WO2007135741A1 - 被検体評価装置および被検体評価方法 - Google Patents

被検体評価装置および被検体評価方法 Download PDF

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WO2007135741A1
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Michihiko Aki
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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/645—Specially adapted constructive features of fluorimeters
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    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/6428—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes"
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    • Y10T—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER US CLASSIFICATION
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    • Y10T436/14—Heterocyclic carbon compound [i.e., O, S, N, Se, Te, as only ring hetero atom]
    • Y10T436/142222—Hetero-O [e.g., ascorbic acid, etc.]
    • Y10T436/143333—Saccharide [e.g., DNA, etc.]

Definitions

  • the present invention relates to a technique for evaluating a subject such as a protein by fluorescence observation.
  • genomic drug discovery in which drug development is efficiently performed using genome information related to nucleotide sequences, gene expression information, and proteins obtained by rapid progress in human genome analysis research. ing.
  • genomic drug discovery we search for genes related to disease based on genome information, and elucidate the mechanism of pathogenesis by analyzing them, and determine target molecules such as proteins that are most effective for treatment. Then, design and synthesis of drug candidates that have medicinal properties for this target molecule. In such processes, the importance of devices that can easily detect target molecules such as proteins is increasing.
  • a technique capable of easily measuring a protein is under development as a proteome analysis technique.
  • the currently established method is the force that is measured by a combination of two-dimensional electrophoresis and a mass spectrometer. This requires a relatively large instrument. Therefore, it is necessary to develop a new technique for grasping the symptoms of a patient in a clinical field such as a hospital laboratory or a bedside.
  • a micrometer-sized groove (microchannel) is formed on a glass or silicon substrate of several centimeters square to form a fine device, in which chemical analysis and reaction are performed. Since liquid and gas samples are flowed into fine channels (several hundred ⁇ m to several ⁇ m wide, several hundred ⁇ m to several ⁇ m deep), the advantages of reducing the amount of sample waste and high-speed processing are achieved. In addition, there is a possibility that even chemical plants can be miniaturized, and this technology is expected to be applied in the bio field.
  • ⁇ TAS is translated as “integrated chemical analysis system”, “micro chemistry 'biochemical analysis system”, etc., and is a chemical analysis system in which sensors, analyzers, etc. are miniaturized. In other words, the functions of the instruments used in the analytical laboratory are integrated on the chip.
  • biochip technology represented by DNA chips (or DNA microarrays) is attracting attention as an effective means for gene analysis.
  • a biochip is a surface of a substrate that is made of glass, silicon, plastic, or other such material.
  • a large number of different analytes made of biopolymers such as DNA and proteins are spotted in high density. It is characterized by simplification of nucleic acid and protein tests in fields such as diagnosis and drug therapy (for example, see Patent Document 1 and Non-Patent Document 1).
  • analyte evaluation technology is often used in which a fluorescent labeling part such as a fluorescent dye is introduced into a protein by some means, and fluorescence is emitted from the fluorescent labeling part by light irradiation.
  • a fluorescent labeling part such as a fluorescent dye
  • devices that analyze protein-protein interactions by measuring the reflectance angle distribution of evanescent light are commercially available, and can be used for proteomic analysis.
  • Evanescent microscopes OLEDUS's BX2 WI-TIRFM, etc.
  • OLEDUS's BX2 WI-TIRFM are also available on the market by observing the state of substance metabolism and how drugs reach each organ by observing fluorescent dyes introduced on the cell surface.
  • These devices are characterized in that they employ a total reflection illumination optical system to excite a fluorescent dye with the generated evanescent light and detect the fluorescence. That is, a sample such as a protein or a cell is fixed to the front surface of the transparent substrate or metal thin film electrode, and excitation light is incident from the back so as to satisfy the total reflection condition.
  • the excitation optical system can be arranged on the back side of the substrate and the fluorescence observation optical system can be arranged on the front side of the substrate, and a work space on the front side of the substrate can be increased.
  • Patent Document 1 JP 2001-235468 A (paragraph numbers 0002 to 0009)
  • Patent Document 2 JP 2005-283560 A (Claims)
  • Non-Patent Document 1 “Journal of America n Chemical Society”, 1997, 119th, p. 8916-8920
  • the conventional measuring apparatus using evanescent light has the following problems. It was.
  • the intensity of evanescent light generated on the surface of a transparent substrate or metal thin film electrode attenuates exponentially as the surface force goes away, and is about one wavelength long (about several hundred nm). If the distance is too high, the strength becomes extremely weak. For this reason, only the fluorescent dye introduced on the cell surface can be excited, the fluorescent dye introduced inside the cell (several hundreds of ⁇ m from the substrate surface) is excited, and the state of substance metabolism and the drug are transferred to each organ. It is a problem that it is impossible to observe the state of penetration.
  • the nucleotide probe method is, for example, as shown in Patent Document 2, in which an attached analyte such as an antibody bound to a gold electrode via a chargeable polymer is attracted to the electrode by applying a potential and applied.
  • an attached analyte such as an antibody bound to a gold electrode via a chargeable polymer is attracted to the electrode by applying a potential and applied.
  • This is a technology that makes use of the property of moving away from the electrode cage (or vice versa).
  • the distance between the fluorescent labeling portion and the carrier can be changed by turning on and off the potential, and light that can excite the fluorescent labeling portion is generated.
  • the fluorescent labeling part When present, for example, when the potential is off, the fluorescent labeling part emits fluorescence, and when the potential is on, the fluorescent labeling part is quenched (taenting), so the on / off cycle of the potential is low.
  • This cut-off condition shows a specific value depending on the molecular weight of the specimen. For example, if the antibody alone is used, the cutoff condition was 2 kHz. Therefore, by specifically binding a protein or the like to the antibody or the like bound to the chargeable polymer, and using the change in the cut-off conditions, it was found that the protein or the like was bound to the antibody or the like.
  • the excitation optical system irradiation fiberscope and its accessories the objective lens of the fluorescence observation optical system, the fiberscope and its accessories, the reference electrode used in the nucleotide probe method, the application electrode, the counter electrode, and its accessories It is necessary to arrange the parts, the fine flow path for handling the specimen, and the accessories (ports, tubes, etc.) in the same space. For this reason, for example, the nucleotide probe method and the fine flow cannot be combined, and there is a problem that it becomes impossible to manufacture a protein detection sensor with high sensitivity and high reproducibility.
  • the present invention solves these problems, and it is possible to evaluate an object at a location far away from the surface of the carrier and to apply the potential to the carrier.
  • the purpose is to provide a subject evaluation technology that can secure a sufficient working space on the academic side.
  • a light irradiation device for emitting fluorescence from a subject a carrier for arranging the subject, and a fluorescence detection device for receiving the fluorescence are provided.
  • a fluorescence detection device for receiving the fluorescence
  • the light irradiation device and the fluorescence detection device are opposite to each other across the carrier, and the light emitted from the light irradiation device can be transmitted to the side where the fluorescence detection device is located.
  • an object evaluation apparatus in which the transmitted light can be emitted by the transmitted light while preventing the transmitted light from directly irradiating the fluorescence detection unit of the fluorescence detection apparatus. .
  • a light irradiation device for emitting fluorescence from a subject
  • a carrier for arranging the subject
  • a fluorescence detection device for receiving the fluorescence
  • the light irradiated from the light irradiation device is transmitted to a certain side of the fluorescence detection device so that the transmitted light does not directly irradiate the fluorescence detection unit of the fluorescence detection device, and the transmitted light does not directly irradiate the subject. Fluorescence is emitted from
  • An object evaluation method including the above is provided.
  • the analyte can adhere to (or adhere to) the carrier, the carrier has a layer made of gold on the surface, and the analyte is fluorescently labeled.
  • the distance between the fluorescent labeling part and the carrier can be changed by the action from the outside, and the action from the outside is caused by electromagnetic influence, chemical influence and biological
  • a group force that is a scientific influence is at least one selected
  • the carrier is an electrode, and the electromagnetic effect is realized by applying a potential difference to the counter electrode
  • the subject is Restricting drugs, proteins, DNA, RNA, antibodies, natural or artificial single-stranded nucleotides, natural or artificial double-stranded nucleotides, abutama, and antibodies with fluorescent labels with proteolytic enzymes Obtained by disassembling Products, organic compounds having an affinity for proteins, biopolymers having an affinity for proteins, complex of these, and any combination thereof, including selected ones
  • the evaluation object is protein, the light irradiation angle, light irradiation intensity and light
  • the salt concentration in the medium, and at least one factor of the group of the adhesion density force of the analyte on the carrier is adjustable (or adjusted), and irradiation from the light irradiation device It is preferred that it can (or will be) done under conditions where no evanescent light is generated!
  • FIG. 1 is a schematic side view of a subject evaluation apparatus according to the present invention.
  • a subject evaluation apparatus includes a light irradiation device for emitting fluorescence from a subject, a carrier for arranging the subject, and a fluorescence detection device for receiving fluorescence, The light emitted from the light irradiation device passes through the carrier and reaches the fluorescence detection device side, which is the fluorescence observation optical system side.
  • the light irradiation device and the fluorescence detection device are on opposite sides of the carrier. It is preferable that the light irradiation device is on the lower side of the carrier and the fluorescence detection device is on the upper side. However, any other arrangement is possible as long as the light irradiation device and the fluorescence detection device are on opposite sides of the carrier. Good.
  • evaluation means presence / absence of a subject, type of subject, amount of subject, location of subject, electromagnetic influence, chemical influence, biological influence. This means qualitatively or quantitatively grasping the behavior of the subject to various effects such as.
  • the carrier used in the conventional object evaluation apparatus cannot transmit light, and since its structure is complicated, it is unexpected that it can be transmitted. Thus, the idea of using transmitted light as excitation light has not been known so far.
  • the transmitted light can be used as excitation light, a sufficient working space can be secured on the fluorescence observation optical system side, and various benefits can be obtained. It has been found that even a carrier having a complicated structure can transmit sufficient light while maintaining its function as a carrier if the film thickness is reduced. If so, the transmitted light should not directly irradiate the fluorescence detection part of the fluorescence detection device. As long as this occurs, when the transmitted light excites the subject to emit fluorescence, the fluorescence can be detected without being disturbed by the transmitted light. At this time, irradiation from the light irradiation device may generate evanescent light. In such a case, there is no problem as long as it does not interfere with the evaluation of the specimen, but it is preferable that conditions that do not generate evanescent light can be selected when the nucleotide probe method described above is employed.
  • the large work space enables, for example, the combination of the nucleotide probe method and the fine flow path.
  • the adoption of the fine flow path reduces the time required for protein detection to the conventional level of about 1Z100. I was able to shorten it.
  • the nucleotide probe method makes it possible to continuously perform the process from fixation to a gold electrode to the process of protein detection in a fine channel. It was found that the reproducibility of protein detection was improved and the required amount of reagent was about lZio.
  • the transmitted excitation light is not attenuated depending on the distance from the substrate thereafter, and is constant regardless of the distance from the substrate surface. Even in this case, fluorescence can be emitted.
  • fluorescence can be emitted.
  • the evanescent light intensity has a drawback that it fluctuates when the refractive index of the medium changes. For example, the analysis of protein-protein interaction in a highly viscous solvent was difficult. Because it is not affected by changes, this kind of consideration is also possible It becomes.
  • the incident angle of the transmitted light with respect to the carrier surface and the relative position between the light irradiation apparatus and the fluorescence detection apparatus are appropriately selected.
  • “Do not irradiate the fluorescence detection unit directly” means that the light irradiated by the light irradiating device may be reflected by another object and irradiate the fluorescence detection unit as indirect light. Needless to say, it is better to have less indirect light. In general, the smaller the amount of transmitted light that irradiates the fluorescence detection section, the lower the background noise required in the subject evaluation.
  • the carrier In order that the light emitted from the light irradiation device can pass through the carrier and reach a certain side of the fluorescence detection device, the carrier needs to transmit the light irradiated by the light irradiation device force.
  • the transmittance which is the ratio of the transmitted light on the side of the fluorescence detection device to the light irradiated from the light irradiation device, but it is preferably at least 20% in practice. Between 20 and 30% is sufficient. As the excitation light, an energy density of 500 WZ3 mm 2 is usually sufficient. This means that when the transmittance is 20 to 30%, the energy of the irradiation light from the light irradiation device may be 1.7 to 2.5 mWZmm 2 . This level of energy is convenient because a portable solid-state laser can be used.
  • any force can be selected as long as it is possible to place an object and use it for evaluation of a desired object.
  • it can.
  • glass, ceramics, plastic, metal, etc. can be used.
  • the above transmittance is 20 to It can be 30%.
  • the shape of the carrier can be arbitrarily selected such as a container and a plate.
  • the carrier itself may be a container, a part of the container, or a substance contained in the container. In the case of a layer, it may have a single layer or a plurality of layer forces.
  • analyte When the analyte can be attached to the carrier, a liquid containing the analyte can be passed over the carrier through the flow path, and the analyte can be attached to the carrier for evaluation. There are many matches.
  • attachment may be any attachment such as physical, chemical, and biological attachment.
  • any attachment can be used as long as it is not contrary to the spirit of the present invention, such as biological bonds, electrostatic bonds, physical adsorption, and chemical adsorption. .
  • a structural portion that can bind to the analyte on the surface of the carrier.
  • a group capable of binding to nucleotides such as a thiol group can be provided on the gold as the analyte binding part.
  • the conductive substance itself is used as a carrier, or a conductive substance layer is provided on the surface of glass, ceramics, plastic, metal, or the like.
  • Such a conductive material may be any material such as a single metal, an alloy, or a laminate thereof. Precious metals represented by gold are chemically stable and can be preferably used.
  • a light irradiation device for irradiating excitation light that excites a subject to emit fluorescence in the present invention and a fluorescence detection device for detecting fluorescence emitted from a fluorescent labeling unit Can be used, but it will be applied to small areas, so 1 Often, it is advantageous to use one or two or more optical fibers.
  • An optical fiber having an inner diameter (diameter) of about 1 ⁇ m to 10 mm can be used.
  • limiting also in the light source used as excitation light Generally visible light is suitable.
  • the light irradiation angle, light irradiation intensity and light irradiation area of the light irradiation device, fluorescence detection angle and fluorescence detection area of the fluorescence detection device, carrier It is preferable that at least one of the following factors can be adjusted: the shape of the substrate, the surface area of the carrier, the salt concentration in the medium used, and the adhesion density force of the analyte on the carrier. If these factors can be adjusted, it may be possible to increase the detection sensitivity in the object evaluation or to estimate the type and amount of the object from the difference in the behavior of the object. In addition, various experiments can be easily performed under fluorescence observation.
  • the subject in the present invention may be appropriately selected according to the purpose of the evaluation.
  • the analyte itself may fluoresce, but may be a substance having a fluorescent label.
  • Specific examples include heme, which is a dye contained in proteins, tributophane tyrosine, which is an amino acid, and drugs, proteins, DNA, RNA, antibodies, natural or artificial single-stranded nucleotide bodies that have a fluorescent label, Natural or artificial double-stranded nucleotides, aptamers, products obtained by limited degradation of antibodies with proteolytic enzymes, organic compounds that have affinity for proteins, and biological organisms that have affinity for proteins A group force consisting of a molecule, a complex thereof, and any combination thereof may be at least one selected.
  • the drug may be considered as the subject, but in some cases the object may be considered as the subject. Think about it.
  • the "nucleotide body” means any one of the group consisting of mononucleotide, oligonucleotide and polynucleotide or a mixture thereof. Such substances are often negatively charged. Single strands or double strands can be used. It is also possible to bind specifically to the analyte by performing hybridization. Proteins, DNA, and nucleotide bodies may be mixed. Biopolymers include those derived from living organisms, processed polymers derived from living organisms, and synthesized molecules. [0044] Here, the above “product” is obtained by subjecting an antibody to limited digestion with a proteolytic enzyme. As long as it meets the gist of the present invention, an antibody Fab fragment or (Fab ') fragment
  • a monoclonal immunoglobulin IgG antibody can be used.
  • a fragment derived from an IgG antibody for example, a Fab fragment or (Fab ′) fragment of an IgG antibody can be used.
  • Fab fragments such as Fab fragments
  • fragments derived from (Fab ′) fragments can also be used.
  • Examples that can be used as organic compounds having high affinity include enzyme substrate analogs such as nicotinamide adenine dinucleotide (NAD), enzyme activity inhibitors, and neurotransmission inhibitors (antagonists).
  • enzyme substrate analogs such as nicotinamide adenine dinucleotide (NAD)
  • enzyme activity inhibitors such as nicotinamide adenine dinucleotide (NAD)
  • enzyme activity inhibitors such as nicotinamide adenine dinucleotide (NAD)
  • enzyme activity inhibitors enzyme activity inhibitors
  • neurotransmission inhibitors antagonists
  • biopolymers having an affinity for proteins include proteins that serve as protein substrates or catalysts, and elemental proteins that constitute molecular complexes.
  • Examples of the antibody drug include "actemra (R) (generic name: tocilizumab) (Chugai Pharmaceutical Co., Ltd.)".
  • actemra tocilizumab
  • tocilizumab tocilizumab
  • those using proteins as analytes for practical use are important and preferable.
  • the fluorescent labeling part known ones can be used. Examples of those that can be suitably used as the fluorescent labeling part in the present invention include indocarboyanin 3 (trade name: Cy3).
  • a method for providing the subject with the fluorescent labeling portion any known method can be selected. For example, a method of introducing by a chemical reaction or a reaction of forming a double-stranded nucleotide from a single-stranded nucleotide can be used. As an example of the latter, an oligonucleotide chain having a fluorescent labeling portion introduced at the 3 ′ end or 5 ′ end can be exemplified.
  • the subject evaluation apparatus includes various subjects such as the presence / absence of a subject, the type of the subject, the amount of the subject, the location of the subject, the electromagnetic influence, the chemical influence, and the biological influence. It can be used for the purpose of qualitatively or quantitatively grasping the behavior of the subject with respect to the influence.
  • the subject includes a fluorescent labeling part, and the fluorescent labeling part and the above-described If the distance to the carrier can be changed, the fluorescence emission is suppressed by the quenching action when the distance to the carrier is small, and when the distance to the carrier is large. Since fluorescence can be emitted, it is possible to obtain information on the presence / absence and type of the subject from the behavior of fluorescence emission and quenching.
  • the behavior of the test object can be grasped from the behavior of fluorescence emission and quenching when an electromagnetic influence is applied.
  • the electromagnetic influence can be realized by using an electrode as a carrier, providing a counter electrode, and applying a potential difference between these electrodes. Electromagnetic effect by applying a potential difference having a constant value, pulse value, step-like value, periodically changing value, or a combination thereof between the carrier and the counter electrode Can be realized.
  • Chemical and biological effects include what happens to cleave bonds, such as covalent bonds and coordination bonds, and inhibits or imparts ionic, hydrophobic or polar interactions. It can be anything.
  • FIG. 1 is a schematic side view of an object evaluation apparatus according to the present invention.
  • a subject evaluation apparatus 1 is configured such that a light irradiation device 2 for emitting fluorescence from a subject and a fluorescence detection device 3 are opposite to each other with a carrier 4 for placing the subject interposed therebetween. It is in.
  • the subject evaluation apparatus 1 is provided in a fine channel 5 having an inlet 51, a channel 52, and an outlet 53, on which a subject (not shown) adheres.
  • the carrier 4 is an electrode, and the potential difference generator 6 is controlled so that a desired potential difference (measured by the voltmeter 101) is generated between the Ag / AgCl / 3M KC1 reference electrode 100 and the carrier 4.
  • the light 8 irradiated from the light irradiation device 2 is transmitted to a certain side of the fluorescence detection device 3, and the transmitted light 9 directly irradiates the fluorescence detection unit of the fluorescence detection device 3. While not doing so, the transmitted light 9 causes the analyte force to also emit fluorescence 10. At this time, Such a preferable aspect of the subject evaluation apparatus according to the present invention can be applied to the present method.
  • Gold was used for the carrier surface of the microchannel with the structure shown in FIG. 1, and a chelate group was provided thereon as an analyte binding part.
  • An aqueous solution containing a nucleotide having a fluorescent labeling portion at one end and a thiol group at the other end was allowed to flow through the fine channel to attach the nucleotide to the surface of the gold carrier.
  • fibroblasts derived from mouse skin (3T3 cells) are fixed on a glass substrate with a cell fixing solution on a glass plate and covered with parafilm so as not to dry.
  • a cell fixing solution on a glass plate and covered with parafilm so as not to dry.
  • Example 2 Although the same observation as in Example 2 was attempted using the same fine flow path as in Example 1, it was impossible because sufficient work space could not be secured on the fluorescence observation optical system side.

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Abstract

　本被検体評価装置は、被検体から蛍光を発光させるための光照射装置と、被検体を配置するための担体と、蛍光を受光するための蛍光検出装置とを備え、担体を挟んで、光照射装置と蛍光検出装置とが互いに反対側にあり、光照射装置から照射された光を蛍光検出装置のある側に透過させることができ、透過光が蛍光検出装置の蛍光検出部を直接照射しないようにしつつ、透過光により被検体から蛍光を発光させることができるようになっている。本装置を使用すれば、蛍光観察によりタンパク質等の被検体を評価する場合に、蛍光観察光学系側に十分な作業空間を確保できるようになる。

Description

明 細 書
被検体評価装置および被検体評価方法
技術分野
[0001] 本発明は、蛍光観察によりタンパク質等の被検体を評価する技術に関する。
背景技術
[0002] 近年、ヒトゲノム解析研究の急速な進展によって得られる塩基配列、遺伝子発現情 報、およびたんぱく質などに関するゲノム情報を利用して、効率的に医薬品の開発を 行う、いわゆるゲノム創薬が進められている。ゲノム創薬ではゲノム情報をもとに、病 気に関係する遺伝子を探し出し、その解析カゝら発病のメカニズムを解明すると共に、 治療に最も有効なたんぱく質等の標的分子を決定する。そのうえで、この標的分子 に対して薬効のある医薬品候補ィ匕合物の設計、合成等を行う。このようなプロセスに お!、て、タンパク質等の標的分子を容易に検出可能な装置の重要性が高まって 、る
[0003] タンパク質を簡便に測定できる技術は、プロテオーム解析技術として発展途上にあ る。現在確立されている方法として、二次元電気泳動と質量分析機の組み合わせで 測定が行われている力 これには比較的大が力りな装置が必要になる。従って、臨床 の現場、たとえば病院の検査室やベッドサイドで患者の症状を把握するためにはあら たな技術の開発が必要とされて 、る。
[0004] 一方、より簡単にタンパク質を解析できる技術としては、 micro— Total Analysis
System —TAS)や Lab— on— a— chipと呼ばれるものが知られている。これは 、数センチメートル角のガラスやシリコンの基板にマイクロメートルサイズの溝 (マイク ロチャネル）を加工して微細な装置となし、その中で化学分析や反応を行うものであ る。液体や気体のサンプルを微細な流路（数百 μ m〜数 μ m幅、数百 μ m〜数 μ m 深)の中に流すため、試料'廃棄物量の低減、高速処理等の利点をもたらし、更に化 学プラントさえも小型化できる可能性があり、この技術のバイオ分野への応用が期待 されている。なお、 μ TASは、「集積化化学分析システム」、「マイクロ化学'生化学 分析システム」等と訳され、センサ、分析装置等を小型化した化学分析システムであ り、分析ィ匕学実験室で使用される機器の機能をチップ上に集約させたものである。
[0005] 中でも、 DNAチップ（または DNAマイクロアレイ）に代表されるバイオチップの技術 は、遺伝子解析に有効な手段として注目されている。バイオチップとは、ガラス、シリ コン、プラスチック等力もなる基板の表面上に、 DNA、タンパク質等の生体高分子か らなる多数の異なった被検体を高密度に整列化してスポットしたもので、臨床診断や 薬品治療等の分野で、核酸やタンパク質の試験を簡素化できるのが特徴である (たと えば特許文献 1、非特許文献 1参照)。
[0006] このような研究、開発においては、何らかの手段によりタンパク質に蛍光色素等の 蛍光標識部を導入し、光の照射によりこの蛍光標識部から蛍光を発光させる被検体 評価技術が多用されている。このような目的のためには、エバネッセント光の反射率 角度分布を測定することで、タンパク質—タンパク質の相互作用を解析する装置 (Bi acore社の Biacore 3000等）が市販されており、プロテオーム解析に貢献している 。また、細胞表面に導入された蛍光色素を観測することで、物質代謝の様子と薬品が 各器官へ到達する様子等を観測するエバネッセント顕微鏡 (OLYMPUS社の BX2 WI—TIRFM等）が市販されている。
[0007] これらの装置は、発生させたエバネッセント光で蛍光色素を励起し、その蛍光を検 出するために、全反射照明光学系を採用していることに特徴がある。すなわち、タン ノ^質または細胞等の試料は、透明基板または金属薄膜電極の表側表面に固定さ れ、裏面から全反射条件を満たすように励起光が入射される。
[0008] このような光学配置では、励起光学系を基板裏側に、蛍光観察光学系を基板表側 に配置することが可能となり、基板表側の作業空間を大きく取ることができる。
特許文献 1：特開 2001— 235468号公報（段落番号 0002〜0009)
特許文献 2：特開 2005 - 283560号公報 (特許請求の範囲）
非特許文献 1 :「ジャーナルォブアメリカンケミカルソサエティ (Journal of America n Chemical Sciety)」， 1997年，第 119卷， p. 8916— 8920
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0009] し力しながら、従来のエバネッセント光を用いた測定装置には、以下の問題があつ た。
[0010] その一つは、透明基板や金属薄膜電極の表面に発生させたエバネッセント光の強 度は、表面力も離れるに従って指数関数的に減衰し、 1波長の長さ (約数百 nm)程 度に離れると、極めて弱い強度になる。このため、細胞表面に導入された蛍光色素し か励起することができず、細胞内部 (基板表面から数百 μ m)に導入された蛍光色素 を励起し、物質代謝の様子や薬品が各器官へ浸透される様子等を観測することはで きないという問題である。
[0011] 他の一つは、基板を金属薄膜電極として使用し、この電極に電位を印加した場合 に、表面に発生させたエバネッセント光の強度がその電極に印加する電位によって 変動するという欠点である。このため、ヌクレオチドプローブ法を用いたタンパク質検 出センサへの適用は不可能であった。
[0012] ヌクレオチドプローブ法とは、例えば特許文献 2に示されるように、金電極に帯電性 ポリマーを介して結合させた付着した抗体等の被検体が電位の印加により電極に引 きつけられ、印加を停止すると電極カゝら離れる性質 (あるいはその逆の性質)を利用 した技術である。この技術によれば、帯電性ポリマーに蛍光標識部を持たせた場合 には、電位のオンオフにより、蛍光標識部と前記担体との間の距離が変化し得、蛍光 標識部を励起できる光が存在する場合には、たとえば、電位がオフのときには、蛍光 標識部が蛍光を発光し、電位がオンのときには、蛍光標識部が消光 (タエンチング） するので、電位のオンオフの周期を低い方力 高い方に掃引させると、もはや蛍光の 発光と消光とを繰り返さなくなる条件 (カットオフ条件)を見出すことができる。このカツ トオフ条件は、被検体の分子量等の大きさに依存して特有な値を示す。たとえば、抗 体のみであれば、カットオフ条件が 2kHzであったもの力 タンパク質が結合した抗体 では 500Hzになる。そこで、帯電性ポリマーに結合させた抗体等に特異的にタンパ ク質等を結合させ、カットオフ条件の変化を利用して、タンパク質等がこの抗体等に 結合したことを見出すことにより、この抗体等に特異的に結合するタンパク質の存在 を見出したり、蛍光の強さから結合したタンパク質の量を評価したりすることが可能と なる。しかしながら、エバネッセント光を利用すると、その強度がその電極に印加する 電位によって変動するため、上記評価が不可能となるのである。 [0013] これらの問題を解決する手段としては、透明基板や金属薄膜電極の表側力 励起 光を入射し、同じ表側に蛍光観察光学系を組み込む光学系が知られているが、励起 光学系と蛍光観察光学系とが、共に表側の空間を占有することになり、作業空間を 大きく取ることができなくなる。具体的には励起光学系の照射用ファイバースコープ およびその付属部品、蛍光観察光学系の対物レンズ、ファイバースコープおよびそ の付属部品、ヌクレオチドプローブ法に用いる参照電極、印加電極、対向電極およ びその付属部品、被検体を取り扱う微細流路およびその付属部品（ポート、チューブ 等）を同一空間に配する必要が出てくる。このため、たとえば、ヌクレオチドプローブ 法と微細流とを組み合わせることができず、高感度、かつ、再現性の高いタンパク質 検出センサを製作できなくなる問題があった。
[0014] 本発明はこれらの問題を解決し、担体表面から遠く離れた場所における被検体の 評価が可能で、担体に電位を印力!]した場合にもその影響がなぐかつ、蛍光観察光 学系側に十分な作業空間を確保できる被検体評価技術を提供することを目的として いる。本発明のさらに他の目的および利点は、以下の説明から明らかになるであろう 課題を解決するための手段
[0015] 本発明の一態様によれば、被検体から蛍光を発光させるための光照射装置と、当 該被検体を配置するための担体と、当該蛍光を受光するための蛍光検出装置とを備 えた、被検体評価装置において、
当該担体を挟んで、当該光照射装置と当該蛍光検出装置とが互いに反対側にあり 当該光照射装置から照射された光を当該蛍光検出装置のある側に透過させること ができ、
当該透過光が当該蛍光検出装置の蛍光検出部を直接照射しないようにしつつ、当 該透過光により当該被検体力 蛍光を発光させることができるようになって 、る 被検体評価装置が提供される。
[0016] 本発明の他の一態様によれば、被検体から蛍光を発光させるための光照射装置と 、当該被検体を配置するための担体と、当該蛍光を受光するための蛍光検出装置と を備え、当該担体を挟んで、当該光照射装置と当該蛍光検出装置とが互いに反対 側にある被検体評価装置を用い、
当該光照射装置から照射された光を、当該蛍光検出装置のある側に透過させ、 当該透過光が当該蛍光検出装置の蛍光検出部を直接照射しないようにしつつ、当 該透過光により当該被検体から蛍光を発光させる
ことを含む被検体評価方法が提供される。
[0017] これらの態様により、担体表面から遠く離れた場所における被検体の評価が可能で 、担体に電位を印力!]した場合にもその影響がなぐかつ、蛍光観察光学系側に十分 な作業空間を確保できる被検体評価技術を提供することができる。
[0018] いずれの態様においても、前記担体に前記被検体が付着することができること (ま たは付着すること)、前記担体が表面に金からなる層を有すること、前記被検体が蛍 光標識部を備え、外部からの作用により、当該蛍光標識部と前記担体との間の距離 が変化し得るようになつていること、前記外部からの作用が、電磁的影響、化学的影 響および生物学的影響力 なる群力 選ばれた少なくとも一つであること、前記担体 が電極であり、対向電極との間に電位差を与えることにより前記電磁的影響が実現さ れること、前記被検体が、蛍光標識部を有する、薬品、タンパク質、 DNA、 RNA、抗 体、天然または人工の 1本鎖のヌクレオチド体、天然または人工の 2本鎖のヌクレオ チド体、アブタマ一、抗体をタンパク質分解酵素で限定分解して得られる産物、タン パク質に対して親和性を有する有機化合物、タンパク質に対して親和性を有する生 体高分子、これらの複合体およびそれらの任意の組み合わせよりなる群力 選ばれ たものを含むこと、前記評価対象がタンパク質であること、前記光照射装置の、光照 射角度、光照射強度および光照射面積、前記蛍光検出装置の蛍光検出角度および 蛍光検出面積、担体の形状、担体の表面積、使用される媒体中の塩濃度、ならびに 、担体上の被検体の付着密度力 なる群の内の少なくとも一つの因子が調整可能で あること (または調整されること）、および、前記光照射装置からの照射がエバネッセン ト光が発生しな 、条件で行われ得ること (または行われること）、が好まし!/、。
発明の効果
[0019] 本発明により、担体表面から遠く離れた場所における被検体の評価が可能で、担 体に電位を印力!]した場合にもその影響がなぐかつ、蛍光観察光学系側に十分な作 業空間を確保できる被検体評価技術を提供することができる。
図面の簡単な説明
[0020] [図 1]本発明に係る被検体評価装置の模式的側面図である。
発明を実施するための最良の形態
[0021] 以下に、本発明の実施の形態を図、実施例等を使用して説明する。なお、これらの 図、実施例等および説明は本発明を例示するものであり、本発明の範囲を制限する ものではない。本発明の趣旨に合致する限り他の実施の形態も本発明の範疇に属し 得ることは言うまでもない。
[0022] 本発明に係る被検体評価装置は、被検体から蛍光を発光させるための光照射装置 と、被検体を配置するための担体と、蛍光を受光するための蛍光検出装置とを備え、 光照射装置から照射された光が担体を透過して、蛍光観察光学系側である蛍光検 出装置のある側に至るようになって!/、る。
[0023] 光照射装置と蛍光検出装置とは、担体を挟んで、互いに反対側にある。担体の下 側に光照射装置があり、上側に蛍光検出装置がある場合が好ましいが、光照射装置 と蛍光検出装置とが担体を挟んで互いに反対側にあれば、その他のどのような配置 でもよい。
[0024] なお、本発明にお ヽて、「評価」とは被検体の有無、被検体の種類、被検体の量、 被検体の存在場所、電磁的影響、化学的影響、生物学的影響等の様々な影響に対 する被検体の挙動等を定性的または定量的に把握することを意味する。
[0025] 従来の被検体評価装置に使用する担体は光を透過させることができず、その構造 も複雑であることから光を透過できるようにすることができるとは思いもよらず、したが つて、透過光を励起光として使用すると言う考え方は、これまで知られていな力つた。
[0026] しかしながら、発想を転換して、もし透過光を励起光として使用できれば、蛍光観察 光学系側に十分な作業空間を確保でき、様々な利益を得ることができるという観点か ら検討した結果、たとえ複雑な構造の担体でも、膜厚を薄くすれば、担体としての機 能を維持しつつ、十分な光を透過させ得ることが見出された。このようになっていれば 、その際、この透過光が、蛍光検出装置の蛍光検出部を直接照射しないようにして おきさえすれば、この透過光が被検体を励起して蛍光を発光させたときに、この透過 光に邪魔されることなく蛍光を検出することが可能となる。なお、このとき、光照射装 置からの照射がエバネッセント光を発生させる場合もあり得る。そのような場合でも被 検体の評価に差し支えない限り問題はないが、上記のヌクレオチドプローブ法を採 用する場合等では、エバネッセント光を発生させない条件を選択できることが好まし い。
[0027] 上記のようにすれば、蛍光観察光学系側に十分な作業空間を確保することが可能 となる。作業スペースが大きく取れることで、たとえば、ヌクレオチドプローブ法と微細 流路を組み合わせることが可能となる、具体的には、微細流路を採用できることにより 、タンパク質の検出に要する時間を従来の約 1Z100に短くできた。また、ヌクレオチ ドプローブ法で、金電極に固定ィ匕する過程から、タンパク質検出の過程までを、微細 流路中で連続的に行えるようになる。タンパク質検出の再現性が向上し、かつ、必要 な試薬量が従来の約 lZioになることが見出された。
[0028] しカゝも、透過した励起光は、その後基板からの距離に依存して減衰することがなぐ 基板表面からの距離によらず一定であるため、被検体が担体力も遠い距離にあって も蛍光を発光させることが可能となる。たとえば、細胞内部に導入された蛍光色素を 励起し、物質代謝の様子と薬品が各器官へ浸透される様子等を観測することが可能 となる。したがって、狙った器官に運搬されるように設計した薬が、実際に運搬される 力どうか検証できるようになり、薬品開発のコストが大幅に減少することが期待される。
[0029] また、エバネッセント光の場合には、基板を金属薄膜電極として使用し、この電極に 電位を印加した場合、印加電位によって、エバネッセント光強度が変動するという欠 点があるが、本発明ではこの問題も解消する。具体的効果としては、このことと作業ス ペースが大きく取れることとで、アレイ型に配置した電極に固定されたヌクレオチドプ ローブのスイッチングを、マルチチャンネル検出器 (たとえば、 CCD)で観測すること が可能となり、これにより、 10〜： LOO種類のタンパク質の同時検出が可能となった。
[0030] 更に、エバネッセント光強度は、媒質の屈折率が変化すると変動する欠点があり、 たとえば粘性の高い溶媒中のタンパク質—タンパク質相互作用解析は困難であった 力 透過励起光の強度は屈折率変化の影響を受けないため、このような検討も可能 となる。
[0031] 蛍光検出装置の蛍光検出部を直接照射しないようにするには、担体面に対する透 過光の入射角度と、光照射装置と蛍光検出装置との相対的位置を適宜選択する。「 蛍光検出部を直接照射しない」とは、光照射装置力 照射された光が他の物体で反 射され、間接光として蛍光検出部を照射することはあり得ることを意味する。この間接 光も少ない方がよいことは言うまでもない。一般的には、蛍光検出部を照射する透過 光の量が少なければ少な ヽほど、要求される被検体評価におけるバックグラウンドノ ィズを低く抑えられる。
[0032] 光照射装置から照射された光が担体を透過して蛍光検出装置のある側に至ること ができるためには、担体が光照射装置力 照射された光を透過することが必要である 力 光照射装置から照射された光が担体を透過して蛍光検出装置のある側に至ると きに通過すべき物体、たとえば、担体を収納する容器があればその容器も光照射装 置から照射された光を透過することが必要であることは言うまでもない。
[0033] 光照射装置から照射された光に対する蛍光検出装置のある側の透過光の割合で ある透過率については特に制限はないが、実用上は少なくとも 20%であることが好ま しい。 20〜30%の間であれば十分である。励起光としては、通常 500 WZ3mm2 のエネルギー密度があれば十分である。このことは、透過率が 20〜30%の場合、光 照射装置からの照射光のエネルギーとしては、 1. 7〜2. 5mWZmm2でよいことを 意味する。この程度のエネルギーであれば、ポータブル型の固体レーザーが使用で きるので便利である。
[0034] 本発明における担体に用いる材料としては、被検体を配置することができ、所望の 被検体の評価に使用できるものであればどのようなものでもよぐ任意のもの力 選択 することができる。例えば、ガラス、セラミックス、プラスチック、金属等を使用できる。タ ンパク質等を付着させる目的からは、公知の金属 (金、プラチナ、チタン等)やセラミツ タス (サファイア等）を含むものを利用することが好ましい。この中でも、金が特に好ま しい。生体高分子を被検体として使用する場合に、担体への付着が容易に行えるか らである。
[0035] その場合、担体として使用する材料の膜厚に留意する必要がある。たとえば、サフ アイァ板の上に金の膜を設けて担体とする場合、金はサファイアとの接着性に欠ける ため、まずサファイア板の上にチタンの層を密着層として設け、その上に、担体作製 中の加熱によりチタン層が金の層まで移動するのを防止するためのプラチナからなる ノリア層を設け、その上に金の層を設ける等の対策が必要となるので、これら材料全 ての膜厚を適切に決めることが重要となる。たとえば、サファイア板の膜厚が 350 /z m 、チタンの膜厚が 5nm、プラチナの膜厚が 5〜： LOnm、金の膜厚が 20〜25nmといつ た構成であれば上記透過率を 20〜30%とすることが可能である。
[0036] この担体は、形状も、容器、板等任意に選択できる。被検体が液状で与えられる場 合には、担体そのものが容器であっても、容器の一部であっても、容器の中に入れら れたものであってもよい。層状の場合は、単層でも複数の層力もなつていてもよい。
[0037] 担体は、被検体が付着することができると、流路を通して被検体を含む液体を担体 上に通して、被検体を担体に付着させ、評価することが可能となるため、好ましい場 合が多い。
[0038] この場合の、「付着」は、物理的、化学的、生物的付着等どのような付着でもよい。
共有結合、配位結合のような化学的結合の他、生物学的結合、静電気的結合、物理 吸着、化学吸着等、本発明の趣旨に反しない限りどのような付着を利用することもで きる。
[0039] この目的のためには、担体の表面に被検体と結合し得る構造部分 (被検体結合部） を設けることも有用である。たとえば金の上にチオール基等のヌクレオチド類と結合し 得る基を被検体結合部として設けることもできる。また、後述する外部からの作用とし て電磁的影響を利用する場合、担体の全部または一部を電極として使用するのが合 理的である。導電性の物質そのものを担体とする場合やガラス、セラミックス、プラス チック、金属等の表面に導電性の物質の層を設けることが考えられる。このような導 電性の物質としては、単金属、合金、それらの積層体等どのようなものでもよい。金に 代表される貴金属は化学的に安定であり、好ましく使用できる。
[0040] 本発明における被検体を励起して蛍光を発光させる励起光を照射するための光照 射装置や蛍光標識部から発光される蛍光を検出するための蛍光検出装置としては 公知のどのようなものを採用してもよいが、微小な領域に適用することになるので、 1 本または 2本以上の光ファイバ一を使用することが有利である場合が多 、。光フアイ バーの内径（直径）としては 1 μ m〜10mm程度のものを使用することができる。励起 光として使用する光源にも制限はないが、一般的には可視光が好適である。
[0041] 上記光照射装置、蛍光検出装置、担体等の機能については、光照射装置の、光 照射角度、光照射強度および光照射面積、蛍光検出装置の蛍光検出角度および蛍 光検出面積、担体の形状、担体の表面積、使用される媒体中の塩濃度、ならびに、 担体上の被検体の付着密度力 なる群の内の少なくとも一つの因子が調整可能であ ることが好ましい。これらの因子が調整可能であれば、被検体評価における検出感度 を上げたり、被検体の挙動の差から、被検体の種類や、その量を推定したりすること が可能になる場合がある。また、蛍光観察下に各種の実験を行うことが容易になる。
[0042] 本発明における被検体は評価の目的に応じて適宜選択すればよい。被検体そのも のが蛍光を発してもよいが、蛍光標識部を持った物質であってもよい。具体例として は、たんぱく質に含まれる色素であるヘム、アミノ酸であるトリブトファンゃチロシンや 、蛍光標識部を備えた、薬品、タンパク質、 DNA、 RNA、抗体、天然または人工の 1 本鎖のヌクレオチド体、天然または人工の 2本鎖のヌクレオチド体、ァプタマ一、抗体 をタンパク質分解酵素で限定分解して得られる産物、タンパク質に対して親和性を有 する有機化合物、タンパク質に対して親和性を有する生体高分子、これらの複合体 およびそれらの任意の組み合わせよりなる群力 選ばれた少なくとも一つを挙げるこ とができる。また、これらのものを含むものでもよい。例えば、細胞中の蛍光標識され た薬品の場合のように、他の物体の一部である場合には、その薬品を被検体と考え ればよ 、が、場合によってはその物体を被検体と考えてもょ 、。
[0043] ここで、本発明にお 、て「ヌクレオチド体」とは、モノヌクレオチド、オリゴヌクレオチド およびポリヌクレオチドよりなる群の 、ずれか一つまたはその混合物を意味する。この ような物質は、マイナスに帯電していることが多い。 1本鎖あるいは 2本鎖を用いること ができる。ノ、イブリダィゼーシヨンすることにより被検体と特異的に結合することもでき る。なお、蛋白質、 DNA、ヌクレオチド体が混在していてもよい。また、生体高分子に は、生体に由来するものの他、生体に由来するものを加工したもの、合成された分子 も含まれる。 [0044] ここで、上記「産物」とは、抗体を蛋白質分解酵素で限定分解して得られるものであ り、本発明の趣旨に合致する限り、抗体の Fabフラグメントまたは (Fab' )フラグメント
2 や抗体の Fab'フラグメントに由来する断片、さらにはその誘導体等どのようなものを 含めることちでさる。
[0045] 抗体としては、たとえば、モノクローナルな免疫グロブリン IgG抗体を使用することが できる。また、 IgG抗体に由来する断片として、たとえば IgG抗体の Fabフラグメントま たは (Fab' )フラグメントを使用することもできる。更に、そのような Fabフラグメントま
2
たは (Fab' )フラグメントに由来する断片などを使用することもできる。蛋白質に対し
2
て親和性を有する有機化合物として使用可能な例を挙げると、ニコチンアミドアデニ ンジヌクレオチド (NAD)等の酵素基質アナログや酵素活性阻害剤、神経伝達阻害 剤 (アンタゴニスト)などがある。蛋白質に対して親和性を有する生体高分子の例とし ては、蛋白質の基質または触媒となる蛋白質、分子複合体を構成する要素蛋白質同 士等を挙げることができる。
[0046] 上記抗体薬品としては、「ァクテムラ (R) (—般名：トシリズマブ）（中外製薬株式会社 )」を例示することができる。上記の中では、実用上タンパク質を被検体とするものが 重要であり、好ましい。
[0047] 上記蛍光標識部としては、公知のものを利用できる。本発明で蛍光標識部として好 適に使用できるものの例を挙げると、インドカルボシァニン 3 (商標 Cy3)などである。 被検体に蛍光標識部を備えさせる方法は、公知の任意の方法力 選択することがで きる。例えば、化学反応によって導入する方法や、 1本鎖ヌクレオチドから 2本鎖ヌク レオチドを形成させる反応を利用することができる。後者の例としては、蛍光標識部を 3 '末端または 5 '末端に導入したオリゴヌクレオチド鎖を例示できる。
[0048] 本発明に係る被検体評価装置は、被検体の有無、被検体の種類、被検体の量、被 検体の存在場所、電磁的影響、化学的影響、生物学的影響等の様々な影響に対す る被検体の挙動等を定性的または定量的に把握する目的で利用することができる。
[0049] 例えば、細胞中に取り込まれた被検体の有無、種類、量、存在場所の情報を得るこ とがでさる。
[0050] また、被検体が蛍光標識部を備え、外部からの作用により、当該蛍光標識部と前記 担体との間の距離が変化し得るようになっていれば、担体との間の距離が小さい場 合には消光作用により蛍光の発光が抑えられ、担体との間の距離が大きい場合には 蛍光を発光させるようにできるため、蛍光の発光と消光の挙動から、被検体の有無や 種類等に関する情報を得ることができる。
[0051] さらには、電磁的影響を与えた場合における蛍光発光および消光の挙動から被検 体の挙動を把握することができる。たとえば、電磁的影響は、担体として電極を使用 し、対向電極を設け、これらの電極間に電位差を与えることにより実現することができ る。担体と対向電極との間に、一定値、パルス値、階段状に変化する値、周期的に変 化する値の内のいずれかまたはその組み合わせの値を有する電位差を与えることに より電磁的影響を実現することができる。
[0052] このような各種の電位差を採用することにより、被検体の伸縮、担体からの脱離、拡 散等の状況を種々の条件で評価することができる。また、比較的簡単に担体力も脱 離するものと脱離しにくいものとを分離して評価することもできる。
[0053] 同様に、化学的影響、生物学的影響等の様々な影響に対する被検体の挙動も把 握し得る。化学的影響や生物学的影響としては、生じている共有結合、配位結合等 の結合を切断することや、イオン的、疎水性または極性的相互作用を阻害しまたは 付与すること等どのようなものでもよ 、。
[0054] 本発明に係る被検体評価方法を、図 1の被検体評価装置の模式図を使用して、例 示的に説明すれば次のようになる。図 1は、本発明に係る被検体評価装置の模式的 側面図である。図 1において、被検体評価装置 1は、被検体から蛍光を発光させるた めの光照射装置 2と、蛍光検出装置 3とが、被検体を配置するための担体 4を挟んで 、互いに反対側にある。被検体評価装置 1は、入り口 51、流路 52および出口 53を持 つ微細流路 5の中に設けられ、その上に（図示されていない)被検体が付着する。担 体 4は電極になっており、 Ag/AgCl/3M KC1参照電極 100と担体 4の間に所望 の電位差 (電圧計 101で測定）が生じるように電位差発生装置 6を制御する。
[0055] このような構成を用いて、光照射装置 2から照射された光 8を、蛍光検出装置 3のあ る側に透過させ、透過光 9が蛍光検出装置 3の蛍光検出部を直接照射しないようにし つつ、透過光 9により被検体力も蛍光 10を発光させるようにする。このとき、上記した ような本発明に係る被検体評価装置についての好ましい態様を本方法に適用するこ とがでさる。
[0056] このようにして、本発明方法を利用すれば、蛍光観察光学系側に十分な作業空間 を確保することができる。また、このため、被検体評価を迅速に行え、蛍光観察下に おける各種の実験や作業が可能になる。更には、従来のエバネッセント光を利用す る技術では不可能であった、担体表面から遠く離れた場所における被検体の評価も 可能になる。また、担体に電位を印加した場合にもその影響がなぐエバネッセント光 を利用する技術の場合のような屈折率変化の影響も防止できる。
実施例
[0057] 次に本発明の実施例および比較例を詳述する。
[0058] [実施例 1]
図 1の構造の微細流路の担体表面に金を用い、その上に被検体結合部としてチォ 一ル基を設けた。この微細流路に、一方の末端に蛍光標識部を持ち、もう一方の末 端にチオール基を持つヌクレオチドを含む水溶液を流し、ヌクレオチドを金担体の表 面に付着させた。
[0059] この状態で、 Ag/AgCl/3M KC1の参照電極に対し ± 200mvの電位差を金担体に 印加し、図 1の被検体評価装置を用いて観察したところ、低周波数では、蛍光の発光 と消光の繰り返しが観察された力 10kHz以上の周波数では消光のみとなつた。
[0060] [実施例 2]
実施例 1と同様の光学系を用 、てガラス板の上にマウスの皮膚由来の線維芽細胞 (3T3細胞）を細胞固定液でガラス基板に固定ィ匕し、乾燥しないようにパラフィルムで 覆い、細胞の高さ方向をスキャンして観察した観察したところ、微細管の細胞内分布 が観察できた。
[0061] [比較例 1]
実施例 2と同様の観察を実施例 1と同様の微細流路を使用して行おうとしたが、蛍 光観察光学系側に十分な作業空間を確保できず、不可能であった。
[0062] [比較例 2]
ガラス板の上にマウスの皮膚由来の線維芽細胞 (3T3細胞）を細胞固定液でガラス 基板に固定ィ匕し、乾燥しないようにパラフィルムで覆い、エバネッセント光を利用した エバネッセント顕微鏡（OLYMPUS社の BX2WI—TIRFM)を使用して観察したと ころ、ガラス基板板近傍の微細管は観察できたが、細胞の高さ方向をスキャンするこ とによる細胞内分布観察はできな力つた。

Claims

請求の範囲
[1] 被検体から蛍光を発光させるための光照射装置と、当該被検体を配置するための 担体と、当該蛍光を受光するための蛍光検出装置とを備えた、被検体評価装置にお いて、
当該担体を挟んで、当該光照射装置と当該蛍光検出装置とが互いに反対側にあり 当該光照射装置から照射された光を当該蛍光検出装置のある側に透過させること ができ、
当該透過光が当該蛍光検出装置の蛍光検出部を直接照射しないようにしつつ、当 該透過光により当該被検体力 蛍光を発光させることができるようになって 、る 被検体評価装置。
[2] 前記担体に前記被検体が付着することができる、請求項 1に記載の被検体評価装 置。
[3] 前記担体が表面に金力 なる層を有する、付記 1または 2に記載の被検体評価装 置。
[4] 前記被検体が蛍光標識部を備え、
外部力 の作用により、当該蛍光標識部と前記担体との間の距離が変化し得るよう になっている、
請求項 1〜3のいずれかに記載の被検体評価装置。
[5] 前記外部力 の作用が、電磁的影響、化学的影響および生物学的影響力 なる群 カゝら選ばれた少なくとも一つである、請求項 4に記載の被検体評価装置。
[6] 前記担体が電極であり、対向電極との間に電位差を与えることにより前記電磁的影 響が実現される、請求項 5に記載の被検体評価装置。
[7] 前記被検体が、蛍光標識部を有する、薬品、タンパク質、 DNA、 RNA、抗体、天 然または人工の 1本鎖のヌクレオチド体、天然または人工の 2本鎖のヌクレオチド体、 アブタマ一、抗体をタンパク質分解酵素で限定分解して得られる産物、タンパク質に 対して親和性を有する有機化合物、タンパク質に対して親和性を有する生体高分子 、これらの複合体およびそれらの任意の組み合わせよりなる群力 選ばれたものを含 む、請求項 1〜6の ヽずれかに記載の被検体評価装置。
[8] 前記評価対象がタンパク質である、請求項 7に記載の被検体評価装置。
[9] 前記光照射装置の、光照射角度、光照射強度および光照射面積、前記蛍光検出 装置の蛍光検出角度および蛍光検出面積、担体の形状、担体の表面積、使用され る媒体中の塩濃度、ならびに、担体上の被検体の付着密度力 なる群の内の少なく とも一つの因子が調整可能である、請求項 1〜8のいずれかに記載の被検体評価装 置。
[10] 前記光照射装置力 の照射がエバネッセント光が発生しない条件で行われ得る、 請求項 1〜9のいずれかに記載の被検体評価装置。
[11] 被検体から蛍光を発光させるための光照射装置と、当該被検体を配置するための 担体と、当該蛍光を受光するための蛍光検出装置とを備え、当該担体を挟んで、当 該光照射装置と当該蛍光検出装置とが互 、に反対側にある被検体評価装置を用 V、 当該光照射装置から照射された光を、当該蛍光検出装置のある側に透過させ、 当該透過光が当該蛍光検出装置の蛍光検出部を直接照射しないようにしつつ、当 該透過光により当該被検体から蛍光を発光させる
ことを含む被検体評価方法。
[12] 前記担体に前記被検体が付着させる、請求項 11に記載の被検体評価方法。
[13] 前記担体が表面に金力もなる層を有する、請求項 11または 12に記載の被検体評 価方法。
[14] 前記被検体が蛍光標識部を備え、
外部力 の作用により、当該蛍光標識部と前記担体との間の距離が変化し得るよう になっている、
請求項 11〜 13の 、ずれかに記載の被検体評価方法。
[15] 前記外部力 の作用が、電磁的影響、化学的影響および生物学的影響力 なる群 力も選ばれた少なくとも一つである、請求項 14に記載の被検体評価方法。
[16] 前記担体が電極であり、対向電極との間に電位差を与えることにより前記電磁的影 響が実現される、請求項 15に記載の被検体評価方法。
[17] 前記被検体が、蛍光標識部を有する、薬品、タンパク質、 DNA、 RNA、抗体、天 然または人工の 1本鎖のヌクレオチド体、天然または人工の 2本鎖のヌクレオチド体、 アブタマ一、抗体をタンパク質分解酵素で限定分解して得られる産物、タンパク質に 対して親和性を有する有機化合物、タンパク質に対して親和性を有する生体高分子 、これらの複合体およびそれらの任意の組み合わせよりなる群力 選ばれたものを含 む、請求項 11〜16のヽずれかに記載の被検体評価方法。
[18] 前記評価対象がタンパク質である、請求項 17に記載の被検体評価方法。
[19] 前記光照射装置の、光照射角度、光照射強度および光照射面積、前記蛍光検出 装置の蛍光検出角度および蛍光検出面積、担体の形状、担体の表面積、使用され る媒体中の塩濃度、ならびに、担体上の被検体の付着密度力 なる群の内の少なく とも一つの因子を調整することを含む、請求項 11〜18のいずれかに記載の被検体 評価方法。
[20] 前記光照射装置力 の照射がエバネッセント光が発生しない条件で行われる、請 求項 11〜 19の 、ずれかに記載の被検体評価方法。
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