amino acid sequence is modified to the amino acid residue present at the same site of mouse antibody KM3566, and VH and VL of humanized antibodies with various modifications are designed.
  • the 9th Ala of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 22 is Thr
  • the 20th Val is Leu
  • the 30th Thr is Arg
  • the 38th Arg is Lys.
  • the 70th lie to Leu
  • the 95th Tyr to Phe
  • at least one of the amino acid modifications replacing Le at the 118th Val was introduced.
  • VL the 15th Leu of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 23 is Val
  • the 19th Ala is Val
  • the 21st lie is Met
  • the 49th Pro is Ser
  • At least one of the amino acid modifications replacing the second Leu with Val was introduced.
  • the designed amino acid sequence was linked to the H chain secretory signal sequence of anti-HB-EGF mouse antibody KM3566 represented by the 1st to 19th positions of SEQ ID NO: 9 to obtain a complete antibody amino acid sequence.
  • the amino acid sequence was converted into a gene codon. If there are multiple gene codons for a single amino acid residue, the frequency of use found in the base sequence of the antibody gene [S EwUEN and £ S of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services S (1991)], the corresponding gene codon was determined.
  • the nucleotide sequence of the cDNA encoding the amino acid sequence of the complete antibody V region is designed, and the 5 'and 3' ends are combined with the primer sequence for amplification primers during PCR reaction ( (Including a restriction enzyme recognition sequence for cloning into the human potato antibody expression vector). Divide the designed base sequence into 4 base sequences in total of about 100 bases from the 5 'end side (adjacent base sequences should have an overlapping sequence of about 20 bases at their ends) A synthetic DNA (SEQ ID NO: 24-27) was synthesized in the order of alternating antisense strands.
  • the reaction solution was precipitated with ethanol, dissolved in sterilized water, treated with an appropriate restriction enzyme, and then ligated to plasmid pBluescript II SK (-) (Stratagene).
  • the recombinant plasmid DNA solution thus obtained is used to transform Escherichia coli DH5 ⁇ strain, and plasmid DNA is prepared from the transformed strain. BigDye Terminator Cycle Sequencing FS Ready Reaction Kit (manufactured by Applied Biosystems) As a result of analyzing the base sequence using, a plasmid having the target base sequence was obtained.
  • the modification of the FR amino acid residue designed in this Example (1) was carried out by preparing a synthetic DNA having a mutation, performing the above PCR, and the cDNA encoding HV0 prepared above.
  • PCR is carried out using synthetic DNA with mutations in plasmid DNA containing DNA as primers and amplified This was done by isolating the gene fragment.
  • the modified gene codon of the amino acid residue was made to be the gene codon found in the anti-HB-EGF mouse antibody KM3566.
  • cycles of 94 ° C for 30 seconds, 55 ° C for 30 seconds, and 72 ° C for 60 seconds were allowed to react in a PCR reaction of 35 cycles.
  • PCR reaction was performed using KOD-plus polymerase (manufactured by TO YOBO).
  • the synthetic DNA used is from Fasmac.
  • a cDNA encoding the amino acid sequence of the VL of the anti-HB-EGF human rabbit antibody designed in this Example (1) was constructed using PCR as follows.
  • the designed amino acid sequence was linked to the L chain secretory signal sequence of anti-HB-EGF mouse antibody KM3566 represented by positions 1 to 20 of SEQ ID NO: 11 to obtain a complete antibody amino acid sequence.
  • the amino acid sequence was converted into a gene codon.
  • the frequency of use found in the base sequence of the antibody gene [SEQUEN S of Proteins of Immunological Interest ⁇ US Dept. Health and Human ber vices (1991) ]. The corresponding gene codon was determined.
  • the nucleotide sequence of the cDNA encoding the amino acid sequence of the complete antibody V region is designed, and then the 5 'and 3' ends are combined with the primer sequences for amplification primers in the PCR reaction (humanized)
  • a restriction enzyme recognition sequence for cloning into an antibody expression vector was added. Divide the designed base sequence into 4 base sequences of about 100 bases each from the 5 'end (adjacent base sequences should have an overlapping sequence of about 20 bases at the end) and sense them
  • Synthetic DNA SEQ ID NOs: 28 to 31 was synthesized in the order of alternating strands and antisense strands.
  • Plasmid DNA was prepared, and the base sequence was analyzed using BigDye Terminator Cycle Sequencing FS Ready Reaction Kit (Applied Biosystems). As a result, plasmid pBS / LVO having the target base sequence was obtained.
  • the modification of the FR amino acid residue designed in this Example (1) was performed by preparing a synthetic DNA having a mutation, carrying out the PCR described above, and the cDNA encoding the LV0 prepared above. PCR was carried out using a synthetic DNA having a mutation as a plasmid DNA containing a synthetic DNA having a mutation as a primer, and the amplified gene fragment was isolated. The gene codons of the amino acid residues after the modification were made to be the gene codons found in the anti-HB-EGF mouse antibody KM3566.
  • PCR reaction is performed at 94 ° C for 30 seconds, 55 ° C for 30 seconds, 72 ° C for 60 seconds in 35 cycles with KOD-plus polymerase (TOYOBO) Was done using.
  • the synthetic DNA used was manufactured by Fasmac.
  • the respective cDNAs encoding HV0 and LV0 obtained in Examples (2) and (3), or their variants, are placed at appropriate positions in the humanized antibody expression vector pKANTEX93 described in WO97 / 10354.
  • Various anti-HB-EGF humanized antibody expression vectors were constructed by inserting the encoding cDNA.
  • Anti-HB-EGF antibodies KM3566, KM3579, and KM3966 all react with human HB-EGF and do not show cross-reactivity with mouse HB-EGF. Therefore, in the amino acid sequence of the EGF-like domain of human HB-EGF, 10 mutant human HB-EGF full-length proteins in which 10 amino acids different from mouse HB-EGF are replaced with amino acids derived from mouse, one by one. (Hereafter, mutation It is written as HB-EGF. ), And the binding activity of the anti-HB-EGF antibody was measured. The 10 types of mutant HB-EGF prepared are shown below.
  • V124L Mutant HB-EGF with leucine replaced at the 124th position from the N-terminus
  • H135L Mutation HB-EGF with the substitution of histidine at position 135 from the N-terminus
  • the above-mentioned mutant HB-EGF and human Z mouse chimeric HB-EGF plasmid for transient expression can be obtained by the method of Mekada et al. (J. Bio. Chem., Vol. 272, 27084-27090, 1997). Made using.
  • Mouse LMTK—cells (ATCC CCL-1.3) were cultured in Dulbecco's modified Eagle's medium supplemented with 100 unit / mL penicillin G, 100 ⁇ g / mL st reptomycin, and 10% Ushidaidai serum did.
  • Each of the above expression plasmids was introduced into mouse LMTK-cells by the calcium phosphate method and then cultured for 48 hours and used in the subsequent experiments.
  • mock cells in which only the vector was introduced into mouse LMTK-cells (hereinafter referred to as mock) were used.
  • anti-HB-EGF rabbit antibody polyclonal antibody that binds equally to all mutant HB-EGFs (antibody name; H-6, synthetic peptides from the 54th to 73rd positions from the N-terminus of human HB-EGF)
  • HB- EGF transgenic cell, human Z mouse chimeric HB- Absorbance against EGF gene-introduced cells and mock was measured by the same method as described above.
  • Piotin-labeled H-6 antibody was used at an antibody concentration of 10 ⁇ g / mL.
  • the value obtained by subtracting the absorbance for mock from the absorbance for each mutant HB-EGF gene-introduced cell and human Z mouse chimeric HB-EG F gene-introduced cell of H-6 antibody was defined as B value.
  • the A / B value was determined by dividing the A value by the B value.
  • the ratio of the A / B value to various mutant HB-EGF was calculated, and this was relative to the various mutant HB-EGF. Binding activity.
  • Anti-HB-EGF monoclonal antibody KM3566 did not bind to I133K, H135L and S147T as compared to pRTHGC-6. Therefore, it was revealed that the anti-HB-EGF monoclonal antibody ⁇ 3566 recognizes an epitope containing the 133rd I, 135th ⁇ and 147th S amino acids. Similarly to anti-HB-EGF monoclonal antibody ⁇ 3566, anti-HB-EGF chimeric antibody ⁇ 3966, which has the same antibody variable region, hardly binds to I133K and H135L compared to pRTHGC-6. In S147T, binding activity decreased to about 1/3.
  • the anti-HB-EGF chimeric antibody KM3966 like the anti-HB-EGF monoclonal antibody KM3566, recognizes an epitope containing the 133rd I, 135th H and 147th S amino acids. Became.
  • anti-HB-EGF monoclonal antibody KM3579 Compared to pRTHGC-6, anti-HB-EGF monoclonal antibody KM3579 did not bind to E141H alone, and all other mutant HB-EGFs showed binding activity equivalent to pRTHGC-6. Therefore, it was revealed that the anti-HB-EGF monoclonal antibody KM3579 recognizes an epitope containing the 141st E amino acid.
  • anti-HB-EGF monoclonal antibody KM3566 and anti-HB-EGF chimeric antibody KM3966 and anti-HB-EGF monoclonal antibody KM3579 It became clear that the group was recognized.
  • the present invention provides monoclonal antibodies and antibody fragments thereof that bind to HB-EGF, membrane-type HB-EGF, and secretory HB-EGF that are bound to cell membranes.

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Abstract

HB-EGFが亢進する疾患を治療するための医薬が求められている。本発明によれば、細胞膜に結合しているHB-EGF、膜型HB-EGFおよび分泌型HB-EGFに結合するモノクローナル抗体およびその抗体断片が提供することができる。

Description

明 細 書
へパリン結合上皮細胞増殖因子様増殖因子に結合するモノクローナル抗 体
技術分野
[0001] 本発明は、細胞膜に結合しているへパリン結合上皮細胞増殖因子様増殖因子 (he pann binding epidermal growth factor-like growth factor ^以「 HB- EG と称す。 )、 膜型 HB- EGFおよび分泌型 HB- EGFに結合するモノクローナル抗体およびその抗体 断片に関する。
背景技術
[0002] HB- EGFは、 1992年に東山らによって、マクロファージに分化したヒトマクロファージ 様細胞株 U-937の培養上清より、精製、単離された (非特許文献 1)。 HB-EGFは、上 皮細胞成長因子（epidermal growth factor, EGF)ファミリーに保存されている 6つのシ スティンを共有しており、 EGFファミリーに属し、また EGFファミリーに属する他のタン ノ ク質と同様に、 I型膜タンパク質として合成される (非特許文献 1および 2)。膜型 HB- EGFは、熱や浸透圧によるストレス、増殖因子、サイト力イン、および Gタンパク質共役 受容体 (GPCR)ァゴニストであるリゾホスファチジン酸 (LPA)などの、様々な生理的刺 激によって活性ィ匕されたメタ口プロテアーゼにより、 14〜22キロダルトン (以下、 kDaと 記す)の分泌型 HB- EGFに変換される（非特許文献 1〜3)。分泌型 HB- EGFは、 EGF 受容体 (EGFR/ErbBl) (非特許文献 1)、 ErbB4(非特許文献 4)および N -アルギニン 二塩基転換酵素 (非特許文献 5)に結合し、線維芽細胞や平滑筋細胞（非特許文献 1)、ケラチノサイト (非特許文献 6)、へパトサイト (非特許文献 7)、メサンギゥム細胞 (非 特許文献 8)に対して増殖促進活性を有する。また、心臓弁等の器官形成 (非特許文 献 28、 29および 31)や創傷治癒 (非特許文献 9および 10)、ァテローム性動脈硬化症 で生じる平滑筋細胞の過形成 (非特許文献 11)、再狭窄 (非特許文献 12および 13)、 肺性高血圧 (非特許文献 14)、肝再生 (非特許文献 15)、脳障害 (非特許文献 16)や 癌 (非特許文献 28〜35)に、 HB-EGFが関与すること等も知られている。
[0003] 一方、細胞表面には相当量の膜型 HB-EGFが、分泌型へ切断されないまま発現し ていることが報告されている（非特許文献 17)。膜型 HB-EGFは、細胞表面で CD9な どのテトラスパニンや、インテグリン α 3 |8 1と複合体を形成していることが知られており 、ジャタスタクライン増殖因子として近接する細胞と相互作用するとの報告もある (非 特許文献 17〜22)。また、 Naglichらは、膜型 HB-EGFがジフテリアトキシンのレセプタ 一として機能し、ジフテリアトキシンの細胞内への進入に関与していることを報告して いる (非特許文献 23)。
目加田らは HB-EGFノックアウト（KO)マウスを作製して、 HB-EGFの生理的機能を 解析した結果、 HB-EGF KOマウスは心室の拡張、心機能の低下、および心臓弁肥 大の症状を示し、半数以上が生後数日で死亡した。このことは、 HB-EGFが心臓の発 達と機能維持に必須なタンパク質であることを示して 、る (非特許文献 24)。
次に目加田らは、プロテアーゼによる切断部位に変異を入れることにより、分泌型 に変換されなくなった HB-EGF (以下、 HBueと称す。）、および膜貫通領域が欠損した プロテアーゼ非依存的に分泌される HB-EGF (以下、 HBAtmと称す。）の、 2種類の遺 伝子を作製した。それぞれの HB-EGF変異体を発現する遺伝子組換えマウスを作製 し、膜型および分泌型 HB-EGFの生理的機能を解析した (非特許文献 25)。その結 果、 HBUC発現マウスは HB- EGF KOマウスに類似した症状を示したことから、分泌型 H B-EGFが活性型タンパク質として機能して ヽると考えられた。 HBAtm発現マウスは新 生児期以前または新生児期に大半が死亡した。さらに、対立遺伝子の片方のみに変 異を導入した HBAtm/+マウスでは、ケラチノサイトの過形成、および新生児期から心 室肥大が認められた。これらの症状は、 HB-EGF KOマウスや HBue発現マウスとは正 反対の表現型であった。ジフテリアトキシンの変異体として知られている CRM197 (非 特許文献 26)は、 HB-EGFの細胞増殖促進活性を特異的に阻害し、かつ細胞膜を透 過しない。この CRM197が、 HBAtm発現マウスの表現型である過形成や心室肥大を抑 制したことから、 HBAtm発現マウスで生成した HBAtmは、分泌前に細胞内の受容体に 結合して作用するのではなぐ細胞外に分泌された後に細胞表面の受容体に結合し て作用することが推定されている。したがって、生体内の膜型 HB-EGFと分泌型 HB- EGFとの量的バランスが、正常な生理機能の維持に必須であり、また生体内では HB -EGFの膜型力も分泌型への変換プロセス力 制御されていると考えられる。 東山らは、胸部大動脈を狭窄して心肥大を誘発させたマウスで、心臓内の分泌型 H B-EGFタンパク質が増加することを見出している。このマウスに、膜型 HB-EGFを分 泌型に変換するプロテアーゼを阻害する低分子化合物を投与すると、心臓における 膜型 HB-EGFの分泌型への変換が抑制された結果、心肥大が抑制されることを報告 している（非特許文献 27)。
これまでに、乳癌、肝癌、膝癌、膀胱癌等、種々の癌で、 HB-EGFが正常組織と比 較して高発現していることが報告されている (非特許文献 28〜31)。また、最近、 HB- EGFが癌の増殖に重要な因子であることが明らかにされた (非特許文献 32および 33) 。 目カロ田らは、ヌードマウスにヒト卵巣癌細胞株を移植するモデル系において、 HB- E GFの small interference RNA(siRNA)を癌細胞株へ導入すること、あるいは癌細胞株 を移植したマウスに CRM197を投与することにより、顕著な腫瘍増殖阻害効果が認め られることを明らかにした。また、東山らは、膀胱癌の細胞株に HB-EGF遺伝子を導 入した株で、 in vitroにおいて細胞増殖、コロニー形成能、血管内皮増殖因子 (VEGF )発現およびサイクリン D1などの発現が増加することを明らかにした。また、 in vivoに おいても、ヌードマウスにおける造腫瘍性の亢進や腫瘍血管新生の亢進が認められ ることを報告した。このような増殖促進作用は、膜型 HB-EGFまたは分泌型 HB-EGF 遺伝子を発現させた場合にのみ認められ、プロテアーゼ抵抗性膜型 HB-EGF遺伝 子を強制発現させた場合には、認められな力つた。したがって、分泌型 HB-EGFは、 卵巣癌や膀胱癌の腫瘍増殖に関わる重要な因子である可能性が示唆された。臨床 患者の HB-EGF発現に関しては、目カロ田らが、卵巣癌患者の腫瘍組織中の HB-EG F mRNA発現量および腹水中の分泌型 HB-EGFタンパク質濃度を解析した結果、 EG Fファミリーの中で HB-EGFのみが発現亢進していることを報告している（非特許文献 32)。更に宫本らは、腫瘍の HB-EGFmRNAが高発現している卵巣癌患者では、低発 現の患者に比べて予後が不良であることを報告した (非特許文献 34)。以上の結果は 、少なくとも卵巣癌において、癌の産生する分泌型 HB-EGFがオートクラインもしくは ノ ラクラインの機序で、癌の増殖に関与していることを示している（非特許文献 35)。 分泌型 HB-EGFに結合して活性を阻害する抗体としてはいくつかのポリクローナル抗 体と、 1種のモノクローナル抗体（ともに R&D社製）が知られている。抗 HB-EGFャギポ リクローナル抗体 (R&D社製）は、 COS-7細胞に発現させた細胞表面の膜型 HB-EG
Fに結合することが、報告されている (非特許文献 3)。膜型タンパク質が癌などの細 胞表面に存在する場合、そのタンパク質に結合するモノクローナル抗体が該細胞の 増殖を阻害する治療薬となり得ることが広く知られて 、る (非特許文献 36)。しかしな がら、分泌型 HB- EGF、細胞膜に結合している HB- EGFおよび膜型 HB- EGFに結合 するモノクローナル抗体にっ 、ては、現在まで報告がな 、。
非特許文献 l:Science,Vol.251, 936,1991
非特許文献 2: J. Biol. Chem.267(1992)6205-6212
非特許文献 3:Nature,Vol.402,884,1999
非特許文献 4:EMBO J.16(1997)1268-1278
非特許文献 5:EMBO J.20(2001)3342-3350
非特許文献 6:J.Biol.Chem.269(1994)20060- 20066
非特許文献 7:Biochem Biophys. Res. Commun.198(1994)25-31
非特許文献 8: J. Pathol.189(1999)431-438
非特許文献 9:Proc.Natl. Acad. Sci. U.S.A.90(1993)3889-3893
非特許文献 10: J. Cell Biol.151(2000)209-219
非特許文献 11 :J. Clin. Invest.,95,404,1995
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発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0006] HB-EGFが関与する疾患を治療するための医薬が求められている。
課題を解決するための手段
[0007] 本発明は以下の（1)〜（24)に関する。
(1)細胞膜に結合して 、るへパリン結合上皮細胞増殖因子様増殖因子 (heparin bind ing epidermal growth factor-like growth factor w下、 HB— EGFと称す。 )、膜型 HB— EGFおよび分泌型 HB-EGFに結合するモノクローナル抗体またはその抗体断片。
(2)細胞膜に結合して 、る HB-EGF、膜型 HB-EGFおよび分泌型 HB-EGFの上皮増 殖因子様ドメイン (EGF様ドメイン）に結合する（1)記載のモノクローナル抗体または その抗体断片。
(3)分泌型 HB-EGFと HB-EGF受容体との結合を阻害する、請求項 1または請求項 2 に記載のモノクローナル抗体またはその抗体断片。
(4)分泌型 HB-EGFに対して中和活性を有する（1)〜（3)の 、ずれか 1項に記載のモ ノクローナル抗体またはその抗体断片。
(5)分泌型 HB-EGFと、 HB-EGF受容体またはジフテリアトキシンとの結合領域に結 合する（1)〜 (4)のいずれか 1項に記載のモノクローナル抗体またはその抗体断片。
(6)配列番号 2で表されるアミノ酸配列の 133番目、 135番目、および 147番目のうち、 少なくとも 1つのアミノ酸を含むェピトープに結合する（1)〜（5)に記載のモノクローナ ル抗体またはその抗体断片。
(7)配列番号 2で表されるアミノ酸配列の 133番目、 135番目および 147番目のアミノ酸 を含むェピトープに結合する（6)に記載のモノクローナル抗体またはその抗体断片。
(8)配列番号 2で表されるアミノ酸配列の 141番目のアミノ酸を含むェピトープに結合 する（1)〜（5)記載のモノクローナル抗体またはその抗体断片。
(9)ハイブリドーマ KM3579 (FERM BP-10491)が生産するモノクローナル抗体が結合 するェピトープに結合する（1)〜（3)、 (5)および (8)に記載のモノクローナル抗体ま たはその抗体断片。
(10)ハイプリドーマ KM3567 (FERM BP-10573)が生産するモノクローナル抗体が結 合するェピトープに結合する（1)〜 ) V、ずれか 1項に記載のモノクローナル抗体ま たはその抗体断片。
(11)ハイプリドーマ KM3566 (FERM BP-10490)が生産するモノクローナル抗体が結 合するェピトープに結合する（1)〜（7)のいずれ力 1項に記載のモノクローナル抗体 またはその抗体断片。
(12)抗体の重鎖可変領域 (以下、 VHと記す)の相補鎖決定領域 (complementarity d etermining region,以下 CDRと記す） 1、 CDR2および CDR3が、それぞれ配列番号 12 、 13および 14で表されるアミノ酸配列を含み、かつ、抗体の軽鎖可変領域 (以下、 VL と記す）の CDR1、 CDR2および CDR3が、それぞれ配列番号 15、 16および 17で表され るアミノ酸配列を含む、 (1)〜（7)および（11)の 、ずれ力 1項に記載のモノクローナル 抗体またはその抗体断片。
(13)モノクローナル抗体力 遺伝子組換え抗体である、（1)〜（12)のいずれ力 1項に 記載の抗体またはその抗体断片。
(14)遺伝子組換え抗体が、ヒト型キメラ抗体、ヒト化抗体およびヒト抗体から選ばれる 、（13)に記載の抗体またはその抗体断片。
(15)ヒト型キメラ抗体の VH力 配列番号 9で表されるアミノ酸配列を含み、かつ、 VL が、（11)で表されるアミノ酸配列を含む、（14)に記載のヒト型キメラ抗体またはその抗 体断片。
(16)ヒト化抗体の VH力 配列番号 22で表されるアミノ酸配列または配列番号 22で表 されるアミノ酸配列の 9番目の Alaを Thrに、 20番目の Valを Leuに、 30番目の Thrを Arg に、 38番目の Argを Lysに、 41番目の Proを Thrに、 48番目の Metを lieに、 67番目の Arg を Lysに、 68番目の Valを Alaに、 70番目の lieを Leuに、 95番目の Tyrを Pheに、および 1 18番目の Valを Leuに置換する改変力 選ばれる少なくとも 1つの改変が導入されたァ ミノ酸配列を含み、かつ、
ヒト化抗体の VLが、配列番号 23で表されるアミノ酸配列または配列番号 23で表される アミノ酸配列の 15番目の Leuを Valに、 19番目の Alaを Valに、 21番目の lieを Metに、 49 番目の Proを Serに、および 84番目の Leuを Valに置換する改変から選ばれる少なくとも 1つの改変が導入されたアミノ酸配列を含む、（14)に記載のヒト化抗体またはその抗 体断片。
(17)抗体断片が、 Fab, Fab\ F(ab')、一本鎖抗体（scFv)、二量体化 V領域（Diabod
2
y)、ジスルフイド安定化 V領域 (dsFv)および CDRを含むペプチド力 選ばれる抗体断 片である（1)〜（16)の 、ずれ力 1項に記載の抗体断片。
(18) (1)〜（17)の 、ずれか 1項に記載の抗体またはその抗体断片をコードする DNA
(19) (18)に記載の DNAを含有する組換え体ベクター。
(20) (19)に記載の組換え体ベクターを宿主細胞に導入して得られる形質転換体。
(21) (20)に記載の形質転換体を培地で培養し、培養物中に（1)〜（17)のいずれか 1 項に記載の抗体またはその抗体断片を生成蓄積させ、培養物から該抗体または該 抗体断片を採取することを特徴とする（1)〜（17)の ヽずれか 1項に記載の抗体または その抗体断片の製造方法。
(22) (1)〜（17)の 、ずれか 1項に記載の抗体またはその抗体断片を有効成分として 含有する医薬。 (23) (1)〜（17)の 、ずれか 1項に記載の抗体またはその抗体断片を有効成分として 含有する、 HB-EGFが関与する疾患の治療剤。
(24) HB-EGFが関与する疾患が癌である、 (23)に記載の治療剤。
発明の効果
[0008] 本発明によれば、細胞膜に結合して 、る HB-EGF、膜型 HB-EGFおよび分泌型 HB -EGFに結合する抗体を提供することができる。
図面の簡単な説明
[0009] [図 1-1]バインディング ELISAにおける各種抗 HB-EGFモノクローナル抗体の反応性 を示す。横軸に各抗体の濃度を、縦軸に各抗体の結合活性を示す。◊はモノクロ一 ナル抗体 KM511、國はモノクローナル抗体 KM3566、△はモノクローナル抗体 KM356 7、▲はモノクローナル抗体 KM3579、〇はモノクローナル抗体 MAB259をそれぞれ表 す。
[図 1- 2]抗 HB- EGFモノクローナル抗体 KM3566、 KM3567, KM3579および MAB259 の HB-EGF— EGFR結合阻害活性を示す。横軸に各抗体の濃度を、縦軸にピオチン 標識 HB-EGFの結合を蛍光強度で示す。横ば 、の実線はピオチン標識 HB-EGF添 カロ、抗体非添加時の蛍光強度、横ばいの点線はピオチン標識 HB-EGF非添加、抗 体非添加時の蛍光強度を示す。△はモノクローナル抗体 KM3566、 Xはモノクローナ ル抗体 KM3567、參はモノクローナル抗体 KM3579、國はモノクローナル抗体 MAB25 9をそれぞれ表す。
[図 2-1]各種抗 HB- EGFモノクローナル抗体の HB- EGF中和活性を示す。横軸に各 抗体の濃度を、縦軸に増殖阻害率（％)を示す。◊はモノクローナル抗体 KM511、■ はモノクローナル抗体 KM3566、▲はモノクローナル抗体 KM3579、〇はモノクローナ ル抗体 MAB259をそれぞれ表す。
[図 2-2]各種抗 HB- EGFモノクローナル抗体の HB- EGF中和活性を示す。横軸に各 抗体の濃度を、縦軸に細胞増殖を示す。 HB-EGF(+)は、 HB-EGF添加、抗体非添加 時の細胞増殖、 HB-EGF (-)は、 HB-EGF非添加、抗体非添カ卩時の細胞増殖を示す 。口はモノクローナル抗体 MAB259、國はモノクローナル抗体 KM3567、▲はモノクロ ーナル抗体 KM3566をそれぞれ表す。 [図 3]FCM解析における各種抗 HB-EGFモノクローナル抗体の反応性を示す。横軸 に各抗体の濃度を、縦軸に平均蛍光強度 MFI値を示す。 Xはモノクローナル抗体 K M511、△はモノクローナル抗体 KM3566、口はモノクローナル抗体 KM3579、〇はモ ノクローナル抗体 MAB259をそれぞれ表す。
[図 4]FCM解析における、 MDA-MB-231細胞に対する各種抗 HB- EGFモノクローナ ル抗体の反応性を示す。各ヒストグラムの実線は陰性対照抗体 KM511、破線は各抗
HB- EGF抗体を示す。（a) MAB529、（b) KM3566、（c) KM3567、（d) KM3579を示す。
[図 5]抗 HB- EGFキメラ抗体発現ベクター pKANTEX3566の造成工程を示す。
[図 6]精製した抗 HB- EGFキメラ抗体 KM3966の SDS-PAGE (5-20%グラジュェントゲル 使用）の泳動パターンを示す。レーン 1が分子量マーカー、レーン 2が還元条件下、 レーン 3が非還元条件下における、抗 HB-EGFキメラ抗体 KM3966を示す。
[図 7]フローサイトメトリーでの、ヒト固形癌細胞株に対する抗 HB-EGFキメラ抗体 KM3
966の反応性を示す。図の縦軸は細胞数を、横軸は蛍光強度を示す。
[図 8]フローサイトメトリーでの、リコンビナント HB-EGFを処理したヒト固形癌細胞株に 対する、抗 HB— EGFキメラ抗体 KM3966の反応性を示す。図の縦軸は細胞数を、横 軸は蛍光強度を示す。
[図 9]抗 HB- EGFキメラ抗体 KM3966のヒト HB- EGFに対する中和活性を示す。図の縦 軸は生細胞数を表す O.D450nmの吸光度値を、横軸は抗体濃度を示す。國は陰性 対照抗体 human IgGゝ口は KM3966を示す。 HB- EGF (—）は HB- EGF非添加、 HB- E GF ( + )は HB- EGF添カ卩を示す。
[図 10]抗 HB-EGFキメラ抗体 KM3966のヒト固形癌細胞株に対する抗体依存性細胞 傷害活性 (ADCC活性)を示す。図の縦軸は細胞傷害活性率 (％)を、横軸は抗 HB- EGFキメラ抗体 KM3966の抗体濃度を示す。横ば 、の直線は抗体非添加時の細胞 傷害活性を示す。
[図 11]抗 HB-EGFキメラ抗体 KM3966の初期癌モデルにおける抗腫瘍活性を示す。 図の縦軸は腫瘍体積を、横軸は癌細胞移植後の日数を表す。參は PBS投与群、〇 は KM3966 10 mg/kg投与群を示す。バーは標準偏差を示す。
[図 12]抗 HB-EGFキメラ抗体 KM3966の進行癌モデルにおける抗腫瘍活性を示す。 図の縦軸は腫瘍体積を、横軸は癌細胞移植後の日数を表す。參は PBS投与群、〇 は KM3966 10 mg/kg投与群を示す。バーは標準偏差を示す。
[図 13]フローサイトメトリーでの抗 HB- EGFマウス抗体 KM3566のヒト血液癌細胞株に 対する反応性を示す。図の縦軸は細胞数を、横軸は蛍光強度を示す。 Aは急性骨 髄性白血病細胞株、 Bは T細胞性白血病細胞株を示す。
[図 14]抗 HB-EGFキメラ抗体 KM3966のヒト血液癌細胞株に対する抗体依存性細胞 傷害活性 (ADCC活性)を示す。図の縦軸は細胞傷害活性率 (％)を、横軸は抗 HB- EGFキメラ抗体 KM3966の抗体濃度を示す。横ば 、の直線は抗体非添カ卩時の細胞 傷害活性を示す。
[図 15]抗 HB- EGFモノクローナル抗体 KM3566、 KM3579,およびキメラ抗体 KM3966 の変異 HB-EGF発現細胞に対する反応性を示す。図の縦軸は各抗体の反応性（％) を、横軸は変異 HB- EGFの種類を示す。
発明を実施するための最良の形態
[0010] 本発明にお 、て、膜型 HB- EGFとは、細胞膜貫通ドメインを有して細胞膜に結合し 、かつシグナル配列、プロ領域、へパリン結合ドメイン、 EGF様ドメイン、ジャクスタメン ブレンドメイン、細胞質ドメインカゝら構成される HB-EGFをいう。具体的には配列番号 2 で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドがあげられる。また、本発明において、 分泌型 HB- EGFとは、膜型 HB- EGFの膜結合部位がプロテアーゼ等で切断された、 EGF様ドメインを含む細胞外ドメインを 、う。具体的には配列番号 3で表されるァミノ 酸配列を有するポリペプチドがあげられる。細胞膜に結合している HB-EGFとは、分 泌型 HB-EGFが、そのへノ リン結合活性および静電気的結合活性などにより、細胞 膜表面に結合して 、る HB- EGFを 、う。
[0011] 細胞膜において、分泌型 HB-EGFが結合する物質としては、細胞膜上に存在し、 分泌型 HB-EGFが結合する物質であれば、いかなるものでも良いが、具体的には多 糖類、より好ましくはグリコサミノダリカンがあげられ、特に好ましくはへパラン硫酸など があげられる。
HB-EGFはジフテリアトキシン、 EGF受容体 ErbBlまたは ErbB4と結合する活性を有 する。 膜型 HB- EGFとしては、下記（a)、（b)、（c)のタンパク質などがあげられる。
(a)配列番号 2で表されるアミノ酸配列力 なるタンパク質；
(b)配列番号 2で表されるアミノ酸配列において、 1つ以上のアミノ酸が欠失、置換、挿 入および/または付加されたアミノ酸配列力もなり、かつ、ジフテリアトキシンが結合 する活性を有するタンパク質；
(c)配列番号 2で表されるアミノ酸配列と 80%以上の相同性を有するアミノ酸配列力もな り、かつ、ジフテリアトキシンが結合するタンパク質；
また、分泌型 HB-EGFとしては、下記（a)、（b)、（c)のタンパク質などがあげられる。
(a)配列番号 3、 4または 5で表されるアミノ酸配列力 なるタンパク質；
(b)配列番号 3、 4または 5で表されるアミノ酸配列において、 1つ以上のアミノ酸が欠失 、置換、挿入および Zまたは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、 EGF受容体 Erb Bl、または ErbB4が結合する活性を有するタンパク質；
(c)配列番号 3、 4または 5で表されるアミノ酸配列と 80%以上の相同性を有するアミノ酸 配列からなり、かつ、 EGF受容体 ErbBl、または ErbB4が結合するタンパク質； 配列番号 2、 3、 4または 5で表されるアミノ酸配列において 1以上のアミノ酸が欠失、 置換、挿入および/または付加されたアミノ酸配列力もなり、かつ、ジフテリアトキシン または EGF受容体 ErbBl、または ErbB4が結合するタンパク質とは、モレキユラ一 ·クロ 一-ング第 2版、カレント 'プロトコ一ルズ'イン'モレキュラ^ ~ ·バイオロジー、ヌクレイツ ク'アシッド 'リサーチ（Nucleic Acids Research) , 10, 6487 (1982)、プロシーディングス 'ナショナル 'アカデミック 'サイエンス 'ユーエスエー (Proc. Natl. Acad. Sci.) USA, 79 , 6409 (1982)、ジーン (Gene) , 34, 315 (1985)、などに記載の部位特異的変異導入 法を用いて、例えば配列番号 2、 3、 4または 5で表されるアミノ酸配列を有するタンパ ク質をコードする DNAに、部位特異的変異を導入することにより取得できるタンパク質 を意味する。欠失、置換、挿入および/または付加されるアミノ酸の数は 1個以上であ りその数は特に限定されないが、上記部位特異的変異導入法などの周知の技術に より、欠失、置換、もしくは付加できる程度の数であり、例えば、 1〜数十個、好ましく は 1〜20個、より好ましくは 1〜10個、さらに好ましくは 1〜5個である。
また、配列番号 2、 3、 4または 5で表されるアミノ酸配列と 80%以上の相同性を有し、 かつ、ジフテリアトキシン、 EGF受容体 ErbBlまたは ErbB4が結合するタンパク質とは、 配列番号 2、 3、 4または 5に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質と少なくとも 80%以 上、好ましくは 85%以上、より好ましくは 90%以上、さらに好ましくは 95%以上、特に 好ましくは 97%以上、最も好ましくは 99%以上の相同性を有し、かつ、ジフテリアトキ シン、 EGF受容体 ErbBlまたは ErbB4が結合する活性を有するタンパク質である。
[0013] 相同性の数値は、特に明示した場合を除き、当業者に公知の相同性検索プロダラ ムを用いて算出される数値であって、塩基配列については BLAST [ジャーナル'ォブ •モレキユラ一 ·バイオロジー (J. Mol. Biol), 215,403 (1990)]においてデフォルトパラメ 一ターを用いて算出される数値などがあげられる。アミノ酸配列については、 BLAST2 [ヌクレイック'アシッド'リサーチ (Nucleic Acid Res.), 25, 3389 (1997)]；ゲノム'リサ一 チ (Genome Res.), 7,り 49 (1997)； http://www.ncbi. nlm.nih. gov/Education/BLAS inf o/infomation3.htmlにお!/、てデフォルトパラメータを用いて算出される数値などがあげ られる。デフォルトパラメータ一としては、 G(Cost to open gap)が塩基配列の場合は 5 、アミノ酸配列の場合は 11、 -E(Cost to extend gap)が塩基配列の場合は 2、アミノ酸 目列の ¾r合は 1、 -q(penalty for nucleotide mismatch)力ト 3、一 r(rewara for nucleotide match)が 1、 -e(expect value)力 0、 -W (wordsize)が塩基配列の場合は 11残基、ァ ミノ酸残基の場合は 3残基、 - y(Dropoff (X) for blast extemsions in bits)が blastnの場 合は 20、 blastn以外のプログラムでは 25である（http：〃 www.ncbi.nlm.nih.gov /blastcg ihelp.html) oまた、アミノ酸配列の解析ソフトとしては FASTA [メソッズ'イン'ェンザィモ ロジー（Methods in Enzymology) , 183, 63 (1990)]などもあげられる。
[0014] 本発明の抗体は、細胞膜に結合して 、る HB-EGF、膜型 HB-EGFおよび分泌型 HB -EGFに結合するモノクローナル抗体であって、細胞膜に結合している HB-EGF、膜 型 HB-EGFおよび分泌型 HB-EGFの上皮増殖因子様ドメイン（EGF様ドメイン）に結 合するモノクローナル抗体を包含する。
EGF様ドメインとは、具体的には配列番号 4または 5で表されるアミノ酸配列を有する ポリペプチドなどがあげられる。
[0015] 当該 EGF様ドメインに結合するモノクローナル抗体とは、分泌型 HB- EGFと HB- EG F受容体との結合を阻害するモノクローナル抗体を包含する。 分泌型 HB-EGFと HB-EGF受容体の結合を阻害する抗体としては、分泌型 HB-EG Fと、 HB-EGF受容体またはジフテリアトキシンとの結合領域に結合するモノクローナ ル抗体などがあげられる。
[0016] 本発明の抗体は、分泌型 HB-EGFに対して中和活性を有する抗体を包含する。本 発明にお 、て中和活性としては、分泌型 HB-EGFの生物活性を抑制する活性を ヽ 、例えば、 HB-EGF受容体が発現している細胞の細胞増殖を抑制する活性などがあ げられる。
本発明の抗体の具体例としては、配列番号 2で表されるアミノ酸を有するポリべプチ ドの 115番目から 147番目のアミノ酸のうち、少なくとも 1つのアミノ酸を含むェピトープ に結合するモノクローナル抗体、好ましくは 133番目から 147番目のうち、少なくとも 1 つのアミノ酸を含むェピトープに結合するモノクローナル抗体、より好ましくは 115番 目、 122番目、 124番目、 125番目、 127番目、 129番目、 133番目、 135番目、 141番目 、および 147番目のアミノ酸のうち、少なくとも 1つのアミノ酸を含むェピトープに結合 するモノクローナル抗体、更に好ましくは 133番目、 135番目、および 147番目のァミノ 酸のうち、少なくとも 133番目および 135番目のアミノ酸を含むェピトープに結合するモ ノクローナル抗体、最も好ましくは 133番目、 135番目および 147番目のアミノ酸を含む ェピトープに結合するモノクローナル抗体などがあげられる。
[0017] 更に具体的には、ハイプリドーマ KM3566 (FERM BP- 10490)、ハイプリドーマ KM35 67 (FERM BP-10573)が生産するモノクローナル抗体、およびハイブリドーマ KM3579 (FERM BP-10491)が生産するモノクローナル抗体が結合するェピトープに結合する モノクローナル抗体が、本発明の抗体として例示される。
中和活性を有する抗体の具体例としては、配列番号 2で表されるアミノ酸を有する ポリペプチドの 133番目、 135番目および 147番目のアミノ酸を含むェピトープに結合 するモノクローナル抗体があげられる。
[0018] 本発明のモノクローナル抗体としては、ハイプリドーマが産生する抗体、遺伝子組 換え抗体などがあげられる。
ノ、イブリドーマとは、ヒト以外の哺乳動物に抗原を免疫して取得された B細胞と、ミエ ローマ細胞とを細胞融合させて得られる所望の抗原特異性を有するモノクローナル 抗体を生産する細胞をいう。
[0019] 遺伝子組換え抗体としては、ヒト型キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体またはそれらの 抗体断片など、遺伝子組換えにより製造される抗体を包含する。遺伝子組換え抗体 において、モノクローナル抗体の特徴を有し、抗原性が低ぐ血中半減期が延長され たものは、治療薬として好ましい。
本発明の遺伝子組換え抗体の具体例としては、抗体の VHの CDR1、 CDR2および CDR3力 それぞれ配列番号 12、 13および 14でそれぞれ表されるアミノ酸配列、およ び抗体の VLの CDR1、 CDR2および CDR3が、それぞれ配列番号 15、 16および 17で 表されるアミノ酸配列を含む遺伝子組換え抗体があげられる。
[0020] 本発明の遺伝子組換え抗体としては、ヒト型キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体または その抗体断片など、遺伝子組換えにより製造される抗体を包含する。
ヒト型キメラ抗体は、ヒト以外の動物の抗体の VHおよび VLとヒト抗体の重鎖定常領 域 (以下、 CHと表記する）および軽鎖定常領域 (以下、 CLと表記する）とからなる抗体 をいう。
[0021] 本発明のヒト型キメラ抗体は、以下のようにして作製することができる。まず、細胞膜 に結合して 、る HB-EGF、分泌型 HB-EGFおよび膜型 HB-EGFに結合するモノクロ ーナル抗体を産生するハイブリドーマより、 VHおよび VLをコードする cDNAを取得す る。取得した cDNAを、ヒト抗体の CHおよび CLをコードする遺伝子を有する動物細胞 用発現ベクターにそれぞれ挿入してヒト型キメラ抗体発現ベクターを構築し、動物細 胞へ導入を行い、発現させることにより、ヒト型キメラ抗体を製造することができる。
[0022] ヒト型キメラ抗体の CHとしては、ヒトイムノグロブリン (以下、 hlgと表記する）に属すれ ばいかなるものでもよいが、 hlgGクラスのものが好適であり、さらに hlgGクラスに属する hIgGl、 hIgG2、 hIgG3、 hIgG4といったサブクラスのいずれも用いることができる。また、 ヒト型キメラ抗体の CLとしては、 hlgに属すればいずれのものでもよぐ κクラスあるい は λクラスのものを用いることができる。
[0023] 本発明のヒト型キメラ抗体としては、具体的には、抗体の VHが配列番号 9で表され るアミノ酸配列および抗体の VLが配列番号 11で表されるアミノ酸配列を含むヒト型キ メラ抗体などがあげられる。更に、抗体の VHが配列番号 9で表されるアミノ酸配列お よび抗体の VLが配列番号 10で表されるヒト型キメラ抗体の具体例としては、ヒト型キメ ラ抗体 KM3966などがあげられる。
[0024] ヒトイ匕抗体は、ヒト以外の動物の抗体の VHおよび VLの CDRのアミノ酸配列をヒト抗 体の VHおよび VLの適切な位置に移植した抗体をいい、 CDR移植抗体、再構成抗体 (^reshaped— antibodyなどと
本発明のヒト化抗体は、以下のように作製することができる。まず、ハイプリドーマが 産生する、細胞膜に結合している HB-EGF、分泌型 HB- EGFおよび膜型 HB- EGFに 結合する、ヒト以外の動物のモノクローナル抗体の、 VHおよび VLの CDRを、任意のヒ ト抗体の VHおよび VLのフレームワーク（以下、 FRと記す）に移植した可変領域をコー ドする cDNAを作製する。作製した cDNAを、ヒト抗体の CHおよび CLをコードする遺伝 子を有する動物細胞用発現ベクターにそれぞれ挿入してヒト化抗体発現ベクターを 構築する。次に、作製したヒト化抗体発現ベクターを、動物細胞へ導入してヒト化抗 体を発現させることにより、ヒトイ匕抗体を製造することができる。
[0025] ヒト抗体の VHおよび VLの FRのアミノ酸配列は、ヒト抗体由来の VHおよび VLの FRの アミノ酸配列であれば、いかなるものでも用いることができる。例えば、 Protein Data B ankなどのデータベースに登録されているヒト抗体の VHおよび VLの FRのアミノ酸配 タ U、ま 7こ ίま sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Hu man Services(1991)などに記載の、ヒト抗体の VHおよび VLの FRの各サブグループの 共通アミノ酸配列などが用いられる。
[0026] ヒト化抗体の CHとしては、 hlgに属すれば!/、かなるものでもよ!/、が、 hlgGクラスのもの が好適であり、さらに hlgGクラスに属する hIgGl、 hIgG2、 hIgG3、 hIgG4といったサブク ラスのいずれも用いることができる。また、ヒトイ匕抗体の CLとしては、 hlgに属すればい ずれのものでもよく、 κクラスあるいはえクラスのものを用いることができる。
本発明のヒト化抗体としては、具体的には、抗体の VHが配列番号 22で表されるアミ ノ酸配列、または配列番号 22で表されるアミノ酸配列中の 9番目の Ala、 20番目の Val 、 30番目の Thr、 38番目の Arg、 41番目の Pro、 48番目の Met、 67番目の Arg、 68番目 の Val、 70番目の Ile、 95番目の Tyrおよび 118番目の Valから選ばれる少なくとも 1つの アミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列および/または抗体の VL 力 配列番号 23で表されるアミノ酸配列、または配列番号 23で表されるアミノ酸配列 中の 15番目の Leu、 19番目の Ala、 21番目の Ile、、 49番目の Proおよび 84番目の Leu 力 選ばれる少なくとも 1つのアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸 配列をそれぞれ含むヒト化抗体などがあげられるが、導入される改変の数に特に制 限はない。
[0027] 例えば，抗体の VHのアミノ酸配列については、抗体の VHが配列番号 22で表される アミノ酸配列中の 20番目の Val、 30番目の Thr、 38番目の Arg、 48番目の Met、 67番目 の Arg、 68番目の Val、 70番目の Ile、 95番目の Tyr、および 118番目の Valが、好ましく は抗体の VHが配列番号 22で表されるアミノ酸配列中の 20番目の Val、 30番目の Thr、 48番目の Met、 68番目の Val、 70番目の Ile、 95番目の Tyr、および 118番目の Valが、 他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を有するヒト化抗体。
[0028] 好ましくは 30番目の Thr、 48番目の Met、 68番目の Val、 70番目の Ile、 95番目の Tyr 力 好ましくは 30番目の Thr、 48番目の Met、 68番目の Val、 70番目の lieが、他のアミノ 酸残基に置換されたアミノ酸配列を有するヒト化抗体。
好ましくは 30番目の Thr、 68番目の Val、 70番目の Ile、 95番目の Tyrが、他のアミノ酸 残基に置換されたアミノ酸配列を有するヒト化抗体。
[0029] 好ましくは 30番目の Thr、 68番目の Val、 70番目の lieが、他のアミノ酸残基に置換さ れたアミノ酸配列を有するヒト化抗体。
好ましくは 30番目の Thr、 70番目の lieが、他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配 列を含むヒト化抗体などがあげられる。
表される上記のアミノ酸改変の結果得られる抗体 VHのアミノ酸配列としては、配列番 号 22で表されるアミノ酸配列中の 9番目の Alaを Thrに、 20番目の Valを Leuに、 30番目 の Thrを Argに、 38番目の Argを Lysに、 41番目の Proを Thrに、 48番目の Metを lieに、 6 7番目の Argを Lysに、 68番目の Valを Alaに、 70番目の lieを Leuに、 95番目の Tyrを Phe に、および 118番目の Valを Leuに置換する改変力も選ばれる少なくとも 1つの改変が 導入されたアミノ酸配列があげられる。
[0030] 11個の改変が導入された VHのアミノ酸配列としては、具体的には、配列番号 22で 表されるアミノ酸配列中の 9番目の Alaを Thrに、 20番目の Valを Leuに、 30番目の Thr を Argに、 38番目の Argを Lysに、 41番目の Proを Thrに、 48番目の Metを lieに、 67番目 の Argを Lysに、 68番目の Valを Alaに、 70番目の lieを Leuに、 95番目の Tyrを Pheに、お よび 118番目の Valを Leuに置換したアミノ酸配列があげられる。
[0031] 10個の改変が導入された VHのアミノ酸配列としては、具体的には、配列番号 22で 表されるアミノ酸配列中の 9番目の Alaを Thrに、 20番目の Valを Leuに、 30番目の Thr を Argに、 38番目の Argを Lysに、 41番目の Proを Thrに、 48番目の Metを lieに、 67番目 の Argを Lysに、 68番目の Valを Alaに、 70番目の lieを Leuに、および 95番目の Tyrを Ph eに置換したアミノ酸配列などがあげられる。
[0032] 9個の改変が導入された VHのアミノ酸配列としては、具体的には、配列番号 22で表 されるアミノ酸配列中の 9番目の Alaを Thrに、 20番目の Valを Leuに、 30番目の Thrを A rgに、 41番目の Proを Thrに、 48番目の Metを lieに、 67番目の Argを Lysに、 68番目の V alを Alaに、 70番目の lieを Leuに、および 95番目の Tyrを Pheに置換したアミノ酸配列、 および 20番目の Valを Leuに、 30番目の Thrを Argに、 38番目の Argを Lysに、 48番目の Metを lieに、 67番目の Argを Lysに、 68番目の Valを Alaに、 70番目の lieを Leuに、 95番 目の Tyrを Pheに、および 118番目の Valを Leuに置換したアミノ酸配列、などがあげら れる。
[0033] 8個の改変が導入された VHのアミノ酸配列としては、具体的には、配列番号 22で表 されるアミノ酸配列中の
9番目の Alaを Thrに、 20番目の Valを Leuに、 30番目の Thrを Argに、 41番目の Proを Th rに、 48番目の Metを lieに、 68番目の Valを Alaに、 70番目の lieを Leuに、および 95番目 の Tyrを Pheに置換したアミノ酸配列、
20番目の Valを Leuに、 30番目の Thrを Argに、 48番目の Metを lieに、 67番目の Argを L ysに、 68番目の Valを Alaに、 70番目の lieを Leuに、 95番目の Tyrを Pheに、および 118 番目の Valを Leuに置換したアミノ酸配列、および
20番目の Valを Leuに、 30番目の Thrを Argに、 38番目の Argを Lysに、 48番目の Metを I leに、 68番目の Valを Alaに、 70番目の lieを Leuに、 95番目の Tyrを Pheに、および 118 番目の Valを Leuに置換したアミノ酸配列、などがあげられる。
[0034] 7個の改変が導入された VHのアミノ酸配列としては、具体的には、配列番号 22で表 されるアミノ酸配列中の
9番目の Alaを Thrに、 30番目の Thrを Argに、 41番目の Proを Thrに、 48番目の Metを lie に、 68番目の Valを Alaに、 70番目の lieを Leuに、および 95番目の Tyrを Pheに置換した アミノ酸配列、および
20番目の Valを Leuに、 30番目の Thrを Argに、 48番目の Metを lieに、 68番目の Valを A1 aに、 70番目の lieを Leuに、 95番目の Tyrを Pheに、および 118番目の Valを Leuに置換 したアミノ酸配列、
などがあげられる。
[0035] 6個の改変が導入された VHのアミノ酸配列としては、具体的には、配列番号 22で表 されるアミノ酸配列中の
9番目の Alaを Thrに、 30番目の Thrを Argに、 48番目の Metを lieに、 68番目の Valを Ala に、 70番目の lieを Leuに、および 95番目の Tyrを Pheに置換したアミノ酸配列、および 20番目の Valを Leuに、 30番目の Thrを Argに、 48番目の Metを lieに、 68番目の Valを A1 aに、 70番目の lieを Leuに、および 95番目の Tyrを Pheに置換したアミノ酸配列、 などがあげられる。
[0036] 5個の改変が導入された VHのアミノ酸配列としては、具体的には、配列番号 22で表 されるアミノ酸配列中の
9番目の Alaを Thrに、 30番目の Thrを Argに、 48番目の Metを lieに、 68番目の Valを Ala に、および 70番目の lieを Leuに置換したアミノ酸配列、および
30番目の Thrを Argに、 48番目の Metを lieに、 68番目の Valを Alaに、 70番目の lieを Leu に、および 95番目の Tyrを Pheに置換したアミノ酸配列、などがあげられる。
[0037] 4個の改変が導入された VHのアミノ酸配列としては、具体的には、配列番号 22で表 されるアミノ酸配列中の
9番目の Alaを Thrに、 30番目の Thrを Argに、 68番目の Valを Alaに、および 70番目の II eを Leuに置換したアミノ酸配列、
30番目の Thrを Argに、 48番目の Metを lieに、 68番目の Valを Alaに、および 70番目の II eを Leuに置換したアミノ酸配列、
20番目の Valを Leuに、 30番目の Thrを Argに、 68番目の Valを Alaに、および 70番目の I leを Leuに置換したアミノ酸配列、
30番目の Thrを Argに、 38番目の Argを Lysに、 68番目の Valを Alaに、および 70番目の lieを Leuに置換したアミノ酸配列、
30番目の Thrを Argに、 41番目の Proを Thrに、 68番目の Valを Alaに、および 70番目の I leを Leuに置換したアミノ酸配列、
30番目の Thrを Argに、 67番目の Argを Lysに、 68番目の Valを Alaに、および 70番目の lieを Leuに置換したアミノ酸配列、
30番目の Thrを Argに、 68番目の Valを Alaに、 70番目の lieを Leuに、および 95番目の T yrを Pheに置換したアミノ酸配列、および
30番目の Thrを Argに、 68番目の Valを Alaに、 70番目の lieを Leuに、および 118番目の Valを Leuに置換したアミノ酸配列、
などがあげられる。
3個の改変が導入された VHのアミノ酸配列としては、具体的には、配列番号 22で表 されるアミノ酸配列中の
30番目の Thrを Argに、 68番目の Valを Alaに、および 70番目の lieを Leuに置換したアミ ノ酸配列、
9番目の Alaを Thrに、 30番目の Thrを Argに、および 70番目の lieを Leuに置換したアミ ノ酸配列、
20番目の Valを Leuに、 30番目の Thrを Argに、および 70番目の lieを Leuに置換したァ ミノ酸配列、
30番目の Thrを Argに、 38番目の Argを Lysに、および 70番目の lieを Leuに置換したァ ミノ酸配列、
30番目の Thrを Argに、 41番目の Proを Thrに、および 70番目の lieを Leuに置換したァ ミノ酸配列、
30番目の Thrを Argに、 48番目の Metを lieに、および 70番目の lieを Leuに置換したアミ ノ酸配列、
30番目の Thrを Argに、 67番目の Argを Lysに、および 70番目の lieを Leuに置換したァ ミノ酸配列、 30番目の Thrを Argに、 70番目の lieを Leuに、および 95番目の Tyrを Pheに置換したァ ミノ酸配列、および
30番目の Thrを Argに、 70番目の lieを Leuに、および 118番目の Valを Leuに置換したァ ミノ酸配列、
などがあげられる。
[0039] 2個の改変が導入された VHのアミノ酸配列としては、具体的には、配列番号 22で表 されるアミノ酸配列中の
30番目の Thrを Argに、および 70番目の lieを Leuに置換したアミノ酸配列、
9番目の Alaを Thrに、および 70番目の lieを Leuに置換したアミノ酸配列、
20番目の Valを Leuに、および 70番目の lieを Leuに置換したアミノ酸配列、
38番目の Argを Lysに、および 70番目の lieを Leuに置換したアミノ酸配列、
41番目の Proを Thrに、および 70番目の lieを Leuに置換したアミノ酸配列、
48番目の Metを lieに、および 70番目の lieを Leuに置換したアミノ酸配列、
67番目の Argを Lysに、および 70番目の lieを Leuに置換したアミノ酸配列、
68番目の Valを Alaに、および 70番目の lieを Leuに置換したアミノ酸配列、
70番目の lieを Leuに、および 95番目の Tyrを Pheに置換したアミノ酸配列、
70番目の lieを Leuに、および 118番目の Valを Leuに置換したアミノ酸配列、
9番目の Alaを Thrに、および 30番目の Thrを Argに置換したアミノ酸配列、
20番目の Valを Leuに、および 30番目の Thrを Argに置換したアミノ酸配列、
30番目の Thrを Argに、および 38番目の Argを Lysに置換したアミノ酸配列、
30番目の Thrを Argに、および 41番目の Proを Thrに置換したアミノ酸配列、
30番目の Thrを Argに、および 48番目の Metを lieに置換したアミノ酸配列、
30番目の Thrを Argに、および 67番目の Argを Lysに置換したアミノ酸配列、
30番目の Thrを Argに、および 68番目の Valを Alaに置換したアミノ酸配列、
30番目の Thrを Argに、および 95番目の Tyrを Pheに置換したアミノ酸配列、および
30番目の Thrを Argに、および 118番目の Valを Leuに置換したアミノ酸配列、 などがあげられる。
[0040] 1個の改変が導入された VHのアミノ酸配列としては、具体的には、配列番号 22で表 されるアミノ酸配列中の
9番目の Alaを Thrに置換したアミノ酸配列、 20番目の Valを Leuに置換したアミノ酸配 列、 30番目の Thrを Argに置換したアミノ酸配列、 38番目の Argを Lysに置換したァミノ 酸配列、 41番目の Proを Thrに置換したアミノ酸配列、 48番目の Metを lieに置換したァ ミノ酸配列、 67番目の Argを Lysに置換したアミノ酸配列、 68番目の Valを Alaに置換し たアミノ酸配列、 70番目の lieを Leuに置換したアミノ酸配列、 95番目の Tyrを Pheに置 換したアミノ酸配列、および 118番目の Valを Leuに置換したアミノ酸配列、があげられ る。
[0041] 抗体の VLについては、例えば配列番号 23で表されるアミノ酸配列中の 15番目の Le u、 19番目の Ala、 21番目の Ile、および 84番目の Leuが、置換されたアミノ酸配列があ げられる。
好ましくは 19番目の Ala、 21番目の Ile、および 84番目の Leuが置換されたアミノ酸配 列があげられる。
上記のアミノ酸改変の結果得られる VLのアミノ酸配列としては、配列番号 23で表さ れるアミノ酸配列中の 15番目の Leuを Valに、 19番目の Alaを Valに、 21番目の lieを Met に、 49番目の Proを Serに、および 84番目の Leuを Valに置換する改変から選ばれる少 なくとも 1つの改変が導入されたアミノ酸配列があげられる。
[0042] 5個の改変が導入された VLのアミノ酸配列としては、具体的には、配列番号 23で表 されるアミノ酸配列中の 15番目の Leuを Valに、 19番目の Alaを Valに、 21番目の lieを M etに、 49番目の Proを Serに、および 84番目の Leuを Valに置換したアミノ酸配列などが あげられる。
4個の改変が導入された VLのアミノ酸配列としては、具体的には、配列番号 23で表 されるアミノ酸配列中の
15番目の Leuを Val〖こ、 19番目の Alaを Valに、 21番目の lieを Metに、および 49番目の P roを Serに置換したアミノ酸配列、
15番目の Leuを Val〖こ、 19番目の Alaを Valに、 21番目の lieを Metに、および 84番目のし euを Valに置換したアミノ酸配列、
15番目の Leuを Valに、 19番目の Alaを Valに、 49番目の Proを Serに、および 84番目の Leuを Valに置換したアミノ酸配列、
15番目の Leuを Val〖こ、 21番目の lieを Metに、 49番目の Proを Serに、および 84番目のし euを Valに置換したアミノ酸配列、および
19番目の Alaを Valに、 21番目の lieを Metに、 49番目の Proを Serに、および 84番目のし euを Valに置換したアミノ酸配列、
などがあげられる。
3個の改変が導入された VLのアミノ酸配列としては、具体的には、配列番号 23で表 されるアミノ酸配列中の
15番目の Leuを Valに、 19番目の Alaを Valに、および 21番目の lieを Metに置換したアミ ノ酸配列、
15番目の Leuを Valに、 19番目の Alaを Valに、および 49番目の Proを Serに置換したアミ ノ酸配列、
15番目の Leuを Valに、 19番目の Alaを Valに、および 84番目の Leuを Valに置換したァ ミノ酸配列、
15番目の Leuを Valに、 21番目の lieを Metに、および 49番目の Proを Serに置換したアミ ノ酸配列、
15番目の Leuを Val〖こ、 21番目の lieを Metに、および 84番目の Leuを Valに置換したァ ミノ酸配列、
15番目の Leuを Valに、 49番目の Proを Serに、および 84番目の Leuを Valに置換したァ ミノ酸配列、
19番目の Alaを Valに、 21番目の lieを Metに、および 49番目の Proを Serに置換したアミ ノ酸配列、
19番目の Alaを Valに、 21番目の lieを Metに、および 84番目の Leuを Valに置換したアミ ノ酸配列、
19番目の Alaを Valに、 49番目の Proを Serに、および 84番目の Leuを Valに置換したアミ ノ酸配列、および
21番目の lieを Metに、 49番目の Proを Serに、および 84番目の Leuを Valに置換したアミ ノ酸配列、 などがあげられる。
[0044] 2個の改変が導入された VLのアミノ酸配列としては、具体的には、配列番号 23で表 されるアミノ酸配列中の
15番目の Leuを Valに、および 19番目の Alaを Valに置換したアミノ酸配列、
15番目の Leuを Valに、および 21番目の lieを Metに置換したアミノ酸配列、
15番目の Leuを Valに、および 49番目の Proを Serに置換したアミノ酸配列、
15番目の Leuを Valに、および 84番目の Leuを Valに置換したアミノ酸配列、
19番目の Alaを Valに、および 21番目の lieを Metに置換したアミノ酸配列、
19番目の Alaを Valに、および 49番目の Proを Serに置換したアミノ酸配列、
19番目の Alaを Valに、および 84番目の Leuを Valに置換したアミノ酸配列、
21番目の lieを Metに、および 49番目の Proを Serに置換したアミノ酸配列、
21番目の lieを Metに、および 84番目の Leuを Valに置換したアミノ酸配列、 および 49番目の Proを Serに、および 84番目の Leuを Valに置換したアミノ酸配列、 などがあげられる。
[0045] 1個の改変が導入された VLのアミノ酸配列としては、具体的には、配列番号 23で表 されるアミノ酸配列中の
15番目の Leuを Valに置換したアミノ酸配列、 19番目の Alaを Valに置換したアミノ酸配 列、 21番目の lieを Metに置換したアミノ酸配列、 49番目の Proを Serに置換したァミノ 酸配列、および 84番目の Leuを Valに置換したアミノ酸配列、などがあげられる。
[0046] 本発明のヒト化抗体の具体例としては、可変領域が、配列番号 22および 23で表され るアミノ酸配列を有するヒト化抗体などがあげられる。
ヒト抗体とは、元来、ヒト体内に天然に存在する抗体をいうが、最近の遺伝子工学的 、細胞工学的、発生工学的な技術の進歩により作製されたヒト抗体ファージライブラリ 一およびヒト抗体産生トランスジエニック動物力も得られる抗体なども含まれる。ヒト体 内に存在する抗体は、例えば、ヒト末梢血リンパ球を単離し、 EBウィルスなどを感染さ せ不死化し、クローニングすることにより、該抗体を産生するリンパ球を単離し培養す ることができ、培養上清中より該抗体を精製することができる。ヒト抗体ファージライブ ラリーは、ヒト B細胞力も調製した抗体遺伝子をファージ遺伝子に挿入することにより F ab、 scFvなどの抗体断片をファージ表面に発現させたライブラリーである。該ライブラ リーより、抗原を固定化した基質に対する結合活性を指標として所望の抗原結合活 性を有する抗体断片を表面に発現しているファージを回収することができる。該抗体 断片は、さらに、遺伝子工学的手法により 2本の完全な H鎖および 2本の完全な L鎖か らなるヒト抗体分子へも変換することができる。ヒト抗体産生トランスジ ニック動物は、 ヒト抗体遺伝子が宿主動物のゲノム遺伝子に組込まれた動物を意味する。具体的に は、例えば、マウス ES細胞ヘヒト抗体遺伝子を導入し、該 ES細胞をマウスの初期胚へ 移植後、発生させることによりヒト抗体産生トランスジエニックマウスを作製することがで きる。ヒト抗体産生トランスジエニック動物からのヒト抗体の作製方法は、通常のヒト以 外の動物で行われているハイプリドーマ作製方法によりヒト抗体産生ノ、イブリドーマを 取得し、培養することで、培養上清中にヒト抗体を生成蓄積させることができる。
[0047] 上述の抗体または抗体断片を構成するアミノ酸配列において、 1つ以上のアミノ酸 が欠失、付加、置換または挿入され、かつ上述の抗体またはその抗体断片と同様な 活性を有する抗体またはその抗体断片も、本発明の抗体またはその抗体断片に包 含される。
欠失、置換、挿入および Zまたは付加されるアミノ酸の数は 1個以上でありその数 は特に限定されないが、モレキュラー 'クローユング第 2版、カレント'プロトコールズ' イン.モレキュラー 'バイオロジー、 Nucleic Acids Research, 10, 6487 (1982)、 Proc. N atl. Acad. Sci., USA, 79, 6409(1982)、 Gene, 34, 315 (1985)、 Nucleic Acids Research , 13, 4431 (1985)、 Proc. Natl. Acad. Sci USA.82, 488 (1985)等に記載の部位特異的 変異導入法等の周知の技術により、欠失、置換もしくは付加できる程度の数である。 、例えば、 1〜数十個、好ましくは 1〜20個、より好ましくは 1〜10個、さらに好ましくは 1 〜5個である。
[0048] 上記の抗体のアミノ酸配列において 1つ以上のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入ま たは付加されたとは、次ぎのことを示す。同一配列中の任意、かつ 1もしくは複数のァ ミノ酸配列中において、 1または複数のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入または付カロ 力 Sあることを意味する。また、欠失、置換、挿入または付加が同時に生じる場合もあり 、置換、挿入または付加されるアミノ酸残基は天然型と非天然型いずれの場合もある 。天然型アミノ酸残基としては、 L-ァラニン、 L-ァスパラギン、 L-ァスパラギン酸、 L-グ ルタミン、 L-グルタミン酸、グリシン、 L-ヒスチジン、 L-イソロイシン、 L-ロイシン、 L-リジ ン、 L-メチォニン、 L-フエ二ルァラニン、 L-プロリン、 L-セリン、 L-スレオニン、 L-トリプ トフアン、 L-チロシン、 L-パリンおよび L-システィンなどがあげられる。
[0049] 以下に、相互に置換可能なアミノ酸残基の好ましい例を示す。同一群に含まれるァ ミノ酸残基は相互に置換可能である。
A群：ロイシン、イソロイシン、ノルロイシン、ノ リン、ノルパリン、ァラニン、 2-アミノブ タン酸、メチォニン、 0-メチルセリン、 t-ブチルグリシン、 t-ブチルァラニン、シクロへ キシノレァラニン
B群：ァスパラギン酸、グルタミン酸、イソァスパラギン酸、イソグルタミン酸、 2-ァミノ アジピン酸、 2-アミノスべリン酸
C群：ァスパラギン、グルタミン
D群：リジン、アルギニン、オル二チン、 2,4-ジァミノブタン酸、 2,3-ジァミノプロピオ ン酸
E群：プロリン、 3-ヒドロキシプロリン、 4-ヒドロキシプロリン
F群：セリン、スレオニン、ホモセリン
G群：フエ-ルァラニン、チロシン
本発明の抗体断片としては、 Fab、 Fab\ F(ab')、 scFv、 diabodv、 dsFvなどがあげら
2
れる。
[0050] Fabは、 IgG型抗体分子をタンパク質分解酵素パパインで処理して得られる。この断 片のうち（H鎖の 224番目のアミノ酸残基で切断される）、 H鎖の N末端側約半分と L鎖 全体がジスルフイド結合で結合した分子量約 5万の抗原結合活性を有する抗体断片 である。
本発明の Fabは、抗体をタンパク質分解酵素パパインで処理して得ることができる。 または、該抗体の Fabをコードする DNAを原核生物用発現ベクターあるいは真核生 物用発現ベクターに挿入し、該ベクターを原核生物あるいは真核生物へ導入するこ とにより、 Fabを発現させ、製造することができる。
[0051] F(ab')は、 IgG型抗体分子をタンパク質分解酵素ペプシンで処理して得られる断片 のうち（H鎖の 234番目のアミノ酸残基で切断される）、 Fabがヒンジ領域のジスルフイド 結合を介して結合されたものよりやや大きい、分子量約 10万の抗原結合活性を有す る抗体断片である。
本発明の F(a ）は、抗体をタンパク質分解酵素ペプシンで処理して得ることができ
2
る。または、下記の Fab'をチォエーテル結合あるいはジスルフイド結合させ、作製する ことができる。
[0052] Fab'は、上記 F(a ）のヒンジ領域のジスルフイド結合を切断した分子量約 5万の抗
2
原結合活性を有する抗体断片である。
本発明の Fa は、 F(ab')を還元剤ジチオスレィトール処理して得ることができる。ま
2
たは、該抗体の Fab'断片をコードする DNAを原核生物用発現ベクターあるいは真核 生物用発現ベクターに挿入し、該ベクターを原核生物あるいは真核生物へ導入する ことにより Fa を発現させ、製造することができる。
[0053] scFvは、 1本の VHと 1本の VLとを適当なペプチドリンカ一（以下、 Pと表記する）を用 いて連結した、 VH- P-VLないしは VL-P-VHポリペプチドで、抗原結合活性を有する 抗体断片である。本発明の scFvは、抗体の VHおよび VLをコードする cDNAを取得し 、 scFvをコードする DNAを構築し、該 DNAを原核生物用発現ベクターあるいは真核 生物用発現ベクターに挿入し、該発現ベクターを原核生物あるいは真核生物へ導入 することにより scFvを発現させ、製造することができる。
[0054] diabodyは、 scFvが二量体ィ匕した抗体断片で、二価の抗原結合活性を有する抗体 断片である。二価の抗原結合活性は、同一とすることもできるし、一方を異なる抗原 結合活性とすることもできる。本発明の diabodyは、抗体の VHおよび VLをコードする c DNAを取得し、 scFvをコードする DNAをリンカ一のアミノ酸配列の長さが 8残基以下と なるように構築し、該 DNAを原核生物用発現ベクターあるいは真核生物用発現べク ターに挿入し、該発現ベクターを原核生物あるいは真核生物へ導入することにより di abodyを発現させ、製造することができる。
[0055] dsFvは、 VHおよび VL中のそれぞれ 1アミノ酸残基をシスティン残基に置換したポリ ペプチドを該システィン残基間のジスルフイド結合を介して結合させたものを ヽぅ。シ スティン残基に置換するアミノ酸残基は Reiterらにより示された方法 (Protein Enginee ring, 7, 697-704, 1994)に従って、抗体の立体構造予測に基づいて選択することが できる。本発明の dsFvは、抗体の VHおよび VLをコードする cDNAを取得し、 dsFvをコ ードする DNAを構築し、該 DNAを原核生物用発現ベクターあるいは真核生物用発現 ベクターに挿入し、該発現ベクターを原核生物あるいは真核生物へ導入することによ り dsFvを発現させ、製造することができる。
[0056] 上述の抗体または該抗体断片に、放射性同位元素、タンパク質または薬剤を結合 させた抗体の誘導体も、本発明に包含される。
本発明の抗体の誘導体は、細胞膜に結合している HB-EGF、膜型 HB-EGFおよび 分泌型 HB-EGFに特異的に結合する抗体または該抗体断片の、 H鎖或いは L鎖の N 末端側或いは C末端側、抗体中の適当な置換基あるいは側鎖、さらには抗体中の糖 鎖に薬剤を化学的手法 (抗体工学入門、金光修著、（株）地人書館、 1994)により結 合させること〖こより製造することができる。
[0057] または、細胞膜に結合して 、る HB-EGF、膜型 HB-EGFおよび分泌型 HB-EGFに 特異的に結合する抗体または該抗体断片をコードする DNAと、結合させた ヽタンパク 質などの薬剤をコードする DNAを連結させて発現ベクターに挿入し、該発現ベクター を宿主細胞へ導入するという遺伝子工学的手法によっても製造することができる。 薬剤としては、化学療法剤、抗体医薬、サイト力インなどの免疫賦活剤、放射性同 位元素、ィムノアジュバンドなどがあげられる。
[0058] さらに、抗体または該抗体断片に結合させる薬剤は、プロドラッグの形態でもよい。
本発明におけるプロドラッグとは、腫瘍環境に存在する酵素などによって化学的な修 飾を受け、癌細胞を傷害する作用を有する物質に変換される薬剤をいう。
化学療法剤としては、アルキル化剤、ニトロソゥレア剤、代謝拮抗剤、抗癌性抗生 物質、植物由来アルカロイド、トポイソメラーゼ阻害剤、ホルモン療法剤、ホルモン拮 抗剤、ァロマターゼ阻害剤、 p糖蛋白阻害剤、白金錯体誘導体、 M期阻害剤、キナー ゼ阻害剤などのいかなる化学療法剤も包含される。化学療法剤としては、アミフォス チン（ェチオール）、シスプラチン、ダカルバジン（DTIC)、ダクチノマイシン、メタロレ タミン（ナイトロジェンマスタード）、ストレプトゾシン、シクロフォスフアミド、ィホスフアミド 、カルムスチン（BCNU)、口ムスチン（CCNU)、ドキソルビシン（アドリアマイシン）、ドキ ソルビシンリポ（ドキシル）、ェピルビシン、ゲムシタビン（ゲムザール）、ダウノルビシン 、ダウノルビシンリポ（ダウノゾーム）、プロカルバジン、マイトマイシン、シタラビン、エト ポシド、メトトレキセート、 5-フルォロウラシル、フルォロウラシル、ビンブラスチン、ビン クリスチン、ブレオマイシン、ダウノマイシン、ぺプロマイシン、エストラムスチン、パクリ タキセル（タキノール）、ドセタキセル（タキソテア）、アルデスロイキン、ァスパラギナー ゼ、ブスルファン、カルボプラチン、ォキサリブラチン、ネダプラチン、クラドリビン、力 ンプトテシン、 CPT-11、 10-ヒドロキシ- 7-ェチル -カンプトテシン（SN38)、フロクスゥリ ジン、フノレダラビン、ヒドロキシゥレア、ィホスフアミド、イダノレビシン、メスナ、イリノテカ ン、ノギテカン、ミトキサントロン、トポテカン、ロイプロリド、メゲストロール、メルファラン 、メルカプトプリン、ヒドロキシカルバミド、プリカマイシン、ミトタン、ぺガスパラガーゼ、 ペントスタチン、ピポブロマン、ストレプトゾシン、タモキシフェン、ゴセレリン、リュープ ロレニン、フノレタミド、テ-ポシド、テストラクトン、チォグァニン、チォテパ、ゥラシルマ スタード、ビノレノレビン、クロラムブシル、ハイド口コーチゾン、プレドニゾロン、メチノレプ レドニゾロン、ビンデシン、二ムスチン、セムスチン、力ぺシタビン、トムデッタス、ァザ シチジン、 UFT、ォキザロプラチン、ゲフイチ-ブ（ィレッサ）、ィマチ-ブ（STI571)、ェ ルロチ -ブ、 Flt3阻害剤、 vascular endothelial growth facotr receptor (VEGFR)阻害 剤、 fibroblast growth factor (FGFR)阻害剤、 EGFR阻害剤（ィレッサ、タルセバなど） ラデイシコール、 17-ァリルアミノ -17-デメトキシゲルダナマイシン、ラパマイシン、アム サクリン、オール トランスレチノイン酸、サリドマイド、アナストロゾール、フアドロゾー ル、レトロゾール、ェキセメスタン、金チォマレート、 D ぺ-シラミン、ブシラミン、ァザ チォプリン、ミゾリビン、シクロスポリン、ラパマイシン、ヒドロコノレチゾン、ベキサロテン（ ターグレチン）、タモキシフェン、デキサメタゾン、プロゲスチン類、エストロゲン類、ァ ナストロゾール（アリミデッタス）、ロイプリン、アスピリン、インドメタシン、セレコキシブ、 ァザチォプリン、ぺ-シラミン、金チォマレート、マレイン酸クロルフエ-ラミン、クロ口 フエ二ラミン、クレマシチン、トレチノイン、ベキサロテン、砒素、ボルテゾミブ、ァロプリ ノール、ゲムッズマブ、イブリツモマブチウキセタン、 131トシッテマブ、タルグレチン、 0NTAK、ォゾガミン、クラリスロマシン、ロイコボリン、ィファスフアミド、ケトコナゾール、 アミノグルテチミド、スラミンおよびメトトレキセート、などがあげられる。 [0059] 化学療法剤と抗体とを結合させる方法としては、ダルタールアルデヒドを介して化学 療法剤と抗体のアミノ基間を結合させる方法、水溶性カルポジイミドを介して化学療 法剤のアミノ基と抗体のカルボキシル基を結合させる方法等があげられる。
抗体医薬としては、抗体の結合によりアポトーシスが誘導される抗原に対する抗体 、あるいは腫瘍細胞の増殖や転移など、腫瘍の病態形成に関わる抗原に対する抗 体のほかに、免疫機能を調節する抗体、病変部位の血管新生を阻害する抗体など があげられる。
[0060] 抗体の結合によりアポトーシスが誘導される抗原としては、 Cluster of differentiation
(以下、 CD) 19、 CD20、 CD21、 CD22、 CD23、 CD24、 CD37、 CD53、 CD72、 CD73、 C D74、 CDw75、 CDw76、 CD77、 CDw78、 CD79a、 CD79b、 CD80 (B7.1), CD81、 CD82 、 CD83、 CDw84、 CD85、 CD86 (B7.2)、 human leukocyte antigen (HLA) -Class II、 E GFRなどがあげられる。
免疫機能を調節する抗体の抗原としては、 CD4、 CD40、 CD40リガンド、 B7ファミリ 一分子 (CD80、 CD86、 CD274, B7- DC、 B7- H2、 B7- H3、 B7- H4)、 B7ファミリー分子 のリガンド（CD28、 CTLA- 4、 ICOSゝ PD- 1、 BTLA)、 OX- 40、 OX- 40リガンド、 CD137 、 tumor necrosis factor (TNF)受容体ファミリー分子 (DR4、 DR5、 TNFR1、 TNFR2)、 T NF— related apoptosis— inducing ligand receptor (TRAIL)ファミリー分子、 TRAILファミリ 一分子の受容体ファミリー (TRAIL- Rl、 TRAIL- R2、 TRAIL- R3、 TRAIL- R4)、 recepto r activator of nuclear factor kappa B ligand (RANK)、 RANKリガンド、 CD25、葉酸受 容体 4、サイト力イン [interleukin- 1 a (以下、 interleukinをと記す)、 IL- 1 β、 IL- 4、 IL- 5 、 IL— 6、 IL— 10、 IL— 13、 transforming growth factor(TGF) β、 TNF a等]、これらのサイ トカインの受容体、ケモカイン（SLC、 ELC、 1-309、 TARC、 MDC、 CTACK等）、これら のケモカインの受容体が好まし 、。
[0061] 病変部位の血管新生を阻害する抗体の抗原としては、 vascular endothelial growth factor (VEGF)、 Angiopoietin、 fibroblast growth factor (FGFノ、 EGF、 platelet-derived growth factor (PDGF)、 insulin-like growth factor (IGF)、 erythropoietin (EPO)、 TGF β、 IL- 8、 Ephilin, SDF-1など、およびこれらの受容体があげられる。
免疫賦活剤としては、 NK細胞、マクロファージ、好中球などの細胞を亢進するサイト 力インであればいかなるものでもよいが、具体例としては、インターフェロン（以下、 IN Fと記す）— α、 INF— j8、 INF— γ、 IL— 2、 IL— 12、 IL— 15、 IL— 18、 IL— 21、 IL— 23、顆粒球 刺激因子 (G- CSF)、顆粒球 ·マクロファージ刺激因子 (GM- CSF)、マクロファージ刺激 因子 (M-CSF)などがあげられる。また、免疫賦活剤として知られている天然物でもよく 、具体例としては、免疫を亢進する薬剤が、 j8 (l→3)ダルカン (レンチナン、シゾフィラ ン）、 αガラクトシルセラミド (KRN7000)、菌体粉末（ピシバニール、 BCG)、菌体抽出 物 (クレスチン)があげられる。放射性同位元素としては、 mI、 125I、 9QY、 64Cu、 199Tc、 77 Lu、 mAt等があげられる。放射性同位元素は、クロラミン T法等によって抗体に直接 結合させることができる。また、放射性同位元素をキレートする物質を抗体に結合さ せてもよ ヽ。キレ ~~ト剤とし一しは、 methylbenzyldiethylene- tnaminepentaacetic acid、 MX- DTPA)などがあげられる。
[0062] 本発明においては、本発明の抗体と、 1つ以上の他の薬剤と組み合わせて投与す ることや、または放射線照射とを組み合わせることもできる。他の薬剤としては、上述 の化学療法剤、抗体医薬、サイト力インなどの免疫賦活剤等が含まれる。
抗体医薬としては、上記の標的となり得る抗原に対する抗体があげられ、例えば EG FR抗体 (Cetuximab、 Panitumumab、 Matuzumabなど）等もあげられる。
[0063] 放射線照射としては、 X線、 γ線などの光子 (電磁波）照射、電子線、陽子線、重粒 子線などの粒子線照射などが含まれる。
組み合わせて投与する方法としては、本発明の抗体との同時投与でもよいし、また 、本発明の抗体の投与と前後して投与しても構わない。
以下に、本発明を詳細に説明する。
[0064] 1.遺伝子組換え抗体の製造方法
(1)抗原の調製
分泌型 ΗΒ- EGFまたは分泌型 ΗΒ- EGFの部分長（以下、これらを単に分泌型 ΗΒ- Ε GFと称することもある）をコードする cDNAを含む発現ベクターを大腸菌、酵母、昆虫 細胞、動物細胞等に導入し、発現させることにより、分泌型 HB-EGFまたは分泌型 HB -EGFの部分断片を得ることができる。また、 HB-EGFを発現している細胞から、プロ テアーゼ処理することにより細胞外領域の HB-EGFを精製することができる。分泌型 HB-EGFを多量に発現して 、る各種ヒト腫瘍培養細胞、ヒト組織など力も分泌型 HB- EGFを精製することもできる。さらに、分泌型 HB-EGFの部分配列を有する合成ぺプ チドを調製し、抗原に用いることもできる。
[0065] 具体的には、本発明で用いられる分泌型 HB-EGFとしては、 Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cola Spring Harbor Laooratory Press (1989)や Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1987- 1997)等に記載さ れた方法等を用い、例えば以下の方法により、これをコードする DNAを宿主細胞中で 発現させて、製造することができる。
[0066] まず、全長 cDNAを適当な発現ベクターのプロモーターの下流に挿入することにより 、組換えベクターを作製する。この際もし必要であれば、全長 cDNAをもとにして HB- EGFをコードする部分を含む適当な長さの DNA断片を調製し、上記全長 cDNAの代 わりに該 DNA断片を使用してもよい。次いで、該組換えベクターを、該発現ベクター に適合した宿主細胞に導入することにより、 HB-EGFを生産する形質転換体を得るこ とがでさる。
[0067] 宿主細胞としては、大腸菌、動物細胞等、目的とする遺伝子を発現できるものであ れば 、ずれをも用いることができる。
発現ベクターとしては、使用する宿主細胞において自律複製可能又は染色体中へ の組込が可能で、分泌型 HB-EGFをコードする DNAを転写できる位置に適当なプロ モーターを含有して 、るものが用いられる。
[0068] 大腸菌等の原核生物を宿主細胞として用いる場合には、本発明において用いられ る HB-EGFをコードする DNAを含有してなる組換えベクターは、原核生物中で自律複 製可能であると同時に、プロモーター、リボソーム結合配列、本発明において用いら れる DNA及び転写終結配列を含むベクターであることが好ま 、。該組換えベクター は、さら〖こ、プロモーターを制御する遺伝子を含んでいてもよい。
[0069] 発現ベクターとしては、例えば、 pBTrp2、 pBTacl、 pBTac2 (いずれも Roche Diagnos tics社製）、 pKK233-2 (Pharmacia社製）、 pSE280 (Invitrogen社製）、 pGEMEX- 1 (P romega社製）、 pQE- 8 (QIAGEN社製）、 pKYPIO (特開昭 58- 110600)、 pKYP200 [A gricultural Biological Chemistry, 48, 669 (1984)]、 pLSAl [Agric. Biol. Chem., 53, 2 77 (1989)]、 pGELl [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 4306 (1985)]、 pBluescript II S K (-) (Stratagene社製）、 pTrs30 [大腸菌 JM109/pTrS30 (FERM BP- 5407)より調製 ]、 pTrs32 [大腸菌 JM109/pTrS32 (FERM BP- 5408)より調製]、 pGHA2 [大腸菌 I GHA2 (FERM BP- 400)より調製、特開昭 60- 221091]、 pGKA2 [大腸菌 IGKA2 (FER M BP- 6798)より調製、特開昭 60- 221091]、 pTerm2 (US4686191、 US4939094, US51 60735)、 pSupex、 pUB110、 pTP5、 pC194、 pEG400 [j. BacterioL, 172, 2392 (1990)] 、 pGEX (Pharmacia社製）、 pETシステム （Novagen社製）、 pME18SFL3等を挙げるこ とがでさる。
[0070] プロモーターとしては、使用する宿主細胞中で機能を発揮できるものであればいか なるものでもよい。例えば、 trpプロモーター（Ptrp)、 lacプロモーター、 PLプロモータ 一、 PRプロモーター、 T7プロモーター等の、大腸菌やファージ等に由来するプロモ 一ターを挙げることができる。また、 Ptrpを 2つ直列させたタンデムプロモーター、 tac プロモーター、 lacT7プロモーター、 let Iプロモーター等のように、人為的に設計改変 されたプロモーター等も用いることができる。
[0071] また、上記組換えベクターとしては、リボソーム結合配列であるシャイン'ダルガルノ
(Shine-Dalgarno)配列と開始コドンとの間を適当な距離 (例えば 6〜18塩基）に調節 したプラスミドを用いることが好ま U、。本発明にお 、て用いられる分泌型 HB- EGFを コードする DNAの塩基配列においては、宿主内での発現に最適なコドンとなるように 塩基を置換することができ、これにより、目的とする分泌型 HB-EGFの生産率を向上 させることができる。さらに、上記組換えベクターにおける遺伝子の発現には転写終 結配列は必ずしも必要ではな!/、が、構造遺伝子の直下に転写終結配列を配置する ことが好ましい。
[0072] 宿主細胞としては、エシ リヒア属等に属する微生物、例えば、大腸菌 XL1-Blue、 大腸菌 XL2-Blue、大腸菌 DH1、大腸菌 DH5 a、大腸菌 BL21(DE3)、大腸菌 MC10 00、大腸菌 KY3276、大腸菌 W1485、大腸菌 JM109、大腸菌 HB101、大腸菌 No.4 9、大腸菌 W3110、大腸菌 NY49等を挙げることができる。
組換えベクターの導入方法としては、上記宿主細胞へ DNAを導入する方法であれ ばいずれも用いることができ、例えば、カルシウムイオンを用いる方法 [Proc. Natl. Ac ad. Sci. USA, 69, 2110 (1972)]、 Gene, 17, 107 (1982)や Molecular & General Geneti cs, 168, 111 (1979)に記載の方法等を挙げることができる。
[0073] 動物細胞を宿主として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、 pcDNAU pcD M8 (フナコシ社より市販）、 pAGE107 [特開平 3- 22979 ; Cytotechnology, 3, 133, (19 90)]、 pAS3- 3 (特開平 2- 227075)、 pCDM8 [Nature, 329, 840, (1987)]、 pcDNAI/A mp (Invitrogen社製）、 pREP4 (Invitrogen社製）、 pAGE103 [J. Biochemistry, 101, 13 07 (1987)]、 pAGE210、 pME18SFL3等を挙げることができる。
[0074] プロモーターとしては、動物細胞中で機能を発揮できるものであればいずれも用い ることができ、例えば、サイトメガロウィルス（CMV)の IE (immediate early)遺伝子のプ 口モーター、 sv40の初期プロモーター、レトロウイルスのプロモーター、メタロチォネィ ンプロモーター、ヒートショックプロモーター、 SR aプロモーター等を挙げることがで きる。また、ヒト CMVの IE遺伝子のェンハンサーをプロモーターと共に用いてもよい。
[0075] 宿主細胞としては、ヒトの細胞であるナマルバ（Namalwa)細胞、サルの細胞である C OS細胞、チャイニーズ'ノ、ムスターの細胞である CHO細胞、 HBT5637 (特開昭 63- 29 9)等を挙げることができる。
組換えベクターの導入方法としては、動物細胞に DNAを導入する方法であれば ヽ ずれも用いることができ、例えば、エレクト口ポレーシヨン法 [Cytotechnology, 3, 133 ( 1990)]、リン酸カルシウム法（特開平 2- 227075)、リボフヱクシヨン法 [Proc. Natl. Acad .Sci. USA, 84, 7413 (1987)]等を挙げることができる。
[0076] 遺伝子の発現方法としては、直接発現以外に、 Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold bpnng Harbor Laboratory Press (1989)に ci載 れ飞 いる方法等に準じて、分泌生産、融合タンパク質発現等を行うことができる。真核生 物由来の細胞で発現させた場合には、糖あるいは糖鎖が付加された分泌型 HB-EG Fを得ることがでさる。
[0077] 以上のようにして得られる形質転換体を培地に培養し、培養物中に該 HB-EGFを 生成蓄積させ、該培養物から採取することにより、分泌型 HB-EGFを製造することが できる。該形質転換体を培地に培養する方法は、宿主の培養に用いられる通常の方 法に従って行うことができる。 プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた糸且換えベクターで形質転換した 微生物を培養するときには、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。 例えば、 lacプロモーターを用いた組換えベクターで形質転換した微生物を培養する ときにはイソプロピル β D チォガラタトピラノシド等を、 trpプロモーターを用いた 組換えベクターで形質転換した微生物を培養するときにはインドールアクリル酸等を 培地に添カ卩してもよい。
[0078] 動物細胞を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、一般に使用さ れている RPMI 1640培地 [The Journal of the American Medical Association, 199, 519 (1967)]、 Eagleの MEM培地 [Science, 122, 501 (1952)]、ダルベッコ改変 MEM培地 [V irology, 8, 396 (1959)]、 199培地 [Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 73, 1 (1950)]又はこ れら培地に牛胎児血清等を添加した培地等を用いることができる。培養は、通常 pH6 〜8、 30〜40°C、 5% CO存在下等の条件下で 1〜7日間行う。また、培養中必要に応
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じて、カナマイシン、ペニシリン等の抗生物質を培地に添カ卩してもよい。
[0079] 上記のとおり、本発明にお 、て用いられる分泌型 HB-EGFをコードする DNAを組み 込んだ組換えベクターを保有する微生物、動物細胞等由来の形質転換体を、通常 の培養方法に従って培養して該 HB-EGFを生成蓄積させ、該培養物より採取するこ とにより、本発明にお 、て用いられる分泌型 HB-EGFを製造することができる。
遺伝子の発現方法としては、直接発現以外に、 Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold bpnng Harbor Laboratory Press (1989)に ci載 れ飞 いる方法等に準じて、分泌生産、融合タンパク質発現等を行うことができる。
[0080] 分泌型 HB-EGFの生産方法としては、宿主細胞内に生産させる方法、宿主細胞外 に分泌させる方法、及び宿主細胞外膜上に生産させる方法があり、使用する宿主細 胞ゃ、生産させる分泌型 HB-EGFの構造を変えることにより、適切な方法を選択する ことができる。
分泌型 HB-EGFが宿主細胞内又は宿主細胞外膜上に生産される場合、ポールソ ンらの方法 [J. Biol. Chem., 264, 17619 (1989)]、ロウらの方法 [Proc. Natl. Acad. Sci ., USA, 86, 8227 (1989)、 Genes Develop., 4, 1288 (1990)]、又は特開平 05- 336963、 WO94/23021等に記載の方法を準用することにより、該遺伝子産物を宿主細胞外に 積極的に分泌させることができる。
[0081] また、特開平 2-227075に記載されている方法に準じて、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝 子等を用いた遺伝子増幅系を利用して生産量を上昇させることもできる。分泌型 HB- EGFは、例えば、以下のようにして単離 '精製することができる。分泌型 HB- EGFが細 胞内に溶解状態で発現した場合には、培養終了後に細胞を遠心分離により回収し、 水系緩衝液に懸濁後、超音波破砕機、フレンチプレス、マントンガウリンホモゲナイザ 一、ダイノミル等により細胞を破砕し、無細胞抽出液を得る。該無細胞抽出液を遠心 分離することにより得られる上清から、通常の酵素の単離精製法、即ち、溶媒抽出法 、硫安等による塩析法、脱塩法、有機溶媒による沈殿法、ジェチルアミノエチル (DE AE)ーセファロース、 DIAION HPA-75 (三菱化学社製）等のレジンを用いた陰イオン 交換クロマトグラフィー法、 S- Sepharose FF (Pharmacia社製）等のレジンを用いた陽ィ オン交換クロマトグラフィー法、ブチルセファロース、フエ-ルセファロース等のレジン を用いた疎水性クロマトグラフィー法、分子篩を用いたゲルろ過法、ァフィ-ティーク 口マトグラフィ一法、クロマトフォーカシング法、等電点電気泳動等の電気泳動法等の 手法を単独又は組み合わせて用い、精製標品を得ることができる。
[0082] また、分泌型 HB-EGFが細胞内に不溶体を形成して発現した場合は、同様に細胞 を回収後破砕し、遠心分離を行うことにより、沈殿画分として該 HB-EGFの不溶体を 回収する。回収した該タンパク質の不溶体をタンパク質変性剤で可溶ィ匕する。該可 溶ィ匕液を希釈又は透析することにより、該タンパク質を正常な立体構造に戻した後、 上記と同様の単離精製法により分泌型 HB-EGFの精製標品を得ることができる。
[0083] 分泌型 HB-EGF又はその糖修飾体等の誘導体が細胞外に分泌された場合には、 培養上清において該 HB-EGF又はその糖修飾体等の誘導体を回収することができる 。即ち、該培養物を上記と同様の遠心分離等の手法により処理することにより可溶性 画分を取得し、該可溶性画分から、上記と同様の単離精製法を用いることにより、精 製標品を得ることができる。
また、本発明において用いられる分泌型 HB-EGFは、 Fmoc法（フルォレニルメチル ォキシカルボ-ル法）、 tBoc法 (t-ブチルォキシカルボ-ル法）等の化学合成法によ つても製造することができる。また、 Advanced ChemTech社、パーキン 'エルマ一社、 Pharmacia社、 Protein Technology Instrument社、 SyntheceU— Vega社、 PerSeptive社、 島津製作所等のペプチド合成機を利用して化学合成することもできる。
(2)動物の免疫と抗体産生細胞の調製
3〜20週令のマウス、ラットまたはハムスターに上記のように調製した抗原を免疫し て、その動物の脾、リンパ節、末梢血中の抗体産生細胞を採取する。また、免疫原性 が低く上記の動物で充分な抗体価の上昇が認められない場合には、 HB-EGFノック アウトマウスを被免疫動物として用いる方法もある。
[0084] 免疫は、動物の皮下あるいは静脈内あるいは腹腔内に、適当なアジュバント〔例え ば、フロインドの完全アジュバント（Complete Freund' s Adjuvant)や水酸化アルミ-ゥ ムゲルと百日咳菌ワクチンなど〕とともに抗原を投与することにより行う。抗原が部分べ プチドである場合には、 BSA (ゥシ血清アルブミン）や KLH (Keyhole Limpet Hemocya nin)などのキャリアタンパク質とコンジュゲートを作製し、これを免疫原として用いる。
[0085] 抗原の投与は、 1回目の投与の後 1〜2週間おきに 5〜10回行う。各投与後 3〜7日 目に眼底静脈叢より採血し、その血清が抗原と反応することを酵素免疫測定法〔Anti bodies - A Laboratory Manual, Cold bpnng Haroor Laboratory, 1988〕などで べる 。免疫に用いた抗原に対し、その血清が十分な抗体価を示したマウス、ラットまたは ハムスターを脾細胞の供給源として提供する。
[0086] 脾細胞を骨髄腫細胞の融合に供するにあたって、抗原物質の最終投与後 3〜7日 目に、免疫したマウス、ラットまたはハムスターより脾臓を摘出し、脾細胞を採取する。 脾臓を MEM培地（日水製薬社製)中で細断し、ピンセットでほぐし、遠心分離（1200 rp m、 5分間）した後、上清を捨て、トリス一塩ィ匕アンモ-ゥム緩衝液 (pH7.65)で 1〜2分 間処理し赤血球を除去し、 MEM培地で 3回洗浄して融合用脾細胞として提供する。
(3)骨髄腫細胞の調製
骨髄腫細胞としては、マウスから得られた株化細胞を使用する。たとえば、 8—ァザ グァニン耐性マウス（BALB/c由来）骨髄腫細胞株 P3- X63Ag8- Ul (P3-U1) (Current Topics in Microbiology and Immunology, 18:1-7, 1978)、 P3- NSl/1- Ag41(NS- 1) (E uropean J.Immunology, 6: 511—519,1976)、 SP2/0— Agl4 (SP— 2) (Nature,276: 269—2 70,1978)、 P3—X63—Ag8653(653) J.Immunology, 123:1548— 1550,1979)、 P3—X63—Ag 8 (X63) (Nature, 256:495-497,1975)などが用いられる。これらの細胞株は、 8-ァザグ ァニン培地〔RPMI- 1640培地にグルタミン（1.5mM)、 2-メルカプトエタノール (5 X 10— 5 M)、ジェンタマイシン (10 g/mL)および牛胎児血清 (FCS)を加えた培地（以下、正常 培地という。 )に、さらに 8-ァザグァニン (15 g/mL)をカ卩えた培地〕で継代する力 細 胞融合の 3〜4日前に正常培地に継代し、融合当日 2 X 107個以上の細胞数を確保す る。
(4)細胞融合
前述した抗体産生細胞と骨髄腫細胞を MEM培地または PBS (リン酸ニナトリウム 1.83 g、リン酸一カリウム 0.21g、食塩 7.65g、蒸留水 1 L、 pH7.2)でよく洗浄し、細胞数が、抗 体産生細胞:骨髄腫細胞 =5〜10:1になるよう混合し、遠心分離 (l,200rpm、 5分間)した 後、上清を捨て、沈澱した細胞群をよくほぐした後、攪拌しながら、 37°Cで、ポリェチ レングリコールー 1,000(PEG- l,000)2g、 MEM 2mLおよびジメチルスルホキシド 0.7m Lの混液を抗体産生細胞数 108当たり 0.2〜lmLの容量でカ卩え、 1〜2分間毎に MEM 培地 l〜2mlを数回加えた後、 MEM培地をカ卩えて全量が 50mLになるようにする。遠心 分離 (900rpm、 5分間）後、上清を捨て、ゆるやかに細胞をほぐした後、メスピペットに よる吸込み、吹出しでゆるやかに細胞を HAT培地〔正常培地にヒポキサンチン（10— 4M )、チミジン（1.5 X 10"5M)およびアミノプテリン（4 X 10— 7M)をカ卩えた培地〕 lOOmL中に 懸濁する。この懸濁液を 96ゥエル培養用フ。レートに 100 L/ゥヱルずつ分注し、 5% COインキュベータ一中、 37°Cで？〜 14日間培養する。
2
培養後、培養上清の一部をとり、後述するバインディングアツセィなどにより、細胞 膜に結合して 、る HB-EGF、分泌型 HB-EGFおよび膜型 HB-EGFの!、ずれにも反応 性を有するモノクローナル抗体を産生するノ、イブリドーマもしくは精製抗体を選択す る。
また、ついで、限界希釈法によりクローユングを 2回繰り返し〔1回目は、 HT培地（HAT 培地力もアミノプテリンを除いた培地）、 2回目は、正常培地を使用する〕、安定して強 い抗体価の認められたものをモノクローナル抗体産生ハイプリドーマ株として選択す る。
(5)モノクローナル抗体の調製 プリスタン処理〔2,6,10,14—テトラメチルペンタデカン（Pristane) 0.5mLを腹腔内投 与し、 2週間飼育する〕した 8〜10週令のマウスまたはヌードマウスに、（4)で得られた 抗 HB-EGFモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ細胞 2 X 106〜5 X 107細胞/匹を 腹腔内注射する。 10〜21日でハイプリドーマは腹水癌化する。このマウス力も腹水を 採取し、遠心分離 (3,000rpm、 5分間）して固形分を除去後、 40〜50%硫酸アンモニゥ ムで塩祈した後、力プリル酸沈殿法、 DEAE-セファロースカラム、プロテイン A—カラ ムあるいはゲル濾過カラムによる精製を行ない、 IgGあるいは IgM画分を集め、精製モ ノクローナル抗体とする。
[0088] 抗体のサブクラスの決定は、サブクラスタイピングキットを用いて酵素免疫測定法に より行う。蛋白量の定量は、ローリー法および 280應での吸光度より算出する。
(6)バインディングアツセィ
抗原としては、（1)に記載の方法により、本発明において用いられる HB-EGFをコー ドする cDNAを含む発現ベクターを大腸菌、酵母、昆虫細胞、動物細胞等に導入して 得た遺伝子導入細胞ゃリコンビナントタンパク質、あるいはヒト組織力も得た精製 HB- EGFや部分ペプチドを用いる。抗原が部分ペプチドである場合には、 BSA (ゥシ血清 アルブミン）や KLH (Keyhole Limpet Hemocyanin)などのキャリアタンパク質とコンジュ ゲートを作製して、これを用いる。
[0089] これらの抗原のうち、分泌型 HB-EGFおよび HB-EGFが細胞に結合している細胞株 を 96ゥエルプレートに分注し固層化した後、第一抗体として、被免疫動物血清、モノ クローナル抗体を産生するハイプリドーマの培養上清もしくは精製抗体を分注して反 応させる。 PBSまたは PBS— 0.05% Tweenでよく洗浄した後、第二抗体としてピオチン、 酵素、化学発光物質あるいは放射線化合物等で標識した抗ィムノグロブリン抗体を 分注して反応させる。 PBS— Tweenでよく洗浄した後、第二抗体の標識物質に応じた 反応を行なう。
[0090] 前述したような方法で、細胞膜に結合して ヽる HB-EGF、分泌型 HB-EGFおよび膜 型 HB-EGFのいずれにも反応性を有するモノクローナル抗体を産生するハイブリドー マもしくは精製抗体を選択することができる。
得られたモノクローナル抗体のうち、分泌型 HB-EGFの HB-EGF受容体への結合阻 害活性を有する抗体としては、ノ、イブリドーマ細胞株 KM3566が生産するモノクローナ ル抗体 KM3566、ハイプリドーマ細胞株 KM3567が産生するモノクローナル抗体 KM35 67、およびハイプリドーマ KM3579が生産するモノクローナル抗体をあげることができ る。ハイプリドーマ細胞株 KM3579は、平成 18年 1月 24日付でブダペスト条約に基づき 独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター (日本国茨城県つくば 巿東 1丁目 1番地 1 中央第 6)に FERM BP-10491として寄託されている。
更に、得られたモノクローナル抗体が分泌型 HB-EGFに対して中和活性を有して ヽ る力否かは、 HB-EGF依存性細胞を用いた細胞増殖阻害アツセィを行うことにより確 認することができる。
[0091] 細胞増殖阻害アツセィに用いる細胞としては、分泌型 HB-EGFが結合することがで きる受容体を有する細胞であれば 、かなる細胞でもよ 、が、具体的には EGF受容体 遺伝子をマウス骨髄性由来細胞株 32D clone3 (ATCC No. CRL- 11346)に導入して 得られた細胞株などがあげられる。
得られたモノクローナル抗体と分泌型 HB-EGFとをプレート上で反応させた後に上 述の細胞株をカロえて培養を行う。対照として、分泌型 HB- EGFを添加しモノクローナ ル抗体を添加しな 、プレート、およびモノクローナル抗体と分泌型 HB-EGFの!、ずれ も添カ卩しないプレートに、同様に上述の細胞株をカ卩えて培養を行う。各プレートでの 細胞数を計測することにより、細胞増殖阻害率を求めることができる。細胞増殖阻害 率が高 、モノクローナル抗体は、中和活性を有するモノクローナル抗体として選択す ることがでさる。
[0092] 本発明の中和活性を有するモノクローナル抗体の具体例としては、ハイプリドーマ 細胞株 KM3566が生産するモノクローナル抗体 KM3566、およびハイプリドーマ細胞 株 KM3567が産生するモノクローナル抗体 KM3567をあげることができる。ハイプリドー マ細胞株 KM3566および KM3567は、それぞれ平成 18年 1月 24日、平成 18年 3月 23日 付でブダペスト条約に基づき独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託セ ンター（日本国茨城県つくば巿東 1丁目 1番地 1 中央第 6)に FERM BP-10490、およ び FERM BP-10573として寄託されている。
[0093] 2.ヒト型キメラ抗体およびヒト化抗体の作製 (1)ヒト化抗体発現用ベクターの構築
ヒト化抗体発現用ベクターとしては、ヒト抗体の CHおよび Zまたは CLをコードする 遺伝子が組み込まれた動物細胞用発現ベクターであれば 、かなるものでもよ!/、。ヒト 化抗体発現用ベクターは、動物細胞用発現ベクターにヒト抗体の CHおよび CLをコ ードする遺伝子をそれぞれクローユングすることにより構築することができる。
[0094] ヒト抗体の C領域は任意のヒト抗体の CHおよび CLであることができ、例えば、ヒト抗 体の H鎖の IgGlサブクラスの C領域（以下、 hC y 1と表記する）およびヒト抗体の L鎖の κクラスの C領域（以下、 hC κと表記する）などがあげられる。ヒト抗体の CHおよび CL をコードする遺伝子としてはェキソンとイントロン力 なる染色体 DNAを用いることがで き、また、 cDNAを用いることもできる。
[0095] 動物細胞用発現ベクターとしては、ヒト抗体の C領域をコードする遺伝子を組込み 発現できるものであればいかなるものでも用いることができる。例えば、 pAGE107 (Cyt otechnology, 3, 133-140, 1990)、 pAGEl 03 (Journal of Biochemistry, 101, 1307-131 0, 1987)、 pHSG274 (Gene, 27, 223-232, 1984)、 pKCR (Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 78, 1527-1531 , 1981)、 pSGl J8 d2-4 (Cytotechnology, 4, 173-180, 1990)などがあげられる。動物細胞用発現べク ターに用いるプロモーターとェンハンサ一としては、 SV40の初期プロモーターとェン ハンサー（Journal of Biochemistry, 101, 1307-1310, 1987)、モロ-一マウス白血病ゥ イノレスの LTRプロモーターとェンノヽンサ一 (Biochemical &Biophysical Research Com munications, 149, 960-968, 1987)、ィムノグロブリン H鎖のプロモーター（Cell, 41 , 7 9-487, 1985)とェンハンサー（Cell, 33, 717-728, 1983)などがあげられる。
[0096] ヒト型キメラ抗体およびヒト化抗体発現用ベクターは、抗体 H鎖および L鎖が別々の ベクター上に存在するタイプ、あるいは同一のベクター上に存在するタイプ（以下、タ ンデム型と表記する）のどちらでも用いることができる力 ヒト型キメラ抗体およびヒト化 抗体発現ベクターの構築の容易さ、動物細胞への導入の容易さ、動物細胞内での 抗体 H鎖および L鎖の発現量のバランスが均衡するなどの点から、タンデム型のヒト化 抗体発現用ベクターの方が好ましい（Journal of Immunological Methods, 167, 271-2 78, 1994) oタンデム型のヒト化抗体発現用ベクターとしては、 pKANTEX93 (W097/1 0354) , pEE18 (Hybridoma, 17, 559-567, 1998)などがあげられる。
(2)ヒト以外の動物の抗体の V領域をコードする cDNAの取得およびアミノ酸配列の解 析
ヒト以外の動物の抗体、例えば、マウス抗体の VHおよび VLをコードする cDNAは以 下のようにして取得することができる。
[0097] ハイプリドーマより mRNAを抽出し、 cDNAを合成する。合成した cDNAをファージある いはプラスミドなどのベクターにクローユングして cDNAライブラリーを作製する。該ラ イブラリーより、マウス抗体の C領域部分あるいは V領域部分をプローブとして用いて 、 VHをコードする cDNAを有する組換えファージある!/、は組換えプラスミドおよび VLを コードする cDNAを有する組換えファージあるいは組換えプラスミドをそれぞれ単離す る。組換えファージあるいは組換えプラスミド上の目的とするマウス抗体の VHおよび VLの全塩基配列を決定し、塩基配列より VHおよび VLの全アミノ酸配列を推定する。
[0098] ヒト以外の動物としては、マウス、ラット、ノヽムスター、ラビットなど、ノヽイブリドーマを 作製することが可能であれば、いかなるものも用いることができる。
ハイプリドーマ力も全 RNAを調製する方法としては、チォシアン酸グァ-ジン一トリフ ルォロ酢酸セシウム法（Methods in Enzymology, 154, 3-28, 1987)、また全 RNAから mRNAを調製する方法としては、オリゴ (dT)固定化セルロースカラム法（Molecular Clo ning: ALaboratory Manual, Cold Spring Harbor Lab. Press New Yor , 1989)など力 あげられる。また、ハイプリドーマから mRNAを調製するキットとしては、 Fast Track mR NA Isolation Kit (Invitrogen社製)、 wuick Prep mRNA Purincation Kit (Pharmacia社 製)などがあげられる。
[0099] cDNAの合成および cDNAライブラリ一作製法としては、常法（Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold bpnng Harbor Lab. Press New York, 1989; Current Proto cols in Molecular Biology, Supplement 1—34)、あるいは巿販のキット、 [列えば、 Super Script™Plasmid System for cDNA Synthesis and Plasmid Cloning (GIBCO BRL社製) や ZAP- cDNA Synthesis Kit (Stratagene社製）を用いる方法などがあげられる。
[0100] cDNAライブラリーの作製の際、ハイプリドーマカゝら抽出した mRNAを铸型として合成 した cDNAを組み込むベクターは、該 cDNAを組み込めるベクターであれば!/、かなるも のでも用いることができる。例えば、 ZAP Express (Strategies, 5, 58-61, 1992)、 pBlue script II SK (+) (Nucleic Acids Research, 17,9494, 1989)、 λ ΖΑΡ II (Stratagene社製） 、 λ gtlO、 λ gtl l (DNA Cloning: A Practical Approach, I, 49, 1985)、 Lambda BlueM id (Clontech社製）、 λ ExCell、 pT7T3 18U (Pharmacia社製）、 pcD2 (Molecular &Cellu lar Biology, 3, 280-289, 1983)および pUC18 (Gene, 33, 103-119, 1985)などのファ ージあるいはプラスミドベクターが用いられる。
[0101] ファージあるいはプラスミドベクターにより構築される cDNAライブラリーを導入する 大腸菌としては該 cDNAライブラリーを導入、発現および維持できるものであれば！/ヽか なるものでも用いることができる。例えば、 XL1- Blue MRF' (Journal of Biotechnology, 23, 271-289, 1992)、 C600 (Genetics, 59, 177-190, 1968)、 Y1088、 Y1090 (Science, 222,778-782, 1983)、 NM522 (Journal of Molecular Biology, 166, 1-19, 1983)、 K802 (Journal of Molecular Biology, 16, 118-133, 1966)および JM105 (Gene, 38, 275-276 , 1985)などが用いられる。
[0102] cDNAライブラリーからのヒト以外の動物の抗体の VHおよび VLをコードする cDNAク ローンの選択法としては、放射性同位元素あるいは蛍光標識したプローブを用いた コロニ^ ~ ·ハイブリダィゼーシヨン法あるいはプラーク'ノヽィブリダィゼーシヨン法（Mole cularし loning: A Laboratory Manual, し old bpnng Harbor Lab. Press New York, 198 9)により選択することができる。また、プライマーを調製し、 mRNAから合成した cDNA あるいは cDNAライブラリーを铸型として、 Polymerase Chain Reaction (以下、 PCR法と 表己する； Molecularし loning: A Laboratory Manual, Cold bpnng Harbor Lab. Press New York, 1989; Current Protocols in Molecular Biology, Supplement 1-34)により V Hおよび VLをコードする cDNAを調製することもできる。
[0103] 上記方法により選択された cDNAを、適当な制限酵素等で切断後、 pBluescript SK( -) (Stratagene社製)などのプラスミドベクターにクローユングし、通常用いられる塩基 配列解析方法、例えば、ジデォキシ法（Proceedings of the National Academy of Scie nces of the United States of America, 74, 5463-5467, 1977)などの反応を行い、塩 基配列自動分析装置 ABI PRISM 377 (ABI社製)などを用いて解析することで該 cDN Aの塩基配列を決定することができる。 [0104] 決定した塩基配列から VHおよび VLの全アミノ酸配列を推定し、既知の抗体の VH および VLの全アミノ酸配列（Sequences of Proteins of Immunological Interest, US De pt. Health and Human Services, 1991)と比較することにより、取得した cDNAが分泌 のためのシグナル配列を含む抗体の VHおよび VLの完全なアミノ酸配列をコードして V、るかを確認することができる。シグナル配列を含む抗体の VHおよび VLの完全なァ ミノ酸配列に関しては、既知の抗体の VHおよび VLの全アミノ酸配列（Sequences of P roteins of Immunological Interest, Ub Dept. Health and Human Services, 1991 Jと比 較することにより、シグナル配列の長さおよび N末端アミノ酸配列を推定でき、さらに はそれらが属するサブグループを知ることができる。また、 VHおよび VLの各 CDRのァ ミノ酸配列についても、既知の抗体の VHおよび VLのアミノ酸配列（Sequences of Prot eins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human services, 1991)と比軟 することによって見出すことができる。
[0105] さらに、 VHおよび VLの完全なアミノ酸配列を用いて任意のデータベース、例えば、 SWISS- PROTや PIR- Proteinなどに対して BLAST法（Journal of Molecular Biology, 21 5, 403-410, 1990)などの配列の相同性検索を行い、配列の新規性を検討することが できる。
(3)ヒト型キメラ抗体発現ベクターの構築
上記 2 ( 1)に記載のヒト化抗体発現用ベクターのヒト抗体の CHおよび CLをコードす る遺伝子の上流に、ヒト以外の動物の抗体の VHおよび VLをコードする cDNAをクロー ユングし、ヒト型キメラ抗体発現ベクターを構築することができる。例えば、ヒト以外の 動物の抗体の VHおよび VLをコードする cDNAを、ヒト以外の動物の抗体の VHおよび VLの 3，末端側の塩基配列とヒト抗体の CHおよび CLの 5，末端側の塩基配列とから成 り、かつ適当な制限酵素の認識配列を両端に有する合成 DNAとそれぞれ連結し、そ れぞれを上記 2 ( 1)に記載のヒト化抗体発現用ベクターのヒト抗体の CHおよび CLをコ ードする遺伝子の上流にそれらが適切な形で発現するようにクローニングし、ヒト型キ メラ抗体発現ベクターを構築することができる。また、ヒト以外の動物の抗体の VHおよ び VLをコードする cDNAを含むプラスミドを铸型として、 5 '末端に適当な制限酵素の 認識配列を有するプライマーを用いて PCR法により VHおよび VLをコードする cDNAを 増幅し、それぞれを上記 2 (1)に記載のヒト化抗体発現用ベクターのヒト抗体の CHお よび CLをコードする遺伝子の上流にそれらが適切な形で発現するようにクローユング し、ヒト型キメラ抗体発現ベクターを構築することができる。
(4)ヒトイ匕抗体 (CDR移植抗体)の V領域をコードする cDNAの構築
ヒト化抗体の VHおよび VLをコードする cDNAは、以下のようにして構築することがで きる。まず、 目的のヒト以外の動物の抗体の VHおよび VLの CDRのアミノ酸配列を移 植するヒト抗体の VHおよび VLの FRのアミノ酸配列を選択する。ヒト抗体の VHおよび VLの FRのアミノ酸配列としては、ヒト抗体由来のものであれば、いかなるものでも用い ることができる。例えば、 Protein Data Bankなどのデータベースに登録されているヒト 抗体の VHおよび VLの FRのアミノ酸配列、ヒト抗体の VHおよび VLの FRの各サブグル ープの共通ア^ノ酸酉 ti歹 U (Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services, 1991)などがあげられる力 その中でも、十分な活性を 有するヒト化抗体を作製するためには、 目的のヒト以外の動物の抗体の VHおよび VL の FRのアミノ酸配列とできるだけ高い相同性 (少なくとも 60%以上）を有するアミノ酸配 列を選択することが望ましい。次に、選択したヒト抗体の VHおよび VLの FRのアミノ酸 配列に、 目的のヒト以外の動物の抗体の VHおよび VLの CDRのアミノ酸配列を移植し 、ヒト化抗体の VHおよび VLのアミノ酸配列を設計する。設計したアミノ酸配列を抗体 の遺伝子の塩基配列に見られるコドンの使用頻度（Sequences of Proteins of Immuno logical Interest, US Dept. Health and Human Services, 1991)を考慮して塩基配列に 変換し、ヒト化抗体の VHおよび VLのアミノ酸配列をコードする塩基配列を設計する。 設計した塩基配列に基づき、 150塩基前後の長さからなる数本の合成 DNAを合成し、 それらを用いて PCR法を行う。この場合、 PCRでの反応効率および合成可能な DNA の長さから、 VH、 VLとも 4本の合成 DNAを設計することが好ましい。
また、両端に位置する合成 DNAの 5'末端に適当な制限酵素の認識配列を導入す ることで、上記 2 (1)で構築したヒト化抗体発現用ベクターに容易にクローユングするこ とができる。 PCR反応後、増幅産物を pBluescript SK(-) (Stratagene社製）などのプラ スミドにクローニングし、上記 2 (2)に記載の方法により、塩基配列を決定し、所望のヒ ト化抗体の VHおよび VLのアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するプラスミドを取 得する。
(5)ヒトイ匕抗体の V領域のアミノ酸配列の改変
ヒト化抗体は、 目的のヒト以外の動物の抗体の VHおよび VLの CDRのみをヒト抗体の VHおよび VLの FRに移植しただけでは、その抗原結合活性は元のヒト以外の動物の 抗体に比べて低下してしまうことが知られている（BIO/TECHNOLOGY, 9, 266-271, 1991)。この原因としては、元のヒト以外の動物の抗体の VHおよび VLでは、 CDRのみ ならず、 FRのいくつかのアミノ酸残基が直接的あるいは間接的に抗原結合活性に関 与しており、それらアミノ酸残基が CDRの移植に伴い、ヒト抗体の VHおよび VLの FR の異なるアミノ酸残基へと変化してしまうことが考えられて 、る。この問題を解決する ため、ヒト化抗体では、ヒト抗体の VHおよび VLの FRのアミノ酸配列の中で、直接抗原 との結合に関与しているアミノ酸残基や CDRのアミノ酸残基と相互作用したり、抗体 の立体構造を維持し、間接的に抗原との結合に関与しているアミノ酸残基を同定し、 それらを元のヒト以外の動物の抗体に見出されるアミノ酸残基に改変し、低下した抗 原結合活性を上昇させることが行われている（BIO/TECHNOLOGY, 9, 266-271, 19 91)。ヒト化抗体の作製においては、それら抗原結合活性に関わる FRのアミノ酸残基 を如何に効率よく同定するか力 最も重要な点であり、そのために X線結晶解析 (Jour nal of Molecular Biology, U2, 535-542, 1977)あるいはコンピューターモデリング（Pr otein Engineering, 7, 1501-1507, 1994)などによる抗体の立体構造の構築および解 祈が行われている。これら抗体の立体構造の情報は、ヒト化抗体の作製に多くの有 益な情報をもたらして来た力 その一方、あらゆる抗体に適応可能なヒト型 CDR移植 抗体の作製法は未だ確立されておらず、現状ではそれぞれの抗体につ!、て数種の 改変体を作製し、それぞれの抗原結合活性との相関を検討するなどの種々の試行 錯誤が必要である。
ヒト抗体の VHおよび VLの FRのアミノ酸残基の改変は、改変用合成 DNAを用いて上 記 2 (4)に記載の PCR法を行うことにより、達成できる。 PCR後の増幅産物について上 記 2 (2)に記載の方法により、塩基配列を決定し、 目的の改変が施されたことを確認 する。
(6)ヒト化抗体発現ベクターの構築 上記 2 (1)に記載のヒト化抗体発現用ベクターのヒト抗体の CHおよび CLをコードす る遺伝子の上流に、上記 2 (4)および (5)で構築したヒト化抗体の VHおよび VLをコー ドする cDNAをクローユングし、ヒト化抗体発現ベクターを構築することができる。例え ば、上記 2 (4)および (5)でヒト化抗体の VHおよび VLを構築する際に用いる合成 DNA のうち、両端に位置する合成 DNAの 5 '末端に適当な制限酵素の認識配列を導入す ることで、上記 2 (1)に記載のヒトイ匕抗体発現用ベクターのヒト抗体の CHおよび CLをコ ードする遺伝子の上流にそれらが適切な形で発現するようにクローユングすることが できる。
(7)ヒト化抗体の一過性発現
作製した多種類のヒト化抗体の抗原結合活性を効率的に評価するために、上記 2 ( 3)および (6)に記載のヒト化抗体発現ベクター、あるいはそれらを改変した発現べクタ 一を用いてヒト化抗体の一過性発現を行うことができる。発現ベクターを導入する宿 主細胞としては、ヒトイ匕抗体を発現できる宿主細胞であれば、いかなる細胞でも用い ることができるが、その発現量の高さから、 COS-7細胞 (ATCC CRL1651)が一般に 用いられる（Methods in Nucleic Acids Research, CRC press, 283, 1991)。 COS- 7糸田 胞への発現ベクターの導入法としては、 DEAE-デキストラン法（Methods in Nucleic A cids Research, CRC press, 283, 1991)、リポフエクシヨン法（Proceedings of the Natio nal Academy of Sciences of the United States of America, 84. 7413-7417, 1987)な どがあげられる。
発現ベクターの導入後、培養上清中のヒト化抗体の発現量及び抗原結合活性は E LISA (Antibodies: ALaboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Chapter 14 , 1988; Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press Limited, 19 96)などにより測定できる。
(8)ヒト化抗体の安定発現
上記 2 (3)および (6)に記載のヒト化抗体発現ベクターを適当な宿主細胞に導入す ることによりヒト化抗体を安定に発現する形質転換細胞を得ることができる。宿主細胞 への発現ベクターの導入法としては、エレクト口ポレーシヨン法（Cytotechnology, 3, 1 33-140, 1990)などがあげられる。ヒト化抗体発現ベクターを導入する宿主細胞として は、ヒトイ匕抗体を発現させることができる宿主細胞であれば、いかなる細胞でも用いる ことができる。例えば、マウス SP2/0- Agl4細胞（ATCC CRL1581)、マウス P3X63- Ag8 .653細胞 (ATCC CRL1580)、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子（以下、 と表記する） 力ズ損した CHO糸田胞 (Proceedings of the National Academy of Sciences of tne Unite d States of America, 77, 4216-4220, 1980)、ラット YB2/3HL.P2.G11.16Ag.20細胞（ ATCC CRL1662、以下、 YB2/0細胞と表記する）などがあげられる。
[0109] 発現ベクターの導入後、ヒト化抗体を安定に発現する形質転換体は、特開平 2-257 891に開示されている方法に従い、 G418 sulfate (以下、 G418と表記する）などの薬剤 を含む動物細胞培養用培地で培養することにより選択できる。動物細胞培養用培地 としては、 RPMI1640培地（日水製薬社製）、 GIT培地（日本製薬社製）、 EX- CELL302 培地（JRH社製）、 IMDM (GIBCO BRL社製）、 Hybridoma- SFM (GIBCO BRL社製）、 またはこれら培地に FBSなどの各種添加物を添加した培地などを用いることができる 。得られた形質転換細胞を培地中で培養することで培養上清中にヒト化抗体を発現 蓄積させることができる。培養上清中のヒト化抗体の発現量および抗原結合活性は、 ELISAにより測定できる。また、形質転換細胞は、特開平 2-257891に開示されている 方法に従い、 DHFR増幅系などを利用してヒト化抗体の発現量を上昇させることがで きる。
[0110] ヒト化抗体は、形質転換細胞の培養上清よりプロテイン Aカラムを用いて精製するこ と力できる (Antibodies: A Laboratory Manual, Cola Spring Harbor Laooratory, し hap ter 8, 1988; Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press Limite d, 1996) oまた、その他に通常、タンパク質の精製で用いられる精製方法を使用する ことができる。例えば、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィーおよび限外濾過等を 組み合わせて行い、精製することができる。精製したヒト化抗体の H鎖、 L鎖あるいは 抗体分子全体の分子量は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（以下、 PAGEと表記する ： Nature, 227, 680-685, 1970)やウェスタンブロッテイング法（Antibodies: A Laborato ry Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, し hapter 12, 1988; Monoclonal Antioodi es: Principles and Practice, Academic Press Limited, 1996)などで測定することがで きる。 (9)ヒト化抗体と抗原との結合活性評価
ヒト化抗体と抗原との結合活性評価は、上記に記載の ELISAを用いて行うことができ る。
[0111] 3.抗体断片の作製
抗体断片は、上記 1および 2に記載の抗体をもとに遺伝子工学的手法あるいはタン ノ ク質ィ匕学的手法により、作製することができる。
遺伝子工学的手法としては、 目的の抗体断片をコードする遺伝子を構築し、動物 細胞、植物細胞、昆虫細胞、大腸菌などの適当な宿主を用いて発現、精製を行うな どの方法があげられる。
[0112] タンパク質ィ匕学的手法としては、ペプシン、ノパインなどのタンパク質分解酵素を用 V、た部位特異的切断、精製などの方法があげられる。
抗体断片として、 Fab、 F(ab' )、 Fa 、 scFv、 diabody, dsFvの製造法について以下
2
に具体的に説明する。
(1) Fabの作製
Fabは、タンパク質ィ匕学的には IgGをタンパク質分解酵素パパインで処理することに より、作製することができる。パパインの処理後は、元の抗体がプロテイン A結合性を 有する IgGサブクラスであれば、プロテイン Aカラムに通すことで、 IgG分子や Fc断片と 分離し、均一な Fabとして回収することができる（Monoclonal Antibodies: Principles an d Practice, third edition, 1995)。プロテイン A結合性を持たない IgGサブクラスの抗体 の場合は、イオン交換クロマトグラフィーにより、 Fabは低塩濃度で溶出される画分中 に [Hi収すること力 eさる (Monoclonal Antioodies: Principles and Practice, third editio n, 1995) oまた、 Fabは遺伝子工学的には、多くは大腸菌を用いて、また、昆虫細胞 や動物細胞などを用いて作製することができる。例えば、上記 2 (2)、 2 (4)および 2 (5) に記載の抗体の V領域をコードする DNAを、 Fab発現用ベクターにクローユングし、 Fa b発現ベクターを作製することができる。 Fab発現用ベクターとしては、 Fab用の DNAを 組み込み発現できるものであればいかなるものも用いることができる。例えば、 pIT106 (Science, 240, 1041-1043, 1988)などがあげられる。 Fab発現ベクターを適当な大腸 菌に導入し、封入体あるいはペリブラズムに Fabを生成蓄積させることができる。封入 体からは、通常タンパク質で用いられるリフォールデイング法により、活性のある Fabと することができ、また、ペリブラズムに発現させた場合は、培養上清中に活性を持った Fabが漏出する。リフォールデイング後あるいは培養上清からは、抗原を結合させた力 ラムを用いることにより、均一な Fabを精製することができる（Antibody Engineering, A Practical Guide, W. H. Freeman ana Company, 1992)。
(2) F(a ）の作製
2
F(ab' )は、タンパク質ィ匕学的には IgGをタンパク質分解酵素ペプシンで処理するこ
2
とにより、作製することができる。ペプシンの処理後は、 Fabと同様の精製操作により、 均一な F(a ）として回収することができる（Monoclonal Antibodies: Principles and Pra
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ctice, third edition, Academic Press, 1995)。また、下記 3 (3)に記載の Fa を。— PDM やビスマレイミドへキサンなどのようなマレイミドで処理し、チォエーテル結合させる方 法や、 DTNB[5,5，- dithiobis(2- nitrobenzoic acid)]で処理し、 S-S結合させる方法によ つても作製することができる（Antibody Engineering, A Practical Approach, IRL PRES S,1996)。
(3) Fa の作製
Fab'は、上記 3 (2)に記載の F(a ）をジチオスレィトールなどの還元剤で処理して
2
得ることができる。また、 Fa は遺伝子工学的には、多くは大腸菌、また、昆虫細胞 や動物細胞などを用いて作製することができる。例えば、上記 2 (2)、 2 (4)および 2 (5) に記載の抗体の V領域をコードする DNAを、 Fa 発現用ベクターにクローユングし、 F a 発現ベクターを作製することができる。 Fa 発現用ベクターとしては、 Fa 用の D NAを組み込み発現できるものであればいかなるものも用いることができる。例えば、 p AK19 (BIO/TECHNOLOGY, 10, 163-167, 1992)などがあげられる。 Fa 発現べクタ 一を適当な大腸菌に導入し、封入体あるいはペリブラズムに Fa を生成蓄積させる ことができる。封入体からは、通常タンパク質で用いられるリフォールデイング法により 、活性のある Fa とすることができ、また、ペリブラズムに発現させた場合は、リゾチ一 ムによる部分消化、浸透圧ショック、ソ-ケーシヨンなどの処理により菌を破砕し、菌 体外へ回収させることができる。リフォールデイング後あるいは菌の破碎液からは、プ 口ティン Gカラムなどを用いることにより、均一な Fa を精製することができる（Antibod y Engineering, A Practical Approach, IRL PRESS, 199bノ。
(4) scFvの作製
scFvは遺伝子工学的には、ファージまたは大腸菌、また、昆虫細胞や動物細胞な どを用いて作製することができる。例えば、上記 2 (2)、 2 (4)および 2 (5)に記載の抗体 の V領域をコードする DNAを、 scFv発現用ベクターにクローユングし、 scFv発現べクタ 一を作製することができる。 scFv発現用ベクターとしては、 scFvの DNAを組み込み発 現できるものであればいかなるものも用いることができる。例えば、 pCANTAB5E (Phar macia社製）、 pHFA (Human Antibodies &Hybridomas, 5, 48-56, 1994)などがあげら れる。 scFv発現ベクターを適当な大腸菌に導入し、ヘルパーファージを感染させるこ とで、ファージ表面に scFvがファージ表面タンパク質と融合した形で発現するファー ジを得ることができる。また、 scFv発現ベクターを導入した大腸菌の封入体あるいは ペリブラズムに scFvを生成蓄積させることができる。封入体からは、通常タンパク質で 用いられるリフォールデイング法により、活性のある scFvとすることができ、また、ペリ ブラズムに発現させた場合は、リゾチームによる部分消化、浸透圧ショック、ソ-ケ一 シヨンなどの処理により菌を破砕し、菌体外へ回収することができる。リフォールディン グ後あるいは菌の破碎液からは、陽イオン交換クロマトグラフィーなどを用いることに より、均一な scFvを精製することができる（Ant¾ody Engineering, A Practical Approac h, IRL PRESS, 1996)。
(5) diabodyの作製
diabodyは遺伝子工学的には、多くは大腸菌、また、昆虫細胞や動物細胞などを用 Vヽて作製することができる。例えば、上記 2 (2)、 2 (4)および 2 (5)に記載の抗体の VH と VLをリンカ一がコードするアミノ酸残基力 残基以下となるように連結した DNAを作 製し、 diabody発現用ベクターにクローユングし、 diabody発現ベクターを作製すること ができる。 diabody発現用ベクターとしては、 diabodyの DNAを組み込み発現できるも のであればいかなるものも用いることができる。例えば、 pCANTAB5E (Pharmacia社製 ) , pHFA (Human Antibodies Hybridomas, 5, 48, 1994)などがあげられる。 diabody発 現ベクターを導入した大腸菌の封入体あるいはペリブラズムに diabodyを生成蓄積さ せることができる。封入体からは、通常タンパク質で用いられるリフォールデイング法 により、活性のある diabodyとすることができ、また、ペリブラズムに発現させた場合は、 リゾチームによる部分消化、浸透圧ショック、ソ-ケーシヨンなどの処理により菌を破砕 し、菌体外へ回収することができる。リフォールデイング後あるいは菌の破砕液からは 、陽イオン交換クロマトグラフィーなどを用いることにより、均一な diabodyを精製するこ とができる（Antibody Engineering, A Practical Approach, IRL PRESS, 1996)。
(6) dsFvの作製
dsFvは遺伝子工学的には、多くは大腸菌、また、昆虫細胞や動物細胞などを用い て作製することができる。まず、上記 2 (2)、 2 (4)および 2 (5)に記載の抗体の VHおよ び VLをコードする DNAの適当な位置に変異を導入し、コードするアミノ酸残基がシス ティンに置換された DNAを作製する。作製した各 DNAを dsFv発現用ベクターにクロ 一ユングし、 VHおよび VLの発現ベクターを作製することができる。 dsFv発現用べクタ 一としては、 dsFv用の DNAを組み込み発現できるものであればいかなるものも用いる ことができる。例えば、 pULI9 (Protein Engineering, 7, 697-704, 1994)などがあげら れる。 VHおよび VLの発現ベクターを適当な大腸菌に導入し、封入体あるいはペリプ ラズムに dsFvを生成蓄積させることができる。封入体ある!/、はペリプラズムカも VHお よび VLを取得し、混合した後に、通常タンパク質で用いられるリフォールデイング法 により、活性のある dsFvとすることができる。リフォールデイング後は、イオン交換クロ マトグラフィーおよびゲル濾過などにより、さらに精製することができる（Protein Engine ering, 7, 697-704, 1994)。
4.本発明の医薬および治療剤
本発明のモノクローナル抗体を有効成分として含有する医薬は、 HB-EGFが関与 する各種疾患を治療することができる。
HB-EGFが関与する疾患としては、癌、心疾患、動脈硬化などがあげられる。
癌としては、乳癌、肝癌、膝癌、膀胱癌、卵巣癌、卵巣胚細胞腫瘍などの固形癌があ げられる。また、いずれかの固形癌に伴う連続性、血行性またはリンパ性転移、腹膜 播種などによる転移癌などもあげられる。また白血病 (急性骨髄性白血病、 T細胞性 白血病など）、リンパ腫、ミエローマなどの造血細胞由来の癌（血液癌、 hematological cancer、 blood cancer)などの癌種があげられる„ [0114] 本発明の抗体またはその抗体断片を有効成分とする医薬は、通常は薬理学的に 許容される 1つ以上の担体と一緒に混合し、製剤学の技術分野においてよく知られる 任意の方法により製造した医薬製剤として提供するのが望ましい。
投与経路は、治療に際して最も効果的なものを使用するのが望ましぐ経口投与、 又は口腔内、鼻腔内、気道内、直腸内、皮下、筋肉内、腹腔内及び静脈内等の非経 口投与をあげることができ、抗体又はペプチド製剤の場合、望ましくは静脈内投与を あげることができる。投与形態としては、噴霧剤、カプセル剤、錠剤、顆粒剤、シロッ プ剤、乳剤、座剤、注射剤、軟膏、テープ剤等があげられる。
[0115] 経口投与に適当な製剤としては、乳剤、シロップ剤、カプセル剤、錠剤、散剤、顆粒 剤等があげられる。乳剤及びシロップ剤のような液体調製物は、水、ショ糖、ソルビト ール、果糖等の糖類、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール等のダリコール 類、ごま油、ォリーブ油、大豆油等の油類、 p—ヒドロキシ安息香酸エステル類等の防 腐剤、ストロベリーフレーバー、ペパーミント等のフレーバー類等を添加剤として用い て製造できる。カプセル剤、錠剤、散剤、顆粒剤等は、乳糖、ブドウ糖、ショ糖、マン 二トール等の賦形剤、デンプン、アルギン酸ナトリウム等の崩壊剤、ステアリン酸マグ ネシゥム、タルク等の滑沢剤、ポリビュルアルコール、ヒドロキシプロピルセルロース、 ゼラチン等の結合剤、脂肪酸エステル等の界面活性剤、グリセリン等の可塑剤等を 添加剤として用いて製造できる。
[0116] 非経口投与に適当な製剤としては、注射剤、座剤、噴霧剤等があげられる。注射剤 は、塩溶液、ブドウ糖溶液、あるいは両者の混合物からなる担体等を用いて調製され る。座剤はカカオ脂、水素化脂肪又はカルボン酸等の担体を用いて調製される。ま た、噴霧剤は該抗体又はペプチドそのもの、ないしは受容者の口腔及び気道粘膜を 刺激せず、かつ該化合物を微細な粒子として分散させ吸収を容易にさせる担体等を 用いて調製される。担体として具体的には乳糖、グリセリン等が例表される。該抗体 及び用いる担体の性質により、エアロゾル、ドライパウダー等の製剤が可能である。ま た、これらの非経口剤にぉ ヽても経口剤で添加剤として例示した成分を添加すること ちでさる。
[0117] 投与量又は投与回数は、目的とする治療効果、投与方法、治療期間、年齢、体重 等により異なる力 通常成人 1日当たり 10 g/kg〜8mg/kgである。
以下の実施例により本発明をより具体的に説明するが、実施例は本発明の例示であ り、本発明の範囲を限定するものでない。
実施例 1
抗 HB-EGFモノクローナル抗体の作製
(1)免疫原の調製
R&Dシステム社製リコンビナント分泌型ヒト HB-EGF (カタログ番号 259-HE/CF)凍 結乾燥品をダルベッコリン酸バッファー（Phosphate buffered saline: PBS)にて溶解し 、免疫原として用いた。
(2)動物の免疫と抗体産生細胞の調製
実施例 1 (1)で調製したリコンビナント分泌型ヒト HB- EGF 25 μ gを水酸化アルミ- ゥムアンュノント LAntibomes - A Laboratory ManuaL, CoLd bpnng Harbor Laborato ry, p99、 1988] 2 mgおよび百日咳ワクチン (千葉県血清研究所製） 1 X 109細胞ととも に HB-EGF欠損マウス (大阪大学微生物病研究所 細胞機能分野研究室より供与、 PNAS、 VOL.100, NO.100、 3221-3226、 2003)に投与した。投与 2週間後より、該 HB- EGF 25 gのみを 1週間に 1回、計 4回投与した。該マウスの眼底静脈より部分採血 し、その血清抗体価を以下に示す酵素免疫測定法で調べ、十分な抗体価を示した マウスから最終免疫 3日後に脾臓を摘出した。脾臓を MEM (Minimum Essential Mediu m)培地（日水製薬社製）中で細断し、ピンセットでほぐし、遠心分離（1200 rpm、 5分 間）した。得られた沈殿画分にトリス一塩ィ匕アンモ-ゥム緩衝液 (PH7.6)を添加し、 1 〜2分間処理することにより赤血球を除去した。得られた沈殿画分 (細胞画分)を ME M培地で 3回洗浄し、細胞融合に用いた。
(3)酵素免疫測定法 (バインディング ELISA)
アツセィには実施例 1 (1)のリコンビナントヒト HB- EGFを 96ゥエルの ELISA用プレート (グライナ一社）に 0.5 g/mL、 50 L/ゥエルで分注し、 4°Cでー晚放置して吸着させ たものを用いた。該プレートを洗浄後、 1 %牛血清アルブミン (BSA) -PBSを 50 L/ ゥェルカ卩ぇ、室温で 1時間放置し、残っている活性基をブロックした。放置後、 1% BS A- PBSを捨て、該プレートに一次抗体として被免疫マウス抗血清、ハイプリドーマ培 養上清を 50 μ L/ゥエル分注し、 2時間放置した。該プレートを 0.05 %ポリオキシェチレ ン（20)ソルビタンモノラウレート [ (ICI社商標 Tween 20相当品：和光純薬社製) 1/PBS ( 以下 Tween-PBSと表記)で洗浄後、 2次抗体としてペルォキシダーゼ標識ゥサギ抗マ ウス IgGガンマ鎖（キルケガード アンド ペリー ラボラトリーズ社）を 50 L/ゥエルカロ えて室温、 1時間放置した。該プレートを Tween-PBSで洗浄後、 ABTS〔2.2-アジノビス (3-ェチルベンゾチアゾール -6-スルホン酸）アンモ-ゥム〕基質液〔1 mmoL/L ABT S/0.1 moL/L クェン酸バッファー（PH4.2)、 0.1 %H O〕を添カ卩し、発色させ OD415
2 2
nmの吸光度をプレートリーダー（Emax; Molecular Devices社）を用いて測定した。
(4)マウス骨髄腫細胞の調製
8-ァザグァニン耐性マウス骨髄腫細胞株 P3X63Ag8U.l (P3- U1： ATCCより購入）を 10%ゥシ胎児血清添加 RPMI1640 (インビトロジヱン社)で培養し、細胞融合時に 2 X 1 07個以上の細胞を確保し、細胞融合に親株として供した。
(5)ハイプリドーマの作製
実施例 1 (2)で得られたマウス脾細胞と実施例 1 (4)で得られた骨髄腫細胞とを 10： 1 になるよう混合し、遠心分離（1200rpm、 5分間）した。得られた沈澱画分の細胞群をよ くほぐした後、攪拌しながら、 37°Cで、ポリエチレングリコール— 1000 (PEG-1000) 1 g 、 MEM培地 lmL、およびジメチルスルホキシド 0.35 mLの混液を 108個のマウス脾細胞 あたり 0.5mL加え、該懸濁液に 1〜2分間毎に MEM培地 lmLを数回加えた後、 MEM 培地をカ卩えて全量が 50mLになるようにした。該懸濁液を遠心分離 (900rpm、 5分間） し、得られた沈澱画分の細胞をゆるやかにほぐした後、該細胞を、メスピペットによる 吸込み吸出しでゆるやかに HAT培地〔10%ゥシ胎児血清添加 RPMI1640培地に HAT Media Supplement (インビトロジェン社製）をカ卩えた培地〕 100 mL中に懸濁した。該懸 濁液を 96ゥエル培養用プレートに 200 μ L/ゥエルずつ分注し、 5%COインキュベータ
2
一中、 37°Cで 10〜14日間培養した。培養後、培養上清を実施例 1 (3)に記載した酵 素免疫測定法で調べ、リコンビナントヒト HB-EGFに反応するゥエルを選び、そこに含 まれる細胞から限界希釈法によるクローユングを 2回繰り返し、抗 HB-EGFモノクロ一 ナル抗体産生ハイブリドーマ株 KM3566、 KM3567および KM3579を確立した。
(6)モノクローナル抗体の精製 プリスタン処理した 8週令ヌード雌マウス（BALB/c)に実施例 1 (5)で得られたノヽイブ リドーマ株を 5〜20 X 106細胞/匹それぞれ腹腔内注射した。 10〜21日後、ハイブリド 一マが腹水癌化することにより腹水のたまったマウスから、腹水を採取（1〜8 mL/匹） した。該腹水を遠心分離 (3000rpm、 5分間）し固形分を除去した。精製 IgGモノクロ一 ナル抗体は、力プリル酸沈殿法 [Antibodies - A Laboratory ManuaL, Cold Spring H arbor Laboratory, 1988〕により精製することにより取得した。モノクローナル抗体のサ ブクラスはサブクラスタイピングキットを用いた ELISA法により決定した。モノクローナ ル抗体 KM3566のサブクラスは IgGl、 KM3567のサブクラスは IgGl、モノクローナル抗 体 KM3579は IgG2bであった。
実施例 2
[0119] HB-EGFに対する抗 HB-EGFモノクローナル抗体の反応性
(1)バインディング ELISAにおける HB-EGFとの反応性
実施例 1 (3)に示した方法に従って行なった。 1次抗体には抗 HB-EGFモノクローナ ル抗体 KM3566、 KM3567, KM3579,巿販抗 HB-EGFモノクローナル抗体 MAB259 (R &D社製）、および陰性対照抗体 KM511 (抗 GCSF誘導体モノクローナル抗体)の各精 製抗体を、 10 g/mLから 5倍希釈で段階的に希釈したものを用いた。結果を図 1—1 に示した。
[0120] 抗 HB-EGFモノクローナル抗体 KM3566、 KM3567, KM3579,および MAB259は、い ずれもリコンビナントヒト HB-EGFに反応し、 BSAには全く反応しな力つた。
(2)ウェスタンブロットにおける HB-EGFとの反応性
1レーンあたり、 20ngのリコンビナントヒト HB- EGF (R&D社製）を SDS-ポリアクリルアミド 電気泳動にて分画し、泳動後のゲルを PVDF膜に転写した。該膜を 10% BSA-PBSで ブロッキング後、抗 HB-EGFモノクローナル抗体 KM3566、 KM3567, KM3579, MAB2 59および陰性対照抗体 KM511の精製抗体を、それぞれ 10%BSA-PBSを用いて 1 g/mLに希釈し、室温で 2時間反応させた。該膜を Tween-PBSでよく洗浄した後、希 釈したペルォキシターゼ標識マウスィムノグロブリン (ザィメット社)を、室温で 1時間反 応させた。該膜を Tween- PBSでよく洗净し、 ECL™western blotting detection reagent s (アマシャムファノレマシア社製)を用いてバンドを検出した。 [0121] 抗 HB-EGFモノクローナル抗体 KM3566、 KM3567, KM3579および MAB259はいず れも、リコンビナント分泌型ヒト HB-EGFの分子量に該当する 15〜30キロダルトン（以 下、 kDaと記す)付近のバンドを検出した。
(3)抗 HB- EGFモノクローナル抗体の HB- EGF— EGFR結合阻害活性の評価
抗 HB-EGFモノクローナル抗体 KM3566、 KM3567, KM3579および MAB259の HB- EGF— EGFR結合阻害活性を 32DZEGFR細胞とピオチン標識 HB-EGFを用いて検 B、Jした。
[0122] リコンビナント分泌型 HB- EGFは EZ- Link Sulfo- NHS- Biotin (ピアス社製）を用いて 常法によりビ才チン標識を行った。
KM3566, KM3567, KM3579および MAB259を 10 g/mLより 5倍希釈で段階的に 希釈し、 50 L/ゥエルで 96ゥエルプレートに分注した。その後、 32DZEGFR細胞を 1 X 104個 /50 L/ゥエルで分注した。更に、至適濃度に希釈したピオチン標識 HB-E GFとアレクサ 647標識ストレプトアビジンをそれぞれ 10 μ L/ゥエル、 50 μ L/ゥエルで 分注し、混合後、室温遮光下で 3時間反応させた。レーザー光 633 nm He/Neで 励起される 650 nm〜685 nmの波長を 8200 Cellular Detection System (アプライドバイ ォシステム社製)で測定した。
[0123] その結果、図 1—2に示すように、 KM3566、 KM3567, KM3579および MAB259は、 いずれも抗体濃度依存的に、ピオチンィ匕 HB-EGFの EGFRへの結合を阻害した。従 つて、全ての抗 HB- EGFモノクローナル抗体は、 HB- EGFと EGFRとの結合を阻害す ることが明らかになった。
実施例 3
[0124] HB-EGFに対する抗 HB-EGFモノクローナル抗体の中和活性の検討
抗 HB-EGFモノクローナル抗体 KM3566、 KM3567, KM3579および MAB259の HB- E GF中和活性を、 HB-EGF依存性細胞を用いた細胞増殖阻害アツセィで調べた。 HB -EGF依存性細胞としては、 EGFR遺伝子をマウス骨髄由来細胞株 32D clone3 (ATC C CRL-11346)に導入して造成した細胞株（以下、 32D/EGFRと記す）を用いた。抗 H B-EGFモノクローナル抗体 KM3566、 KM3567, KM3579, MAB259、および陰性対照 抗体 KM511の精製抗体を、それぞれ 20 g/mLより 3〜4倍希釈で段階的に希釈し、 5 0 μ L/ゥエルで 96ゥエルプレートに分注した。次に、 0.1 μ g/mLのリコンビナントヒト ΗΒ -EGF (R&D社)を、 10 L/ゥエルで分注し、混合した後氷上で 2時間反応させた。そ の後、 32D/EGFR細胞を、 1 X 104個 /40 μ L/ゥエルで播種し、 36時間培養した。生細 胞数測定試薬 SF (ナカライテスタ社)を 10 L/ゥエルで添加し、 2時間後に OD450nm の吸光度をプレートリーダー（Emax; Molecular Devices社）を用いて測定した。
[0125] HB-EGF添加、抗体非添加のゥエルの吸光度を阻害率 0%とし、 HB-EGF非添加、 抗体非添加のゥエルの吸光度を阻害率 100%として、各ゥエルの細胞増殖阻害率を 算出した結果を図 2—1に示した。その結果、 KM3566は、細胞株 32D/EGFRに対し て MAB259と同程度の HB-EGF依存性増殖の阻害活性を示した。従って、 2つの抗体 は同程度の HB-EGF中和活性を有していることが明らかになった。一方、 KM3579は 細胞株 32D/EGFRの増殖を全く阻害しな力つたことから、 HB-EGF中和活性を有さな いことが明らかになった。
[0126] 更に、同様にして KM3567の中和活性を検討した結果を図 2— 2に示した。その結 果、 KM3567は、 KM3566と比べて活性は弱いものの、 HB-EGF依存性細胞増殖の阻 害活性を有していた。
実施例 4
[0127] 膜型 HB-EGFに対する抗 HB-EGFモノクローナル抗体の反応性の検討
1〜5 X 105細胞のヒト胃癌細胞株 MKN- 28 (HSRRB JCRB0253)、ヒト卵巣癌 ES- 2 (A TCC CRL- 1978)およびヒト乳癌細胞株 MDA- MB- 231 (ATCC HTB- 26)に、 0.1 % BS A- PBSで各濃度に希釈した抗 HB- EGFモノクローナル抗体 KM3566、 KM3567, KM3 579、 MAB259、および陰性対照抗体 KM511を加え、混合して全量を 50 しとした。こ れらの細胞懸濁液を、氷上で 40分間反応後、 0.1% BSA-PBSで 3回洗浄を行った。該 細胞に、 0.1 % BSA- PBSで希釈調製した FITC標識ャギ抗マウス IgG + IgM (H+L)ポリ クローナル抗体（Kirkegaard & Perry Laboratories社）を 50 μ L添加し、氷冷下 40分間 反応させた。 0.1 % BSA-PBSで洗浄を行った後、 0.1 % BSA-PBSに懸濁してフローサ イトメーター (コールター社製)用いて、蛍光強度を測定した。
[0128] 図 3に、 ΜΚΝ- 28および ES- 2に、上記モノクローナル抗体を 20 μ g/mLから 2倍希釈 で反応させた場合の平均蛍光強度 (MFI値)を示す。図 4に、ヒト乳癌細胞株 MDA-M B-231に、上記モノクローナル抗体を 20 g/mLで反応させた場合のヒストグラムを示 す。その結果、 MKN-28については KM3566、 KM3579の結合活性が認められ、また E S-2では、 KM3566>KM3579の順で結合活性が認められた。更に、 MDA-MB-231で は KM3566>KM3567 KM3579の順で結合活性が認められた。また、いずれの細胞 についても MAB259の MFI値は陰性対照抗体 KM511および抗体非添加陰性対照と 同程度であり、細胞への結合がほとんど認められな力つた。以上より、モノクローナル 抗体 KM3566、 KM3567および KM3579は、癌細胞株の膜型および細胞膜に結合した HB-EGFに結合することが明ら力となった。
実施例 5
抗 HB- EGFモノクローナル抗体の可変領域をコードする cDNAの単離、解析
(1)抗 HB- EGFモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ細胞からの mRNAの調製 実施例 1に記載のハイプリドーマ KM3566より、 RNAeasy Maxi kit (QIAGEN社製）お よび OligotexTM- dT30〈Super〉mRNA Purification Kit (Takara社製）を用いて、添付 の使用説明書に従い、ハイプリドーマ細胞 5 X 107細胞より約 4.8 gの mRNAを調製し た。
(2)抗 HB-EGFモノクローナル抗体 KM3566の H鎖および L鎖可変領域の遺伝子クロ 一ユング
実施例 5 (1)で取得した抗 HB- EGFモノクローナル抗体 KM3566の mRNAの 1 μ gか ら、 BD SMARTTM RACE cDNA Amplification Kit (BD Biosciences社製）を用いて、 添付の使用説明書に従い、 5'側にキット添付の BD SMART IITM A Oligonucleotide 配列を有する cDNAを取得した。その cDNAを铸型として、キット添付のユニバーサル プライマー Amixと、配列番号 6で表される塩基配列を有するマウス Ig( γ )特異的ブラ イマ一とを用いて PCR反応を行 、、 VHの cDNA断片を増幅した。また Ig ( y )特異的プ ライマーの代わりに配列番号 7で表される塩基配列を有するマウス Ig( κ )特異的ブラ イマ一を用いて PCRを行い、 VLの cDNA断片を増幅した。 PCRは、 94°Cで 5分間加熱 後、 94°Cで 30秒間、 72°Cで 3分間からなる反応サイクルを 5回、 94°Cで 30秒間、 70°C で 30秒間、 72°Cで 3分間力 なる反応サイクルを 5回、 94°Cで 30秒間、 68°Cで 30秒間 、 72°Cで 3分間からなる反応サイクルを 30回それぞれ行った後、 72°Cで 10分間反応さ せた。 PCRは PTC- 200 DNA Engine (BioRad社製）を用いて行った。
[0130] 得られた PCR産物をクローニングし、塩基配列を決定するため、ァガロースゲル電 気泳動で分離し、 H鎖、 L鎖各々約 600bpの PCR産物を Gel Extraction Kit (QIAGEN 社製)を用いて抽出した。得られた抽出断片を、 Smalで消化した pBluescriptll SK (-) ベクターに、 Ligation high (東洋紡績社製)を用いて連結した後、コーェンらの方法 [P roc.Natl.Acad.Sci.USA,69, 2110(1972)]により大腸菌 DH5 α株を形質転換した。得ら れた形質転換体より自動プラスミド抽出機 (クラボウ社製)を用いてプラスミドを抽出し 、 BigDye Terminator Cycle sequencing FS Ready Reaction Kit (PEノヽイオンスアムズ 社製）を用い添付の説明書に従って反応後、同社のシーケンサー ABI PRISM3700に よりクロー-ングした PCR産物の塩基配列を解析した。その結果、 cDNAの 5'末端に 開始コドンと推定される ATG配列が存在する、完全長の H鎖 cDNAを含むプラスミド K M3566VH10G2および L鎖 cDNAを含むプラスミド KM3566VL10K2が取得された。 (3)抗 HB-EGFモノクローナル抗体 V領域のアミノ酸配列の解析
プラスミド KM3566VH10G2に含まれて!/、た VHの全塩基配列を配列番号 8に、該配 列から推定された、シグナル配列を含んだ VHの全アミノ酸配列を配列番号 9に、ブラ スミド KM3566VL10K2に含まれていた VLの全塩基配列を配列番号 10におよび該配 列から推定された、シグナル配列を含んだ VLの全アミノ酸配列を配列番号 11にそれ ぞれ示した。既知のマウス抗体の配列データ [SEQUENCES of Proteins of Immunolo gical Interest, US Dept. Health and Human Services (1991) ]との比較、並びに精製し た抗 HB-EGFモノクローナル抗体 KM3566の H鎖及び L鎖の N末端アミノ酸配列をプロ ティンシーケンサー（島津製作所社製： PPSQ-10)を用いて解析した結果との比較か ら、単離した各々の cDNAは分泌シグナル配列を含む抗 HB-EGFモノクローナル抗 体 KM3566をコードする完全長 cDNAであり、 H鎖については配列番号 9に記載のアミ ノ酸配列の 1から 19番目 1S L鎖については配列番号 11に記載のアミノ酸配列の 1か ら 20番目が分泌シグナル配列であることが明ら力となった。
[0131] 次に、抗 HB- EGFモノクローナル抗体 KM3566の VHおよび VLのアミノ酸配列の新 規性について検討した。配列解析システムとして GCG Package (version 9.1、 Genetic s Computer Group社製）を用い、既存のタンパク質のアミノ酸配列データベースを BL ASTP法 [Nucleic Acids Res. ,25, 3389(1997)]により検索した。その結果、 VH、 VLとも に完全に一致するアミノ酸配列は認められず、抗 HB-EGFモノクローナル抗体 KM35 66の VHおよび VLは新規なアミノ酸配列を有していることが確認された。
[0132] また、抗 HB- EGFモノクローナル抗体 KM3566の VHおよび VLの CDRを、既知の抗 体のアミノ酸配列と比較することにより同定した。抗 HB-EGFモノクローナル抗体 KM3 566の VHの CDR1、 CDR2および CDR3のアミノ酸配列を配列番号 12、 13および 14に、 VLの CDR1、 CDR2および CDR3のアミノ酸配列を配列番号 15、 16および 17にそれぞ れ示した。
実施例 6
[0133] 抗 HB-EGFキメラ抗体の作製
( 1)抗 HB- EGFキメラ抗体発現ベクター pKANTEX3566の構築
WO97/10354に記載のヒト化抗体発現用ベクター PKANTEX93と、実施例 5 (2)で得 られたプラスミド KM3566VH10G2および KM3566VL10K2を用いて、抗 HB- EGFキメラ 抗体発現ベクター PKANTEX3566を以下のようにして構築した。
[0134] プラスミド KM3566VH10G2を铸型として lOOng使用し、 10 X KOD緩衝液 10 μ L、 2m mol/L dNTP 10 μ L、 25mmol/Lの塩化マグネシウムを 2 μ 10 μ mol/Lの配列番 号 18および 19記載の塩基配列を有するプライマーをそれぞれ 1 μ L、 KOD polymeras e (東洋紡績社製） 1 μ L、を含む総量 100 Lからなる溶液を、 96°Cで 3分間加熱後、 9 4°Cで 1分間、 55°Cで 1分間、 72°Cで 1分間の反応を 25サイクル、 72°Cで 8分間反応さ せた。この反応によって、 pKANTEX93に挿入するための制限酵素認識配列が付カロ された KM3566の VHをコードする遺伝子配列を合成した。同様に、プラスミド KM3566 VL10K2を铸型として 100ng、 10 X KOD緩衝液 10 μ L、 2mmol/Lの dNTPを 10 μ L、 25 mmol/Lの塩化マグネシウムを 2 μ ^ ΙΟ μ mol/Lの配列番号 20および 21記載の塩基 配列を有するプライマーをそれぞれ 1 μ L、 KOD polymerase (東洋紡績社製） 1 ^ L, を含む総量 100 Lからなる溶液を、 96°Cで 3分間加熱後、 94°Cで 1分間、 55°Cで 1分 間、 72°Cで 1分間の反応を 25サイクル、 72°Cで 8分間反応させた。この反応によって、 PKANTEX93に挿入するための制限酵素認識配列が付加された KM3566の VLをコー ドする遺伝子配列を合成した。それぞれの PCR反応産物をエタノール沈殿することに より精製、濃縮し、 Smalで消化した pBluescriptll SK (-)ベクターにクローユングすること で、 KM3566の VHをコードする遺伝子配列を含むプラスミド pKM3566VHと、 VLをコー ドする遺伝子配列を含むプラスミド PKM3566VLとを取得した。次に、ベクター pKANT EX93と、上記で得られた pKM3566VLに、それぞれ制限酵素 BsiWI (New England Bio labs社製)を加えて 55°Cで 1時間反応後、引き続き制限酵素 EcoRI (TaKaRa社製)を 加えて、 37°Cで 1時間反応させた。その反応液をァガロースゲル電気泳動した後、 QI Aquick Gel Extraction Kit (QIAGEN社製）を用いて、約 12.8kbの pKANTEX93の Eco RI-BsiWI断片および約 0.43kbの VLの、 EcoRI-BsiWI断片をそれぞれ回収した。得ら れた 2種類の断片を Ligation high (東洋紡績社製)を用いて添付の説明書に従って連 結し、得られた組換えプラスミド DNA溶液を用いて大腸菌 DH5 α株 (東洋紡績社製） を形質転換した。形質転換株のクローンより各プラスミド DNAを調製して制限酵素処 理により確認し、 目的の約 0.43kbの EcoRI-BsiWI断片が挿入されたプラスミド ρΚΑΝΤ EX3566VLを取得した。次に、上記で得られた pKANTEX3566VLと pKM3566VHに、 それぞれ制限酵素 Apal (TaKaRa社製)を加えて 37°Cで 1時間反応させた後、さらに制 限酵素 NotI (New England Biolabs社製）をカ卩えて 37°Cで 1時間反応させた。その反応 液をァガロースゲル電気泳動にて分画し、約 13.2kbの pKANTEX3566VLおよび約 0.4 7kbの VHの、 Apal- Notl断片をそれぞれ回収した。得られた 2種類の断片を Ligation High (東洋紡績社製)を用いて添付の説明書に従って連結し、得られた組換えプラス ミド DNA溶液を用いて大腸菌 DH5 a株 (東洋紡績社製)を形質転換した。形質転換 株のクローンより各プラスミド DNAを調製して制限酵素処理により確認し、 目的の約 0. 47kbの Apal- Notl断片が挿入されたプラスミド pKANTEX3566を取得した。該プラスミ ト tこ ¾)して、 BigDye Terminatorし ycle Sequencing Fb Ready Reaction Kit (PEノヽィォ システムズ社製)を用いて、添付の説明書に従って反応後、同社のシーケンサー ABI PRISM3700により塩基配列を解析した。その結果、 目的の KM3566の VHをコードす る cDNA、および VLをコードする cDNAがそれぞれクローユングされた、抗 HB- EGFキ メラ抗体発現ベクター PKANTEX3566を取得した。ベクター構築の概略図を図 5に示 した。
(2)抗 HB-EGFキメラ抗体の動物細胞での発現 上記（1)で得られた抗 HB-EGFキメラ抗体発現ベクター pKANTEX3566を用いて抗 HB- EGFキメラ抗体の動物細胞での発現を、常法 [Antibody Engineering, A Practica 1 Guide.W.H.Freeman and Company(1992)]により行い、抗 HB- EGFキメラ抗体を産生 する形質転 ·ΚΜ3966を取得した。
(3)精製キメラ抗体の取得
上記（2)で得られた形質転換株 ΚΜ3966を、通常の培養法で培養した後、細胞懸 濁液を回収し、 3000rpm、 4°Cの条件で 10分間の遠心分離を行って培養上清を回収 した後、 0.22 μ m孔径 MillexGVフィルター（ミリポア社製）を通して濾過滅菌した。得ら れた培養上清より Protein A High- capacityレジン（Milipore社製）カラムを用いて、添 付の説明書に従い、抗 HB-EGFキメラ抗体 KM3966を精製した。得られた抗 HB-EGF キメラ抗体 KM3966の精製標品の精製度および発現分子サイズを、グラジュェントゲ ル (ATTO社製、 E-T520L)を用いて、添付の説明書に従い、 SDS-PAGEにより確認し た。
[0135] 結果を図 6に示した。精製した抗 HB-EGFキメラ抗体 KM3966は、非還元条件下で は分子量が 150〜200 kDa付近に 1本のバンドが、還元条件下では約 50kDaと約 25k Daの 2本のバンドが認められた。これらの分子量は、 IgGクラスの抗体力 非還元条件 下では分子量は約 150kDaであり、還元条件下では、分子内の S-S結合が切断され、 約 50kDaの分子量の H鎖と、約 25kDaの分子量の L鎖に分解されるという報告 [Antibo dies— A Laboratory Manuau し old Spring Harbor Laboratory ^ Chapter 丄 4 (1988)、 Mo noclonal Antibodies-Principles and Practice^ Academic Press Limited (1996) ]と一致 している。よって、抗 HB-EGFキメラ抗体 KM3966が正しい構造の抗体分子として発現 されて 、ることが確認された。
実施例 7
[0136] 抗 HB-EGFキメラ抗体の活性評価
(1)ヒト固形癌細胞株に対する結合活性
実施例 6で得られた抗 HB-EGFキメラ抗体 KM3966のヒト固形癌細胞株に対する結 合性を評価するため、蛍光抗体法により以下のように検討した。
ヒト卵巣癌細胞株の MCAS (JCRB0240)、 RMG- 1 (JCRB IF050315)、 ES- 2 (CRL197 8)、ヒト乳癌細胞株の MDA- MB- 231 (ATCC HTB- 26)、 T47D (HTB- 133)、 SK-BR-3 (ATCC HTB- 30)、 ZR- 75- 1 (ATCC CRL- 1500)、ヒト胃癌細胞株の MKN- 28 (HSRR B JCRB0253)の各種細胞株を、 0.02%- EDTA Solution (ナカライテスタ社製）で剥離し PBSで洗浄後、 96ゥエル U底プレート（FALCON社製）に、 1〜2 X 105個 /50 μ L/ゥ エルずつ分注した。 1%BSA-PBSで g/mLに調製した抗 HB-EGFキメラ抗体 ΚΜ3 966溶液を、 50 LZゥエルずつ分注してプレートミキサーで攪拌し、氷上に 30分間 静置した。 PBSにより 2回洗浄後、 100倍希釈した 2次抗体 FITC- conjugated AffiniPure F ) 2 Fragment Rabbit Anti-Human IgG、H+L) Qac son Laboratories社製) 、 5 0 LZゥエルずつ添加し、プレートミキサーで攪拌し、遮光して氷上に 30分間静置し た。 PBSで 2回洗浄後、フローサイトメーター EPICS XL System II v3.0 (BECKMAN C OULTER社製)を用いて蛍光強度を測定した。陰性対照抗体としては抗 FGF8キメラ 抗体 KM3034 (US2004-0253234)を用いた。
[0137] 結果を図 7に示した。いずれのヒト固形癌細胞株の膜型および細胞膜に結合した H B- EGFに対しても、抗 HB- EGFキメラ抗体 KM3966は結合した。
(2)抗 HB- EGFキメラ抗体 KM3966のヒト HB- EGFに対する結合活性測定
マウス抗体 KM3566とキメラ抗体 KM3966のヒト HB-EGFに対する結合活性を反応速 度論的に解析するため、ビアコアを用いて結合活性測定を行った。以下の操作は全 て BiacoreT- 100 (Biacore社製）を用いて行った。 HBS- EP Buffer (Biacore社製）を用 いて 5 μ g/mLに調製したヒトHB-EGF (R&D社製）を、ァミンカップリング法により CM5 センサーチップ（Biacore社製）に 80RU (resonance unit)になるように固層化した。その 後 9應 ol/Lから 5段階に希釈した各種抗体を 10 μ LZminの速度でチップ上に流し、 各濃度におけるセンサーグラムを解析し、各抗体のヒト HB-EGFに対する結合速度定 数及び解離速度定数を算出した。
[0138] その結果、両抗体とも本抗体濃度域では、ヒト HB- EGFと結合後、ほとんど解離反 応が認められないことが明らかとなり、解離速度定数については算出できな力つた。 一方で結合速度定数については、算出が可能であり、その結果を表 1に示した。本 結果より、両抗体は、ヒト HB-EGFに対してほぼ同等の結合活性を有することが確認 された。 Ml
抗体 Ka(l/Ms)
KM3566 2.7 X 105
KM3966 2.4 X 10-
(3)細胞膜に結合して 、る HB-EGFに対する抗 HB-EGFモノクローナル抗体の反応 性
細胞株を 0.02%-EDTA Solution (ナカライテスタ社製）で剥離し PBSで洗浄後、 RPMI 1640培地（GIBCO-BRL社製）をカ卩え、 300 G、 5分間遠心して上清を除去した。細胞 に、 0.1%BSA- PBSで希釈したリコンビナントヒト HB- EGF (R&D社製）を 1 μ g/mLで添 加し、 37°Cで 10分間反応させた。リコンビナントヒト HB-EGFを添カ卩しない場合は、 0.1 %BSA-PBSのみを添カ卩し、同様に 37°Cで 10分間反応させた。 1%BSA-PBSにより 2回 洗浄後、 l%BSA-PBSで10 iu g/mLに調製した抗HB-EGFキメラ抗体KM3966溶液を 、 50 LZゥエルで分注してプレートミキサーで攪拌し、氷上に 30分間静置した。 PBS により 2回洗浄後、 100倍希釈した 2次抗体 FITC- conjugated AffiniPure F (ab' ) Frag
2 ment Rabbit Anti-Human Igu (H+Lノ (Jackson Laboratories社:^)を 50 μ LZウエノレず つ添加し、プレートミキサーで攪拌して遮光し、氷上に 30分間静置した。 PBSにより 2 回洗浄後、フローサイトメーター EPICS XL System II v3.0 (BECKMAN COULTER社 製）にて蛍光強度を測定した。陰性対照抗体としては抗 FGF8キメラ抗体 (US2004-02 53234)を用いた。
その結果、全ての細胞株において、リコンビナント HB-EGFを処理した細胞は、処 理して 、な 、細胞に比べて、抗 HB-EGFキメラ抗体 KM3966の反応性が増加した（図 8)。従って、本発明の抗 HB-EGFキメラ抗体 KM3966は、膜型および細胞膜に結合し た HB-EGFの両方に結合することが明らかになった。
(4)ヒト固形癌細胞株に対する中和活性
実施例 6で得られた、抗 HB-EGFキメラ抗体 KM3966の HB-EGFに対する中和活性を 評価するため、 HB-EGF依存性増殖阻害活性を測定した。 HB-EGF依存性細胞とし ては、 HB-EGF陽性ヒト卵巣癌細胞株 RMG-KJCRB IF050315)およびヒト胃癌細胞株 MKN-28 (HSRRB JCRB)を用いた。 [0140] 細胞株を 0.02%-EDTA Solution (ナカライテスタ社製）で剥離し PBSで洗浄後、 RPMI 1640培地 (GIBCO-BRL社製）（無血清）を加え、 300G、 5分間遠心分離して上清を除 去した。同培地で細胞を懸濁後、 RMG-Iは 2.5 X 103個 Z50 μ LZゥエル、 MKN-28は 1 X 104個 /50 μ LZゥエルで 96ゥエルプレートに播種した。 0.1%BSA-PBSで希釈したリ コンビナントヒト HB- EGF (R&D社製）を、 RMG-Iの場合は 3 ng/mLの濃度のものを 50 μ LZゥエル、 MKN- 28の場合は 30ng/mLの濃度のものを 50 μ LZゥエルで添カ卩した 後、抗 HB- EGFキメラ抗体 KM3966を 30 μ g/mLから 10倍で 4段階に希釈し、 50 μ L/ ゥエルで添加して混合した。陰性対照抗体として human IgG (三菱ゥエルファーマ社 製)を用いた。 37°Cで 72時間培養した後、生細胞数測定試薬 WST-1 (ナカライテスタ 社製） 15 μ LZゥエルを添カ卩し、 2時間後に OD450 nmの吸光度をプレートリーダー（E max;MoLecular Devices社製）を用いて測定した。
[0141] 結果を図 9に示した。 RMG- 1、 MKN- 28ともに、 HB-EGF添カ卩による細胞増殖が認め られ、 HB- EGF依存性増殖を示した。抗 HB- EGFキメラ抗体 KM3966は HB- EGF依存 性細胞増殖を抗体濃度依存的に抑制し、中和活性を示した。
(5)抗体依存性細胞傷害活性 (ADCC活性）
実施例 6で得られた抗 HB-EGFキメラ抗体 KM3966の ADCC活性を、以下に示す方 法に従って測定した。
(5)— 1 標的細胞溶液の調製
ヒト卵巣癌細胞株の MCAS、 RMG- 1、 ES-2、ヒト乳癌細胞株の MDA-MB- 231、 T47D 、 SK-BR-3, ZR-75-l、ヒト胃癌細胞株の MKN- 28の各種細胞株を 0.02%-EDTA Solut ion (ナカライテスタ社製)で剥離し、 1% FCS JRH社製）を含むフエノールレッド不含 RP MI1640培地（Invitrogen社製）（以下、 ADCC用培地と記す)で洗浄後、同培地で至適 濃度に調製して標的細胞溶液とした。
(5) - 2 エフェクター細胞溶液の調製
末梢血単核球（Peripheral blood mononuclear celhPBMC)は、健常人末梢血から以 下に示した方法により分離した。へノ^ンナトリウム注 N「シミズ」（清水製薬社製)を少 量含ませたシリンジで健常人末梢血 50mLを採血した。採取した末梢血に同量の生 理食塩水 (メーカー名）を加えて希釈し、良く攪拌した。 15mLチューブ (Greiner社製） に約 6.5mLずつ分注した Polymorphprep (NYCOMED社製）の上に、同量の希釈末梢 血を静かに重層し、室温で 800G、 30分間遠心分離して単核球層を分離した。 ADCC 用培地を用いて 2回洗浄した後、同培地により至適濃度に調製し、エフェクター細胞 溶液とした。
(5) 3 ADCC活性の測定 96ゥエル U底プレート（FALCON社製）の各ゥエルに、 抗体希釈溶液を 50 L分注しておき、（4) 1で調製した標的細胞溶液を 50 L、（4 )—2で調製したエフェクター細胞溶液を 50 L添加して (エフェクター細胞 (E)と標的 細胞 (T)の比は 25とした）、全量を 150 Lとし、 37°Cで 4時間反応させた。標的細胞自 然遊離の値は、標的細胞溶液 50 L、培地 100 Lを加えることにより、また、標的細 胞およびエフェクター細胞自然遊離の値は、標的細胞溶液 50 L、エフェクター細胞 50 レ培地 50 Lをカ卩えることにより取得した。標的細胞全遊離の値は、標的細胞 溶液 L、培地 80 Lを加え、反応終了 45分前に 9%Triton X-100溶液を L添 加することにより取得した。反応後、プレートを遠心分離し、上清中の乳酸デヒドロゲ ナーゼ（LDH)活性を、 LDH- Cytotoxic Test (Wako社製）を用いて、添付説明書に従 つて吸光度を測定することで検出した。 ADCC活性は次式により求めた。
(式）
ADCC活性 (%) = ( [検体の吸光度] [標的細胞およびエフェクター細胞自然遊離 の吸光度]) Z ( [標的細胞全遊離の吸光度] [標的細胞自然遊離の吸光度]) X 10 0
結果を図 10に示した。抗 HB-EGFキメラ抗体 KM3966は HB-EGF陽性ヒト固形癌細 胞株に対して、抗体濃度依存的に細胞傷害活性を示した。
(6)マウスゼノグラフトを用いた抗腫瘍活性評価
実施例 6で得られた抗 HB-EGFキメラ抗体 KM3966の抗腫瘍活性を評価するため、 ヒト卵巣癌、ヒト乳癌のマウスゼノグラフト初期癌および進行癌モデルを用いて評価を 行なった。
(6)— 1 初期癌モデルでの評価
ヒト卵巣癌細胞株の MCASおよび ES- 2を 0.02%- EDTA Solution (ナカライテスタ社製） で剥離し PBSで洗浄後、 RPMI1640培地（GIBCO-BRL社製）をカ卩え、 300G、 5分間遠 心分離して上清を除去した。同培地を加えて遠心分離操作により洗浄後、至適濃度 に調製した細胞懸濁液を SCIDマウス雌 6-8週齢（日本クレア社製)の右脇下にそれぞ れ 100 Lで皮下移植した。同日から、抗体投与群は PBSで希釈した抗体溶液を、コ ントロール群は PBSのみを 100 Lずつ尾静脈投与した（1群 5-7匹)。投与は 1週間に 2回、計 8回行い、腫瘍が観察された時点カゝらノギスで腫瘍径を測定した。腫瘍体積 は以下の式により算出した。
(式） 腫瘍体積 (mm3) =長径 X短径 2 X 0.5
結果を図 11に示した。抗 HB-EGFキメラ抗体 KM3966は、卵巣癌細胞株 MCASおよ び ES-2の腫瘍増殖を有意に阻害した。従って、抗 HB-EGFキメラ抗体 KM3966は、移 初期癌モデルにおいて、抗腫瘍効果を有することが明らかになった。。
(6) - 2 進行癌モデルでの評価
ヒト卵巣癌細胞株の MCASおよび ES- 2、ヒト乳癌細胞株 MDA- MB- 231を 0.02%- ED TA Solution (ナカライテスタ社製）で剥離し PBSで洗浄後、 RPMI1640培地（GIBCO-B RL社製)を加え、 300 G、 5分間遠心して上清を除去した。同培地を加えて遠心分離 操作により洗浄後、至適濃度に調製した細胞懸濁液を SCIDマウス雌 6-8週齢（日本 クレア社製)の右脇下にそれぞれ 100 Lで皮下移植した。経過を観察して、腫瘍体 積が 100mm3前後になった段階でマウスを選抜し、各群の平均腫瘍体積が同等にな るように群分けを行った。同日から、抗体投与群は PBSで希釈した抗体溶液を、コント ロール群は PBSのみを 100 Lずつ尾静脈投与した（1群 6-7匹)。投与は 1週間に 2回 、計 8回行い、抗体投与時点カゝらノギスで腫瘍径を測定した。腫瘍体積は以下の式に より算出した。
(式） 腫瘍体積 (mm3) =長径 X短径 2 X 0.5
結果を図 12に示した。その結果、抗 HB-EGFキメラ抗体 KM3966は、卵巣癌細胞株 MCAS, ES-2および乳癌細胞株 MDA-MB-231の腫瘍増殖を有意に阻害した。従つ て、抗 HB-EGFキメラ抗体 KM3966は、進行癌モデルでおいて、抗腫瘍活性を有する ことが明らかになった。
実施例 8
抗 HB-EGF抗体のヒト血液癌細胞株に対する反応性および抗体依存性細胞傷害活 性 (ADCC活性)の評価
(1)ヒト血液癌細胞株における HB- EGF発現解析
ヒト血液癌細胞株における HB-EGF発現を評価するため、蛍光抗体法により検討し た。ヒト急性骨髄性白血病細胞株の ML- 1 (DSMZ ACC464)、 MOLM-13 (DSMZ AC C554)、 MV- 4- 11 (ATCC CRL9591)、 HL-60 (ATCC CCL- 240)、 NB- 4 (DSMZ AC C207)、 KG- la(ATCC CCL- 246.1)およびヒト T細胞性白血病細胞株の Karpas299 ( DSMZ ACC31)、 Jurkat (RCB RCB0806)を PBSで洗浄後、至適濃度に調製し、 96ゥヱ ル U底プレート（FALCON社製）に 50 μ LZゥエル（約 2 X 105cells)で分注した。 1%BS A- PBSにて 20 μ g/mLに調製した抗 HB- EGFマウス抗体 ΚΜ3566溶液を 50 μ LZゥェ ルを分注してプレートミキサーで攪拌し、氷上に 30分間静置した。 PBSにより 2回洗浄 後、 50倍希釈した 2次抗体 Anti- mouse Igs/FITC Goat F(ab') (DAKO社製)を 50 L
2
Ζゥエルで添加し、プレートミキサーで攪拌して遮光して氷上に 30分間静置した。 ΡΒ Sで 2回洗浄後、フローサイトメーター EPICS XL System II v3.0 (BECKMAN COULTE R社製)を用いて、蛍光強度を測定した。陰性対照抗体としては mouse IgGl (DAKO 社製)を用いた。
結果を図 13に示した。 KM3566は、 T細胞性白血病および急性骨髄性白血病細胞 株に特異的に結合した。従って、ヒト血液癌細胞株おいて、 HB-EGFが発現している ことが確認された。
(2)ヒト血液癌細胞株に対する抗 HB-EGFキメラ抗体の抗体依存性細胞傷害活性 (A DCC活性）
HB-EGF発現が確認された急性骨髄性白血病細胞株に対する、 HB-EGFキメラ抗 体 KM3966の ADCC活性を、以下に示す方法に従って測定した。
(2)— 1 標的細胞溶液の調製
ヒト急性骨髄性白血病細胞株の ML-1、 MOLM-13, MV-4-ll、 HL-60, NB-4およ び KG-laを PBSで洗浄後、 ADCC用培地で洗浄後、同培地で至適濃度に調製して標 的細胞溶液とした。
(2) - 2 エフェクター細胞溶液の調製
末梢血単核球（Peripheral blood mononuclear celhPBMC)は、健常人末梢血から以 下に示した方法により分離した。へノ^ンナトリウム注 N「シミズ」（清水製薬社製)を少 量含ませたシリンジで健常人末梢血 50mLを採血した。採取した末梢血に同量の生 理食塩水 (大塚製薬製)を加えて希釈し、良く攪拌した。 15mLチューブ (Greiner社製 )に約 6.5mLずつ分注した Polymorphprep (NYCOMED社製）の上に、同量の希釈末 梢血を静かに重層し、室温で 800G、 30分間遠心分離して単核球層を分離した。 ADC C用培地を用いて 2回洗浄した後、同培地により至適濃度に調製し、エフェクター細 胞溶液とした。
(2) - 3 ADCC活性の測定
96ゥエル U底プレート（FALCON社製）の各ゥヱルに、抗体希釈溶液を 50 L分注し ておき、（2)— 1で調製した標的細胞溶液を 50 レ（2)— 2で調製したエフェクター 細胞溶液を 50 μ L添加して (エフェクター細胞 (Ε)と標的細胞 (Τ)の比は 25とした）、 全量を 150 Lとし、 37°Cで 4時間反応させた。標的細胞自然遊離の値は、標的細胞 溶液 L、培地 100 Lを加えることにより、また、標的細胞およびエフェクター細胞 自然遊離の値は、標的細胞溶液 50 L、エフェクター細胞 50 L、培地 50 Lをカロえ ることにより取得した。標的細胞全遊離の値は、標的細胞溶液 50 L、培地 80 Lを 加え、反応終了 45分前に 9%Triton X-100溶液を 20 L添加することにより取得した。 反応後、プレートを遠心分離し、上清中の乳酸デヒドロゲナーゼ (LDH)活性を、 LDH -Cytotoxic Test (Wako社製)を用いて、添付説明書に従って吸光度を測定すること で検出した。 ADCC活性は次式により求めた。
(式）
ADCC活性 (%) = ( [検体の吸光度] [標的細胞およびエフェクター細胞自然遊離 の吸光度]) Z ( [標的細胞全遊離の吸光度] [標的細胞自然遊離の吸光度]) X 10 0
結果を図 14に示した。抗 HB-EGFキメラ抗体 KM3966は HB-EGF陽性ヒト血液癌細 胞株に対して、抗体濃度依存的に細胞傷害活性を示した。従って、本発明の抗 EB- EGFモノクローナル抗体および遺伝子組換え抗体力 HB-EGFを発現して 、る卵巣 癌などの固形癌のみならず、急性骨髄性白血病、および T細胞性白血病などの血液 癌に対しても有効な可能性が示唆された。 実施例 9
[0144] 抗 HB- EGFヒト化抗体の作製
(1)抗 HB-EGFヒトイ匕抗体の VHおよび VLのアミノ酸配列の設計
まず、抗 HB-EGFヒト化抗体の VHのアミノ酸配列を以下のようにして設計した。
配列番号 12〜14でそれぞれ表される抗体 VHの CDR1〜3のアミノ酸配列を移植す るためのヒト抗体の VHの FRのアミノ酸配列を選択した。力バットらは、既知の様々なヒ ト抗体の VHをそのアミノ酸配列の相同性から 3種類のサブグループ（HSG Ι〜ΠΙ)に 分類し、更に、それらのサブグループ毎に共通配列を報告している [SEQUENCES of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services(1991)]。 それら共通配列は、ヒトにおいてより免疫原性が低下する可能性が考えられることか ら、それら共通配列を基に抗 HB-EGFヒト化抗体の VHのアミノ酸配列を設計した。よ り結合活性の高 ヽ抗 HB-EGFヒト化抗体を作製するために、設計にあたってはヒト抗 体の VHの 3種類のサブグループの共通配列の FRのアミノ酸配列のうち、抗 HB- EGF マウス抗体 KM3566の VHの FRのアミノ酸配列と最も高!、相同性を有する FRのァミノ 酸配列を選択した。
[0145] 相同性を検索した結果、 HSGI、 HSGIIおよび HSGIIIの相同性はそれぞれ 73.6%、 50.
6%および 56.3%であった。従って、 KM3566の VH領域の FRのアミノ酸配列はサブグル ープ Iと最も高 ヽ相同'性を有して ヽた。
以上の結果から、ヒト抗体の VHのサブグループ Iの共通配列の FRのアミノ酸配列の 適切な位置に抗 HB- EGFマウス抗体 KM3566の VHの CDRのアミノ酸配列を移植した 。し力し、配列番号 9に記載の KM3566の VHのアミノ酸配列中の 74番目の Lysは、力 ノ ノトらがあげるヒト抗体 FRのアミノ酸配列の相当する部位において、最も使用される 頻度が高 ヽアミノ酸残基ではな ヽが、比較的高 ヽ頻度で使用されるアミノ酸残基であ るため、上記の KM3566のアミノ酸配列で認められるアミノ酸残基を用いることとした。 このようにして、配列番号 22で表される抗 HB-EGFヒトイ匕抗体の VHのアミノ酸配列 HV 0を設計した。
[0146] 次に、抗 HB-EGFヒトイ匕抗体の VLのアミノ酸配列を以下のようにして設計した。
配列番号 15〜17でそれぞれ表される抗体 VLの CDR1〜3のアミノ酸配列を移植す るためのヒト抗体の VLの FRのアミノ酸配列を選択した。力バットらは、既知の様々なヒ ト抗体の VLをそのアミノ酸配列の相同性から 4種類のサブグループ（HSG！〜 IV)に 分類し、更に、それらのサブグループ毎に共通配列を報告している [Sequences of Pr oteins of Immunological Interest, Ub Dept. Health ana Human ¾ervices(1991)]。そこ で VHの場合と同様にして、ヒト抗体の VLの 4種類のサブグループの共通配列の FR のアミノ酸配列のうち、抗 HB- EGFマウス抗体 KM3566の VLの FRのアミノ酸配列と最 も高 、相同性を有する FRのアミノ酸配列を選択した。
[0147] 相同性を検索した結果、 HSGI、 HSGII、 HSGIIIおよび HSGIVの相同性はそれぞれ 7 5.0%、 75.0%、 71.3%および 81.3%であった。従って、 KM3566の VLの FRのアミノ酸配列 はサブグループ IVと最も高 、相同性を有して 、た。
以上の結果から、ヒト抗体の VLのサブグループ IVの共通配列の FRのアミノ酸配列 の適切な位置に抗 HB- EGFマウス抗体 KM3566の VLの CDRのアミノ酸配列を移植し た。し力し、配列番号 11に記載の KM3566の VLのアミノ酸配列中の 110番目の Leuは 、力バットらがあげるヒト抗体 FRのアミノ酸配列の相当する部位において、最も使用さ れる頻度が高 ヽアミノ酸残基ではな ヽが、比較的高!ヽ頻度で使用されるアミノ酸残基 であるため、上記の KM3566のアミノ酸配列で認められるアミノ酸残基を用いることとし た。このようにして、配列番号 23で表される抗 HB-EGFヒトイ匕抗体の VLのアミノ酸配列 LV0を設計した。
[0148] 上記で設計した抗 HB-EGFヒトイ匕抗体の VHのアミノ酸配列 HV0および VLのアミノ酸 配列 LV0は、選択したヒト抗体の FRのアミノ酸配列に抗 HB-EGFマウス抗体 KM3566 の CDRのアミノ酸配列のみを移植した配列である。しかし、一般に、ヒト化抗体を作製 する場合には、単なるヒト抗体の FRへのマウス抗体の CDRのアミノ酸配列の移植のみ では結合活性が低下してしまうことが多い。このため、結合活性の低下を回避するた め、ヒト抗体とマウス抗体で異なっている FRのアミノ酸残基のうち、結合活性に影響を 与えると考えられるアミノ酸残基を、 CDRのアミノ酸配列の移植とともに、改変すること が行われている。そこで、本実施例でも、結合活性に影響を与えると考えられる FRの アミノ酸残基を以下のようにして同定した。
[0149] まず、上記で設計した抗 HB-EGFヒトイ匕抗体の VHのアミノ酸配列 HV0および VLの アミノ酸配列 LVOよりなる抗体 V領域 (HV0LV0)の三次元構造をコンピューターモデリ ングの手法を用いて構築した。三次元構造座標作製に関してはソフトウェア AbM (Ox ford Molecular社製）を、三次元構造の表示についてはソフトウェア Pro- Explore (Oxfo rd Molecular社製）、あるいは ViewerLite (Accelrys社製）を用いてそれぞれ添付の使 用説明書に従い、行った。また、抗 HB-EGFマウスモノクローナル抗体 KM3566の V領 域の三次元構造のコンピューターモデルも同様にして構築した。更に、 HV0LV0の V Hおよび VLの FRのアミノ酸配列の中で、抗 HB- EGFマウス抗体 KM3566と異なって!/ヽ るアミノ酸残基を選択し、抗 HB-EGFマウス抗体 KM3566のアミノ酸残基へ改変したァ ミノ酸配列を作製し、同様に三次元構造モデルを構築した。これら作製した抗 HB-E GFマウス抗体 KM3566、 HV0LV0および改変体の V領域の三次元構造を比較し、抗 体の結合活性に影響を与えると予測されるアミノ酸残基を同定した。
その結果、 HV0LV0の FRのアミノ酸残基の中で抗原結合部位の三次元構造を変化 させ、抗体の結合活性に影響を与えると考えられるアミノ酸残基として、 HV0では 9番 目の Ala、 20番目の Val、 30番目の Thr、 38番目の Arg、 41番目の Pro、 48番目の Met、 6 7番目の Arg、 68番目の Val、 70番目の Ile、 95番目の Tyr、および 118番目の Valを、 LV 0では 15番目の Leu、 19番目の Ala、 21番目の Ile、 49番目の Pro、および 84番目の Leu をそれぞれ選択した。これらの選択したアミノ酸残基のうち、少なくとも 1つ以上のアミ ノ酸配列をマウス抗体 KM3566の同じ部位に存在するアミノ酸残基へ改変し、様々な 改変を有するヒト化抗体の VHおよび VLを設計した。具体的には、抗体 VHについて は、配列番号 22で表されるアミノ酸配列の 9番目の Alaを Thrに、 20番目の Valを Leuに 、 30番目の Thrを Argに、 38番目の Argを Lysに、 41番目の Proを Thrに、 48番目の Met を lieに、 67番目の Argを Lysに、 68番目の Valを Alaに、 70番目の lieを Leuに、 95番目の Tyrを Pheに、および 118番目の Valを Leuに置換するアミノ酸改変のうち、少なくとも 1 つの改変を導入した。また、 VLについては、配列番号 23で表されるアミノ酸配列の 15 番目の Leuを Valに、 19番目の Alaを Valに、 21番目の lieを Metに、 49番目の Proを Ser に、および 84番目の Leuを Valに置換するアミノ酸改変のうち、少なくとも 1つの改変を 導入した。
(2)抗 HB- EGFヒト化抗体の VHをコードする cDNAの構築 本実施例 (1)で設計した抗 HB-EGFヒトイ匕抗体の VHのアミノ酸配列 HVOをコードする cDNAを、 PCRを用いて以下のようにして構築した。
[0151] まず、設計したアミノ酸配列と、配列番号 9の 1〜19番目に表される抗 HB-EGFマウ ス抗体 KM3566の H鎖の分泌シグナル配列とを繋げて完全な抗体アミノ酸配列とした 。次に、該アミノ酸配列を遺伝子コドンに変換した。 1つのアミノ酸残基に対して複数 の遺伝子コドンが存在する場合は、抗体の遺伝子の塩基配列に見られる使用頻度 [S EwUENし £S of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Serv iceS(1991)]を考慮し、対応する遺伝子コドンを決定した。決定した遺伝子コドンを繋 げて、完全な抗体 V領域のアミノ酸配列をコードする cDNAの塩基配列を設計し、更 に 5'末端と 3'末端に PCR反応時の増幅用プライマーの結合塩基配列 (ヒトイ匕抗体発 現用ベクターへクローユングするための制限酵素認識配列も含む)を付加した。設計 した塩基配列を 5'末端側から約 100塩基ずつ計 4本の塩基配列に分け (隣り合う塩基 配列は、その末端に約 20塩基の重複配列を有するようにする)、それらをセンス鎖、ァ ンチセンス鎖の交互の順で、合成 DNA (配列番号 24-27)を合成した。
[0152] 各合成 DNA (配列番号 24- 27)を最終濃度が 0.1 μ mol/Lとなるように Lの反応 液にカロえて、 0.5 μ mol/L T3プライマー（Takara Shuzo社製）、 0.5 μ mol/L T7プライ マー（Takara Shuzo社製）および 1単位の KOD polymerase (東洋紡績社製）を用いて 、 KOD polymeraseに添付の使用説明書に従い、 PCRを行った。この際の反応条件は 使用説明書に記された条件 (94°C 30秒間、 50°C 30秒間、 74°C 60秒間のサイクルを 30サイクル）に従った。該反応液をエタノール沈殿した後、滅菌水に溶解し、適当な 制限酵素処理を行った後に、プラスミド pBluescript II SK(- ) (Stratagene社製）に連結 した。このようにして得られた組換えプラスミド DNA溶液を用いて大腸菌 DH5 α株を 形質転換し、形質転換株の株よりプラスミド DNAを調製し、 BigDye Terminator Cycle Sequencing FS Ready Reaction Kit (Applied Biosystems社製）を用いて塩基配列を 解析した結果、 目的の塩基配列を有するプラスミドを取得した。
[0153] 次に、本実施例（1)で設計した FRのアミノ酸残基の改変は、変異を有する合成 DN Aを作製し、上記の PCRを行う力、上記で作製した HV0をコードする cDNAを含むプラ スミド DNAを铸型として変異を有する合成 DNAをプライマーとして PCRを行 ヽ、増幅 遺伝子断片を単離することにより行った。改変後のアミノ酸残基の遺伝子コドンにつ いては、抗 HB-EGFマウス抗体 KM3566に見られる遺伝子コドンとなるように行った。 また、以下、特に記載の無い場合、 94°C 30秒間、 55°C 30秒間、 72°C 60秒間のサイ クルを、 35サイクルの PCR反応で反応させた。 PCR反応は KOD- plus polymerase (TO YOBO社製）を使用して行った。また、使用した合成 DNAはファスマック社製のもので ある。
(3)抗 HB- EGFヒト化抗体の VLをコードする cDNAの構築
本実施例（1)で設計した抗 HB-EGFヒトイ匕抗体の VLのアミノ酸配列をコードする cD NAを、 PCRを用いて以下のようにして構築した。
[0154] まず、設計したアミノ酸配列と、配列番号 11の 1〜20番目に表される抗 HB-EGFマウ ス抗体 KM3566の L鎖の分泌シグナル配列とを繋げて完全な抗体アミノ酸配列とした 。次に、該アミノ酸配列を遺伝子コドンに変換した。 1つのアミノ酸残基に対して複数 の遺伝子コドンが存在する場合は、抗体の遺伝子の塩基配列に見られる使用頻度 [ SEQUENし S of Proteins of Immunological Interest ^ US Dept. Health and Human ber vices (1991) ]を考慮し、対応する遺伝子コドンを決定した。決定した遺伝子コドンを 繋げて、完全な抗体 V領域のアミノ酸配列をコードする cDNAの塩基配列を設計し、 更に 5'末端と 3'末端に PCR反応時の増幅用プライマーの結合塩基配列 (ヒト化抗体 発現用ベクターへクローユングするための制限酵素認識配列も含む)を付加した。設 計した塩基配列を、 5'末端側から約 100塩基ずつ計 4本の塩基配列に分け（隣り合う 塩基配列は、その末端に約 20塩基の重複配列を有するようにする）、それらをセンス 鎖、アンチセンス鎖の交互の順で、合成 DNA (配列番号 28〜31)を合成した。
[0155] 各合成 DNA (配列番号 28〜31)を最終濃度が 0.1 μ mol/Lとなるように Lの反応 液にカロえて、 0.5 μ mol/L T3プライマー（Takara Shuzo社製）、 0.5 μ mol/L T7プライ マー（Takara Shuzo社製）および 1単位の KOD polymerase (東洋紡績社製）を用いて 、 KOD polymeraseに添付の使用説明書に従い、上記（2)と同様に PCRを行った。反 応液をエタノール沈殿した後、滅菌水に溶解し、適当な制限酵素処理を行った後に 、プラスミド pBluescript II SK(- ) (Stratagene社製）に連結した。このようにして得られた 組換えプラスミド DNA溶液を用いて大腸菌 DH5 α株を形質転換し、形質転換株より プラスミド DNAを調製し、 BigDye Terminator Cycle Sequencing FS Ready Reaction Ki t (Applied Biosystems社製)を用いて塩基配列を解析した結果、 目的の塩基配列を 有するプラスミド pBS/LVOを取得した。
[0156] 次に、本実施例（1)で設計した FRのアミノ酸残基の改変は、変異を有する合成 DN Aを作製し、上記の PCRを行う力、上記で作製した LV0をコードする cDNAを含むプラ スミド DNAを铸型として変異を有する合成 DNAをプライマーとして PCRを行 ヽ、増幅 遺伝子断片を単離することにより行った。改変後のアミノ酸残基の遺伝子コドンにつ V、ては、抗 HB-EGFマウス抗体 KM3566で見られる遺伝子コドンとなるように行った。
[0157] 以下に、特に記載の無い場合、 PCR反応は 94°C 30秒間、 55°C 30秒間、 72°C 60秒 間のサイクルを、 35サイクルで、 KOD-plus polymerase (TOYOBO社製）を使用して行 つた。また、使用した合成 DNAはファスマック社製のものを使用した。
(4)抗 HB-EGFヒト化抗体発現ベクターの構築
WO97/10354に記載のヒト化抗体発現用ベクター pKANTEX93の適当な位置に本 実施例（2)および（3)で得られた HV0および LV0をコードするそれぞれの cDNA、ある いはそれらの改変体をコードする cDNAを挿入し、各種抗 HB-EGFヒト化抗体発現べ クタ一を構築した。
(5)抗 HB-EGFヒト化抗体の動物細胞を用いた安定発現および精製抗体の取得 抗 HB-EGFヒト化抗体の動物細胞を用いた安定発現および培養上清力もの抗体の 精製は、実施例 6 (2)および（3)に記載の方法と同様にして行った。
実施例 10
[0158] 抗 HB-EGF抗体の結合ェピトープに関する解析
ヒト HB- EGFに対する抗 HB- EGF抗体 KM3566、 KM3579,及び KM3966の結合ェピ トープについて、下記の解析を行った。
(1)変異型ヒト HB-EGF全長遺伝子導入細胞の造成
抗 HB- EGF抗体 KM3566、 KM3579,及び KM3966はいずれもヒト HB- EGFに反応 し、マウス HB- EGFには交差反応性を示さない。そこで、ヒト HB- EGFの EGF様ドメイン のアミノ酸配列中で、マウス HB-EGFと異なる 10個のアミノ酸を、各々 1個づっマウス 由来のアミノ酸に置換した 10種類の変異型ヒト HB-EGF全長タンパク質 (以下、変異 HB-EGFと記す。）を発現する遺伝子導入細胞を造成し、これらに対する抗 HB-EGF 抗体の結合活性を測定することにより、結合ェピトープの解析を行った。作製した 10 種類の変異 HB-EGFを以下に示す。
(1) N末端より 115番目のフエ-ルァラニンをチロシンに置換した変異 HB-EGF (以下 、 F115Yと表記）
(2) N末端より 122番目のリジンをアルギニンに置換した変異 HB-EGF (以下、 K122Rと 表， C)
(3) N末端より 124番目のパリンをロイシンに置換した変異 HB- EGF (以下、 V124Lと表 記）
(4) N末端より 125番目のリジンをグルタミンに置換した変異 HB-EGF (以下、 K125Qと 表， C)
(5) N末端より 127番目のロイシンをフエ-ルァラニンに置換した変異 HB-EGF (以下、 L127Fと表記）
(6) N末端より 129番目のァラニンをスレオニンに置換した変異 HB-EGF (以下、 A129 Tと表記）
(7) N末端より 133番目のイソロイシンをリジンに置換した変異 HB-EGF (以下、 I133Kと 表， C)
(8) N末端より 135番目のヒスチジンをロイシンに置換した変異 HB-EGF (以下、 H135L と表記）
(9) N末端より 141番目のグルタミン酸をヒスチジンに置換した変異 HB-EGF (以下、 E 141Hと表記）
(10) N末端より 147番目のセリンをスレオニンに置換した変異 HB-EGF (以下、 S147T と表記)。
さらに陽性対照として以下のヒト Zマウスキメラ型 HB-EGF全長遺伝子導入細胞を 造成した。
(11) N末端より 1番目から 49番目までの配列がマウス HB-EGF由来配列、 N末端より 5 0番目から 208番目までの配列がヒト HB-EGF由来配列力も成る、ヒト Zマウスキメラ型 HB- EGF (以下、 pRTHGC- 6と記す。）を作製した。 EGF様ドメインは、全てヒト HB- EG F由来配列である為、陽性対照として用いた。
[0160] 上記の変異 HB- EGFおよびヒト Zマウスキメラ型 HB- EGFの一過性発現用プラスミド は、 目加田らの方法 (J.Bio.Chem., Vol.272, 27084-27090, 1997)を用いて作製した 。マウス LMTK—細胞（ATCC CCL-1.3)は、 100 unit/mL penicillin G、 100 μ g/mL st reptomycin、 10 %ゥシ月台児血清を添カロした Dulbecco' s modified Eagle' s mediumにて 培養した。上記の各発現プラスミドをリン酸カルシウム法によりマウス LMTK-細胞に導 入後、 48時間培養したものを以降の実験に用いた。
[0161] 陰性対照には、ベクターのみをマウス LMTK-細胞に導入した細胞（以下、 mockと 表記）を用いた。
(2)変異 HB-EGF遺伝子導入細胞を用いた抗 HB-EGF抗体の結合活性解析 まず、 1 X 105個の変異 HB-EGF遺伝子導入細胞、ヒト Zマウスキメラ型 HB-EGF遺 伝子導入細胞、および mockに、結合バッファー（Ham' s F12に非必須アミノ酸、 20 m M Hepes-NaOH (pH7.2)、 10 %ゥシ胎児血清を添加したもの）で 2 μ g/mLに希釈した ピオチン標識抗 HB- EGF抗体 (KM3566、 KM3579, KM3966)を 4°C、 2時間反応させた 。反応後、氷冷した洗浄バッファー（PBSに 0.5 mM CaCl、 0.5 mM MgCl、 0.1 %ゥシ
2 2
胎児血清を添カ卩したもの）で 2回洗浄し、続いて 1回 PBS(+) (PBSに 0.5 mM CaCl、 0.5
2 mM MgClを添カ卩したもの）で洗浄した。洗浄した細胞に、 PBS(+)で 1.8%に希釈した
2
ホルムアルデヒド溶液をカ卩え、 4°C、 20分間、細胞を固定した。次に、 PBS(+)で 1回洗 浄した後、グリシン溶液（0.2M- glycine、 lOOmM- Tris, pH 8.1)で 4C、 20分間処理し 、続いて洗浄バッファーで 4°C、 20分間インキュベートした。次に、結合バッファーで 0. 1 μ g/mLに希釈した HRP結合ストレプトアビジンを、 4°C、 1時間反応させ、洗浄バッフ ァ一で 2回洗浄、 PBS(+)で 2回洗浄した。ペルォキシダーゼ検出用キット（ナカライテス ク社製、 ELISA POD基質 OPDキット）を用いて発色を行い、 492nmにおける吸光度を 測定し、細胞に結合した HRP活性を測定した。
[0162] 抗 HB- EGF抗体の各種変異 HB- EGF遺伝子導入細胞、およびヒト Zマウスキメラ型 HB-EGF遺伝子導入細胞に対する吸光度より、 mockに対する吸光度を差し引いた 値を A値とした。
次に、マウス LMTK-細胞の細胞膜上に発現した変異 HB-EGF蛋白の発現量を解 析するため、全ての変異 HB-EGFに等しく結合する抗 HB-EGFゥサギポリクローナル 抗体 (抗体名称； H- 6、ヒト HB-EGFの N末端から 54番目〜73番目までの合成べプチ ドをセファロース CL-6Bに架橋したものをゥサギに免疫感作することにより作製された 抗体、 EMBO J.、 13、 2322-2330、 1994)の変異 HB- EGF遺伝子導入細胞、ヒト Zマ ウスキメラ型 HB-EGF遺伝子導入細胞、および mockに対する吸光度を、上記と同様 の方法により測定した。ただしピオチン標識 H-6抗体は、抗体濃度 10 μ g/mLで使用 した。 H-6抗体の各変異 HB-EGF遺伝子導入細胞およびヒト Zマウスキメラ型 HB-EG F遺伝子導入細胞に対する吸光度より、 mockに対する吸光度を差し引いた値を B値 とした。
[0163] 遺伝子導入細胞の発現量の差を補正する為、 A値を B値で除することにより A/B値 を求めた。抗 HB-EGF抗体の陽性対照 pRTHGC-6に対する A/B値を 100 %とした時 の、各種変異型 HB-EGFに対する A/B値の割合を算出し、これを各種変異 HB-EGF に対する相対的結合活性とした。
結果を図 15に示した。抗 HB- EGFモノクローナル抗体 KM3566は、 pRTHGC-6と比 ベて、 I133K、 H135Lおよび S147Tに殆んど結合しなかった。従って、抗 HB-EGFモノ クローナル抗体 ΚΜ3566は 133番目の I、 135番目の Ηおよび 147番目の Sのアミノ酸を 含むェピトープを認識していることが明らかになった。また、同一の抗体可変領域を 有する抗 HB- EGFキメラ抗体 ΚΜ3966も、抗 HB- EGFモノクローナル抗体 ΚΜ3566と同 様に、 pRTHGC-6と比べて、 I133Kおよび H135Lには、殆んど結合せず、 S147Tでは 約 1/3に結合活性が低下した。従って、抗 HB-EGFキメラ抗体 KM3966は、抗 HB-EG Fモノクローナル抗体 KM3566と同様に、 133番目の I、 135番目の Hおよび 147番目の S のアミノ酸を含むェピトープを認識していることが明らかになった。
[0164] 抗 HB- EGFモノクローナル抗体 KM3579は、 pRTHGC-6と比べて、 E141Hのみに結 合せず、他の変異 HB- EGFには全て、 pRTHGC- 6と同等の結合活性を示した。従つ て、抗 HB- EGFモノクローナル抗体 KM3579は、 141番目の Eのアミノ酸を含むェピトー プを認識していることが、明らかになった。
以上の結果から、抗 HB-EGFモノクローナル抗体 KM3566および抗 HB-EGFキメラ 抗体 KM3966と、抗 HB- EGFモノクローナル抗体 KM3579は、 HB- EGFの異なるェピト ープを認識していることが明らかになった。
産業上の利用可能性
本発明により、細胞膜に結合している HB-EGF、膜型 HB-EGFおよび分泌型 HB-E GFに結合するモノクローナル抗体およびその抗体断片が提供される。
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Claims

請求の範囲
[I] 細胞膜に結合して 、るへパリン結合上皮細胞増殖因子様増殖因子 (heparin binding epidermal growth factor-like growth factor 以下、 HB— EGFと称す。）、膜型 HB— EGF および分泌型 HB-EGFに結合するモノクローナル抗体またはその抗体断片。
[2] 細胞膜に結合している HB-EGF、膜型 HB-EGFおよび分泌型 HB-EGFの上皮増殖 因子様ドメイン (EGF様ドメイン）に結合する請求項 1記載のモノクローナル抗体また はその抗体断片。
[3] 分泌型 HB-EGFと HB-EGF受容体との結合を阻害する、請求項 1または請求項 2に記 載のモノクローナル抗体またはその抗体断片。
[4] 分泌型 HB-EGFに対して中和活性を有する請求項 1〜3のいずれか 1項に記載のモノ クローナル抗体またはその抗体断片。
[5] 分泌型 HB-EGFと、 HB-EGF受容体またはジフテリアトキシンとの結合領域に結合す る請求項 1〜4のいずれか 1項に記載のモノクローナル抗体またはその抗体断片。
[6] 配列番号 2で表されるアミノ酸配列の 133番目、 135番目、および 147番目のうち、少な くとも 1つのアミノ酸を含むェピトープに結合する請求項 1〜5に記載のモノクローナル 抗体またはその抗体断片。
[7] 配列番号 2で表されるアミノ酸配列の 133番目、 135番目および 147番目のアミノ酸を 含むェピトープに結合する請求項 6に記載のモノクローナル抗体またはその抗体断 片。
[8] 配列番号 2で表されるアミノ酸配列の 141番目のアミノ酸を含むェピトープに結合する 請求項 1〜5記載のモノクローナル抗体またはその抗体断片。
[9] ハイプリドーマ KM3579 (FERM BP-10491)が生産するモノクローナル抗体が結合す るェピトープに結合する請求項 1〜3、 5および 8に記載のモノクローナル抗体またはそ の抗体断片。
[10] ハイプリドーマ KM3567 (FERM BP-10573)が生産するモノクローナル抗体が結合す るェピトープに結合する請求項 1〜7いずれか 1項に記載のモノクローナル抗体または その抗体断片。
[II] ハイプリドーマ KM3566 (FERM BP-10490)が生産するモノクローナル抗体が結合す るェピトープに結合する請求項 1〜7のいずれ力 1項に記載のモノクローナル抗体ま たはその抗体断片。
[12] 抗体の重鎖可変領域（以下、 VHと記す）の相補鎖決定領域 (complementarity deter mining region,以下 CDRと記す） 1、 CDR2および CDR3が、それぞれ配列番号 12、 13 および 14で表されるアミノ酸配列を含み、かつ、抗体の軽鎖可変領域 (以下、 VLと記 す）の CDR1、 CDR2および CDR3が、それぞれ配列番号 15、 16および 17で表されるァ ミノ酸配列を含む、請求項 1〜7および 11のいずれ力 1項に記載のモノクローナル抗 体またはその抗体断片。
[13] モノクローナル抗体力 遺伝子組換え抗体である、請求項 1〜12のいずれ力 1項に記 載の抗体またはその抗体断片。
[14] 遺伝子組換え抗体が、ヒト型キメラ抗体、ヒト化抗体およびヒト抗体から選ばれる、請 求項 13に記載の抗体またはその抗体断片。
[15] ヒト型キメラ抗体の VH力 配列番号 9で表されるアミノ酸配列を含み、かつ、 VL力 配 列番号 11で表されるアミノ酸配列を含む、請求項 14に記載のヒト型キメラ抗体または その抗体断片。
[16] ヒト化抗体の VH力 配列番号 22で表されるアミノ酸配列または配列番号 22で表され るアミノ酸配列の 9番目の Alaを Thrに、 20番目の Valを Leuに、 30番目の Thrを Argに、 3 8番目の Argを Lysに、 41番目の Proを Thrに、 48番目の Metを lieに、 67番目の Argを Ly sに、 68番目の Valを Alaに、 70番目の lieを Leuに、 95番目の Tyrを Pheに、および 118番 目の Valを Leuに置換する改変力も選ばれる少なくとも 1つの改変が導入されたァミノ 酸配列を含み、かつ、
ヒトイ匕抗体の VLが、配列番号 23で表されるアミノ酸配列または配列番号 23で表される アミノ酸配列の 15番目の Leuを Valに、 19番目の Alaを Valに、 21番目の lieを Metに、 49 番目の Proを Serに、および 84番目の Leuを Valに置換する改変から選ばれる少なくとも 1つの改変が導入されたアミノ酸配列を含む、請求項 14に記載のヒト化抗体またはそ の抗体断片。
[17] 抗体断片が、 Fab、 Fab'、 F(ab')、一本鎖抗体（scFv)、二量体化 V領域（Diabody)、
2
ジスルフイド安定化 V領域 (dsFv)および CDRを含むペプチド力も選ばれる抗体断片 である請求項 1〜16のいずれ力 1項に記載の抗体断片。
[18] 請求項 1〜17のいずれか 1項に記載の抗体またはその抗体断片をコードする DNA。
[19] 請求項 18に記載の DNAを含有する組換え体ベクター。
[20] 請求項 19に記載の組換え体ベクターを宿主細胞に導入して得られる形質転換体。
[21] 請求項 20に記載の形質転換体を培地で培養し、培養物中に請求項 1〜 17のいずれ 力 1項に記載の抗体またはその抗体断片を生成蓄積させ、培養物力 該抗体または 該抗体断片を採取することを特徴とする請求項 1〜17のいずれか 1項に記載の抗体 またはその抗体断片の製造方法。
[22] 請求項 1〜17のいずれか 1項に記載の抗体またはその抗体断片を有効成分として含 有する医薬。
[23] 請求項 1〜17のいずれか 1項に記載の抗体またはその抗体断片を有効成分として含 有する、 HB-EGFが関与する疾患の治療剤。
[24] HB-EGFが関与する疾患が癌である、請求項 23に記載の治療剤。
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