WO2007111324A1

WO2007111324A1 - 遺伝子中の５－メチルシトシン検出方法および検出キット

Info

Publication number: WO2007111324A1
Application number: PCT/JP2007/056296
Authority: WO
Inventors: Sei-Ichi Nishimoto; Kazuhito Tanabe; Hisatsugu Yamada
Original assignee: Kyoto University
Priority date: 2006-03-29
Filing date: 2007-03-27
Publication date: 2007-10-04
Also published as: JPWO2007111324A1

Abstract

　簡便、短時間、低コスト、かつ高感度の５－メチルシトシン検出法および検出キットを実現する。塩基のメチル化の有無を検出することができない従来のインベーダー法を改変し、標的ＤＮＡ中の５－メチルシトシン部位を選択的に切断する方法と組み合わせる。具体的には標的ＤＮＡ中の５－メチルシトシン部位を選択的に切断し、５’断片を得る。当該５’断片とハイブリダイズし得るＦＲＥＴプローブおよびフラップエンドヌクレアーゼを用いて酵素反応を行い、蛍光を検出する。

Description

明細書

遺伝子中の 5—メチルシトシン検出方法および検出キット

技術分野

[0001] 本発明は、遺伝子中の 5—メチルシトシン検出方法および検出キットに関するものである。

背景技術

[0002] 遺伝子中のシトシンのメチル化は DNAとタンパク質との相互作用を変化させ、遺伝子発現を制御していることが知られている。このため、遺伝子中の 5—メチルシトシン部位を検出することは遺伝子解析を行う上で非常に重要であり、現在までに様々な検出法が開発されてきた。

[0003] 既存の 5—メチルシトシン塩基の検出システムとしては、 Maxam—Gilbert化学修飾法、重亜硫酸ナトリウム処理を伴う Methylation Specific PCR(MSP)法、 PN A— DNA複合体と酵素処理を用いる方法などがこれまでに報告されている (非特許文献 1〜4)。

[0004] Maxam—Gilbert化学修飾法では、 DNAをヒドラジンで処理することにより、 DNA のシトシン塩基に選択的に損傷を与える。このとき、メチルイ匕されていないシトシンはヒドラジン処理によって切断され、一方、メチルイ匕されたシトシンはヒドラジン処理によつて切断されない。よって、ヒドラジン処理をした DNAをポリアクリルアミドゲル電気泳動（PAGE)で解析すると、シトシンのメチルイ匕 Z非メチルイ匕を、切断によって生じるバンドの有無によって検出することができる。

[0005] しかしながら、この Maxam—Gilbert化学修飾法の場合、 5—メチルシトシンの存在は、 PAGE上での切断バンドの欠損として検出される。このため、メチル化が部分的にでも非特異的に切断されるとバックグラウンドの切断バンドが表れてしまい、 5- メチルシトシンの存在を判定できなくなるという問題が度々生じてしまう。

[0006] また、 MSP法は、重亜硫酸ナトリウムに対する 5—メチルシトシンと非メチルシトシンとの反応性の違いを利用したものである。この方法では、 DNAを重亜硫酸ナトリウムで処理する。その結果、 DNA中の非メチルシトシンは脱ァミノ化されゥラシルへと変換される力 5—メチルシトシンは反応性が低いため脱ァミノ化されずにそのまま残る。その後、適切なプライマーを用いて PCRを行うと、もともとシトシンであった部位はチミン（ゥラシル）として増幅され、一方、 5—メチルシトシンはシトシンとして増幅される。よって、増幅されたサンプルをシークェンシングすると、本来 5—メチルシトシンであつた部分はシトシンとして検出され、非メチルシトシンであった部分はチミンとして検出される。これにより、シトシンのメチルイ匕 Z非メチルイ匕を判定することができる。

[0007] し力しながら、この方法では、重亜硫酸ナトリウム処理に通常 20〜40時間を要し、検出に時間が力かる点が問題となっている。

[0008] また、 PNA—DNA複合体を用いる方法では、 PNA—DNA複合体を制限酵素で処理することにより、 DNA中の 5—メチルシトシンを検出する。し力しながら、制限酵素による処理を用いるため、制限酵素が認識する配列のみにし力適用できないという問題があった。また、 5—メチルシトシンの検出は蛍光の消失によって検出されるため、度々バックグラウンドの問題が生じてしまう。

[0009] これらのことから、簡便で一般的な他の 5—メチルシトシン検出法の開発が大きな研究課題になっている。

[0010] ところで、ビタミン K3として知られる 2—メチル 1, 4 ナフトキノンは光酸化剤として機能し、各種核酸塩基を一電子酸化することが報告されている (非特許文献 5)。具体的には、ナフトキノン存在下では、紫外線照射により 5—メチルー 2'—デォキシシチジンが 5 ホルミル 2 ' デォキシシチジンや 5 ヒドロキシメチル 2 ' デォキシシチジンなどの酸ィ匕体に変換されることが報告されている。

[0011] ナフトキノンの有するこのような特性に着目し、本願発明者らは、ナフトキノンの光化学反応特性を応用し、 5—メチルシトシンの検出が可能であることを報告している（非特許文献 6、 7)。この方法によれば、上述の各検出方法が有している問題を解消することがでさる。

[0012] この方法では、 5—メチルシトシンの検出対象となる DNAと相補的な配列を有する DNAオリゴマーの末端部分または中央部にナフトキノンを導入し、修飾 DNAオリゴマーを合成し、この修飾 DNAオリゴマーを対象 DNAとハイブリダィゼーシヨンさせる。そして、ハイブリダィゼーシヨンした二本鎖 DNAに光照射を行う。このとき、 5—メチルシトシンはナフトキノンの光酸ィ匕によって切断され、一方、非メチルシトシンは切断されない。よって、光照射した後の二本鎖 DNAを PAGEにより解析することによって、 5—メチルシトシンの存在を、切断バンドとして検出することができる。

[0013] 一方、インベーダー法（米国 Tird Wave Technologies社）は、遺伝子増幅の必要がなぐ迅速、低コストで遺伝子変異を検出できる方法として知られており、一塩基多型の解析に広く利用されている (特許文献 1、非特許文献 8)。

特許文献 1：特表 2001— 526526号公報（平成 13年 12月 18日公表）

非特許文献 1 : Church, G. M., Gilbert, W. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1984, 81, 199 1.

非特許文献 2 : Frommer, M., McDonald, L. E.， Millar, D. S.， Collis, C. M., Watt, F. , Gigge, G. W.， Molloy, P. L.， Paul, C.し Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1992, 89, 182 7.

非特許文献 3 : Herman, H. G" Graff, J. R" Myohanen, S.， Nelkin, B. D" Baylin, S. B. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1996, 93, 9821.

非特許文献 4 : Okamoto, A., Tanabe, K., Satio, I. J. Am. Chem. Soc. 2002, 124, 102 62.

非特許文献 5 : Douki, T.， Cadet, J. Int. J. Radiat. Biol. 1999, 75, 571.

非特許文献 6 :Yamada, H., Tanabe, K., Nishimoto, S. Bioorganic & Medicinal Chemi stry Letters 2005, 15, 665

非特許文献 7 :Yamada, H., Tanabe, K., Nishimoto, S. Nucleic Acids Symposium Seri es 2005, No.49,149-150

非特許文献 8 : Lyamichev, V., et al, Nat. BioltechnoL, 17 (3) 292-296 (1999) 発明の開示

[0014] し力しながら、本願発明者らが開発した、ナフトキノンを利用した 5—メチルシトシンの検出方法は、 5—メチルシトシンの存在を、 DNA断片として PAGEにより解析しなければならず、検出感度、並びに検出操作の煩雑さ、所要時間およびコストの面で課題を有している。すなわち、より簡便、短時間、低コスト、かつ高感度の 5—メチルシトシン検出法への改良が期待されている。 [0015] 一方、遺伝子変異、特に一塩基多型の検出に広く利用されているインベーダー法では、その原理力も塩基のメチルイ匕の有無を検出することはできない。すなわち、メチルイ匕の有無に関わらず、相補的な塩基と対合するからである。

[0016] 本発明は、上記の問題点に鑑みてなされたものであり、その目的は、遺伝子中の 5 ーメチルシトシンの検出に適用できるようにインベーダー法を改変し、簡便、短時間、低コスト、かつ高感度の 5—メチルシトシン検出法を実現することにある。

[0017] 本発明に係る遺伝子中の 5—メチルシトシン検出方法は、検出対象の 5—メチルシトシンを含む標的 DNAの当該 5—メチルシトシン部位を選択的に切断し、当該 5—メチルシトシンの 5'側に隣接する塩基を 3'末端に有する DNA断片を取得する工程（1 )；上記 DNA断片、または上記 DNA断片の 3'末端領域とハイブリダィズし得る塩基配列を 3，末端領域に有する FRETプローブおよびフラップエンドヌクレアーゼを反応させる工程 (2) ;および反応混合物の蛍光を検出する工程 (3)を包含することを特徴としている。

[0018] 上記工程（1)において、ポリヌクレオチド鎖内部にナフトキノンを有する光機能性核酸を用いることが好ましい。ここで、「光機能性核酸」とは、 5—メチルシトシン検出用の核酸で、かつ、外部力光を照射することによりナフトキノンが 5—メチルシトシンに対して酸ィ匕的切断を起こす機能を有している核酸のことを指す。

[0019] 上記光機能性核酸は、次に示す一般式 (1)

5，一 A— Z— B— 3，

(ただし、一般式（1)中、 Aおよび Bはそれぞれ 1塩基以上の直鎖状のヌクレオチドを表し、 Zはナフトキノンを含有する化合物を表す）

によって表されることが好まし、。

[0020] また、上記一般式（1)中の Zが、次の化学式（2)〜（6)

[0021] [化 1] 置〕0023

〕0022

[0024]

[0025]

(ただし、上記の化学式（2)〜（6)において、「5'」は上記一般式（1)中のヌクレオチド A側を表し、「3'」は上記一般式（1)中のヌクレオチド B側を表し、 5'末端の酸素原子はヌクレオチド Aの 3 '末端のリン酸基の酸素原子を表し、 3，末端の酸素原子はヌクレオチド Bの 5'末端のリン酸基の酸素原子を表す。 ) の何れか 1つによって表されることが好ましぐ化学式（2)によって表されることがより好ましい。

[0026] また、上記光機能性核酸は、標的 DNAとハイブリダィズし得る塩基配列からなり、かつ、標的 DNAとハイブリダィズした際に、検出対象の 5—メチルシトシンと対向する位置に上記ナフトキノンが挿入されて、ることが好まし!/、。

[0027] 本発明に係るキットは、遺伝子中の 5—メチルシトシンを検出するためのキットであつて、以下の（a)〜（c)を備えることを特徴としている。

(a)標的 DNAとハイブリダィズし得る塩基配列からなり、かつ、標的 DNAとハイブリダイズした際に、検出対象の 5—メチルシトシンと対向する位置にナフトキノンが挿入されている光機能性核酸

(b)標的 DNA中に存在する検出対象の 5—メチルシトシンの 5 '側に隣接する塩基を 3 '末端に有する DNA断片の 3 '末端領域とハイブリダィズし得る塩基配列を 3 '末端領域に有する FRETプローブ

(c)フラップエンドヌクレアーゼ。

[0028] 本発明に係る方法は、 5—メチルシトシンの存在を蛍光により検出できるものである。それゆえ、煩雑な操作を必要とせず、簡便かつ低コストで 5—メチルシトシンを検出できるという効果を奏する。また、標的 DNAの切断により生じる DNA断片量より多くの蛍光分子が遊離するので、サンプル中の標的遺伝子が少量であっても増幅検出が可能であるという効果を奏する。また、従来法では、検出までに数日を要したが、本発明に係る方法を用いれば、数時間程度で 5—メチルシトシンを検出できると、う効果を奏する。

[0029] 本発明のさらに他の目的、特徴、および優れた点は、以下に示す記載によって十分わ力るであろう。また、本発明の利益は、添付図面を参照した次の説明で明白になるだろう。

図面の簡単な説明

[0030] [図 1]本発明に係る方法の原理を示す模式図である。

[図 2]ナフトキノンのヒドラジン誘導体の合成方法を示す図である。

[図 3]実施例で使用した FRETプローブを示す図である。 [図 4(A)]標的 DNA(ODNl)から目的の 5'断片が生成していることを確認した、光照射およびピぺリジン処理を行った反応液の HPLCプロフィールである。

[図 4(B)]標的 DNA(ODNl)から目的の 5'断片が生成していることを確認した、 MA LDI—TOF— MSのチャートである。

[図 5]本発明に係る方法により標的 DNA中の 5—メチルシトシンを検出できたことを示す蛍光スペクトルチャートである。

[図 6]本発明に係る方法において、光照射を行わない場合、および、ピぺリジン処理を行わな、場合には蛍光発光が観測されなヽことを示す蛍光スペクトルチャートである。

[図 7]本発明に係る方法において、標的 DNAから生成する 5'断片の相補配列を有しな、プローブオリゴマー (FRETプローブ)を用いた場合には蛍光発光が観測されな、ことを示す蛍光スペクトルチャートである。

[図 8]本発明に係る方法における検出限界を検討した結果を示す蛍光スペクトルチヤートである。

[図 9(A)]本発明に係る方法において、標的 DNAに ODN2を用い、光照射 0時間の結果を示す蛍光顕微鏡写真である。

[図 9(B)]本発明に係る方法において、標的 DNAに ODN2を用い、光照射 2時間の結果を示す蛍光顕微鏡写真である。

[図 9(C)]本発明に係る方法において、標的 DNAに ODN1を用い、光照射 0時間の結果を示す蛍光顕微鏡写真である。

[図 9(D)]本発明に係る方法において、標的 DNAに ODN1を用い、光照射 2時間の結果を示す蛍光顕微鏡写真であり、 5—メチルシトシン検出シグナルを蛍光顕微鏡により可視化し得ることを示す。

発明を実施するための最良の形態

[0031] 本発明の実施の一形態について説明すれば、以下のとおりである。なお、本発明はこれに限定されるものではな!/、。

[0032] 1. 5—メチルシトシン検出方法

本発明に係る遺伝子中の 5—メチルシトシン検出方法は、以下の（1)〜（3)の工程を包含するものであればょ、。

工程（1)：検出対象の 5—メチルシトシンを含む標的 DNAの当該 5—メチルシトシン部位を選択的に切断し、当該 5—メチルシトシンの 5'側に隣接する塩基を 3'末端に有する DNA断片を取得する。

工程（2)：上記 DNA断片、または上記 DNA断片の 3'末端領域とハイブリダィズし得る塩基配列を 3，末端領域に有する FRETプローブおよびフラップエンドヌクレアーゼを反応させる。

工程 (3)：反応混合物の蛍光を検出する。

本発明に係る遺伝子中の 5—メチルシトシン検出方法の概略を図 1に示した。以下、各工程について詳細に説明する。

[0033] 〔工程（1)〕

工程（1)では、検出対象の 5—メチルシトシンを含む標的 DNAの当該 5—メチルシトシン部位を選択的に切断し、当該 5—メチルシトシンの 5 '側に隣接する塩基を 3 '末端に有する DNA断片を取得する。このような DNA断片を取得する方法としては、例えば、本発明者らが開発したポリヌクレオチド鎖内部にナフトキノンを有する光機能性核酸を用いる方法 (非特許文献 6、 7を参照）、四酸化オスミウムによる酸化反応を用、る方法 (Okamoto, A., Tainaka, K. Nucleic Acids symposium Series No.49, 45— 4り, 2005)などを挙げることができる。中でも、反応試薬に毒劇物を用いないことから、本発明者らが開発したポリヌクレオチド鎖内部にナフトキノンを有する光機能性核酸を用いる方法が好ましい。

[0034] 以下、ポリヌクレオチド鎖内部にナフトキノンを有する光機能性核酸を用いる方法を例に挙げて説明する。

[0035] 光機能性核酸は、ポリヌクレオチド鎖と、このポリヌクレオチド鎖内部にナフトキノンを有している。光機能性核酸は、ポリヌクレオチド鎖部分によって、検出対象の 5—メチルシトシンを含む標的 DNAとハイブリダィズすることができる。また、ハイブリダィズした光機能性核酸および標的 DNAに対して光照射を行うと、標的 DNAにおける、光機能性核酸の近傍のシトシンカチルイ匕されて、る場合は、ナフトキノンによって 5 —メチルシトシン部分で DNA鎖が切断され、一方、シトシンカ^チルイ匕されていない場合は切断されない。

[0036] 本明細書において「光機能性」とは、上述したように、外部から光を照射することによって、ナフトキノンが 5—メチルシトシンに対して酸ィ匕的切断を起こす機能を有していることを指す。従って、本明細書において「光機能性核酸」とは、外部から光を照射することによりナフトキノンが 5—メチルシトシンに対して酸ィ匕的切断を起こす機能を有して!/、る核酸のことを指す。

[0037] また、本明細書において、「ポリヌクレオチド」とは、「遺伝子」、「核酸」、または「核酸分子」と同義であり、ヌクレオチドの重合体を指す。本明細書において、「塩基配列」は、「核酸配列」または「ヌクレオチド配列」と同義であり、デォキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド (A、 G、 Cおよび Tと省略される）の配列として示される。

[0038] また、ポリヌクレオチドは、 RNAの形態、 DNAの形態の何れであってもよい。さらに、 DNAの場合、二本鎖、一本鎖の何れであってもよい。また、ポリヌクレオチドにおいて、ヌクレオチドの結合数は 2個以上であればいくつでもよい。ポリヌクレオチドは、化学合成したものであってもよいし、自然環境力も抽出したものであってもよい。

[0039] また、「ポリヌクレオチド鎖内部」とは、ポリヌクレオチド鎖の 5，末端および 3，末端のヌクレオチド以外のヌクレオチドを指す。

[0040] 本明細書において、「ナフトキノン」とは、下記の化学式

[0041]

によって表されるナフトキノン構造を有する化合物を指し、本発明に係る光機能性核酸は上記何れかのナフトキノン構造を含んでいればよい。なお、光機能性核酸が含むナフトキノンとしては、 1, 4 ナフトキノン、 1, 2 ナフトキノンに限定されるものではなぐそれぞれのナフトキノンに置換基が導入された誘導体であってもよい。このような誘導体としては、例えばビタミン Κとして知られる 2—メチル 1, 4 ナフトキノンや、その 2位のメチル基を他のアルキル基、アルコキシ基、ハロゲン基、ニトロ基、またはァミノ基に置換したものなどが挙げられる。さらに、芳香環上に、各種置換基 (電子供与基としてアルキル基、アミノ基、アルコキシ基、若しくはヒドロキシ基等;または電子吸引基として-トロ基、若しくはハロゲン基等）が導入されていてもよい。本明細書では、以下、これらの誘導体を含むナフトキノン構造を有する化合物を単にナフトキノンという。

[0042] ナフトキノンは、ポリヌクレオチド鎖の末端（5 '末端または 3 '末端）に有して、てもよぐ両末端以外の部分、すなわち「ポリヌクレオチド鎖内部」に有していてもよい。ナフトキノンの可動範囲が限定され、非特異的なグァニン連続配列の酸ィ匕的切断を抑制するという観点から、「ポリヌクレオチド鎖内部」にナフトキノンを有していることが好ましい。なお、光機能性核酸は、ヌクレオチドにナフトキノンが付加されたィ匕合物であつてもよいし、あるいは、ヌクレオチドがナフトキノンによって置換されたものであってもよい。

[0043] ポリヌクレオチド鎖内部のヌクレオチドがナフトキノンによって置換された光機能性核酸は、下記の一般式（1)

5，一 A— Z— B— 3， …ひ）

と表すことができる。

[0044] 上記の一般式（1)において、ナフトキノンを含有する化合物 Zは、ヌクレオチド Aの 3

'末端のリン酸基およびヌクレオチド Bの 5，末端のリン酸基と結合していることが好ましい。ポリヌクレオチドとナフトキノンとの結合方法は特に限定されるものではないが、例えば、上記の一般式（1)における Zが下記の化学式（2)

[0045] [化 7]

で表されるものであってもよ、。

[0046] ただし、上記の化学式（2)において、「5'」は上記一般式（1)中のヌクレオチド A側を表し、「3'」は上記一般式（1)中のヌクレオチド B側を表し、 5'末端の酸素原子はヌクレオチド Aの 3'末端のリン酸基の酸素原子を表し、 3'末端の酸素原子はヌクレオチド Bの 5'末端のリン酸基の酸素原子を表す。

[0047] また、これ以外の化合物 Zの例として、次の化学式（3)〜（6)

[0048] [化 8]

[0049]

[0050] [化 10]

[0051] [化 11]

であってもよい。これらの合成方法については、後述の〔光機能性核酸の合成方法〕において説明する。

[0052] なお、ポリヌクレオチドとナフトキノンとを結合するリンカ一部分は、なるべく短!、ものが好ましい。これにより、リンカ一部分の構造的自由度が限定され、ナフトキノンによる非特異的な酸ィ匕的切断をさらに抑制することができる。

[0053] また、上記のポリヌクレオチド Aおよび Bは、標的 DNAとハイブリダィズし得る塩基配列であることを要する。ノ、イブリダィズし得る限りにおいて、標的 DNAの検出対象の 5—メチルシトシンを含む領域の塩基配列に対する相補配列と 100%の同一性を有するものでなくてもよい。 100%の同一性がなくてもハイブリダィズ可能であることを当業者は容易に理解する。具体的には、上記一般式（1)の 5'— A— Z— B— 3'を例にすると、 Zを一つの塩基と仮定した場合、ポリヌクレオチド A—Z— Bが、標的 DNA の 5—メチルシトシンを含む部分領域に相補的な配列と 80%以上の同一性を有していることが好ましい。この場合、標的 DNA側の塩基配列において、 Aの 5'末端よりも 5'側のミスマッチは同一性の算出には考慮せず、同様に、 Bの 3'末端よりも 3'側のミスマッチも考慮しない。同一性は、 85%以上であることがより好ましぐ 90%以上であることがさらに好ましぐ 95%以上であることが特に好ましぐ Z以外の配列が 100% 一致することが最も好ま U、。

[0054] また、上記一般式（1)にお、て、 Zの位置は、光機能性核酸と標的 DNAとがハイブリダィズした際に、検出対象の 5—メチルシトシンと対向する位置であることが望まれる。ここで、「対向する位置」とは、ポリヌクレオチド A— Z— B (光機能性核酸)と標的 D NAとがハイブリダィズするとき、検出対象の 5—メチルシトシンと対合するヌクレオチドカら 5 '側または 3 '側に 5塩基以内に存在するヌクレオチドと結合して、ることが意図される。好ましくは 3塩基以内、より好ましくは 2塩基以内、さらに好ましくは 1塩基以内、最も好ましくは Zの位置が検出対象の 5—メチルシトシンと対合する位置である。これにより、ハイブリダィゼーシヨンの際に、ナフトキノンを検出対象の 5—メチルシトシンに近接させることができるため、検出対象の 5—メチルシトシン以外の塩基における酸ィ匕的切断を抑制することができる。

[0055] 工程（1)における、具体的な手順としては、まず、光機能性核酸と標的 DNAとをノヽイブリダィズさせる。なお、ハイブリダィゼーシヨンは、定法に従って行えばよい。

[0056] 次に、ハイブリダィゼーシヨンによって、二本鎖を形成している標的 DNAおよび光機能性核酸に対して、光照射を行う（図 1参照)。なお、光照射反応は、光機能性核酸と標的 DNAの間の二重鎖解離温度 (Tm値)以下で行わなければならな、。また、照射する光は、 400nm以下の波長であることが好ましぐ 350nm以下であることがより好ましぐ 330nm以下であることがさらに好ましい。これにより、ナフトキノンの酸ィ匕的切断を誘起することができる。

[0057] 続いて、反応溶液にピぺリジンを添カ卩して処理することにより、 5—メチルシトシン部位が完全に切断される。ピぺリジン処理は、例えば、 10 Lの反応溶液に 10%ピぺリジン水溶液を 50 L加え、 90°Cで 20分加熱すればよい。これにより標的 DNAの切断断片を含む乾燥 DNAペレットが得られる。

[0058] ここで、図 1の上段に示すように、ナフトキノンの近傍のシトシンカ^チルイ匕状態である場合、 DNA鎖の酸ィ匕的切断が起こる。一方、ナフトキノンの近傍のシトシンが非メチルイ匕状態である場合は、図 1の下段に示すように、 DNA鎖の酸ィ匕的切断は起こらない。

[0059] 標的 DNA中に検出対象の 5—メチルシトシンが存在した場合、標的 DNAは 5—メチルシトシン部位が欠損した状態で 2つの断片に切断される。このうち、工程（2)に必要な断片は 5'断片、すなわち、 5—メチルシトシンの 5'側に隣接する塩基を 3'末端に有する DNA断片である。当該標的 DNAの 5'断片を単離して、次の工程（2)に供してもよいが、当該標的 DNAの 5'断片を含む乾燥 DNAペレットをそのまま工程（2) に供することができる。作業の簡便さから標的 DNAの 5'断片を含む乾燥 DNAペレットをそのまま工程（2)に供することが好ましい。

[0060] 〔工程（2)〕

工程（2)では、工程（1)で生成した標的 DN Aの 5'断片、 FRETプローブおよびフラップエンドヌクレアーゼ (以下、「FEN」と略記する場合がある）を反応させる。上述のように、工程（1)で得られた乾燥 DNAペレットを適当な緩衝液で溶解し当該溶液に直接 FRETプローブおよび FENを添加すればよ!、。乾燥 DNAペレットを溶解する溶液としては、例えば 20mM Tris-HCl(pH7. 4)、 15mM NaCl、 10 XREC™ リアクションバッファー 12、および添加用 1 X BSAを含有する緩衝液を挙げることができるが、 FENの酵素反応を阻害しないものであれば、これに限定されない。

[0061] 例えば工程（1)で得られた乾燥 DNAペレットを 15 Lの緩衝液に溶解した場合、 FRETプローブが 1 μ Μ〜5 μ M、 FENが 1ユニット〜 5ユニットとなるように FRETプローブおよび FENを添加することが好まし!/、。ただしこれに限定されるものではなぐ適宜好適な添加量を設定すればょヽ。

[0062] 反応条件としては、 30°Cで 1分間〜 5分間の反応を標準とすればよい。反応時間を長くすれば、バックグラウンドも含めて生じる蛍光の強度が増加することが発明者らにより確認されている。

[0063] 反応終了後は、直ちに次の工程 (3)に進み、反応混合物 (反応溶液)の蛍光を検出することができる。したがって、本発明に係る検出方法を用いれば、従来と比較して非常に短時間で遺伝子中の 5—メチルシトシンの存在を検出することができる。

[0064」 FRET (fluorescence resonance energy transfer：光共鳴エネノレ³ r— 移)プロ一ブは、例えば図 3に示すような塩基配列力なるオリゴヌクレオチドを挙げることができる。すなわち、 FRETプローブの 3'末端領域は、標的 DNAの 5—メチルシトシン部分で選択的に切断された 5 '断片の 3 '領域とハイブリダィズし得る塩基配列を有している（図 3の線で囲った塩基配列）。したがって、 FRETプローブの当該領域の塩基配列は、標的 DNAおよび検出対象 5—メチルシトシンに応じて適宜変更することができる。当該塩基配列は上記 5 '断片の 3'領域の相補配列と 100%の同一性を有するものでなくてもよい。 100%の同一性がなくてもハイブリダィズ可能であることを当業者は容易に理解する。ただし、 100%の同一性を有することが好ましい。

[0065] なお、上記標的 DNAの 5 '断片とハイブリダィズし得る FRETプローブの 3 '領域の最も 5'側の塩基は、標的 DNA中の検出対象 5—メチルシトシンの 5'側に隣接する塩基 (上記 5'断片の 3'末端の塩基)の相補塩基であることを要する。この部分が FE Nの認識部位となるからである。

[0066] FRETプローブの 5 '末端側は、回文配列になっており、自らニ本鎖を形成してへァピン構造を構成する。また、 5'末端の塩基は、上記標的 DNAの 5'断片の 3 '末端の塩基と同一である。この 5'末端の塩基を除き、ヘアピン構造を構成する回文配列は特に限定されない。また、標的 DNAおよび検出対象 5—メチルシトシンに応じて変更する必要はない。

[0067] 標的 DNAの 5 '断片とハイブリダィズし得る FRETプローブの 3 '末端領域の塩基数は 5塩基〜 20塩基が好ま、。 5塩基より短、と酵素 (FEN)の基質となり得な、ことがあり、 20塩基より長いと酵素 (FEN)による切断効率が低下することがある。また、ヘアピン構造を構成する FRETプローブの 5'末端領域の塩基数は、特に限定されないが、 25塩基〜 40塩基が好ましい。

[0068] FRETプローブの 5 '末端の塩基は蛍光色素で標識されており、 5'末端近傍にはその蛍光強度を抑制する消光剤（タエンチヤー）が結合している。なお、逆に、消光剤が 5'末端で蛍光色素がその近傍でもよい。蛍光色素と消光材が同一のプローブに結合されている場合には、蛍光共鳴エネルギー転移によりその蛍光強度が抑制され、同一のプローブに結合されていない状態では、蛍光強度は抑制されない。上記標的 DNAの 5'断片が FRETプローブとハイブリダィズすることで、 FENが認識する構造が構成され、その結果 5'末端の蛍光色素が切断されることにより、 5—メチルシトシンの存在を蛍光強度として検出することができる。

[0069] FRETプローブに用いられる蛍光色素としては FMA(6—カルボキシーフルォレセイン）、 TAMRA (6—カルボキシーテトラメチルーローダミン）、 Cy— 3、 Cy—5などが挙げられる。また消光材（タエンチヤー）としては 4-(4'-dimethylaminophenylazo)ben zoic acid、dabcyl)、 4— dimethylaminoazobenzene— 4 -sulfonic acid (daosyl)なとかげられる。

[0070] FRETプローブは、市販の DNA合成機を用いて合成することができる（実施例を参照)。その際、蛍光色素で標識されたホスホロアミダイト、消光剤で標識されたホスホロアミダイトを用いればょ、。

[0071] 一塩基多型（SNPs)を検出するための一般的なインベーダー法では、一般にシグナルプローブおよびインベーダープローブと称される 2種類の非標識オリゴヌクレオチドと FENとを用いてシグナルプローブからフラップアームを切り出し、このフラップアームと FRETプローブとのハイブリダィズにより FEN認識部位を構成し蛍光色素を遊離させる。この際、ハイブリダィズした錯体にマッチ配列がある力、ミスマッチ配列があるかで、 SNPsを検出する。これに対して、本発明に係る 5—メチルシトシン検出方法では、 5—メチルシトシン部位で切断された標的 DNAの断片を予め作製し、得られた標的 DNAの 5'断片が FRETプローブにハイブリダィズ (インべイド）することにより FEN認識部位を構成し、蛍光色素を遊離させる。すなわち、標的 DNAの切断断片の有無により蛍光色素の遊離を制御し、メチルイ匕の有無を検出する。また、この場合は、、わゆるシグナルプローブおよびインベーダープローブを用いな!/、。

[0072] 〔工程（3)〕

工程 3では、反応混合物 (反応溶液)の蛍光を検出すればよい。蛍光を検出する方法は特に限定されないが、例えば蛍光光度計を用いて蛍光強度を測定する方法を挙げることができる。この場合、反応混合物をそのまま蛍光光度計に供し、用いた蛍光物質に応じて、使用する機器の推奨する方法で測定することができる。蛍光強度を測定する場合は、対照を設けて蛍光強度を比較することにより、より正確に対象の 5—メチルシトシンの存在を検出することができる。対照としては、例えば、標的 DNA を添カ卩しないもの、フラップエンドヌクレアーゼを添カ卩しないもの、などを挙げることができる。対照の蛍光強度と比較して 110%以上の蛍光強度が測定された場合に、 5 —メチルシトシン陽性の判定をすることが好ましい。

[0073] 蛍光を検出する他の方法としては、例えば、蛍光顕微鏡で観察する方法を挙げることができる。蛍光顕微鏡で観察する場合、反応混合物にァガロースなどを添加してゲル化し、その一部をスライドグラス上に置き、カバーグラスで挟んで観察することができる。用いた蛍光物質に応じて、励起波長、検出波長、露光時間を選択すればよい。後述の実施例で示すように、ゲル全体が蛍光を発光していれば、 5—メチルシトシン陽性の判定をすることができる。

[0074] 〔光機能性核酸の合成方法〕

光機能性核酸は、ナフトキノンを導入する位置のヌクレオチドを脱塩基したポリヌクレオチド鎖に対して、ナフトキノン誘導体を縮合させることによって合成することができる。具体的な縮合方法の一例を以下に示すが、これに限定されるものではなぐ公知の他の様々な方法を用いてもょ、。

[0075] まず、図 2に示すように、 2—メチルー 1, 4 ナフトキノンの 3位にカルボン酸を導入し、その後、ヒドラジンを縮合することによってナフトキノンのヒドラジン誘導体を合成する。

[0076] 一方で、ホスホロアミダイト法 (後藤俊夫、芝哲夫、松浦輝夫監修『有機化学実験の手引き 4 合成反応 II一』ィ匕学同人）によって、下記の一般式 (7)

5，一 A— Y— B— 3， - -- (7)

で表される脱塩基前駆体修飾部を含む修飾ポリヌクレオチド鎖を DNAシンセサイザ一上で合成する。なお、一般式（7)において、 Aおよび Bは上述した標的 DNAとハイブリダィズするヌクレオチド鎖である。また、 Yは脱塩基前駆体修飾部であり、例えば下記の化学式

[0077] [化 12]

Y によって表される化合物とすることができる。

[0078] そして、 Υが上記の化学式で表される場合、修飾ポリヌクレオチド鎖に含まれる Υのジオール部分を過ヨウ素酸ナトリウムなどでホルミル基に変換する。

[0079] そして、上述したナフトキノンのヒドラジン誘導体を修飾ポリヌクレオチド鎖のホルミル基と縮合させることによって、下記の一般式（1)

5，一 Α— Ζ— Β— 3，

(ただし、 Zは、

[0080] [化 13]

Z である）

で表される光機能性核酸を得ることができる。

[0081] なお、ホルミル基とヒドラジンとの縮合反応は酸性条件下で行うことが好ましぐ pH5 以上 7以下がより好ましぐ pH6が特に好ましい。また、反応温度は、室温以下で行うことが好ましぐ 10°C以下がより好ましぐ 4°Cが特に好ましい。これにより、修飾ポリヌクレオチド鎖にナフトキノンを導入することができる。 [0082] また、上述の例においては、修飾ポリヌクレオチド鎖とナフトキノンとを、ホルミル基とヒドラジンとの縮合によって結合させた力これに限定されるものではなぐ例えば、ァルキルアミノ基を導入した修飾ポリヌクレオチド鎖とスクシンィミジル基を導入したナフトキノン誘導体とを縮合させてもよい。この反応式の一例を次の反応式 (8)に示す。

[0083] [化 14]

なお、上記の反応式（8)の詳細は、 Bergeron et al., Nucleic Acids Res., 2004, 32 6154-"に記載されており、本明細書ではこれを援用する。

[0084] また、別の例として、アミノ基を導入した修飾ポリヌクレオチド鎖とスクシンィミジル基を導入したナフトキノン誘導体とを縮合させた例を次の反応式 (9)に示す。

[0085] [化 15]

なお、上記の反応式（9)において、アミノ基を導入した修飾ポリヌクレオチド鎖は、例えば" Okamoto, A. et al. J. Am. Chem. Soc. 126, 14732-14733, 2004"に記載されて、る方法を参照して合成することができる。

[0086] また、さらに別の例として、アルキルチオール基を導入した修飾ポリヌクレオチド鎖とマレイミド基またはチオール基を導入したナフトキノンの誘導体とを縮合させてもよい。チオール基を導入した修飾ポリヌクレオチド鎖とマレイミド基を導入したナフトキノンとを縮合させる反応式の一例を次の反応式（10)に示す。

[0087] [化 16]

なお、上記の反応式（10)において、チオール基を導入した修飾ポリヌクレオチド鎖は、例えば" Sun, S. et al. J. Org. Chem. 1996, 61, 5708- 5709"に記載されている方法を参照して合成することができる。

[0088] さらには、ナフトキノンを有する修飾核酸塩基 (一塩基の修飾ヌクレオチド)を合成しておき、 DNAシンセサイザーによって、任意の部分にこの修飾核酸塩基が挿入された修飾ポリヌクレオチド鎖を合成してもよい。例えば、下記の式（11)のように、修飾核酸塩基としてナフトキノン含有ゥリジン誘導体を合成しておき、これを含んだポリヌクレォチド鎖を DNAシンセサイザーによって合成してもよ!/、。 [0089] [化 17]

なお、上記の反応式（11)において、ナフトキノン含有ゥリジン誘導体は、例えば" 0 kamoto, A. et al. J. Am. Chem. So 126, 4820-4827, 2004"に記載されている方法を参照して合成することができる。

[0090] 本発明において使用し得る光機能性核酸は、ナフトキノンを含有するポリヌクレオチド鎖であれば、上記の方法や他の公知の方法によって得られる様々な産物が含まれる。

[0091] 2. 5—メチルシトシン検出キット

本発明は、以下の（a)〜（c)を備える、遺伝子中の 5—メチルシトシン検出キットを提供する。

(c)フラップエンドヌクレアーゼ

本キットを用いることにより、上記本発明に係る遺伝子中の 5—メチルシトシン検出方法を簡便かつ迅速に実施することができる。

[0092] 光機能性核酸、 FRETプローブおよびフラップエンドヌクレアーゼにつ!/、ては、既に詳細に説明したので、ここでの説明は省略する。

[0093] 本キットは、上記 (a)〜（c)をそれぞれ溶液や凍結乾燥物などの形態で備えて！/ヽればよい。上記 (a)〜（c)以外の具体的なキットの構成については特に限定されるものではなぐ必要な試薬や器具等を適宜選択してキットの構成とすればよい。例えば、反応用緩衝液、反応用チューブ、ピぺリジン溶液などを挙げることができる。

[0094] 本明細書中において用語「キット」は、特定の材料を内包する容器 (例えば、ボトル、プレート、チューブ、ディッシュなど)を備えた包装が意図される。好ましくは当該材料を使用するための使用説明書を備える。使用説明書は、紙またはその他の媒体に書かれていても印刷されていてもよぐあるいは磁気テープ、コンピューター読み取り可能ディスクまたはテープ、 CD-ROMなどのような電子媒体に付されてもょ、。

[0095] 本発明に係る遺伝子中の 5—メチルシトシン検出キットの使用については、上述の遺伝子中の 5—メチルシトシン検出方法の実施形態に準じればよぐここでの説明は省略する。

[0096] 〔実施例〕

以下、本発明について実施例を用いてさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。

[0097] 1.実験方法等

〔機器.試薬等〕

Abssic Phosphoramidite、 5 —Fluorescein Phosphoramidite、 Dabcyl— dTなどの DNA合成試薬は Glen Reseachより購入した。オリゴマー（ODNs)の質量分析は、マトリックス支援レーザ脱離イオンィ匕飛行時間型 (MALDI— TOF)質量分析装置（PerSeptive Voyager Elite、加速電圧 2 lkV、ネガティブモード）において、マトリクスとして 2，，3，， 4，一トリヒドロキシァセトフエノン、内部標準として T ( [M

8

— ΗΓ2370. 61)、Τ ( [Μ— ΗΓ5108. 37)および Τ ( [Μ— Η] _8150. 33)を

17 27

用いて行った。

[0098] 逆相 HPLCは、 6Α HPLCシステム（島津社）、 D— 7000 HPLCシステム（日立社)または L— 2400 HPLCシステム（日立社）を用いて行った。逆相カラム（Inertsi 1 ODS— 3、 GL— Sciences Inc. 、 4. 6mm X 250mmもしくは φ 10mm X 15 Omm、または CAPCELL PAR MF SHISEIDO、 φ 10mm X 250mm)試料溶液を注入した。カラム溶出は 260nmにおける UV吸収でモニターした。 [0099] アルカリホスファターゼ（ゥシ腸由来）は PROMEGAから、ヌクレアーゼ P1は YAM ASAから、ホスホジエステラーゼ Iは ICNからそれぞれ購入した。 λ = 312nmの光 ex

照射は Lourmat TFX- 20M トランスイルミネーターを用いて行った。 T4ポリヌクレオチドキナーゼ（lOunitesZmL)は-ツボンジーンからそれぞれ購入した。ヒトフラップエンドヌクレアーゼ一 I (Human FEN— 1)、 10 XREC™リアクションバッファー 1 2および添加用 10 X BSAは Travigen Inc.力も購入した。すべての溶液の調製には純水（ャマト社製、 WR600A)を使用した。蛍光スペクトルの測定には、島津社製蛍光光度計 (RF— 5300PC)を使用した。

[0100] 〔3 （ヒドラジノカルボ-ルェチル） 2—メチルー 1, 4 ナフトキノン（ナフトキノンのヒドラジン誘導体 3)の合成〕

まず、 2—メチル 1, 4 ナフトキノン (和光純薬工業株式会社製)をコハク酸と反応させ、コハク酸の酸化的脱カルボキシル化を通じて、 3 カルボキシー 2 メチル —1, 4 ナフトキノン (ナフトキノンのカルボン酸誘導体 1)を得た (参考文献: Salmon —し hemin, L.; Buisine, Ε·; Yardley, V·; Kohler, S.; Debreu, M— Α·; Landry, V·; Sergh eraert, C; Croft, S. L.; Krauth— Siegel, L.; Davioud— Charvet, E. J. Med. Chem. 200 1, 44, 548.) o次に、 100mg (0. 41mmol)の 3—カルボキシ— 2—メチル 1, 4— ナフトキノンを lmLの DMFに溶解した溶液に対して、 1—ェチル 3— (3 ジメチルァミノプロピル）—カルポジイミド 1塩酸塩（157mg, 0. 82mmol)および 1—ヒドロキシベンゾトリアゾール（l lOmg, 0. 81mmol)をカ卩え、 0°Cで 30分間攪拌した。この反応混合物に、ヒドラジン 1水和物（64mg, 2mmolを 0. 2mLの DMFに溶解したもの）を加え、周囲温度で 2時間攪拌した。この反応混合物を水で希釈した後、ェチル酢酸によって反応混合物を抽出した。得られた有機層を鹹水で洗浄し、無水 MgSO 上で乾燥させ、濾過し、真空中で濃縮した。

4

[0101] 次に、得られた粗製産物をフラッシュクロマトグラフィー（SiO , 50〜100% EtOA

2

c/へキサン）によって精製し、 3— (ヒドラジノカルボ-ルェチル） 2—メチル 1, 4 —ナフトキノンけフトキノンのヒドラジン誘導体 3)の淡黄色固体を得た。

[0102] なお、この固体の性質は以下の通りであった：融点 182〜183°C, NMR(300 MHz, DMSO— d6) δ 9. 00 (br, 1H) , δ 8. 06〜7. 96 (m, 2H) , 7. 89 〜7. 81 (m, 2H) , 4. 15 (br, 2H) , 2. 79 (t, J = 7. 5Hz, 2H) , 2. 19 (t, J = 7. 8 Hz, 2H) , 2. l l (s, 3H) ; ¹³C NMR(75MHz, DMSO— d6) δ 183. 8, 170. 3, 143. 5, 135. 4, 131. 6, 126. 1, 32. 1, 26. 8, 12. 4 ;FABMS (NBA) m /z 259 [ (M+H) +] ;HRMS calcd. for 【（M+H) +] 259. 1083, found 259. 1082。

[0103] 〔トリオール基を含むオリゴデォキシヌクレオチドの合成〕

Model 392 DNA/RNA 合成装置（Applied Biosystems社）上で、脱塩基部位前駆体として機能する修飾部位 (脱塩基前駆体修飾部)を含むオリゴデォキシヌクレオチド (以下、「オリゴマー」と記す)を標準的なホスホロアミダイト法を用いて合成した。合成したオリゴマーの塩基配列については後述する。自動合成の後、得られたオリゴマーを逆相 HPLC (0. 1M TEAA, pH7. 0の溶媒混合物による溶離、流量 3. OmLZ分での 60分以上に亘る 0%から 30%へのァセトニトリルの一次勾配および 80分以上に亘る 30%から 100%へのァセトニトリルの一次勾配）によって精製した。

[0104] 次に、乾燥させたオリゴマーを 200 μ Lの 80%酢酸に懸濁し、室温にて 30分インキュベーシヨンした。 30分後、反応混合物に等量の脱イオン水を加え、 DMTおよび Τ BDMS基を取り除くためにさらに 4時間室温にてインキュベーションした。

[0105] 続いて、完全に脱保護されたオリゴマーを、逆相 HPLC (0. 1M TEAA, pH7. 0 の溶媒混合物による溶離、流量 3. OmLZ分での 60分以上に亘る 0%から 30%へのァセトニトリルの一次勾配および 80分以上に亘る 30%から 100%へのァセトニトリルの一次勾配）によって精製した。

[0106] 得られたオリゴマーの純度および濃度を、 37°Cにおいてアルカリホスファターゼ、ヌクレアーゼ P1およびホスホジエステラーゼ Iで 4時間消化することによって求めた。合成したオリゴマーであるかどうかは、 MALDI—TOF MASS分析装置によって確かめた（mZz 6248. 87 (calcd. for [M—H] ^_ 6248. 01) )。

[0107] 〔DNA鎖の内部に 2—メチル 1, 4—ナフトキノンを含有するオリゴデォキシヌタレォチド（NQ— ODN)の合成〕

脱塩基部位前駆体として機能する修飾部位をもつオリゴマー（100 μ Μ)を、 0. 1 MNaOAc (pH6. 0, 80 L)に溶力した 0. 5mM過ヨウ素酸ナトリウムととちに 4°Cの遮光条件下で 1時間インキュベーションした。得られた反応混合物に対して、上述のナフトキノンのヒドラジン誘導体 3をァセトニトリル（5mM, 80 ^ L)に溶解したものをカロえ、周囲温度で 14時間インキュベーションした。そして、得られた反応混合物を逆相 HPLC (0. 1M TEAA, pH7. 0の溶媒混合物による溶離、流量 3. OmLZ分での 60分以上に亘る 0%から 30%へのァセトニトリルの一次勾配および 80分以上に亘る 30%から 100%へのァセトニトリルの一次勾配）で精製し、 NQ— ODN2を得た。

[0108] 得られた NQ— ODNの純度および濃度は、アルカリホスファターゼ、ヌクレアーゼ P 1およびホスホジエステラーゼ Iによって 37°Cでー晚完全に消化することによって求めた。合成したオリゴマーであるかどうかは、 MALDI—TOF MASS分析装置によつて確力めた（mZz 6455. 26 (calcd. for [M— H] _ 6456. 22) )。

[0109] 〔プローブオリゴマー（FRETプローブ）の合成〕

光標識および 4— (4'— dimethylaminophenylazo) benzoic acid (dabcyl )標識のホスホロアミダイトを用いて DNA合成機（Applied Biosystems 3400)で合成した。合成後、逆相 HPLC (0. 1M TEAA (pH7. 0)の溶媒混合物による溶離、流量 3. OmLZ分での 60分以上に亘る 0%力 60%へのァセトニトリルの一次勾配 )で精製した。アルカリホスファターゼ、ヌクレアーゼ P1およびホスホジエステラーゼ I で完全に消化した後、プローブオリゴマーの精製度および濃度を測定した。

[0110] 〔〔NQ— ODNの光酸化：蛍光測定〕

標的オリゴマーを（50nM— 50pM)を 2—メチルー 1, 4 ナフトキノンユニットを持つ相補的なオリゴマー（100nM— 100pM)と、 2mM力コジル酸ナトリウムを含む Na C1緩衝液 (pH7. 0) 10 L中でハイブリダィズさせた。サーモサイクラ一（BIO— RA D社製、 iCycler)を用いて試料を 90°Cで 5分間加熱した後、ゆっくりと 4°Cまで下げることにより、ハイブリダィゼーシヨンを完了した。続いて、標的の二本鎖オリゴマーにトランスイルミネーターを用いて 0°Cで 312nmの光を照射した。照射後、 50 /z Lの 10 %ピペリジン (vZv)を添加し、 90°Cで 20分間処理して濃縮した。乾燥 DNAペレットを 10 Lの脱イオン水で溶解した後、 800 Lのエタノールをカ卩えて沈澱させた。沈渣 DNAを 100 μ Lの 80%エタノールで洗浄し、真空乾燥した。得られた DNAペレツト (光照射した標的サンプル)を蛍光強度の測定および蛍光顕微鏡観察に供した。

[0111] 〔フラップエンドヌクレアーゼ Iによるプローブオリゴマーの酵素反応手順〕

すべての反応は、全量 15 Lに調製して行った。すなわち、 1. 5 Lの 1 Mプローブオリゴマーを 11. 5 Lの光照射した標的サンプル溶液に添加した。ここで、標的サンプル溶液は、 20mM Tris-HCl (pH7. 4)、 15mM NaCl、 10 X REC™リアクシヨンバッファー 12、および添加用 1 X BSAを含有する緩衝液中に 500fmol— 50

Oamolの標的 DNAを含む。

[0112] 続いて、 2 Lのフラップエンドヌクレアーゼ一 1 (1ユニット）を添カ卩し、 30°Cで 5分間インキュベートした。酵素反応終了後、反応液（10 L)を 390 Lの脱イオン水で希釈し、蛍光強度の増加をモニターした (励起波長 495nm)。

[0113] 〔蛍光顕微鏡観察〕

上述の酵素反応後、 δ μ ^ Ι . 7%ァガロースゲル溶液を反応液に添カ卩し、混和した反応液を室温で一夜放置した。ゲル片をカバーグラスで挟み、蛍光顕微鏡観察に供した。蛍光は KEYENCE ΒΖ— 8000でモニターした（励起 480Z30nm、検出 5

10nm、露光時間 55ms)。

2.実験結果

〔使用オリゴマー〕

p53がん抑制遺伝子配列には、メチル化された 5 '—CpG— 3 'が変異の hot spot として存在することが報告されている（Tornaletti, S., Pfeifer, G. P. Oncogene 1995, 1 0, 1493. ; Baylin, S. B., Herman, J. G. Trends Genet. 2000, 16, 168.； Esteller, M., Corn, P. G.， Baylin, S. B" Herman, J. G. Cancer Res. 2001, 61, 3225.)。本実施例では、その一つである codon282 (下記の ODNl, 2の配列における CGG)を含む塩基配列を持つ DNAオリゴマーを検出対象に選んだ。なお、各実験手順の詳細は上述の通りである。

[0114] 検出対象となるオリゴマーのうち、 5—メチルシトシンを有するオリゴマーを ODNl ( 5， - CTGGGAGAGACC^mGGCGCACAG - 3 '：酉己歹 IJ番号 1)とし 5—メチノレシトシンを有しないオリゴマーを ODN2 (5，一 CTGGGAGAGACCGGCGCACAG— 3，：配列番号 2)とした。これらのオリゴマーは、インビトロジヱン社から購入した。 [0115] また、ナフトキノンを導入する対象となるオリゴマーの配列は、基本的には ODN1および ODN2と相補的な配列とし、 ODN1および ODN2の codon282のメチル化されうるシトシン塩基の相補部位のみをトリオール基を有する化合物とした。具体的には、 5'— CTGTGCGCCYGTCTCTCCCAG— 3'とし、 Yを、

[0116] [化 18]

Y とした _c

[0117] そして、このオリゴマーを過ヨウ素酸ナトリウムで処理し、トリオール基をホルミル基に変換した後、 3 （ヒドラジノカルボ-ルェチル） 2—メチルー 1, 4 ナフトキノン（ナフトキノンのヒドラジン誘導体 3)と縮合させ、ナフトキノンを導入した DNAオリゴマー、 NQ— ODNを得た。この NQ— ODN2の配列は、 5，— CTGTGCGCCZGTCTCT CCCAG— 3'でぁり、 Zは、

[0118] [化 19]

Z である。

[0119] プローブオリゴマー（FRETプローブ）は、図 3に示す 2種類を合成した。プローブォリゴマー 1 (配列番号 3)は標的 DNAの 5'断片の 3'領域の相補配列を有しており、プローブオリゴマー 2 (配列番号 4)は標的 DNAの当該領域の相補配列を有しない。合成手順は上述の通りである。 MALDI—TOF— MSにより目的のプローブオリゴマーであることを確認した（プローブオリゴマー l : calcd. for 13130. 77, found 13 130. 90、プローブオリゴマー 2 : calcd. for 13866. 27, found 13867. 10)。

[0120] 〔光酸化、ピぺリジン処理後に生成する DNA断片の同定〕

ODN1と NQ— ODNとを上述のようにハイブリダィズさせ、光照射およびピぺリジン処理を行った後、 HPLCで目的の 5，断片（5，— CTGGGAGAGAC— 3，：配列番号 5)のリテンションタイムの位置（図 4 (A)の purification)を粗く分取し、 MALDI— TOF— MSに供した。 MALDI—TOF— MSのチャートを図 4 (B)に示した。その結果、目的の 5'断片が生成していることが確認できた（calcd. for 3405. 24, foun d 3405. 75)。

[0121] 〔フラップエンドヌクレアーゼ Iによるプローブオリゴマーの酵素反応（実験 1)〕

ODN1 (標的 DNA) 50nM (500fmol)および NQ— ODNlOOnM (lpmol)を含有する試料をノヽイブリダィズさせ、光照射、ピぺリジン処理を行い、乾燥ペレットを得た。全量が 15 /z Lとなるように緩衝液、プローブオリゴマー 1およびフラップエンドヌクレアーゼ一 Iを添カ卩して 30°Cで 5分間インキュベートした。これを 40倍に希釈して蛍光を測定した。

[0122] 対照として、標的 DNAを ODN2としたもの、標的 DNAを添カ卩しな!/、もの、フラップエンドヌクレアーゼ一 Iを添カ卩しないものを設けた。

[0123] 結果を図 5に示した。図 5から明らかなように、メチルイ匕したシトシン (mC)を有する

ODN1を用い、かつ、フラップエンドヌクレアーゼ Iを添カ卩した場合のみ強い蛍光発光が観測された。この結果から、本系を用いることにより mCを含有する標的 DNA を蛍光の強度を測定することにより検出できることが示された。

[0124] 〔フラップエンドヌクレアーゼ Iによるプローブオリゴマーの酵素反応（実験 2)〕上記実験 1と同様の条件で、光照射を行わない場合、および、ピぺリジン処理を行わない場合について、実験を行った。

[0125] 結果を図 6に示した。図 6から明らかなように、光照射を行わない場合、および、ピペリジン処理を行わない場合は、標的 DNAを添加しない場合と同様に蛍光発光が観測されなかった。

[0126] 〔フラップエンドヌクレアーゼ Iによるプローブオリゴマーの酵素反応（実験 3)〕上記実験 1と同様の条件で、標的 DNAから生成する 5'断片の相補配列を有しないプローブオリゴマー 2を用いて実験を行った。試料として、プローブオリゴマー 1Z ODNl、プローブオリゴマー 2ZODNl、プローブオリゴマー 2Z標的 DNAなし、プローブオリゴマー 2ZODN1Zフラップエンドヌクレアーゼ Iなし、の 4種類の組み合わせを用いた。

[0127] 結果を図 7に示した。図 7から明らかなように、プローブオリゴマー 2ZODN1を組合せた試料では、標的 DNAを添カ卩しな、場合およびフラップエンドヌクレアーゼ I を添加しない場合と同様に蛍光発光が観測されな力つた。

[0128] 以上、実験 1 3の結果から、光照射およびピぺリジン処理により生成する 5 '断片と当該 5，断片の相補配列を有するプローブオリゴマーが複合体を形成し、インベース部分をフラップエンドヌクレアーゼー Iが認識した結果、切断に至り、蛍光が発光することが確認された。

[0129] 〔検出限界の検討〕

試料に含まれる ODN1の量を 500fmol、 50fmol、 5fmolおよび 500amolと減少させ、上記実験 1と同様の条件でフラップエンドヌクレアーゼ Iによるプローブオリゴマ一の酵素反応を行った。対照として、標的 DNAを ODN2としたものを設けた。なお、プローブオリゴマー 1を用い、すべての試料にフラップエンドヌクレアーゼ Iを添カロした。

[0130] 結果を図 8に示した。図 8から明らかなように、 ODN1の量が 500amolのレベルまで、対照と比較して蛍光強度の違いを検出できた。この結果から、本系を用いれば、 fmol未満の標的 DNA量でも検出できることが明ら力となった。

[0131] 〔5—メチルシトシン検出シグナルの可視化 (蛍光顕微鏡観察)〕

上記実験 1と同様の条件で、 500fmolの ODN1または ODN2を標的 DNAとして、フラップエンドヌクレアーゼー Iによる酵素反応を行った。上述の通り反応液にァガロースゲル溶液を添加してゲルイ匕し、蛍光顕微鏡で観察した。なお、それぞれの標的 DNAについて、光照射を 0時間（光照射なし)および 2時間の 2通り行った。

[0132] 結果を図 9 (A)〜（D)に示した。 (A)および (B)は ODN2を標的 DNAとした場合、

(C)および (D)は ODN1を標的 DNAとした場合の結果を示す。図 9 (A)〜（D)から明らかなように、 5—メチルシトシンを有する ODN1を標的 DNAとし、 2時間の光照射を行った場合、強い蛍光発光が観察された。一方、光照射を行わなカゝつた場合ゃ標的 DNAに ODN2を用いた場合は、蛍光発光が観察されな力つた。この結果から、 D NA内の 5—メチルシトシンを視覚的に検出できることが示された。

[0133] なお、発明を実施するための最良の形態の項においてなした具体的な実施態様または実施例は、あくまでも、本発明の技術内容を明らかにするものであって、そのような具体例にのみ限定して狭義に解釈されるべきものではなぐ本発明の精神と次に記載する請求の範囲内で、いろいろと変更して実施することができるものである。

[0134] また、本明細書中に記載された学術文献および特許文献の全てが、本明細書中にぉヽて参考として援用される。

産業上の利用の可能性

[0135] 本発明によれば、簡便、かつ、高感度なシトシンのメチルイ匕判定方法を実現できる。本発明のメチルイ匕判定方法は、任意の塩基配列を持つ遺伝子に適用可能であるため、遺伝子診断、遺伝子解析、さらには遺伝子が関与する生体分子の相互作用の解明等、医学 ·生物学上幅広い分野で利用することができる。

Claims

請求の範囲

[1] 検出対象の 5—メチルシトシンを含む標的 DNAの当該 5—メチルシトシン部位を選択的に切断し、当該 5—メチルシトシンの 5 '側に隣接する塩基を 3 '末端に有する D

NA断片を取得する工程（1) ;

上記 DNA断片、または上記 DNA断片の 3'末端領域とハイブリダィズし得る塩基配列を 3，末端領域に有する FRETプローブおよびフラップエンドヌクレアーゼを反応させる工程（2) ;および

反応混合物の蛍光を検出する工程 (3)

を包含することを特徴とする遺伝子中の 5—メチルシトシン検出方法。

[2] 上記工程（1)において、ポリヌクレオチド鎖内部にナフトキノンを有する光機能性核酸を用いることを特徴とする請求項 1に記載の遺伝子中の 5—メチルシトシン検出方法。

[3] 上記光機能性核酸が、次に示す一般式 (1)

5，一 A— Z— B— 3，

によって表されることを特徴とする請求項 2に記載の遺伝子中の 5—メチルシトシン検出方法。

[4] 上記一般式（1)中の Zが、次の化学式 (2)〜（6)

[化 1]

[化 2]

96Z9S0/.00Zdf/X3d εε OA

(ただし、上記の化学式（2)〜（6)において、「5'」は上記一般式（1)中のヌクレオチド A側を表し、「3'」は上記一般式（1)中のヌクレオチド B側を表し、 5'末端の酸素原子はヌクレオチド Aの 3 '末端のリン酸基の酸素原子を表し、 3，末端の酸素原子はヌクレオチド Bの 5'末端のリン酸基の酸素原子を表す。 )

の何れか 1つによって表されることを特徴とする請求項 3に記載の遺伝子中の 5—メチルシトシン検出方法。

[5] 上記一般式（1)中の Zが、上記化学式（2)によって表されることを特徴とする請求項

4に記載の遺伝子中の 5—メチルシトシン検出方法。

[6] 上記光機能性核酸が、標的 DNAとハイブリダィズし得る塩基配列力もなり、かつ、標的 DNAとハイブリダィズした際に、検出対象の 5—メチルシトシンと対向する位置に上記ナフトキノンが挿入されていることを特徴とする請求項 1〜5の何れ力 1項に記載の遺伝子中の 5—メチルシトシン検出方法。

[7] 以下の（a)〜（c)を備えることを特徴とする遺伝子中の 5—メチルシトシン検出キット (a)標的 DNAとハイブリダィズし得る塩基配列からなり、かつ、標的 DNAとハイブリダイズした際に、検出対象の 5—メチルシトシンと対向する位置にナフトキノンが挿入されている光機能性核酸

(c)フラップエンドヌクレアーゼ