WO2007131776A1 - SPEZIES-UNABHÄNGIGE DNA-FINGERPRINT-ANALYSE MIT PRIMER ABGELEITET VON DER NotI - ERKENNUNGSSEQUENZ - Google Patents

SPEZIES-UNABHÄNGIGE DNA-FINGERPRINT-ANALYSE MIT PRIMER ABGELEITET VON DER NotI - ERKENNUNGSSEQUENZ Download PDF

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WO2007131776A1
WO2007131776A1 PCT/EP2007/004317 EP2007004317W WO2007131776A1 WO 2007131776 A1 WO2007131776 A1 WO 2007131776A1 EP 2007004317 W EP2007004317 W EP 2007004317W WO 2007131776 A1 WO2007131776 A1 WO 2007131776A1
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WO
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ggc cgc
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primer
dna
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PCT/EP2007/004317
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Jürgen FRÖHLICH
Jens Pfannebecker
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Johannes Gutenberg-Universität Mainz
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria
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    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers

Definitions

  • the invention relates to a nucleic acid-supported species-independent detection method for biological material which finds application in humans as well as in animals, plants and microorganisms and in particular for genomic fingerprint analysis and elucidation of the relative relationships or ratios of individuals, plant cultivars, Animal breeds and strains of microorganisms is suitable.
  • the present invention further relates to primers and kits for use in the method of the invention.
  • DNA or genome analysis is the most advanced method of determining the identity and relatedness of various individuals.
  • DNA polymorphisms occupy an important position.
  • those genetic markers that could be shown to be genetically coupled to a trait of interest can be used, for example, for cloning genes, for medical diagnostics, as well as for introgression, i. H. the introduction of features or genes of one population into the gene pool of another by repeated crossbreeding and backcrossing.
  • the most commonly used DNA markers are restriction fragment length polymorphisms (RFLP).
  • RFLP restriction fragment length polymorphisms
  • VNTRs variable number of tandem repeats
  • STR is a sequence of two to six base pairs that repeats several times in succession. The total length of the STR is less than 100 bp. The analysis of STR regions is particularly useful in forensics, as even very low DNA concentrations lead to a successful result (Ruitberg et al., Nucleic Acid Res. 29 (2001), 320-322).
  • RAPD-PCR Randomly Amplified Polymorphic DNA-PCR
  • RAPD-PCR allows automated genomic analysis over the above-mentioned RFLP and targeted PCR, as well as the use of a standardized primer set for genomic analysis of a variety of species, without the need for preparatory work such as sequencing.
  • it is not universally applicable and also requires the use of a set of several different primers.
  • the use of a set of up to several hundred primers may be necessary for the performance of genomic analyzes by RAPD-PCR, with the individual primers displaying different polymorphisms and the evaluation being correspondingly complicated.
  • the so-called "ghost bands" occur in the RAPD-PCR in addition to non-specific PCR amplificates, making the results are poorly reproducible. For this reason, the RAPD-PCR is also not recognized for genealogy in court.
  • the object of the present invention was therefore to overcome the disadvantages of the prior art described above.
  • the present invention provides a method for the specific detection of individuals, and in particular for the determination of the degree of relatedness of individual individuals and for the differentiation of individuals of different origin.
  • the present invention relates to a method for detecting nucleic acid species using at least one primer containing a sequence derived from a palindromic, preferably GC-rich, sequence.
  • DNA fingerprint analysis This term is also used below; however, that concludes inventive method not only the detection of DNA species, but also other nucleic acids, such as RNA and genetic elements and viruses.
  • primers containing a sequence derived from a single 8 bp palindromic sequence can be used for species-independent fingerprinting of prokaryotic and eukaryotic organisms and, surprisingly, provide high resolution and good reproducibility ,
  • the identification of bacteria and yeasts up to species or strain level could be achieved reliably; see Examples 3 - 5 and 9 and Figures 2 - 6 and 18 and 19.
  • the inventive method could be used successfully for the elucidation of relationships of different grape varieties; see Example 6 and FIGS. 9 and 10.
  • a differentiation up to the level of the clone could be achieved; see Figures 11 and 12.
  • inventive method was successfully used in the determination of the degree of relationship or the distinction of animals, here laboratory mice; see Example 7 and Figures 13 and 14.
  • method of the invention could also be used successfully for genome typing of human individuals; see example 8 as well as figures 15, 16 and 17.
  • the method according to the invention is capable of detecting and identifying species on the basis of their nucleic acid and of using a primer which has an 8 bp palindromic sequence or binds to such in the genome of the individuals to be examined, to determine the genetic relationship of any pro- and eukaryotic organisms. Due to the surprising universality and the high resolution, the method according to the invention can advantageously be used for the identification of biological material in samples and for the differentiation of microorganisms, for example bacteria and yeast strains or also plant varieties or animal breeds.
  • the present invention relates to the use of at least one first primer for DNA fingerprint analysis, which is characterized in that the at least first primer contains a sequence which is of an 8 bp palindromic and / or preferably GC-rich sequence is derived.
  • oligonucleotide includes an oligomer of ribonucleic acid (RNA) or deoxyribonucleic acid (DNA) or mimetics thereof. These include oligonucleotides composed of naturally occurring nucleobases, sugars, and covalent internucleoside linkages (backbones), as well as oligonucleotides having structures that are not found in nature, but whose function is similar to that occurring naturally.
  • the term "primer" in the context of the present invention encompasses any molecule which contains a sequence which is derived from a preferably 8 bp palindromic sequence and is capable of initiating or supporting a polymerase reaction. It will be appreciated that the primer of the invention preferably has an 8-bp palindromic sequence and / or hybridizes to one contained in a target nucleic acid molecule under conditions which permit the initiation of a polymerase reaction.
  • hybridization conditions can be found in relevant standard works, such as Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Handbook, CSH Press, CoId Spring Harbor, 1989 or Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates and Wiley Interscience, NY (1989 and newer editions). Preferred hybridization conditions are described in the examples.
  • thermostable polymerases are to be used, such as thermostable DNA polymerase for PCR, which are well known in the art. Suitable examples are the thermostable DNA polymerases from Thermus aquaticus, Thermus flavis or Thermococcus litoralis.
  • the polymerases need not be derived from enzyme isolations, but may also be of montenan origin. In this regard, in certain embodiments of the present invention, the performance of a single polymerase reaction is sufficient.
  • labeled primers are used here.
  • NM primer primers derived from the NotI recognition sequence
  • Oenococcus oeni and Pediococcus parvulus have been analyzed by the inventive use of the above -fort primer; see Example 3 or Example 4 and Figures 2 and 3 and Figure 4 and 5.
  • the iVotl primer could also be a kinship analysis with several strains of the yeast Brettanomyces bruxellensis be performed; see example 5 and figures 6 - 8.
  • the descent of various grape varieties of the vine Vitis vinifera vinifera could be demonstrated; see Example 6 and Figures 9 to 12.
  • the Mtfl primers a kinship analysis of laboratory mice (Mus musculus); see Example 7 and FIGS. 13 and 14.
  • the method according to the invention could also be used successfully for genome typing of human individuals (Homo sapiens sapiens); see example 8 as well as figures 15, 16 and 17.
  • a preferred embodiment of the primer is characterized in that the sequence contained in the primer derived from an 8 bp palindromic sequence is the recognition sequence of a restriction endonuclease.
  • This recognition sequence of a restriction endonuclease is particularly preferably the recognition sequence of the restriction endonuclease NotI; see also the examples.
  • the iVbrt recognition sequence (5'-GCGGCCGC-3 ') is less common in the genome of various organisms compared to the recognition sequences of other restriction endonucleases. The sequence is therefore suitable for use as a primer, since according to the invention it is assumed that this will hybridize less frequently with the genomic DNA.
  • the sequence is suitable for use as a PCR primer, as not too many sections on the genomic DNA template are amplified, which would complicate the evaluation of the band pattern after gel electrophoretic separation of the PCR products.
  • the primers according to the invention are preferably selected from the sequences shown in Tables 1 and 2.
  • the iVM recognition sequence consists exclusively of the nucleotides G and C.
  • the present invention also encompasses DNA fingerprinting analyzes using a first and / or second primer having a GC-rich core sequence of 5 to 7 nucleotides, preferably 6 nucleotides.
  • These primers or their core sequences are also particularly preferably derived from the NotI recognition sequence. Accordingly, such a primer described above having a GC-rich core sequence of, for example, only 6 nucleotides is also considered as a first primer for the purposes of the present invention derived from a palindromic sequence, particularly preferably from the recognition sequence of the restriction endonuclease NotI.
  • the primers according to the invention may have a GC content, as indicated for the exemplified primers in Tables 1 and 2.
  • sequences according to the invention can have further linkages, for example with marker molecules and / or nucleotides, at the 5'-end and / or 3'-end.
  • a preferred embodiment of the primer according to the invention is characterized in that at least one further nucleotide is added to the sequence contained in the primer 5 '.
  • a further preferred embodiment of the use according to the invention is characterized in that at least one further nucleotide is added simultaneously or alternatively 3 'to the sequence contained in the primer.
  • the nucleotide attached to the sequence is adenosine monophosphate (A).
  • the 3 'nucleotide (s) attached to the sequence is / are adenosine monophosphate (A), cytidine monophosphate (C), guanosine monophosphate (G) and thymidine monophosphate (T); see also the examples.
  • A adenosine monophosphate
  • C cytidine monophosphate
  • G guanosine monophosphate
  • T thymidine monophosphate
  • the primers according to the invention usually have a length of up to 50 nucleotides, preferably of up to 25 nucleotides, more preferably of 9 to 12 nucleotides and in a particularly preferred embodiment of 10 or 11 nucleotides.
  • the invention can also be carried out with shorter, in particular 8 nucleotide, long primers.
  • any technique may be used in which the polynucleotide sequence is duplicated or copied or copied.
  • the known Amplif ⁇ kations compiler to which the polymerase chain reaction (PCR) counts, sometimes as nested PCR, asymmetric PCR or multiplex PCR performed, or alternative methods, such as the ligase chain reaction (LCR), nucleic acid sequence-based amplification (NASBA), transcription-mediated amplification (TMA) or the transcription-based amplification system (abbreviated TAS, see Kwo et al., Proceedings of the National Academy of Sciences USA 86 (1989), 1173-1177), which proceeds according to the retroviral replication pattern "Sequence replication system” (abbreviated 3SR, see Guatelli et al., Proceedings of the National Academy of Sciences USA 87 (1990), 1874-1878) and the Q-beta replicase system (see Kramer and Lizadi, Nature 339
  • a preferred embodiment of the use according to the invention is therefore characterized in that the DNA to be analyzed is amplified with the at least first primer by polymerase chain reaction (PCR).
  • PCR polymerase chain reaction
  • Preferably applicable PCR conditions are shown in the examples.
  • nucleic acid or polynucleotide sequences according to the present invention may be amplified, such as double-stranded and single-stranded DNA and RNA.
  • the polynucleotide sequence to be amplified may itself be part of a longer polynucleotide sequence, for example part of a gene, a regulatory sequence, a viral or bacterial DNA or RNA sequence, a messenger RNA (m-RNA) or a plasmid.
  • m-RNA messenger RNA
  • the primers are preferably used in a newly developed PCR method according to the invention, the specific amplification of polymorphic DNA-PCR (SAPD-PCR).
  • SAPD-PCR is particularly suitable for determining the genetic relationship of any organisms belonging to the same species. The method can therefore be used for the identification or differentiation of strains or sometimes also species (Brettanomyces bruxellensis).
  • the SAPD-PCR is an inventive development of the principle of the aforementioned RAPD-PCR.
  • SAPD-PCR In the case of SAPD-PCR, unknown regions are likewise amplified on the genomic DNA of the organisms strains, as in RAPD-PCR, but in contrast to RAPD-PCR, specifically selected specific primers are used in SAPD-PCR, ie preferably those described above inventive primer. As with RAPD PCR, only one primer per PCR reaction is used in the SAPD PCR. The primers bind to complementary sites in the genome and cause the amplification of the regions flanking them.
  • sequences contained in the primer according to the invention and directed by palindromic sequences are randomly distributed in the genome and occur approximately once at 50% GC content per 4 n nucleotides, where 4 is the number of nucleotide bases A, T, G and C in the DNA and n represents the number of nucleotides in the recognition sequence. It can be expected that with increasing length of the primers, this specific nucleotide sequence will occur less frequently in a DNA. For the use according to the invention are particularly suitable primers that occur less frequently in the genome of various organisms compared to other nucleotide sequences.
  • the primers according to the invention which contain sequences derived from palindromic sequences (Table 1), are therefore particularly suitable for use in SAPD-PCR, since not too many sections are amplified on the genomic DNA template that the evaluation of the band pattern For example, after gel electrophoretic separation of the PCR products would complicate.
  • the introduction of a so-called “ramp” has proved to be advantageous in carrying out the SAPD-PCR. As a result, in particular the variability of the PCR products can be reduced.
  • the ramp describes the stepwise increase in temperature between annealing (hybrid formation) and elongation (extension) of the primer. The temporal extent of the ramp ensures a more reproducible binding of the primer to the DNA template.
  • An inventive application example of a ramp can be found in Example 2, paragraph 2.2.
  • the implementation of the ramp in connection with the DNA fingerprint method according to the invention leads, for example, after electrophoretic separation of the DNA in agarose gels and subsequent visualization in UV light after staining with ethidium bromide to particularly meaningful and stable fingerprint band patterns; see Figures 1, 2, 4, 7, 9, 13, 15 and 16.
  • the present invention involves the introduction of a ramp in amplification, which is preferably performed as SAPD-PCR.
  • the implementation of a second amplification has proven to be particularly advantageous in SAPD-PCR. This can increase product specificity.
  • the amplification product of the first amplification is used. This is, preferably under Use of specific primers, amplified in the second amplification, the so-called nested SAPD-PCR.
  • a corresponding inventive application example of a nested SAPD-PCR can be found in Example 2, section 2.3. In this way, the occurrence of nonspecific PCR products is minimized (Puig et al., Appl Environ Microbiol 60 (1994), 2963-2970).
  • nested PCR lies in the fact that linear and protein-free DNA fragments are used for amplification, since genomic DNA sometimes can not be denatured 100% and may still be associated with histones even after several purification steps. Also, small amounts of DNA are amplified so that they become recognizable in the agarose gel. Since several areas are amplified simultaneously during (nested) SAPD-PCR, the method counts to the multilocus method. The simultaneous amplification of several gene loci produces a meaningful fingerprint band pattern after electrophoretic separation of the PCR products in agarose gels and subsequent visualization in UV light after staining with ethidium bromide; see Figures 1, 2, 4, 6, 7, 9, 13, 15 and 16.
  • the primer according to the invention is preferably used in a nested SAPD-PCR.
  • the second primer has a longer nucleotide sequence than the first primer.
  • 3 ' is added to the sequence of the second primer over the first primer, an additional nucleotide.
  • This may be adenosine monophosphate (A), cytidine monophosphate (C), guanosine monophosphate (G) or thymidine monophosphate (T) (Table 2).
  • the nested SAPD-PCR As shown in the examples, it has proven to be particularly advantageous to perform no ramp in the second amplification, the nested SAPD-PCR.
  • this comprises an amplification of the DNA to be analyzed by PCR, wherein a first amplification is carried out with a first primer and a second amplification with a second primer.
  • the first amplification is performed with ramp and the second amplification without ramp.
  • the present invention relates to the above-described SAPD-PCR and nested SAPD-PCR, which is not limited to the use of the primers according to the invention, although these are preferred.
  • primer concentrations in the range from 0.1 to 10 ⁇ M preferably in the range from 0.5 to 5 ⁇ M and particularly preferably from 2 ⁇ 1 ⁇ M
  • concentrations in the range of 50-500 ng have proven to be particularly advantageous when carrying out the SAPD-PCR.
  • 50-500 nM template DNA and 1-2 ⁇ M primer are used for the amplification reaction; see example 2, paragraphs 2.2 and 2.3.
  • a PCR accelerator Enhancer Solution P, Peqlab, Q-Solution, Qiagen
  • the reaction carried out without ramp preferably a PCR accelerator (Enhancer Solution P, Peqlab, Q-Solution, Qiagen) is used and the reaction carried out without ramp.
  • the omission of the ramp is advantageous because strain-relevant differences are better expressed.
  • the biggest advantage of nested SAPD-PCR over molecular biological methods of kinship analysis used so far is that it can be applied to all organisms studied so far, even organisms with a highly conserved genome ⁇ Oenococcus oeni), without a large number of randomly chosen primers try (see commercially available RAPD primer kits containing up to more than 500 primers).
  • the kit for the nested SAPD-PCR compares with only 5 to 20 primers and has been successfully used in bacteria, yeasts, plants, animals and humans, ie in pro- and eukaryotic organisms. For the analysis usually 6 primers are sufficient.
  • the inventive method in addition to the SAPD PCR also includes the technique of Sequence Characterized Amplified Region PCR (SCAR-PCR).
  • SCAR-PCR Sequence Characterized Amplified Region PCR
  • the Sequence Characterized Amplified Region (SCAR) analysis was first used by Paran and Michelmore (Paran and Michelmore, Theor. Appl. Genet. 85 (1993), 985-993).
  • SCAR-PCR a specific band is excised from the SAPD gel and the sequence determined. Subsequently, the specific primers flanking the sequence are synthesized, which in turn can be used to identify the corresponding clone or a specific species in a SCAR-PCR.
  • a further great advantage of the DNA fingerprint analysis according to the invention, in particular the nested SAPD-PCR, is that, in contrast to previously used molecular biological methods, it is suitable both for the detection and identification of nucleic acid species in or from any biological material, as well as for Relationship analysis can be applied to any of a variety of organisms groups.
  • the inventive method has been used successfully on bacteria, yeasts, plants, animals and humans, ie prokaryotic and eukaryotic organisms.
  • the use in the determination of various types of tumors is possible.
  • the second primer is a nested primer.
  • the second primer has a longer nucleotide sequence than the first primer.
  • 3 ' is added to the sequence of the second primer over the first primer, an additional nucleotide.
  • This may be adenosine monophosphate (A), cytidine monophosphate (C), guanosine monophosphate (G) or thymidine monophosphate (T).
  • the first primer has one of the sequences given in Table 1.
  • the first or second primer has one of the sequences given in Table 2.
  • the DNA is separated by size on a gel. Fingerprints of comparable resolution and sensitivity can be visualized here with DIG-labeled PCR products directly in the gel without the generally carried out in a known manner transfer of the DNA fragments on membranes (Southern Blot). Thus, the creation of such fingerprints in the simplest way without the use of radioactivity is possible.
  • the amplification products are preferably separated into electrophoresis gels, such as agarose or polyacrylamide gels. These are visualized in the gel, for example by using intercalating substances, and the data are evaluated by direct scanning of the gels using computer assisted data analysis.
  • the present invention also relates to gel electrophoresis agents and methods in which oxic acids of silicon, i. H. Silica or salts thereof, such as sodium silicate or aqueous solutions thereof, may be added to the gel composition.
  • sica is preferably also understood as meaning the salt of the silica or particularly preferably an aqueous solution thereof, such as soda waterglass and silica gel, which is also known under the name "silica gel".
  • alkali metal salts of silicic acid especially sodium silicate.
  • aqueous sodium silicate solution is preferred, but other silicates such as calcium silicate are also known, which may optionally be used according to the invention.
  • Other salts of silicic acid are known, such as olivine, zircon, garnet, thortveitite, kieselgalmei and others which are preferably used in aqueous solution.
  • the present invention relates to the use of any silicic acid or salts and aqueous solutions thereof in gel electrophoresis, in particular in agarose gels for the separation of nucleic acids.
  • the silicas or silicates or aqueous solutions thereof are advantageously before the boiling and according to the invention in a concentration of 0.005% to 0.1% gel added, preferably in a concentration of 0.01% to 0.05% and more preferably in a concentration corresponding to 0.035% sodium silicate in a 1.5% agarose gel solution; see also the examples in paragraph 1.13.
  • the present invention also relates to methods for the detection of nucleic acid molecules in gels, in particular agarose gels using silica.
  • a high resolving power of the gels is of particular interest, such as sequencing gels and in particular DNA or RNA fingerprint gels.
  • this aspect of the present invention is not limited to the use of the above-identified primers, but is generally used in the nucleic acid fingerprint analysis application. Accordingly, the embodiments explained in the present description for the DNA fingerprint analysis according to the invention also relate to the use according to the invention of silica in gels or to gel electrophoretic separation of nucleic acids, without, however, being restricted to the use of the primers described in the preceding aspect of the invention, these are of course preferred. Therefore, the present invention generally relates to gel compositions, preferably comprising agarose, containing silica in the form described above, and preferably in the stated concentration.
  • agarose gel compositions particularly preferred are 0.5% to 2.5% agarose gel compositions, advantageously 1.5% agarose gel compositions, the alkali silicates, preferably sodium silicate as an aqueous solution such as water glass in a concentration of 0.01% to 0.05%, preferably 0.035 % contain.
  • the alkali silicates preferably sodium silicate as an aqueous solution such as water glass in a concentration of 0.01% to 0.05%, preferably 0.035 % contain.
  • gel compositions according to the invention are also encompassed by the term kit as used in the present application.
  • the DNA is made visible by intercalating substances.
  • the DNA is stained with ethidium bromide and visualized under UV light.
  • This staining method is state of the art and described, for example, in Sambrook et al., Supra.
  • Inventive application examples of the visualization of a DNA fingerprint band pattern in UV light after staining with ethidium bromide can be found in Example 1, Section 1.13 and FIGS. 1, 2, 4, 6, 7, 9, 13, 15 and 16.
  • For the Staining of the amplification products in polyacrylamide gels is for example the silver staining; See, for example, Schumacher et al., EMBO J. 2 (1983), 1549-1555.
  • the amplification product is transferred to a membrane as a further or alternative step and made visible by hybridization with a probe.
  • a probe for example, a dot blot or Southern blot can be carried out and the DNA transferred to the membrane can be made visible by hybridization with a probe. Since the primers are part of the amplified DNA, it is also possible simply to detect the bands on the membrane used for the Southern blot.
  • the probe preferably comprises the primer according to the invention. Southern blots and hybridizations with a suitable probe are also known in the art and described, for example, in Sambrook et al., Supra. described.
  • the primer carries a label.
  • the label is a non-radioactive label, in particular digoxigenin, biotin, a fluorescent dye, a dye or a radioactive label, in particular 32 P or 35 S.
  • suitable labels including associated detection systems is known. Fluorescent and chemi- or bioluminescent labels are preferred for reasons of sensitivity and practical handling.
  • the fingerprint analysis according to the invention can advantageously be used for biodiversity studies, genetic relationship studies, taxonomic studies, or in particular in legal medicine, breeding, plant variety protection, gene bank management, diagnostics (eg tumors, mutations, microorganisms), in population genetics or for evolutionary studies.
  • the fingerprint pattern is specific to each strain of a species.
  • the fingerprints can therefore be used for the kinship analysis of closely related organisms / strains and in particular for the performance of paternity tests.
  • Another application of the use according to the invention relates to the field of partnership analysis, and is used, for example, in partnership brokerage.
  • this polymorphisms analyzed which correlate with certain features of a subject and, similar to morphological features regarding facial physiognomy, etc.
  • the present invention relates to one of the above-defined primers, which is preferably suitable for use in accordance with the invention.
  • the primer according to the invention particularly preferably has one of the sequences given in Table 1 or Table 2; see also SEQ ID NOs: 1-20. These primers are preferred examples of the primers used in previous DNA fingerprinting analyzes.
  • one or more primers according to the invention may also be applied to solid supports or membranes, for example to a chip or microarray. Typical support materials are glass, nylon membranes and plastic films. Such products are commonly grouped under the terms “chips” and “arrays” or “microarrays”.
  • the present invention relates to a kit for DNA fingerprint analysis.
  • This preferably comprises the primers according to the invention and / or a gel composition according to the invention and optionally further agents for carrying out a DNA fingerprint analysis according to the invention, for example the required buffers and other reagents for carrying out the amplification reaction.
  • this is for carrying out the SAPD-PCR according to the invention and preferably for carrying out the Nested SAPD-PCR according to the invention, as described above and explained in Example 2, suitable.
  • the kit according to the invention therefore comprises at least a first primer or a first primer S et for performing a first Amplif ⁇ kation and a second, so-called nested primer or a set of such nested primer for performing the second amplification as explained above.
  • the kit according to the invention preferably comprises a manual for carrying out the DNA fingerprint analysis according to the invention or the SAPD or nested SAPD PCR according to the invention.
  • the kit furthermore comprises a polymerase for the amplification of the DNA to be analyzed and, advantageously, an enhancer solution for the nested PCR.
  • the kit according to the invention further comprises a known standard.
  • the kit according to the invention is characterized in a further preferred embodiment in that it additionally comprises a device for carrying out the amplification, for example a PCR machine. Suitable devices are well known in the art.
  • the kit according to the invention further comprises means for evaluating a DNA fingerprint analysis, preferably a computer-assisted evaluation system. Examples Computer-assisted evaluation systems are described in Example 1 under 1.14, 1.15 and in FIGS. 1, 3, 5, 8, 10, 14 and 17.
  • the present invention relates to methods for DNA fingerprint analysis of biological material, for example of humans, animals, plants, microorganisms or viruses, the method comprising the use of the primer or of the kit according to the invention and / or according to the SAPD invention.
  • PCR or nested SAPD-PCR is performed.
  • the method comprises the amplification of the DNA to be analyzed by polymerase chain reaction (PCR).
  • PCR polymerase chain reaction
  • the method according to the invention can in principle be used for the identification and the detection of biological material.
  • Biological material is any material that contains genetic information and / or reproduces itself or that can be reproduced in a biological system. Possible applications of the DNA fingerprint analysis according to the invention, primers and kits result basically from itself.
  • DNA fingerprinting analysis, primers and kits of the invention is of course particularly advantageous in those areas in which issues related to determining the genetic distance or similarity of nucleic acid species play a role, such as biodiversity studies genetic relationship, taxonomic studies or studies in the field of forensic medicine, breeding, plant variety protection, gene bank management, diagnostics, population genetics or evolution.
  • Fig. 1 Gel image evaluation and cluster analysis in the nested SAPD-PCR.
  • Ml ⁇ -ONA / EcoRI + HindIII Marker, 3.
  • M2 GeneRuler TM 100 bp DNA Ladder.
  • FIG. 3 Cluster analysis of the oenococcal strains on the basis of the nested SAPD PCR with the primers C-Not-A, C-Not-C and C-Not-T.
  • Fig. 4 Result of the nested SAPD-PCR with strains of P. parvulus with C-Not
  • FIG. 5 Cluster analysis of the P. parvulus strains on the basis of the nested SAPD PCR with the primers C-Not-A and C-Not-G.
  • Fig. 6 Result of the SAPD-PCR for species differentiation of Brettanomyces sp. after gel electrophoresis separation of the PCR products.
  • Fig. 7 Result of the nested SAPD-PCR with the B. bruxellensis strains with C-Not
  • Fig. 8 Cluster analysis of the Brettanomyces bruxellensis strains using the nested
  • SAPD-PCR with primers A-Not-A, A-Not-C, A-Not-G, A-Not-T, C-Not-C, C-Not-G and C-Not-T.
  • Fig. 9 Result of nested SAPD-PCR with Vitis vinifera with C-Not PCR product after gel electrophoresis separation.
  • Primer C-Not-G.
  • 'Marker GeneRuler TM 100 bp DNA-Ladder Plus.
  • Fig. 10 Cluster analysis with vines ⁇ Vitis vinifera) using the nested SAPD-PCR with the primers G-Not-A, G-Not-G and G-Not-T.
  • Fig. 12 Result of nested SAPD-PCR of various SO 4, Pinot Noir and
  • Fig. 13 Example for distinguishing different laboratory mice by means of nested SAPD
  • Primer C-Not-T.
  • 2 markers GeneRuler TM 100 bp DNA Ladder.
  • FIG. 14 Cluster analysis with mouse mice (Mus musculus) on the basis of the nested SAPD
  • Fig. 15 Result of nested SAPD-PCR with DNA from human blood cells with A-
  • FIG. 16 result of the nested SAPD-PCR with DNA from human blood cells with A-
  • Fig. 17 Cluster analysis with DNA from human blood cells using the nested
  • SAPD-PCR with the primers A-Not-A, A-Not-G, C-Not-A and C-Not-G.
  • Fig. 18 Nested SAPD-PCR with different species of the genus Pediococcus after gel electrophoretic separation.
  • the nested SAPD-PCR was performed with primer G-Not-T.
  • the amplifcates to be analyzed were cut out with a sterile scalpel.
  • PDA P. damnosus
  • PPA P. parvulus
  • PAC P. acidilactici
  • PPE P. pentosaceus
  • PIN P. inopinatus
  • PCE P.cellicola
  • PCL P. claussenii
  • PST P. stiksii
  • PDE P. dextrinicus.
  • Table 3 in Example 9 For the root designation, see Table 3 in Example 9.
  • Fig. 19 SCAR-PCR for the specific identification of P. acidilactici after gel electrophoretic separation (control with related species).
  • M marker (DNA Ladder Mix, Fermentas)
  • PAC P. acidilactici
  • PDA Pediococcus damnosus
  • PPA P. parvulus
  • PIN P. inopinatus
  • PDE P. dextrinicus
  • PPE Pediococcus pentosaceus
  • PCL P. claussenii
  • PCE P.cellicola
  • PST P.
  • strains All 15 examined oenococcal strains came from the culture collection of the institute for microbiology and wine research of the University of Mainz. The strains were on the one hand from different wines from different regions of Germany (strains: B70, B241, B325, B358, B359, B367, B377, B378) and on the other hand from commercially available starter cultures (SK1, SK2, SK3 (Lallemand, Erbslöh), B350 (B).
  • Pediococcal strains were transplanted into 10 ml MRS medium (1% peptone, tryptic digested, 1% meat extract, 0.5% yeast extract, 2% glucose, 0.1% Tween 80, 0.2% K 2 HPO 4 , 0 Dissolve 5% sodium acetate, 0.2% (NH 4 ) 2 citrate, 0.02% MgSO 4 .7H 2 O, 0.005% MnSO 4 .7H 2 O in demineralised (d) H 2 O, to pH 5, 2 and autoclave for 15 min.) At RT and harvesting the cells in the late log phase.
  • MRS medium 1% peptone, tryptic digested, 1% meat extract, 0.5% yeast extract, 2% glucose, 0.1% Tween 80, 0.2% K 2 HPO 4 , 0 Dissolve 5% sodium acetate, 0.2% (NH 4 ) 2 citrate, 0.02% MgSO 4 .7H 2 O, 0.005% MnSO 4 .7H 2 O in deminer
  • the Brett ⁇ nomyces strains all came from the culture collection of the Institute of Microbiology and Wine Research of the University of Mainz. Of the Brett ⁇ nomyces bruxellensis strains used (9, 30, 34A, 34B, 35, 75A, 75B, 76A, 76B, 374, 566, 567, 568, 573, 575, 579), strains 9, 30, 34A, 34B , 35, 75A, 75B, 76A, 76B all isolated from the same wine-growing region. The remaining tribes came from more distant regions.
  • the type strains of the Brettanomyces species B. anomalus (574), B. custersianus (576), B. nanus (577) and B.
  • naardenensis (578) were included in the kinship analysis.
  • the yeast strains were dissolved in 250 ml of YPG medium (1% yeast extract, 2% peptone, 1% glucose in dH 2 O, adjust to pH 6.5 and autoclave for 15 min.) After cooling, 0.002% cycloheximide and 0.01% Ampicillin) at 30 ° C at 130 rpm on a shaker incubated. The cells were harvested in the late log phase.
  • the Brettanomyces bncxellensis strains were digested with zymolyase (Kitamura and Yamamoto, Arch. Biochem., Biophys., 1 (1972), 403-406). 15 ml of warm lysis buffer were added to 10 ml of Zeil suspension and, after addition of 1 ml of Zymolyase solution (15 mg / ml) for 2 h at 37 0 C incubated.
  • proteinase K 100 ⁇ g / ml
  • RNase A 12.5 ⁇ g / ml
  • RNase T1 25 U / ml
  • Marmur (1961) was used to isolate the genomic DNA (Marmur, J. Mol. Biol. 3 (1961), 208).
  • the DNA from Gram-positive bacteria and yeast can also be a kit ® DNeasy Tissue Kit (Qiagen, Hilden) are performed.
  • the DNA was extracted with the DNeasy ® Tissue Kit (Qiagen, Hilden) according to the protocol "Purification of Total DNA from Rodent Tails" isolated.
  • the blood of the subjects was taken intravenously. Carried the DNA from blood cells according to the protocol "Isolation of Genomic DNA from Whole Nucleated Nucleated or Non- Animal Blood” using the DNeasy ® Tissue Kit (Qiagen, Hilden).
  • the storage of the isolated DNA with 0, lxSSC buffer is suitable only for short periods and prepares for longer storage (> 0.5 a) difficulties (background, lack of reproducibility) in the nested SAPD-PCR.
  • the storage in a suspension consisting of 70% ethanol and 0, lxSSC buffer prolongs shelf life by years.
  • Concentration and purity of the isolated DNA were determined photometrically at 260 nm.
  • the analysis of the PCR fragments was carried out in a 1.5% agarose gel in a horizontal electrophoresis chamber. To improve the dissolution of the gels, (0.035%) of sodium bicarbonate water was added before boiling. Ethidium bromide solution (final concentration 500 ng / ml) was added before pouring the gel. 5 ⁇ l PCR product were mixed with 1 ⁇ l loading buffer (6x) and applied to the gel. The separation of the fragments was first carried out for 20 min at a voltage of 60 V and then for 130 min at 75 V. After electrophoresis, the band pattern was made visible on a transilluminator by UV light.
  • the gels were photographed following electrophoresis using a gel documentation unit (Polaroid, Offenbach) and stored in TIF data format.
  • TINA program Raytest isotope measuring devices, Straubenhardt
  • Brightness profiles were generated from the individual traces of the gel images. Then the individual profiles were aligned.
  • the aligned brightness profiles are converted to a dual data matrix according to the presence of a band.
  • the intensity of the bands was taken into account by selecting 3 intensity categories. For the dual representation, therefore, 3 matrix positions are occupied per signal.
  • Several data matrices created by evaluating gel images of the same strains with different SAPD primers are sequenced. This data matrix was converted to a dendrogram by the program ClustalX 1.83 (Thompson et al., Nucleic Acids Res. 25 (1997), 4876-4882). The principal implementation of the gel image evaluation and cluster analysis is shown in FIG. Example 2: Inventive SAPD-PCR
  • the four decamer A, C, G and T distress were used. These consisted of the nucleotide (base) adenine monophosphate, to which the recognition sequence of the NM restriction endonuclease and in each case a further nucleotide (A, C, G or T) were added; see Table 1.
  • undecamers were constructed by adding one more base to the sequence of S APD primers; see Table 2.
  • reaction mixtures with a total volume of 25 ⁇ l were prepared.
  • the PCR was carried out in 200 ⁇ l reaction vessels.
  • the contents of the individual reagents of a 25 ⁇ l reaction mixture are as follows:
  • thermocycler program for SAPD-PCR with the primers A-, C-, G-, T-Not is shown below.
  • the annealing temperature was 35 ° C. Following the annealing step, a so-called "ramp" followed.
  • the temperature increase to Elongation lasted 8 min per PCR cycle.
  • the entire PCR program with 35 cycles lasted approx. 15.5 h.
  • the template DNA used in the nested PCR was a microliter PCR product of the first PCR reaction.
  • Enhancer Solution P (Peqlab) resulted in increased amplification of specific PCR products (Table 4).
  • the annealing temperature was in the nested PCR with the A and T-Not primers 39 ° C and with the C- and G-primers Not 41 0 C. There is no ramp was used.
  • the entire PCR reaction took about 5 h.
  • the composition of a reaction mixture for the nested SAPD-PCR is shown below.
  • Oenococci are suitable for malolactic fermentation in wine and are used in the form of starter cultures (Davis et al., Appl. Environ. Microbiol. 51 (1986), 539-545). Oenococci are heterofermentative lactic acid bacteria. The species Oenococcus oeni is genotypically very homogeneous. The strains studied so far always showed a homology of more than 70% in the case of DNA-DNA hybridization (Garvie, J. Syst. Bacteriol., 26 (1976), 116-122 and Dicks et al., Int. J. Syst. Bacteriol (1990), 83-91) and have almost no sequence differences of 1500 bp in the analysis of the 16S rDNA customary for bacterial identification.
  • Environ Microbiol 63 (1997), 1261-1267 and Zapparoli et al., FEMS Microbiol. Lett 166 (1998), 325-332) are molecular biology methods which have become the parent Identification in Oenococcus oeni could already be used successfully. However, stem level could not always be achieved by PFGE (Zavaleta et al., Appl. Environ. Microbiol., 63 (1997) 1261-1267).
  • the irregularity of spontaneous malolactic fermentation in wine has led to the use of Oenococcus oeni in the form of starter cultures.
  • suitable Oenococcus oeni strains it is important to have a strain identification method that ensures the identity of selected cultures. For winemakers who refrain from using commercial starter cultures and use naturally occurring oenococcal strains from their own wine, it is also important to distinguish them from undesirable lactic acid bacteria to specifically enrich the strains that exert a positive influence on the flavor.
  • Example 4 Application of nested SAPD-PCR in Pediococcus parvulus
  • Pediococci are facultative anaerobic, homofermentative, coccoid lactic acid bacteria.
  • the genus Pediococcus (P.) is composed of about ten species. Known members of the genus are P. damnosus, P. parvulus, P. inopinatus, P. dextrinicus, P. pentosaceus, P. acidilactici, P. urinaeequi, P. claussenii, P. cellicola and P. soyae.
  • Pediococci occur predominantly on plants and fermented foods (cereals, meat, fish, vegetables, beer and wine).
  • P. acidilactici and P. pentosaceus are among the most commonly used species used in the fermentation of sausage products. Some species have been isolated from the gastrointestinal tract and genitourinary tract of animals and humans. Some pediococcal strains, like oenococci, can also undergo malolactic fermentation in wine, but, in contrast to the oenococci, form interfering byproducts such as diacetyl and acetoin (Wibowo et al., Am., J. Enol., Vitic., 36 (1985), 302-313 ). Their growth is therefore undesirable in the wine.
  • dammosus are able, at pH values above 3.5, to synthesize an exopolysaccharide which already ensures a strong increase in viscosity at a cell titer of 10 5 cells / ml (Sponholz, In: Wine Microbiology and Biotechnology ( Fleet, GH, Ed.) Hardwood Academic Publisher, Chur. (1993), 395-420).
  • a reproducibility and a higher resolving power improved compared to the above-mentioned fingerprint methods could be achieved by the nested SAPD-PCR according to the invention according to Example 2. Similar to the analysis with the oenococci (see example 3), a good reproducibility and a high resolving power could also be confirmed in the study of the pediococci on the basis of 8 examined Pediococcus parvulus strains; see Figures 4 and 5.
  • Yeasts of the genus Brett ⁇ nomyces may be responsible for miscarriages in wine (Chatonnet et al., J. Sei, Food Agric., 60 (1992), 165-178) and are also used in the preparation of specific types of beer (Gilliland J. Inst. Brew. 67 (1961), 257-261). They occur in wine mostly after alcoholic and malolactic fermentation, during storage of the wine in keg or bottle (Chatonnet et al., Am J. Enol, Vitic 46 (1995), 463-468).
  • Brettanomyces yeasts can produce the characteristic "Brett" aromas even at low cell densities of 100 to 1000 cells / ml. The fact that these yeasts are often present in low cell counts and that they grow slowly makes their identification difficult. To prevent spoilage, winemakers need a reliable method for identifying Brettanomyces strains, so that countermeasures can be taken before wine quality deteriorates. Ibeas et al. (1996) used a nested PCR method to detect Brettanomyces strains in sherry wine (Ibeas et al., Appl Environ Microbiol 62 (1996), 998-1003). Mitrakul et al. (1999) used the RAPD-PCR to distinguish yeast strains within the species B.
  • the method according to the invention with different sensitivity levels enables species separation, variety delineation and clone discrimination. It is possible to clarify the relationships of even very closely related grape varieties and to provide the results obtained in a database for future comparisons through the high reproducibility of the method. Now it is possible to clarify practically relevant issues such as the synonyms of old, indigenous grape varieties and to investigate clonal distinctions of the documents, Burgundy varieties and variances as well as the genetic stability of varieties. Furthermore, the method can also be used for the examination and genotyping of individual old vines. In addition, color mutations, variations of the aromas and the "berryiness" of the vines can be examined.
  • mice Most laboratory mouse strains originated from crosses of Mus musculus domesticus with Mus musculus musculus. Almost all laboratory strains are derived from inbred lines and are therefore genetically almost identical. Mice are ideal model organisms for the elucidation of gene functions, and not just because they multiply rapidly, but also because much is known about their genes. The mouse genome with its approximately 25,000 genes is completely sequenced, and in addition the genetic make-up of humans and mice is approximately 95 percent (Mouse genome sequencing consortium: Nature 420 (2002), 520-562 ). For human diseases such as diabetes, Parkinson's, hypertension and cancer, faulty genes are at least partly responsible. Many genes correspond to each other in mice and humans and can cause the same diseases.
  • SSR simple sequence repeat
  • microsatellites are distributed throughout the mammalian genome. The microsatellites differ only in the number of repeating units. The mouse genome contains about twice as many microsatellites as the human genome. In addition, the difference between the alleles of various inbred strains is considerable (Newton and Graham, PCR (Laboratory in Focus) 2nd ed. (Ed. Newton and Graham), Spectrum Akad. Verl., Heidelberg (1994), 145).
  • SNP single nucleotide polymorphism
  • the nested SAPD-PCR according to the invention allows different laboratory mice to be distinguished in a simple and easily reproducible manner, without knowledge of specific target DNA sequences.
  • the tail tips of 7 laboratory mice (A, B, 2, 3, 5, 6, 8) were used for DNA isolation. Of these, mice A and B were littermates. Of the remaining mice, only mouse 2 was more closely related to mice A and B.
  • mouse 2 could be confirmed as the closest relative to mouse pair A and B; FIGS. 13 and 14.
  • Example 8 Genome typing of human individuals (Homo sapiens sapiens)
  • DNA analysis is the most advanced method for determining the identity and relatedness of human individuals.
  • the genome typing of human individuals is used primarily in genealogy, forensic science, and clinical medicine / diagnostics.
  • An unassailable result is a prerequisite for the evidential value of the results.
  • the so-called "ghost bands" can occur or disappear again and again in the method of the RAPD-PCR, and the results are therefore poorly reproducible, the RAPD-PCR is not recognized for genealogical appraisals in court.
  • Fingerprint analyzes have been used since 1985 to study so-called VNTRs (variable number of tandem repeats) for the genome typing of human individuals.
  • minisatellites are located on the telomeres of the chromosomes and consist of longer repeating units than the microsatellites. They occur in each individual in an unmistakable length at the examined VNTR locus.
  • DNA sections containing VNTRs are amplified, separated by gel electrophoresis and visualized after staining with ethidium bromide under UV light. Since the repeats occur in a variable number of units, a specific band pattern results for each human from the different lengths of the PCR amplicons (Jeffreys et al., Nature 314 (1985), 67-73 and Jeffreys et al., Nature 316 (1985), 76-90).
  • the nested SAPD-PCR according to the invention opens up the distinction between different and related humans, without the need for obtaining sequence information in advance.
  • the relatedness of 13 persons to one another was determined by means of the nested SAPD-PCR according to the invention and subsequent cluster analysis with DNA from human blood cells.
  • the relationships of the two families studied (I, II) were confirmed; see Figures 15, 16 and 17.
  • the person E I (S) was the father (parent S) of child K I (S) and K 2 I ($) and the brother of person E II ($) (parent $).
  • Person E I ($) was the mother of Kl I (S) and K2 I ($).
  • Person E II (S) was the father of the persons Kl II ($) and K2 II ($).
  • Example 9 Application of nested SAPD-PCR and SCAR-PCR for the identification of species of the genus Pediococcus
  • the method according to the invention in addition to the SAPD-PCR described in Example 2 also includes the technique of Sequence Characterized Amplified Region PCR (SCAR PCR).
  • SCAR PCR Sequence Characterized Amplified Region PCR
  • a specific band is excised from the SAPD gel and the sequence certainly.
  • the specific primers flanking the sequence are synthesized, which in turn can be used in a SCAR-PCR to identify the corresponding clone or a specific species.
  • Specific primers were constructed for species identification of strains of the genus Pediococcus. For this purpose, first the nested SAPD-PCR was carried out according to Example 2 with the primer G-No t-T; See Figure 18. Strains screened for SCAR-PCR are shown in Table 3. If present, multiple strains of each species were screened to find amplification products that are common to all strains within a species but are absent in all other species. After gel electrophoretic separation of the amplification products and staining with an ethidium bromide solution, the agarose gel was visualized under UV light.
  • Species-specific gel bands were excised with a sterile scalpel and redissolved with the Qiagen Gel Extraction Kit (Qiagen, Hilden); See Figure 18.
  • the eluted amplicons were cloned into the pCR4-T0P0 plasmid using the TOPO TA Cloning Kit for Sequencing (Invitrogen) and transformed into a competent E. coli strain (E. coli TOP10).
  • the transformed clones were selected and cultured in LB medium overnight. Subsequently, the plasmids of the transformed cells were isolated with the Qiagen Miniprep Kit.
  • a PCR was performed with the primers M13-forward and M 13 -reverse (Invitrogen).
  • the plasmids containing the desired insert were sequenced from both sides with the M13 forward and M13 reverse primers (MWG-Biotech, Ebersberg). From the sequences determined, primers were designed which bind to sequences located within the insert.
  • a touchdown PCR was performed.
  • 25 ⁇ l reaction mixtures were prepared. These preparations consisted in each case of 10 ⁇ M primer (forward and reverse), 200 ⁇ M per NTP, Ix reaction buffer (including 1.5 mM MgCl 2 ) (Peqlab), 20 ng of template DNA, 1 unit of Taq DNA polymerase (Peqlab). , The initial denaturation was carried out for 5 min at 95 ° C. Subsequently, 6 cycles were carried out at 94 ° C for 30 seconds, 69 ° C for 30 seconds (the temperature was lowered by 1 ° C for each cycle) and 72 ° C for 30 seconds.

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Abstract

Die Erfindung beschreibt Spezies-unabhängige Nachweisverfahren für pro- und eukaryotische Organismen. Darüber hinaus werden Primer und Kits zur Verwendung in der Fingerprint-Analyse von biologischem Material bereitgestellt. Die Primer sind von der Erkennungssequenz der Restriktionsendonuklease NotI abgeleitet worden.

Description

SPEZIES-UNABHÄNGIGE DNA-FINGERPRINT-ANALYSE MIT PRIMER ABGELEITET VON DER NOT I - ERKENNUNGS S EQUENZ
Die Erfindung betrifft ein Nukleinsäure-gestütztes Spezies-unabhängiges Nachweisverfahren für biologisches Material, das sowohl beim Menschen, als auch bei Tieren, Pflanzen und Mikroorganismen Anwendung findet und insbesondere zur genomischen Fingerprint-Analyse und Aufklärung von Verwandtschaftsgraden bzw. -Verhältnissen von Individuen, Pflanzensorten, Tierrassen und Stämmen von Mikroorganismen geeignet ist. Die vorliegende Erfindung betrifft darüber hinaus Primer und Kits zur Verwendung in dem erfϊndungsgemäßen Verfahren.
Die DNA- bzw. Genom-Analyse stellt die modernste Methode zur Bestimmung der Identität und der Verwandtschaft verschiedener Individuen dar. Unter den genetischen Markern für die Genom-Analyse nehmen DNA-Polymorphismen eine wichtige Position ein. Insbesondere diejenigen genetischen Marker, für die gezeigt werden konnte, dass sie genetisch mit einem Merkmal von Interesse gekoppelt sind, können beispielsweise für das Klonieren von Genen, für medizinische Diagnostik sowie für die Introgression, d. h. die Einführung von Merkmalen bzw. Genen einer Population in den Genbestand einer anderen durch wiederholte Kreuzung und Rückkreuzungen, verwendet werden. Die am häufigsten verwendeten DNA-Marker sind Restriktionsfragmentlängen-Polymorphismen (RFLP). Der Nachweis von RFLPs durch Southern Blot Hybridisierungen ist allerdings arbeitsaufwändig und mit dem für viele Anwendungen erforderlichen hohen analytischen Durchsatz nicht vereinbar. Andere Polymorphismen-Assays, die auf der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) basieren, setzen insbesondere für die Gestaltung der Amplifikationsprimer bestimmte Informationen über die Ziel-DNA-Sequenz voraus. Auch hier stehen die für die Gewinnung der Sequenzinformationen aufzuwendende Zeit sowie die dabei anfallenden Kosten einer Verwendung im Rahmen groß angelegter Hochdurchsatzstudien entgegen.
Unter den Fingerprint- Analysen wurden seit 1985 so genannte VNTRs (variable number of tandem repeats) zur Genomtypisierung menschlicher Individuen untersucht. Diese auch Minisatelliten genannten Bereiche befinden sich an den Telomeren der Chromosomen und bestehen aus längeren Wiederholungseinheiten als die Mikrosatelliten. Sie treten bei jedem Individuum in einer unverwechselbaren Länge am untersuchten VNTR-Locus auf. Mit Hilfe der PCR-Technik werden VNTRs enthaltende DNA-Abschnitte vervielfältigt, durch Gelelektrophorese aufgetrennt und nach Anfärbung mit Ethidiumbromid unter UV -Licht sichtbar gemacht. Da die Sequenzwiederholungen in einer variablen Anzahl von Einheiten vorkommen, ergibt sich anhand der unterschiedlichen Länge der PCR-Amplifikate für jeden Menschen ein spezifisches Bandenmuster (Jeffreys et al., Nature 314 (1985), 67-73 und Jeffreys et al., Nature 316 (1985), 76-90). Etwa ab 1998 wurden die VNTRs fast vollständig durch die STR-Technik (short tandem repeat) (Edwards et al., Am. J. Hum. Genet. 49 (1991), 746-756) verdrängt. Als STR wird eine Abfolge von zwei bis sechs Basenpaaren bezeichnet, die sich mehrere Male hintereinander wiederholt. Dabei ist die gesamte Länge des STR kleiner als 100 bp. Die Analyse von STR-Regionen bietet sich vor allem in der Gerichtsmedizin an, da auch sehr niedrige DNA-Konzentrationen zu einem erfolgreichen Resultat führen (Ruitberg et al., Nucleic Acid Res. 29 (2001), 320-322).
Zur Aufklärung von Verwandtschaftsverhältnissen menschlicher Individuen wurde auch die Untersuchung von Punktmutationen herangezogen. Mit Hilfe der SNP-Methode lassen sich einzelne Basenaustausche bekannter Sequenzen genau analysieren. 90 % aller genetischen Variationen im menschlichen Genom sind SNPs. Sie sind ungleichmäßig stark über das Genom verteilt, hoch variabel und lassen sich relativ schnell und einfach bestimmen.
Ein Verfahren, das die Untersuchung genetischer Variation erlaubt, ohne dass es eine Kenntnis der Ziel-DNA-Sequenz erfordert, basiert auf dem Prinzip der Randomly Amplifϊed Polymorphie DNA-PCR (RAPD-PCR) (Williams et al., Nucleic Acids Res. 18 (1990), 6531- 6535). Die RAPD-PCR basiert auf der Amplifikation von genomischer DNA mit einzelnen Primern von willkürlicher Nukleotidsequenz. Diese Primer detektieren Polymorphismen in der Abwesenheit von spezifischer Nukleotidsequenzinformation, wobei die Polymorphismen als genetische Marker wirken und zur Konstruktion von genetischen Karten verwendet werden können. Die RAPD-PCR erlaubt gegenüber der vorstehend genannten RFLP und der zielgerichteten PCR automatisierte genomische Analysen sowie die Verwendung eines standardisierten Primersets für die genomische Analyse einer Auswahl verschiedener Spezies, ohne dass Vorarbeiten wie Sequenzierungen erforderlich sind. Dennoch ist sie nicht universell anwendbar und erfordert zudem die Verwendung eines Sets aus mehreren verschiedenen Primern. Für die Durchführung genomischer Analysen durch RAPD-PCR kann grundsätzlich die Verwendung eines Sets von bis zu mehreren hundert Primern erforderlich sein, wobei die einzelnen Primer unterschiedliche Polymorphismen anzeigen und sich die Auswertung entsprechend aufwändig gestaltet. Zudem treten bei der RAPD-PCR neben unspezifischen PCR-Amplifikaten auch so genannte "Geisterbanden" auf, wodurch die Ergebnisse schlecht reproduzierbar sind. Aus diesem Grund wird die RAPD-PCR auch nicht für Abstammungsgutachten vor Gericht anerkannt.
Den vorbekannten Verfahren ist gemeinsam, dass sie arbeitsaufwändig sind und/oder keine zuverlässigen Aussagen zu Verwandtschaftsgraden und Abstammungen von Individuen mit geringer genetischer Distanz, beispielsweise von sehr ähnlichen Pflanzensorten erlauben. Es liegt auf der Hand, dass die Bereitstellung von Mitteln und Verfahren, die die Bestimmung der genetischen Distanz zwischen einzelnen Individuen und deren Verwandtschaftsgrad erlauben, in vielen Bereichen der modernen Biologie oder Medizin wesentliche Vorteile mit sich bringen wird.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung war daher, die vorstehend beschriebenen Nachteile aus dem Stand der Technik zu überwinden.
Die Lösung dieser Aufgabe wird durch die in den Ansprüchen gekennzeichneten und nachfolgend beschriebenen Ausführungsformen erreicht.
Demnach stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum spezifischen Nachweis von Individuen zur Verfügung, und insbesondere zur Bestimmung des Verwandtschaftsgrades einzelner Individuen und zur Differenzierung von Individuen verschiedener Herkunft. Im Einzelnen betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Nachweis von Nukleinsäurespezies unter der Verwendung mindestens eines Primers, der eine Sequenz enthält, die von einer palindromischen, vorzugsweise GC -reichen Sequenz abgeleitet ist. Im Allgemeinen werden solche Verfahren unter dem Begriff "DNA-Fingerprint-Analyse" zusammengefasst. Dieser Begriff wird auch nachfolgend verwendet; jedoch schließt das erfindungsgemäße Verfahren nicht nur den Nachweis von DNA-Spezies ein, sondern auch anderer Nukleinsäuren, wie RNA sowie genetischer Elemente und Viren.
Überraschenderweise wurde gefunden, dass Primer, die eine Sequenz enthalten, welche von einer einzelnen 8 bp langen palindromischen Sequenz abgeleitet ist, für Spezies-unabhängige Fingerprint-Analysen von pro- und eukaryotischen Organismen eingesetzt werden können und wiederum überraschenderweise ein hohes Auflösungsvermögen und gute Reproduzierbarkeit vermitteln. Beispielsweise konnte die Identifizierung von Bakterien und Hefen bis auf Art- bzw. Stammniveau zuverlässig erzielt werden; siehe die Beispiele 3 - 5 und 9 sowie die Figuren 2 - 6 sowie 18 und 19. Ferner konnte das erfindungsgemäße Verfahren erfolgreich zur Aufklärung von Verwandtschaftsverhältnissen verschiedener Rebsorten eingesetzt werden; siehe Beispiel 6 sowie Figur 9 und 10. Hierbei konnte eine Differenzierung bis auf Klonniveau erreicht werden; siehe Figuren 11 und 12. Darüber hinaus konnte das erfindungsgemäße Verfahren erfolgreich bei der Bestimmung des Verwandtschaftsgrades bzw. der Unterscheidung von Tieren, hier Labormäusen, eingesetzt werden; siehe Beispiel 7 und Figuren 13 und 14. Schließlich konnte das erfindungsgemäße Verfahren auch erfolgreich zur Genomtypisierung menschlicher Individuen verwendet werden; siehe Beispiel 8 sowie Figuren 15, 16 und 17.
Die Beispiele zeigen, dass das erfindungsgemäße Verfahren zum Nachweis und Identifizierung von Spezies anhand deren Nukleinsäure und zur der Verwendung eines Primers, der eine 8 bp lange palindromische Sequenz aufweist bzw. an eine solche im Genom der zu untersuchenden Individuen bindet, in der Lage ist, die genetische Verwandtschaft von beliebigen pro- und eukaryotischen Organismen zu bestimmen. Aufgrund der überraschenden Universalität und des hohen Auflösungsvermögens kann das erfindungsgemäße Verfahren vorteilhafterweise zur Identifizierung von biologischem Material in Proben und zur Unterscheidung von Mikroorganismen, beispielsweise Bakterien und Hefestämmen oder auch von Pflanzensorten bzw. Tierrassen herangezogen werden.
Der vorliegende Befund ist umso überraschender, als in der Regel im Stand der Technik davon ausgegangen wurde, dass Primer lediglich in taxonomisch eng gesteckten Grenzen eingesetzt werden können, wenn aussagekräftige Fingerprints erhalten werden sollen. Im Allgemeinen betrifft die vorliegende Erfindung daher in einem ersten Aspekt die Verwendung mindestens eines ersten Primers zur DNA-Fingerprint-Analyse, welche dadurch gekennzeichnet ist, dass der mindestens erste Primer eine Sequenz enthält, die von einer 8 bp langen, palindromischen und/oder vorzugsweise GC-reichen Sequenz abgeleitet ist.
Der Begriff "Primer" bzw. "Oligonukleotid" umfasst ein Oligomer aus Ribonukleinsäure (RNA) oder Desoxyribonukleinsäure (DNA) oder Mimetika davon. Hierzu gehören Oligonukleotide, die aus natürlich vorkommenden Nukleobasen, Zuckern und kovalenten Internukleosid-Verknüpfungen (Rückgrat) bestehen, genauso wie Oligonukleotide mit Strukturen, die in der Natur nicht vorkommen, deren Funktion aber den natürlich vorkommenden ähnlich ist.
Grundsätzlich umfasst der Begriff "Primer" im Sinne der vorliegenden Erfindung jedes Molekül, das eine Sequenz enthält, die von einer, vorzugsweise 8 bp langen, palindromischen Sequenz abgeleitet und in der Lage ist, eine Polymerase-Reaktion zu initiieren oder zu unterstützen. Dabei versteht sich, dass der erfindungsgemäße Primer vorzugsweise eine 8 bp lange palindromische Sequenz aufweist und/oder an eine solche, die in einem Zielnukleinsäuremolekül enthalten ist, unter Bedingungen hybridisiert, die die Initiierung einer Polymerase-Reaktion erlauben. Beispielhafte Hybridisierungsbedingungen können einschlägigen Standardwerken entnommen werden, wie Sambrook et al., "Molecular Cloning, A Laboratory Handbook", CSH Press, CoId Spring Harbour, 1989 oder Ausubel, "Current Protocols in Molecular Biology", Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N. Y. (1989 und neuere Auflagen). Bevorzugte Hybridisierungsbedingungen sind in den Beispielen beschrieben.
Prinzipiell umfasst sind die bekannten Polymerase-Reaktionen, die mit jedweder Polymerase durchgeführt werden können. Vorzugsweise sind thermostabile Polymerasen zu verwenden, wie zum Beispiel thermostabile DNA-Polymerasen für die PCR, die im Stand der Technik hinreichend bekannt sind. Geeignet sind beispielsweise die thermostabilen DNA-Polymerasen aus Thermus aquaticus, Thermus flavis oder Thermococcus litoralis. Die Polymerasen müssen nicht von Enzymisolierungen stammen, sondern können auch Monierten Ursprungs sein. Diesbezüglich ist in bestimmten Ausfuhrungsformen der vorliegenden Erfindung bereits die Durchführung einer einzelnen Polymerase-Reaktion ausreichend. Vorzugsweise werden hierbei markierte Primer eingesetzt.
Der überraschende Befund der vorliegenden Erfindung wurde anhand der Verwendung eines Primers verifiziert, der von der 8 bp langen palindromischen Erkennungssequenz der Restriktionsendonuklease Notl (5'-GCGGCCGC-S') abgeleitet ist; siehe Tabellen 1 und 2. Hierbei wurde überraschenderweise festgestellt, dass sich Primer, die von der Notl- Erkennungssequenz abgeleitet sind ("NM-Primer"), besonders gut zur direkten Stamm- Identifizierung von Mikroorganismen- Stämmen verschiedener Arten eignen, die aus Weinen isoliert wurden. Beispielsweise wurden durch die erfindungsgemäße Verwendung des vorstehenden Λfort-Primers Bakterien-Stämme der Arten Oenococcus oeni und Pediococcus parvulus analysiert; siehe Beispiel 3 bzw. Beispiel 4 sowie Figur 2 und 3 bzw. Figur 4 und 5. Mit dem iVotl-Primer konnte ebenfalls eine Verwandtschaftsanalyse mit mehreren Stämmen der Hefe Brettanomyces bruxellensis durchgeführt werden; siehe Beispiel 5 sowie Figuren 6 - 8. Daneben konnte die Abstammung verschiedener Rebsorten der Weinrebe Vitis vinifera vinifera aufgezeigt werden; siehe Beispiel 6 sowie Figuren 9 bis 12. Weiterhin gelang mit den Mtfl-Primern eine Verwandtschaftsanalyse von Labormäusen (Mus musculus); siehe Beispiel 7 sowie Figuren 13 und 14. Schließlich konnte das erfindungsgemäße Verfahren auch erfolgreich zur Genomtypisierung menschlicher Individuen (Homo sapiens sapiens) verwendet werden; siehe Beispiel 8 sowie Figuren 15, 16 und 17.
Demgemäß ist eine bevorzugte Ausführungsform des Primers dadurch gekennzeichnet, dass die im Primer enthaltene, von einer 8 bp langen palindromischen Sequenz abgeleitete Sequenz die Erkennungssequenz einer Restriktionsendonuklease ist. Besonders bevorzugt ist diese Erkennungssequenz einer Restriktionsendonuklease die Erkennungssequenz der Restriktionsendonuklease Notl; siehe auch die Beispiele. Die iVbrt-Erkennungssequenz (5'- GCGGCCGC-3') kommt im Genom verschiedener Organismen im Vergleich zu den Erkennungssequenzen anderer Restriktionsendonukleasen seltener vor. Die Sequenz eignet sich daher zur Verwendung als Primer, da erfindungsgemäß davon ausgegangen wird, dass dieser seltener mit der genomischen DNA hybridisieren wird. Besonders gut eignet sich die Sequenz zur Verwendung als PCR-Primer, da nicht zu viele Abschnitte auf der genomischen DNA-Matrize amplifiziert werden, welche die Auswertung des Bandenmusters nach gelelektrophoretischer Auftrennung der PCR-Produkte erschweren würden. Dieser besonders bevorzugten Ausfuhrungsform entsprechend sind die erfindungs gemäßen Primer demnach vorzugsweise ausgewählt unter den in Tabelle 1 und 2 gezeigten Sequenzen. Wie zu erkennen, besteht die iVM-Erkennungssequenz ausschließlich aus den Nukleotiden G und C. Im Falle der Verwendung von Primern, die nicht die TVotl-Erkennungssequenz aufweisen, ist es daher bevorzugt, Primer zu verwenden, die ebenfalls einen hohen GC-Gehalt von mindestens 50 von bis zu 100 % aufweisen, vorzugsweise im Bereich von 70 - 95 %. In diesem Zusammenhang wurde in Untersuchungen im Rahmen der vorliegenden Erfindung überraschenderweise festgestellt, dass in bestimmten Ausführungsformen, insbesondere bei der DNA-Fingerprint-Analyse von biologischem Material mit geringerem genetischem Informationsgehalt wie beispielsweise des Genoms von Mikroorganismen, Organellen wie Mitochondrien oder Viren auch Primer vorzugsweise eingesetzt werden können, die eine GC- haltige Kernsequenz von weniger als 8 Nukleotiden aufweisen, beispielsweise 7 oder lediglich 6 Nukleotide, die dann vorzugsweise ausschließlich oder im Wesentlichen aus G und/oder C bestehen, gegebenenfalls aber wie vorstehend erläutert an ihrem 5'- und/oder 3'-Ende ein weiteres Nukleotid tragen. Die Verwendung solcher Primer bietet sich insbesondere bei der DNA-Fingerprint-Analyse von Bakterien wie den in den Beispielen beschriebenen Oenokokken oder Pediokokken an. Daher umfasst die vorliegende Erfindung auch DNA-Fingerprint-Analysen unter Verwendung eines ersten und/oder zweiten Primers, der eine GC-reiche Kernsequenz von 5 bis 7 Nukleotiden, vorzugsweise 6 Nukleotiden aufweist. Besonders bevorzugt sind auch diese Primer bzw. deren Kernsequenzen von der Notl-Erkennungssequenz abgeleitet. Dementsprechend wird auch ein solcher vorstehend beschriebener Primer mit einer GC-reichen Kernsequenz von beispielsweise nur 6 Nukleotiden als ein erster Primer im Sinne der vorliegenden Erfindung angesehen, der von einer palindromischen Sequenz abgeleitet ist, insbesondere vorzugsweise von der Erkennungssequenz der Restriktionsendonuklease Notl. In einer Ausführungsform der Erfindung wird für den ersten und/oder zweiten Primer ein Gemisch der vorstehend beschriebenen Primer eingesetzt, d. h. Primer, die 8 oder mehr Nukleotide aufweisen und von einer 8 bp langen palindromischen Sequenz abgeleitet sind, und Primer mit weniger als 8 Nukleotiden, deren Kernsequenz GC -reich ist wie vorstehend beschrieben. Im Einzelnen können die erfϊndungsgemäßen Primer einen GC-Gehalt aufweisen, wie er für die beispielhaft dargestellten Primer in Tabelle 1 und 2 angegeben ist.
Zusätzlich zu der Sequenz, die von einer 8 bp langen palindromischen Sequenz abgeleitet ist, können die erfindungsgemäßen Sequenzen am 5 '-Ende und/oder 3 '-Ende weitere Verknüpfungen, beispielsweise mit Markermolekülen und/oder Nukleotiden aufweisen. Eine bevorzugte Ausführungsform des erfindungsgemäßen Primers ist dadurch gekennzeichnet, dass 5' an der im Primer enthaltenen Sequenz mindestens ein weiteres Nukleotid angefügt ist. Eine weitere bevorzugte Ausführungsform der erfindungsgemäßen Verwendung ist dadurch gekennzeichnet, dass gleichzeitig oder alternativ 3' an der im Primer enthaltenen Sequenz mindestens eine weiteres Nukleotid angefügt ist. Vorzugsweise ist das 5' an der Sequenz angefügte Nukleotid Adenosinmonophosphat (A). Das/die 3' an der Sequenz angefügte(n) Nukleotid(e) ist/sind Adenosinmonophosphat (A), Cytidinmonophosphat (C), Guanosinmonophosphat (G) und Thymidinmonophosphat (T); siehe auch die Beispiele.
Die erfindungsgemäßen Primer besitzen üblicherweise eine Länge von bis zu 50 Nukleotiden, vorzugsweise von bis 25 Nukleotiden, mehr bevorzugt von 9 bis 12 Nukleotiden und in einer besonders bevorzugten Ausführungsform von 10 oder 11 Nukleotiden. Allerdings ist die Erfindung auch mit kürzeren, insbesondere 8 Nukleotide langen Primern durchführbar.
Zur Amplifikation einer Nukleinsäure- bzw. Polynukleotidsequenz kann jedwede Technik verwendet werden, bei der die Polynukleotidsequenz vervielfältigt bzw. reproduziert oder kopiert wird. Prinzipiell brauchbar sind die bekannten Amplifϊkationsverfahren, zu denen die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) zählt, mitunter auch als nested PCR, asymmetrische PCR oder Multiplex-PCR durchgeführt, oder alternative Verfahren, wie die Ligase-Kettenreaktion (LCR), Nukleinsäuresequenz-basierende Amplifikation (NASBA), Transkriptions-vermittelte Amplifikation (TMA) bzw. das auf Transkription basierende Amplifikationssystem (abgekürzt TAS, siehe Kwo et al., Proceedings of the National Academy of Sciences USA 86 (1989), 1173 - 1177), das nach retroviralem Replikationsmuster ablaufende "Sequenz- Replikationssystem" (abgekürzt 3SR, siehe Guatelli et al., Proceedings of the National Academy of Sciences USA 87 (1990), 1874 - 1878) und das Q-beta Replicase-System (siehe Kramer und Lizadi, Nature 339 (1989), 401 - 402). Bestimmte Versionen dieser Techniken und/oder Kombinationen mit anderen molekularbiologischen Methoden können zweckmäßig sein. Insbesondere geeignet ist jedoch die PCR, wie sie vorstehend genannt und in den Ausführungsbeispielen beschrieben ist.
Eine bevorzugte Ausfuhrungsform der erfindungsgemäßen Verwendung ist daher dadurch gekennzeichnet, dass die zu analysierende DNA mit dem mindestens ersten Primer durch Polymerase-Kettenreaktion (PCR) amplifiziert wird. Bevorzugt anzuwendende PCR- Bedingungen sind den Beispielen zu entnehmen.
Es können jegliche Arten von Nukleinsäure- bzw. Polynukleotidsequenzen gemäß der vorliegenden Erfindung amplifiziert werden, wie doppelsträngige und einzelsträngige DNA und RNA. Die zu amplifizierende Polynukleotidsequenz kann selbst Teil einer längeren Polynukleotidsequenz sein, beispielsweise Teil eines Gens, einer regulatorischen Sequenz, einer viralen oder bakteriellen DNA- oder RNA-Sequenz, einer Boten-RNA (m-RNA) oder eines Plasmids.
In einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung werden die Primer vorzugsweise in einer neu entwickelten erfindungsgemäßen PCR-Methode, der specific amplification of Polymorphie DNA-PCR (SAPD-PCR), verwendet. Die SAPD-PCR ist insbesondere zur Ermittlung der genetischen Verwandtschaft von beliebigen Organismen geeignet, die derselben Art angehören. Die Methode kann daher zur Identifikation bzw. zur Unterscheidung von Stämmen oder teilweise auch Arten (Brettanomyces bruxellensis) herangezogen werden. Die SAPD-PCR ist eine erfindungsgemäße Weiterentwicklung des Prinzips der vorstehend genannten RAPD-PCR. Bei der SAPD-PCR werden zwar ebenfalls wie bei der RAPD-PCR unbekannte Bereiche auf der genomischen DNA der Organismen-Stämme amplifiziert, im Unterschied zur RAPD-PCR werden bei der SAPD-PCR jedoch speziell ausgewählte spezifische Primer verwendet, d. h. vorzugsweise die vorstehend beschriebenen erfindungsgemäßen Primer. Wie bei der RAPD-PCR wird auch bei der SAPD-PCR nur jeweils ein Primer pro PCR-Reaktion verwendet. Die Primer binden an komplementäre Stellen im Genom und bedingen die Amplifikation der Bereiche, die sie flankieren. Die im erfindungsgemäßen Primer enthaltenen und von palindromischen Sequenzen angeleiteten Sequenzen sind statistisch im Genom verteilt und kommen bei 50 % GC-Gehalt pro 4n Nukleotide etwa einmal vor, wobei 4 für die Anzahl der Nukleotidbasen A, T, G und C in der DNA und n für die Anzahl der Nukleotide in der Erkennungssequenz steht. Es kann erwartet werden, dass mit zunehmender Länge der Primer diese spezifische Nukleotidabfolge weniger häufig in einer DNA vorkommt. Für die erfindungsgemäße Verwendung eigenen sich insbesondere Primer, die im Genom verschiedener Organismen im Vergleich zu anderen Nukleotidabfolgen seltener vorkommen.
Die erfindungsgemäßen Primer, welche Sequenzen enthalten, die von palindromischen Sequenzen abgeleitet wurden (Tabelle 1), eignen sich daher besonders zur Verwendung bei der SAPD-PCR, da nicht zu viele Abschnitte auf der genomischen DNA-Matrize amplifiziert werden, die die Auswertung des Bandenmusters beispielsweise nach gelelektrophoretischer Auftrennung der PCR-Produkte erschweren würden.
Als vorteilhaft hat sich bei der Durchführung der SAPD-PCR die Einführung einer so genannten "Rampe" erwiesen. Dadurch kann insbesondere die Variabilität der PCR-Produkte reduziert werden. Die Rampe beschreibt den schrittweisen Temperaturanstieg zwischen Annealing (Hybridbildung) und Elongation (Verlängerung) des Primers. Die zeitliche Ausdehnung der Rampe gewährleistet eine reproduzierbarere Bindung des Primers an die DNA-Matrize. Ein erfindungsgemäßes Anwendungsbeispiel einer Rampe kann dem Beispiel 2, Ziffer 2.2 entnommen werden. Die Durchführung der Rampe im Zusammenhang mit dem erfindungsgemäßen DNA-Fingerprint- Verfahren führt beispielsweise nach elektrophoretischer Auftrennung der DNA in Agarosegelen und anschließender Visualisierung im UV-Licht nach Färbung mit Ethidiumbromid zu besonders aussagekräftigen und stabilen Fingerprint-Bandenmustern; siehe Figuren 1, 2, 4, 7, 9, 13, 15 und 16.
Daher umfasst die vorliegende Erfindung in einem weiteren Aspekt der DNA-Fingerprint- Analyse die Einführung einer Rampe bei der Amplifikation, die bevorzugt als SAPD-PCR durchgeführt wird.
Als besonders vorteilhaft hat sich bei der SAPD-PCR die Durchführung einer zweiten Amplifikation erwiesen. Dadurch kann die Produktspezifität erhöht werden. Hierbei wird das Amplifikationsprodukt der ersten Amplifikation eingesetzt. Dieses wird, vorzugsweise unter Verwendung von spezifischen Primern, in der zweiten Amplifikation, der so genannten nested SAPD-PCR, amplifiziert. Ein entsprechendes erfindungsgemäßes Anwendungsbeispiel einer nested SAPD-PCR kann dem Beispiel 2, Ziffer 2.3 entnommen werden. Auf diese Weise wird das Auftreten von unspezifischen PCR-Produkten minimiert (Puig et al., Appl. Environ. Microbiol. 60 (1994), 2963-2970). Der Vorteil der nested PCR liegt darin, dass lineare und proteinfreie DNA-Fragmente für die Amplifikation eingesetzt werden, da genomische DNA sich teilweise nicht 100 % denaturieren lässt und selbst nach mehreren Reinigungsschritten noch mit Histonen assoziiert sein kann. Ebenfalls werden geringe Mengen an DNA amplifiziert, so dass sie im Agarosegel erkennbar werden. Da bei der (nested) SAPD-PCR mehrere Bereiche gleichzeitig amplifiziert werden, zählt die Methode zu den Multilocus- Verfahren. Durch die gleichzeitige Amplifikation mehrerer Genorte entsteht nach elektrophoretischer Auftrennung der PCR-Produkte in Agarosegelen und anschließender Visualisierung im UV-Licht nach Färbung mit Ethidiumbromid ein aussagekräftiges Fingerprint-Bandenmuster; siehe Figuren 1, 2, 4, 6, 7, 9, 13, 15 und 16.
Daher wird in einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung der erfindungsgemäße Primer bevorzugt bei einer nested SAPD-PCR eingesetzt. Der zweite Primer weist hierbei gegenüber dem ersten Primer eine längere Nukleotidsequenz auf. Vorzugsweise ist 3' an der Sequenz des zweiten Primers gegenüber dem ersten Primer ein zusätzliches Nukleotid angefügt. Dieses kann Adenosinmonophosphat (A), Cytidinmonophosphat (C), Guanosinmonophosphat (G) oder Thymidinmonophosphat (T) sein (Tabelle 2).
Wie in den Beispielen gezeigt, hat es sich hierbei als besonders vorteilhaft erwiesen, bei der zweiten Amplifikation, der nested SAPD-PCR, keine Rampe durchzufuhren. In einer besonders bevorzugten Ausfuhrungsform der erfindungsgemäßen DNA-Fingerprint-Analyse umfasst diese eine Amplifikation der zu analysierenden DNA durch PCR, wobei eine erste Amplifikation mit einem ersten Primer und eine zweite Amplifikation mit einem zweiten Primer durchgeführt wird. In einer besonders bevorzugten Ausfuhrungsform der erfindungsgemäßen DNA-Fingerprint-Analyse wird die erste Amplifikation mit Rampe und die zweite Amplifikation ohne Rampe durchgeführt. In einem eigenständigen Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung die vorstehend beschriebene SAPD-PCR und nested SAPD-PCR, die nicht auf die Verwendung der erfindungsgemäßen Primer beschränkt ist, wobei diese allerdings bevorzugt sind.
Bei Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens hat sich weiterhin gezeigt, dass insbesondere Primerkonzentrationen im Bereich von 0,1 - 10 μM, vorzugsweise im Bereich von 0,5 - 5 μM und besonders bevorzugt von 2 ± 1 μM geeignet sind. Hinsichtlich der Template-DNA haben sich bei Durchführung der SAPD-PCR Konzentrationen im Bereich von 50 - 500 ng als besonders vorteilhaft erwiesen. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens werden für die Amplifikationsreaktion 50 - 500 nM Template-DNA und 1 - 2 μM Primer eingesetzt; siehe Beispiel 2, Ziffern 2.2 und 2.3.
Bei der Durchführung der erfindungsgemäßen nested SAPD-PCR wurde überraschenderweise festgestellt, dass diese ganz allgemein dazu geeignet ist, die schlechte Reproduzierbarkeit der RAPD-PCR zu verbessern, bei der häufig das zufällige Auftreten oder Verschwinden von PCR-Amplifikaten, bei Wiederholung der gleichen Reaktion, beobachtet werden kann (Newton und Graham, PCR (Labor im Fokus) 2. Aufl. (Ed. Newton und Graham), Spektrum Akad. Verl., Heidelberg (1994)). Die erste PCR-Runde (SAPD-PCR) im erfϊndungsgemäßen Verfahren basiert auf der Methode der RAPD-PCR, daher können auch weniger spezifische Primer-Bindungen entstehen. Diese Bindungen sind jedoch notwendig um auf Stamm-Ebene differenzieren zu können.
Um Stamm-relevante schwächere Banden an die Intensität anderer Amplifikate anzugleichen, wird im erfindungsgemäßen Verfahren in der nested PCR-Reaktion (zweite Amplifikation) vorzugsweise ein PCR-Beschleuniger (Enhancer-Solution P, Peqlab; Q-Solution, Qiagen) verwendet und die Reaktion ohne Rampe durchgeführt. Das Weglassen der Rampe ist vorteilhaft, da Stamm-relevante Unterschiede besser zum Ausdruck kommen. Durch die Anwendung eines nested Primers, also z. B. die Verwendung des Primers A-Not (5 ' AGCGGCCGC-A 3 ') in der ersten Reaktion und beispielsweise A-Not-A (5ΑGCGGCCGC-AA 3 ') bei der nested PCR wird der Einfluss nicht-reproduzierbarer Banden gemindert. Mit der Auswertung mehrerer Gelbilder (i. d. R. 4), die durch nested SAPD-PCR mit verschiedenen Primern zuvor produziert wurden, kann so der fehlerhafte Einfluss durch Auftreten oder Verschwinden einzelner Gelbanden minimiert werden. Gegenüber anderen Fingerprint- Verfahren, wie z. B. RFLP- (Zavaleta et al., Appl. Environ. Microbiol. 63 (1997), 1261-1267) bzw. RAPD- (Lechiancole et al., Syst. Appl. Microbiol. (2005), Elektronische Veröffentlichung vor dem Druck) Analyse überzeugt die nested SAPD- PCR durch ein höheres Auflösungsvermögen.
Der größte Vorteil der nested SAPD-PCR gegenüber bisher verwendeten molekularbiologischen Methoden zur Verwandtschaftsanalyse ist, dass sie bei allen bisher untersuchten Organismen-Gruppen, selbst bei Organismen mit sehr konserviertem Genom {Oenococcus oeni), angewandt werden kann, ohne eine Vielzahl von zufällig gewählten Primern auszuprobieren (vgl. handelsübliche RAPD-Primer Kits mit bis zu über 500 Primern). Das Kit für die nested SAPD-PCR kommt vergleichsweise mit nur 5 bis 20 Primern aus und konnte bisher bei Bakterien, Hefen, Pflanzen, Tieren und Menschen, also bei pro- und eukaryotischen Organismen erfolgreich eingesetzt werden. Für die Analyse sind üblicherweise 6 Primer ausreichend.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform umfasst das erfindungsgemäße Verfahren neben der SAPD-PCR auch die Technik der Sequence Characterized Amplified Region-PCR (SCAR-PCR). Diese wird im Anschluss an die erfindungsgemäße SAPD-PCR durchgeführt; siehe Beispiel 9. Die Sequence Characterized Amplified Region (SCAR)-Analyse wurde erstmals von Paran und Michelmore eingesetzt (Paran und Michelmore, Theor. Appl. Genet. 85 (1993), 985-993). Bei der SCAR-PCR wird eine spezifische Bande aus dem SAPD-GeI ausgeschnitten und die Sequenz bestimmt. Im Anschluss daran werden die die Sequenz flankierenden spezifischen Primer synthetisiert, mit der sich nun wiederum in einer SCAR- PCR der entsprechende Klon oder eine bestimmte Spezies identifizieren lässt.
Ein weiterer großer Vorteil der erfindungsgemäßen DNA-Fingerprint-Analyse, insbesondere der nested SAPD-PCR ist, dass sie im Gegensatz zu bisher verwendeten molekularbiologischen Verfahren sowohl zum Nachweis und der Identifizierung von Nukleinsäurespezies in bzw. von jedwedem biologischem Material geeignet ist, als auch zur Verwandtschaftsanalyse bei beliebigen unterschiedlichen Organismen-Gruppen angewandt werden kann. Das erfindungsgemäße Verfahren wurde bisher an Bakterien, Hefen, Pflanzen, Tieren und Menschen, also pro- und eukaryotischen Organismen, erfolgreich eingesetzt. Daneben ist auch der Einsatz bei der Bestimmung verschiedener Tumorarten möglich. In einer bevorzugten Ausfuhrungsform der erfindungsgemäßen DNA-Fingerprint-Analyse ist der zweite Primer ein nested Primer. Der zweite Primer weist hierbei gegenüber dem ersten Primer eine längere Nukleotidsequenz auf. Vorzugsweise ist 3' an der Sequenz des zweiten Primers gegenüber dem ersten Primer ein zusätzliches Nukleotid angefügt. Dieses kann Adenosinmonophosphat (A), Cytidinmonophosphat (C), Guanosinmonophosphat (G) oder Thymidinmonophosphat (T) sein.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform weist der erste Primer eine der in Tabelle 1 angegebenen Sequenzen auf. In einer weiteren besonders bevorzugten Ausführungsform der erfindungsgemäßen Verwendung weist der erste oder zweite Primer eine der in Tabelle 2 angegebenen Sequenzen auf.
Üblicherweise wird in der erfindungsgemäßen DNA-Fingerprint-Analyse die DNA der Größe nach auf einem Gel aufgetrennt. Fingerprints vergleichbarer Auflösung und Sensitivität können hierbei mit DIG-markierten PCR-Produkten direkt im Gel ohne die generell in bekannter Weise vorgenommene Übertragung der DNA-Fragmente auf Membranen (Southern Blot) sichtbar gemacht werden. Damit ist die Erstellung derartiger Fingerprints in einfachster Weise ohne die Verwendung von Radioaktivität möglich. Vorzugsweise werden hierzu die Amplifikationsprodukte in Elektrophoresegelen, wie Agarose- oder Polyacrylamidgelen, aufgetrennt. Diese werden im Gel, beispielsweise durch Verwendung von interkalierenden Substanzen sichtbar gemacht, und die Daten durch direktes Einscannen der Gele unter Verwendung von Computer-unterstützter Datenanalyse ausgewertet. Verfahren zur Computer-unterstützten Datenanalyse sind dem Fachmann bekannt und dem Stand der Technik zu entnehmen, beispielsweise in Doldi et al., Plant Breeding 116 (1997), 331-335; Karp et al., Molecular tools for Screening biodiversity (1998), Chapman und Hall, London; Lebeda und Jendrulek, Theor. Appl. Genet. 75 (1987), 194-199; Nei und Li, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 76 (1979), 5269-5273; Ruckenbauer, Cluster- Analysen und ihre Möglichkeiten zur Erfassung von Komplexeigenschaften in der Getreidezüchtung, Arbeitstagung, Arbeitsgemeinschaft Saatzuchtleiter Gumpenstein (1976), 157-168, Stachel et al., Theor. Appl. Genet. 100 (2000), 242-248 und Veronesi und Falcinelli, Euphytica 38 (1988), 211- 220. Verfahren zur Herstellung von Agarose- oder Polyacrylamidgelen zur Elektrophorese bzw. zur Auftrennung von Nukleinsäuren, beispielsweise von PCR-Produkten auf einem Elektrophoresegel sind im Stand der Technik bekannt und beispielsweise beschrieben in Beispiel 1, Ziffer 1.13 sowie in Sambrook et al., "Molecular Cloning, A Laboratory Handbook", CSH Press, CoId Spring Harbour, 1989. Exemplarische Anwendungen für die Computer-unterstützte Datenanalyse sind im Beispiel 1 unter Ziffern 1.14, 1.15 beschrieben sowie in den Figuren 1, 3, 5, 8, 10, 14 und 17 dargestellt.
Im Zuge der Experimente zum Nachweis der durch die erfindungsgemäße PCR erhaltenen Amplifikationsprodukte nach elektrophoretischer Auftrennung in Agarosegelen wurde überraschend festgestellt, dass die Auflösung der Gele durch Zugabe von wässriger Natriumsilicatlösung (Natronwasserglas) wesentlich verbessert werden kann; siehe auch Ziffer 1.13 in den Beispielen. In einem eigenständigen Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung daher auch Gelelektrophoresemittel und -verfahren, in denen Sauerstoffsäuren des Siliziums, d. h. Kieselsäure bzw. Salze davon wie Natriumsilicat oder wässrige Lösungen davon der Gelzusammensetzung zugesetzt werden. Bei der Verwendung des Begriffs "Kieselsäure" wird vorzugsweise darunter auch das Salz der Kieselsäure bzw. besonders bevorzugt eine wässrige Lösung davon, wie Natronwasserglas verstanden sowie Silikagel, das auch unter dem Namen "Kieselgel" bekannt ist. Besonders bevorzugt sind Alkalisalze der Kieselsäure, insbesondere Natriumsilicat. Grundsätzlich ist die Verwendung von wässriger Natriumsilicatlösung bevorzugt, jedoch sind auch andere Silicate wie Kalziumsilicat bekannt, die gegebenenfalls erfindungsgemäß verwendet werden können. Weitere Salze der Kieselsäure sind bekannt, wie Olivin, Zirkon, Granate, Thortveitit, Kieselgalmei und andere die vorzugsweise in wässriger Lösung verwendet werden. Grundsätzlich kommt auch die Verwendung der Monokieselsäure und deren Kondensationsprodukten in Betracht. Dementsprechend betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung jedweder Kieselsäure bzw. Salze und wässrige Lösungen davon in der Gelelektrophorese, insbesondere in Agarosegelen zur Auftrennung von Nukleinsäuren.
Die Kieselsäuren bzw. Silicate oder wässrige Lösungen davon werden vorteilhafterweise vor dem Aufkochen und erfindungsgemäß in einer Konzentration von 0,005 % bis 0,1 % dem Gel zugegeben, vorzugsweise in einer Konzentration von 0,01 % bis 0,05 % und besonders bevorzugt in einer Konzentration, die 0,035 % Natronwasserglas in einer 1,5 %igen Agarosegellösung entspricht; siehe auch die Beispiele in Ziffer 1.13. Aus den vorstehenden Ausfuhrungen und den Beispielen ergibt sich demnach, dass die vorliegende Erfindung auch Verfahren zum Nachweis von Nukleinsäuremolekülen in Gelen, insbesondere Agarosegelen unter Verwendung von Kieselsäure betrifft. Besonders bevorzugt sind natürlich Verwendungen, bei denen ein hohes Auflösungsvermögen der Gele von besonderem Interesse ist, wie Sequenziergele und insbesondere DNA oder RNA Fingerprintgele. Dabei ist dieser Aspekt der vorliegenden Erfindung nicht auf die Verwendung der vorstehend gekennzeichneten Primer beschränkt, sondern findet ganz allgemein in der Nukleinsäure- Fingerprint-Analyse Anwendung. Demzufolge betreffen die in der vorliegenden Beschreibung erläuterten Ausführungsformen für die erfindungsgemäße DNA-Fingerprint- Analyse auch die erfindungsgemäße Verwendung von Kieselsäure in Gelen bzw. zur gelelektrophoretischen Auftrennung von Nukleinsäuren, ohne jedoch auf die Verwendung der im vorstehenden Aspekt der Erfindung beschriebenen Primer beschränkt zu sein, wobei diese natürlich bevorzugt sind. Daher betrifft die vorliegende Erfindung ganz allgemein Gelzusammensetzungen, vorzugsweise umfassend Agarose, die Kieselsäure in der vorstehend beschriebenen Form und vorzugsweise in der angegebenen Konzentration enthalten. Besonderns bevorzugt sind dabei 0,5 %igebis 2,5 %ige Agarosegelzusammensetzungen, vorteilhafterweise 1,5 %ige Agarosegelzusammensetzungen, die Alkalisilicate, vorzugsweise Natriumsilicat als wässrige Lösung wie Wasserglas in einer Konzentration von 0,01 % bis 0,05 %, vorzugsweise 0,035 % enthalten. Solche erfindungsgemäßen Gelzusammensetzungen sind auch unter dem Begriff Kit, wie er in der vorliegenden Anmeldung gebraucht wird, umfasst.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der erfindungsgemäßen DNA-Fingerprint- Analyse wird die DNA durch interkalierende Substanzen sichtbar gemacht. Vorzugsweise wird die DNA hierbei mit Ethidiumbromid angefärbt und unter UV-Licht sichtbar gemacht. Diese Färbemethode ist Stand der Technik und beispielsweise in Sambrook et al., a.a.O. beschrieben. Erfindungsgemäße Anwendungsbeispiele der Visualisierung eines DNA- Fingerprint-Bandenmusters im UV-Licht nach Färbung mit Ethidiumbromid sind dem Beispiel 1, Ziffer 1.13 sowie den Figuren 1, 2, 4, 6, 7, 9, 13, 15 und 16 zu entnehmen. Für die Anfärbung von den Amplifikationsprodukten in Polyacrylamidgelen bietet sich beispielsweise die Silberfärbung an; siehe beispielsweise Schumacher et al., EMBO J. 2 (1983), 1549-1555.
In einer weiteren Ausfuhrungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird als weiterer oder alternativer Schritt das Amplifikationsprodukt auf eine Membran übertragen und durch Hybridisierung mit einer Sonde sichtbar gemacht. Hierzu kann beispielsweise ein Dot Blot oder Southern Blot durchgeführt und die auf die Membran übertragene DNA durch Hybridisierung mit einer Sonde sichtbar gemacht werden. Da die Primer Bestandteil der amplifizierten DNA sind, ist durch sie in einfacher Weise auch ein Nachweis der Banden auf der für den Southern Blot verwendeten Membran möglich. Somit umfasst die Sonde vorzugsweise den erfindungsgemäßen Primer. Die Durchführung von Southern Blots sowie die Hybridisierungen mit einer geeigneten Sonde sind ebenfalls Stand der Technik und beispielsweise in Sambrook et al., a.a.O. beschrieben.
In einer bevorzugten Ausführungsform trägt der Primer eine Markierung. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist die Markierung eine nicht-radioaktive Markierung, insbesondere Digoxigenin, Biotin, ein Fluoreszenzfarbstoff, ein Farbstoff oder eine radioaktive Markierung, insbesondere 32P oder 35S. Dem Fachmann ist eine Vielzahl geeigneter Markierungen samt dazugehöriger Detektionssysteme bekannt. Fluoreszierende und chemi- oder biolumineszierende Markierungen werden aus Gründen der Sensitivität und praktischen Handhabung bevorzugt.
Die erfindungsgemäße Fingerprint- Analyse kann vorteilhafterweise für Biodiversitätsstudien, Studien zur genetischen Verwandtschaft, taxonomische Studien, oder insbesondere in der Rechtsmedizin, der Züchtung, im Sortenschutz, im Genbank-Management, in der Diagnostik (z. Bsp. Tumore, Mutationen, Mikroorganismen), in der Populationsgenetik oder für Evolutionsstudien eingesetzt werden. Das Fingerprint-Muster ist für jeden Stamm einer Art spezifisch. Die Fingerprints können daher zur Verwandtschaftsanalyse nahe verwandter Organismen/Stämme herangezogen werden und hierbei insbesondere für die Durchführung von Vaterschaftstests. Eine weitere Anwendungsmöglichkeit der erfindungsgemäßen Verwendung betrifft das Gebiet der Partnerschaftsanalysen, und findet beispielsweise bei der Partnerschaftsvermittlung Anwendung. Vorzugsweise werden hierbei Polymorphismen analysiert, die mit bestimmten Merkmalen eines Subjekts korrelieren und ähnlich wie bei morphologischen Merkmalen betreffend die Gesichtsphysiognomie etc. Aussagen über die Kompatibilität von Partnern bzw. Eltern erlauben (Ähnlichkeits-Attraktivitäts-Hypothese). Die hierbei generierten Bandenmuster werden anschließend mit Phylogenie-Programmen ausgewertet. Erfindungsgemäße Anwendungsbeispiele der Auswertung sind in Beispiel 1 unter Ziffer 1.14, 1.15 beschrieben sowie in den Figuren 1, 3, 5, 8, 10, 14 und 17 dargestellt.
In einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung einen der vorstehend definierten Primer, der vorzugsweise zur erfindungsgemäßen Verwendung geeignet ist. Hierbei weist der erfindungsgemäße Primer besonders bevorzugt eine der in Tabelle 1 oder Tabelle 2 angegebenen Sequenzen auf; siehe auch SEQ ID NOs: 1-20. Diese Primer sind bevorzugte Beispiele der in den bisherigen DNA-Fingerprint-Analysen angewandten Primer. In bestimmten Ausführungformen können ein oder mehrere erfindungsgemäße Primer auch auf feste Träger oder Membranen aufgebracht sein, beispielsweise auf einen Chip oder Microarray. Typische Trägermaterialien sind dabei Glas, Nylonmembranen und Plastikfilme. Solche Produkte werden gewöhnlich unter den Begriffen "Chips" und "Arrays" bzw. "Microarrays" zusammengefasst. Verfahren zur Herstellung solcher Chips und (Micro)arrays sind dem Fachmann bekannt; siehe beispielsweise die Übersicht in Dufva, Biomol. Eng. 22 (2005), 173-184 oder Soper et al., Methods 37 (2005), 103-113. Ferner bieten kommerzielle Anbieter die Anfertigung von "Chips nach Maß", d. h. so genannte "Custom-made DNA Arrays" und "Oligo-Sets", siehe beispielsweise Affymetrix, USA, BioCat, Deutschland, GeneScan Europe, Deutschland, Sigma-Aldrich Chemie, Deutschland. Daher umfasst der Begriff "Primer" auch Mittel wie Chips und (Micro)arrays, an denen ein oder mehrere erfindungsgemäße Primer immobilisiert sind.
In einer weiteren Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein Kit zur DNA- Fingerprint-Analyse. Dieses umfasst vorzugsweise die erfindungsgemäßen Primer und/oder eine erfindungsgemäße Gelzusammensetzung und gegebenenfalls weitere Mittel zur Durchführung einer erfindungsgemäßen DNA-Fingerprint-Analyse, beispielsweise die erforderlichen Puffer und andere Reagenzien zur Durchführung der Amplifikationsreaktion. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Kits ist dieses zur Durchführung der erfindungsgemäßen SAPD-PCR und vorzugsweise zur Durchführung der erfindungsgemäßen nested SAPD-PCR, wie vorstehend beschrieben und in Beispiel 2 erläutert, geeignet. Vorteilhafterweise umfasst das erfindungsgemäße Kit daher mindestens einen ersten Primer bzw. ein erstes Primer- S et zur Durchführung einer ersten Amplifϊkation und einen zweiten, so genannten nested Primer bzw. ein Set solcher nested Primer zur Durchführung der zweiten Amplifikation wie vorstehend erläutert. Ferner umfasst das erfindungsgemäße Kit vorzugsweise ein Manual zur Durchführung der erfindungsgemäßen DNA-Fingerprint-Analyse bzw. der erfindungsgemäßen SAPD- bzw. nested SAPD-PCR. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform umfasst das Kit weiterhin eine Polymerase für die Amplifikation der zu analysierenden DNA sowie vorteilhafterweise eine Enhancer- Lösung für die nested PCR. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform umfasst das erfindungsgemäße Kit weiterhin einen bekannten Standard. Dieser Standard kann beispielsweise als Referenz für den Nachweis und/oder die Diagnostik unbekannter Spezies verwendet werden. Das erfindungsgemäße Kit ist in einer weiteren bevorzugten Ausführungsform dadurch gekennzeichnet, dass es zusätzlich eine Vorrichtung zur Durchführung der Amplifikation umfasst, beispielsweise eine PCR-Maschine. Dafür geeignete Vorrichtungen sind im Stand der Technik hinreichend bekannt. Vorzugsweise umfasst das erfindungsgemäße Kit weiterhin Mittel zur Auswertung einer DNA-Fingerprint- Analyse, vorzugsweise ein Computer-unterstütztes Auswertungssystem. Beispiele Computerunterstützter Auswertungssysteme sind in Beispiel 1 unter Ziffer 1.14, 1.15 beschrieben sowie in den Figuren 1, 3, 5, 8, 10, 14 und 17 dargestellt.
Ferner betrifft die vorliegende Erfindung Verfahren zur DNA-Fingerprint-Analyse von biologischem Material, beispielsweise von Menschen, Tieren, Pflanzen, Mikroorganismen oder Viren, wobei das Verfahren die Verwendung des erfindungsgemäßen Primers bzw. des erfindungsgemäßen Kits umfasst und/oder gemäß der erfindungsgemäßen SAPD-PCR bzw. nested SAPD-PCR durchgeführt wird. Vorzugsweise umfasst das Verfahren die Amplifikation der zu analysierenden DNA durch Polymerase-Kettenreaktion (PCR). Das erfindungsgemäße Verfahren kann grundsätzlich zur Identifizierung und zum Nachweis von biologischem Material verwendet werden. "Biologisches Material" ist jedes Material, das genetische Informationen enthält und/oder sich selbst reproduzieren oder in einem biologischen System reproduziert werden kann. Anwendungsmöglichkeiten der erfindungsgemäßen DNA-Fingerprint-Analyse, Primer und Kits ergeben sich im Grunde von selbst. Neben den bereits vorstehend beschriebenen Anwendungsmöglichkeiten kommt beispielsweise auch deren Einsatz in der Lebens- und Futtermittelindustrie in Betracht. Beispielsweise ist es bekannt, dass viele Lebensmittel Spuren von Nukleinsäuren enthalten, die auf die Ursprungspflanze oder das Ursprungstier zur Herstellung des Lebensmittels schließen lassen. Mittels der vorliegenden Erfindung können nun gesicherte Aussagen über den tatsächlichen Ursprung der Lebensmittel bzw. der Zutaten getroffen werden. Ferner können gegebenenfalls Verunreinigungen festgestellt werden wie Kontamination durch Bakterien und Viren. Wie insbesondere durch die Beispiele nahegelegt, ist der Einsatz der erfindungsgemäßen DNA-Fingerprint- Analyse, Primer und Kits natürlich insbesondere in den Bereichen vorteilhaft, in denen Fragen zur Ermittlung der genetischen Distanz bzw. Ähnlichkeit von Nukleinsäurespezies eine Rolle spielen, wie Biodiversitätsstudien, Studien zur genetischen Verwandtschaft, taxonomische Studien oder Studien aus dem Bereich Rechtsmedizin, Züchtung, Sortenschutz, Genbank-Management, Diagnostik, Populationsgenetik oder Evolution.
Weitere Ausführungsformen und Anwendungen der vorliegenden Erfindung sind den Beispielen und den Figuren zu entnehmen, die zu einem besseren Verständnis der vorliegenden Erfindung und ihrer vielen Vorteile beitragen, jedoch nicht als Einschränkung verstanden werden sollen.
Die Figuren zeigen:
Fig. 1: Gelbild- Auswertung und Cluster- Analyse bei der nested SAPD-PCR.
Das Verfahren wurde mit 5 Stämmen von B. bruxellensis durchgeführt. Ml = λ-ONA/EcoRl+Hindlll Marker, 3. M2 = GeneRuler™ 100 bp DNA Ladder.
(1) Ergebnis der SAPD-PCR (Primer: A-Not).
(2) Ergebnis der nested SAPD-PCR (Primer: A-Not-G).
(3) Erstellen von Helligkeitsprofilen aus den einzelnen Gelspuren. Entfernen der Hintergrundsignale.
(4) Übereinanderlegen der einzelnen Datenreihen.
(5) Erstellen eines 3-stelligen, dualen Zahlencodes, der das Vorhandensein oder die Abwesenheit einer Gelbande und die Intensität des Signals beschreibt. (6) Erstellen eines Stammbaums anhand der Datenmatrix.
Fig. 2: Ergebnis der nested SAPD-PCR mit den verwendeten O. oe«/-Stämmen mit C-
Not PCR-Produkt nach gelelektrophoreti scher Auftrennung. Primer: C-Not-C. 'Marker: λ-DNA / EcoRI+Hindlll, 2Marker: GeneRuler™ lOO bp DNA-Ladder.
Fig. 3: Cluster-Analyse der Oenokokken-Stämme anhand der nested SAPD-PCR mit den Primern C-Not-A, C-Not-C und C-Not-T.
Fig. 4: Ergebnis der nested SAPD-PCR mit Stämmen von P. parvulus mit C-Not
PCR-Produkt nach gelelektrophoretischer Auftrennung. Primer: C-Not-C. 'Marker: GeneRuler™ 100 bp DNA-Ladder Plus.
Fig. 5: Cluster-Analyse der P. parvulus-Stämme anhand der nested SAPD-PCR mit den Primern C-Not-A und C-Not-G.
Fig. 6: Ergebnis der SAPD-PCR zur Artunterscheidung von Brettanomyces sp. nach gelelektrophoretischer Auftrennung der PCR-Produkte.
Es sind 3 verschiedene Stämme der Art Brettanomyces bruxellensis verwendet worden sowie Typstämme der anderen Brettanomyces-Piiten. Primer: A-Not. Ml = Marker: λ-DNA / EcoW+HindlU.
Fig. 7: Ergebnis der nested SAPD-PCR mit den B. bruxellensis-Stämmen mit C-Not
PCR-Produkt nach gelelektrophoretischer Auftrennung.
Primer: C-Not-C. 'Marker: λ-DNA / EcόBl+HindUL. 2Marker: GeneRuler™ lOO bp DNA-Ladder.
Fig. 8: Cluster-Analyse der Brettanomyces bruxellensis-Stämme anhand der nested
SAPD-PCR mit den Primern A-Not-A, A-Not-C, A-Not-G, A-Not-T, C-Not-C, C-Not-G und C-Not-T. Fig. 9: Ergebnis der nested SAPD-PCR mit Vitis vinifera mit C-Not PCR-Produkt nach gelelektrophoretischer Auftrennung. Primer: C-Not-G. 'Marker: GeneRuler™ 100 bp DNA-Ladder Plus.
Fig. 10: Cluster- Analyse mit Weinreben {Vitis vinifera) anhand der nested SAPD-PCR mit den Primern G-Not-A, G-Not-G und G-Not-T.
Fig. 11: Ergebnis der SAPD-PCR verschiedener SO 4-, Spätburgunder- und Bionova-
Klone mit G-Not PCR-Produkte nach gelelektrophoretischer Auftrennung. Marker: GeneRuler™ 100 bp DNA-Ladder
Fig. 12: Ergebnis der nested SAPD-PCR verschiedener SO 4-, Spätburgunder- und
Bionova-Klone mit G-Not-T PCR-Produkten nach gelelektrophoretischer Auftrennung. Marker: GeneRuler™ 100 bp DNA-Ladder
Fig. 13: Beispiel zur Unterscheidung verschiedener Labormäuse mittels nested SAPD-
PCR. A: Ergebnis der nested SAPD-PCR.
Primer: C-Not- A. 'Marker: λ-DNA / EcoRI+HindUI Marker, 3. B: Ergebnis der nested SAPD-PCR.
Primer: C-Not-C. 'Marker: GeneRuler™ 100 bp DNA-Ladder. C: Ergebnis der nested SAPD-PCR.
Primer: C-Not-G. 'Marker: λ-DNA / EcoKL+Hindlll Marker, 3. D: Ergebnis der nested SAPD-PCR.
Primer: C-Not-T. 2Marker: GeneRuler™ 100 bp DNA-Ladder.
Fig. 14: Cluster-Analyse mit Labormäusen (Mus musculus) anhand der nested SAPD-
PCR mit den Primern C-Not-A, C-Not-C, C-Not-G, C-Not-T.
Fig. 15: Ergebnis der nested SAPD-PCR mit DNA aus menschlichen Blutzellen mit A-
Not PCR-Produkt nach gelelektrophoretischer Auftrennung. Primer: A-Not-C. 'Marker: GeneRuler™ 100 bp DNA-Ladder Plus. K=Kind, A=Außengruppe, E=Elter, Z=Zwilling, Familien=I, II
Fig. 16: Ergebnis der nested SAPD-PCR mit DNA aus menschlichen Blutzellen mit A-
Not PCR-Produkt nach gelelektrophoretischer Auftrennung. Primer: A-Not-G. 'Marker: GeneRuler™ 100 bp DNA-Ladder Plus. K=Kind, A= Außengruppe, E=Elter, Z=Zwilling, Familien=I, II
Fig. 17: Cluster- Analyse mit DNA aus menschlichen Blutzellen anhand der nested
SAPD-PCR mit den Primern A-Not-A, A-Not-G, C-Not-A und C-Not-G.
Fig. 18: Nested SAPD-PCR mit verschiedenen Arten der Gattung Pediococcus nach gelelektrophoretischer Auftrennung. Die nested SAPD-PCR wurde mit Primer G-Not-T durchgeführt. Die zu analysierenden Amplifϊkate wurden mit einem sterilen Skalpell ausgeschnitten. Abkürzungen: PDA = P. damnosus, PPA = P. parvulus, PAC = P. acidilactici, PPE = P. pentosaceus, PIN = P. inopinatus, PCE = P. cellicola, PCL = P. claussenii, PST = P. stiksii, PDE = P. dextrinicus. Zur Stammbezeichnung siehe Tabelle 3 in Beispiel 9.
Fig. 19: SCAR-PCR zur spezifischen Identifizierung von P. acidilactici nach gelelektrophoretischer Auftrennung (Kontrolle mit verwandten Arten). Zur Stammbezeichnung siehe Tabelle 3 in Beispiel 9. Abkürzungen: M = Marker (DNA Ladder Mix, Fermentas), PAC = P. acidilactici, PDA = Pediococcus damnosus, PPA = P. parvulus, PIN = P. inopinatus, PDE = P. dextrinicus, PPE = Pediococcus pentosaceus, PCL = P. claussenii, PCE = P. cellicola, PST = P. stilesii, La = Lactobacillus acidophilus, Ld = Lactobacillus delbrückii, Lc = Lactobacillus casei, Lf = Lactobacillus fermentum, Lp = Lactobacillus plantarum, Lh = Lactobacillus hilgardii, Lb = Lactobacillus buchneri, E. = Enterococcus, Ef = Enterococcus faecalis, Lei = Lactococcus lactis, Sm = Streptococcus mutans, Lm = Leuconostoc mesenteroides, Oo = Oenococcus oeni. Der Offenbarungsgehalt der vor- und nachstehend zitierten Dokumente aus dem Stand der Technik ist hiermit durch Bezugnahme in dieser Anmeldung enthalten, insbesondere betreffend die Herstellung von erfindungsgemäßen Primern, damit beladene Chips und Arrays, etc. Diese und andere Ausführungsformen sind dem Fachmann offenbart und offensichtlich und umfasst durch die Beschreibung und die Beispiele der vorliegenden Erfindung. Weiterführende Literatur zu einer der oben angeführten Werkstoffen und elektronischen Hilfsmitteln, die im Sinne der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, können dem Stand der Technik entnommen werden, z.B. aus öffentlichen Bibliotheken unter z.B. der Benutzung elektronischer Hilfsmittel. Zudem bieten sich andere öffentliche Datenbanken an wie die "Medline", die über das Internet zur Verfügung stehen.
Techniken zur Ausführung der Erfindung sind dem Fachmann bekannt und können der einschlägigen Literatur entnommen werden, siehe beispielsweise Molecular Cloning A Laboratory Manual, 2nd Ed., ed. by Sambrook, Fritsch and Maniatis (CoId Spring Harbor Laboratory Press: 1989); DNA Cloning, Volumes I and II (D. N. Glover ed., 1985); Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait ed., 1984); Mullis et al. U.S. Pat. No. 4,683,195; Nucleic Acid Hybridization (B. D. Harnes & S. J. Higgins eds. 1984); Transcription And Translation (B. D. Harnes & S. J. Higgins eds. 1984); Culture Of Animal Cells (R. I. Freshney, Alan R. Liss, Inc., 1987); Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press, 1986); B. Perbai, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984); the treatise, Methods In Enzymology (Academic Press, Inc., N. Y.); Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells (J. H. Miller and M. P. Calos eds., 1987, CoId Spring Harbor Laboratory); Methods In Enzymology, VoIs. 154 and 155 (Wu et al. eds.), Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology (Mayer and Walker, eds., Academic Press, London, 1987); Handbook Of Experimental Immunology, Volumes I-IV (D. M. Weir and C. C. Blackwell, eds., 1986); Extracting information from cDNA arrays, Herzel et al., CHAOS 11, (2001), 98-107. Die nachfolgenden Beispiele illustrieren die Erfindung, ohne sie einzuschränken. BEISPIELE
Beispiel 1: Material und Methoden
1.1 Kultivierung bzw. Herkunft der Oenococcus oeni- Stämme
Alle 15 untersuchten Oenokokken-Stämme kamen aus der Kulturensammlung des Institutes für Mikrobiologie und Weinforschung der Universität Mainz. Die Stämme wurden einerseits aus verschiedenen Weinen aus unterschiedlichen Regionen Deutschlands (Stämme: B70, B241, B325, B358, B359, B367, B377, B378) und andererseits aus kommerziell erhältlichen Starterkulturen (SKl, SK2, SK3 (Lallemand, Erbslöh), B350 ("Viniflora oenos", Hansen), B352 ("Leuconostoc oenos", Lallemand), B353 ("Siha Viniflora oenos", Begerow), B354 ("Ana-Start", Deutsche Weinanalytiker) isoliert. Die Oenokokken-Stämme B358, B359, B367, B377, B378 waren alle von demselben Weingut. Die Oenokokken-Stämme wurden in 250 ml Tomatensaft-Medium (2 % Trypton, 0,5 % Hefeextrakt, 0,5 % Pepton, 0,5 % Glucose, 0,005 % Tween 80 in 1 :4 verdünntem Tomatensaft lösen, auf pH 5,2-5,5 einstellen und 15 min autoklavieren) bei RT inkubiert und die Zellen für die Isolation der genomischen DNA in der späten log-Phase geerntet.
1.2 Kultivierung bzw. Herkunft der Pediococcus parvulus-Stämme
Alle 8 verwendeten Pediococcus parvulus-Stämme (9, 30, 34, 35, 115, 128, 21 6, 36_6) stammten aus der Kulturensammlung des Institutes für Mikrobiologie und Weinforschung der Universität Mainz. Die Stämme wurden ursprünglich aus rheinhessischen Weinen isoliert. Die Pediokokken- Stämme wurden in 10 ml MRS-Medium (1 % Pepton, tryptisch verdaut, 1 % Fleischextrakt, 0,5 % Hefeextrakt, 2 % Glucose, 0,1 % Tween 80, 0,2 % K2HPO4, 0,5 % Natriumacetat, 0,2 % (NH4)2-Citrat, 0,02 % MgSO4-7H2O, 0,005 % MnSO4-7H2O in demineralisiertem (d) H2O lösen, auf pH 5,2 einstellen und 15 min autoklavieren) bei RT kultiviert und die Zellen in der späten log-Phase geerntet.
1.3 Kultivierung bzw. Herkunft der Brettαnomyces- Stämme
Die Brettαnomyces-Stämme stammten alle aus der Kulturensammlung des Institutes für Mikrobiologie und Weinforschung der Universität Mainz. Von den verwendeten Brettαnomyces bruxellensis-Stämmen (9, 30, 34A, 34B, 35, 75A, 75B, 76A, 76B, 374, 566, 567, 568, 573, 575, 579) wurden die Stämme 9, 30, 34A, 34B, 35, 75A, 75B, 76A, 76B alle aus dem gleichen Weinanbaugebiet isoliert. Die restlichen Stämme stammten aus weiter entfernten Regionen. Außerdem wurden die Typstämme der Brettanomyces-Arten B. anomalus (574), B. custersianus (576), B. nanus (577) und B. naardenensis (578) mit in die Verwandtschaftsanalyse einbezogen. Die Hefestämme wurden in 250 ml YPG-Medium (1 % Hefeextrakt, 2 % Pepton, 1 % Glucose in dH2O lösen, auf pH 6,5 einstellen und für 15 min autoklavieren. Nach dem Abkühlen 0,002 % Cycloheximid und 0,01 % Ampicillin zugeben) bei 30 °C mit 130 UpM auf einem Schüttler inkubiert. Die Zellen wurden in der späten log- Phase geerntet.
1.4 Herkunft von Vitis vinifera vinifera
Für die Cluster- Analyse der Weinreben wurden die Rebsorten Riesling, Silvaner, Madeleine Royale, Müller-Thurgau, Rieslaner, Spätburgunder, Frühburgunder, Grauer Burgunder, Weißburgunder, Trollinger und Kerner verwendet.
1.5 Zellernte der Mikroorganismen
250 ml Zellkultur wurden nach der jeweiligen Inkubationszeit für 25 min bei 12.000 g abzentrifugiert und der Überstand verworfen. Das Zellpellet wurde in 125 ml Waschpuffer resuspendiert und die Zeil-Suspension zentrifugiert (12.000 g, 20 min). Dieser Waschschritt wurde einmal wiederholt. Anschließend wurde der Überstand dekantiert und evtl. verbleibender Überstand abpipettiert. Die Zellen wurden dann in 10 ml Zell-Suspensions- Puffer aufgenommen.
1.6 Zellaufschluss und DNA-Isolierung der Mikroorganismen
Der Zellaufschluss von Oenococcus oeni und Pediococcus parvulus erfolgte durch Inkubation mit Lysozym. Nach Zugabe von 25 mg (2,5 mg/ml) Lysozym zu der Zeil-Suspension wurde die Mischung für 2-3 h bei RT inkubiert. Anschließend wurden 15 ml des warmen Lyse- Puffers zugegeben und die Zellen 2 h bei 55 °C aufgeschlossen. Nach der Inkubation mit Lysozym wurde die Zeil-Suspension mit Proteinase K (100 μg/ml), RNase A (12,5 μg/ml) und RNase Tl (25 U/ml) versetzt und für 2 h bei 55 °C inkubiert.
Die Brettanomyces bncxellensis-Stämme wurden mit Zymolyase aufgeschlossen (Kitamura und Yamamoto, Arch. Biochem. Biophys. 1 (1972), 403-406). 10 ml Zeil-Suspension wurden mit 15 ml warmem Lyse-Puffer versetzt und nach Zugabe von 1 ml Zymolyase-Lösung (15 mg/ml) 2 h bei 37 0C inkubiert. Nach der Inkubation der Zellen mit Zymolyase wurden Proteinase K (100 μg/ml), RNase A (12,5 μg/ml) und RNase Tl (25 U/ml) zu der Zeil- Suspension gegeben und für 2 h bei 55 °C inkubiert.
1.7 Isolation genomischer DNA aus Mikroorganismen
Zur Isolation der genomischen DNA wurde die Technik von Marmur (1961) angewandt (Marmur, J. Mol. Biol. 3 (1961), 208). Alternativ kann die DNA-Isolierung aus Grampositiven Bakterien und Hefen auch mit einem Kit DNeasy® Tissue Kit (Qiagen, Hilden) durchgeführt werden.
1.8 DNA-Isolierung aus Vitis vinifera
Die DNA-Isolierung erfolgte nach der Methode von Lodhi et al. (1994) (Lodhi et al., Plant Mol. Biol. Rep. 12 (1994), 6-13).
1.9 DNA-Isolierung aus Mus musculus
Ca. 2 cm der Mausschwänze wurden dekapitiert. Die DNA wurde mit dem DNeasy® Tissue Kit (Qiagen, Hilden) nach dem Protokoll "Purification of Total DNA from Rodent Tails" isoliert.
1.10 DNA-Isolierung aus menschlichen Blutzellen
Das Blut der Probanden wurde intravenös entnommen. Die DNA-Isolierung aus Blutzellen erfolgte nach dem Protokoll "Isolation of Genomic DNA from Whole Nucleated or Non- Nucleated Animal Blood" mit Hilfe des DNeasy® Tissue Kit (Qiagen, Hilden).
1.11 Lagerung der DNA
Die Lagerung der isolierten DNA mit 0,lxSSC-Puffer ist nur für kurze Zeiträume geeignet und bereitet bei längerer Aufbewahrung (> 0,5 a) Schwierigkeiten (Hintergrund, Mangel an Reproduzierbarkeit) bei der nested SAPD-PCR. Die Aufbewahrung in einer Suspension bestehend aus 70 %igem Ethanol und 0,lxSSC-Puffer verlängert die Lagerfristen um Jahre.
1.12 Bestimmung der DNA-Konzentration und -Reinheit
Konzentration und Reinheit der isolierten DNA wurden photometrisch bei 260 nm bestimmt. Die Konzentration der DNA-Probe berechnete sich unter Berücksichtigung des Verdünnungsfaktors (V) sowie des Multiplikationsfaktors (F), der für doppelsträngige DNA (dsDNA) 50 beträgt, wie folgt: c [ng/μl] = (OD bei 260 nm)*V*F.
1.13 Durchführung der Agarose-Gelelektrophorese
Die Analyse der PCR-Fragmente erfolgte in einem 1,5 %igen Agarose-Gel in einer Horizontalelektrophorese-Kammer. Zur Verbesserung der Auflösung der Gele wurden (0,035 %) Natron Wasserglas vor dem Aufkochen zugegeben. Vor dem Giessen des Gels wurde Ethidiumbromid-Lösung (Endkonzentration 500 ng/ml) zugegeben. Je 5 μl PCR- Produkt wurden mit 1 μl Ladepuffer (6x) vermischt und auf das Gel aufgetragen. Die Trennung der Fragmente erfolgte zunächst für 20 min bei einer Spannung von 60 V und anschließend für 130 min bei 75 V. Nach der Elektrophorese wurde das Bandenmuster auf einem Transilluminator durch UV-Licht sichtbar gemacht.
1.14 Computergestützte Fingerprint-Analyse Gelbildauswertung
Die Gele wurden im Anschluss an die Elektrophorese mithilfe einer Geldokumentationseinheit (Polaroid, Offenbach) fotografiert und im TIF-Datenformat gespeichert. Im Programm TINA (Raytest Isotopenmessgeräte, Straubenhardt) wurden aus den einzelnen Spuren der Gelbilder Helligkeitsprofile generiert. Anschließend wurden die einzelnen Profile aligniert.
1.15 Cluster- Analyse (alternativ mit GelComparll®, Applied Maths)
Die alignierten Helligkeitsprofile werden entsprechend dem Vorhandensein einer Bande in eine duale Datenmatrix umgewandelt. Die Intensität der Banden wurde durch Auswahl von 3 Intensitätskategorien berücksichtigt. Für die duale Darstellung werden daher pro Signal 3 Matrizenpositionen belegt. Mehrere Datenmatrices, die durch die Auswertung der Gelbilder gleicher Stämme mit verschiedenen SAPD-Primern erstellt wurden, werden hintereinander gereiht. Diese Datenmatrix wurde mit dem Programm ClustalX 1.83 (Thompson et al., Nucleic Acids Res. 25 (1997), 4876-4882) in ein Dendrogramm umgewandelt. Die prinzipielle Durchführung der Gelbild-Auswertung und Cluster-Analyse ist in Figur 1 dargestellt. Beispiel 2: Erfindungsgemäße SAPD-PCR
Wenn nicht anders angegeben, können Techniken zur Ausführung der Erfindung der einschlägigen Literatur entnommen werden, siehe beispielsweise Sambrook et al., "Molecular Cloning, A Laboratory Handbook", CSH Press, CoId Spring Harbour, 1989; DNA Cloning, Bd. I and II (D. N. Glover Hrsg., 1985) und Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait Hrsg., 1984).
2.1 Oligonukleotide
Zur SAPD-PCR wurden die vier Decamere A-, C-, G- und T-Not verwendet. Diese bestanden aus dem Nukleotid (Base) Adeninmonophosphat, an der die Erkennungssequenz der NM- Restriktionsendonuklease und jeweils ein weiteres Nukleotid (A, C, G oder T) angefügt wurden; siehe Tabelle 1. Für die nested SAPD-PCR wurden Undecamere konstruiert, indem an die Sequenz der S APD-Primer jeweils eine weitere Base angefügt wurde; siehe Tabelle 2.
2.2 Durchführung der SAPD-PCR
Zur SAPD-PCR wurden Reaktionsansätze mit einem Gesamtvolumen von 25 μl hergestellt. Die PCR wurde in 200 μl-Reaktionsgefäßen durchgeführt. Die Gehaltsangaben der einzelnen Reagenzien eines 25 μl Reaktionsansatzes lauten wie folgt:
Figure imgf000030_0001
(Die Gesamtkonzentration an MgCl2 im Reaktionsansatz betrug 4 mM).
Nachfolgend ist das Thermocycler Programm zur SAPD-PCR mit den Primern A-, C-, G-, T- Not dargestellt. Die Annealing-Temperatur betrug 35 °C. Im Anschluss an den Annealing- Schritt folgte eine sog. "Rampe". Die Temperaturerhöhung bis zur Elongation dauerte 8 min pro PCR-Zyklus. Das gesamte PCR-Programm mit 35 Zyklen dauerte ca. 15,5 h.
Figure imgf000031_0001
2.3 Durchführung der nested SAPD-PCR
Als Template-DNA diente bei der nested PCR ein Mikroliter PCR-Produkt der ersten PCR- Reaktion. Durch die Zugabe von Enhancer Solution P (Peqlab) kam es zu einer verstärkten Amplifikation spezifischer PCR-Produkte (Tab. 4). Die Annealing-Temperatur betrug bei der nested PCR mit den A- und T-Not Primern 39 °C und mit den C- und G-Not Primern 41 0C. Es wurde keine Rampe verwendet. Die gesamte PCR-Reaktion dauerte ca. 5 h. Nachfolgend ist die Zusammensetzung eines Reaktionsansatzes zur nested SAPD-PCR dargestellt.
Figure imgf000031_0002
(Die Gesamtkonzentration an MgCl2 im Reaktionsansatz betrug 4 mM). Nachfolgend ist das Thermocycler-Programm einer nested SAPD-PCR dargestellt.
Figure imgf000032_0001
(Pro Reaktionsansatz wurde nur 1 Primer verwendet).
Tabelle 1 : Beispiele verwendeter Oligonukleotide (Primer) für die SAPD-PCR
Figure imgf000032_0002
Tabelle 2: Beispiele verwendeter Oligonukleotide (Primer) für die nested SAPD-PCR
Figure imgf000032_0003
Beispiel 3: Anwendung der nested SAPD-PCR bei Oenococcus oeni
Oenokokken eignen sich für den biologischen Säureabbau im Wein und werden in Form von Starterkulturen eingesetzt (Davis et al., Appl. Environ. Microbiol. 51 (1986), 539-545). Oenokokken sind heterofermentative Milchsäurebakterien. Die Spezies Oenococcus oeni ist genotypisch sehr homogen. Die bisher untersuchten Stämme zeigten bei der DNA-DNA- Hybridisierung stets eine Homologie über 70 % (Garvie, J. Syst. Bacteriol. 26 (1976), 116- 122 und Dicks et al., Int. J. Syst. Bacteriol. 40 (1990), 83-91) und weisen bei der für die Bakterienidentifizierung üblichen Analyse der 16S-rDNA nahezu keine Sequenzunterschiede auf 1500 bp auf. Somit besteht die Gattung Oenococcus weltweit aus nur einer Art. Die Sequenzanalyse der Region zwischen den 16S- und 23SrRNA-Genen (Le Jeune und Lonvaud-Funel et al., Res. Microbiol. 148 (1997), 79-86) erwies sich ebenfalls als ungeeignet für eine direkte Stammidentifizierung. Die Pulsfeldgelelektrophorese (PFGE) genomischer Makrorestriktionsfragmente (Kelly et al., Appl. Environ. Microbiol. 59 (1993), 3969-3972 und Sato et al., FEMS Microbiol. Lett. 202 (2001) 109-114) und die RAPD-PCR (Zavaleta, et al., Appl. Environ. Microbiol. 63 (1997), 1261-1267 und Zapparoli et al., FEMS Microbiol. Lett. 166 (1998), 325-332) sind molekularbiologische Methoden, die zur Stamm- Identifizierung bei Oenococcus oeni bereits erfolgreich eingesetzt werden konnten. Durch PFGE konnte das Stamm-Niveau jedoch nicht immer erreicht werden (Zavaleta et al., Appl. Environ. Microbiol. 63 (1997) 1261-1267). Die Unregelmäßigkeit der spontan auftretenden malolaktischen Gärung im Wein hat zum Einsatz von Oenococcus oeni in Form von Starterkulturen geführt. Für eine kommerzielle Nutzung von geeigneten Oenococcus oeni- Stämmen ist es wichtig, ein Verfahren zur Stamm-Identifizierung zur Hand zu haben, das die Identität ausgewählter Kulturen gewährleistet. Für Winzer, die auf den Einsatz von kommerziellen Starterkulturen verzichten und natürlich vorkommende Oenokokken- Stämme aus dem eigenen Wein verwenden, ist es außerdem wichtig, diese von unerwünschten Milchsäurebakterien zu unterscheiden, um gezielt die Stämme anzureichern, die einen positiven Einfluss auf das Aroma ausüben.
Eine aussagekräftige und reproduzierbare Stamm-Identifizierung gelang allerdings erst durch die Verwendung der erfindungsgemäßen nested SAPD-PCR gemäß Beispiel 2. Am Beispiel von 15 untersuchten Oenokokken-Stämmen konnte dabei deren Auflösung auf Stamm-Niveau gezeigt werden; siehe Figuren 2 und 3. Beispiel 4: Anwendung der nested SAPD-PCR bei Pediococcus parvulus
Pediokokken sind fakultativ anaerobe, homofermentative, coccoide Milchsäurebakterien. Die Gattung Pediococcus (P.) setzt sich aus etwa zehn Spezies zusammen. Bekannte Vertreter der Gattung sind P. damnosus, P. parvulus, P. inopinatus, P. dextrinicus, P. pentosaceus, P. acidilactici, P. urinaeequi, P. claussenii, P. cellicola und P. soyae. Pediokokken kommen überwiegend auf Pflanzen und fermentierten Nahrungsmitteln (Getreideprodukte, Fleisch, Fisch, Gemüse, Bier und Wein) vor.
P. acidilactici und P. pentosaceus gehören zu den meist verwendeten Arten, die bei der Fermentierung von Wurstprodukten eingesetzt werden. Einige Arten wurden aus dem Gastrointestinaltrakt und dem Urogenitaltrakt von Tieren und Menschen isoliert. Manche Pediokokken- Stämme können wie Oenokokken ebenfalls den biologischen Säureabbau im Wein durchführen, bilden aber im Unterschied zu den Oenokokken störende Nebenprodukte wie Diacetyl und Acetoin (Wibowo et al., Am. J. Enol. Vitic. 36 (1985), 302-313). Ihr Wachstum ist daher im Wein unerwünscht. Bei der Weinbereitung gelangen die Pediokokken über die Weintrauben oder über unsterile Kellergeräte in den Wein (Costello et al., Food Techno. Aust. 35 (1983), 14-18). Am häufigsten wurden die Arten P. damnosus, P. pentosaceus und P. parvulus aus Weinen isoliert. Diese Arten können durch die Bildung von Exopolysacchariden zum "Zäh-" oder "Lindwerden" von Weinen führen. Vor allem Stämme von P. dammosus sind bei pH- Werten über 3,5 fähig ein Exopolysaccharid zu synthetisieren, das bei einem Zelltiter von 105 Zellen/ml bereits für eine starke Zunahme der Viskosität sorgt (Sponholz, In: Wine Microbiology and Biotechnology (Fleet, G.H., Ed.). Hardwood Academic Publisher, Chur. (1993), 395-420).
Ein weiterer negativer Einfluss auf die Weinqualität ist die Fähigkeit einiger Pediokokken- Stämme zur Bildung von biogenen Aminen, wie z. B. Histamin, die gesundheitsschädlich für den Mensch sein können (Landete et al., J Appl. Microbiol. 99 (2005), 580-586). Es wurden bereits mehrere molekularbiologische Verfahren zur Identifizierung von Stämmen der Gattung Pediococcus beschrieben. Die am häufigsten verwendeten Methoden sind Fingerprint- Verfahren wie die RAPD-PCR und die PFGE. Eine RAPD-PCR Methode mit einem 9-mer Primer wurde von Nigatu et al. (Lett. Appl. Microbiol. 26 (1998), 412-416) zur Art-Unterscheidung verschiedener Isolate der Gattung Pediococcus aus fermentiertem Getreide eingesetzt. In dieser Studie konnte mittels RAPD-PCR mehr als 40 % der Isolate nicht zu der richtigen Art zugeordnet werden. Durch eine vergleichende 16S-rDNA- Sequenzierung wurde festgestellt, dass die Isolate neben einigen Arten der Gattung Pediococcus zu fünf weiteren Gattungen gehören. Zur Unterscheidung verschiedener Stämme der Spezies P. acidilactici wurde von Mora et al. (2000a,b) neben einer RFLP-Analyse und der Analyse einzelner Haushaltsgene, ein 18-mer Primer zur RAPD-PCR verwendet (Mora et al., Microbiology 146 (2000a), 2027-2038 und Mora et al., Syst. Appl. Microbiol. 23 (2000b), 400-408). Mit dem generierten 18-mer Primer konnten nur Stämme der Art P. acidilactici unterschieden werden. Mit Hilfe der PFGE wurden die Verwandtschaftsverhältnisse von Stämmen der Spezies P. acidilactici und P. pentosaceus analysiert (Barros et al., J. Clin. Microbiol. 39 (2001), 1241-1246). Die PFGE wurde von Luchansky et al. (1992) verwendet, um Pediocin-produzierende von Pediocin-negativen Stämmen der Spezies P. acidilactici zu unterscheiden (Luchansky et al., Appl. Environ. Microbiol. 58 (1992), 3053-3059). Simpson et al. (2002) untersuchten die Verwandtschaft von 33 Stämmen unterschiedlicher Herkunft, die sechs verschiedenen Spezies der Gattung Pediococcus angehörten mittels RAPD-PCR und PFGE. (Simpson et al., Appl. Environ. Microbiol. 68 (2002), 765-771). Es konnten fast alle Stämme mit der einen oder anderen Methode unterschieden werden. Bei der RAPD-PCR wurde durch die Kombination der Ergebnisse zweier Primer eine bessere Möglichkeit der Stammdifferenzierung erreicht, als mit jeweils nur einem Primer. Mit Hilfe der PFGE konnten aber insgesamt mehr Stämme unterschieden werden.
Eine gegenüber den vorstehend genannten Fingerprint-Methoden verbesserte Reproduzierbarkeit und ein höheres Auflösungsvermögen konnte durch die erfindungsgemäße nested SAPD-PCR gemäß Beispiel 2 erzielt werden. Ähnlich der Analyse mit den Oenokokken (siehe Beispiel 3) konnte auch bei der Untersuchung der Pediokokken anhand von 8 untersuchten Pediococcus parvulus-Stämmen eine gute Reproduzierbarkeit sowie ein hohes Auflösungsvermögen bestätigt werden; siehe Figuren 4 und 5.
Beispiel 5: Anwendung der nested SAPD-PCR bei Brettαnomyces bruxellensis
Hefen der Gattung Brettαnomyces können für Fehltöne in Wein verantwortlich sein (Chatonnet et al., J. Sei. Food Agric. 60 (1992), 165-178) und werden auch bei der Herstellung spezieller Biersorten verwendet (Gilliland J. Inst. Brew. 67 (1961), 257-261). Sie treten im Wein meist nach der alkoholischen und der malolaktischen Gärung, während der Lagerung des Weins im Fass oder in der Flasche auf (Chatonnet et al., Am. J. Enol. Vitic. 46 (1995), 463-468). Trotz der überwiegend negativen Bezeichnung des "Brett"-Charakters wurde beobachtet, dass die Hefen in niedrigen Zellzahlen in einigen Fällen Rotweinen einen positiven Charakter und mehr Komplexität geben (Fugelsang, Wine Microbiology (Ed. KC Fugelsang), Chapman and Hall, New York (1997), 72-80). Oft werden diese Aromen aber als Fehltöne beurteilt. Das Auftreten von Brettanomyces-Hefen wurde in nahezu allen Weinanbaugebieten der Welt beobachtet. Die sortentypischen und regionalen Aromamerkmale eines Weines können vollkommen von Fehltönen überdeckt werden und der Wein kann unangenehm bitter schmecken (Fugelsang, Wine Microbiology (Ed. KC Fugelsang), Chapman and Hall, New York (1997), 72-80). Brettanomyces-Hefen können die charakteristischen "Brett" -Aromen schon in niedrigen Zelldichten von 100 bis 1000 Zellen/ml erzeugen. Die Tatsache, dass diese Hefen oft in niedrigen Zellzahlen vorhanden sind und dass sie langsam wachsen, erschwert ihre Identifizierung. Um dem Verderben des Weines vorzubeugen brauchen die Weinhersteller eine zuverlässige Methode zur Identifikation von Brettanomyces-Stämmen, damit Gegenmaßnahmen eingeleitet werden können bevor die Weinqualität sich verschlechtert. Ibeas et al. (1996) benutzten eine nested PCR-Methode, um Brettanomyces- Stämme in Sherrywein nachzuweisen (Ibeas et al., Appl. Environ. Microbiol. 62 (1996), 998-1003). Mitrakul et al. (1999) verwendeten die RAPD-PCR um Hefe-Stämme innerhalb der Spezies B. bruxellensis zu unterscheiden (Mitrakul et al., Food Microbiology 16 (1999), 3-14). Obwohl die Stammdifferenzierung gut durch die RAPD-PCR in dieser Studie funktionierte, waren die Ergebnisse dieser Methode nur schwer reproduzierbar. Auch hier war die nested SAPD-PCR überlegen. Die klassischen Methoden für die Identifizierung und Zellzahlbestimmung der Brettanomyces-Reün dauern 1 bis 2 Wochen und beruhen auf Kultivierung auf semiselektivem Medium mit anschließender Charakterisierung durch biochemische und physiologische Analyse sowie durch mikroskopische Prüfung (Fugelsang, Wine Microbiology (Ed. KC Fugelsang), Chapman and Hall, New York (1997), 72-80). Um die hohe Diversität verschiedener Brettanomyces brnxellensis-Stämme nachweisen zu können, fehlt es aber immer noch an geeigneten Methoden zur Stamm-Unterscheidung. Aussagekräftige und reproduzierbare Ergebnisse zur Stamm-Unterscheidung konnten erst durch die erfindungsgemäße SAPD-PCR erzielt werden. Hierbei gelang die Unterscheidung auf Art-Niveau bereits nach der ersten PCR, wie am Beispiel von 6 verschiedenen Arten der Gattung Brettanomyces gezeigt werden konnte; siehe Figur 6. Mittels der nested SAPD-PCR und anschließender Cluster-Analyse konnte darüber hinaus eine starke Regionsbezogenheit der aus der Region Wonnegau isolierten Brettanomyces bruxellensis-Stämme gezeigt werden. Die topographische Herkunft der Stämme ließ sich mit hoher Kongruenz auf den dargestellten Stammbaum abbilden. Dieser Befund unterstützt die Annahme, dass auch Mikroorganismen einen Beitrag zum Terroir einer Weinregion leisten und die Qualität des Weines nicht nur allein durch Klima, Rebe und Boden geprägt wird. Als "Außengruppe" bei der Analyse wurden Stämme (374, 566-568) aus der Institutsstammsammlung verwendet; siehe hierzu Beispiel 1 sowie Figuren 7 und 8.
Beispiel 6: Anwendung der nested SAPD-PCR bei Vitis vinifera subsp. Vinifera
6.1 Sortenabgrenzung
Zur Weinherstellung wird die Weinrebe Vitis vinifera subsp. vinifera kultiviert. Wegen der langen Geschichte der Kultivierung von Weinreben und dem nahezu weltweiten Anbau in den unterschiedlichsten Klimaten und Standorten entstand eine Vielzahl an verschiedenen Sorten. Diese wurden oft falsch identifiziert oder die gleiche Sorte wurde an verschiedenen Orten unterschiedlich bezeichnet. Dies führte dazu, dass die Abstammung vieler Kreuzungen bis heute unklar ist. Es ist bisher nur wenig über Unterschiede im Genom der verschiedenen Rebsorten bekannt. Außerdem wurden bisher nur wenige Gensequenzen in Datenbanken hinterlegt. Zur Verwandtschaftsanalyse von Weinreben wurden bereits einige Fingerprint- Methoden angewandt. RFLP-Analysen wurden von Bowers et al. an einigen in Kalifornien kultivierten Weinreben durchgeführt (Bowers et al., Am. J. Enol. Vitic. 44 (1993), 266-270). Die Ergebnisse zeigten, dass bei zwei unterschiedlich bezeichneten Rebsorten "Zinfandel" und "Primitivo" das gleiche Bandenmuster auftrat. Daraufhin wurde angenommen, dass es sich bei den beiden Rebsorten um ein und dieselbe Sorte handelte. Andererseits war in dieser Studie aber auch das Fingerprintmuster des Spätburgunders mit dem des Grauen Burgunders identisch. Die Unterschiede zwischen den zwei genetisch nahe verwandten, aber morphologisch unterschiedlichen Rebsorten konnten mit dieser Methode also nicht aufgelöst werden. Die Analyse von kurzen, nicht kodierenden DNA-Sequenzwiederholungen (SSR- Analyse) führte ebenfalls zu keiner Differenzierung zwischen den Burgundersorten (Bowers et al., Genome 39 (1996), 628-633). Ye et al. (1998) führten eine RAPD-PCR zur Aufklärung der Verwandtschaftsverhältnisse verschiedener Reben durch und konnten mit dieser Methode auch keine Unterschiede zwischen Spätburgunder und dem Grauen Burgunder auflösen. Darüber hinaus lieferte der Vergleich anderer unterschiedlicher Rebsorten ein gleiches Bandenmuster (Ye et al., Vitis 37 (1998), 33-38). Im Jahr 2000 konnte durch SSR- Analyse bewiesen werden, dass Müller-Thurgau eine Kreuzung von Riesling mit Madeleine Royale ist und nicht wie lange Zeit angenommen wurde aus der Kreuzung zwischen Riesling und Silvaner entstand (Dettweiler et al., Vitis 39 (2000), 63-65).
Zur näheren Bestimmung der Verwandtschaftsverhältnisse verschiedener Reben mittels nested SAPD-PCR gemäß Beispiel 2 wurden Weinreben der Rebsorten Riesling, Silvaner, Madeleine Royale, Müller-Thurgau, Rieslaner, Spätburgunder, Frühburgunder, Grauer Burgunder, Weißburgunder, Trollinger und Kerner verwendet. Hierbei konnte mit hoher Auflösung die Herkunft des Müller-Thurgau als Kreuzung zwischen Madeleine Royale und Riesling bestätigt werden. Außerdem konnte die Verwandtschaft der Rebsorte Rieslaner zu der Gruppe der Burgunder-Sorten aufgeklärt werden. Dieses Ergebnis überrascht, da eine nahe Beziehung zur Riesling-Sorte besteht. Der Umstand erklärt sich durch die Tatsache, dass sowohl die Burgunder-, als auch die Silvanersorten aus Kreuzungen mit der Rebe Traminer hervorgegangen sind; siehe Figuren 9 und 10.
6.2 Klonunterscheidung
Das erfindungsgemäße Verfahren mit unterschiedlichen Empfindlichkeitsstufen ermöglicht Artentrennung, Sortenabgrenzung bis hin zu Klonunterscheidung. Es ist dabei möglich die Verwandtschaftsverhältnisse selbst sehr naheverwandter Rebsorten aufzuklären und durch die hohe Reproduzierbarkeit des Verfahrens die erhaltenen Resultate in einer Datenbank für zukünftige Vergleiche bereitzustellen. Es lassen sich nun praxisrelevante Fragestellungen wie die Synonyme alter, autochthoner Rebsorten klären und Klonunterscheidungen der Unterlagen, Burgundersorten und -varianzen sowie die genetische Stabilität von Sorten untersuchen. Ferner kann das Verfahren auch zur Untersuchung und Genotypisierung einzelner alter Rebstöcke angewandt werden. Darüber hinaus lassen sich Farbmutationen, Variationen der Aromatypen und der "Beerigkeit" der Reben untersuchen. Mit Hilfe der erfindungsgemäßen nested SAPD-PCR können Klone auf ihre Unterscheidbarkeit hin untersucht werden, und es wird somit eine Möglichkeit des Klonschutzes bereitgestellt. Die Figuren 11 und 12 zeigen Ergebnisse zur "Beerigkeit" von Spätburgundersorten und der Verwandtschaft der Unterlagen SO 4 und Binova. Die bisher nicht differenzierbaren Unterlagen SO 4 und Binova sind bereits nach der ersten SAPD-PCR Runde schon unterscheidbar. Sowohl die SO 4- als auch die Burgunder-Klone sind identisch und als jeweils eine Sorte zu erkennen, gemäß der Auflösungsgrenze bzw. Empfindlichkeitsstufe für die erste PCR-Runde; siehe Figur 11. Nach der verschachtelten (nested) SAPD PCR (zweite Runde) kann man nun auch deutlich die SO 4-Klone und die Burgunder-Klone (kleinbeerig: 164, kompakt: 166, aufrecht: 167, lockerbeerig: 168) voneinander unterscheiden; siehe Figur 12.
Beispiel 7: Anwendung der nested SAPD-PCR bei Labormäusen (Mus musculus)
Die meisten Labormaus- Stämme sind ursprünglich aus Kreuzungen von Mus musculus domesticus mit Mus musculus musculus entstanden. Fast alle Labormaus- Stämme gehen aus Inzuchtlinien hervor und sind daher genetisch nahezu identisch. Mäuse sind für die Aufklärung von Genfunktionen ideale Modellorganismen und das nicht nur, weil sie sich rasch vermehren, sondern auch, weil über ihre Gene vieles bekannt ist. Das Mausgenom mit seinen ca. 25.000 Genen ist vollständig sequenziert, zudem gleicht sich das Erbgut von Mensch und Maus zu etwa 95 Prozent (Mouse genome sequencing consortium: Initial sequencing and comparative analysis of the mouse genome. Nature 420 (2002), 520-562). Für menschliche Krankheiten wie Diabetes, Parkinson, Bluthochdruck und Krebs sind fehlerhafte Gene zumindest mitverantwortlich. Viele Gene entsprechen einander bei Maus und Mensch und können dieselben Krankheiten auslösen. Gelingt es, die entsprechenden Gene zu identifizieren und ihre Funktion zu entschlüsseln, können Krankheitsursachen besser erkannt und neue Therapien entwickelt werden. Zur Unterscheidung von Labormäusen wird am häufigsten die SSR-Analyse angewandt. Die als SSR (simple sequence repeat) oder Mikrosatelliten bezeichneten Sequenzwiederholungen von Dinukleotiden (TG-oder CA- repeats) sind über das komplette Genom von Säugern verteilt. Die Mikrosatelliten unterscheiden sich nur in der Anzahl ihrer Wiederholungseinheiten. Das Mausgenom enthält etwa doppelt so viele Mikrosatelliten wie das menschliche Genom. Hinzu kommt, dass die Differenz zwischen den Allelen verschiedener Inzuchtstämme beträchtlich ist (Newton und Graham, PCR (Labor im Fokus) 2. Aufl. (Ed. Newton und Graham), Spektrum Akad. Verl., Heidelberg (1994), 145.). Zur Untersuchung von Unterschieden im Genom von Labormäusen wurde auch die SNP- Analyse (single nucleotide polymorphism) verwendet (Wade et al., Nature 420 (2002), 574-578). Bei dieser Methode werden Punktmutationen, also Variationen von einzelnen Basenpaaren in einem DNA-Strang, untersucht, die bei mindestens 1 % der jeweiligen Population vorkommen (Li et al., Electrophoresis 20 (1999), 1258-1265). Die SNP -Methode setzt voraus, dass die Wildtyp DNA-Sequenz und die Art der mutierten Form sehr genau bekannt ist. Durch das Aufspüren von Punktmutationen können die Angehörigen einer Population unterschieden und Verwandtschaftsverhältnisse aufgeklärt werden.
Die erfindungsgemäße nested SAPD-PCR erlaubt hingegen die Unterscheidung verschiedener Labormäuse auf einfache und gut reproduzierbare Weise, ohne Kenntnis bestimmter Ziel- DNA-Sequenzen. Hierzu wurden die Schwanzspitzen von 7 Labormäusen (A, B, 2, 3, 5, 6, 8) zur DNA-Isolierung verwendet. Davon waren die Mäuse A und B Wurfgeschwister. Von den restlichen Mäusen war nur Maus 2 näher mit den Mäusen A und B verwandt. Mittels der nested SAPD-PCR gemäß Beispiel 2 konnte die Maus 2 als nächster Verwandter zu dem Mäusepaar A und B bestätigt werden; Figuren 13 und 14.
Beispiel 8: Genomtypisierung menschlicher Individuen {Homo sapiens sapiens)
Die DNA-Analyse stellt die modernste Methode zur Bestimmung der Identität und der Verwandtschaft menschlicher Individuen dar. Die Genomtypisierung menschlicher Individuen findet vor allem beim Abstammungsgutachten, in der Gerichtsmedizin und in der klinischen Medizin/Diagnostik Verwendung. Ein unanfechtbares Ergebnis ist eine Voraussetzung für die Beweiskraft der Ergebnisse. Da bei der Methode der RAPD-PCR immer wieder so genannte "Geisterbanden" auftreten oder verschwinden können, und die Ergebnisse dadurch schlecht reproduzierbar sind, wird die RAPD-PCR nicht für Abstammungsgutachten vor Gericht anerkannt. Unter den Fingerprint-Analysen wurden seit 1985 so genannte VNTRs (variable number of tandem repeats) zur Genomtypisierung menschlicher Individuen untersucht. Diese auch Minisatelliten genannten Bereiche befinden sich an den Telomeren der Chromosomen und bestehen aus längeren Widerholungseinheiten als die Mikrosatelliten. Sie treten bei jedem Individuum in einer unverwechselbaren Länge am untersuchten VNTR-Locus auf. Mit Hilfe der PCR-Technik werden VNTRs enthaltende DNA- Abschnitte vervielfältigt, durch Gelelektrophorese aufgetrennt und nach Anfärbung mit Ethidiumbromid unter UV-Licht sichtbar gemacht. Da die Sequenzwiederholungen in einer variablen Anzahl von Einheiten vorkommen, ergibt sich anhand der unterschiedlichen Länge der PCR-Amplifikate für jeden Menschen ein spezifisches Bandenmuster (Jeffreys et al., Nature 314 (1985), 67-73 und Jeffreys et al., Nature 316 (1985), 76-90). Etwa ab 1998 wurden die VNTRs fast vollständig durch die STR-Technik (short tandem repeat) (Edwards et al., Am. J. Hum. Genet. 49 (1991), 746-756) verdrängt. Als STR wird eine Abfolge von zwei bis sechs Basenpaaren, die sich mehrere Male hintereinander wiederholt, bezeichnet. Dabei ist die gesamte Länge des STR kleiner als 100 bp. Die Analyse von STR-Regionen bietet sich vor allem in der Gerichtsmedizin an, da auch sehr niedrige DNA-Konzentrationen zu einem erfolgreichen Resultat fuhren (Ruitberg et al., Nucleic Acid Res. 29 (2001), 320-322). Zur Aufklärung von Verwandtschaftsverhältnissen menschlicher Individuen wurde auch die Untersuchung von Punktmutationen herangezogen. Mit Hilfe der SNP-Methode (siehe oben) lassen sich einzelne Basenaustausche bekannter Sequenzen genau analysieren. 90 % aller genetischen Variationen im menschlichen Genom sind SNPs. Sie sind ungleichmäßig stark über das Genom verteilt, hoch variabel und lassen sich relativ schnell und einfach bestimmen. Die vorstehend genannten Analyseverfahren, wie die SNP-Methode sind allerdings ohne Kenntnis bestimmter Ziel-DNA-Sequenzen nicht durchführbar.
Hingegen eröffnet die erfindungsgemäße nested SAPD-PCR die Unterscheidung verschiedener und verwandter Menschen, ohne dass es im Vorfeld der Beschaffung von Sequenzinformationen bedarf. Beispielsweise wurde mithilfe der erfindungsgemäßen nested SAPD-PCR und anschließender Cluster-Analyse mit DNA aus menschlichen Blutzellen die Verwandtschaft von 13 Personen zueinander ermittelt. Hierbei konnten die Verwandtschaftsverhältnisse der beiden untersuchten Familien (I, II) bestätigt werden; siehe Figuren 15, 16 und 17. Dabei war die Person E I (S) der Vater (Elter S) von Kind Kl I (S) und K2 I ($) und der Bruder von Person E II ($) (Elter $). Person E I ($) war die Mutter von Kl I (S) und K2 I ($). Person E II (S) war der Vater von den Personen Kl II ($) und K2 II ($). Person E II (?) die Mutter von Kl II (?) und K2 II (?) und die Schwester von Person E I (S)- Daneben wurden die im Folgenden genannten außenstehenden Personen mit in die Verwandtschaftsanalyse einbezogen. Die Zwillinge Zl ($) und Z2 (?) und die Personen der Außengruppe Al (S), A2 (S) und A3 ($).
Beispiel 9: Anwendung der nested SAPD-PCR und SCAR-PCR zur Identifizierung von Arten der Gattung Pediococcus
In einer bevorzugten Ausfuhrungsform beinhaltet das erfindungsgemäße Verfahren neben der unter Beispiel 2 beschriebenen SAPD-PCR auch die Technik der Sequence Characterized Amplified Region PCR (SCAR PCR). Es handelt sich hierbei um eine PCR-Technik, die der erfindungsgemäßen SAPD-PCR bzw. nested SAPD-PCR nachgeschaltetet wird. Bei der SCAR-PCR wird eine spezifische Bande aus dem SAPD-GeI ausgeschnitten und die Sequenz bestimmt. Im Anschluss daran werden die die Sequenz flankierenden spezifischen Primer synthetisiert, mit der sich nun wiederum in einer SCAR-PCR der entsprechende Klon oder eine bestimmte Spezies identifizieren lässt.
Zur Art-Identifizierung von Stämmen der Gattung Pediococcus wurden spezifische Primer konstruiert. Hierzu wurde zunächst die nested SAPD-PCR gemäß Beispiel 2 mit dem Primer G-No t-T durchgeführt; siehe Figur 18. Die für die SCAR-PCR untersuchten Stämme sind in Tabelle 3 angegeben. Falls vorhanden wurden von jeder Art mehrere Stämme untersucht, um Amplifikationsprodukte zu finden, die bei allen Stämmen innerhalb einer Art vorkommen, aber bei allen anderen Arten nicht vorhanden sind. Nach gel-elektrophoretischer Auftrennung der Amplifikationsprodukte und Färben mit einer Ethidiumbromidlösung wurde das Agarosegel unter UV-Licht visualisiert.
Art-spezifische Gelbanden wurden mit einem sterilen Skalpell ausgeschnitten und mit dem Qiagen Gel Extraction Kit (Qiagen, Hilden) rückgelöst; siehe Figur 18. Die eluierten Amplifikate wurden mit Hilfe des TOPO TA Cloning Kit for Sequencing (Invitrogen) in das pCR4-T0P0 Plasmid kloniert und in einen kompetenten E. co/z-Stamm (E. coli TOPlO) transformiert. Die transformierten Klone wurden selektioniert und in LB-Medium über Nacht kultiviert. Anschließend wurden die Plasmide der transformierten Zellen mit dem Qiagen Miniprep Kit isoliert. Zur Kontrolle, ob sich das gewünschte Insert im Plasmid befindet, wurde eine PCR mit den Primern M13-Forward und M 13 -Reverse (Invitrogen) durchgeführt. Die Plasmide, die das gewünschte Insert enthielten, wurden mit den Primern M13-Forward und M13-Reverse von beiden Seiten sequenziert (MWG-Biotech, Ebersberg). Anhand der ermittelten Sequenzen wurden Primer konstruiert, die an Sequenzen binden, die sich innerhalb des Inserts befinden.
Mit diesen Primern wurde eine Touchdown PCR durchgeführt. Zur Touchdown PCR wurden 25 μl Reaktionsansätze erstellt. Diese Ansätze bestanden aus jeweils 10 μM Primer (Forward und Reverse), 200 μM je NTP, Ix Reaktionspuffer (incl. 1,5 mM MgCl2) (Peqlab), 20 ng template-DNA, 1 Unit Taq DNA-Polymerase (Peqlab). Die Initial-Denaturierung wurde für 5 min bei 95 °C durchgeführt. Anschließend wurden 6 Zyklen für 30 Sekunden bei 94 °C, 30 Sekunden bei 69 °C (wobei die Temperatur bei jedem Zyklus um 1 °C erniedrigt wurde) und 30 Sekunden bei 72 °C durchgeführt. Schließlich wurden noch 22 Zyklen für 30 Sekunden bei 94 °C, für 30 Sekunden bei 62 °C und für 30 Sekunden bei 72 0C durchgeführt. Die abschließende Elongation erfolgte für 5 min bei 72 °C. Zur Untersuchung der Spezifität der ausgewählten Primer wurden jeweils mehrere Stämme der gleichen Art, die Typstämme der anderen Pedikokken Arten und einige Stämme verwandter Milchsäurebakterien getestet. Das Ergebnis einer SCAR-PCR mit Art-spezifischen Primern ist in Figur 19 am Beispiel von Pediococcus acidilactici dargestellt.
Tabelle 3 : Zur SCAR-PCR verwendete Bakterienstämme
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Kulturensammlungen: DSMZ: Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen, Braunschweig; IMW: Stammsammlung des Instituts für Mikrobiologie und Weinforschung, Universität Mainz; P. = Pediococcus. τ = Typstamm

Claims

Patentansprüche
1. Verwendung mindestens eines ersten Primers zur DNA-Fingerprint- Analyse, wobei der mindestens erste Primer eine Sequenz enthält, die von einer 8 bp langen palindromischen bzw. GC-reichen Sequenz abgeleitet ist.
2. Verwendung nach Anspruch 1, wobei die palindromische bzw. GC-reiche Sequenz die Erkennungssequenz einer Restriktionsendonuklease ist.
3. Verwendung nach Anspruch 2, wobei die Restriktionsendonuklease iVotl ist.
4. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei 5' an der Sequenz mindestens ein weiteres Nukleotid angefügt ist.
5. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei 3' an der Sequenz mindestens ein weiteres Nukleotid angefugt ist.
6. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei das 5' an der Sequenz angefügte Nukleotid Adenosinmonophosphat (A) ist.
7. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei das/die 3' an der Sequenz angefügte(n) Nukleotid(e) ausgewählt ist/sind aus der Gruppe bestehend aus Adenosinmonophosphat (A), Cytidinmonophosphat (C), Guanosinmonophosphat (G) und Thymidinmonophosphat (T).
8. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei der Primer eine Länge von 9 bis 12 Nukleotiden hat.
9. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei der Primer eine Länge von 10 oder 11 Nukleotiden hat.
10. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei die zu analysierende DNA mit dem mindestens ersten Primer durch Polymerase-Kettenreaktion (PCR) amplifiziert wird.
11. Verwendung nach Anspruch 10, wobei die Amplifϊkation der zu analysierende DNA durch PCR eine erste Amplifikation mit dem ersten Primer und eine zweite Amplifikation mit einem zweiten Primer umfasst.
12. Verwendung nach Anspruch 11, wobei der zweite Primer ein nested Primer ist.
13. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 12, wobei der erste Primer eine der folgenden Sequenzen aufweist (5' → 3'):
AGC GGC CGC A; AGC GGC CGC C; AGC GGC CGC G; AGC GGC CGC T.
14. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 13, wobei der erste oder zweite Primer eine der folgenden Sequenzen aufweist (5' -→ 3'):
AGC GGC CGC AA; AGC GGC CGC AC; AGC GGC CGC AG; AGC GGC CGC AT; AGC GGC CGC CA; AGC GGC CGC CC; AGC GGC CGC CG; AGC GGC CGC CT; AGC GGC CGC GA; AGC GGC CGC GC; AGC GGC CGC GG; AGC GGC CGC GT; AGC GGC CGC TA; AGC GGC CGC TC; AGC GGC CGC TG; AGC GGC CGC TT.
15. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 14, wobei das Amplifikationsprodukt der Größe nach auf einem Gel aufgetrennt wird.
16. Verwendung nach Anspruch 15, wobei das Gel ein Agarose- oder Polyacrylamidgel ist.
17. Verwendung nach Anspruch 15 oder 16, wobei dem Gel Kieselsäure oder ein Salz davon zugesetzt wird.
18. Verwendung nach Anspruch 17, wobei das Salz der Kieselsäure Natriumsilicat oder eine wässrige Lösung davon ist.
19. Verwendung nach Anspruch 17 oder 18, wobei die Kieselsäure oder das Salz davon in einer Konzentration von 0,01 bis 0,05 % zugesetzt wird.
20. Verwendung nach einem der Ansprüche 15 bis 19, wobei die DNA durch interkalierende Substanzen sichtbar gemacht wird.
21. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 20, wobei als weiterer Schritt die DNA auf eine Membran übertragen und durch Hybridisierung mit einer Sonde sichtbar gemacht wird.
22. Verwendung nach Anspruch 21, wobei die Sonde der in einem der vorstehenden Ansprüchen definierte Primer ist.
23. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 22, wobei der Primer eine Markierung trägt.
24. Verwendung nach Anspruch 23, wobei die Markierung eine nicht-radioaktive Markierung, insbesondere Digoxigenin, Biotin, ein Fluoreszenzfarbstoff, ein Farbstoff oder eine radioaktive Markierung, insbesondere 32P ist.
25. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 24, wobei die Fingerprint-Analyse für Biodiversitätsstudien, Studien zur genetischen Verwandtschaft, taxonomische Studien, oder insbesondere in der Rechtsmedizin, der Züchtung, im Sortenschutz, im Genbank- Management, in der Diagnostik, in der Populationsgenetik oder für Evolutionsstudien eingesetzt wird.
26. Primer wie in einem der vorstehenden Ansprüche definiert.
27. Primer nach Anspruch 26, der eine der folgenden Sequenzen aufweist (51 → 3'):
AGC GGC CGC A; AGC GGC CGC C; AGC GGC CGC G; AGC GGC CGC T; AGC GGC CGC AA; AGC GGC CGC AC; AGC GGC CGC AG; AGC GGC CGC AT; AGC GGC CGC CA; AGC GGC CGC CC; AGC GGC CGC CG; AGC GGC CGC CT; AGC GGC CGC GA; AGC GGC CGC GC; AGC GGC CGC GG; AGC GGC CGC GT; AGC GGC CGC TA; AGC GGC CGC TC; AGC GGC CGC TG; AGC GGC CGC TT.
28. Kit zur DN A-Fingerprint- Analyse, umfassend einen Primer nach Anspruch 26 oder 27 und/oder ein Gel wie in den Ansprüchen 17 bis 19 definiert, sowie ggf. Mittel zur Durchführung einer DN A-Fingerprint- Analyse.
29. Kit nach Anspruch 28, weiterhin umfassend eine Polymerase für die Amplifikation der zu analysierenden DNA.
30. Kit nach Anspruch 28 oder 29, weiterhin umfassend einen bekannten Standard.
31. Kit nach einem der Ansprüche 28 bis 30 weiterhin umfassend eine Vorrichtung zur Durchführung der Amplifikation.
32. Kit nach einem der Ansprüche 28 bis 31, weiterhin umfassend Mittel zur Auswertung einer DN A-Fingerprint- Analyse.
33. Verfahren zur DNA-Fingerprint- Analyse von biologischem Material, wobei das Verfahren die Verwendung eines Primers nach Anspruch 26 oder 27, eines Kits nach einem der Ansprüche 28 bis 32 oder eines Gels wie in einem der Ansprüche 17 bis 19 definiert, umfasst.
34. Verfahren nach Anspruch 33, wobei das Verfahren die Amplifikation der zu analysierenden DNA durch Polymerase-Kettenreaktion (PCR) umfasst.
35. Verfahren nach Anspruch 33 oder 34, wobei das Verfahren eine Sequence Characterized Amplified Region (SCAR) PCR umfasst.
36. Verfahren nach einem der Ansprüche 33 bis 35, wobei die DNA-Fingerprint-Analyse Biodiversitätsstudien, Studien zur genetischen Verwandtschaft, taxonomische Studien oder Studien aus dem Bereich Rechtsmedizin, Züchtung, Sortenschutz, Genbank- Management, Diagnostik, Populationsgenetik oder Evolution umfasst.
37. Verfahren nach einem der Ansprüche 33 bis 36, wobei Amplifikationsprodukte der zu analysierenden DNA mit denen eines Standards verglichen werden.
38. Verfahren nach einem der Ansprüche 33 bis 37, wobei Amplifikationsprodukte der zu analysierenden DNA durch interkalierende Substanzen oder Hybridisierung mit einer Sonde sichtbar gemacht werden.
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