WO2007098715A1 - Composición farmacéutica conteniendo ghrp-6 capaz de prevenir y eliminar las fibrosis y otras formas de depósito patológico en los tejidos - Google Patents

Composición farmacéutica conteniendo ghrp-6 capaz de prevenir y eliminar las fibrosis y otras formas de depósito patológico en los tejidos Download PDF

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Jorge Berlanga Acosta
Danay Cibrian Vera
Diana GARCÍA DEL BARCO HERRERA
Gerardo Enrique GUILLÉN NIETO
José SUAREZ ALBA
Ernesto Lopez Mola
Manuel Selman-Housein Sosa
Mariela Vazquez Castillo
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Centro De Ingenieria Genetica Y Biotecnologia
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Definitions

  • the present invention relates to the field of the pharmaceutical industry and medicine, more specifically with the use of secretagogue peptides which, administered in a pharmaceutical composition repeatedly, prevent and eliminate the deposits of pathological fibrotic material in internal parenchymal tissues such as liver, lungs, esophagus, small intestine, kidneys, blood vessels, joints, in addition to systemic forms of cutaneous fibrosis of any etiopathogenesis.
  • Fibrosis processes are a set of pathological entities of a mono-organic or systemic nature that are characterized by the abnormal deposition of extracellular matrix in the parenchyma of almost all internal organs, blood vessels, or skin. These are considered as the result of complex processes of auto-immune basis or interstitial responses to prolonged imitative and inflammatory events.
  • excessive deposition of collagen material occurs in the parenchyma by effector interstitial cells, or from the stromal material that expands and obliterates the functional tissue.
  • the effector cells of these processes are of mesenchymal origin and are usually quite specific according to the affected tissue.
  • myo-fibroblasts are accused of pathological fibrosis processes.
  • TGF- ⁇ transforming growth factor beta
  • CTGF connective tissue
  • PDGF growth factor derived from platelets
  • liver fibrosis When liver damage is caused, the inflammatory response and the remodeling of the extraceiular matrix (ME) restore the normal function and architecture of this organ. However, when the damage persists, there is an imbalance between the factors that try to repair and reach the resolution of the problem causing an alteration in the regulation of the ME and causing the excessive synthesis of its components.
  • the liver is the main organ involved in the regulation of metabolism, in the process of blood filtration and in hormonal regulation. Hepatic starred cells (HSC) are located in the space that forms between endothelial cells and hepatocytes, called the Disse space or sinusoidal space, from where they surround the endothelial cells with their long cytoplasmic processes.
  • HSCs are able to synthesize and secrete components of ME and represent an important source in fibrotic processes. These cells are characterized by the storage of retinyl esters, the synthesis of growth factors and other cytokines, in addition to their role in the regulation of sinusoidal blood flow.
  • the HSCs can pass from a quiescent state to an active state that is induced by the paracrine secretion of inflammatory cytokines, by the production of reactive oxygen species or by changes in the structure of the ME that cause changes in the cellular phenotype.
  • HSCs differentiate to myofibroblasts by acquiring an elongated form, express smooth muscle ⁇ -actin and lose stored retinol.
  • HSCs acquire new properties that help them maintain and amplify the inflammatory response: proliferative capacity, contractibility, cytokine production and mainly the synthesis and secretion of components of ME.
  • TGF- ⁇ synthesized mainly in the activation phase by Kupffer cells; in the perpetuation phase, the TGF- /? It is mainly produced by activated HSCs perpetuating their activation.
  • any of the forms of fibrotic induration of the liver is Incompatible with life (Hepatic Failure. Last Updated: September 3, 2004.
  • Pulmonary fibrosis is a slowly progressive disease that includes a diverse group of entities. Histologically, it is characterized by a temporal heterogeneity of the lesions, predominantly those of myofibroblasts. Although the sequence of events in the pathogenesis of pulmonary fibrosis is well documented, there is little information on the exact mechanisms involved in the initial damage. It is possible that immunological phenomena are important, especially autoimmune. Genetic factors must also play some role. Microscopically, a constant feature is the hyperplastic change in alveolar epithelial cells (type 2 pneumocytes) with prominent nucleoli and cytologic atypia, which often mimic a viral infection. Ultrastructurally, it is possible to find intranuclear tubular inclusions.
  • TGF- ⁇ is involved as one of the main cytokines that orchestrate the process.
  • Myo-fibroblasts are the effector matrix-producing cells.
  • ES Systemic sclerosis
  • T and B lymphocytes Functional alterations in these cells cause the triad characteristic of pathological changes in ES: progressive cutaneous and visceral fibrosis, obliteration of the lumen of small arteries and arterioles, and abnormalities in The immunity
  • the alterations in the humoral and cellular immunity cause the production of numerous antibodies, some of which are highly specific for the disease, the chronic infiltration of mononuclear cells in the affected tissues and the dysregulation of the production of lymphokines and growth factors.
  • fibronectin 3
  • the fibroblasts of patients with ES express high levels of receptors for TCF-beta on their surface, which may be responsible for the increase in the signal induced by TGF-b and the increase in collagen production (30). This disease is also fatal and incurable (Steen V. Targeted therapy for systemic sclerosis. Autoimmun Rev. 2006 Feb; 5 (2): 122-4.)
  • Diabetic Nephrosclerosis or Diabetic Nephropathy Almost all diabetic patients develop greasing of the glomerular and tubular basement membranes 2 or 3 years after the diagnosis of the disease. Some of them will develop glomerular mesangium expansion and interstitial fibrosis, the pathological marks of progressive diabetic nephropathy. Over time, the nephropathy evolves and clinically manifests as the appearance of proteinuria, hypertension and renal failure. There is a good correlation between the expansion of the region of the mesangium, the severity of interstitial fibrosis and arteriosclerosis, with the decrease in the glomerular filtration rate.
  • the disease is a pathological scar of the penile albuginea that can cause the organ to retract, and in erection, curvature and retraction.
  • the majority of the authors agree that the fibrotic degeneration of the tunica albuginea is preceded by an inflammatory phenomenon that could be triggered by a vasculitic, immunological process, trauma, or collagenopathy .
  • a first invasion period is described where the fibrotic plaque can progress silently denoting the curve or retraction of the penis, presenting pain in the erection or during the penetration. The predominant symptoms are those caused by fibrosis.
  • TGF-beta is invoked as an inducing or amplifying agent of the molecular basis of the disease (Jakut M. New discoveries in the basic science understand the Peyronie's disease. Curr Urol Rep. 2004 Dec; 5 (6): 478-84)
  • vascular disease of the brain has been identified in brains for example of patients suffering from Alzheimer's disease as a marker that can represent an important pathogenic factor in this disease and other forms of dementia.
  • the laminar and regional distribution of vascular lesions correlates with the presence of neurofibrillar clews and senile plaques. More than 100 years ago, morphological abnormalities were described for the first time in the cerebral vessels of the elderly, which consisted of stiffness, tortuosity and curling. Less than 20 years ago these notes have received full support while it has been described that the capillaries of the senile hippocampus distorted more with age than the great vessels.
  • the thickening of the basement membrane and the collagen deposits are similar in rats and humans with age and it is considered that these processes of degeneration fibrotic sclerosis of the cerebral microvasculature is the anatomical basis of dementia processes in general. These diseases are clinically worsened in that the cerebral circulation is hindered by the occlusion of the arteriolar networks and end up causing the absence of all life. of coherent social relationship and cognitive activity.
  • the role of vascular disease in the pathogenesis of dementia is currently being reassessed while it is suggested that more than 50% of patients with dementia have some stigma of cerebral vascular disease.
  • Beta amyloid is one of those proteins that acts in the formation of extracellular brain deposits as it ages. Alzheimer's dementia has an insidious onset with a progressive decline of higher mental functions, affecting fixation and evocation memory. The neuropathological findings are reflected in the accumulation of neuritic plaques and neurofibrillary tangles in vulnerable areas of the brain and brain stem.
  • the plates contain a compact nucleus of beta-amyloid, an oligopeptide derived from the precursor of the beta-amyloid protein.
  • the risk to develop a dementia is strongly associated with the polymorphism of the apolipoprotein E. the brain, Apo-E interacts with beta-amyloid, and Apo-E4 is associated with an increased deposit of beta-amyloid and an increased number of neurofibrillary tangles.
  • Both the attention and the processes of memory and learning are the points of affectation of brain functions most strikingly affected in Alzheimer's disease as a model of demential diseases that occur with accumulation of beta-amyloid.
  • the beta-amyloid protein has necrogenic effects on brain cells, mediated by the action of free radicals.
  • the deposit of beta-amyloid in the cerebral parenchyma is a distinctive fact of the pathogenesis of Alzheimer's disease, although it also occurs to a lesser extent in normal aging.
  • the reduction of the synthesis of the neurotoxic form of beta-amyloid protein can attenuate the process that contributes to neuronal damage in Alzheimer's disease.
  • its elimination of the brain and its subsequent excretion would contribute to the improvement of the superior nervous functions of the patients.
  • Alzheimer's disease severely impairs the patient's quality of life, and has no cure until now Gurol ME. Plasma beta-amyloid and white matter lesions in AD, MCI, and cerebral amyloid angiopathy.
  • FIG. 1 Percentage of animals per group with renal fibroid involvement at the end of the GHRP-6 treatment. Note the difference between the group of placebo animals that receive saline solution and those that receive GHRP-6. The highest difference is observed when comparing the placebo group with the one receiving the dose of 400 ⁇ g / Kg - which suggests a dose-dependent effect. Histological evaluation of the fibro-proliferative reaction in the renal interstitium. It includes the process of fibrotic encapsulation of tubules and fibrotic glomeruli.
  • the objective of the present experiment was to evaluate the effect of the pharmaceutical composition based on GHRP-6 on the reversal of hepatic fibrosis in rats.
  • Hepatic fibrosis was induced in male Wistar rats of 250 grams of average body weight by means of ligation of the external bile duct.
  • the rats were anesthetized with the ketamine / xylazine combination and subjected to a laparotomy until the common bile duct was exposed. This was doubly linked with chrome catgut 4-0.
  • the animals were randomly assigned to three experimental groups of 20 rats each: (1) Group receiving physiological saline-placebo control.
  • liver and blood serum were extracted.
  • the liver fragments were fixed in neutral formalin and processed with Masson's hematoxylin / eosin or trichrome stains for evaluation of the general damage and the severity of the induration of the fibrosis.
  • Other liver fragments were stored at -70 ° C until processing to determine the hydroxy-proline content by acid hydrolysis in 1 N HCI, as well as intra-hepatic levels of redox metabolism indicators. The biochemical determinations were made on the basis of the calculation of total proteins by the Bradford method. Table 1. Grading scale of the process: (0) - null, (1) - moderate, (2) - limited, (3) - severe, (4) - very severe.
  • the treatment with GHRP-6 clearly demonstrates the ability of this peptide to eliminate and control the deposition of collagen material and extracellular matrix in general in the parenchyma of the liver as a result of the ligation of the common bile duct.
  • the importance of treatment is demonstrated in the convergence of morphological and biochemical data that maintain that despite having unsaturated a state of severe peri-ductal and peri-portal fibrotic involvement in general, this can be taken to negligible levels without recurrence. It is noteworthy that the animals in the placebo group showed no spontaneous recovery.
  • the objective of the present experiment was to evaluate the effect of the pharmaceutical composition based on GHRP-6 on the reversal of hepatic fibrosis in rats, this time induced by carbon tetrachloride (CCL4).
  • CCL4 carbon tetrachloride
  • This is a hepato-toxic agent that causes chronic hepatitis and fibrosis when administered in the long term.
  • Hepatic fibrosis was induced in male Wistar rats of 250 grams of average body weight by intraperitoneal inoculation twice a week of CCL4 50% / 50% (V / V) in olive oil, for 4 weeks. After the administration period, 25% of the population of treated rats was sacrificed and submitted to a study of blood biochemistry and pathological anatomy. The process of liver fibrosis was demonstrated in all the animals studied.
  • the animals were randomly assigned to three experimental groups of 15 rats each: (1) Group receiving saline solution Physiological - placebo control. (2) Group that receives GHRP-6 at the dose of 100 ⁇ g / Kg, (3) Group that receives GHRP-6 at the dose of 400 ⁇ g / Kg.
  • the treatments were administered every day for four weeks after demonstrating the process of fibrosis of the liver parenchyma. The treatments began immediately after the fibrosis was established and the administration of the CCI4 was suspended. Concluded the treatments the animals were sacrificed by over dose of anesthesia and the liver and blood serum were extracted.
  • liver fragments were fixed in neutral formalin and processed with Masson's hematoxylin / eosin or trichrome stains for evaluation of the general damage and the severity of the induration of the fibrosis.
  • Other liver fragments were stored at -70 ° C until processing to determine the hydroxy-proline content by acid hydrolysis in 1 N HCI, as well as intra-hepatic levels of redox metabolism indicators.
  • the biochemical determinations were made on the basis of the calculation of total proteins by the Bradford method.
  • the characterization of the response to treatment with the pharmaceutical composition was performed by determining the serum levels of GOT and GPT transaminases, histological criteria in quantitative scale and some critical markers, eloquent of the level of lipo-peroxidative damage. Table 5.
  • Grading scale of the process (0) - null, (1) - moderate, up to 25% of the cut (2) - limited to 50% of the cut, (3) - severe, up to 75% of the cut (4) -very severe, more than 75% of the cut.
  • the treatment with GHRP-6 demonstrates the ability of this peptide to eliminate and control the deposition of collagen material and extracellular matrix in general in the parenchyma of the liver as a result of repeated administration of CCL4.
  • the treatment also proves to prevent the death of hepatocytes from individual, focal and pericentrolobular shape.
  • the importance of the treatment is demonstrated in the convergence of morphological, enzymatic and biochemical data that maintain that despite having unsaturated a state of severe diffuse fibrotic compromise in the form of confluent bridges, this can be taken to negligible levels without recurrence. Again, it is noteworthy that the animals in the placebo group showed no spontaneous recovery.
  • the objective of the present experiment was to evaluate the effect of the pharmaceutical composition based on GHRP-6 on the reversal of renal fibrosis in rats.
  • the process was induced by the continuous administration of the anti-neoplastic agent Doxorubicin (DX) at a dose of 2.5 mg / kg twice a week for 8 weeks.
  • DX the anti-neoplastic agent
  • the presence of fibrotic deposit in the peri-portal, peri-bronchial spaces and all the renal interstitium with cyst-nodular pattern was demonstrated by histopathological study of these organs in 25% of the population of rats that had been intoxicated with Doxorubicin . From this point, the administration of DX was suspended and treatment with the pharmaceutical composition containing GHRP-6 was started.
  • the treatment was carried out daily, at doses of 100 and 400 ⁇ g / kg in a volume of 1 ml intraperitoneally, for 4 weeks.
  • the animals were randomly assigned to three experimental groups of 20 rats each: (1) Group receiving physiological saline - placebo control. (2) Group that receives GHRP-6 at the dose of 100 ⁇ g / Kg, (3) Group that receives GHRP-6 at the dose of 400 ⁇ g / Kg. Concluded the treatments the animals were sacrificed for over doses of anesthesia and the kidneys, liver, lungs and blood serum were extracted. The tissue fragments were fixed in neutral formalin and processed with Masson's hematoxylin / eosin or trichrome stains for evaluation of the fibrosis induration process.
  • Graduation scale of the fibrotic kidney process Grade (0) - Null, Grade (1) - Moderate, interstitium interests without deforming or encapsulating tubules or glomeruli, Grade (2) - Intense, interstitium interests, deforms the tubules, obliterating its light, encapsulates the glomerulus externally, Grade (3) - Very intense, interstitium intensely interested, encapsulates and collapses the tubules, collapses the glomeruli. It includes the deposit at mesangial level.
  • Table 1 Serum levels of GOT and GPT in the groups at the end of treatment. Integrity of the liver parenchyma.
  • the objective of the present experiment was to evaluate the effect of the pharmaceutical composition based on GHRP-6 on the reversal of pulmonary fibrosis in rats.
  • the process was induced by the administration of the anti-neoplastic agent Bleomycin (Ble) at a dose of 2.5 U / kg twice a week for 4 weeks.
  • Bleomycin the anti-neoplastic agent
  • the presence of fibrosis in the lungs was demonstrated by histopathological study of these organs in 25% of the population of rats that had been intoxicated with Ble. From this point on, the administration of Ble was suspended and treatment with the pharmaceutical composition containing GHRP-6 was started.
  • the treatment was carried out daily, at doses of 100 and 400 ⁇ g / kg in a volume of 1 ml intraperitoneally, for 4 weeks.
  • the animals were randomly assigned to three experimental groups of 10 rats each: (1) Group receiving physiological saline - placebo control. (2) Group that receives GHRP-6 at the dose of 100 ⁇ g / Kg, (3) Group that receives GHRP-6 at the dose of 400 ⁇ g / Kg.
  • the animals were sacrificed for over doses of anesthesia and the lungs and blood serum were extracted.
  • the tissue fragments were fixed in neutral formalin and processed with Masson's hematoxylin / eosin or trichrome stains for evaluation of the fibrosis induration process. Other fragments were stored at -70 ° C until processing to determine the hydroxy-proline content by hydrolysis acid in 1 N HCI. The biochemical determinations were made on the basis of the calculation of total proteins by the Bradford method.
  • the histological evaluation of the fibro-proliferative reaction in the lung includes the process of perivascular, peri-bronchial, and septal fibrosis.
  • the degree of total pulmonary fibrosis was established considering the extension and intensity of the process in these three segments in order to determine the percentage of animals affected or not at the end of the treatment with GHRP-6.
  • the results of the number of animals per group with fibrotic lungs according to their severity appear in Table 1.
  • Grade 1- predominantly peri-vascular fibrosis in more than 75% of arterioles and capillaries.
  • Grade 2- predominantly peri-vascular fibrosis in more than 75% of arterioles and capillaries, plus peri-bronchial involvement.
  • Grade 3- predominantly peri-vascular fibrosis in more than 75% of arterioles and capillaries, plus peri-bronchial involvement. The presence of fibrotic material in the interalveolar septa is already verified.
  • Example 5 Effect of the pharmaceutical composition based on GHRP-6 in the control and elimination of the accumulation of beta-amyloid protein in the brain.
  • the objective of this study was to evaluate the influence of prolonged administration (8 weeks) of GHRP-6 on brain biochemical and morphological markers, indicators of the progression of damage to the central nervous system, in transgenic mice for the precursor protein of the beta-amyloid
  • APP transgenic mice were acquired that overexpress the amyloid beta precursor protein; male and 20-25 grams in weight.
  • mice were sacrificed for overdose of anesthesia and prefused in-situ with saline.
  • the brains were removed and a cerebral hemisphere was frozen in dry ice and the contralateral fixed in a 4% solution of neutral para-formaldehyde.
  • the samples were subjected to cryo-cuts of 10 microns and colored with H / E, Congo Red or incubated with an antibody that specifically recognizes beta-amyloid.
  • the morphometric processes were performed by capturing the microscopic image with a video camera coupled to the microscope, being analyzed by the DIGIPAT program. Indicators studied.
  • Cerebral concentration of myo-inositol as an indicator of old age and deterioration of brain metabolism ( ⁇ mol / gram of tissue). Markers of oxidative stress in the brain. Table 15. Effect of GHRP6 treatment on the removal of brain amyloid deposits.
  • Table 15 compiles all the results of the parameters studied to characterize the effect of long-term treatment with the pharmaceutical composition containing GHRP-6. Note that the results refer to the counting of digital images of a single cerebral hemisphere. To overcome this limitation the counts were performed blindly by three different observers and the results shown correspond to 5 sheet readings. Table 15. Effect of the pharmaceutical composition containing GHRP-6 in the control of amyloid accumulation and brain biochemistry.
  • the pharmaceutical composition containing GHRP-6 has a favorable impact in the control of the accumulation of amyloid material in its various forms in the brain, as well as in the correction of the organ's metabolism. There is a marked effect given by the reduction of amyloid deposits, and reduction of plate size. The marked effect of reducing the accumulation of myo-inositol establishes the evidence of a correction of biochemical routes, of greater assimilation of energy, and of better nutrition of neurons. This can have a favorable clinical impact on the control of brain aging.
  • Table 16 the favorable effect of the pharmaceutical composition containing GHRP-6 in the control of lipid peroxidation in the brain of transgenic animals for Alzheimer's disease is demonstrated. Again this evidence suggests the favorable effect of this composition to control one of the processes most responsible for the deterioration of nerve tissue in diseases and during aging.
  • mice 18-20 month old male mice were used when they already had symptomatic evidence of the disease.
  • the animals were randomized and assigned to the following experimental and treatment groups: A - placebo group that received physiological saline. B - group treated with 100 ⁇ g / kg of GHRP-6. C - group treated with 100 ⁇ g / kg of GHRP-2. D - group treated with 100 ⁇ g / kg of Ghrelin. E- group treated with 100 ⁇ g / kg Hexarelina.
  • the treatments were carried out twice in the week and for 16 weeks, intra-peritoneally. Concluded the treatments, regardless of the clinical improvement evidenced in numerous treated animals, an autopsy study and the sampling of brain tissue with the meninges for histopathological and biochemical determinations were carried out.
  • the animals received an anesthetic overdose were prefused with cold physiological saline solution by intracardiac route to drag the blood from the brain.
  • the samples were subjected to cryo-cuts of 10 microns and colored with H / E, Congo Red or incubated with an antibody that specifically recognizes beta-amyloid.
  • the morphometric processes were performed by capturing the microscopic image with a video camera attached to the microscope, being analyzed by the program
  • Cerebral concentration of myo-inositol as an indicator of old age and deterioration of brain metabolism ( ⁇ mol / gram of tissue).
  • treatment with each of the secretagogues significantly reduces the number of arteries, arterioles and capillaries positive to fibrillar amyloid (congo red) and granular deposits of osmiophilic material (coloration from Nissl). Consequently, the presence of subcortical microinfarms that constitute leukoencephalopathy, as well as the number of hemorrhagic foci also appear significantly diminished in each of the treatments with the compositions.
  • the secretagogue peptides studied here show the ability to reduce or attenuate the neuro-toxicity that is caused by the high production of reactive oxygen species present in human disease, and also verified in animals that only receive saline solution. This effect extends the concept of general neuro-protection of these substances to contexts in which brain aging is mediated by vascular damage and excessive lipid peroxidation.
  • Example 7 Effect of the peptides GHRP-6, GHRP-2, Hexarelina and / or Ghrelina in the elimination of the pathological deposits of physiological material of the skin.
  • fragments of keloids of human origin were xenotransplanted to mice athymic in the dorsal region.
  • A- SALINE CONTROL GROUP (VEHICLE OF ACTIVE PRINCIPLES).
  • the treatments were performed once every 24 hours, for a period of 7 days.
  • the substances were infiltrated at the edges of the implants, producing the local bioavailability of the active ingredients in the area, at doses from 1 milligram to 5 micrograms.
  • the animals were sacrificed, and the implants removed for evaluation of the pharmacological response of each substance.
  • the samples were fragmented for histological study and biochemical determinations of collagen, after being weighed.
  • the fragments for histological study were fixed in 10% neutral formalin and those dedicated to biochemistry were stored at -70 degrees Celsius.
  • the parameters studied were: a- Wet weight of each graft collected, b- Hydroxy-proline content in the tissue.
  • each of the peptides at the doses tested exerts a potent anti-fibrotic effect in the established experimental system, characterized by being acute, rapidly reducing excess collagen material and extracellular matrix, reducing the number of inducing cells (mast cells) ) and effectors (fibroblasts and myofibroblasts). It is notorious that from the third infiltration with any of the peptides tested, the implants show a marked reduction in size and begin to turn pale and devitalized.

Abstract

La presente invención se relaciona con el uso de péptidos secretagogos los cuales administrados en una composición farmacéutica de forma reiterada previenen y eliminan los depósitos de material fibrótico patológico en tejidos parenquimatosos internos como hígado, pulmones, esófago, intestino delgado, riñones, vasos sanguíneos, articulaciones, además de formas sistémicas de fibrosis cutánea de cualquier etiopatogenia. Adicionalmente estos péptidos impiden y eliminan el depósito de material amiloideo y hialino en cualquiera de sus formas químicas y manifestaciones tisulares; entre otras del cerebro, cerebelo, vasos sanguíneos, hígado, intestinos, riñones, bazo, páncreas, articulaciones, y la piel. De esta forma se corrige la disfunción de células, tejidos y órganos afectados por estos depósitos anormales. Los péptidos de la presente invención administrados por infiltración o tópicos contribuyen a prevenir y eliminar los queloides y las cicatrices hipertróficas en la piel por secuelas de quemaduras, y otros traumas cutáneos.

Description

COMPOSICIÓN FARMACÉUTICA CONTENIENDO GHRP-6 CAPAZ DE PREVENIR Y ELIMINAR LAS FIBROSIS Y OTRAS FORMAS DE DEPÓSITO
PATOLÓGICO EN LOS TEJIDOS
Campo de Ia técnica
La presente invención se relaciona el campo de Ia industria farmacéutica y Ia medicina, mas específicamente con el uso de péptidos secretagogos los cuales administrados en una composición farmacéutica de forma reiterada, previenen y eliminan los depósitos de material fibrótico patológico en tejidos parenquimatosos internos como hígado, pulmones, esófago, intestino delgado, ríñones, vasos sanguíneos, articulaciones, además de formas sistémicas de fibrosis cutánea de cualquier etiopatogenia.
Estado de Ia técnica anterior
Los procesos de fibrosis son un conjunto de entidades patológicas de carácter mono-orgánico o sistémico que se caracterizan por el depósito anormal de matriz extracelular en el parénquima de casi todos los órganos internos, los vasos sanguíneos, o Ia piel. Estas se consideran como Ia resultante de complejos procesos de base auto-inmune o de respuestas intersticiales a eventos imitativos e inflamatorios prolongados. En sentido general, ocurre un depósito excesivo de material colágeno en el parénquima por células intersticiales efectoras, o a partir del material estromático que se expande y oblitera al tejido funcional. Las células efectoras de estos procesos son de origen mesenquimatoso y suelen ser bastante específicas de acuerdo con el tejido afectado. En sentido general se inculpa a los mio-fibroblastos de los procesos de fibrosis patológicas. Los mecanismos que favorecen Ia implantación de las fibrosis son complejos, y resultan aun poco conocidos. De todas formas, con independencia del órgano diana en cuestión se insiste en Ia participación del factor de crecimiento transformante tipo beta (TGF- β), el factor de crecimiento derivado del tejido conectivo (CTGF) y del factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF). Las fibrosis a largo plazo son generalmente mortales y no tienen cura hasta el presente. A continuación abordaremos algunos aspectos teóricos referidos a los procesos de fibrosis en algunos órganos (Ding J, Yu J, Wang C, Hu W, Li D, Luo Y, Luo H, Yu H. Ginkgo biloba extract alleviates liver fibrosis induced by CCI4 in rats. Liver International 2005: 25: 1224-1232.) (Friedman SL. Reversal of hepatic fibrosis - Fact or fantasy? Hepatology. 2006 Jan 30;43(S1 ):S82-S88)
Fibrosis hepática Cuando se ocasiona un daño al hígado, Ia respuesta inflamatoria y Ia remodelación de Ia matriz extraceiular (ME) restauran Ia función y Ia arquitectura normal de este órgano. Sin embargo, cuando el daño persiste, existe un desbalance entre los factores que intentan reparar y llegar a Ia resolución del problema ocasionando una alteración en la regulación de Ia ME y provocando Ia síntesis excesiva de sus componentes. El hígado es el principal órgano involucrado en Ia regulación del metabolismo, en el proceso de filtración de Ia sangre y en Ia regulación hormonal. Las células estrelladas hepáticas (HSC) se localizan en el espacio que se forma entre las células endoteliales y los hepatocitos, llamado espacio de Disse o espacio sinusoidal, desde donde rodean a las células endoteliales con sus largos procesos citoplasmáticos. Las HSC son capaces de sintetizar y secretar componentes de la ME y representan una fuente importante en procesos fibróticos. Estas células se caracterizan por el almacenamiento de esteres de retinil, Ia síntesis de factores de crecimiento y otras citocinas, además de su papel en Ia regulación del flujo sanguíneo sinusoidal. Las HSC pueden pasar de un estado quiescente a un estado activo que es inducido por Ia secreción paracrina de citocinas inflamatorias, por Ia producción de especies reactivas del oxígeno o bien por cambios en Ia estructura de Ia ME que ocasionan cambios en el fenotipo celular. Durante su activación las HSC se diferencian a miofibroblastos adquiriendo una forma elongada, expresan σ-actina de músculo liso y pierden el retinol almacenado. En este estado las HSC adquieren nuevas propiedades que les ayudan a mantener y amplificar Ia respuesta inflamatoria: capacidad proliferativa, contractibilidad, producción de citocinas y principalmente Ia síntesis y secreción de componentes de ME. Entre los principales factores que ocasionan Ia producción de proteínas de ME en HSC activadas está el TGF-β, sintetizado principalmente en Ia fase de activación por células de Kupffer; en Ia fase de perpetuación, el TGF-/? llega a ser producido principalmente por las HSC activadas perpetuando su activación. En sentido general, cualquiera de las formas de induración fibrótica del hígado, es incompatible con Ia vida (Hepatic Failure. Last Updated: September 3, 2004. Editor(s): David Eric Bernstein, MD, Chief, Section of Hepatology, North Shore University Hospital, Director, Associate Professor, Department of Intemal Medicine, División of Hepatology, New York University School of Medicine; Francisco Talavera, PharmD, PhD, Sénior Pharmacy Editor, eMedicine; Osear S Brann, MD, Associate Clinical Professor, UCSD School of Medicine; Program Director of Gastroenterology Fellowship, Department of Intemal Medicine, Naval Medical Center San Diego; Alex J Mechaber, MD, FACP, Director of Clinical Skills Program, Assistant Professor, Department of Intemal Medicine, División of General Intemal Medicine, University of Miami School of Medicine; and Julián Katz, MD, Professor, Department of Intemal Medicine, División of Gastroenterology, MCP Hahnemann University) (Sarem M. Hepatic stellate cells: it's role in normal and pathological conditions. Gastroenterol Hepatol. 2006 Feb;29(2):93-101 ) Fibrosis Pulmonar.
La fibrosis pulmonar es una enfermedad lentamente progresiva que incluye un grupo diverso de entidades. Histológicamente, se caracteriza por una heterogeneidad temporal de las lesiones, predominando los de miofibroblastos. Aunque Ia secuencia de eventos en Ia patogenia de Ia fibrosis pulmonar está bien documentada, hay poca información sobre los mecanismos exactos envueltos en el daño inicial. Es posible que sean importantes los fenómenos inmunológicos sobre todo, auto-inmunes. Los factores genéticos también deben desempeñar algún papel. Microscópicamente, una característica constante es el cambio hiperplásico en las células epiteliales alveolares (neumocitos tipo 2) con nucléolo prominente y atipia citológica, que a menudo remedan una infección viral. Ultraestructuralmente, es posible encontrar inclusiones tubulares intranucleares. El proceso de depósito de matriz y particularmente de material colágeno en el parénquima del pulmón va insidiosamente deteriorando su arquitectura, colapsando bronquios, y alvéolos que al final dejan de constituir territorio funcional para pasar a ser no funcional, y que por demás compromete Ia ventilación en el pulmón. En este proceso nuevamente, se involucra al TGF-β como una de las principales citoquinas que orquesta el proceso. Los mio-fibroblastos son las células efectoras productoras de matriz. (Medranda Gómez MA, Paricio Nunez P, Tovar Martínez A, Ferrer Marín F, González Martínez P, García Puche MJ. Pulmonary fibrosis. Rev Esp Enferm Dig. 2005 Nov; 97(11 ):843-4)
Fibrosís sistémica cutánea o Escleroderma.
La Esclerosis Sistémica (ES) es una enfermedad extremadamente compleja. Hasta Ia actualidad no existe ninguna hipótesis única que explique su patogénesis. Sin embargo, anormalidades fundamentales en fibroblastos; células endoteliales, células del sistema inmunológico, en particular, linfocitos T y B. Las alteraciones funcionales en estas células ocasionan Ia característica triada de cambios patológicos en ES: fibrosis cutánea y visceral progresiva, obliteración del lumen de pequeñas arterias y arteriolas, y anormalidades en Ia inmunidad. Las alteraciones en Ia inmunidad humoral y celular originan Ia producción de numerosos anticuerpos, algunos de los cuales son altamente específicos para Ia enfermedad, Ia infiltración crónica de células mononucleares en los tejidos afectados y Ia disregulación de Ia producción de linfocinas y factores de crecimiento. Hasta ahora, no está claro cuál de estas alteraciones es de primordial importancia o cómo están interrelacionadas para causar el proceso fibrótico progresivo en Ia ES. Sin embargo, un componente crucial de esta patogénesis es Ia activación no regulada y persistente de los genes que codifican varios tipos de colágeno y otras proteínas de la matriz extracelular en los fibroblastos de pacientes con ES. Ésta es Ia diferencia más importante entre los fibroblastos normales, los cuales promueven cicatrización normal y los fibroblastos en Ia ES los cuales muestran una incontrolada producción y deposición de colágeno dando como resultado una fibrosis patológica en los órganos afectados. Nuevamente, uno de los factores de crecimiento que parece jugar un papel crucial en Ia fibrosis tisular de Ia ES es el TGF-beta. Uno de sus mas importantes efectos es Ia estimulación de Ia síntesis de varios tipos de colágeno y otras proteínas de Ia matriz extracelular incluyendo fibronectina (31 ). Los fibroblastos de pacientes con ES expresan altos niveles de receptores para TCF-beta en su superficie Io cual puede ser responsable del incremento de Ia señal inducida por TGF-b y del aumento de Ia producción de colágeno (30). Esta enfermedad es también mortal e incurable (Steen V. Targeted therapy for systemic sclerosis. Autoimmun Rev. 2006 Feb; 5(2): 122-4.)
Nefroesclerosis diabética o Nefropatía Diabética. Casi todos los pacientes diabéticos desarrollan engrasamiento de las membranas básales glomerular y tubular a los 2 ó 3 años del diagnóstico de Ia enfermedad. Algunos de ellos llegarán a desarrollar expansión del mesangio glomerular y fibrosis intersticial, las marcas patológicas de Ia nefropatía diabética progresiva. Con el tiempo, Ia nefropatía evoluciona y clínicamente se manifiesta como Ia aparición de proteinuria, hipertensión e insuficiencia renal. Existe una buena correlación entre Ia expansión de Ia región del mesangio, Ia severidad de Ia fibrosis intersticial y Ia arteriosclerosis, con el descenso de Ia tasa de filtración glomerular. Ello tiene como consecuencia que Ia expansión mesangial reduce Ia filtración glomerular por oclusión de los capilares glomerulares y disminución del área efectiva para Ia filtración. De Ia misma manera, Ia fibrosis tubulo-intersticial altera Ia arquitectura y función tubular y ello conduce a insuficiencia renal. En esta enfermedad también se ha establecido el papel del TGF-beta en Ia orquestación de los procesos fibrosos que ocurren el riñon de los pacientes diabéticos. Esta enfermedad tiene un curso progresivo, insidioso y termina con Ia vida del paciente por Insuficiencia Renal (Cohén, M. P., Ziyadeh, F. N., Hong, S. W., Shearman, C. W., Hud, E., Lautenslager, G. T., Iglesias-de Ia Cruz, M. C, & Chen, S. (2002). Inhibiting albumin glycation in vivo ameliorates glomerular overexpression of TGF- beta etal Kidney Int, 61 : 2025-2032), (Ziyadeh, F. N., Hoffman, B. B., Han, D. C, Iglesias-de Ia Cruz, M. C, Hong, S. W., Isono, M., Chen, S., McGowan, T. A., & Sharma, K. (2000). Long-term prevention of renal insufficiency, excess matrix gene expression and glomerular mesangial matrix expression by treatment with monoclonal anti-TGF-beta antibody in db/db diabetic mice. Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 97: 8015-8020) Fibrosis del Pene o Enfermedad de Peyronie.
Conceptualmente Ia enfermedad es una cicatriz patológica de Ia albugínea peneana que puede ocasionar en estado de reposo retracción del órgano, y en erección, curvatura y retracción. A pesar de no poder precisarse el inicio de Ia enfermedad, Ia mayoría de los autores coinciden en que Ia degeneración fibrótica de Ia túnica albugínea esta precedida por un fenómeno inflamatorio que podría estar desencadenado por un proceso vasculítico, inmunológico, un traumatismo, o una colagenopatía. Se describe un primer período de invasión donde Ia placa fibrótica puede progresar en forma silenciosa denotando Ia curva o Ia retracción del pene, presentando dolor en la erección o durante Ia penetración. Los síntomas que predominan son los originados por Ia fibrosis. Algunos pacientes pueden presentar, además, asociadas con estos síntomas, Ia fibrosis del cartílago del lóbulo de Ia oreja. Aunque no es una enfermedad mortal, compromete seriamente Ia calidad de vida de los pacientes. Nuevamente se invoca al TGF-beta como agente inductor o amplificador de Ia base molecular de Ia enfermedad (Jakut M. New discoveries in the basic science understandíng of Peyronie's disease. Curr Urol Rep. 2004 Dec;5(6):478-84)
Enfermedad Microvascular del Cerebro. La vasculopatía se ha identificado en cerebros por ejemplo de pacientes aquejados de la Enfermedad de Alzheimer como un marcador que puede representar un importante factor patogénico en esta enfermedad y otras formas de demencia. La distribución laminar y regional de las lesiones vasculares se correlaciona con la presencia de ovillos neurofibrilares y placas seniles. Hace más de 100 años .se describió por primera vez anomalías morfológicas en los vasos cerebrales de los ancianos, que consistían en rigideces, tortuosidades y ensortijamiento. Hace menos de 20 años estos apuntes han recibido total respaldo en tanto que se ha descrito que los capilares del hipocampo senil se distorsionaban más con Ia edad que los grandes vasos. A nivel ultraestructural, se distinguen: (a) inclusiones membranosas dentro de Ia membrana basal; y (b) depósitos microvasculares de colágeno (fibrosis) o engrosamiento de los componentes de Ia membrana basal. Con la edad se produce un marcado incremento de Ia degeneración de pericitos en los capilares. Los depósitos de fibras de colágeno en el interior de Ia membrana basal han sido observados en el cerebro de mamíferos. La periodicidad de 64 nm en estas fibras permitió identificar Ia naturaleza colagénica de esta fibrosis microvascular, con asiento entre el endotelio y los pericitos o en Ia cara externa de Ia membrana basal. El engrosamiento de la membrana basal y los depósitos de colágeno son similares en ratas y seres humanos con Ia edad y se considera que estos procesos de degeneración esclerosis fibrótica de Ia microvasculatura cerebral es Ia base anatómica de los procesos demenciales en general. Estas enfermedades se empeoran clínicamente en Ia medida que Ia circulación cerebral se dificulta por Ia oclusión de las redes arteriolares y terminan provocando Ia ausencia de toda vida de relación social coherente y de actividad cognitiva. El papel de Ia enfermedad vascular en Ia patogénesis de Ia demencia está siendo revalorado en el momento actual en tanto que se sugiere que más del 50% de las pacientes con demencia tienen algún estigma de enfermedad vascular cerebral. Existen otros procesos neuro-cerebrales de tipo demenciales no de tipo Alzhemier en los que Ia persona experimenta serio deterioro de Ia memoria, el aprendizaje y de las habilidades en general. El más representativo de estos procesos es tal vez Ia leuco-encefalopatía arterial cerebral autosómica con infartos subcorticales (CADASIL- iniciales de su nombre en ingles). La enfermedad no tiene una base molecular y celular comprendida. No obstante se conoce que las arteriopatías dadas por depósito de material granular osmiofílico que va paulatinamente ocluyendo Ia luz de las arterias, provocando focos de isquemia en el cerebro con el subsiguiente episodio de infarto. La perdida de Ia viabilidad neuronal por los microinfartos lleva al deterioro de Ia actividad nerviosa superior del cerebro, y por tanto a un estado de senectud y demencia (Nakanao I. The function and integrity of the neurovascular unit rests upon the integration of the vascular and inflammatory cell systems. Curr Neurovasc Res. 2005 Dec;2(5):409-23. ;Mott RT. Neuropathology of Alzheimer's disease. Neuroimaging Clin N Am. 2005 Nov;15(4):755-65.
Otros procesos degenerativos. Acumulación de Beta Amiloide. La enfermedad de Alzheimer, Ia demencia de mayor prevalencia en mayores de 65 años, es una de las principales causas de muerte en este grupo de edad. Aunque el origen de Ia enfermedad aún no se conoce, los cerebros de los pacientes de Alzheimer presentan acumulo de diversos tipos de proteínas dentro y fuera de las neuronas que estarían relacionados con Ia enfermedad. La beta amiloide es una de esas proteínas que actúa en Ia formación de depósitos cerebrales extracelulares a medida que se envejece. La demencia de Alzheimer tiene un inicio insidioso con un declinar progresivo de las funciones mentales superiores, afectando a Ia memoria de fijación y de evocación. Los hallazgos neuropatológicos se concretan en acumulo de placas neuríticas y de ovillos neurofibrilares en las zonas vulnerables del cerebro y del troncoencéfalo. Las placas contienen un núcleo compacto de beta-amiloide, un oligopéptido derivado del precursor de Ia proteína beta-amiloide. El riesgo para desarrollar una demencia se ve fuertemente asociado al polimorfismo de Ia apolipoproteina E. En el cerebro, Ia Apo-E interactua con Ia beta-amiloide, y Ia Apo-E4 se asocia con un depósito aumentado de beta-amiloide y un número aumentado de ovillos neurofibrilares. Tanto Ia atención como los procesos de Ia memoria y de aprendizaje son los puntos de afectación de las funciones cerebrales mas llamativamente afectadas en Ia enfermedad de Alzheimer como modelo de las enfermedades demenciales que cursan con acumulación de beta-amiloide. Hasta ahora, existe un único fármaco aprobado por Ia FDA para el tratamiento del déficit cognitivo de Ia enfermedad de Alzheimer. La proteína beta-amiloide tiene efectos necrogenicos sobre las células cerebrales, mediado por Ia acción de los radicales libres. El depósito de beta-amiloide en el parénquima cerebral es un hecho distintivo de Ia patogénesis de Ia enfermedad de Alzheimer, aunque también ocurre en menor grado en el envejecimiento normal. La reducción de Ia síntesis de Ia forma neurotóxica de Ia proteína beta-amiloide pueden atenuar el proceso que contribuye al daño neuronal en Ia enfermedad de Alzheimer. Así mismo su eliminación del cerebro y su posterior excreción contribuiría a Ia mejoría de las funciones nerviosas superiores de los pacientes. La enfermedad de Alzheimer deteriora severamente Ia calidad de vida del paciente, y no tiene cura hasta el presente Gurol ME. Plasma beta-amyloid and white matter lesions in AD, MCI, and cerebral amyloid angiopathy. Neurology. 2006 Jan 10;66(1 ):23-9.; Han HS. The function and integrity of the neurovascular unit rests upon the integration of the vascular and inflammatory cell systems. Curr Neurovasc Res. 2005 Dec;2(5):409- 23; Anderson E. The Oorganic Brain Syndrome (OBS) scale: a systematic review. lnt J Geriatr Psychiatry. 2006 Jan 27.
DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS.
Figura 1. Porciento de animales por grupo con compromiso fíbrótico renal al final del tratamiento con GHRP-6. Nótese Ia diferencia existente entre el grupo de animales placebo que recibe solución salina y aquellos que reciben GHRP-6. La diferencia mas alta se observa al comparar el grupo placebo con el que recibe Ia dosis de 400 μg/Kg - lo que sugiere un efecto dosis-dependiente. Evaluación histológica de Ia reacción fibro-proliferativa en el intersticio renal. Incluye el proceso de encapsulación fibrótica de túbulos y a los glomérulos fibróticos. De esta forma se establece el grado de fíbrosis renal total que se emplea para determinar el porciento de animales afectados o no al final del tratamiento, (a) - significa diferencia estadística de p<0.001 entre el grupo de dosis de 400μg/kg de GHRP-6 y el placebo.
EJEMPLOS. Ejemplo 1. Reversión de Ia fibrosis hepática en ratas.
El objetivo del presente experimento fue el de evaluar el efecto de Ia composición farmacéutica basada en GHRP-6 en Ia reversión de Ia fibrosis hepática en ratas. Se indujo fibrosis hepática en ratas Wistar macho de 250 gramos de peso corporal promedio mediante Ia ligadura del conducto biliar externo. Para ello las ratas fueron anestesiadas con Ia combinación ketamina/xylazina y sometidas a una laparotomía hasta exponer el conducto biliar común. Este fue doblemente ligado con catgut cromado 4-0. Luego de concluida Ia cirugía los animales fuero aleatoriamente asignados a tres grupos experimentales de 20 ratas cada uno: (1 ) Grupo que recibe solución salina fisiológica- control placebo. (2) Grupo que recibe GHRP-6 a Ia dosis de 100 μg/Kg, (3) Grupo que recibe GHRP-6 a Ia dosis de 400 μg/Kg. Los tratamientos se administraron todos los días por espacio de tres semanas luego de inducido el proceso de fibrosis del parénquima del hígado. Todos los tratamientos comenzaron tres semanas después de establecida Ia fibrosis. El seguimiento del proceso de daño hepático se realizó mediante examen de ultrasonido semanal del área de proyección del órgano, evolución de los niveles séricos de transaminasas GOT y GPT, niveles de gamma glutamyl transferasa (GGT) y volumen de ascitis. Los tratamientos con GHRP-6 o placebo se realizaron una vez ai día por Ia vía intraperitoneal. Concluidos los tratamientos los animales fueron sacrificados por sobre dosis de anestesia y se procedió a Ia extracción del hígado y del suero sanguíneo. Los fragmentos de hígado fueron fijados en formalina neutra y procesados con las coloraciones de hematoxilina/eosina o tricrómica de Masson para evaluación del daño general y de Ia severidad de Ia induración de Ia fibrosis. Otros fragmentos de hígado fueron conservados a -70° C hasta su procesamiento para determinar el contenido de hidroxi-prolina mediante hidrólisis acida en 1 N HCI, así como los niveles intra- hepáticos de indicadores del metabolismo redox. Las determinaciones bioquímicas se realizaron sobre Ia base del cálculo de proteínas totales por el método de Bradford. Tabla 1. Escala de gradación del proceso: (0) - nula, (1 ) - moderada, (2) - limitada, (3) - severa, (4) -muy severa.
Figure imgf000012_0001
*p<0.001. Prueba de Chi cuadrado.
Tabla 2. Evaluación de los niveles de hidroxi-prolina en el hígado al final de tres semanas de tratamiento.
Figure imgf000012_0002
** p=0.00021. Placebo vs. Tratados. *p=0.001 Dosis I vs. Dosis II. Prueba de t- de student de dos colas.
Tabla 3. Niveles séricos de GOT, GPT y GGT en los grupos al concluir las tres semanas de tratamiento.
Figure imgf000012_0003
** p=0.0003. Placebo vs. Tratado Dosis Il e Intactos. *p=0.0002 Dosis I vs. Dosis Il e Intactos. No existieron diferencias entre Intactos y Dosis II. Prueba de t- de student de dos colas. Tabla 4. Nivel de marcadores de estrés oxidativo en las muestras de hígado al final de Ia tercera semana de tratamiento.
Figure imgf000013_0001
** p=0.0001. Placebo vs. Tratado Dosis Il e Intactos. *p=0.0003 Dosis I vs. Dosis Il e Intactos. No existieron diferencias entre Intactos y Dosis II. Prueba de t-de student de dos colas.
El tratamiento con GHRP-6 claramente demuestra Ia capacidad de este péptido para eliminar y controlar el depósito de material colágeno y de matriz extracelular en general en el parénquima del hígado como consecuencia de Ia ligadura del conducto biliar común. La importancia del tratamiento se demuestra en Ia convergencia de los datos morfológicos y bioquímicos que sostienen que a pesar de haberse insaturado un estado de severo compromiso fibrótico peri-ductal y peri-portal en general, este puede ser llevado a niveles despreciables sin recurrencia. Es de destacar que los animales del grupo placebo no mostraron recuperación espontánea.
Ejemplo 2. Reversión de Ia fibrosis hepática en ratas.
El objetivo del presente experimento fue el de evaluar el efecto de Ia composición farmacéutica basada en GHRP-6 en Ia reversión de Ia fibrosis hepática en ratas, en esta ocasión inducida por tetracloruro de carbono (CCL4). Este es un agente hepato-toxico que provoca hepatitis crónica y fibrosis cuando se administra a largo plazo. Se indujo Ia fibrosis hepática en ratas Wistar macho de 250 gramos de peso corporal promedio mediante Ia inoculación intraperitoneal dos veces por semana del CCL4 50%/50% (V/V) en aceite de oliva, por espacio de 4 semanas. Transcurrido el periodo de administración, el 25% de Ia población de ratas tratadas fue sacrificada y sometida a estudio de bioquímica sanguínea y de anatomía patológica. El proceso de fibrosis del hígado fue demostrado en todos los animales estudiados. Los animales fueron aleatoriamente asignados a tres grupos experimentales de 15 ratas cada uno: (1 ) Grupo que recibe solución salina fisiológica- control placebo. (2) Grupo que recibe GHRP-6 a Ia dosis de 100 μg/Kg, (3) Grupo que recibe GHRP-6 a Ia dosis de 400 μg/Kg. Los tratamientos se administraron todos los días por espacio de cuatro semanas luego de demostrado el proceso de fibrosis del parénquima del hígado. Los tratamientos comenzaron inmediatamente después de establecida Ia fibrosis y de suspendida Ia administración del CCI4. Concluidos los tratamientos los animales fueron sacrificados por sobre dosis de anestesia y se procedió a Ia extracción del hígado y del suero sanguíneo. Los fragmentos de hígado fueron fijados en formalina neutra y procesados con las coloraciones de hematoxilina/eosina o tricrómica de Masson para evaluación del daño general y de Ia severidad de Ia induración de Ia fibrosis. Otros fragmentos de hígado fueron conservados a -70° C hasta su procesamiento para determinar el contenido de hidroxi-prolina mediante hidrólisis acida en 1 N HCI, así como los niveles intra-hepáticos de indicadores del metabolismo redox. Las determinaciones bioquímicas se realizaron sobre Ia base del cálculo de proteínas totales por el método de Bradford. La caracterización de Ia respuesta al tratamiento con Ia composición farmacéutica se realizó mediante Ia determinación de los niveles séricos de transaminasas GOT y GPT, criterios histológicos en escala cuantitativa y algunos marcadores críticos, elocuentes del nivel de daño lipo-peroxidativo. Tabla 5. Escala de gradación del proceso: (0) - nula, (1 ) - moderada, hasta un 25% del corte (2) - limitada hasta un 50% del corte, (3) - severa, hasta un 75% del corte (4) -muy severa, más de un 75% del corte. Evaluación histológica de Ia reacción fibro-proliferativa en patrón de puentes. Incluye conjuntamente Ia existencia de Necrosis en Ia zona III. Número de animales por grupo según grado de compromiso al final del tratamiento.
Figure imgf000014_0001
*p<0.001 . Prueba de Chi cuadrado. Grado 0. Grupo Il vs. Placebo y Dosis Grado 1. Dosis I y Il vs. Placebo. Placebo, grados 3 y 4 vs. Animales tratados. Tabla 6. Evaluación de los niveles de hidroxi-prolina en el hígado al final del tratamiento.
Figure imgf000015_0001
** p=0.00021. Placebo vs. Tratados. *p=0.001 Dosis I vs. Dosis II. Prueba de t-de student de dos colas.
Tabla 7. Niveles séricos de GOT y GPT en los grupos al concluir el tratamiento.
Figure imgf000015_0002
** p=0.0005. Placebo vs. Tratado Dosis Il e Intactos. *p=0.001 Dosis I vs. Dosis Il e Intactos. No existieron diferencias entre Intactos y Dosis II. Prueba de t-de student de dos colas.
Tabla 8. Nivel de marcadores de estrés oxidativo en las muestras de hígado al final de Ia tercera semana de tratamiento.
Grupos SODt Catalasa HPT MDA Experimentales •
Grupo Intacto 28261 08 ± 1260.94 14.84 ± 1 .24 18.72 ± 3.22 0.09 + 0.02
Grupo salina - 289.2 ± 116.1** 560.59 ± 44.28** 257.84 ± 86.14** 0.56 ± 1.04 ** placebo
Grupo Dosis I 17632 .08 ± 321.55* 60.43 ± 11.81 * 55.11 ± 2.77 0.16 ± 1.16 *
Grupo Dosis Il 20187.87+ 245.13 22.67 ± 3 .56 26.44 ± 2.43 0.09 + 0.01
** p=0.0002. Placebo vs. Tratados: Dosis I y II e Intactos. *p=0.0005 Dosis I vs. Dosis II, Placebo e Intactos. No existieron diferencias entre Intactos y Dosis II. Prueba de t-de student de dos colas.
El tratamiento con GHRP-6 demuestra Ia capacidad de este péptido para eliminar y controlar el depósito de material colágeno y de matriz extracelular en general en el parénquima del hígado como consecuencia de Ia administración reiterada de CCL4. El tratamiento también demuestra prevenir Ia muerte de los hepatocitos de forma individual, focal y pericentrolobulillar. La importancia del tratamiento se demuestra en Ia convergencia de los datos morfológicos, enzimáticos y bioquímicos que sostienen que a pesar de haberse insaturado un estado de severo compromiso fibrótico difuso en forma de puentes confluentes, este puede ser llevado a niveles despreciables sin recurrencia. Nuevamente, es de destacar que los animales del grupo placebo no mostraron recuperación espontánea.
Ejemplo 3. Reversión de Ia fibrosis renal o Nefroesclerosis en ratas. Tercer experimento.
El objetivo del presente experimento fue el de evaluar el efecto de Ia composición farmacéutica basada en GHRP-6 en Ia reversión de Ia fibrosis renal en ratas. En esta ocasión el proceso fue inducido por Ia administración continua del agente anti-neoplásico Doxorubicina (DX) a una dosis de 2.5 mg/kg dos veces por semana por espacio de 8 semanas. La presencia de deposito fibrótico en los espacios peri-portales, peri-bronquiales y de todo el intersticio renal con patrón quistito-nodular fue demostrado por estudio histopatológico de estos órganos en el 25% de Ia población de ratas que había sido intoxicada con Ia Doxorubicina. A partir de este punto, se suspendió Ia administración de DX y se inició el tratamiento con Ia composición farmacéutica que contiene GHRP-6. El tratamiento se realizo diariamente, a dosis de 100 y 400μg/kg en un volumen de 1 mi por vía intraperitoneal, por espacio de 4 semanas. Los animales fueron aleatoriamente asignados a tres grupos experimentales de 20 ratas cada uno: (1 ) Grupo que recibe solución salina fisiológica- control placebo. (2) Grupo que recibe GHRP-6 a Ia dosis de 100 μg/Kg, (3) Grupo que recibe GHRP-6 a Ia dosis de 400 μg/Kg. Concluidos los tratamientos los animales fueron sacrificados por sobre dosis de anestesia y se procedió a Ia extracción de los ríñones, el hígado, los pulmones y del suero sanguíneo. Los fragmentos de tejidos fueron fijados en formalina neutra y procesados con las coloraciones de hematoxilina/eosina o tricrómica de Masson para evaluación del proceso de induración de Ia fibrosis. Otros fragmentos fueron conservados a -70° C hasta su procesamiento para determinar el contenido de hidroxi-prolina mediante hidrólisis acida en 1 N HCI, así como los niveles de creatinina y de marcadores de estrés oxidativo. Las determinaciones bioquímicas se realizaron sobre Ia base del cálculo de proteínas totales por el método de Bradford. Tabla 9. Numero de animales por grupo en cada nivel de severidad del compromiso fibrótico. Escala de gradación del proceso fibrótico del riñon: Grado (0) - Nula, Grado (1 ) - Moderada, interesa el intersticio sin deformar o encapsular los túbulos ni los glomérulos, Grado (2) - Intensa, interesa todo el intersticio, deforma los túbulos, obliterando su luz, encapsula el glomérulo externamente, Grado (3) - Muy intensa, interesa el intersticio intensamente, encapsula y colapsa los túbulos, colapsa los glomérulos. Comprende el depósito a nivel mesangial.
Figure imgf000017_0001
*p<0.001. Prueba de Chi cuadrado.
Tabla 10. Evaluación de los niveles de hidroxi-prolina en los ríñones al final del tratamiento.
Figure imgf000017_0002
** p=0.0001. Placebo vs. Tratados. *p=0.05 Dosis I vs. Dosis II. Prueba de t-de student de dos colas.
Tabla 1 1. Niveles séricos de GOT y GPT en los grupos al concluir el tratamiento. Integridad del parénquima hepático.
Figure imgf000017_0003
** p=0.0005. Placebo vs. Tratados. *p=0.042 Dosis I vs. Dosis Il Prueba de t-de student de dos colas. Tabla 12. Nivel de marcadores de estrés oxidativo en las muestras de tejido renal al final de Ia cuarta semana de tratamiento.
Figure imgf000018_0001
** p=0.0002. Placebo vs. Tratados: Dosis I y II. *p=0.033 Dosis I vs. Dosis II. No existieron diferencias entre Intactos y Dosis II. Prueba de t-de student de dos colas.
Ejemplo 4. Control de Ia fibrosis del pulmón.
El objetivo del presente experimento fue el de evaluar el efecto de Ia composición farmacéutica basada en GHRP-6 en Ia reversión de Ia fibrosis pulmonar en ratas. En esta ocasión el proceso fue inducido por Ia administración del agente anti- neoplásico Bleomicina (Ble) a una dosis de 2.5 U/kg dos veces por semana por espacio de 4 semanas. La presencia de fibrosis en los pulmones fue demostrada por estudio histopatológico de estos órganos en el 25% de Ia población de ratas que había sido intoxicada con Ia Ble. A partir de este punto, se suspendió Ia administración de Ble y se inició el tratamiento con Ia composición farmacéutica que contiene GHRP-6. El tratamiento se realizo diariamente, a dosis de 100 y 400μg/kg en un volumen de 1 mi por vía intraperitoneal, por espacio de 4 semanas. Los animales fueron aleatoriamente asignados a tres grupos experimentales de 10 ratas cada uno: (1 ) Grupo que recibe solución salina fisiológica- control placebo. (2) Grupo que recibe GHRP-6 a Ia dosis de 100 μg/Kg, (3) Grupo que recibe GHRP-6 a Ia dosis de 400 μg/Kg. Concluidos los tratamientos, los animales fueron sacrificados por sobre dosis de anestesia y se procedió a Ia extracción de los pulmones y del suero sanguíneo. Los fragmentos de tejidos fueron fijados en formalina neutra y procesados con las coloraciones de hematoxilina/eosina o tricrómica de Masson para evaluación del proceso de induración de Ia fibrosis. Otros fragmentos fueron conservados a -70° C hasta su procesamiento para determinar el contenido de hidroxi-prolina mediante hidrólisis acida en 1 N HCI. Las determinaciones bioquímicas se realizaron sobre Ia base del cálculo de proteínas totales por el método de Bradford.
La evaluación histológica de Ia reacción fibro-proliferativa en el pulmón incluye el proceso de fibrosis perivascular, peri-bronquial, y septal. El grado de fibrosis pulmonar total se estableció considerando Ia extensión e intensidad del proceso en estos tres segmentos para de esta forma determinar el porciento de animales afectados o no al final del tratamiento con el GHRP-6. Los resultados del número de animales por grupo con pulmones fibróticos de acuerdo a su severidad aparecen en Ia tabla 1.
Grado 0- no evidencias de fibrosis o solo finas fibras difusas o de focos de material areolar que no sugieren compromiso respiratorio.
Grado 1- fibrosis predominantemente peri-vascular en más del 75% de las arteriolas y los capilares.
Grado 2- fibrosis predominantemente peri-vascular en más del 75% de las arteriolas y los capilares, más compromiso peri-bronquial.
Grado 3- fibrosis predominantemente peri-vascular en más del 75% de las arteriolas y los capilares, más compromiso peri-bronquial. Ya se constata Ia presencia de material fibrótico en los septos interalveolares.
Tabla 13. Animales de cada grupo ubicados según Ia severidad de Ia fibrosis pulmonar.
Figure imgf000019_0001
* p<0.05. Prueba exacta de Fisher.
Como puede observarse, no existen animales en el grupo placebo incluidos en las escalas Grados 0 y 1. La mayoría de estos se encuentran en el grupo Grado 3 de severidad. Contrariamente, Ia dosis Il muestra un potente efecto en tanto que más del 50% de los animales se ubican Ia escala Grado 0. Tabla 14. Evaluación de los niveles de hidroxi-prolina en los pulmones al final del tratamiento con salina o GHRP-6.
Figure imgf000020_0001
** p=0.0001. Placebo vs. Tratados. *p=0.05 Dosis I vs. Dosis II. Prueba de t-de student de dos colas.
El efecto del tratamiento en Ia eliminación o reversibilidad de Ia fibrosis pulmonar ' inducida por Ia bleomicina se hace evidente a también partir de Ia determinación del contenido de hidroxi-prolina en muestras secas de tejido pulmonar, Io que hace convergencia con los resultados histológicos ya descritos. Hasta el presente se han mostrado evidencias del potente efecto anti-fibrótico de Ia composición farmacéutica que contiene GHRP-6 en cuatro experimentos independientes en modelos experimentales que involucran: dos estudios de fibrosis del hígado, un estudio de fibrosis del riñon y un estudio de fibrosis del pulmón. Los resultados son repetibles y reproducibles, Io que indica Ia eficacia del tratamiento en el control de estos procesos en mas de un órgano interno, e independientemente de Ia base etio-patogénica que Ie dio origen.
Ejemplo 5. Efecto de Ia composición farmacéutica basada en GHRP- 6 en el control y eliminación de Ia acumulación de proteína beta-amiloide en el cerebro. El objetivo del presente estudio fue el de evaluar Ia influencia de Ia administración prolongada (8 semanas) de GHRP-6 sobre marcadores bioquímicos y morfológicos cerebrales, indicadores de Ia progresión del daño en el sistema nervioso central, en ratones transgénicos para Ia proteína precursora del beta- amiloide. Para el presente estudio se adquirieron ratones transgénicos APP que sobre- expresan Ia proteína precursora del beta amiloide; de sexo masculino y de 20-25 gramos de peso. Los animales (N=30) fueron aleatoriamente asignados a: Grupo placebo - con solución salina íisiológica 0.9%. Grupo Dosis I - GHRP-6 a 50 μg/kg de peso en solución salina. Grupo Dosis Il - GHRP-6 a 100 μg/kg de peso en solución salina. Los tratamientos se realizaron por vía intra-peritoneal en un volumen de 1 mL, cinco días a Ia semana y por espacio de 8 semanas, de tal forma los animales recibieron 40 administraciones de GHRP-6. Sobre Ia experiencia de estudios piloto exploratorios, habíamos conocido que este lapso de tiempo de tratamiento era suficiente para mejorar habilidades cognitivas y motoras de los animales en condiciones de estrés.
Concluidas las 8 semanas de tratamiento, los ratones fueron sacrificados por sobre-dosis de anestesia y prefundidos in-situ con solución salina. Los encéfalos fueron extraídos y un hemisferio cerebral fue congelado en hielo seco y el contralateral fijado en una solución al 4% de para-formaldehído neutro. Las muestras fueron sometidas a criocortes de 10 mieras y coloreadas con H/E, Rojo Congo o incubadas con un anticuerpo que reconoce específicamente el beta- amiloide. Los procesos morfométricos se realizaron capturando Ia imagen microscópica con una cámara de vídeo acoplada al microscopio, siendo analizada por el programa DIGIPAT. Indicadores estudiados.
Numero de depósitos fibrilares de proteína beta-amiloide positivos al rojo congo. Numero de focos inmunoreactivos con el anticuerpo que reconoce a Ia proteína beta-amiloide. Talla de las placas amiloideas en el cerebro reconocidas a 200 y 400x (en mieras cuadradas).
Concentración cerebral de mio-inositol como indicador de vejez y deterioro del metabolismo cerebral (μmol/gramo de tejido). Marcadores de estrés oxidativo en el cerebro. Tabla 15. Efecto del tratamiento con GHRP6 en Ia remoción de los depósitos amilodes cerebrales.
Figure imgf000021_0001
** p=0.0001. *p=0.0023. Prueba de U Mann Whitney.
En Ia tabla 15 se recopilan todos los resultados de los parámetros estudiados para caracterizar el efecto del tratamiento a largo plazo con Ia composición farmacéutica que contiene GHRP-6. Nótese que los resultados se refieren al conteo de imágenes digitales de un solo hemisferio cerebral. Para salvar esta limitación los conteos se realizaron a ciegas por tres observadores diferentes y los resultados que se muestran corresponden a 5 lecturas de las láminas. Tabla 15. Efecto de Ia composición farmacéutica que contiene GHRP-6 en el control de Ia acumulación de amiloide y Ia bioquímica cerebral.
Como puede observarse el tratamiento por 8 semanas con Ia composición farmacéutica que contiene GHRP-6 tiene un favorable impacto en el control de Ia acumulación de material amiloide en sus diversas formas en el cerebro, así como en Ia corrección del metabolismo del órgano. Existe un marcado efecto dado por Ia reducción de los depósitos amiloideos, y reducción de Ia talla de las placas. El marcado efecto de reducción de Ia acumulación de mio-inositol establece Ia evidencia de una corrección de rutas bioquímicas, de mayor asimilación de Ia energía, y de mejor nutrición de las neuronas. Ello puede tener un favorable impacto clínico en el control del envejecimiento cerebral. A continuación en Ia tabla 16, se demuestra el favorable efecto de Ia composición farmacéutica que contiene GHRP-6 en el control de Ia peroxidación de los lípidos en el cerebro de animales transgénicos para Ia enfermedad de Alzheimer. Nuevamente estas evidencias sugieren el efecto favorable de esta composición para controlar uno de los procesos más responsabilizados con el deterioro del tejido nervioso en las enfermedades y durante el envejecimiento.
Tabla 16. Marcadores del estrés oxidativo en tejido cerebral.
Grupos SODt Catalasa HPT MDA Experimentales
Grupo salina -placebo 475.9 ± 60.32** 118.6 ± 26.33** 105.6 ± 22.1** 1.232 ± 1.14 **
Grupo Dosis I 611.17 ± 44.79* 81.6 ± 15.25 54.3 i 11.87* 0.77 . . 1.56 *
Grupo Dosis Il 863.22± 50.3 60.18 ± 13.67 21.25 ± 5.44 0.4 + 0.02 p=0.00Q14. Placebo vs. Tratados: Dosis I y II. *p=0.025 Dosis I vs. Dosis II. Prueba de U-Mann Whitney. Ejemplo 6. Efecto de Ia composición farmacéutica basada en GHRP- 6 y otros péptidos para el control de Ia demencia de origen vascular. Eliminación del material osmiofilico de Ia vasculatura cerebral. Prevención y control del proceso de envejecimiento cerebral.
Este experimento se realizó con el propósito de evaluar Ia eficacia de composiciones farmacéuticas que indistintamente contienen alguno de los siguientes péptidos: GHRP-6, GHRP-2, hexarelina, ghrelina, sobre el control del proceso de involución neuro-funcional central en animales transgénicos que sobre-expresan una forma mutada del gen NOTCH 3 en las células musculares lisas de los vasos sanguíneos. Con el transcurso de los meses estos animales desarrollan una arteriopatía similar a Ia que aparece en Ia enfermedad CADASIL referida en Ia memoria descriptiva, y que acontece como una de las principales causas de demencia vascular. Las lesiones vasculares en estos animales también incluyen las vasculopatias retinocerebrales, cerebrales y de Ia cóclea. Desde el punto de vista histopatológico se destaca Ia presencia de material amiloide en el cerebro y los vasos sanguíneos, el depósito de material granular osmiofilico en las paredes arteriales del cerebro y las meninges, así como Ia reducción de su luz. En el cerebro y los principales troncos nerviosos aparecen zonas blanco-pálidas, zonas de microinfartos y focos hemorrágicos.
Se utilizaron ratones macho de 18-20 meses de edad cuando ya tenían evidencias sintomatológicas de Ia enfermedad. Los animales fueron aleatorizados y asignados a los siguientes grupos experimentales y de tratamiento: A - grupo placebo que recibió solución salina fisiológica. B - grupo tratado con 100 μg/kg de GHRP-6. C - grupo tratado con 100 μg/kg de GHRP-2. D - grupo tratado con 100 μg/kg de Ghrelina. E- grupo tratado con 100 μg/kg de Hexarelina. Los tratamientos se efectuaron dos veces en Ia semana y por espacio de 16 semanas, vía intra-peritoneal. Concluidos los tratamientos, independientemente de Ia mejoría clínica evidenciada en numerosos animales tratados, se procedió a estudio de autopsia y a Ia toma de muestras de tejido cerebral con las meninges para determinaciones histopatológicas y bioquímicas. Los animales recibieron una sobredosis de anestesia, fueron prefundidos con solución salina fisiológica fría por vía intracardiaca para arrastrar Ia sangre del encéfalo. Los encéfalos fueron extraídos y un hemisferio cerebral fue congelado en hielo seco y el contralateral fijado en una solución al 4% de para-formaldehído neutro. Las muestras fueron sometidas a criocortes de 10 mieras y coloreadas con H/E, Rojo Congo o incubadas con un anticuerpo que reconoce específicamente el beta-amiloide. Los procesos morfométricos se realizaron capturando Ia imagen microscópica con una cámara de vídeo acoplada al microscopio, siendo analizada por el programa
DIGIPAT.
Indicadores estudiados:
Número de depósitos fibrilares de proteína beta-amiloide en los vasos sanguíneos.
Número de infartos subcorticales.
Número de hemorragias subcorticales.
Concentración cerebral de mio-inositol como indicador de vejez y deterioro del metabolismo cerebral (μmol/gramo de tejido).
Marcadores de estrés oxidativo en el cerebro.
Tabla 17. Resultados de las determinaciones morfométricas sobre el tejido cerebral.
Figure imgf000024_0001
** p<0.0002 entre el placebo y el resto de los grupos de tratamiento con las sustancias de cada una de las composiciones farmacéuticas.
Como puede observarse el tratamiento con cada uno de los secretagogos reduce significativamente el número de arterias, arteriolas y capilares positivos a amiloide fibrilar (rojo congo) y a los depósitos granulares de material osmiofílico (coloración de Nissl). Consecuentemente, Ia presencia de microinfartos subcorticales que constituyen Ia leucoencefalopatía, así como el número de focos hemorrágicos también aparecen significativamente disminuidos en cada uno de los tratamientos con las composiciones.
Tabla 18. Indicadores del estrés oxidativo en tejido cerebral.
Figure imgf000025_0001
** significa diferencia de p<0.01 entre los animales del grupo placebo que recibieron solución salina fisiológica y el resto de los grupos que fueron tratados con las composiciones farmacéuticas individuales que contienen a los péptidos.
El efecto de los péptidos se hace muy evidente también al estudiar el proceso de peroxidación de lípidos en el cerebro de los animales transgénicos modelo de Ia enfermedad humana CADASIL.
Como ocurre con Ia reducción de los daños vasculares y de los infartos, los péptidos secretagogos aquí estudiados, muestran Ia capacidad de reducir o atenuar Ia neuro-toxicidad que se provoca por Ia alta producción de especies reactivas de oxigeno, presentes en Ia enfermedad humana, y constatada además en los animales que solo reciben solución salina. Este efecto, extiende el concepto de neuro-protección general de estas sustancias a contextos en los que el envejecimiento cerebral se encuentre mediado por daños vasculares y de peroxidación lipídica excesiva.
Ejemplo 7. Efecto de los péptidos GHRP-6, GHRP-2, Hexarelina y/o Ghrelina en Ia eliminación de los depósitos patológicos de material fisiológico de Ia piel. Para estudiar el efecto de los péptidos GHRP-6, GHRP-2, Hexarelina y/o Ghrelina en Ia eliminación de los depósitos patológicos de material fisiológico de Ia piel, fragmentos de queloides de origen humano fueron xenotrasplantados a ratones atímicos en Ia región dorsal. Transcurridas 72 horas de evolución, que permitieron corroborar el prendimiento y Ia viabilidad de los xenoinjertos, los animales (N=6) fueron aleatoriamente asignados a los siguientes grupos de tratamiento
A- GRUPO CONTROL SALINO (VEHÍCULO DE LOS PRINCIPIOS ACTIVOS).
B- GRUPO QUE RECIBE GHRP6 C- GRUPO QUE RECIBE GHRP2 D- GRUPO QUE RECIBE HEXARELINA E- GRUPO QUE RECIBE GHRELINA
Los tratamientos se realizaron una vez cada 24 horas, por un periodo de 7 días. Las sustancias fueron infiltradas en los bordes de los implantes, produciendo Ia biodisponibilidad local de los principios activos en Ia zona, a dosis desde 1 miligramo a 5 microgramos. Transcurrido el periodo de tratamiento, los animales fueron sacrificados, y los implantes extraídos para evaluación de Ia respuesta farmacológica de cada sustancia. Las muestras fueron fragmentadas para estudio histológico y determinaciones bioquímicas de colágeno, luego de ser pesadas. Los fragmentos para estudio histológico se fijaron en formalina neutra al 10% y los dedicados a bioquímica se conservaron a -70 grados centígrados. Los parámetros estudiados fueron: a- Peso húmedo de cada injerto colectado, b- Contenido de hidroxi-prolina en el tejido. c- Numero de campos microscópicos con clara positividad del tejido a las coloraciones histológicas de Rojo Pricosirio, y tricrómica de Masson. Las magnificaciones empleadas fueron x 4 y x 10. Los datos de cada magnificación se han promediado. d- Numero de mastocitos por campo microscópico - positivos a Ia coloración de azul de anilina. La magnificación empleada fue x 20.
Como se ilustra en Ia tabla 19, todos los péptidos estudiados ejercieron un significativo efecto anti-fibrótico al compararse con los animales que recibieron vehículo como control.
Tabla 19. Efecto anti-fibrótico de los tratamientos en piel.
Figure imgf000027_0001
(a) Significa diferencia significativa de p<0.01 entre los grupos que recibieron los péptidos y el control salino de vehículo. Two-tailed t-test.
Resulta evidente que cada uno de los péptidos a las dosis ensayadas ejerce un potente efecto anti-fibrótico en el sistema experimental establecido, caracterizado por ser agudo, reducir rápidamente el exceso de material colágeno y de matriz extracelular, reducir el numero de células inductoras (mastocitos) y de efectoras (fibroblastos y miofibroblastos). Es notorio que a partir de Ia tercera infiltración con cualquiera de los péptidos ensayados los implantes muestran una marcada reducción de Ia talla y comienzan a tornarse pálidos y desvitalizados.

Claims

REIVINDICACIONES
1. Composición farmacéutica caracterizada porque contiene péptidos secretagogos y es capaz de prevenir, controlar y eliminar los depósitos patológicos de material fibrótico y el exceso de matriz extracelular de los órganos internos y de Ia piel del receptor.
2. Composición de acuerdo con Ia reivindicación 1 , caracterizada porque elimina los depósitos intracelulares y extracelulares de material hialino, amiloide, formas granulares de material eosinofílico y/o osmiofílico de órganos internos, externos y de Ia red vascular.
3. Composición de acuerdo con las reivindicaciones 1 y 2 para restaurar Ia funcionalidad normal de cualquier órgano o tejido interno o externo que se haya afectado por depósitos excesivos de material fibrótico, amiloide, osmiofílico, eosinofílico o hialino.
4. Composición de acuerdo con las reivindicaciones 1-3 para ser administrada a pacientes o animales.
5. Composición de acuerdo con las reivindicaciones 1-4 para ser administrada a pacientes o animales, por ruta parenteral, pudiendo ser intra-venosa, intramuscular, sub-cutánea, intra-peritoneal, intra-tecal, e infiltración local en piel, sobre mucosas, epitelios u órganos o mas específicamente dentro de sus lesiones.
6. Composición de acuerdo con las reivindicaciones 1-4 para ser administrada a pacientes o animales, en Ia que Ia composición se administra por vía rectal.
7. Composición de acuerdo con las reivindicaciones 1-6 para ser administrada a pacientes o animales por vía tópica en forma liquida, de compresas, formulaciones semi-sólidas o sólidas.
8. Composición de acuerdo con las reivindicaciones 1-6 para ser administrada a pacientes o animales, por cualquiera de las vías descritas en las reivindicaciones 5 y 6, capaz de eliminar los depósitos de material fibrótico y exceso de matriz extracelular de cualquier etiopatogenia en el hígado como secuela de hepatitis virales, alcoholismo, intoxicaciones, auto-inmunes o idiopáticas en general.
9. Composición de acuerdo con las reivindicaciones 1-6 para ser administrada a pacientes o animales, por cualquiera de las vías descritas en las reivindicaciones 5 y 6, capaz eliminar los depósitos de material fibrótico y exceso de matriz extracelular en órganos como los plumones pudiendo ser de origen tóxico, profesional, medicamentoso, radioactivo, auto-inmune, secuela de asma, alergias o idiopático en general.
10. Composición de acuerdo con las reivindicaciones 1-6 para ser administrada a pacientes o animales, por cualquiera de las vías descritas en las reivindicaciones 5 y 6, capaz de eliminar los depósitos de material fibrótico, fibro-hialino, o amiloideo y el exceso de matriz extracelular en órganos como los ríñones pudiendo ser Ia nefro-esclerosis o y/o Ia túbulo-esclerosis de origen diabético, tóxico, profesional, medicamentoso, auto-inmune, idiopático en general o secuela de infecciones a repetición.
11. Composición de acuerdo con las reivindicaciones 1-6 para ser administrada a pacientes o animales, por cualquiera de las vías descritas en las reivindicaciones 5 y 6, capaz de eliminar los depósitos de material fibrótico, fibro-hialino, o amiloideo y el exceso de matriz extracelular en Ia piel, pudiendo ser de origen auto-inmune, idiopático en general.
12. Composición de acuerdo con las reivindicaciones 1-6 para ser administrada a pacientes o animales, por cualquiera de las vías descritas en las reivindicaciones 5 y 7, capaz de eliminar los depósitos de material fibrótico, fibro-hialino, o amiloideo y el exceso de matriz extracelular en Ia piel, pudiendo tratarse específicamente de queloides, cicatrices hipertróficas u otras formas de cicatrices exuberantes.
13. Composición de acuerdo con las reivindicaciones 1-6 para ser administrada a pacientes o animales, por cualquiera de las vías descritas en las reivindicaciones 5 y 7, capaz de corregir Ia apariencia estética de Ia piel en cirugías reconstructivas, estéticas o similares.
14. Uso del péptido GHRP-6 de acuerdo con las reivindicaciones 1-6 para Ia manufactura de una composición farmacéutica para ser administrada a pacientes o animales, por cualquiera de las vías descritas en las reivindicaciones 5 y 7 para eliminar los depósitos de material fibrótico, fibro- hialino, o amiloideo y el exceso de matriz extraceiular en Ia piel, pudiendo tratarse específicamente de secuelas fibróticas de acné en cualquiera de sus formas.
15. Composición de acuerdo con las reivindicaciones 1-6 para ser administrada a pacientes o animales, por cualquiera de las vías descritas en las reivindicaciones 5 y 6, capaz de eliminar los depósitos de material fibrótico, fibro-hialino, o amiloideo y el exceso de matriz extraceiular en el páncreas, y el tubo digestivo desde el esófago hasta el recto.
16. Composición de acuerdo con las reivindicaciones 1 -6 para ser administrada a pacientes o animales, por cualquiera de las vías descritas en las reivindicaciones 5 y 6, capaz de eliminar los depósitos de material fibrótico, fibro-hialino, o amiloideo y el exceso de matriz extraceiular en toda Ia red vascular.
17. Composición de acuerdo con las reivindicaciones 1-6 para ser administrada a pacientes o animales, por cualquiera de las vías descritas en las reivindicaciones 5 y 6, capaz de eliminar los depósitos de amiloideo y/o hialino, y/o de material granular granular osmiofílico o eosinofílico en el cerebro y sus células.
18. Composición de acuerdo con las reivindicaciones 1-6 para ser administrada a pacientes o animales, por cualquiera de las vías descritas en las reivindicaciones 5 y 6, capaz de eliminar los depósitos de amiloideo y/o hialino, y/o de material granular osmiofílico o eosinofílico en Ia red de vasos del organismo, incluidos los del sistema nervioso central y las meninges.
19. Composición de acuerdo con las reivindicaciones 1-6 para ser administrada a pacientes o animales, por cualquiera de las vías descritas en las
. reivindicaciones 5 y 6, capaz de reducir y/o prevenir el deposito de material fibrótico, amiloideo y/o hialino, y/o de granular osmiofílico y/o eosinofílico en las paredes de los vasos sanguíneos en general.
20. Composición de acuerdo con las reivindicaciones 1-6 para ser administrada a pacientes o animales, por cualquiera de las vías descritas en las reivindicaciones 5 y 6, capaz de eliminar los depósitos de amiloideo y/o hialino, y/o de material granular granular osmiofílico o eosinofílico, de nervios craneales, extra-craneales, sensitivos, motores, mixtos y/o del sistema neuro- vegetativo.
21. Composición de acuerdo con las reivindicaciones 1-6 para ser administrada a pacientes o animales, por cualquiera de las vías descritas en las reivindicaciones 5 y 6, capaz de reducir y/o prevenir el deposito de material fibrótico, amiloideo y/o hialino, y/o de granular osmiofílico y/o eosinofílico en las paredes de los vasos sanguíneos en general.
22. Composición de acuerdo con las reivindicación 1 caracterizada porque contiene uno o varios de los siguientes componentes GHRP-6, o GHRP-2, o Ghrelina, o Hexarelina, es capaz de detener y controlar el proceso de excesiva peroxidación de lípidos y de estrés oxidativo en células, tejidos y órganos sistémicos para ser administrada a pacientes o animales, por cualquiera de las vías descritas en las reivindicaciones 5 y 6.
23. Composición de acuerdo con las reivindicación 22 caracterizada porque es capaz de detener y controlar el proceso de excesiva peroxidación de lípidos y de estrés oxidativo; particularmente en el sistema nervioso central y los nervios periféricos, para ser administrada a pacientes o animales, por cualquiera de las vías descritas en las reivindicaciones 5 y 6.
24. Uso de ios péptidos GHRP-6, o GHRP-2, o Ghrelina, o Hexarelina en una composición farmacéutica útil para detener y controlar el proceso de envejecimiento cerebral y el deterioro de sus funciones dados por excesiva peroxidación de lípidos y de estrés oxidativo; así como por daño de su sistema vascular, para ser administrada a pacientes o animales, por cualquiera de las vías descritas en las reivindicaciones 5 y 6.
25. Uso de los péptidos GHRP-6 o GHRP-2, o Ghrelina, o Hexarelina de acuerdo con las reivindicaciones 1-6 para Ia manufactura de una composición farmacéutica útil para detener y controlar el proceso de envejecimiento cerebral y el deterioro de sus funciones dados por excesiva peroxidación de lípidos y de estrés oxidativo; así como por daño de su sistema vascular, para ser administrada a pacientes o animales, por cualquiera de las vías descritas en las reivindicaciones 5 y 6.
26. Uso de los péptidos GHRP-6, o GHRP-2, o Ghrelina, o Hexarelina para Ia manufactura de una composición farmacéutica útil para detener y controlar el proceso de acumulación de materiales amiloideo y/o hialino, y/o granular osmiofílico o eosinofílico en las células y el espacio extracelular del tejido del sistema nervioso central y periférico y para ser administrada a pacientes o animales, por cualquiera de las vías descritas en las reivindicaciones 5 y 6.
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