WO2007099869A1

WO2007099869A1 - Hcv治療及び予防剤

Info

Publication number: WO2007099869A1
Application number: PCT/JP2007/053371
Authority: WO
Inventors: Michinori Kohara; Takuya Umehara; Masayuki Sudo
Original assignee: Tokyo Metropolitan Organization For Medical Research; Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha
Priority date: 2006-02-24
Filing date: 2007-02-23
Publication date: 2007-09-07
Also published as: JPWO2007099869A1

Abstract

　本願発明者らは、U18666Aについて、HCVレプリコン阻害活性の検討を行ったところ、本化合物はHCVレプリコンRNAの複製またはHCVタンパク質の発現を阻害する効果を持つことが認められた。さらに本願発明者らは、siRNAを用いたDHCR24のノックダウン実験を行ったところ、DHCR24の発現を抑制した細胞では、有意にHCVレプリコン活性及びHCVタンパク質発現が阻害されることが明らかとなった。以上のことから、コレステロール生合成過程に関与する酵素活性を阻害することによって、HCV感染症の治療または予防を行うことが出来ることを明らかにした。

Description

明細書

HCV治療及び予防剤

技術分野

[0001] 本発明は、コレステロールの生合成過程を遮断する物質を有効成分として含有する、 HCV感染症を治療または予防するための薬剤に関する。また、 HCV感染症を治療または予防するための薬剤のスクリーニング方法、およびこれらに用いるためのキットに関する。

背景技術

[0002] HCVの感染者は世界で:!〜 2億人、日本国内では 200万人以上と推測されている。これらの患者の約 50%が慢性肝炎に移行しそのうち約 20%が感染後 30年以上たつて肝硬変、肝癌となる。肝癌の約 90%の原因が C型肝炎といわれている。日本国内では、毎年 2万人以上の患者が HCV感染に伴う肝癌により死亡している。

HCVは 1989年に輸血後の非 A非 B型肝炎の主要な原因ウィルスとして発見された。 HCVはエンベロープを有する RNAウィルスであり、そのゲノムは 1本鎖（ + ) RN Aからなり、フラビウィルス科のへパチウィルス（H印 acivims)属に分類される。

[0003] HCVは、レ、まだ明らかでない原因により宿主の免疫機構を回避するため、免疫機構の発達した大人に感染した場合でも持続感染が成立することが多ぐ慢性肝炎、肝硬変、肝癌へと進行し、手術により摘出しても、非癌部で引き続き起こる炎症のため肝癌が再発する患者が多レ、ことも知られてレ、る。

よって、 C型肝炎の有効な治療法の確立が望まれており、その中でも、抗炎症剤により炎症を抑える対処療法とは別に、患部である肝臓において HCVを減らすあるいは根絶させる薬剤の開発が強く望まれている。

[0004] 現在、 HCV排除の唯一の有効な治療法としてインターフェロン治療が知られている。しかしインターフェロンが有効な患者は、全患者の 1/3程度である。特に HCV ゲノタイプ lbに対するインターフェロンの奏効率は非常に低レ、。従って、インターフエロンに代わる、もしくはそれと併用し得る抗 HCV薬の開発が強く望まれている。近年、リバビリン（Ribavirin : :!— β— D—リボフラノシル一 1Η— 1, 2, 4—トリァゾールー 3—カルボキシアミド）がインターフェロンとの併用による C型肝炎治療薬として巿販されているが、有効率は依然低ぐ更なる新規な C型肝炎治療薬が望まれている。また、インターフェロンァゴニスト、インターロイキン一 12ァゴニストなど、患者の免疫力を増強させることによってウィルスを排除する手段も試みられているが、いまだ有効とされる薬剤は見出されていない。

HCV遺伝子がクローニングされて以来、ウィルス遺伝子の機構と機能、各ウィルスのタンパク質の機能などについての分子生物学的解析は急速に進展した力ホスト細胞内でのウィルスの複製、持続感染、病原性などのメカニズムは十分に解明されておらず、信頼できる培養細胞を用いた HCV感染実験系は構築されていなかった。従って従来、抗 HCV薬の評価をするにあたり他の近縁ウィルスを用いた代替ウィルスアツセィ法を用いなければならなかった。

し力、し近年、 HCVの非構造領域部分を用いてインビトロでの HCV複製を観測することが可能になったことにより、レブリコンアツセィ法によって抗 HCV薬を容易に評価することができるようになった (非特許文献 1)。この系での HCV RNA複製のメカ二ズムは、肝細胞に感染した全長 HCV RNAゲノムの複製と同一であると考えられている。従って、この系は、 HCVの複製を阻害する化合物の同定に有用な細胞に基づくアツセィ系ということができる。

下記式（3)で表される化合物の塩酸塩 U18666A (3 β -(2-Diethylaminoethoxy)andr ost-5-en-17-one, HC1)は、細胞透過性の両イオン性アミノステロイドで、細胞膜のタンパク質透過性を阻害する化合物として知られている。

3-beta-hydroxysterol delta- 24- reductase活性を阻害することで、細胞内の LDL由来コレステロールの生合成と移送を阻害するものと考えられている。また， Δ 8 -ステロ一ルイソメラーゼ活性を阻害することも知られている。 [0006] なお、本出願の発明に関連する先行技術文献情報を以下に示す。

特許文献 1： WO2006/016657

特許文献 2： WO2005/019268

非特許文献 l : Lohmann V., et al" Science, 285, 110-113 (1999)

非特許文献 2 : Ye J. , et al, PNAS, 100 (26), 15865-15870 (2003)

非特許文献 3 : Sakamoto H" et al., Nat Chem Biol. 1(6):333_7 (2005)

発明の開示

発明が解決しょうとする課題

[0007] スフインゴ脂質であるスフインゴミエリン、およびコレステロールは細胞膜上のラフトの構成成分であり、インフルエンザ、 HIV等のウィルスはラフトを介して複製される（Ta keda M. et al" PNAS, 100， 25(2003)、 Lucero H. A., et al, Archives of Biochemistry and Biophysics, 426, 208(2004)、 Simons K.， Nature, 387， 569 (1997)、 G._ Z. Leu et al. Biochemical and biophysical research communications, 318(1), 275 - 80 (2004))。

[0008] 本願発明者らは、スフインゴ脂質生合成が HCV感染に関与すること、およびスフィンゴ脂質生合成に関わる酵素の活性や発現を阻害する化合物が、 HCV感染症の極めて有用な治療剤または予防剤となることを明らかにした (特許文献 1、非特許文献 3 また、コレステロールの生合成に関わる 3 -ヒドロキシ -3-メチルダルタリル- CoAレダクターゼを阻害する化合物である口パスタチンが、 HCVの複製阻害活性を有することが知られている（非特許文献 2)。し力ながら、口パスタチンの HCV複製阻害能は低く、コレステロールの生合成の阻害が HCV感染症の治療または予防に関与するか否かは定かではなかった。また、 HCV感染症の治療または予防に対し、より高い効果を示す薬剤の提供が求められており、このような薬剤を提供するための効果的な薬剤のスクリーニング法も求められている。

[0009] 一方、本発明者らは、これまでにコレステロール生合成の最終段階を触媒する酵素である 3-beta-hydroxysterol delta-24-reductase (DHCR24)力肝癌患者の癌部および肝癌細胞株において高発現していることを見出し、 DHCR24を認識する抗体が肝癌のマーカーとして使用可能であることを明らかにした（特許文献 2)。し力しながら、コレステロール生合成に関与する DHCR24の活性および発現阻害が、 HCVの複製阻害活性を有するか否かは解明されていなかった。

[0010] 本発明は、このような状況に鑑みてなされたものであり、その目的は、デスモステロールからコレステロールの生合成過程を遮断する物質を有効成分として含有する、 H

CV感染症を治療または予防するための薬剤を提供することにある。また、 HCV感染症を治療または予防するための薬剤のスクリーニング方法、およびこれらに用いるためのキットの提供も目的とする。

課題を解決するための手段

[0011] 本発明者らは、上記の課題を解決するために、細胞膜上のラフトの構成成分であるコレステロールの生合成を阻害することにより、 HCV複製が阻害されるか否かについて検討を行った。まず、以下の式（3)で表される化合物の塩酸塩である、デスモステロールからコレステロールの生合成を特異的に阻害する化合物 U18666Aについて、 HCVレプリコンアツセィを行った。

[0013] U18666Aを OnMから 500nMの範囲でレプリコン細胞 Huh_3_lに与え、培養しタンパク質を回収した後、 HCVタンパク由来の抗 NS3ゥサギ抗体を用いてウェスタン解析を行った。その結果、 U18666Aに 84nMの濃度で HCVタンパク質の発現を 50%減少させる効果が認められた（図 2)。また、 U18666Aを OnMから ΙΟΟΟηΜの範囲で HCVレプリコン保持細胞 FLR3-1に与え、培養後、ルシフェラーゼアツセィおよび WSTによる細胞毒性試験を行った。その結果、 U18666Aは HCVレプリコン阻害活性を示すことが明らかになつた（図 3)。さらに、 U18666Aはロバスタチンよりも明らかに高レ、 HCVレプリコン阻害活性を示した。

以上の結果より、 DHCR24を特異的に阻害する化合物 U18666Aは、抗 HCV複製阻害活性を持ち、コレステロール生合成が HCV感染に関与していることが示唆された。

[0014] さらに、 DHCR24を siRNAによりノックダウンして、 HCVレプリコン阻害活性を測定した。具体的には、 DHCR24発現を低下させた条件下で、 FLR-3-1細胞における HCV レプリコン活性の影響を測定した。その結果、 DHCR24の発現を抑制するため siRNA 処理した細胞では、コントロール siRNA処理した細胞に対し有意に HCVレプリコン活性を阻害する効果が強く認められた（図 4)。

これらの結果より、コレステロール生合成が HCV感染に関与することがわかり、該生合成過程に存在する酵素活性を阻害することによって、 HCV感染症の治療または予防を行うことが可能であると示唆された。

[0015] 本発明は、より具体的には以下の〔1〕〜〔32〕を提供するものである。

〔1〕デスモステロールからコレステロールの生合成過程を遮断する物質を有効成分として含有する、 HCV感染症を治療または予防するための薬剤。

〔2〕デスモステロールからコレステロールの生合成過程を遮断する物質が以下の（a )または (b)である、〔1〕に記載の薬剤。

(a) DHCR24の酵素活性を阻害する物質

(b) DHCR24の発現を抑制する物質

〔3〕 DHCR24の酵素活性を阻害する物質が、下記一般式（1)

〔式中、 Xは、下記:

からなる群から選ばれるいずれかの基を示し;

Wは、下記：

からなる群から選ばれるレ、ずれかの基を示し；

Yは、水素原子またはメチル基を示し；

Vは、酸素原子又は硫黄原子を示し；

nは 2〜6の整数を示し；

mは 0または 1を示し；

Rと Rは、互いに独立して、 C Cアルキル基を示し、または隣接する窒素原子と

1 2 1 4

一緒になつて互いに結合してモルフオリ二ル基を形成してレ、てもよく；

は、単結合または二重結合を意味する。〕で表される化合物またはその薬学的に許容される塩である、〔2〕に記載の薬剤。

〔4〕前記式（1)で表される化合物が、下記一般式（2)

〔式中、 R、 R、 m、 nは、請求項 3に記載の R、 R、 m、 nと同意義である。〕で表され

1 2 1 2

る、〔3〕に記載の薬剤。

〔5〕前記式（1)で表される化合物が、下記式（3)

で表される、〔3〕に記載の薬剤。

〔6〕 DHCR24の酵素活性を阻害する物質が、 DHCR24を認識する抗体である、〔2〕に記載の薬剤。

〔7〕 DHCR24の発現を抑制する物質が、以下の（a)または (b)である、〔2〕に記載の薬剤。

(a) DHCR24をコードする DNAの転写産物と相補的な RNA

(b) DHCR24をコードする DNAの転写産物を特異的に開裂するリボザィム活性を有する RNA

〔8〕 HCV感染症が、 C型肝炎、肝硬変、肝繊維化、または肝癌である、〔1〕〜〔7〕のいずれかに記載の薬剤。

〔9〕以下の（a)〜（c)の工程を含む、 HCV感染症を治療または予防するための薬剤のスクリーニング方法。

(a)デスモステロールからコレステロールの生合成過程に関与する酵素に被検化合物を接触させる工程

(b) (a)に記載の酵素と被検化合物の結合を検出する工程

(c) (a)に記載の酵素と結合する被検化合物を、 HCV感染症を治療または予防する薬物として選択する工程

〔10〕以下の（a)〜（c)の工程を含む、 HCV感染症を治療または予防するための薬剤のスクリーニング方法。

(a)被検化合物を細胞に接触させる工程

(b)デスモステロールからコレステロールの生合成過程で合成される化合物の量を測定する工程

(c)被検化合物を接触させていない場合と比較して、上記化合物の量を減少させた被検化合物を、 HCV感染症を治療または予防する薬物として選択する工程

〔11〕以下の（a)〜（c)の工程を含む、 HCV感染症を治療または予防するための薬剤のスクリーニング方法。

(a)被検化合物を細胞に接触させる工程

(b)デスモステロールからコレステロールの生合成過程に関与する酵素の発現レべルを測定する工程

(c)被検化合物を接触させてレ、なレ、場合と比較して、上記酵素の発現レベルを減少させた被検化合物を、 HCV感染症を治療または予防する薬物として選択する工程 [12] 以下の（a)〜（d)の工程を含む、 HCV感染症を治療または予防するための薬剤のスクリーニング方法。

(a)デスモステロールからコレステロールの生合成過程に関与する酵素をコードする DNAのプロモーター領域の下流にレポーター遺伝子が機能的に結合した DNAを有する細胞または細胞抽出液を提供する工程

(b)該細胞または該細胞抽出液に被検化合物を接触させる工程

(c)該細胞または該細胞抽出液における該レポーター遺伝子の発現レベルを測定する工程

(d)被検化合物を接触させてレ、なレ、場合と比較して、該レポーター遺伝子の発現レベルを減少させた被検化合物を、 HCV感染症を治療または予防する薬物として選択する工程

〔13〕以下の（a)〜（c)の工程を含む、 HCV感染症を治療または予防するための薬剤のスクリーニング方法。

(b)該コレステロールの生合成過程に関与する酵素の活性を測定する工程

(c)被検化合物を接触させない場合と比較して、上記酵素の活性を低下させた被検化合物を、 HCV感染症を治療または予防する薬物として選択する工程

〔14〕デスモステロールからコレステロールの生合成過程に関与する酵素力 DHC R24である、〔9〕〜〔： 13〕のレ、ずれかに記載のスクリーニング方法。〔15〕 HCV感染症が、 C型肝炎、肝硬変、肝繊維化、または肝癌である、〔9〕〜〔14 〕のいずれかに記載のスクリーニング方法。

〔16〕〔9〕〜〔15〕のいずれかに記載のスクリーニング方法に用いるためのキット。

[17] デスモステロールからコレステロールの生合成過程を遮断する物質を対象に投与する工程を含む、 HCV感染症を治療または予防する方法。

〔18〕デスモステロールからコレステロールの生合成過程を遮断する物質が以下の (a)または (b)である、〔17〕に記載の方法。

(a) DHCR24の酵素活性を阻害する物質

(b) DHCR24の発現を抑制する物質

〔19〕 DHCR24の酵素活性を阻害する物質が、下記一般式（1)

〔式中、 Xは、下記：

からなる群から選ばれるいずれかの基を示し;

wは、下記：

からなる群から選ばれるレ、ずれかの基を示し；

Υは、水素原子またはメチル基を示し；

Vは、酸素原子又は硫黄原子を示し； nは 2〜6の整数を示し；

mは 0または 1を示し；

Rと Rは、互いに独立して、 C—Cアルキル基を示し、または隣接する窒素原子と

1 2 1 4

は、単結合または二重結合を意味する。：]で表される化合物またはその薬学的に許容される塩である、〔18〕に記載の方法。

〔20〕前記式（1)で表される化合物が、下記一般式（2)

1 2 1 2

る、〔19〕に記載の方法。

〔21〕前記式（1)で表される化合物が、下記式（3)

で表される、〔19〕に記載の方法。

[22] DHCR24の酵素活性を阻害する物質が、 DHCR24を認識する抗体である、〔1 8〕に記載の方法。

[23] DHCR24の発現を抑制する物質力 S、以下の（_a)または（b)である、〔18〕に記載の方法。

(a) DHCR24をコードする DNAの転写産物と相補的な RNA

[24] HCV感染症が、 C型肝炎、肝硬変、肝繊維化、または肝癌である、〔17〕から〔 23]のレ、ずれかに記載の方法。

〔25〕 HCV感染症を治療または予防するための薬剤を製造するための、デスモステロールからコレステロールの生合成過程を遮断する物質の使用。

[26] デスモステロールからコレステロールの生合成過程を遮断する物質が以下の (a)または (b)である、〔25〕に記載の使用。

(a) DHCR24の酵素活性を阻害する物質

(b) DHCR24の発現を抑制する物質

〔27〕 DHCR24の酵素活性を阻害する物質が、下記一般式（1)

〔式中、 Xは、下記:

からなる群から選ばれるいずれかの基を示し;

Wは、下記：

からなる群から選ばれるいずれかの基を示し；

Yは、水素原子またはメチル基を示し；

Vは、酸素原子又は硫黄原子を示し；

nは 2〜6の整数を示し；

mは 0または 1を示し；

Rと Rは、互いに独立して、 C -Cアルキル基を示し、または隣接する窒素原子と

1 2 1 4

は、単結合または二重結合を意味する。〕で表される化合物またはその薬学的に許容される塩である、〔26〕に記載の使用。

〔28〕前記式（1)で表される化合物が、下記一般式 (2)

1 2 1 2

る、〔27〕に記載の使用。

〔29〕前記式（1)で表される化合物が、下記式（3)

で表される、 [27]に記載の使用 _c 〔30〕 DHCR24の酵素活性を阻害する物質が、 DHCR24を認識する抗体である、〔2 6〕に記載の使用。

〔31〕 DHCR24の発現を抑制する物質が、以下の（a)または（b)である、〔26〕に記載の使用。

(a) DHCR24をコードする DNAの転写産物と相補的な RNA

[32] HCV感染症が、 C型肝炎、肝硬変、肝繊維化、または肝癌である、〔25〕から〔 31〕のいずれかに記載の使用。

図面の簡単な説明

[0016] [図 1]3-ヒドロキシ -3-メチルダルタリル- CoAからコレステロールの生合成過程および、 HCV複製までのカスケードを示す図である。

[図 2]ウェスタンブロット解析による、 U18666Aの HCVタンパク質合成阻害活性を測定した結果を示す写真である。

[図 3]U18666Aの HCVレプリコン阻害活性および細胞毒性を測定した結果を示す図である。

[図 4]DHCR24 siRNAの HCVレプリコン阻害活性を測定した結果を示す図である。発明を実施するための最良の形態

[0017] 本発明は、コレステロールの生合成過程を遮断する物質を有効成分として含有する、 HCV感染症を治療または予防するための薬剤に関する。

本発明において、コレステロールの生合成過程としては、より好ましくは 3-ヒドロキシ -3-メチルダルタリル- CoA力らコレステロールの生合成過程（図 1 )を挙げることが出来る。

本発明において、コレステロールの生合成過程を遮断する物質とは、 3-ヒドロキシ- 3-メチルダルタリル- CoAからコレステロールの生合成過程に関わる生体内反応を、直接的もしくは間接的に阻害するものであれば如何なる物質であってもよい。該物質は、コレステロールの生合成過程に関わる酵素の活性を阻害する物質、コレステロ一ルの生合成に関わる酵素の発現を阻害する物質であってもよぐまた、これらの阻害剤を生成または増加させる物質であって、生合成に関わる酵素を間接的に阻害する物質であってもよい。

[0018] 本発明の「コレステロールの生合成過程に関わる酵素の発現を抑制」という記載には、遺伝子の転写の抑制およびタンパク質への翻訳の抑制が含まれる。また、 DNA の発現の完全な停止のみならず発現の減少も含まれる。

本発明において、コレステロールの生合成過程に関わる酵素としては、より好ましくは 3— beta-hydroxysterol delta-24-reductase (DHCR24)を挙げること力 Sできる。

本発明の物質としては、コレステロール生合成過程の最終段階である、デスモステロールからコレステロールの生合成過程を遮断する物質を好ましい例として挙げることができる。該生合成過程を遮断する物質としては、該生合成に関与する DHCR24の酵素活性または該酵素の発現を阻害する化合物を挙げることができる。

[0019] 本発明の、 DHCR24の酵素活性を阻害する化合物としては、該酵素活性を阻害するものであれば如何なるものでもよいが、好ましくは

下記一般式（1)

〔式中、 Xは、下記:

からなる群から選ばれるいずれかの基を示し;

Wは、下記：

からなる群から選ばれるいずれかの基を示し；

Yは、水素原子またはメチル基を示し；

Vは、酸素原子又は硫黄原子を示し；

nは 2〜6の整数を示し；

mは 0または 1を示し；

1 2 1 4

は、単結合または二重結合を意味する。〕で表される化合物またはその薬学的に許容される塩を挙げることができる。

式（1)で表される化合物について、 Xは、好ましくはォキソ基である。 Wは、好ましくは一CH—である。 Vは、好ましくは酸素原子である。 nは好ましくは 2または 3であり

2

、更に好ましくは 2である。 mは、好ましくは 0である。 Rと Rは、互いに独立して、好ま

1 2

しくはメチノレ基もしくはェチノレ基であり、さらに好ましくはともにェチノレ基である。また、

としては、好ましくは二重結合である。

式（1)で表される化合物としては、下記式（2)で表される化合物が挙げられる。

式（2)中、 R、 R、 m、 nは、式（1)の R、 R、 m、 nと同意義である。

1 2 1 2

このような式（1)または（2)で表される化合物としては、好ましくは下記式（3)で表される化合物が挙げられる。

上記式中、「Ac」はァセチル基を意味し、「Et」はェチル基を意味する。

[0023] 本発明において、「C -Cアルキル基」とは、炭素原子数が:!〜 4のアルキル基を

1 4

示す。ここで、アルキル基とは、脂肪族炭化水素から任意の水素原子を 1個除いて誘導される一価の基であり、骨格中にヘテロ原子または不飽和炭素一炭素結合を含有せず、水素および炭素原子を含有するヒドロカルビルまたは炭化水素の部分集合のことをいい、直鎖状または分枝鎖状の構造を含む。「C—Cアルキル基」として、具

1 4

体的には、メチノレ基、ェチル基、 1一プロピル基、 2—プロピル基、 2—メチルー 1ープ口ピル基、 2—メチルー 2—プロピノレ基、 1一ブチル基、 2—ブチル基等があげられる

[0024] また、式（1)で表される化合物の薬学的に許容される塩は、当該化合物と、医薬品の製造に使用可能である酸または塩基とを接触させることにより製造される。当該塩には、例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、硫酸塩、スルホン酸塩、リン酸塩、ホスホン酸塩、酢酸塩、クェン酸塩、リンゴ酸塩、サリチル酸塩などのカルボン酸塩、または、ナトリウム塩、カリウム塩などのアルカリ金属塩；マグネシウム塩、カルシゥム塩などのアルカリ土類金属塩；アンモニゥム塩、アルキルアンモニゥム塩、ジァルキルアンモニゥム塩、トリアルキルアンモニゥム塩、テトラアルキルアンモニゥム塩などのアンモニゥム塩などが含まれる。当該塩として、好ましくは塩酸塩が挙げられる。また、当該塩には当該化合物が形成していてもよい水和物もしくは溶媒和物を含む。式（1)で表される化合物がフリー体として得られる場合、当該化合物が形成していてもよい塩またはそれらの水和物もしくは溶媒和物の状態に、常法に従って変換することができる。

このような式（1 )で表される化合物は、公知の方法を用いて製造することができる。たとえば、、米国特許 3000910、米国特許 3210386、または米国特許 3389051に記載された方法を用いて製造することができる。このうち、特に、式（3)で表されるィ匕合物の塩酸塩（U18666A)は CALBIOCHEM(R)により入手可能である。

[0025] 該化合物によりデスモステロールからコレステロールの生合成を特異的に阻害すること力 Sできる。

[0026] 本発明の、 DHCR24の発現を抑制する物質としては、 DHCR24をコードする DNAの転写産物と相補的な RNA、または該転写産物を特異的に開裂するリボザィムを挙げること力 Sできる。本発明において、発現を抑制される DHCR24の由来は特に限定されないが、好ましくは哺乳動物由来であり、より好ましくはヒト由来である。

[0027] DHCR24をコードする DNAとしては NMJ314762 (配列番号： 1 )に記載の塩基配列からなる DNA、配列番号： 2に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする DNA 、および配列番号： 2に記載のアミノ酸配列において 1または複数のアミノ酸が置換、欠失、付カロ、および/または挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする天然由来の DNA等も含まれる。「1または複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、および /または挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質」は、天然型のタンパク質と同等の機能を有し、かつ高い相同性を持つものである。高い相同性とは、アミノ酸配列全体で、少なくとも 50%以上、さらに好ましくは 70%以上、さらに好ましくは 90%以上 (例えば、 95%，96%，97%,98%,99%以上）の配列の同一性を指す。変異するアミノ酸残基においては、アミノ酸側鎖の性質が保存されている別のアミノ酸に変異されることが望ましレ、。例えばアミノ酸側鎖の性質としては、疎水性アミノ酸 (A、 I、 L、 M F、 P、 W、 Y、 V)、親水性アミノ酸 (R、 D、 N、 C、 E、 Q、 G、 H、 K、 S、 T)、脂肪族側鎖を有するァミノ酸 (G、 A、 V、 L、 I、 P)、水酸基含有側鎖を有するアミノ酸 (S、 T、 Υ)、硫黄原子含有側鎖を有するアミノ酸（C、 M)、カルボン酸及びアミド含有側鎖を有するアミノ酸（D、 N 、 E、 Q)、塩基含有側鎖を有するアミノ酸 (R、 K、 Η)、芳香族含有側鎖を有するァミノ酸 (H、 F、 Y、 W)を挙げることができる（括弧内はいずれもアミノ酸の一文字標記を表す)。あるアミノ酸配列に対する 1又は複数個のアミノ酸残基の欠失、付加及び/又は他のアミノ酸による置換により修飾されたアミノ酸配列を有するポリペプチドがその生物学的活性を維持することはすでに知られている。

[0028] DHCR24をコードする DNAには、配列番号： 1に記載の塩基配列からなる DNAにハイブリダィズする DNAも含まれる。ノ、イブリダィゼーシヨンにおける条件は当業者であれば適宜選択することができる力ハイブリダィゼーシヨン後の洗浄において、例えば 42。C、 5 X SSC、 0.1%SDSの条件であり、好ましくは 50。C、 5 X SSC、 0.1 %SDSの条件である。より好ましいハイブリダィゼーシヨンの条件としては、例えば 65°C、 0.1 X SSC 及び 0.1。/。SDSの条件である。

[0029] 本発明の「DHCR24をコードする DNAの転写産物と相補的な RNA」の一つの態様は、 DHCR24をコードする DNAの転写産物と相補的なアンチセンス RNAである。

アンチセンス核酸が標的遺伝子の発現を抑制する作用としては、以下のような複数の要因が存在する。すなわち、三重鎖形成による転写開始阻害、 RNAポリメラーゼによって局部的に開状ループ構造がつくられた部位とのハイブリッド形成による転写抑制、合成の進みつつある RNAとのハイブリッド形成による転写阻害、イントロンとェキソンとの接合点でのハイブリッド形成によるスプライシング抑制、スプライソソーム形成部位とのハイブリッド形成によるスプライシング抑制、 mRNAとのハイブリッド形成による核から細胞質への移行抑制、キヤッビング部位やポリ (A)付加部位とのハイブリッド形成によるスプライシング抑制、翻訳開始因子結合部位とのハイブリッド形成による翻訳開始抑制、開始コドン近傍のリボソーム結合部位とのハイブリッド形成による翻訳抑制、 mRNAの翻訳領域やポリソーム結合部位とのハイブリッド形成によるペプチド鎖の伸長阻止、および核酸とタンパク質との相互作用部位とのハイブリッド形成による遺伝子発現抑制などである。これらは、転写、スプライシング、または翻訳の過程を阻害して、標的遺伝子の発現を抑制する。

[0030] 本発明で用いられるアンチセンス配列は、上記のいずれの作用で標的遺伝子の発現を抑制してもよい。一つの態様としては、遺伝子の mRNAの 5'端近傍の非翻訳領域に相補的なアンチセンス配列を設計すれば、遺伝子の翻訳阻害に効果的であろう。しかし、コード領域もしくは 3'側の非翻訳領域に相補的な配歹も使用し得る。このように、遺伝子の翻訳領域だけでなく非翻訳領域の配列のアンチセンス配列を含む DN Aも、本発明で利用されるアンチセンス DNAに含まれる。使用されるアンチセンス DN Aは、適当なプロモーターの下流に連結され、好ましくは 3'側に転写終結シグナルを含む配列が連結される。このようにして調製された DNAは、公知の方法で、所望の植物へ形質転換できる。アンチセンス DNAの配列は、形質転換する植物が持つ内在性遺伝子またはその一部と相補的な配列であることが好ましレ、が、遺伝子の発現を有効に阻害できる限り、完全に相補的でなくてもよい。転写された RNAは、標的とする遺伝子の転写産物に対して好ましくは 90%以上、最も好ましくは 95%以上の相補性を有する。アンチセンス配列を用いて、効果的に標的遺伝子の発現を阻害するには、アンチセンス DNAの長さは、少なくとも 15塩基以上であり、好ましくは 100塩基以上であり、さらに好ましくは 500塩基以上である。通常、用いられるアンチセンス DNAの長さは 5kbよりも短ぐ好ましくは 2.5kbよりも短い。

[0031] 「DHCR24をコードする DNAの転写産物と相補的な RNA」の他の一つの態様は、 DH CR24をコードする DNAの転写産物と相補的な siRNAである。本発明の siRNAは、標的である DHCR24遺伝子の転写産物と相補的な RNA (アンチセンス RNA鎖）および該 RNAに相補的な RNA (センス RNA鎖）が結合した二重鎖 RNAである。

本発明において RNAは、標的遺伝子 mRNAのいずれかの領域に対するアンチセンス RNAをコードしたアンチセンスコード DNAと、標的遺伝子 mRNAのいずれかの領域のセンス RNAをコードしたセンスコード DNAより発現させることができる。また、これらのアンチセンス RNAおよびセンス RNAより siRNAを作成することもできる。

[0032] 本発明の siRNAの発現システムを、ベクター等に保持させる場合の構成としては、同一のベクター力アンチセンス RNA、センス RNAを発現させる場合と、異なるベクタ一からそれぞれアンチセンス RNA、センス RNAを発現させる場合がある。例えば、同一のベクターからアンチセンス RNA、センス RNAを発現させる構成としては、アンチセンスコード DNAおよびセンスコード DNAの上流にそれぞれ ροΙΠΙ系のような短レ、 RNA を発現し得るプロモータを連結させたアンチセンス RNA発現カセット、センス RNA発現カセットをそれぞれ構築し、これらカセットを同方向にあるいは逆方向にベクターに揷入することにより構成すること力 Sできる。また、異なる鎖上に対向するようにアンチセンスコード DNAとセンスコード DNAと逆向きに配置した発現システムを構成することもできる。この構成では、アンチセンス RNAコード鎖とセンス RNAコード鎖とが対となつた一つの二本鎖 DNA (siRNAコード DNA)が備えられ、その両側にそれぞれの鎖からアンチセンス RNA、センス RNAとを発現し得るようにプロモータを対向して備えられる。この場合には、センス RNA、アンチセンス RNAの下流に余分な配列が付加されることを避けるために、それぞれの鎖（アンチセンス RNAコード鎖、センス RNAコード鎖）の 3'末端にターミネータ一をそれぞれ備えることが好ましい。このターミネータ一は、 A ( アデニン)塩基を 4つ以上連続させた配列などを用いることができる。また、このパリンドロームスタイルの発現システムでは、二つのプロモータの種類を異ならせることが好ましい。

[0033] また、異なるベクター力アンチセンス RNA、センス RNAを発現させる構成としては、例えば、アンチセンスコード DNAおよびセンスコード DNAの上流にそれぞれ ροΙΠΙ系のような短レ、 RNAを発現し得るプロモータを連結させたアンチセンス RNA発現カセット、センス RNA発現カセットをそれぞれ構築し、これらカセットを異なるベクターに保持させることにより構成すること力 Sできる。

[0034] 本発明の siRNAは、細胞内で毒性を示さない範囲の短鎖からなる二重鎖 RNAを意味し、例えば、 15〜49塩基対と、好適には 15〜35塩基対と、さらに好適には 21〜30 塩基対とすることができる。あるいは、発現される siRNAが転写され最終的な二重鎖 R NA部分の長さが、例えば、 15〜49塩基対、好適には 15〜35塩基対、さらに好適には 21〜30塩基対とすることができる。

本発明の siRNAにおいて RNA同士が対合した二重鎖 RNAの部分は、完全に対合しているものに限らず、ミスマッチ（対応する塩基が相補的でない）、バルジ (一方の鎖に対応する塩基がない）などにより不対合部分が含まれていてもよい。本発明においては、 siRNAにおける RNA同士が対合する二重鎖 RNA領域中に、バルジおよびミスマッチの両方が含まれてレ、てもよレ、。

本発明の siRNA、標的遺伝子と完全に相補的である必要はないが、少なくとも 70% 以上、好ましくは 80%以上、さらに好ましくは 90。/o以上、最も好ましくは 95%以上 (例えば、 95%，96%，97%,98%,99%以上）の配列の相補性を有する。

[0035] 本発明の siRNAとしては、以下の（A)または（B)で表される siRNAを、より好ましい例として挙げること力 Sできる。

(A)配列番号： 3に記載の塩基配列を含む RNA、および配列番号: 4に記載の塩基配列を含む RNA力らなる 2重鎖 RNA

(B)配列番号： 5に記載の塩基配列を含む RNA、および配列番号: 6に記載の塩基配列を含む RNAからなる 2重鎖 RNA

[0036] 本発明の「DHCR24の発現の抑制」は、また、リボザィムをコードする DNAを利用して行うことも可能である。リボザィムとは触媒活性を有する RNA分子のことをいう。リボザィムには種々の活性を有するものがあるが、中でも RNAを切断する酵素としてのリボザィムの研究により、 RNAの部位特異的な切断を目的とするリボザィムの設計が可肯 gとなった。リボザィムには、グループ Iイントロン型や、 RNasePに含まれる M1RNAのように 400ヌクレオチド以上の大きさのものもある力ハンマーヘッド型やヘアピン型と呼ばれる 40ヌクレオチド程度の活性ドメインを有するものもある。

[0037] 例えば、ハンマーヘッド型リボザィムの自己切断ドメインは、 G13U14C15の C15の 3' 側を切断するが、活性には U14が 9位の Aと塩基対を形成することが重要とされ、 15位の塩基は Cの他に Aまたは Uでも切断されることが示されてレ、る。リボザィムの基質結合部を標的部位近傍の RNA配列と相補的になるように設計すれば、標的 RNA中の U C、UUまたは UAという配列を認識する制限酵素的な RNA切断リボザィムを作出することが可能である。例えば、阻害標的となる本発明の酵素のコード領域中には標的となりうる部位が複数存在する。

また、ヘアピン型リボザィムも、本発明の目的のために有用である。ヘアピン型リボザィムは、例えばタバコリングスポットウィルスのサテライト RNAのマイナス鎖に見出される (J.M.Buzayan Nature 323:349,1986)。このリボザィムも、標的特異的な RNA切断を起こすように設計できることが示されてレ、る。

[0038] 標的を切断できるよう設計されたリボザィムは、植物細胞中で転写されるようにカリフラワーモザイクウィルスの 35Sプロモーターなどのプロモーターおよび転写終結配列に連結される。しかし、その際、転写された RNAの 5'末端や 3'末端に余分な配列が付加されていると、リボザィムの活性が失われてしまうことがある。このようなとき、転写されたリボザィムを含む RNAからリボザィム部分だけを正確に切り出すために、リボザィム部分の 5'側や 3'側に、トリミングを行うためのシスに働く別のトリミングリボザィムを配置させることも可能である (K.Taira et al. (1990) Protein Eng. 3:733、 A.M.Dzianotta nd J.J.Bujarski (1989) Proc.Natl.Acad.Sci.USA. 86:4823、 C.A.Grosshansand R.T.C ech (1991) Nucleic Acids Res. 19:3875、 K.Taira et al. (1991) Nucleic Acids Res. 19 :5125)。また、このような構成単位をタンデムに並べ、標的遺伝子内の複数の部位を切断できるようにして、より効果を高めることもできる (N.Yuyama et al. Biochem.Biophy s.Res.Commun. 186: 1271, 1992)。このようなリボザィムを用いて本発明で標的となる遺伝子の転写産物を特異的に切断し、該遺伝子の発現を抑制することができる。

[0039] また本発明の、 DHCR24の酵素活性を阻害する物質としては、以下の（a)または (b )に記載のペプチドを認識する抗体を挙げることもできる。

(a)配列番号： 2に記載のアミノ酸配列からなるペプチド

(b)配列番号： 2に記載のアミノ酸配列において 1または複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および/もしくは挿入されたアミノ酸配列からなるペプチド

[0040] 本発明における抗体の由来は特に限定されるものではないが、好ましくは哺乳動物由来であり、より好ましくはヒト由来の抗体を挙げることが出来る。

本発明で使用される該ペプチドを認識する抗体は、公知の手段を用いてポリクローナル又はモノクローナル抗体として得ることができる。本発明で使用される該ペプチドを認識する抗体として、特に哺乳動物由来のモノクローナル抗体が好ましい。哺乳動物由来のモノクローナル抗体としては、ハイプリドーマに産生されるもの、および遺伝子工学的手法により抗体遺伝子を含む発現ベクターで形質転換した宿主に産生されるものがある。この抗体は DHCR24と結合することにより、 DHCR24の酵素活性を阻害する。その結果として、コレステロールの合成が阻害され、ラフトを介した HCVウイノレスの複製が抑制されるものと考えられる。

[0041] 該ペプチドを認識する抗体産生ハイプリドーマは、基本的には公知技術を使用し、以下のようにして作製できる。すなわち、該ペプチドを感作抗原として使用して、これを通常の免疫方法にしたがって免疫し、得られる免疫細胞を通常の細胞融合法によつて公知の親細胞と融合させ、通常のスクリーニング法により、モノクローナルな抗体産生細胞をスクリーニングすることによって作製できる。具体的には、該ペプチドを認識する抗体を作製するには次のようにすればよい。該ペプチドをコードする塩基配列を公知の発現ベクター系に挿入して適当な宿主細胞を形質転換させた後、その宿主細胞中又は、培養上清中から目的の該ペプチドを公知の方法で精製し、この精製ペプチドを感作抗原として用いればよい。また、該ペプチドと他の蛋白質との融合蛋白質を感作抗原として用いてもょレ、。

感作抗原で免疫される哺乳動物としては、特に限定されるものではなレ、が、細胞融合に使用する親細胞との適合性を考慮して選択するのが好ましぐ一般的にはげっ歯類の動物、例えば、マウス、ラット、ハムスター等が使用される。

[0042] 感作抗原を動物に免疫するには、公知の方法にしたがって行われる。例えば、一般的方法として、感作抗原を哺乳動物の腹腔内又は、皮下に注射することにより行われる。具体的には、感作抗原を PBS (Phosphate-Buffered Saline )や生理食塩水等で適当量に希釈、懸濁したものを所望により通常のアジュバント、例えば、フロイント完全アジュバントを適量混合し、乳化後、哺乳動物に 4-21日毎に数回投与するのが好ましレ、。また、感作抗原免疫時に適当な担体を使用することができる。

このように免疫し、血清中に所望の抗体レベルが上昇するのを確認した後に、哺乳動物から免疫細胞が取り出され、細胞融合に付される。細胞融合に付される好ましい免疫細胞としては、特に脾細胞が挙げられる。

前記免疫細胞と融合される他方の親細胞としての哺乳動物のミエローマ細胞は、すでに、公知の種々の細胞株、例えば、 P3X63Ag8.653 (Kearney, J. F. et al. J. Imm nol. (1979) 123， 1548—1550)、 P3X63Ag8U. l (Current Topics in Microbiology and I mmunology (1978) 81, 1-7)、 NS- 1 (Kohler. G. and Milstein, C. Eur. J. Immunol.(19 76) 6, 511-519 )、 MPC-11 (Margulies. D. H. et al. , Cell (1976) 8， 405-415 )、 SP2/ 0 (Shulman, M. et al" Nature (1978) 276, 269—270)、 F〇（de St. Groth, S. F. et al, J. Immunol. Methods (1980) 35, 1-21 )、 S194 (Trowbridge, I. S. J. Exp. Med. (1978) 148, 313- 323)、 R210 (Galfre, G. et al, Nature (1979) 277, 131-133 )等が適宜使用される。

[0043] 前記免疫細胞とミエローマ細胞の細胞融合は基本的には公知の方法、たとえば、ミノレシュタインらの方法（Kohler. G. and Milstein, C.、 Methods Enzvmol. (1981) 73, 3 -46)等に準じて行うことができる。

より具体的には、前記細胞融合は例えば、細胞融合促進剤の存在下に通常の栄養培養液中で実施される。融合促進剤としては例えば、ポリエチレングリコール (PEG )、センダイウィルス（HVJ)等が使用され、更に所望により融合効率を高めるためにジメチルスルホキシド等の補助剤を添加使用することもできる。

免疫細胞とミエローマ細胞との使用割合は、例えば、ミエローマ細胞に対して免疫細胞を 1〜10倍とするのが好ましい。前記細胞融合に用いる培養液としては、例えば、前記ミエローマ細胞株の増殖に好適な RPMI1640培養液、 MEM培養液、その他、この種の細胞培養に用いられる通常の培養液が使用可能であり、さらに、牛胎児血清 (FCS)等の血清補液を併用することもできる。

[0044] 細胞融合は、前記免疫細胞とミエローマ細胞との所定量を前記培養液中でよく混合し、予め、 37°C程度に加温した PEG溶液、例えば、平均分子量 1000〜6000程度の PEG溶液を通常、 30〜60% (w/v)の濃度で添加し、混合することによって目的とする融合細胞（ハイプリドーマ）が形成される。続いて、適当な培養液を逐次添加し、遠心して上清を除去する操作を繰り返すことによりハイプリドーマの生育に好ましくない細胞融合剤等を除去できる。

当該ハイプリドーマは、通常の選択培養液、例えば、 HAT培養液（ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンを含む培養液)で培養することにより選択される。当該 H AT培養液での培養は、目的とするハイプリドーマ以外の細胞（非融合細胞）が死滅するのに十分な時間、通常数日〜数週間継続する。ついで、通常の限界希釈法を実施し、目的とする抗体を産生するハイプリドーマのスクリーニングおよびクローニングが行われる。

[0045] また、ヒト以外の動物に抗原を免疫して上記ハイプリドーマを得る他に、ヒトリンパ球を in vitroで所望の抗原蛋白質又は抗原発現細胞で感作し、感作 Bリンパ球をヒトミエローマ細胞、例えば U266と融合させ、所望の抗原又は抗原発現細胞への結合活性を有する所望のヒト抗体を得ることもできる（特公平 59878参照）。さらに、ヒト抗体遺伝子のレパートリーを有するトランスジェニック動物に抗原又は抗原発現細胞を投与し、前述の方法に従い所望のヒト抗体を取得してもよい（国際特許出願公開番号 W〇 93/12227、 WO 92/03918、 WO 94/02602、 WO 94/25585、 WO 96/34096、 WO 96/ 33735参照）。

このようにして作製されるモノクローナル抗体を産生するハイプリドーマは、通常の培養液中で継代培養することが可能であり、また、液体窒素中で長期保存することが可能である。

[0046] 当該ハイプリドーマからモノクローナル抗体を取得するには、当該ハイプリドーマを通常の方法にしたがい培養し、その培養上清として得る方法、あるいはハイプリドーマをこれと適合性がある哺乳動物に投与して増殖させ、その腹水として得る方法などが採用される。前者の方法は、高純度の抗体を得るのに適しており、一方、後者の方法は、抗体の大量生産に適している。

[0047] 本発明には、モノクローナル抗体として、抗体遺伝子をハイブリドーマからクロー二ングし、適当なベクターに組み込んで、これを宿主に導入し、遺伝子組換え技術を用いて産生させた組換え型抗体を用いることができる（例えば、 Borrebaeck C. A. K. an d Larrick J. W. THERAPEUTIC MONOCLONAL ANTIBODIES, Published in the U nited Kingdom by MACMILLAN PUBLISHERS LTD, 1990参照）。

具体的には、目的とする抗体を産生する細胞、例えばハイプリドーマから、抗体の可変（V)領域をコードする mRNAを単離する。 mRNAの単離は、公知の方法、例えば、グァニジン超遠心法（Chirgwin, J. M. et al.， Biochemistry (1979) 18， 5294-5299 ) 、 AGPC法（Chomczynski, P. et al., Anal. Biochem. (1987)162, 156- 159)等により全 R NAを調製し、 mRNA Purification Kit (Pharmacia製）等を使用して mRNAを調製する。また、 QuickPrep mRNA Purification Kit (Pharmacia製）を用いることにより mRNAを直接調製すること力 Sできる。

[0048] 得られた mRNAから逆転写酵素を用いて抗体 V領域の cDNAを合成する。 cDNAの合成は、 AMV Reverse Transcriptase First-strand cDNA Synthesis Kit等を用いて行うことができる。また、 cDNAの合成および増幅を行うには 5 ' -Ampli FINDER RACE Ki t (Clontech製）および PCRを用いた 5，_!^^^法 1~0}1111&11， M. A. et al., Pro Natl. Acad. Sci. USA(1988)85, 8998-9002； Belyavsky, A. et al" Nucleic Acids Res. (1989) 17， 2919-2932)を使用することができる。得られた PCR産物から目的とする DNA断片を精製し、ベクター DNAと連結する。さらに、これより組換えベクターを作成し、大腸菌等に導入してコロニーを選択して所望の組換えベクターを調製する。目的とする D

NAの塩基配列を公知の方法、例えば、デォキシ法により確認する。

[0049] 目的とする抗体の V領域をコードする DNAが得られれば、これを所望の抗体定常領域 (C領域）をコードする DNAと連結し、これを発現ベクターへ組み込む。又は、抗体の V領域をコードする DNAを、抗体 C領域の DNAを含む発現ベクターへ組み込んであよい。

本発明で使用される抗体を製造するには、後述のように抗体遺伝子を発現制御領域、例えば、ェンハンサー、プロモーターの制御のもとで発現するよう発現ベクターに組み込む。次に、この発現ベクターにより宿主細胞を形質転換し、抗体を発現させること力 Sできる。

[0050] 本発明では、ヒトに対する異種抗原性を低下させること等を目的として人為的に改変した遺伝子組換え型抗体、例えば、キメラ（Chimeric)抗体、ヒト化（Humanized)抗体、ヒト (human)抗体を使用できる。これらの改変抗体は、既知の方法を用いて製造すること力 Sできる。

キメラ抗体は、前記のようにして得た抗体 V領域をコードする DNAをヒト抗体 C領域をコードする DNAと連結し、これを発現ベクターに組み込んで宿主に導入し産生させることにより得られる（欧州特許出願公開番号 EP 125023、国際特許出願公開番号 W 0 92-19759参照）。この既知の方法を用いて、本発明に有用なキメラ抗体を得ることができる。

[0051] ヒトイ匕抗体は、再構成 (reshaped)ヒト抗体またはヒト型化抗体とも称され、ヒト以外の哺乳動物、例えばマウス抗体の相補性決定領域 (CDR)をヒト抗体の相補性決定領域へ移植したものであり、その一般的な遺伝子組換え手法も知られている（欧州特許出願公開番号 EP 125023、国際特許出願公開番号 WO 92-19759参照）。

具体的には、マウス抗体の CDRとヒト抗体のフレームワーク領域（FR; framework reg ion)を連結するように設計した DNA配列を、末端部にオーバーラップする部分を有するように作製した数個のオリゴヌクレオチドから PCR法により合成する。得られた DNA をヒト抗体 C領域をコードする DNAと連結し、次いで発現ベクターに組み込んで、これを宿主に導入し産生させることにより得られる（欧州特許出願公開番号 EP 239400、国際特許出願公開番号 WO 92-19759参照）。

[0052] CDRを介して連結されるヒト抗体の FRは、相補性決定領域が良好な抗原結合部位を形成するものが選択される。必要に応じ、再構成ヒト抗体の相補性決定領域が適切な抗原結合部位を形成するように抗体の可変領域のフレームワーク領域のァミノ酸を置換してもよい（Sato, K.et al.， Cancer Res. (1993) 53, 85ト 856)。

[0053] キメラ抗体、ヒト化抗体には、ヒト抗体 C領域が使用される。ヒト抗体 C領域としては、 C yが挙げられ、例えば、 C γ 1、 C γ 2、 C γ 3又は C y 4を使用することができる。また、抗体又はその産生の安定性を改善するために、ヒト抗体 C領域を修飾してもよい。キメラ抗体はヒト以外の哺乳動物由来抗体の可変領域とヒト抗体由来の C領域からなり、ヒト化抗体はヒト以外の哺乳動物由来抗体の相補性決定領域とヒト抗体由来のフレームワーク領域および c領域からなり、ヒト体内における抗原性が低下しているため、本発明に使用される抗体として有用である。

本発明に使用されるヒト化抗体の好ましい具体例としては、ヒト化 PM-1抗体が挙げられる（国際特許出願公開番号 WO 92-19759参照）。

[0054] また、ヒト抗体の取得方法としては先に述べた方法のほか、ヒト抗体ライブラリーを用いて、パンニングによりヒト抗体を取得する技術も知られている。例えば、ヒト抗体の可変領域を一本鎖抗体（scFv)としてファージディスプレイ法によりファージの表面に発現させ、抗原に結合するファージを選択することもできる。選択されたファージの遺伝子を解析すれば、抗原に結合するヒト抗体の可変領域をコードする DNA配列を決定すること力 Sできる。抗原に結合する scFvの DNA配列が明らかになれば、当該配列を適当な発現ベクターを作製し、ヒト抗体を取得することができる。これらの方法は既に衆知であり、 WO 92/01047, WO 92/20791, WO 93/06213, WO 93/11236, WO 93/ 19172, WO 95/01438, WO 95/15388を参考にすることができる。

[0055] 前記のように構築した抗体遺伝子は、公知の方法により発現させ、取得することができる。哺乳類細胞の場合、常用される有用なプロモーター、発現される抗体遺伝子、その 3'側下流にポリ Aシグナルを機能的に結合させた DNAあるいはそれを含むベタターにより発現させることができる。例えばプロモーター Zェンハンサ一としては、ヒトサイトメガロウイノレス前期プロモ¹ ~~タ¹ ~~ Zェンノヽンサ ¹ ~~ (human cytomegalovirus imme diate early promoter/enhancer)を挙けることか eさる。

[0056] また、その他に本発明で使用される抗体発現に使用できるプロモーター/ェンハンサ一として、レトロウイルス、ポリオ一マウィルス、アデノウイルス、シミアンウィルス 40 (S V40)等のウィルスプロモーター/ェンハンサーゃヒトェロンゲーシヨンファクター 1ひ ( HEF1 a )などの哺乳類細胞由来のプロモーター Zェンハンサーを用いればょレ、。例えば、 SV40プロモーター Zェンハンサーを使用する場合、 Mulliganらの方法（Mu lligan, R. C. et al. , Nature (1979) 277, 108-114)、また、 HEF1ひプロモーター Zェンハンサーを使用する場合、 Mizushimaらの方法（Mizushima, S. and Nagata, S. Nucl eic Acids Res. (1990) 18, 5322 )に従えば容易に実施することができる。

[0057] 大腸菌の場合、常用される有用なプロモーター、抗体分泌のためのシグナル配列、発現させる抗体遺伝子を機能的に結合させて発現させることができる。例えばプロモーターとしては、 _lacZプロモーター、 _araBプロモーターを挙げることができる。 lacZプ口モーターを使用する場合、 Wardらの方法（Ward, E. S. et al. , Nature (1989) 341 , 5 44-546 ; Ward, E. S. et al. FASEB J. (1992) 6, 2422-2427 )、 araBプロモーターを使用する場合、 Betterらの方法（Better, M. et al. Science (1988) 240, 1041-1043 )に従えばよい。

抗体分泌のためのシグナル配列としては、大腸菌のペリブラズムに産生させる場合、 pelBシグナル配列（Lei, S. P. et al J. Bacteriol. (1987) 169, 4379-4383)を使用すればよい。ペリブラズムに産生された抗体を分離した後、抗体の構造を適切にリフォ一ルド（refold)して使用する（例えば、 WO96/30394を参照）。

[0058] 複製起源としては、 SV40、ポリオ一マウィルス、アデノウイルス、ゥシパピローマウイノレス（BPV)等の由来のものを用いることができ、さらに、宿主細胞系で遺伝子コピー数増幅のため、発現ベクターは選択マーカーとして、アミノグリコシドホスホトランスフヱラーゼ (APH)遺伝子、チミジンキナーゼ (TK)遺伝子、大腸菌キサンチングァニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ecogpt)遺伝子、ジヒドロ葉酸還元酵素（dhfr)遺伝子等を含むことができる。

[0059] 本発明で使用される抗体の製造のために、任意の産生系を使用することができる。抗体製造のための産生系は、 in vitroおよび in vivoの産生系がある。 in vitroの産生系としては、真核細胞を使用する産生系や原核細胞を使用する産生系が挙げられる真核細胞を使用する場合、動物細胞、植物細胞、又は真菌細胞を用いる産生系がある。動物細胞としては、（1)哺乳類細胞、例えば、 CH〇、 COS,ミエローマ、 BHK(bab y hamster kidney), HeLa、 Veraなど、（2)両生類細胞、例えば、アフリカッメガエル卵母細胞、あるいは (3)昆虫細胞、例えば、 sf9、 sf21、 Tn5などが知られている。植物細胞としては、ニコチアナ 'タバクム (Nicotiana tabacum)由来の細胞が知られており、これをカルス培養すればよい。真菌細胞としては、酵母、例えば、サッカロミセス（Sacch aromyces),禺、例えはサッ刀口ミセス-セレビシェ (Saccharomyces cerevisiae)、糸状困、例えばァスペルギルス属（Aspergillus)属、例えばァスペルギルス'二ガー（Aspergill us niger)などが知られている。

原核細胞を使用する場合、細菌細胞を用いる産生系がある。細菌細胞としては、大腸菌（E.coli)、枯草菌が知られている。

[0060] これらの細胞に、目的とする抗体遺伝子を形質転換により導入し、形質転換された細胞を in vitroで培養することにより抗体が得られる。培養は、公知の方法に従い行う。例えば、培養液として、 DMEM、 MEM, RPMI1640、 IMDMを使用することができ、牛胎児血清 (FCS)等の血清補液を併用することもできる。また、抗体遺伝子を導入した細胞を動物の腹腔等へ移すことにより、 in vivoにて抗体を産生してもよい。

一方、 in vivoの産生系としては、動物を使用する産生系や植物を使用する産生系が挙げられる。動物を使用する場合、哺乳類動物、昆虫を用いる産生系などがある。哺乳類動物としては、ャギ、ブタ、ヒッジ、マウス、ゥシなどを用いることができる（Vic ki Glaser, SPECTRUM Biotechnology A卯 lications, 1993)。また、昆虫としては、カイコを用いることができる。植物を使用する場合、例えばタバコを用いることができる。

[0061] これらの動物又は植物に抗体遺伝子を導入し、動物又は植物の体内で抗体を産生させ、回収する。例えば、抗体遺伝子をャギカゼインのような乳汁中に固有に産生される蛋白質をコードする遺伝子の途中に揷入して融合遺伝子として調製する。抗体遺伝子が揷入された融合遺伝子を含む DNA断片をャギの胚へ注入し、この胚を雌のャギへ導入する。胚を受容したャギから生まれるトランスジエニックャギ又はその子孫が産生する乳汁から所望の抗体を得る。トランスジエニックャギから産生される所望の抗体を含む乳汁量を増加させるために、適宜ホルモンをトランスジエニックャギに使用してもよい。 (Ebert, K.M. et al , Bio/Technology (1994) 12， 699-702 )。

[0062] また、カイコを用いる場合、目的の抗体遺伝子を揷入したバキュロウィルスをカイコに感染させ、このカイコの体液より所望の抗体を得る（Maeda, S. et al, Nature (1985) 315， 592-594)。さらに、タバコを用いる場合、目的の抗体遺伝子を植物発現用べクター、例えば pMON530に揷入し、このベクターを Agrobacterium tumefaciensのようなバクテリアに導入する。このバクテリアをタバコ、例えば Nicotiana tabacumに感染させ、本タバコの葉より所望の抗体を得る（Julian, K.-C. Ma et al., Eur. J. Immunol.(1994 )24, 131-138)。

[0063] 上述のように in vitro又は in vivoの産生系にて抗体を産生する場合、抗体重鎖（H 鎖）又は軽鎖（L鎖）をコードする DNAを別々に発現ベクターに組み込んで宿主を同時形質転換させてもよいし、あるいは H鎖および L鎖をコードする DNAを単一の発現ベクターに組み込んで、宿主を形質転換させてもよい（国際特許出願公開番号 WO 94-11523参照）。

[0064] 本発明で使用される抗体は、本発明に好適に使用され得るかぎり、抗体の断片やその修飾物であってよい。例えば、抗体の断片としては、 Fab、 F(ab ' )2, Fv、又は H鎖と L鎖の Fvを適当なリンカ一で連結させたシングルチェイン Fv (scFv)が挙げられる。具体的には、抗体を酵素、例えば、パパイン、ペプシンで処理し抗体断片を生成させるか、又は、これら抗体断片をコードする遺伝子を構築し、これを発現ベクターに導入した後、適当な宿主細胞で発現させる（例えば、 Co, M.S. et al, J. Immunol. (19 94) 152, 2968—2976、 Better, M. & Horwitz, A. H. Methods in Enzymology (1989) 17 8， 476-496、 Pluckthun, A. & Skerra, A. Methods in Enzymology (1989) 178, 497-5 15、 Lamoyi, E.， Methods in Enzymology (1989) 121, 652-663、 Rousseaux, J. et al. ， Methods in Enzymology (1989) 121, 663-66、 Bird, R. E. et al., TIBTECH (1991) 9 ， 132-137参照）。

[0065] scFvは、抗体の H鎖 V領域と L鎖 V領域を連結することにより得られる。この scFvにおいて、 H鎖 V領域と L鎖 V領域はリンカ一、好ましくは、ペプチドリンカ一を介して連結される（Huston, J. S. et al.、 Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1988) 85, 5879—5883)。 s cFvにおける H鎖 V領域および L鎖 V領域は、上記抗体として記載されたもののいずれの由来であってもよい。 V領域を連結するペプチドリンカ一としては、例えばアミノ酸 1 2-19残基からなる任意の一本鎖ペプチドが用いられる。

[0066] scFvをコードする DNAは、前記抗体の H鎖又は、 H鎖 V領域をコードする DNA、および L鎖又は、 L鎖 V領域をコードする DNAを铸型とし、それらの配列のうちの所望のァミノ酸配列をコードする DNA部分を、その両端を規定するプライマー対を用いて PCR 法により増幅し、次いで、さらにペプチドリンカ一部分をコードする DNAおよびその両端を各々 H鎖、 L鎖と連結されるように規定するプライマー対を組み合せて増幅することにより得られる。

また、一旦 scFvをコードする DNAが作製されれば、それらを含有する発現ベクター、および該発現べクタ一により形質転換された宿主を常法に従って得ることができ、また、その宿主を用いて常法に従って、 scFvを得ることができる。

これら抗体の断片は、前記と同様にしてその遺伝子を取得し発現させ、宿主により産生させることができる。本発明でいう「抗体」にはこれらの抗体の断片も包含される。

[0067] 抗体の修飾物として、ポリエチレングリコール (PEG)等の各種分子と結合した抗体を使用することもできる。本発明でいう「抗体」にはこれらの抗体修飾物も包含される。このような抗体修飾物を得るには、得られた抗体に化学的な修飾を施すことによって得ること力 Sできる。これらの方法はこの分野においてすでに確立されている。

[0068] 前記のように産生、発現された抗体は、細胞内外、宿主から分離し均一にまで精製すること力 Sできる。本発明で使用される抗体の分離、精製はァフィ二ティークロマトグラフィ一により行うことができる。ァフィ二ティークロマトグラフィーに用いるカラムとしては、例えば、プロテイン Aカラム、プロテイン Gカラムが挙げられる。プロテイン Aカラムに用いる担体として、例えば、 HyperD, POROS、 S印 haroseF.F.等が挙げられる。その他、通常のタンパク質で使用されている分離、精製方法を使用すればよぐ何ら限定されるものではない。

[0069] 例えば、上記ァフィ二ティークロマトグラフィー以外のクロマトグラフィー、フィルター、限外濾過、塩析、透析等を適宜選択、組み合わせれば、本発明で使用される抗体を分離、精製すること力 Sできる。クロマトグラフィーとしては、例えば、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、ゲルろ過等が挙げられる。これらのクロマトダラフィ" ~は HPLし (High performance liquid chromatography)に適用し得る。ま 7こ、木目 HPLC (reverse phase HPLC)を用いてもよレヽ。

[0070] 上記で得られた抗体の濃度測定は吸光度の測定又は ELISA等により行うことができる。すなわち、吸光度の測定による場合には、 PBS (-)で適当に希釈した後、 280nmの吸光度を測定し、 lmg/mlを 1.350Dとして算出する。また、 ELISAによる場合は以下のように測定することができる。すなわち、 0.1M重炭酸緩衝液（pH9.6)で l z g/mlに希釈したャギ抗ヒト IgG(TAG製） 100 μ 1を 96穴プレート（Nunc製）にカロえ、 4。Cでー晚インキュベーシヨンし、抗体を固相化する。ブロッキングの後、適宜希釈した本発明で使用される抗体又は抗体を含むサンプル、あるいは標品としてヒ HgG (CAPPEL製) 100 μ 1を添加し、室温にて 1時間インキュベーションする。

洗浄後、 5000倍希釈したアルカリフォスファターゼ標識抗ヒ HgG (BIO SOURCE製） 100 /i lを加え、室温にて 1時間インキュベートする。洗浄後、基質溶液を加えインキュベーシヨンの後、 MICROPLATE READER Model 3550 (Bio-Rad製）を用いて 405nm での吸光度を測定し、目的の抗体の濃度を算出する。

[0071] 本明細書における「治療」という記載は、本発明の薬物を被験者に投与することによつて、 HCVを消滅あるいは軽減させること、さらなる HCVの広がりを抑制すること、 H CVの感染による症状を軽減することを意味する。また、本発明において「予防」とは、 HCVの感染により起こる症状を予防することをレ、う。 HCVの感染による症状としては、好ましくは C型肝炎、肝硬変、肝繊維化、肝癌などが挙げられる。

[0072] 本発明の化合物は、そのまま、又は、その薬理学的に許容される塩として医薬に使用すること力 Sできる。上記塩としては薬理学的に許容されるものであれば特に限定されず、例えば、塩酸、硫酸、硝酸、リン酸、臭化水素酸などの鉱酸との塩;酢酸、酒石酸、乳酸、クェン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、メタンスルホン酸、エタンスノレホン酸、ベンゼンスルホン酸、トルエンスルホン酸、ナフタレンスルホン酸、ショウノウスルホン酸などの有機酸との塩;ナトリウム、カリウム、カルシウムなどのアルカリ金属又はアルカリ土類金属などとの塩などを挙げることができる。

上記医薬製剤に含まれる有効成分化合物の量は、特に限定されず広範囲に適宜選択される力例えば、 0. 1-99. 5重量％、好ましくは 0. 5〜90重量％である。

[0073] 本発明の化合物を、常法に従って主薬として、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、矯味矯臭剤、溶解補助剤、懸濁剤、コーティング剤などの医薬の製剤技術分野におレ、て通常使用し得る既知の補助剤を用いて製剤化することができる。錠剤の形態に成形するに際しては、担体としてこの分野で従来公知のものを広く使用でき、例えば乳糖、白糖、塩ィ匕ナトリウム、グノレコース、尿素、澱粉、炭酸カルシウム、カオリン、結晶セルロース、ケィ酸などの賦形剤；水、エタノール、プロパノール、単シロップ、グルコース液、激粉液、ゼラチン溶液、カルボキシメチルセルロース、セラック、メチルセルロース、リン酸カリウム、ポリビュルピロリドンなどの結合剤；乾燥澱粉、アルギン酸ナトリウム、寒天末、ラミナラン末、炭酸水素ナトリウム、炭酸カルシウム、ポリオキシェチレンソルビタン脂肪酸エステル、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸モノグリセリド、澱粉、乳糖などの崩壊剤；白糖、ステアリン、カカオバター、水素添加油などの崩壊抑制剤；第 4級アンモニゥム塩類、ラウリル硫酸ナトリウムなどの吸収促進剤；グリセリン、澱粉などの保湿剤;澱粉、乳糖、カオリン、ベントナイト、コロイド状ケィ酸などの吸着剤；精製タルク、ステアリン酸塩、硼酸末、ポリエチレングリコールなどの潤沢剤などが例示できる。

[0074] さらに錠剤は、必要に応じ、通常の剤皮を施した錠剤、例えば、糖衣錠、ゼラチン被包錠、腸溶被錠、フィルムコーティング錠あるいは二重錠、多層錠とすることができる。丸剤の形態に成形するに際しては、担体としてこの分野で従来公知のものを広く使用でき、例えばグルコース、乳糖、カカオバター、澱粉、硬化植物油、カオリン、タルクなどの賦形剤；アラビアゴム末、トラガント末、ゼラチン、エタノールなどの結合剤；ラミナラン寒天などの崩壊剤などが例示できる。坐剤の形態に成形するに際しては、担体としてこの分野で従来公知のものを広く使用でき、例えばポリエチレングリコール、カカオバター、高級アルコール、高級アルコールのエステル類、ゼラチン、半合成グリセリドなどを挙げることができる。注射剤として調製される場合には、液剤および懸濁剤は殺菌され、かっ血液と等張であるのが好ましぐこれら液剤、乳剤および懸濁剤の形態に成形するに際しては、希釈剤としてこの分野で慣用されているものをすベて使用でき、例えば、水、エタノール、プロピレングリコール、エトキシ化イソステアリノレアルコール、ポリオキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類などを挙げることができる。なお、この場合、等張性の溶液を調製するのに充分な量の食塩、グノレコース、あるいはグリセリンを医薬製剤中に含有せしめてもよく、また通常の溶解補助剤、緩衝剤、無痛化剤などを添加してもよい。さらに必要に応じて着色剤、保存剤、香料、風味剤、甘味剤などや他の医薬品を含有することちできる。

[0075] 上記医薬組成物は、投与単位形態で投与することが好ましぐ経口投与、組織内投与 (皮下投与、筋肉内投与、静脈内投与など)、局所投与 (経皮投与など)又は経直腸的に投与することができる。上記医薬組成物は、これらの投与方法に適した剤型で投与されることは当然である。

[0076] 本発明の医薬が投与される対象は哺乳動物である。哺乳動物は、好ましくはヒトである。

[0077] 本発明の化合物など又はそれの製薬上許容され得る塩を医薬として投与する場合、抗ウィルス剤としての用量は、年齢、体重などの患者の状態、投与経路、病気の性質と程度などを考慮した上で調整することが望ましいが、通常は、ヒトについては、成人に対して本発明の有効成分量として、一日当たり、 0.1〜2000mgの範囲である。上記範囲未満の用量で足りる場合もあるが、逆に上記範囲を超える用量を必要とする場合もある。多量に投与するときは、一日数回に分割して投与することが望ましい。上記経口投与は、固形、粉末又は液状の用量単位で行うことができ、例えば、末剤、散剤、錠剤、糖衣剤、カプセル剤、ドロップ剤、舌下剤、その他の剤型などにより行うことができる。

[0078] 上記組織内投与は、例えば、溶液や懸濁剤などの皮下、筋肉内又は静脈内注射用の液状用量単位形態を用いることによって行うことができる。これらのものは、本発明の化合物又はその製薬上許容される塩の一定量を、例えば、水性や油性の媒体などの注射目的に適合する非毒性の液状担体に懸濁又は溶解し、ついで上記懸濁液又は溶液を滅菌することにより製造される。 [0079] 上記局所投与 (経皮投与など）は、例えば、液剤、クリーム剤、粉末剤、ペースト剤、ゲル剤、軟膏剤などの外用製剤の形態を用いることによって行うことができる。これらのものは、本発明の化合物又はその製薬上許容される塩の一定量を、外用製剤の目的に適合する香料、着色料、充填剤、界面活性剤、保湿剤、皮膚軟化剤、ゲル化剤、担体、保存剤、安定剤などのうちの一種以上と組み合わせることにより製造される。

また、本発明の薬剤を、処置を施したい領域に局所的に投与することもできる。例えば、手術中の局所注入、カテーテルの使用、または本発明の「デスモステロールからコレステロールの生合成過程を遮断する物質」をコードする DNAの標的化遺伝子送達により投与することも可能である。

[0080] 上記経直腸的投与は、本発明の化合物又はその製薬上許容される塩の一定量を、例えば、パルミチン酸ミリスチルエステルなどの高級エステル類、ポリエチレングリコール、カカオ脂、これらの混合物などからなる低融点固体に混入した座剤などを用いて行うことができる。

[0081] 本発明の薬剤は、少なくとも 1つの既知の HCV治療剤と共に薬学的組成物の一部として投与されてもよい。または、本発明の薬剤は、少なくとも 1つの既知の HCV治療剤と同時に投与されてもよい。一つの態様において、本発明の薬剤および既知の H CV治療剤は、実質的に同時に投与されてもよい。

[0082] 本発明は、デスモステロールからコレステロールの生合成過程を遮断する物質を対象に投与する工程を含む、 HCV感染症を治療または予防する方法に関する。

[0083] 本発明において、「対象」とは、本発明の薬剤を投与する生物体をいう。生物体は、特に限定されるものではないが、動物（例えば、ヒト、家畜動物種、野生動物）を含む

[0084] 本発明はまた、 HCV感染症を治療または予防するための薬剤を製造するための、デスモステロールからコレステロールの生合成過程を遮断する物質の使用に関する

[0085] 本発明は、 HCV感染症を治療または予防するための薬剤のスクリーニング方法に関する。本発明のスクリーニング方法の第一の態様としては、まず、デスモステロールからコレステロールの生合成に関与する酵素に被検化合物を接触させる。

本発明のスクリーニング方法における「デスモステロール力コレステロールの生合成に関与する酵素 (以下「該生合成酵素」として約して使用される場合もある）」としては、好ましくは DHCR24等を挙げることができる。これら酵素の由来は、特に制限はなぐ例えばこれらの酵素は酵母またはヒトを含む哺乳動物等の由来のものであってもよい。

[0086] 第一の態様に用いられる生合成酵素の状態としては、特に制限はなぐ例えば、精製された状態、細胞内に発現した状態、細胞抽出液内に発現した状態などであってもよレ、。該生合成酵素が発現している細胞としては、内在性の生合成酵素を発現している細胞、または外来性の生合成酵素を発現している細胞が挙げられる。上記内在性の生合成酵素を発現している細胞としては、培養細胞などを挙げることができる力これに限定されるものではなレ、。上記培養細胞としては、特に制限はなぐ例えば、市販のものを用いることが可能である。また、上記外来性の生合成酵素を発現している細胞は、例えば、生合成酵素をコードする DNAを含むベクターを細胞に導入することで作製できる。ベクターの細胞への導入は、一般的な方法、例えば、リン酸力ルシゥム沈殿法、電気パルス穿孔法、リボフエタミン法、マイクロインジヱクシヨン法等によって実施することができる。このような外来性の生合成酵素が導入される細胞が由来する生物種としては、哺乳類に限定されず、外来タンパク質を細胞内に発現させる技術が確立されてレ、る生物種であればょレ、。

[0087] 生合成酵素が発現している細胞抽出液は、例えば、試験管内転写翻訳系に含まれる細胞抽出液に、生合成酵素をコードする DNAを含むベクターを添加したものを挙げること力 Sできる。該試験管内転写翻訳系としては、特に制限はなぐ市販の試験管内転写翻訳キットなどを使用することが可能である。

[0088] 本発明の方法における「被検化合物」としては、特に制限はなぐ例えば、天然化合物、有機化合物、無機化合物、タンパク質、ペプチド等の単一化合物、並びに、化合物ライブラリー、遺伝子ライブラリーの発現産物、細胞抽出物、細胞培養上清、発酵微生物産生物、海洋生物抽出物、植物抽出物、原核細胞抽出物、真核単細胞抽出物もしくは動物細胞抽出物等を挙げることができる。上記被検化合物は必要に応じて適宜標識して用いることができる。標識としては、例えば、放射標識、蛍光標識等を挙げることができる。また、「複数の被検化合物」としては、特に制限はなぐ例えば、上記被検化合物に加えて、これらの被検化合物を複数種混合した混合物も含まれる。

[0089] 本発明において「接触」は、生合成酵素の状態に応じて行う。例えば、生合成酵素が精製された状態であれば、精製標品に被検化合物を添加することにより行うことができる。また、細胞内に発現した状態または細胞抽出液内に発現した状態であれば、それぞれ、細胞の培養液または該細胞抽出液に被検化合物を添加することにより行うことができる。本発明における細胞としては、特に制限されないが、酵母またはヒトを含む哺乳動物由来の細胞が好ましい。被検化合物がタンパク質の場合には、例えば、該タンパク質をコードする DNAを含むベクターを、生合成酵素が発現している細胞へ導入する、または該ベクターを生合成酵素が発現している細胞抽出液に添カロすることで行うことも可能である。また、例えば、酵母または動物細胞等を用いた 2ノ、イブリツド法を利用することも可能である。

[0090] 第一の態様では、次いで、上記生合成酵素と被検化合物の結合を検出する。タンパク質間の結合を検出または測定する手段は、例えばタンパク質に付した標識を利用することにより行うことができる。標識の種類は、例えば、蛍光標識、放射標識等が挙げられる。また、酵素ツーハイブリット法や、 BIACOREを用いた測定方法等、公知の方法によって測定することもできる。本方法においては、ついで、上記生合成酵素と結合した被検化合物を選択する。選択された被検化合物の中には、 HCV感染症を治療または予防するための薬剤が含まれる。また、選択された被検化合物を、以下のスクリーニングの被検化合物として用いてもよい。

[0091] 本発明のスクリーニング方法の第二の態様としては、まず、デスモステロールからコレステロールの生合成に関与する酵素を保持する細胞に被検化合物を接触させる。該生合成酵素および「被検化合物」「接触」の記載に関しては上記の説明の通りである。

第二の態様では、次いで、デスモステロールからコレステロールの生合成過程で合成される化合物の量を測定する。合成される化合物としては、中間生成物等も含まれる力より好ましくは最終生成物であるコレステロールを挙げることができる。

合成された化合物の定量は、 GC-MS法、 MS-MS法、 LC-MS法等公知の方法によつて測定することができる。本方法においては、ついで、被検化合物を接触させていない場合と比較して、合成された化合物の量を減少させた場合に、被検化合物を、 H CV感染症を治療または予防するための薬剤として選択する。

[0092] 本発明のスクリーニング方法の第三の態様としては、まず、デスモステロールからコレステロールの生合成に関与する酵素を保持する細胞に被検化合物を接触させる。該生合成酵素および「被検化合物」「接触」の記載に関しては上記の説明の通りである。

第三の態様では、次いで、デスモステロールからコレステロールの生合成過程に関与する酵素の発現レベルを測定する。該生合成酵素の発現レベルの測定は、当業者に公知の方法によって行うことができる。例えば、該生合成酵素の mRNAを定法に従って抽出し、この mRNAを铸型としたノーザンハイブリダィゼーシヨン法、または RT- PCR法を実施することによって該遺伝子の転写レベルの測定を行うことができる。さらに、 DNAアレイ技術を用いて、該生合成酵素の発現レベルを測定することも可能である。

[0093] また、該生合成酵素を含む画分を定法に従って回収し、該生合成酵素の発現を SD S-PAGE等の電気泳動法で検出することにより、遺伝子の翻訳レベルの測定を行うこともできる。また、該生合成酵素に対する抗体を用いて、ウェスタンブロッテイング法を実施し、該生合成酵素の発現を検出することにより、遺伝子の翻訳レベルの測定を行うことも可能である。

[0094] 該生合成酵素の検出に用いる抗体としては、検出可能な抗体であれば、特に制限はないが、例えばモノクローナル抗体、またはポリクローナル抗体の両方を利用すること力 Sできる。該抗体は、当業者に公知の方法により調製することが可能である。ポリクローナル抗体であれば、例えば、次のようにして取得することができる。該生合成酵素、あるいは GSTとの融合タンパク質として大腸菌等の微生物において発現させたリコンビナントタンパク質、またはその部分ペプチドをゥサギ等の小動物に免疫し血清を得る。これを、例えば、硫安沈殿、プロテイン A、プロテイン Gカラム、 DEAEイオン交換クロマトグラフィー、該生合成酵素や合成ペプチドをカップリングしたァフィ二ティーカラム等により精製することにより調製する。また、モノクローナル抗体であれば、例えば、該生合成酵素またはその部分ペプチドをマウス等の小動物に免疫を行い、同マウスより脾臓を摘出し、これをすりつぶして細胞を分離し、該細胞とマウスミエローマ細胞とをポリエチレングリコール等の試薬を用いて融合させ、これによりできた融合細胞（ハイプリドーマ）の中から、該生合成酵素に結合する抗体を産生するクローンを選択する。次いで、得られたハイプリドーマをマウス腹腔内に移植し、同マウスより腹水を回収し、得られたモノクローナル抗体を、例えば、硫安沈殿、プロテイン A、プロティン Gカラム、 DEAEイオン交換クロマトグラフィー、該生合成酵素や合成ペプチドをカツプリングしたァフィ二ティーカラム等により精製することで、調製することが可能である第三の態様においては、ついで、該生合成酵素の発現レベルが、被検化合物を接触させないときに比べ減少する場合に、被検化合物を、 HCV感染症を治療または予防するための薬剤として選択する。

[0095] 本発明のスクリーニング方法の第四の態様としては、まず該生合成酵素のプロモーター領域の下流にレポーター遺伝子が機能的に結合した DNAを有する細胞または細胞抽出液を提供する。

第四の態様において、「機能的に結合した」とは、生合成酵素のプロモーター領域に転写因子が結合することにより、レポーター遺伝子の発現が誘導されるように、生合成酵素のプロモーター領域とレポーター遺伝子とが結合してレ、ることをレ、う。従つて、レポーター遺伝子が他の遺伝子と結合しており、他の遺伝子産物との融合タンパク質を形成する場合であっても、生合成酵素のプロモーター領域に転写因子が結合することによって、該融合タンパク質の発現が誘導されるものであれば、上記「機能的に結合した」の意に含まれる。

[0096] 上記レポーター遺伝子としては、その発現が検出可能なものであれば特に制限されず、例えば、当業者において一般的に使用される CAT遺伝子、 lacZ遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子、 β -グルクロニダーゼ遺伝子（GUS)および GFP遺伝子等を挙げること力 Sできる。第四の態様では、次いで、上記細胞または上記細胞抽出液に被検化合物を接触させる。次いで、該細胞または該細胞抽出液における上記レポーター遺伝子の発現レベルを測定する。「被検化合物」および「接触」の記載に関しては上記の説明の通りである。

[0097] レポーター遺伝子の発現レベルは、使用するレポーター遺伝子の種類に応じて、当業者に公知の方法により測定することができる。例えば、レポーター遺伝子が CAT 遺伝子である場合には、該遺伝子産物によるクロラムフヱニコールのァセチル化を検出することによって、レポーター遺伝子の発現レベルを測定することができる。レポ一ター遺伝子が lacZ遺伝子である場合には、該遺伝子発現産物の触媒作用による色素化合物の発色を検出することにより、また、ルシフェラーゼ遺伝子である場合には、該遺伝子発現産物の触媒作用による蛍光化合物の蛍光を検出することにより、また、 β -ダルクロニダーゼ遺伝子（GUS)である場合には、該遺伝子発現産物の触媒作用による Glucuron (ICN社）の発光や 5_ブロモ _4_クロ口- 3_インドリル- β -ダルクロニド (X-Gluc) の発色を検出することにより、さらに、 GFP遺伝子である場合には、 G FPタンパク質による蛍光を検出することにより、レポーター遺伝子の発現レベルを測定すること力 Sできる。

第四の態様においては、ついで、上記レポーター遺伝子の発現レベルが、被検化合物を接触させないときに比べ減少する場合に、被検化合物を、 HCV感染症を治療または予防するための薬剤として選択する。

[0098] 本発明のスクリーニング方法の第五の態様としては、まず、デスモステロールからコレステロールの生合成に関与する酵素に被検化合物を接触させる。該生合成酵素および「被検化合物」「接触」の記載に関しては上記の説明の通りである。

第五の態様では、次いで、上記生合成酵素の活性を測定する。生合成酵素の活性測定は、それぞれの酵素につき公知の方法で行うことができる。一般的には、基質と生成物との間の分光学的性質の差を利用して、その時間的変化を測定する活性測定法が使用されるが、酵素上の情報基 (例えばトリブトファンゃチロシンのようなァミノ酸残基、および補酵素等）からの情報をストップフロー法や種々の緩和法を用いて、酵素反応をより直接的に測定する方法が選択されてもよい。活性測定法に用いられる分光学的方法としては、吸光、蛍光、 CD、 NMR、 ESR、 IR、ラマン等を挙げることができる。第五の態様においては、ついで、上記生合成酵素の活性が、被検化合物を接触させないときに比べ低下する場合に、被検化合物を、 HCV感染症を治療または予防するための薬剤として選択する。

[0099] 本発明は、上記に記載の 5つのスクリーニング方法に用いるためのキットに関する。

このようなキットには、上記に記載の 5つのスクリーニング方法の検出工程や測定ェ程に使用されるものを含みうる。例えば、デスモステロールからコレステロールの生合成に関与する酵素の発現レベルの測定に必要とされるプローブ、プライマー、抗体、染色液等を挙げることができる。その他、蒸留水、塩、緩衝液、タンパク質安定剤、保存剤等が含まれていてもよい。

なお、本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照として本明細書に組み入れられる。

実施例

[0100] 以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが本発明はこれら実施例に制限されるものではない。

〔実施例 1〕ウェスタンプロット解析による U18666Aの HCVタンパク質合成阻害活性の測定

ウェスタンブロット解析は以下の方法でおこなった。 U18666Aを 0 nMから 500 nMの範囲でレプリコン細胞 Huh-3-lに与え、 5%CO存在下、 37°Cにて培養した。 72時間後に培地を捨て、 PBS (Phosphate buffered saline, Sigma cat. no. P3813)を加え、ピペッティングにより細胞をはがし、遠心により細胞を回収した。 6穴プレートの細胞当たり 200 μ Lの CelLyticTM- M (Sigma cat. no. C2978)と 2 μ Lのプロテアーゼインヒビタ一力クテル（Sigma cat. no. P8340)を加え、室温で 15分間振とうした。遠心分離（1500 0回転、 15分間）後、上清のタンパク定量を Dye Reagent (nacalai tesque cat. no. 074 -27)にておこなった（ゥシ γグロブリン標準液、 BIO-RAD cat. no. 500-0005)。得られたタンパク質 5 を 9— 11%グラジェントゲル（第一化学薬品 cat. no. 317552)でトリスグリシン SDS緩衝液（BIO-RAD cat. no. 161-0772)を用いて電気泳動した。分子量サイズマーカーは Broad marker (BIORAD cat. no. 161-0318)を用いた。電気泳動したタンパク質をミニトランスブロットセル（BIO- RAD cat. no. 170-3930)にてメンブレン（Immobilon-FL、ミリポア cat. no. IPFL00010)に転写した。以下、ォデッセィ (ァロカ )のプロトコールに従い、一次抗体に HCVタンパク質由来の抗 NS3ゥサギ抗体（Natur e chemical biology, 2005, 1, p333)を用いてウェスタン解析を行った。その結果、 U18 666Aによる HCVタンパク質合成の阻害の濃度依存性が確認された（図 2)。各バンドの強度を定量し、 HCVタンパク質の発現を 50%減少させる薬剤濃度（IC50)を計算したところ、 84 nMであった。

[0101] 〔実施例 2〕 U18666Aの HCVレプリコン阻害活性

実験開始前日にルシフヱラーゼ遺伝子を含む HCVレブリコン保持細胞 FLR 3-1を 96ゥエル白色マルチウヱルプレート（ノレシフェラーゼアツセィ用；発光測定）と 96ゥェルマルチウエルプレート（毒性試験用；吸光度）のそれぞれに 4000個/ゥヱルで撒いた。この時 5% H-FCSを含む D-MEM GlutaMax I培地を使用した。試験開始当日に終濃度が 0.24、 0.89, 3.90、 62.5, 250、 1000 nMになるように U18666Aを加えた。 5% C 0 37°Cで 72時間培養後、ルシフェラーゼアツセィおよび WST-8による細胞毒性試験を行った。 U18666Aを加えなレ、ものをコントロールとした。

ルシフェラーゼアツセィ法

培地交換を行い、 1 well当たりの体積を 75 μ ΐにした。 75 μ 1の BrightGlo (Promega; E2620)を加えてすぐにゥエルの発光量を Mithras 940 (Berthold)で測定した。

WST-8アツセィ法

TetraColor ONE (生化学工業; cat.# 800560)を培地 100 μ ΐ当たりに 7 μ ΐ加え、 5% CO 37°Cで 1時間から 2時間培養した。培養後の発色をマイクロリーダーモデル 550 ( 測定波長 450 nm;対象波長 650 nm; Bio-Rad)で測定した。

その結果、 U18666Aは HCVレプリコン阻害活性を示した（図 3)。さらに、 U18666Aは口パスタチンよりも明らかに高い HCVレブリコン阻害活性を示した。

[0102] 〔実施例 3〕 DHCR24 siRNAの HCVレプリコン阻害活性

細朐とトランスフエクシヨン

実験開始前日にルシフヱラーゼ遺伝子を含む HCVレブリコン保持細胞 FLR 3-1を 96ゥヱル白色マルチウヱルプレート（ノレシフェラーゼアツセィ用；発光測定； SUMILO N cat.# MS-8096)と 96ウェルマルチウエルプレート（毒性試験用；吸光度； Falcon c at.# 353072)のそれぞれに 4500個/ 100 μ 1/ゥエルで撒いた。この時 5% H_FCS (GIB CO, Cat#: 26140-079)を含む D-MEM GlutaMax I培地（GIBCO; cat.# 10569-010) を使用した。

試験開始当日、終濃度が 1、 3、 10、 30 nMになるように DHCR24に対する siRNA (表 1 )を LIC- LA3015を用いて FLR3-1にトランスフエクシヨンした。

[表 1]

DHCR24 siRNAの配歹 IJ (配列番号： 3〜6)

DHCR24 (Gene #; NM_014762)の配列を参考にして、 5 '非翻訳領域を含む配列から 417番目および 1024番目力、らの二種類の siRNAをデザインした。

[0104] トランスフエクシヨン用の siRNA/LIC_LA3015複合体は 2 μ M siRNA (5%グルコース溶液)に調製した siRNAを 448 ng/ μ ΐの LIC-LA3015 (5%グルコース溶液）に加え、室温で 15分放置した後ソニケーシヨンを 30秒間行うことにより 1 μ Μの siRNA/LIC_LA30 15を作製した。この溶液を 300、 100、 30、 10 nMになるように 5%グルコース溶液で段階希釈して各 Wellに 1.1 μ 1ずつ加えた。そのまま 5% CO、 37°Cで 72時間培養し、ルシフェラーゼアツセィと WST-8アツセィを行レ、、 HCV複製を定量した。

その結果、 DHCR24の発現を抑制するため siRNA処理した細胞では、コントロール si RNA処理した細胞に対し有意に HCVレプリコン活性を阻害する効果が強く認められた（図 4)。

産業上の利用可能性

[0105] 本発明により、コレステロール生合成に関わる酵素、特に DHCR24の活性や発現を阻害する物質が、 HCVの複製阻害活性を示すことが明らかとなった。また、本発明の阻害剤は、コレステロールの生合成に関わる 3-ヒドロキシ -3-メチルダルタリル -CoAレダクターゼを阻害するロバスタチン（Ye J.， et al.， PNAS, 100 (26), 15865-15870 (200 3))よりも強レ、 HCVの複製阻害活性を有していることが明カ^なつた。 [0106] このこと力ら、本発明の阻害剤は、従来の薬剤に比べより高い効果を示す HCV感染症の有用な治療剤または予防剤となるものと考えられる。さらに本発明の、デスモステロールからコレステロールの生合成過程に関与する酵素、特に DHCR24をターゲットとするスクリーニング方法は、より効果的な抗 HCV薬の探索に役立つものと考えられる。

[0107] これまでの HCV感染症を予防または治療する薬剤は、生体内のどのカスケードに作用するかが知られていないものが多ぐ副作用が心配されていた力本発明の薬剤は標的が明確であるため、副作用の排除、薬剤の効果の調節等が容易に行えるものと考えられる。

Claims

請求の範囲

[1] デスモステロールからコレステロールの生合成過程を遮断する物質を有効成分として含有する、 HCV感染症を治療または予防するための薬剤。

[2] デスモステロールからコレステロールの生合成過程を遮断する物質が以下の（a)または (b)である、請求項 1に記載の薬剤。

(a) DHCR24の酵素活性を阻害する物質

(b) DHCR24の発現を抑制する物質

[3] DHCR24の酵素活性を阻害する物質が、下記一般式（1)

〔式中、 Xは、下記:

からなる群から選ばれるいずれかの基を示し;

Wは、下記:

〇=(

からなる群から選ばれるいずれかの基を示し;

Yは、水素原子またはメチル基を示し；

Vは、酸素原子又は硫黄原子を示し；

nは 2〜6の整数を示し；

mは 0または 1を示し； Rと Rは、互いに独立して、 C -Cアルキル基を示し、または隣接する窒素原子と

1 2 1 4

は、単結合または二重結合を意味する。〕で表される化合物またはその薬学的に許容される塩である、請求項 2に記載の薬剤。

[4] 前記式（1)で表される化合物が、下記一般式（2)

〔式中、 R、 R、 m、 nは、請求項 3に記載の R、 R、 m、 nと同意義である。」で表され

1 2 1 2

る、請求項 3に記載の薬剤。

[5] 前記式（1)で表される化合物が、下記式（3)

で表される、請求項 3に記載の薬剤。

[6] DHCR24の酵素活性を阻害する物質力 S、 DHCR24を認識する抗体である、請求項 2 に記載の薬剤。

[7] DHCR24の発現を抑制する物質が、以下の（a)または (b)である、請求項 2に記載の薬剤。

(a) DHCR24をコードする DNAの転写産物と相補的な RNA (b) DHCR24をコードする DNAの転写産物を特異的に開裂するリボザィム活性を有する RNA

[8] HCV感染症が、 C型肝炎、肝硬変、肝繊維化、または肝癌である、請求項 1から 7のいずれかに記載の薬剤。

[9] 以下の（a)から（c)の工程を含む、 HCV感染症を治療または予防するための薬剤のスクリーニング方法。

(b) (a)に記載の酵素と被検化合物の結合を検出する工程

[10] 以下の（a)から（c)の工程を含む、 HCV感染症を治療または予防するための薬剤のスクリーニング方法。

(a)被検化合物を細胞に接触させる工程

[11] 以下の（a)から（c)の工程を含む、 HCV感染症を治療または予防するための薬剤のスクリーニング方法。

(a)被検化合物を細胞に接触させる工程

(c)被検化合物を接触させてレ、なレ、場合と比較して、上記酵素の発現レベルを減少させた被検化合物を、 HCV感染症を治療または予防する薬物として選択する工程

[12] 以下の（a)から（d)の工程を含む、 HCV感染症を治療または予防するための薬剤のスクリーニング方法。

[13] 以下の（a)から（c)の工程を含む、 HCV感染症を治療または予防するための薬剤のスクリーニング方法。

(c)被検化合物を接触させなレ、場合と比較して、上記酵素の活性を低下させた被検化合物を、 HCV感染症を治療または予防する薬物として選択する工程

[14] デスモステロールからコレステロールの生合成過程に関与する酵素力 DHCR24である、請求項 9から 13のいずれかに記載のスクリーニング方法。

[15] HCV感染症が、 C型肝炎、肝硬変、肝繊維化、または肝癌である、請求項 9から 14 のいずれかに記載のスクリーニング方法。

[16] 請求項 9から 15のいずれかに記載のスクリーニング方法に用いるためのキット。

[18] デスモステロールからコレステロールの生合成過程を遮断する物質が以下の（a)または (b)である、請求項 17に記載の方法。

(a) DHCR24の酵素活性を阻害する物質

(b) DHCR24の発現を抑制する物質

[19] HCV感染症を治療または予防するための薬剤を製造するための、デスモステロ一ルからコレステロールの生合成過程を遮断する物質の使用。デスモステロールからコレステロールの生合成過程を遮断する物質が以下の（_a)または (b)である、請求項 19に記載の使用。

(a) DHCR24の酵素活性を阻害する物質

(b) DHCR24の発現を抑制する物質