WO2007097447A1 - 核酸保護基の脱離方法 - Google Patents

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WO2007097447A1
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Hidetoshi Kitagawa
Hirofumi Masuda
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Nippon Shinyaku Co., Ltd.
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Definitions

  • the present invention relates to a ribonucleic acid derivative in which the 2'-position hydroxyl group of ribose is protected with the following substituent (I), and the 3'-position hydroxyl group and the 5'-position hydroxyl group are protected with a key protecting group.
  • the present invention relates to a method for removing the 3'-position hydroxyl group and the 5'-position hydroxyl protecting group of ribose.
  • WG 1 represents an electron-withdrawing group.
  • Examples of the “electron-withdrawing group” according to WG 1 include, for example, nitro-containing nitro, alkylsulfonyl, arylsulfonyl, and halogen. Of these, Ciano is preferred.
  • alkyl part of the “alkylsulfol” according to WG 1 examples include linear or branched alkyl having 1 to 5 carbon atoms. Specific examples include methyl, ethyl, n-propyl, isopropyl, n-butyl, isobutyl, sec butyl, tert-butyl, n-pentyl, isopentyl, neopentyl and tert pentyl.
  • Examples of the “aryl” part of the “aryl reel” according to WG 1 include aryl having 6 to 12 carbon atoms. Specific examples include phenyl, 1-naphthyl, 2-naphthyl, and biphenyl. For example, halogen, alkyl, alkoxy, and nitro-containing nitro may be mentioned as the substituents that may be substituted, and 1 to 3 of these are substituted at any position. Also good.
  • Oligoribonucleic acid is well known to be useful as an RNA probe for gene analysis, RNA drug material (antisense RNA, ribozyme, gene expression control using RNAi), artificial enzyme, and aptamer. is there.
  • Non-patent Document 1 A phosphoramidite compound that has been substituted with 2-cyanethoxymethyl (CEM group), which can be eliminated, is known (Non-patent Document 1). Wada et al. Also provided, for example, a phosphoramidite complex compound in which 1- (2-cyanethoxy) ethyl (CEE group) is introduced into the 2′-position hydroxyl group as a reagent for producing oligo RNA. (Non-Patent Document 2, Non-Patent Document 3). In the process of producing the phosphoramidite toy compound, Wada et al.
  • a fluorinating agent in order to remove the disiloxyl group protecting the 3′-position hydroxyl group and the 5′-position hydroxyl group of ribose.
  • TBAF trabutylammonium fluoride
  • acid acetic acid, hydrochloric acid, sulfuric acid
  • Patent Document 1 International Publication WO2005Z023828 A1 Pamphlet
  • Non-patent document 1 Oki et al., ORGANIC LETTERS, Vol. 7, 3477 (2005)
  • Non-patent document 2 Takeshi Wada, BIO INDUSTRY, Vol. 21, No. 1, 17 (2004)
  • Non-patent document 3 T. Umemoto Tetrahedron Letters, Vol. 45, 9529 (2004)
  • Non-Patent Document 4 Naohiro Tsujiyoshi et al., Jornal of Organic Chemistry, 70, 10453 (2005
  • the object of the present invention is to provide a ribonucleic acid derivative in which the 2′-hydroxyl group of ribose is mainly protected with the following substituent (I), and the 3′-hydroxyl group and the 5′-hydroxyl group are protected with a key protecting group! Efficient removal of the carbon substituents protecting the 3 'and 5' hydroxyl groups of ribose It is to provide a method of separating.
  • WG 1 has the same meaning as described above.
  • a ribonucleic acid derivative represented by the following general formula (1) is substituted with a tertiary ammine represented by the following general formula (2): It was found that a ribonucleic acid derivative represented by the following general formula (3) can be efficiently produced by acting a salt with hydrofluoric acid or a mixture of tertiary amine and hydrofluoric acid. Has been completed.
  • Bz represents a nucleobase which may have a protecting group or a modified product thereof.
  • WG 1 has the same meaning as described above.
  • R 7a , R 7b , R are the same or different and each represents a force representing alkyl, or a bicyclic saturated amino ring formed by R 7a , R 7b , R 7e together with the adjacent nitrogen atom Represents a group.
  • X represents a number in the range of 1-30.
  • A represents a silicon substituent represented by the following general formula (4a) or (4b).
  • R 6 represents alkyl.
  • the “nucleobase” related to Bz is not particularly limited as long as it is used for nucleic acid synthesis, and examples thereof include pyrimidine bases such as cytosine and uracil, and purine bases such as adenine and guanine.
  • the “nucleobase” according to Bz is preferably protected from an amino group having an amino group, such as adenine, guanine, and cytosine.
  • the “protecting group for amino group” is not particularly limited as long as it is used as a protecting group for nucleic acids. Specifically, for example, benzoyl, 4-methoxybenzoyl, acetyl, propionyl, Examples include butyryl, isobutyryl, phenylacetyl, phenoxyacetyl, 4 t tert butylphenoxyacetyl, 4 isopropylphenoxycetyl, and (dimethylamino) methylene.
  • a “modified product” of Bz is a group in which a nucleobase is substituted with an arbitrary substituent.
  • substituents include halogen, acyl, alkyl, arylalkyl, alkoxy, alkoxyalkyl, hydroxy , Monoalkyl amide-containing dialkylamino, force lpoxy, silane-containing nitro, and 1 to 3 of them are substituted at any position.
  • halogen related to the “modified” of Bz
  • examples of the “halogen” related to the “modified” of Bz include fluorine, chlorine, bromine and iodine.
  • acyl according to “modified” of Bz include linear or branched alkanol having 1 to 6 carbon atoms and aroyl having 7 to 13 carbon atoms. Specific examples include formyl, acetyl, n-propiol, isopropiool, n-butyryl, isobutyryl, tert-butyryl, valeryl, hexanol, benzoyl, naphthoyl, and levulinyl.
  • alkyl related to the “modified” of Bz
  • examples of the “alkyl” related to the “modified” of Bz include linear or branched alkyl having 1 to 5 carbon atoms. Specific examples include methyl, ethyl, n-propyl, isopropyl, n-butyl, isobutyl, sec butyl, tert-butyl, n-pentyl, isopentyl, neopentyl and tert pentyl.
  • substituent which may be substituted with the alkyl include halogen, alkyl, alkoxy, quino and nitro, and these are substituted at 1 to 3 positions at any position. May be.
  • alkyl part of “arylalkyl”, “alkoxyalkyl”, “monoalkylamino”, “dialkylamino” and “alkylsulfol” related to “modified” of Bz is the same as the above “alkyl”. The same can be mentioned.
  • Examples of the “modified” of Bz and “alkoxy” include linear or branched alkoxy having 1 to 4 carbon atoms. Specific examples include methoxy, ethoxy, n -propoxy, isopropoxy, n-butoxy, isobutoxy, sec-butoxy and tert-butoxy. Of these, those having 1 to 3 carbon atoms are preferred, and methoxy is particularly preferred.
  • alkoxy part of the “alkoxyalkyl” related to the “modified product” of Bz examples include the same as the above “alkoxy”.
  • aryl in “aryl alkyl” related to “modified” of Bz examples include aryl having 6 to 12 carbon atoms. Specific examples include a file, 1-naphthyl, 2-naphthyl and biphenyl. Examples of the substituent which may be substituted with the aryl include halogen, alkyl, alkoxy, and nitro-containing nitro, and 1 to 3 of these may be substituted at an arbitrary position. .
  • alkyl examples of “alkyl”, “alkylene”, “alkyl” and “alkoxy” as substituents of “alkyl” related to “modified” of Bz are the same as those described above.
  • alkyl examples include linear or branched alkyl having 1 to 5 carbon atoms. Specific examples include methyl, ethyl, n-propyl, isopropyl, n-butyl, isobutyl, sec-butyl, tert-butyl, n-pentyl, isopentyl, neopentyl and tert-pentyl.
  • Examples of the salt of tertiary amine and hydrofluoric acid that can be used in the present invention, or a mixture of tertiary amine and hydrofluoric acid include, for example, tertiary amine and fluorine represented by the above general formula (2). Examples thereof include a salt with hydrofluoric acid or a mixture of tertiary amine and hydrofluoric acid in an appropriate solvent in an arbitrary ratio.
  • Examples of the “alkyl” relating to R 7a , R 7b and R 7c include the same “alkyl” relating to the “modified” of Bz.
  • Examples of the “bicyclic saturated amino ring group” relating to R 7a , R 7b and R 7e include quinutaridin and triethylenediamine.
  • X represents a number in the range of 1 to 30, and may be a fraction. The number is preferably in the range of 2 to 15, more preferably the number in the range of 3 to 10.
  • tertiary amine examples include trimethylamine, triethylamine, tripropylamine, tributylamine, N, N-diisopropylethylamine, quinutaridin, and triethylenediamine.
  • salt of tertiary amine and hydrofluoric acid examples include, for example, trimethylamine trihydrofluoride, trimethylamine tetrahydride fluoride, trimethylamine pentahydride fluoride, and trimethylamine amine hydrate.
  • triethylamine trihydrofluoride is preferable.
  • the “mixture of tertiary amine and hydrofluoric acid” that can be used in the present invention include, for example, the above tertiary amine and hydrofluoric acid in an appropriate solvent (eg, THF, acetonitrile, methanol, etc.). And isopropyl, toluene, etc.), for example, mixed at a mixing ratio (molar ratio) of 1: 1 to 1:30 (tertiary amine: hydrofluoric acid).
  • a ribonucleic acid derivative represented by the following general formula (1) is added to a salt of a tertiary amine and hydrofluoric acid represented by the following general formula (2), or a tertiary amine.
  • Bz and WG 1 are as defined above.
  • R 2a and R 2b are the same or different and each represents an alkyl or a 5- to 6-membered saturated amino ring group formed by R 2a and R 2b together with an adjacent nitrogen atom.
  • the powerful saturated amino ring group may have one oxygen atom or sulfur atom as a ring constituent atom in addition to the nitrogen atom.
  • WG 2 is the same or different and represents an electron-withdrawing group.
  • R 1 represents a substituent represented by the following general formula (5).
  • the scale 11 , R 12 and R 13 are the same or different and each represents hydrogen or alkoxy.
  • Examples of the “alkoxy” related to 1, R 12 and R 13 include the same “alkoxy” related to the modified Bz.
  • Examples of the “alkyl” related to R 2a and R 2b include the same “alkyl” related to the modified Bz.
  • Examples of the “5- to 6-membered saturated amino ring group” related to R 2a and R 2b include pyrrolidine-1-yl, piperidine 1-yl, morpholine 1-yl, and thiomorpholine 1-yl. be able to.
  • Examples of the “electron withdrawing group” according to WG 2 include the same as the “electron withdrawing group” according to WG 1 .
  • the 2 'hydroxyl group of ribose is protected with the following substituent (I), and the 3' hydroxyl group and the 5 'hydroxyl group are protected with a key protecting group.
  • This is a phosphoramidite toy compound.
  • the group introduced into the hydroxyl group at the 2 ′ position is a linear substituent, and the three-dimensional structure around the phosphorus atom bonded to the hydroxyl group at the 3 ′ position is crowded.
  • the condensation reaction proceeds in a very short time and the condensation yield is good.
  • oligo DNA refers to an oligonucleic acid that only has deoxyribonucleic acid (DNA)! Uh.
  • oligo RNA refers to oligonucleic acid such as ribonucleic acid (RNA) and deoxyribonucleic acid (DNA), and at least one refers to an oligonucleic acid containing ribonucleic acid (RNA).
  • the raw material when the raw material has a substituent that affects the reaction (for example, hydroxy, amide-containing carboxy), the raw material is intensively protected with an appropriate protecting group according to a known method.
  • the reaction is performed later.
  • the protecting group is finally reduced by catalytic reduction, alkali treatment,
  • the protecting group can be removed according to a known method such as acid treatment.
  • the method for producing the phosphoramidite compound (A) represented by the following general formula (A) according to the present invention (hereinafter referred to as “the method for producing phosphoramidite of the present invention”) will be described in detail below. To do.
  • the phosphoramidite compound (A) can be produced from a known compound or an easily manufacturable intermediate, for example, by performing the operations of the following step a to step e. Details will be described below.
  • An ether-type protecting group that is eliminated under neutral conditions was introduced into the 2′-position hydroxyl group by allowing an alkyl reagent to act on the ribonucleic acid derivative represented by the following general formula (6).
  • alkylating reagent examples include an ether compound represented by the following general formula (11).
  • L represents a halogen, an arylthio group, an alkyl sulfoxide group or an alkylthio group.
  • WG 1 has the same meaning as described above.
  • etheric compound (11) examples include the following compounds 1 to 2.
  • the ether compound (11) is a novel alkyl reagent that can introduce an ether-type substituent that can be removed under neutral conditions into a hydroxyl group at the 2′-position under basic conditions. It is useful as a reagent for producing the phosphoramidite compound (A).
  • the ether compound (11) can be produced by carrying out the following steps 1 to 4.
  • WG 1 is as defined above.
  • R 3 represents alkyl or aryl.
  • Compound (14) is an ethereal compound (11) in which L is an alkylthio group.
  • Examples of the “alkyl” related to R 3 include the same “alkyl” related to the modified form of Bz.
  • examples of the alkylthiomethylating reagent include a mixed solution of dimethyl sulfoxide, acetic anhydride and acetic acid.
  • the amount of “dimethyl sulfoxide” used is suitably 10 to 200 times the molar amount of the compound (13), and 20 to 100 times the molar amount.
  • the amount of “acetic acid” to be used is 10 to 150 times the molar force S relative to the molar amount of the compound (13), and 20 to: LOO times the molar amount.
  • the amount of acetic anhydride used is A molar amount of 10 to 150 times the molar amount of the compound (13) is appropriate, and 20 to a molar amount of LOO.
  • the reaction temperature is suitably from 0 ° C to 100 ° C.
  • the reaction time varies depending on the type of raw material used, reaction temperature, etc., but 1 to 48 hours is usually appropriate.
  • R 3 has the same meaning as described above.
  • X 2 represents halogen.
  • Compound (14) is a compound in which L in the etheric compound (11) is halogen. Examples of the “norogen” relating to X 2 include the same “norogen” relating to the modified Bz.
  • This step can be performed by a known method (for example, T. Benneche et al., Synthesis 762 (1983)).
  • the solvent to be used is not particularly limited as long as it does not participate in the reaction.
  • 1S Examples include halogenated hydrocarbons such as dichloromethane, chlorophenol, carbon tetrachloride, and 1,2-dichloroethane.
  • Examples of the halogenating reagent include sulfuryl chloride and phosphorus oxychloride.
  • the amount of “halogen reagent” used is suitably 0.8 to 20 times the molar amount of the compound (14) and 1 to 10 times the molar amount.
  • the reaction temperature is 0 °. C-100 ° C is suitable.
  • the reaction time varies depending on the type of raw materials used, reaction temperature, etc. Usually 30 minutes to 24 hours is appropriate.
  • X 2 has the same meaning as described above.
  • R 3a represents a reel.
  • Compound (16) is a compound in which L in the etheric compound (11) is an arylthio group.
  • Examples of the “aryl” related to R 3a include the same “aryl” related to the modified Bz.
  • the solvent to be used is not particularly limited as long as it does not participate in the reaction, and examples thereof include dichloromethane and acetonitrile.
  • the arylthiolation reagent for example, thienol and 4-methylbenzene thiol can be mentioned.
  • the amount of the “arylethioy reagent” used is suitably 0.8 to 20 times the molar amount, preferably 1 to 5 times the molar amount of the compound (15).
  • the reaction temperature is 0 A temperature of ° C to 100 ° C is appropriate.
  • the reaction time varies depending on the type of raw material used, reaction temperature, etc., but 1 to 48 hours is usually appropriate.
  • R 3 has the same meaning as described above.
  • Compound (17) is a compound in which L in the ether compound (11) is an alkyl sulfoxide group.
  • Examples of the “alkyl” related to R 3 include the same “alkyl” related to the modified form of Bz.
  • the solvent to be used is not particularly limited as long as it does not participate in the reaction, and examples thereof include dichloromethane, chloroform, and methanol.
  • the oxidizing agent include methacroperoxybenzoic acid, metaperiodic acid salt, and hydrogen peroxide.
  • the amount of the “oxidant” used is suitably 0.8 to 10 times the molar amount, preferably 1 to 2 times the molar amount of the compound (14).
  • the reaction temperature is suitably from 0 ° C to 100 ° C. Reaction time is the type of raw material used, reaction temperature Force varies depending on etc. Usually 1 to 48 hours is appropriate.
  • This step can be performed according to a known method by allowing an alkylating reagent and a base to act on a ribonucleic acid derivative (6) that is commercially available or can be synthesized according to a method described in the literature. it can.
  • the solvent to be used is not particularly limited as long as it does not participate in the reaction, and examples thereof include halogenated hydrocarbons such as dichloromethane, chlorophenol, carbon tetrachloride, 1,2-dichloroethane.
  • the amount of the “alkylating reagent” to be used is suitably 0.8 to 20 times, preferably 1 to 10 times, the molar amount of the ribonucleic acid derivative (6).
  • an alkylating reagent can be allowed to act on the ribonucleic acid derivative (6) via an intermediate produced by reacting a metal reagent and a base.
  • the “metal reagent” examples include disodium dibutyltin and t-butylmagnesium chloride.
  • the amount of the “metal reagent” to be used is suitably 0.8 to 20 times, preferably 1 to 10 times the molar amount of the ribonucleic acid derivative (6).
  • base examples include pyridine, 2,6-dimethylpyridine, 2,4,6-trimethylpyridine, N-methylimidazole, triethylamine, tributylamine, N, N-diisopropylethylamine, 1,8-diazabicyclo [ 5. 4. 0] — 7—Undecene and other organic bases can be mentioned.
  • the amount of the “base” used is suitably 0.8 to 20 times the molar amount, preferably 1 to 10 times the molar amount of the molar amount of the ribonucleic acid derivative (6).
  • the reaction temperature is suitably from 0 ° C to 120 ° C.
  • the reaction time varies depending on the type of raw materials used, reaction temperature, etc. Usually, 30 minutes to 24 hours is appropriate.
  • This step is carried out according to a known method (for example, M. Matteucci, Tetrahedron Letters, Vol. 31, 2385 (1990)), and can be obtained as a commercial product or synthesized in accordance with the method described in the literature (6) Further, it can be carried out by reacting an alkylating reagent, an acid and a halogenating agent for the sulfur atom.
  • the amount of the “alkylating reagent” used is suitably 0.8 to 5 times the molar amount of the ribonucleic acid derivative (6), preferably The molar amount is 1 to 3 times.
  • Examples of the “acid” include trifluoromethanesulfonic acid, silver trifluoromethanesulfonate, and trimethylsilyl trifluoromethanesulfonate.
  • the amount of the “acid” used is suitably 0.01 to 20 times the molar amount, preferably 0.02 to 10 times the molar amount of the ribonucleic acid derivative (6).
  • the solvent to be used is not particularly limited as long as it is not involved in the reaction.
  • the “halogenating agent for sulfur atom” used in the present process include N-promosuccinimide (NBS) and N-odosuccinimide (NIS).
  • NBS N-promosuccinimide
  • N-odosuccinimide N-odosuccinimide
  • the amount of the “halogenating agent for sulfur atom” is suitably 0.8 to 10 times the molar amount of the ribonucleic acid derivative (6), preferably 1 to 5 times the molar amount.
  • the reaction temperature is suitably 78 ° C to 30 ° C.
  • the reaction time varies depending on the type of raw materials used, the reaction temperature, etc. Power Usually 5
  • a ribonucleic acid derivative (6) which is available as a commercial product or can be synthesized according to a method described in the literature, is made to work with an alkyl reagent, an acid anhydride, and a base according to a known method. This can be implemented.
  • the amount of the “alkyly reagent” used is suitably 0.8 to 5 times, preferably 1 to 3 times the amount of the ribonucleic acid derivative (6).
  • the “acid anhydride” include trifluoromethanesulfonic acid anhydride and acetic anhydride.
  • the amount of the “acid anhydride” used is suitably 0.01 to 20 times the molar amount, preferably 0.02 to 10 times the molar amount of the ribonucleic acid derivative (6).
  • the base include tetramethylurea and collidine.
  • the amount of the “base” used is suitably 0.01 to 20 times the molar amount, preferably 0.02 to L0 times the molar amount of the ribonucleic acid derivative (6).
  • the solvent used is not particularly limited as long as it does not participate in the reaction, and examples thereof include dichloromethane, chloroform, carbon tetrachloride, 1,2-dichloroethane, and any mixed solvent thereof.
  • the reaction temperature is suitably -78 ° C to 30 ° C.
  • the reaction time varies depending on the type of raw materials used, reaction temperature, etc. Force Usually 5 to 24 hours is appropriate.
  • step a a step of producing a ribonucleic acid derivative represented by the following general formula (7) by reacting the ribonucleic acid derivative (6) with dimethyl sulfoxide, acetic acid and acetic anhydride.
  • Examples of the “alkyl” related to R 6 include the same “alkyl” related to the modified form of Bz.
  • This step is carried out according to a known method by allowing dimethyl sulfoxide, acetic acid and acetic anhydride to act on a ribonucleic acid derivative (6) which is available as a commercial product or can be synthesized according to a method described in the literature. be able to.
  • the amount of “dimethyl sulfoxide” used is 10 to 200 times the molar amount of the ribonucleic acid derivative (6), preferably 20 to: L 00 times the molar amount.
  • the amount of “acetic acid” used is suitably 10 to 150 times the molar amount, preferably 20 to L00 times the molar amount of the ribonucleic acid derivative (6).
  • the amount of “acetic anhydride” used is suitably 10 to 150 times, preferably 20 to 100 times the molar amount of the ribonucleic acid derivative (6).
  • the reaction temperature is suitably 10 ° C to 50 ° C.
  • the reaction time varies depending on the type of raw materials used, reaction temperature, etc. Usually, 30 minutes to 24 hours is appropriate.
  • step b the ribonucleic acid derivative (7) produced in the step b is reacted with an alcohol compound represented by the following general formula (8), an acid, and a halogenating agent for a sulfur atom.
  • an alcohol compound represented by the following general formula (8) an acid
  • a halogenating agent for a sulfur atom a ribonucleic acid derivative represented by the following general formula (1), wherein an ether-type protecting group that is eliminated under the sexual conditions is introduced into the 2′-position hydroxyl group.
  • This step can be performed by reacting the ribonucleic acid derivative (7) with an alcoholic compound (8), an acid and a halogenating agent for a sulfur atom according to a known method.
  • the solvent to be used is not particularly limited as long as it does not participate in the reaction.
  • the amount of the “alcohol compound (8)” used is suitably 0.8 to 20 times the molar amount, preferably 1 to 10 times the molar amount of the ribonucleic acid derivative (7).
  • Examples of the “acid” include trifluoromethane sulfonic acid, silver trifluoromethane sulfonate, and trimethylsilyl trifluoromethane sulfonate.
  • Examples of the “halogenating agent for sulfur atom” include N-bromosuccinimide (NBS) and N-odosuccinimide (NIS).
  • the amount of the “halogenating agent for sulfur atom” is suitably 0.1 to 20 times the molar amount, preferably 0.2 to 10 times the molar amount of the ribonucleic acid derivative (7). It is.
  • the reaction temperature is suitably from -100 ° C to 20 ° C.
  • the reaction time varies depending on the type of raw materials used, reaction temperature, etc., but usually 5 minutes to 12 hours is appropriate.
  • a salt of a tertiary amine and hydrofluoric acid represented by the following general formula (2) or a tertiary amine and hydrofluoric acid By reacting the mixture to remove the C-substituent, which protects the 3-position hydroxyl group and 5-position hydroxyl group of ribose, the ribonucleic acid derivative represented by the following general formula (3) can be obtained. Manufacturing process. WG1
  • A, Bz, R 7a , R 7b , x is as defined above.
  • the ribonucleic acid derivative (1) is dissolved in a suitable solvent, and a salt of tertiary amine and hydrofluoric acid as shown in the general formula (2) or a tertiary amine and hydrofluoric acid is used. This can be carried out by reacting the mixture.
  • this step is carried out using a mixed reagent in which a suitable acid is further added to a salt of tertiary amine and hydrofluoric acid or a mixture of tertiary amine and hydrofluoric acid. It can also be done.
  • a suitable acid is further added to a salt of tertiary amine and hydrofluoric acid or a mixture of tertiary amine and hydrofluoric acid.
  • the acid that can be used include acetic acid, hydrochloric acid, and sulfuric acid.
  • the amount of the acid to be used is, for example, 0.8 to 10 and preferably 1 to 1.5 with respect to the molar amount of the ribonucleic acid derivative (1).
  • Examples of the solvent that can be used include THF, acetonitrile, methanol, isopropyl, and toluene.
  • THF and acetonitrile are preferable.
  • the salt of tertiary amine and hydrofluoric acid used is 1 to L0 times the molar amount of ribonucleic acid derivative (1). Is suitably 1.2 to 1.5 times the molar amount.
  • the reaction temperature is suitably from 0 ° C to 80 ° C.
  • the reaction time varies depending on the type of ribonucleic acid derivative, the salt of tertiary amine and hydrofluoric acid used, the mixture of tertiary amine and hydrofluoric acid, the solvent used, etc., but it depends on the reaction temperature, etc. However, usually 30 minutes to 10 hours is appropriate.
  • the ribonucleic acid derivative (3) can be obtained as a precipitate by adding or cooling an appropriate amount of water as it is or after cooling.
  • the amount of water to be added is suitably 0.05 to 5 times the amount of the solvent used, preferably 0.06 to 1 time, more preferably 0.0 07-0. It is 1 times the amount.
  • Bz and R ⁇ WG 1 are as defined above.
  • X 3 represents halogen.
  • Examples of the “norogen” relating to X 3 include the same “norogen” relating to the modified form of Bz.
  • This step can be performed by reacting ribonucleic acid derivative (3) coconut R 3 (9) according to a known method.
  • the amount of (9) used is suitably 0.8 to 20 times the molar amount, preferably 1 to 10 times the molar amount of the ribonucleic acid derivative (3).
  • the solvent used is not particularly limited as long as it does not participate in the reaction, and examples thereof include acetonitrile and THF.
  • “Base” includes pyridine, 2,6-dimethylpyridine, 2,4,6-trimethylpyridine, N-methylimidazole, triethylamine, tributylamine, N, N-diisopropylethylamine, 1, 8 —Zazabicyclo [5. 4.
  • Examples of the “phosphoramidite reagent” include compounds represented by the following general formulas (12a) and (12b).
  • R 2a , R 2b and WG 2 are as defined above.
  • X 1 represents halogen.
  • Examples of the “norogen” relating to X 1 include the same “norogen” relating to the modified form of Bz.
  • This step is a reaction in which a phosphoramidite reagent is allowed to act on the ribonucleic acid derivative (10) to phosphorylate the 3′-position hydroxyl group, and can be carried out according to a known method.
  • An activator can also be used as needed.
  • the solvent to be used is not particularly limited as long as it does not participate in the reaction, and examples thereof include acetonitrile and THF.
  • the amount of the “phosphoramidite candy reagent” is suitably 0.8 to 20 times the molar amount, preferably 1 to 10 times the molar amount of the ribonucleic acid derivative (10).
  • the “activator” include 1H-tetrazole, 5-ethylthiotetrazole, 5-benzilmer force, Pto 1H-tetrazole, 4,5-dichloroimidazole, 4,5-disyanoimidazole, and benzotriazole. Mention may be made of triflate, imidazole triflate, pyridinium triflate, N, N-diisopropylethylamine, 2,4,6-collidine ZN-methylimidazole.
  • the amount of the “activating agent” used is 0 with respect to the molar amount of the ribonucleic acid derivative (10). 8-20 times molar amount is suitable, Preferably it is 1-10 times molar amount.
  • the reaction temperature is suitably from 0 ° C to 120 ° C.
  • the reaction time varies depending on the type of raw materials used, reaction temperature, etc., but usually 30 minutes to 24 hours is appropriate.
  • the produced phosphoramidite complex (A) is obtained by means known per se, for example, concentration, liquid conversion, phase transfer, solvent extraction, crystallization, recrystallization, fractional distillation, chromatography. Can be separated and purified by one.
  • oligo RNA represented by the following general formula (B) (hereinafter referred to as “oligo RNA (B)”) can be produced.
  • each B independently represents a nucleobase or a modified form thereof.
  • Each Q independently represents O or S.
  • Each R is independently H, hydroxyl group, halogen, alkoxy, alkylthio, alkylamino, dialkylamino, alkoxy, alkenylthio, alkenylamino, dialkenylamidoalkynoxy, alkynylthio, alkynyl. Represents amino, dialkynylamino or alkoxyalkyloxy, at least one of which represents a hydroxyl group.
  • Z represents H, a phosphate group or a thiophosphate group.
  • n represents an integer in the range of 1 to 200.
  • n is preferably an integer in the range of 10 to: L00, and more preferably an integer in the range of 15 to 50.
  • the nucleobase represented by B is not particularly limited, and examples thereof include pyrimidine bases such as cytosine, uracil and thymine, and purine bases such as adenine and guanine.
  • the “modified form” of B is a group in which the nucleobase is substituted with an arbitrary substituent. Examples of the substituent related to the modified form of B include halogen, acyl, alkyl, arylalkyl, alkoxy, Examples include alkoxyalkyl, hydroxy, amino-containing monoalkylamino-containing dialkyl, amino-containing carboxy, and sia-containing nitro, which are substituted at 1 to 3 positions at any position.
  • alkyl examples include the same “alkyl” as the modified Bz.
  • alkoxy in “alkoxyalkyloxy” according to R include the same “alkoxy” as the modified Bz.
  • alkenyl of “alkalkoxy”, “alkylkethio”, “alkylkeamino” and “dialkylamino” relating to R include, for example, linear or branched C 2-6 carbon atoms.
  • bur aryl, 1-propyl, isopropenyl, 1-butenyl, 2-butenyl, 1 pentenyl, 1-hexenanol and the like can be mentioned.
  • alkyl in “alkyloxy”, “alkylthio”, “alkylamino”, and “dialkylamino” according to R include, for example, linear or branched carbon numbers of 2 to There can be mentioned 4 alkyls. Specific examples include ethynyl, 2-probule, 1 petitil and the like.
  • the production method of oligo RNA (B) using the phosphoramidite compound (A) is a force that can be performed according to a known method. This can be done by condensing the nucleic acid monomer compound in the 3 ′ to 5 ′ direction.
  • oligo RNA in which at least one of each R is a hydroxyl group (B) can be manufactured.
  • Step B by using the entire phosphoramidite compound (A) as the nucleic acid monomer compound, an oligo RNA (B) in which each R is a hydroxyl group can be produced.
  • those other than the phosphoramidite compound (A) are not particularly limited as long as they are generally used for the synthesis of oligo RNA or oligo DNA.
  • all steps can be produced using a manual or a commercially available DNA automatic synthesizer. It is desirable to use an automatic synthesizer in order to simplify the operation method by using an automatic synthesizer and to ensure the accuracy of synthesis.
  • those other than the nucleic acid monomer compound are not particularly limited as long as they are generally used for the synthesis of oligo DNA or oligo RNA.
  • each Q is independently the same as defined above.
  • n WG 2 has the same meaning as above.
  • Each Bx independently represents a nucleic acid base which may have a protecting group or a modified form thereof.
  • Each R 4 is independently H, halogen, alkoxy, alkylthio, alkylamino, dialkylamino, alkenyloxy, alkenylthio, alkenylamino, dialkenylamidoalkynoxy, alkynylthio, alky It represents a substituent represented by the following formula (20): kylamino, dialkylami-containing alkoxyalkyloxy.
  • WG 1 has the same meaning as described above.
  • E represents isacyl or a substituent represented by the following general formula (21).
  • T is H, acyloxy, halogen, alkoxy, alkylthio, alkylamino, dialkylamino, alkenyloxy, alkenylthio, alkenylamino, dialkenylamimed alkynyloxy, alkynylthio, alkynylamino, dialkynylamimed alkyl
  • Xyloxyloxy represents a substituent represented by the general formula (20) or a substituent represented by the general formula (21). However, either E or T represents the substituent (21).
  • nucleobase relating to Bx is not particularly limited as long as it is used for nucleic acid synthesis, and examples thereof include pyrimidine bases such as cytosine, uracil and thymine, and purine bases such as adenine and guanine. .
  • Nucleobase relating to Bx is preferably protected from a nucleic acid base having an amino group, for example, adenine, guanine, and cytosine, wherein the amino group is protected.
  • the “protecting group for amino group” is not particularly limited as long as it is used as a protecting group for nucleic acids.
  • benzoyl, 4-methoxybenzoyl, acetyl, propiol, butyryl, isobutyryl Mention may be made of phenylacetyl, phenoxyacetyl, 4-tert-butyl phenoxyacetyl, 4 isopropylphenoxycetyl and (dimethylamino) methylene.
  • the “modified product” of Bx is a group in which the nucleobase is substituted with an arbitrary substituent.
  • substituents related to the “modified product” of Bx include halogen, acyl, alkyl, arylalkyl, alkoxy. , Alkoxyalkyl, hydroxy, amino-containing monoalkylamino-containing dialkylamino, carboxy, and cyanated nitro, and 1 to 3 of them are substituted at any position.
  • Examples of the “norogen”, “alkoxy”, “alkylamino” and “dialkylamino” related to R 4 include the same as those related to the modified form of Bz. Examples thereof include the same “alkyl” related to the modified form of Bz.
  • Examples of the “alkoxy” part of the “alkoxyalkyloxy” according to R 4 include the same “alkoxy” as the above-mentioned modified body of Bz.
  • alkyl part of “alkyloxy”, “alkylthio”, “alkylamino” and “dialkylamino” related to R 4 is the same as “alkynyl” related to R above. It can be done.
  • alkylamino “alkylamine”, and “alkylamino” related to R 4 are not particularly limited as long as they can be protected as long as they are used as protective groups for the amino groups.
  • trifluoroacetyl benzoyl, 4-methoxybenzoyl, acetyl , Propionyl, butyryl, isobutyryl, phenylacetyl, phenoxyacetyl, 4 tert butylphenoxyacetyl, 4 isopropylphenoxycetyl, and (dimethylamino) methylene.
  • trifluoroacetyl is preferred.
  • Examples of the “acyl” related to E include the same “acyl” related to the modified form of Bz.
  • Examples of “norogen”, “alkoxy”, “alkylamino” and “dialkylamino” related to T include the same as those related to the modified form of Bz. Can be the same as the “alkyl” related to the modified form of Bz.
  • Examples of the “alkoxy” part of the “alkoxyalkyloxy” according to T include the same “alkoxy” as the modified Bz.
  • alkynyl part of “alkyloxy”, “alkylthio”, “alkylamino”, and “dialkylamino” related to T should be the same as the “alkyl” related to R above. It is out.
  • Alkylamino “alkenylamino”, and “alkynylamino” related to T are protected and are not particularly limited as long as they can be used as protective groups for an amino group.
  • Trifluoroacetyl benzoyl, 4-methoxybenzoyl, acetyl, propionyl, butyryl, isobutyryl, phenylacetyl, phenoxyacetyl, 4 t tert butyl phenoxy acetyl, 4 isopropyl phenoxy acetyl, (dimethylamino C) methylene.
  • trifluoroacetyl is preferred.
  • Oligo RNA or oligo DNA supported on a solid phase carrier produced by the operation (n 2 to: LOO)
  • Oligonucleic acid derivative (18)) (hereinafter referred to as “oligonucleic acid derivative supported on a solid phase carrier”) can be carried out by allowing an acid to act thereon.
  • R 2 represents acyloleoxy.
  • R 4a is H, acyloleoxy, halogen, anoloxy, alkylthio, alkylamino, dialkylamino, alkalkoxy, alkellthio, alkenylamino, dialkenylamidoalkynoxy, alkynylthio, alkynylamino, dialky It represents ruamido-alkoxyalkyloxy or the substituent (20).
  • acyl moiety related to “acyloxy” of R 2 and R 4a
  • examples of the “acyl” moiety related to “acyloxy” of R 2 and R 4a include the same “acyl” related to the modified Bz.
  • Examples of “norogen”, “alkoxy”, “alkylamino” and “dialkylamino” relating to R 4a include the same as those relating to the modified form of Bz. Examples thereof include the same “alkyl” related to the modified form of Bz.
  • Examples of the “alkoxy” part of the “alkoxyalkyloxy” according to R 4a include the same “alkoxy” as the above-mentioned modified body of Bz.
  • alkyl part of “alkyloxy”, “alkylthio”, “alkylamino” and “dialkylamino” relating to R 4a is the same as “alkynyl” relating to said R. It can be done.
  • amino “alkylamino”, “alkylamine” and “alkylamino” related to R 4a
  • the protective group that can be protected as long as it is used as a protective group for an amino group.
  • trifluoroacetyl, benzoyl, 4-methoxybenzoyl, acetyl, propionyl Examples include butyryl, isobutyryl, phenylacetyl, phenoxyacetyl, 4 tert butylphenoxyacetyl, 4 isopropylphenoxycetyl, and (dimethylamino) methylene.
  • trifluoroacetyl is particularly preferred.
  • solid phase carriers examples include controlled pore glass (CPG), oxalylated-constant glass (eg, Alul et al., Nucleic Acids Research, Vol. 19, 15 27 (1991)). ), TentaGel support-aminopolyethylene glycol derivative support (see, eg, Wright et al., Tetrahedron Letters, Vol. 34, 3373 (1993)),
  • linker examples include 3aminopropyl, succiol, 2,2′-diethanol sulfol, and long chain alkylamino (LCAA).
  • the nucleic acid derivative (23a) and the nucleic acid derivative (23b) are compounds carried on a solid phase carrier produced according to a known method or available as a commercial product.
  • Preferred embodiments include, for example, the following general formula: Examples thereof include nucleic acid derivatives represented by (24) and (25).
  • B, Q, R ⁇ R 4 and WG 2 are as defined above.
  • the nucleic acid derivatives (24) and (25) in which R 4 is the substituent (20) can be produced from the phosphoramidite compound (A) according to a known method.
  • the “acid” that can be used in this step include trifluoroacetic acid, dichloroacetic acid, and trichloroacetic acid.
  • the acid that can be used in this process is suitable to a concentration of 1-5%. It can also be diluted with an appropriate solvent.
  • the solvent is not particularly limited as long as it does not participate in the reaction, and examples thereof include dichloromethane, acetonitrile, water, and any mixed solvent thereof.
  • the reaction temperature in the above reaction is preferably 20 ° C to 50 ° C.
  • the reaction time varies depending on the type of (oligo) nucleic acid derivative (18), the type of acid used, the reaction temperature, etc., but usually 1 minute to 1 hour is appropriate.
  • the amount of the reagent to be used is suitably 0.8 to: LOO-fold molar amount, preferably 1 to 10-fold molar amount with respect to the oligonucleic acid derivative supported on the solid phase carrier.
  • each B, each Q, each R 4 , and each WG 2 are independently the same as described above.
  • This process is carried on a solid support! It can be carried out by allowing a nucleic acid monomer compound and an activator to act on the oligonucleic acid derivative.
  • nucleic acid monomer compound examples include a phosphoramidite compound (A) or a nucleic acid derivative represented by the following general formula (27).
  • V may be a nucleobase or a modified form thereof.
  • nucleobase is not particularly limited as long as it is used for nucleic acid synthesis.
  • Examples thereof include pyrimidine bases such as cytosine, uracil and thymine, and purine bases such as adenine and guanine.
  • Nucleobase according to B is a nucleobase having an amino group, whether it is protected or not.
  • adenine, guanine, and cytosine preferably have a protected amino group.
  • the “amino group protecting group” is not particularly limited as long as it is used as a nucleic acid protecting group. Specifically, for example, benzoyl, 4-methoxybenzoyl, acetyl, propionyl, butyryl. , Isobutyryl, phenylacetyl, phenoxyacetyl, 4 tert butyl phenoxyacetyl, 4 isopropylphenoxyacetyl, and (dimethylamino) methylene.
  • the “modified form” of B is a group in which the nucleobase is substituted with an arbitrary substituent.
  • substituent related to the “modified product” examples include halogen, acyl, alkyl, arylalkyl, alkoxy, alkoxyalkyl, hydroxy, amide-containing monoalkylamino-alkylalkylamino, carboxy, and cyano-containing nitro. 1 to 3 are substituted at any position.
  • Examples of the “activator” include the same as described above.
  • the reaction solvent is not particularly limited as long as it does not participate in the reaction, and examples thereof include acetonitrile and THF.
  • the reaction temperature in the above reaction is preferably 20 ° C to 50 ° C. Good.
  • the reaction time varies depending on the type of oligonucleic acid derivative (19), the type of activator used, the reaction temperature, etc., but usually 1 minute to 1 hour is appropriate.
  • the amount of the reagent to be used is suitably 0.8 to: LOO-fold molar amount, preferably 1 to 10-fold molar amount with respect to the oligonucleic acid derivative supported on the solid phase carrier.
  • step B the step of capping the hydroxyl group at the 5′-position of the unreacted oligonucleic acid derivative (19).
  • each Q, each R 4, each WG 2 are each independently, the same
  • R 5 represents methyl or phenoxymethyl.
  • E, n, and T are as defined above.
  • R 5 represents methyl, phenoxymethyl, tert-butylphenoxymethyl.
  • This step is a reaction for protecting the hydroxyl group at the 5 ′ position, which has not been reacted in Step B, and can be carried out by acting a capping agent on the oligonucleic acid derivative supported on the solid phase carrier. .
  • the “capping agent” examples include acetic anhydride, phenoxyacetic anhydride or tert-butylphenoxyacetic anhydride.
  • the capping agent can be used by diluting with a suitable solvent so as to have a concentration of 0.05 to LM.
  • the solvent is not particularly limited as long as it is not involved in the reaction, and examples thereof include pyridine, dichloromethane, acetonitrile, THF, and any mixed solvent thereof.
  • 4-dimethylaminopyridine or N-methylimidazole can be used as a “reaction accelerator” as necessary.
  • the reaction temperature in the above reaction is preferably 20 ° C to 50 ° C.
  • the reaction time varies depending on the type of oligonucleic acid derivative (19), the type of capping agent used, the reaction temperature, etc., but usually 1 to 30 minutes is appropriate.
  • the amount of the reagent to be used is suitably 0.8 to LOO-fold molar amount, preferably 1 to 10-fold molar amount with respect to the oligonucleic acid derivative supported on the solid phase carrier.
  • each Q, each R 4, each WG 2 are each independently, the same
  • This step is a reaction for converting trivalent phosphorus to pentavalent phosphorus using an oxidizing agent, and can be performed by allowing an oxidizing agent to act on the oligonucleic acid derivative supported on the solid phase carrier. I'll do it.
  • iodine or tert-butyl hydroperoxide can be used as the “oxidant”, for example.
  • the oxidizing agent can be used by diluting with an appropriate solvent so as to have a concentration of 0.05 to 2M.
  • the solvent used in the reaction is not particularly limited as long as it does not participate in the reaction, and examples thereof include pyridine, THF, water, and any mixed solvent thereof.
  • iodine Z water Z pyridine THF or iodine Z pyridine acetic acid or a peroxide (such as t-butyl hydroperoxide Z methylene chloride) can be used.
  • oxidizing phosphorus with sulfur as an “oxidant”, for example, sulfur, Beaucage reagent (3H-1,2, benzodithiol-3-one 1,1 dioxide), 3 amino-1,2,4 Dithiazole-5 thione (ADTT) can be used.
  • the oxidizing agent can be used by diluting with an appropriate solvent so as to have a concentration of 0.05 to 2M.
  • the solvent used in the reaction is not particularly limited as long as it does not participate in the reaction, and examples thereof include dichloromethane, acetonitrile, pyridine, and any mixed solvent thereof.
  • the reaction temperature is preferably 20 ° C to 50 ° C.
  • the reaction time varies depending on the type of oligonucleic acid derivative (26), the type of oxidizing agent used, the reaction temperature, etc., but usually 1 to 30 minutes is appropriate.
  • the amount of the reagent to be used is suitably 0.8 to 100 times, preferably 10 to 50 times the molar amount of the oligonucleic acid derivative supported on the solid phase carrier.
  • step D the oligonucleic acid derivative (29) produced in this step is excised from the solid phase carrier force, and each nucleobase part and each phosphate group protecting group are removed.
  • each beta, the beta, each Q, each R 4, each WG 2 are each independently, before
  • E, R, n, T, and Z are as defined above.
  • the cleaving step is a reaction in which oligo RNA having a desired chain length is removed from the solid phase carrier and the linker by a cleaving agent, and the cleaving agent is added to the solid carrier carrying the oligo RNA having the desired chain length. Can be implemented.
  • the protecting group in the nucleobase portion can be removed.
  • Examples of the “cutting agent” include concentrated aqueous ammonia and methylamine.
  • the “cleaving agent” that can be used in this step can be used by diluting with, for example, water, methanol, ethanol, isopropyl alcohol, acetonitrile, THF, or any mixed solvent thereof. Of these, ethanol is preferred.
  • the reaction temperature is suitably from 15 ° C to 75 ° C, preferably from 15 ° C to 30 ° C, more preferably from 18 ° C to 25 ° C.
  • the deprotection reaction time is suitably from 10 minutes to 30 hours, preferably from 30 minutes to 24 hours, more preferably from 1 to 4 hours.
  • Hydroxide ammonia in the solution used for deprotection - concentration ⁇ beam is 20 to 30 weight 0/0 is the appropriate, preferably 25-3 0% by weight, more preferably 28-30 wt% It is.
  • the amount of the reagent to be used is suitably 0.8 to LOO-fold molar amount, preferably 10 to 50-fold molar amount with respect to the oligonucleic acid derivative supported on the solid support.
  • An oligonucleic acid represented by the following general formula (31) is allowed to act on the oligonucleic acid derivative (30) produced in step E by acting a reagent for removing the protecting group of the 2′-position hydroxyl group of each ribose. Producing a derivative;
  • each Q, each R, each R 4 independently have the same meanings as defined above.
  • n and R ⁇ Z are as defined above.
  • This step can be carried out by reacting the oligonucleic acid derivative (30) with a reagent that removes the protecting group for the 2′-position hydroxyl group.
  • the step of removing the protecting group at the 2′-position hydroxyl group can be carried out by acting, for example, TBAF or triethylamine trihydrofluoride as a “reagent for removing the protecting group at the 2′-position hydroxyl group”. it can. Used '2' hydroxyl acid
  • the amount of the “reagent for removing the protecting group” is suitably 1 to 500 times, preferably 5 to 10 times the amount of the protecting group to be removed.
  • the solvent to be used is not particularly limited as long as it does not participate in the reaction, and examples thereof include THF, N-methylpyrrolidone, pyridine, dimethyl sulfoxide, and any mixed solvent thereof.
  • the reaction solvent is used in an amount of 0.8 to: LOO-fold molar amount, preferably 1 to 10-fold molar amount with respect to the “reagent for removing the protecting group of the 2′-position hydroxyl group”. is there.
  • the reaction temperature is preferably 20 ° C to 80 ° C.
  • the reaction time varies depending on the type of oligonucleic acid derivative (30), the type of reagent used for removing the protecting group of the 2′-position hydroxyl group, the reaction temperature, etc., but usually 1 to 100 hours is appropriate.
  • nitroalkane alkylamine, amidine, thiol, thiol derivative or any mixture thereof is added as an acrylo-tolyl scavenger to capture acrylonitrile, a by-product in this step. can do.
  • nitroalkane include a linear 1- to 6-troalkane having 1 to 6 carbon atoms.
  • Specific examples include nitromethane.
  • alkylamine include a linear alkylamine having 1 to 6 carbon atoms. Specific examples include methylamine, ethylamine, n-propylamine, n-butylamine, n-pentylamine, and n-hexylamine.
  • amidine examples include benzamidine and formamidine.
  • thiol examples include linear thiols having 1 to 6 carbon atoms. Specific examples include methanethiol, ethanethiol, 1 propanethiol, 1 butanethiol, 1 pentanethiol, and 1-hexanethiol.
  • thiol derivative examples include alcohols or ethers having the same or different linear alkyl thiol group having 1 to 6 carbon atoms.
  • 2-mercaptoethanol 4 mercapto 1-butanol, 6 mercapto 1 monohexanol, mercaptomethyl ether, 2 mercaptoethyl ether, 3 mercaptopropyl ether, 4-menolecaptobutyl ether, 5-mercaptopentyl ether, 6-Mercaptohexyl ester.
  • the amount of “acrylonitrile scavenger” used depends on the type of oligonucleic acid derivative (30), etc. 2 of each ribose of the oligonucleic acid derivative (30).
  • the amount of 0.8 to 500-fold molar amount is appropriate, preferably 1 to 10-fold molar amount, relative to 2-cyanethoxymethyl protecting the hydroxyl group.
  • Step F Step of removing the 5′-position hydroxyl group of the oligonucleic acid derivative (31) produced in Step F.
  • each B, each Q, and each R are independently the same as defined above.
  • n and R ⁇ Z are as defined above.
  • This step is a reaction that finally removes the protecting group of the 5′-position hydroxyl group of the oligonucleic acid derivative (31), and can be carried out by allowing an acid to act on the oligo RNA cleaved by the solid carrier force. .
  • Examples of the “acid” that can be used in this step include triclonal acetic acid, dichloroacetic acid, and acetic acid.
  • the acid that can be used in this step can also be diluted with an appropriate solvent.
  • the solvent is not particularly limited as long as it does not participate in the reaction, and examples thereof include dichloromethane, acetonitrile, water, a buffer solution having a pH of 2 to 5 or any mixed solvent thereof.
  • Examples of the buffer solution include an acetate buffer solution.
  • the reaction temperature in the above reaction is preferably 20 ° C to 50 ° C.
  • the reaction time of the oligonucleic acid derivative (31) Although it depends on the type, type of acid used, reaction temperature, etc., 1 minute to 1 hour is usually appropriate.
  • the amount of reagent used is based on the oligonucleic acid derivative supported on the solid support.
  • the molar amount is suitably 0.8 to 100 times, preferably 1 to 10 times the molar amount.
  • a step of separating and purifying the oligo RNA (B) produced in step G is a step of separating and purifying the oligo RNA (B) produced in step G.
  • the “separation and purification step” refers to usual separation and purification means from the above reaction mixture, such as extraction, concentration, neutralization, filtration, centrifugation, recrystallization, C-force C reverse phase column chromatography, C
  • Examples of the “elution solvent” include acetonitrile, methanol, ethanol, isopropyl alcohol, water alone, or a mixed solvent in an arbitrary ratio.
  • examples of additives include sodium phosphate, potassium phosphate, sodium chloride salt, potassium salt salt, ammonium acetate, triethylammonium acetate, sodium acetate, acetic acid lithium, Tris-HCl, Ethylenediamine tetraacetic acid can be added at a concentration of lmM to 2M, and the pH of the solution can be adjusted in the range of 1 to 9.
  • an oligo RNA (B) having a desired chain length can be produced.
  • a nucleic acid derivative (23a) in which R 4 3 ⁇ 4 or acyloxy is used or R A nucleic acid derivative (23b) or the like in which 2 is acyl can be used.
  • nucleic acid derivative (23a) in which R 4a is H or acyloxy, or a nucleic acid derivative (23b) in which R 2 is acyl is used as a starting material
  • at least one of the present invention is a nucleic acid monomer compound. It is necessary to use phosphoramidite toy compounds.
  • oligo RNA (B) is isolated and purified by performing step F before performing step E, followed by step E, and then performing step G. It ’s all right.
  • reaction solution is added to the saturated aqueous solution of saturated Japanese hydrogen carbonate hydrogen carbonate and water solution of sodium hydrogen carbonate and extracted with chlorinated methylethylenelene.
  • the dried mixture was dried and dried with anhydrous magnesium sulfate sulfate, and the solvent mixture was distilled off.
  • Construction process 22 55 "—— OO ((44 .. 44 ''-dimethymethoxytoxitricyl)) 22 '' --00-- ((22 Shiyananoetoxixime methylyl) )) Manufacture of uririgidin 33, 1 OO—— ((22 Shishiano-no-Echitill NN .. NN Dizyiisosopropilopyrhofos Phosphorophore)
  • the solution was brought to 0 ° C., 2 mL of THF solution of 10 mg (0.06 mmol) of trifluoromethanesulfonic acid was added and stirred, and then 92 mg (0.4 mmol) of N-dosuccinimide was added and stirred for 1 hour.
  • the reaction solution was filtered through Celite and washed with methylene chloride, and then the organic phase was washed with 1M aqueous sodium hydrogen thiosulfate solution, washed with saturated aqueous sodium hydrogen carbonate solution, dried over anhydrous magnesium sulfate and evaporated. did.
  • Step 1 Making acetylyl-5, -0- (4.4, -dimethoxytrityl) -2, -0- (2-cyanethoxymethyl) cytidine
  • N 4 acetylyl 5, -0- (4, 4, -dimethoxytrityl) cytidine 588 mg (lmmol) is dissolved in 1,2-dichloroethane 4 mL, and diisopropylethylamine 452 mg (3.5 mm ol) is prepared. Then, 365 mg (l.2 mmol) of dibutyltin dichloride was added, and the mixture was reacted at room temperature for 1 hour. Thereafter, the temperature was raised to 80 ° C., and 155.4 mg (l. 3 mmol) of chloromethyl 2-cyanoethyl ether was added dropwise, followed by stirring for 60 minutes.
  • reaction mixture was extracted with saturated aqueous sodium hydrogen carbonate solution with methylene chloride, dried over anhydrous magnesium sulfate, and the solvent was distilled off.
  • the resulting mixture was subjected to 30 g silica gel column chromatography. Purification gave N 4 -acetyl- 5,5-0- (4,4, -dimethoxytrityl) -2, -0- (2-cyanethoxymethyl) cytidine (219 mg; yield 35%).
  • N 4 acetyleno 3,5,1 O tetraisopropyldisiloxane 1,3 diyl
  • cytidine 1.
  • THFlOmL in a mixed solvent 975 mg (3.79 mmol) of silver trifluoromethanesulfonate was added, and molecular sieve 4A was added and dried. Under ice cooling, 370 mg (2.08 mmol) of N bromosuccinimide was added, and the reaction vessel was shielded from light and stirred for 10 minutes.
  • Step 1 N 2 —acetylyl 5, — O— (4.4, -dimethoxytrityl) -2 ′ ⁇ 0—2
  • N 2 acetylyl 5, -0- (4, 4, -dimethoxytrityl) guanosine 627 mg (l mmol) is dissolved in 1,2-dichloroethane 4 mL, and diisopropyl etheramine 452 mg (3.5 mm ol) is prepared. Then, 365 mg (l.2 mmol) of dibutyltin dichloride was added, and the mixture was reacted at room temperature for 1 hour. Thereafter, the temperature was raised to 80 ° C., and 155.4 mg (l. 3 mmol) of chloromethyl 2-cyanoethyl ether was added dropwise, followed by stirring for 60 minutes.
  • Step 2 N 2 —Acetyl-5, — O— (4.4, —Dimethoxytrityl) —2, -0- (2-Cyanethoxymethyl) guanosine 3′—O— (2-Cyanoethyl N.
  • N Diisopropyl Phosphoramidite
  • Step 1 N s —acetylyl-5, —O— (4.4, -dimethoxytrityl) -2′-0
  • Og (36. Om mol) is dissolved in 170 mL of 1,2-dichloroethane and 16.3 g (126 mmol) of diisopropylethylamine Then, 12. lg (39.7 mmol) of dibutyltin dichloride was added and reacted at room temperature for 1 hour. Thereafter, the mixture was stirred at 80 ° C. for 15 minutes, and 4.30 g (36. Ommol) of chloromethyl 2-cyanoethyl ether was added dropwise, followed by stirring for 30 minutes.
  • reaction solution was added to a saturated aqueous sodium hydrogen carbonate solution, extracted with methylene chloride, dried over anhydrous magnesium sulfate, evaporated, and the resulting mixture was purified by silica gel column chromatography. 6 -Acetyl-1,5-0- (4,4,1-dimethoxytrityl) -2, -O- (2-cyanethoxymethyl) adenosine was obtained. (7. 47g; Yield 33%)
  • Step 2 N a —Acetyl— 5′— O— (4.4′-Dimethoxytrityl) —2 ′ ⁇ 0- (2-Cyanethoxymethyl) adenosine 3, 1 O— (2-Cyanoethyl N. N-diisopropyl Phosphoramidite)
  • N 2 full enoki Xia cetyl over 5'- O- (4, 4'- dimethoxytrityl) was dissolved guanosine 720mg of (Lmmol) in 1, 2 Jikuroroetan 4 mL, diisopropyl E chill ⁇ Min 452mg of (3. 5 mmol) was added, Next, 365 mg (l.2 mmol) of dibutyltin dichloride was added and reacted at room temperature for 1 hour. Thereafter, the temperature was raised to 80 ° C., and 55.4 mg (l.3 mmol) of chloromethyl 2-cyanoethyl ether was added dropwise and stirred as it was for 60 minutes.
  • Step 2 N 2 —Phenoxyacetyl- 5′—O— (4.4′-dimethoxytrityl) 2 ′ ⁇ 0- (2-Cyanethoxymethyl) guanosine 3′—O— (2-Cyanoethyl N. N-Diisopropyl Mouth Pill Phosphoramidite Making
  • N 2 phenoxycetyl-5, -0- (4, 4, -dimethoxytrityl) — 2, 1, O— (2 cyanoethoxymethyl) guanosine obtained in Step 1 was mixed with methyl chloride.
  • Dissolve in 4 mL of Len add 128.8 mg (0.996 mmol) of diisopropylethylamine, add 14-1.5 mg (0.598 mmol) of 2-cyanoethyl N, N-diisopropylchlorophosphoramidite, and react at room temperature for 1 hour. . After the reaction, the solvent was distilled off, and the resulting mixture was purified by 3 Og silica gel column chromatography to obtain the target compound (316 mg; yield 79%).
  • New 2 full enoki Xia cetyl-2, -0- (2 Xia Roh ethoxymethyl) guanosine 660 mg (1. 32 mmol) was dried for 30 minutes by azeotropic vacuum pump with pyridine. After dissolving in 9 mL of THF, 2. lg (26.4 mmol) of pyridine and 600 mg of molecular sieves 4A were added under an argon atmosphere and stirred for 10 minutes. To this, 540 mg (l. 58 mmol) of 4,4,1-dimethoxytrityl chloride was added in three portions every hour, and the mixture was further stirred for 1 hour.
  • Step 1 N a —Acetyl 1 3 ′. 5′— O— (Tetraisopropyldisiloxane 1 1.3 Dil) 2′— O Preparation of methylthiomethyladenosine
  • Step 2 N a Asechiru 3 ,. 5'-O- (tetraisopropyldisiloxane 1.3 Jie Le) 2'O-(2-Xia Bruno ethoxymethyl) Preparation of Adenosine
  • reaction mixture was cooled and neutralized by adding triethylamine, diluted with methylene chloride, washed with aqueous sodium thiosulfate and saturated aqueous sodium bicarbonate, dried over anhydrous sodium sulfate, and evaporated.
  • the resulting mixture was purified by silica gel column chromatography to obtain the target compound. (722 mg; 71% yield).
  • nucleic acid monomer compounds 5, —O— (4,4, -dimethoxytrityl) -2, —O— (2—cyanethoxymethyl) uridine 3,1 O— (2 cyanethyl N, N diisopropyl phosphoramidite) , N 4 —acetylyl-5, — O— (4, 4, dimethoxytrityl) -2, — O 1 (2 cyanoethoxymethyl) cytidine 3, —O— (2 cyanoethinole N, N diiso Propyl phosphoramidite), N 6- acetyl--5, —O— (4, 4, -dimethoxytrityl) — 2, —O— (2 cyanoethoxymethinole) adenosine 3, —O— (2 cyanoethinole N, N Diisopropyl phosphoramidite), N 2 —phenoxyacetylyl 5, -0- (4, 4, —dimeth
  • the absorbance (OD) of ultraviolet light with a wavelength of 260 nm was used.
  • the absorbance (OD) was similarly used as the yield of the target compound.
  • Test Example 1 ⁇ —Acetenolay 2 '-0- (2 Cyanethoxymethinole) cytidine
  • the 2'-position hydroxyl group of ribose is protected with 1- (2 cyanoethoxy) ethyl
  • the 3'-position hydroxyl group and the 5'-hydroxyl group are protected with disiloxyl.
  • the target compound could be obtained as a precipitate without performing silica gel column purification.
  • N 2 —Phenoxyacetyl- 2 '-0- (2 Cyanethoxymethyl) guanosine 47 g (63 mmol) of N 2 —Phenoxyacetylyl 3 ,, 5, 1 O— (Tetraisopropyldisiloxane) 1,3 diyl) 2, -0- (2 cyanoethoxymethyl) guanosine was dissolved in 280 mL of acetonitrile, and 15.3 g (95 mmol) of triethylamine trihydrofluoride was added at 35 ° C for 2 hours. Stir.
  • the reaction solution was extracted twice with 100 ml of hexane, 30 ml of water was added to the remaining acetonitrile nitrile layer, and the mixture was stirred at room temperature for 5 minutes.
  • Test Example 3 N a —acetyl-2-, -0- (2-cyanethoxymethyl) adenosine
  • 3 Ribonucleic acid derivatives with low purity and high purity without the need for purification using a silica gel column by the action of a salt of tertiary amine and hydrofluoric acid, or a mixture of tertiary amine and hydrofluoric acid (3) Can be obtained as precipitates.
  • the phosphoramidite compound (A) that can be used for the production of oligo RNA (B) can be produced at low cost.

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Description

核酸保護基の脱離方法
技術分野
[0001] 本発明は、リボースの 2'位水酸基が下記置換基 (I)で保護され、 3'位水酸基と 5' 位水酸基がケィ素保護基で保護されて ヽるリボ核酸誘導体にっ ヽて、リボースの 3 ' 位水酸基と 5'位水酸基のケィ素保護基を除去する方法に関するものである。
[化 1]
*へ^ MG、
( I )
式 (I)中、 WG1は、電子吸引性基を表す。
WG1に係る「電子吸引性基」としては、例えば、シァ入ニトロ、アルキルスルホニル 、ァリールスルホ -ル、ハロゲンを挙げることができる。なかでも、シァノが好ましい。
WG1に係る「アルキルスルホ -ル」の「アルキル」部分としては、例えば、直鎖状又 は分枝鎖状の炭素数 1〜5のアルキルを挙げることができる。具体的には、例えば、メ チル、ェチル、 n プロピル、イソプロピル、 n—ブチル、イソブチル、 sec ブチル、 t ert—ブチル、 n—ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、 tert ペンチルを挙げる ことができる。
WG1に係る「ァリールスルホ -ル」の「ァリール」部分としては、例えば、炭素数 6〜1 2のァリールを挙げることができる。具体的には、例えば、フエ-ル、 1 ナフチル、 2 —ナフチル、ビフエニルを挙げることができる。当該ァリールは置換されていてもよぐ 力かる置換基としては、例えば、ハロゲン、アルキル、アルコキシ、シァ入ニトロを挙 げることができ、これらが任意の位置に 1〜3個置換されていてもよい。
背景技術
[0002] オリゴリボ核酸 (オリゴ RNA)は、遺伝子解析の RNAプローブ、 RNA医薬品素材 ( アンチセンス RNA、リボザィム、 RNAiを利用した遺伝子発現制御）、人工酵素、ァ プタマ一として有用であることは周知である。
オリゴ RNAを製造するための試薬として、リボースの 2'位水酸基が中性条件にお ヽて脱離可能な 2—シァノエトキシメチル（CEM基）で置換されて!、るホスホロアミダ イトィ匕合物が知られている (非特許文献 1)。また、和田らも、オリゴ RNAを製造するた めの試薬として、例えば、 1— (2—シァノエトキシ)ェチル (CEE基)を 2'位の水酸基 に導入したホスホロアミダイトイ匕合物を提供している（非特許文献 2、非特許文献 3)。 該ホスホロアミダイトイ匕合物を製造する過程において、和田らは、リボースの 3'位水 酸基と 5'位水酸基を保護しているジシロキシル基を脱離するために、フッ素化剤 (テ トラブチルアンモ -ゥムフロリド（以下、「TBAF」という。）、トリェチルァミントリヒドロフ 口リド、フッ化水素ピリジン等）と酸 (酢酸、塩酸、硫酸)との任意の混合比の混合試薬 として使用することができることを報告している（特許文献 1)。し力しながら、実施例で は、 TBAFと酢酸との混合試薬を使用してジシロキシル基が脱保護されている例が あるのみである。
また、實吉らは、 2'位水酸基が 2—シァノエチルで置換されたホスホロアミダイトイ匕 合物を製造する過程にぉ 、て、リボースの 3 '位水酸基と 5 '位水酸基を保護して！/、る ジシロキシル基を脱離するため、トリェチルァミントリヒドロフロリドとトリエチルァミンと の 1： 0. 5の混合比の混合試薬を使用することができることを報告して 、る (非特許文 献 4)。 特許文献 1：国際公報 WO2005Z023828 A1パンフレット
非特許文献 1 :大木ら， ORGANIC LETTERS, Vol. 7, 3477 (2005) 非特許文献 2 :和田 猛， BIO INDUSTRY, Vol. 21, No. 1, 17 (2004) 非特許文献 3 :T. Umemotoら， Tetrahedron Letters, Vol. 45, 9529 (2004) 非特許文献 4:實吉尚郎ら， Jornal of Organic Chemistry, 70, 10453 (2005
)
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
本発明の目的は、主として、リボースの 2'位水酸基が下記置換基 (I)で保護され、 3 '位水酸基と 5 '位水酸基がケィ素保護基で保護されて!ヽるリボ核酸誘導体につ!、 て、リボースの 3'位水酸基と 5'位水酸基を保護しているケィ素置換基を、効率よく脱 離する方法を提供することにある。
[化 2]
WG
( I )
式 (I)中、 WG1は、前記と同義である。
課題を解決するための手段
本発明者らは、上記目的を達成するために、鋭意検討した結果、次の一般式（1) で表されるリボ核酸誘導体に、次の一般式（2)で表される 3級ァミンとフッ化水素酸と の塩、又は 3級ァミンとフッ化水素酸との混合物を作用させることによって、次の一般 式 (3)で表されるリボ核酸誘導体を効率よく製造できることを見出し、本発明を完成 するに至った。
[化 3]
、WG1
Figure imgf000005_0001
式（1)、（2)及び (3)中、 Bzは、保護基を有していてもよい核酸塩基又はその修飾 体を表す。 WG1は、前記と同義である。 R7a、 R7b、 R ま、それぞれ同一若しくは異な つて、アルキルを表す力、又は R7a、 R7b、 R7eが隣接する窒素原子と一緒になつて形 成する、 2環性の飽和アミノ環基を表す。 Xは、 1〜30の範囲内にある数を表す。 Aは 、次の一般式 (4a)又は (4b)で表されるケィ素置換基を表す。
[化 4]
Rs R6 R6
S卜 0- Si—
R6 R6 R6
( 4 a ) ( 4 b ) 式 (4a)及び (4b)中、 R6は、アルキルを表す。 Bzに係る「核酸塩基」としては、核酸の合成に使用されるものであれば特に制限さ れず、例えば、シトシン、ゥラシル等のピリミジン塩基、アデニン、グァニン等のプリン 塩基が挙げることができる。
Bzに係る「核酸塩基」は、保護されていてもよぐなかでもアミノ基を有する核酸塩 基、例えば、アデニン、グァニン、シトシンは、ァミノ基が保護されているのが好ましい 。力かる「ァミノ基の保護基」としては、核酸の保護基として使用されるものであれば特 に制限されず、具体的には、例えば、ベンゾィル、 4ーメトキシベンゾィル、ァセチル、 プロピオニル、ブチリル、イソブチリル、フエ二ルァセチル、フエノキシァセチル、 4 t ert ブチルフエノキシァセチル、 4 イソプロピルフエノキシァセチル、 （ジメチルアミ ノ)メチレンを挙げることができる。
Bzの「修飾体」とは、核酸塩基が任意の置換基で置換されている基であり、かかる 置換基としては、例えば、ハロゲン、ァシル、アルキル、ァリールアルキル、アルコキ シ、アルコキシアルキル、ヒドロキシ、アミ入モノアルキルアミ入ジアルキルァミノ、力 ルポキシ、シァ入ニトロを挙げることができ、これらが任意の位置に 1〜3個置換され ている。
Bzの「修飾体」に係る「ハロゲン」としては、例えば、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素を挙 げることができる。
Bzの「修飾体」に係る「ァシル」としては、例えば、直鎖状又は分枝鎖状の炭素数 1 〜6のアルカノィル、炭素数 7〜13のァロイルを挙げることができる。具体的には、例 えば、ホルミル、ァセチル、 n—プロピオ-ル、イソプロピオ-ル、 n—ブチリル、イソブ チリル、 tert—ブチリル、バレリル、へキサノィル、ベンゾィル、ナフトイル、レブリニル を挙げることができる。
Bzの「修飾体」に係る「アルキル」としては、例えば、直鎖状又は分枝鎖状の炭素数 1〜5のアルキルを挙げることができる。具体的には、例えば、メチル、ェチル、 n—プ 口ピル、イソプロピル、 n—ブチル、イソブチル、 sec ブチル、 tert—ブチル、 n—ぺ ンチル、イソペンチル、ネオペンチル、 tert ペンチルを挙げることができる。当該ァ ルキルは置換されていてもよぐ力かる置換基としては、例えば、ハロゲン、アルキル 、アルコキシ、シ了ノ、ニトロを挙げることができ、これらが任意の位置に 1〜3個置換 されていてもよい。
Bzの「修飾体」に係る「ァリールアルキル」、「アルコキシアルキル」、「モノアルキル ァミノ」、「ジアルキルァミノ」及び「アルキルスルホ -ル」の「アルキル」部分は、上記の 「アルキル」と同じものを挙げることができる。
Bzの「修飾体」〖こ係る「アルコキシ」としては、例えば、直鎖状又は分枝鎖状の炭素 数 1〜4のアルコキシを挙げることができる。具体的には、例えば、メトキシ、エトキシ、 n—プロポキシ、イソプロポキシ、 n—ブトキシ、イソブトキシ、 sec—ブトキシ、 tert—ブ トキシを挙げることができる。なかでも炭素数 1〜3のものが好ましぐとりわけメトキシ が好ましい。
Bzの「修飾体」に係る「アルコキシアルキル」の「アルコキシ」部分は、上記の「アルコ キシ」と同じちのを挙げることができる。
Bzの「修飾体」に係る「ァリールアルキル」の「ァリール」としては、例えば、炭素数 6 〜12のァリールを挙げることができる。具体的には、例えば、フエ-ル、 1—ナフチル 、 2—ナフチル、ビフエ-ルを挙げることができる。当該ァリールは置換されていてもよ ぐ力かる置換基としては、例えば、ハロゲン、アルキル、アルコキシ、シァ入ニトロを 挙げることができ、これらが任意の位置に 1〜3個置換されていてもよい。
Bzの「修飾体」に係る「アルキル」、「ァリール」の置換基である「ノヽロゲン」、「アルキ ル」及び「アルコキシ」としては、各々上記と同じものを挙げることができる。
R6に係る「アルキル」としては、例えば、直鎖状又は分枝鎖状の炭素数 1〜5のアル キルを挙げることができる。具体的には、例えば、メチル、ェチル、 n—プロピル、イソ プロピル、 n—ブチル、イソブチル、 sec—ブチル、 tert—ブチル、 n—ペンチル、イソ ペンチル、ネオペンチル、 tert—ペンチルを挙げることができる。
本発明において使用しうる 3級ァミンとフッ化水素酸との塩、又は 3級ァミンとフツイ匕 水素酸との混合物としては、例えば、上記一般式（2)で表される 3級ァミンとフッ化水 素酸との塩、又は適当な溶媒中において 3級ァミンとフッ化水素酸とが任意の比で混 合されたものを挙げることができる。
R7a、 R7b、 R7cに係る「アルキル」としては、 Bzの「修飾体」に係る「アルキル」と同じも のを挙げることができる。 R7a、 R7b、 R7eに係る「2環性の飽和アミノ環基」としては、例えば、キヌタリジン、トリエ チレンジァミンを挙げることができる。
Xは、 1〜30の範囲内にある数を表し、端数であってもよい。好ましくは 2〜15の範 囲内にある数であり、より好ましくは 3〜 10の範囲内にある数である。
本発明に使用する「3級ァミン」として、例えば、トリメチルァミン、トリェチルァミン、ト リプロピルァミン、トリブチルァミン、 N, N—ジイソプロピルェチルァミン、キヌタリジン 、トリエチレンジァミンを挙げることができる。
本発明に係る「3級ァミンとフッ化水素酸との塩」としては、例えば、トリメチルァミント リハイドロフロリド、トリメチルアミンテトラハイド口フロリド、トリメチルァミンペンタハイド口 フロリド、トリメチルァミンへキサハイド口フロリド、トリメチルァミンペンタハイド口フロリド 、トリェチルアミンジハイド口フロリド、トリェチルァミントリハイドロフロリド、トリェチルアミ ンテトラハイド口フロリド、トリェチルァミン 26ノヽイド口フロリド、キヌタリジントリハイドロフ 口リド、トリエチレンジアミンテトラハイド口フロリドを挙げることができる（例えば、 Journ al Molecular Structure, 193, 247 (1989)、 Pol. J. Chem, 67 (2) , 281 (19 93)、 Chem。 Europ. J. , 4 (6) , 1043 (1998)、 J. Fluorine. Chem. , 118 (1— 2) , 123, (2002)を参照）。とりわけ、トリェチルァミントリハイドロフロリドが好ましい。 また、本発明に使用しうる「3級ァミンとフッ化水素酸との混合物」としては、例えば、 上記 3級ァミンとフッ化水素酸とを、適当な溶媒 (例えば、 THF、ァセトニトリル、メタノ ール、イソプロパール、トルエン）中、例えば、 1 : 1〜1 : 30 (3級ァミン：フッ化水素酸） の混合比（モル比）で混合したものを挙げることができる。また、好ましくは 1： 2〜1： 1 5 (3級ァミン:フッ化水素酸)の混合比（モル比）で混合したものであり、より好ましくは 1： 3〜1： 10 (3級ァミン：フッ化水素酸)の混合比（モル比）で混合したものである。 また、本発明として、次の一般式（1)で表されるリボ核酸誘導体に、次の一般式 (2) で表される 3級ァミンとフッ化水素酸との塩、又は 3級ァミンとフッ化水素酸との混合物 を作用させ、リボースの 3 '位水酸基と 5 '位水酸基とを保護して 、るケィ素置換基を 脱離することによって、次の一般式 (3)で表されるリボ核酸誘導体を製造する工程を 含む、下記一般式 (A)で表されるホスホロアミダイト化合物（以下、「ホスホロアミダイト 化合物 (A)」と 、う。 )の製造方法を挙げることができる。 [化 5]
Figure imgf000009_0001
式（1)、（2)及び（3)中、 A、 Bz、 R7a、 R7b、
Figure imgf000009_0002
xは、前記と同義である c [化 6]
Figure imgf000009_0003
(A)
式 (A)中、 Bz、 WG1は、前記と同義である。 R2a、 R2bは、同一若しくは異なって、ァ ルキルを表すか、又は、 R2a、 R2bが隣接する窒素原子と一緒になつて形成する、 5〜 6員の飽和アミノ環基を表す。力かる飽和アミノ環基は、窒素原子の他に環構成原子 として酸素原子又は硫黄原子を 1個有していてもよい。 WG2は、同一又は異なって、 電子吸引性基を表す。 R1は、次の一般式 (5)で表される置換基を表す。
[化 7]
Figure imgf000009_0004
( 5 )
式（5)中、尺11、 R12、 R13は、同一又は異なって、水素又はアルコキシを表す。
1、 R12、 R13に係る「アルコキシ」としては、前記 Bzの修飾体に係る「アルコキシ」と 同じものを挙げることができる。
R2a、 R2bに係る「アルキル」としては、前記 Bzの修飾体に係る「アルキル」と同じもの を挙げることができる。 R2a、 R2bに係る「5〜6員の飽和アミノ環基」としては、例えば、ピロリジン— 1—ィル、 ピぺリジン 1 ィル、モルホリン 1 ィル、チオモルホリン一 1 ィルを挙げること ができる。
WG2に係る「電子吸引性基」としては、前記 WG1〖こ係る「電子吸引性基」と同じもの を挙げることができる。
[0007] ホスホロアミダイトイ匕合物 (A)は、リボースの 2'位水酸基が下記置換基 (I)で保護さ れ、 3 '位水酸基と 5 '位水酸基がケィ素保護基で保護されて ヽるホスホロアミダイトイ匕 合物である。また、 2'位の水酸基に導入された基が直鎖状の置換基であり、 3 '位の 水酸基に結合するリン原子の周りにおける立体が混み合って 、な 、ため、従来から 使用されているホスホロアミダイトイ匕合物と比較して、オリゴ RNAを合成する際、非常 に短時間に縮合反応が進行し、縮合収率がよいという特徴を有する。ホスホロアミダ イトィ匕合物 (A)を使用することにより、オリゴ DNAの製造とほぼ同様の手法を用いて 、高純度のオリゴ RNAの製造が可能である。
[化 8] 。^^
( I ) 式 (I)中、 WG1は、前記と同義である。
[0008] ここで、「オリゴ DNA」とは、デォキシリボ核酸（DNA)のみ力 なるオリゴ核酸を！、う 。また、本発明において「オリゴ RNA」とは、リボ核酸 (RNA)及びデォキシリボ核酸（ DNA)カゝらなるオリゴ核酸であり、少なくとも 1つはリボ核酸 (RNA)を含有するオリゴ 核酸をいう。
[0009] 以下、本発明を詳細に説明する。 発明を実施するための最良の形態
[0010] 以下に示す製法において、原料が反応に影響を及ぼす置換基 (例えば、ヒドロキシ 、アミ入カルボキシ)を有する場合は、原料をあら力じめ公知の方法に従い、適当な 保護基で保護した後に反応を行う。保護基は、最終的に、接触還元、アルカリ処理、 酸処理などの公知の方法に従い保護基を脱離することができる
[0011] I.本発明にカゝかるホスホロアミダイト化合物 (A)の製法
本発明にかかる次の一般式 (A)で表されるホスホロアミダイトイ匕合物 (A)の製造方 法 (以下、「本発明ホスホロアミダイト製造方法」という。）について、以下に詳述する。 ホスホロアミダイト化合物 (A)は、公知化合物又は容易に製造可能な中間体から、 例えば、次の工程 a〜工程 eの操作を実施することにより製造することができる。 以下、詳細に説明する。
[0012] (1)工程 a :
次の一般式 (6)で表されるリボ核酸誘導体にアルキルィ匕試薬を作用させることによ つて、中性条件下において脱離するエーテル型保護基を 2'位の水酸基に導入した 、次の一般式（1)で表されるリボ核酸誘導体を製造する工程。
[化 9]
Figure imgf000011_0001
式（1)及び (6)中、 Bz、 A、 WG1は、前記と同義である。
「アルキル化試薬」として、例えば、次の一般式（11)で表されるエーテルィ匕合物を 挙げることができる。
[化 10] へ^/ WG
式（11)中、 Lは、ハロゲン、ァリールチオ基、アルキルスルホキシド基又はアルキル チォ基を表す。 WG1は、前記と同義である。
Lに係る「ノヽロゲン」、「ァリールチオ基」の「ァリール」、「アルキルスルホキシド基」及 び「アルキルチオ基」の「アルキル」としては、前記 Bzの修飾体に係る「ノヽロゲン」、「ァ リール」、「アルキル」と同じものを挙げることができる。
エーテルィ匕合物（11)の具体例としては、次の 1.〜2.の化合物を挙げることができ る。
1.クロロメチル 2—シァノエチルエーテル
2. 2—シァノエチル メチルチオメチルエーテル
エーテルィ匕合物（11)は、中性条件下にお 、て脱離可能なエーテル型置換基を、 2'位の水酸基に塩基性条件下において導入することができる新規なアルキルィ匕試 薬であり、ホスホロアミダイト化合物 (A)を製造するための試薬として有用である。 エーテルィ匕合物（11)は、次に示す工程 1〜工程 4を実施することにより製造するこ とがでさる。
工程 1 :
次の一般式（13)で表されるアルコール化合物をアルキルチオメチル化し、次の一 般式（14)で表される化合物を製造する工程。
[化 11]
H。〜 R 八。〜
( 1 3 ) ( 1 4 ) 式（13)及び（14)中、 WG1は、前記と同義である。 R3は、アルキル又はァリールを 表す。
化合物（14)は、 Lがアルキルチオ基であるエーテルィ匕合物（11)である。
R3に係る「アルキル」としては、前記 Bzの修飾体に係る「アルキル」と同じものを挙げ ることがでさる。
R3がメチルである場合、アルキルチオメチル化試薬としては、例えば、ジメチルスル ホキシド、無水酢酸及び酢酸の混合溶液を挙げることができる。「ジメチルスルホキシ ド」の使用量は、化合物（13)のモル量に対して、 10〜200倍モル量が適当であり、 2 0〜100倍モル量である。「酢酸」の使用量は、化合物（13)のモル量に対して、 10〜 150倍モル量力 S適当であり、 20〜： LOO倍モル量である。「無水酢酸」の使用量は、ィ匕 合物（13)のモル量に対して、 10〜150倍モル量が適当であり、 20〜： LOO倍モル量 である。反応温度は、 0°C〜100°Cが適当である。反応時間は、使用する原料の種 類、反応温度等によって異なるが、通常 1〜48時間が適当である。
工程 2 :
化合物（14)をハロゲンィ匕し、次の一般式（15)で表される化合物を製造する工程。
[化 12]
R3Sへ^^ ^ X2へ 0^\^1
( " ) ( 1 5 ) 式（14)及び（15)中、
Figure imgf000013_0001
R3は、前記と同義である。 X2は、ハロゲンを表す。 化合物（14)は、エーテルィ匕合物（11)における Lがハロゲンである化合物である。 X2に係る「ノヽロゲン」としては、前記 Bzの修飾体に係る「ノヽロゲン」と同じものを挙げ ることがでさる。
本工程は、公知の方法（例えば、 T. Bennecheら、 Synthesis 762 (1983) )によ り実施することができる。使用する溶媒は、反応に関与しなければ特に限定されない 1S 例えば、ジクロロメタン、クロロホノレム、四塩化炭素、 1, 2—ジクロロェタンなどの ハロゲン系炭化水素を挙げることができる。ハロゲン化試薬としては、例えば、塩化ス ルフリル、ォキシ塩化リンを挙げることができる。「ハロゲンィ匕試薬」の使用量は、化合 物（14)のモル量に対して、 0. 8〜20倍モル量が適当であり、 1〜10倍モル量である o反応温度は、 0°C〜100°Cが適当である。反応時間は、使用する原料の種類、反 応温度等によって異なる力 通常 30分〜 24時間が適当である。
工程 3 :
化合物（ 15)をァリ一ルチオィ匕し、次の一般式（16)で表される化合物を製造するェ 程。
[化 13] χ2へ。〜 R へ〜
( 1 5 ) ( 1 6 )
式（15)及び（16)中、
Figure imgf000013_0002
X2は、前記と同義である。 R3aは、ァリールを表す。 化合物（16)は、エーテルィヒ合物（11)における Lがァリールチオ基である化合物で ある。
R3aに係る「ァリール」としては、前記 Bzの修飾体に係る「ァリール」と同じものを挙げ ることがでさる。
本工程は、公知の方法により実施することができる。使用する溶媒は、反応に関与 しなければ特に限定されないが、例えば、ジクロロメタン、ァセトニトリルを挙げること ができる。ァリールチオ化試薬としては、例えば、チォフエノール、 4 メチルベンゼン チオールを挙げることができる。「ァリールチオィ匕試薬」の使用量は、化合物（15)の モル量に対して、 0. 8〜20倍モル量が適当であり、好ましくは 1〜5倍モル量である o反応温度は、 0°C〜100°Cが適当である。反応時間は、使用する原料の種類、反 応温度等によって異なるが、通常 1〜48時間が適当である。
工程 4 :
化合物（14)を酸ィ匕し、次の一般式（17)で表される化合物を製造する工程。
[化 14] r3s 〜 〜
0
( 1 4 ) ( 1 7 ) 式（14)及び（17)中、
Figure imgf000014_0001
R3は、前記と同義である。
化合物（17)は、エーテルィ匕合物（11)における Lがアルキルスルホキシド基である 化合物である。
R3に係る「アルキル」としては、前記 Bzの修飾体に係る「アルキル」と同じものを挙げ ることがでさる。
本工程は、公知の方法により実施することができる。使用する溶媒は、反応に関与 しなければ特に限定されないが、例えば、ジクロロメタン、クロ口ホルム、メタノールを 挙げることができる。酸化剤としては、例えば、メタクロ口過安息香酸、メタ過ヨウ素酸 塩、過酸ィ匕水素を挙げることができる。「酸化剤」の使用量は、化合物（14)のモル量 に対して、 0. 8〜10倍モル量が適当であり、好ましくは 1〜2倍モル量である。反応 温度は、 0°C〜100°Cが適当である。反応時間は、使用する原料の種類、反応温度 等によって異なる力 通常 1〜48時間が適当である。
[0014] 「アルキル化試薬」として、化合物（15)を使用する場合、以下のように実施すること ができる。
本工程は、公知の方法に従い、市販品として入手可能又は文献記載の方法に従 い合成可能であるリボ核酸誘導体 (6)にアルキル化試薬と塩基とを作用させること〖こ より実施することができる。使用する溶媒は、反応に関与しなければ特に限定されな いが、例えば、ジクロロメタン、クロロホノレム、四塩化炭素、 1, 2—ジクロロエタンなど のハロゲン系炭化水素を挙げることができる。「アルキル化試薬」の使用量は、リボ核 酸誘導体（6)のモル量に対して、 0. 8〜20倍モル量が適当であり、好ましくは 1〜1 0倍モル量である。本工程において、必要に応じて、リボ核酸誘導体 (6)に金属試薬 と塩基を作用させ製造される中間体を経由した後、アルキル化試薬を作用させること もできる。力かる「金属試薬」として、例えば、二塩ィ匕ジブチルスズ、 t—ブチルマグネ シゥムクロライドを挙げることができる。「金属試薬」の使用量は、リボ核酸誘導体 (6) のモル量に対して、 0. 8〜20倍モル量が適当であり、好ましくは 1〜 10倍モル量で ある。「塩基」としては、ピリジン、 2, 6—ジメチルビリジン、 2, 4, 6—トリメチルピリジン 、 N—メチルイミダゾール、トリエチルァミン、トリブチルァミン、 N, N—ジイソプロピル ェチルァミン、 1, 8—ジァザビシクロ [5. 4. 0]— 7—ゥンデセンなどの有機塩基を挙 げることができる。「塩基」の使用量は、リボ核酸誘導体 (6)のモル量に対して、 0. 8 〜20倍モル量が適当であり、好ましくは 1〜 10倍モル量である。反応温度は、 0°C〜 120°Cが適当である。反応時間は、使用する原料の種類、反応温度等によって異な る力 通常 30分〜 24時間が適当である。
[0015] 「アルキル化試薬」として、化合物（14)又は（16)を使用する場合、以下のように実 施することができる。
本工程は、公知の方法（例えば、 M. Matteucci, Tetrahedron Letters, Vol. 31 , 2385 (1990) )に従い、市販品として入手可能又は文献記載の方法に従い合 成可能であるリボ核酸誘導体 (6)に、アルキル化試薬と酸と硫黄原子に対するハロゲ ン化剤とを作用させることにより実施することができる。「アルキル化試薬」の使用量は 、リボ核酸誘導体（6)のモル量に対して、 0. 8〜5倍モル量が適当であり、好ましくは 1〜3倍モル量である。「酸」としては、例えば、トリフルォロメタンスルホン酸、トリフル ォロメタンスルホン酸銀、トリメチルシリルトリフルォロメタンスルホネートを挙げることが できる。「酸」の使用量は、リボ核酸誘導体（6)のモル量に対して、 0. 01〜20倍モル 量が適当であり、好ましくは 0. 02〜10倍モル量である。使用する溶媒は、反応に関 与しなければ特に限定されないが、例えば、ジクロロメタン、クロ口ホルム、四塩化炭 素、 1, 2—ジクロロエタン、ベンゼン、トルエン、キシレン、テトラヒドロフラン（以下、「T HF」という。）、ァセトニトリル又はこれら任意の混合溶媒を挙げることができる。本ェ 程において使用する「硫黄原子に対するハロゲン化剤」として、例えば、 N プロモス クシンイミド (NBS)、 N—ョードスクシンイミド (NIS)を挙げることができる。「硫黄原子 に対するハロゲン化剤」の使用量は、リボ核酸誘導体 (6)のモル量に対して、 0. 8〜 10倍モル量が適当であり、好ましくは 1〜5倍モル量である。反応温度は、 78°C〜 30°Cが適当である。反応時間は、使用する原料の種類、反応温度等によって異なる 力 通常 5分〜 5時間が適当である。
「アルキル化試薬」として、化合物（17)を使用する場合、以下のように実施すること ができる。
本工程は、公知の方法に従い、市販品として入手可能又は文献記載の方法に従 い合成可能であるリボ核酸誘導体 (6)に、アルキルィ匕試薬と酸無水物と塩基とを作 用させること〖こより実施することができる。「アルキルィ匕試薬」の使用量は、リボ核酸誘 導体（6)のモル量に対して、 0. 8〜5倍モル量が適当であり、好ましくは 1〜3倍モル 量である。「酸無水物」としては、例えば、トリフルォロメタンスルホン酸無水物、無水 酢酸を挙げることができる。「酸無水物」の使用量は、リボ核酸誘導体 (6)のモル量に 対して、 0. 01〜20倍モル量が適当であり、好ましくは 0. 02〜10倍モル量である。 塩基としては、例えば、テトラメチルゥレア、コリジンを挙げることができる。「塩基」の 使用量は、リボ核酸誘導体（6)のモル量に対して、 0. 01〜20倍モル量が適当であ り、好ましくは 0. 02〜： L0倍モル量である。使用する溶媒は、反応に関与しなければ 特に限定されないが、例えば、ジクロロメタン、クロ口ホルム、四塩化炭素、 1, 2—ジク ロロエタン又はこれら任意の混合溶媒を挙げることができる。反応温度は、—78°C〜 30°Cが適当である。反応時間は、使用する原料の種類、反応温度等によって異なる 力 通常 5分〜 24時間が適当である。
[0017] (2)工程 b :
工程 aとは別に、リボ核酸誘導体 (6)にジメチルスルホキシドと酢酸と無水酢酸とを 作用させること〖こよって、次の一般式 (7)で表されるリボ核酸誘導体を製造する工程
[化 15]
Figure imgf000017_0001
式 (6)及び（7)中、 A、 Bzは、前記と同義である。
R6に係る「アルキル」としては、前記 Bzの修飾体に係る「アルキル」と同じものを挙げ ることがでさる。
本工程は、公知の方法に従い、市販品として入手可能又は文献記載の方法に従 い合成可能であるリボ核酸誘導体 (6)に、ジメチルスルホキシドと酢酸と無水酢酸と を作用させること〖こより実施することができる。
「ジメチルスルホキシド」の使用量は、リボ核酸誘導体（6)のモル量に対して、 10〜 200倍モル量力適当であり、好ましくは 20〜： L 00倍モル量である。「酢酸」の使用量 は、リボ核酸誘導体（6)のモル量に対して、 10〜150倍モル量が適当であり、好まし くは 20〜： L00倍モル量である。「無水酢酸」の使用量は、リボ核酸誘導体（6)のモル 量に対して、 10〜150倍モル量が適当であり、好ましくは 20〜 100倍モル量である。 反応温度は、 10°C〜50°Cが適当である。反応時間は、使用する原料の種類、反応 温度等によって異なる力 通常 30分〜 24時間が適当である。
[0018] (3)工程 c :
工程 bにお 、て製造されるリボ核酸誘導体（7)に次の一般式 (8)で表されるアルコ 一ルイ匕合物と酸と硫黄原子に対するハロゲン化剤とを作用させることによって、中性 条件下において脱離するエーテル型保護基を 2'位の水酸基に導入した、次の一般 式（1)で表されるリボ核酸誘導体を製造する工程。
Figure imgf000018_0001
式（7)、 （8)及び（1)中、 A、 Bz、 WG1は、前記と同義である。
本工程は、公知の方法に従い、リボ核酸誘導体（7)に、アルコールィ匕合物（8)と酸 と硫黄原子に対するハロゲン化剤とを作用させることにより実施することができる。 使用する溶媒は、反応に関与しなければ特に限定されないが、例えば、ジクロロメ タン、クロ口ホルム、四塩化炭素、 1, 2—ジクロロエタン、ベンゼン、トルエン、キシレン 、 THF、ァセトニトリル又はこれら任意の混合溶媒を挙げることができる。「アルコール 化合物（8)」の使用量は、リボ核酸誘導体（7)のモル量に対して、 0. 8〜20倍モル 量が適当であり、好ましくは 1〜 10倍モル量である。「酸」としては、例えば、トリフルォ ロメタンスルホン酸、トリフルォロメタンスルホン酸銀、トリメチルシリルトリフルォロメタ ンスルホネートを挙げることができる。「硫黄原子に対するハロゲン化剤」としては、例 えば、 N—ブロモスクシンイミド（NBS)、 N—ョードスクシンイミド（NIS)を挙げること 力 Sできる。「硫黄原子に対するハロゲン化剤」の使用量は、リボ核酸誘導体（7)のモ ル量に対して、 0. 1〜20倍モル量が適当であり、好ましくは 0. 2〜10倍モル量であ る。反応温度は、— 100°C〜20°Cが適当である。反応時間は、使用する原料の種類 、反応温度等によって異なるが、通常 5分〜 12時間が適当である。
(4)工程 d:
工程 a又は cにおいて製造されるリボ核酸誘導体（1)に、次の一般式（2)で表される 3級ァミンとフッ化水素酸との塩、又は 3級ァミンとフッ化水素酸との混合物を作用さ せリボースの 3，位水酸基と 5，位水酸基とを保護して ヽるケィ素置換基を脱離するこ とによって、次の一般式 (3)で表されるリボ核酸誘導体を製造する工程。 、WG1
Figure imgf000019_0001
式（1)、（2)及び（3)中、 A、 Bz、 R7a、 R7b、
Figure imgf000019_0002
xは、前記と同義である。 本工程は、リボ核酸誘導体（1)を適当な溶媒に溶解し、上記一般式 (2)のような 3 級ァミンとフッ化水素酸との塩、又は 3級ァミンとフッ化水素酸との混合物を反応させ ること〖こより実施することができる。
また、場合によっては、 3級ァミンとフッ化水素酸との塩、又は 3級ァミンとフッ化水 素酸との混合物に、さらに適当な酸を添加した混合試薬を使用して本工程を実施す ることもできる。使用することができる酸としては、例えば、酢酸、塩酸、硫酸を挙げる ことができる。当該酸の使用量としては、リボ核酸誘導体（1)のモル量に対して、例え ば、 0. 8〜10が適当であり、好ましくは 1〜1. 5である。
使用しうる溶媒としては、例えば、 THF、ァセトニトリル、メタノール、イソプロパール 、トルエンを挙げることができる。特に、 THF、ァセトニトリルが好ましい。
リボ核酸誘導体（1)の種類や用いる 3級ァミンとフッ化水素酸との塩、 3級ァミンとフ ッ化水素酸との混合物、使用する溶媒等によって異なるが、本工程に使用しうる「3級 ァミンとフッ化水素酸との塩、 3級ァミンとフッ化水素酸との混合物」の使用量としては 、リボ核酸誘導体（1)のモル量に対して、 1〜： L0倍モル量が適当であり、好ましくは 1 . 2〜1. 5倍モル量である。反応温度は、 0°C〜80°Cが適当である。反応時間は、リ ボ核酸誘導体の種類や用いる 3級ァミンとフッ化水素酸との塩、 3級ァミンとフッ化水 素酸との混合物、使用する溶媒等によって異なるが、反応温度等によって異なるが、 通常 30分〜 10時間が適当である。
反応終了後、そのまま又は反応混合物に適量の水を加えて冷却することにより、リ ボ核酸誘導体（3)を析出物として得ることができる。添加する水の量としては、使用す る溶媒の量に対して、 0. 05〜5倍量が適当であり、好ましくは 0. 06〜1倍量であり、 より好ましくは 0. 07-0. 1倍量である。 (5)工程 e :
工程 dにおいて製造されるリボ核酸誘導体 (3)の 5'位の水酸基に酸性条件下にお Vヽて脱離する保護基 (R1)を導入する、リボ核酸誘導体（10)を製造する工程。
[化 18]
Figure imgf000020_0001
式（3)、 （9)及び（10)中、 Bz、 R\ WG1は、前記と同義である。 X3は、ハロゲンを 表す。
X3に係る「ノヽロゲン」としては、前記 Bzの修飾体に係る「ノヽロゲン」と同じものを挙げ ることがでさる。
本工程は、公知の方法に従い、リボ核酸誘導体（3)〖こ R 3 (9)を作用させることに より実施することができる。 (9)の使用量は、リボ核酸誘導体（3)のモル量に対し て、 0. 8〜20倍モル量が適当であり、好ましくは 1〜 10倍モル量である。使用する溶 媒は、反応に関与しなければ特に限定されないが、例えば、ァセトニトリル、 THF等 を挙げることができる。「塩基」としては、ピリジン、 2, 6—ジメチルビリジン、 2, 4, 6- トリメチルピリジン、 N—メチルイミダゾール、トリエチルァミン、トリブチルァミン、 N, N —ジイソプロピルェチルァミン、 1, 8—ジァザビシクロ [5. 4. 0]— 7—ゥンデセンなど の有機塩基を挙げることができる。「塩基」の使用量は、リボ核酸誘導体 (3)のモル量 に対して、 0. 8〜20倍モル量が適当であり、好ましくは 1〜 10倍モル量である。反応 温度は、 0°C〜120°Cが適当である。反応時間は、使用する原料の種類、反応温度 等によって異なる力 通常 30分〜 24時間が適当である。 (6)工程 f :
工程 eにおいて製造されるリボ核酸誘導体（10)にホスホロアミダイトイ匕試薬と、必要 に応じて活性化剤とを作用させることによって、 3'位の水酸基がホスホロアミダイトイ匕 されたホスホロアミダイトイ匕合物 (A)を製造する工程。
Figure imgf000021_0001
式（10)及び (A)中、 Bz、
Figure imgf000021_0002
WG2は、前記と同義である。
「ホスホロアミダイトイ匕試薬」としては、例えば、次の一般式（12a)、 （12b)で表され る化合物を挙げることがでさる。
[化 20]
R2b
X1
WG' R21
、
R2a
( 1 2 a ) ( 1 2 b )
2 a
式（12a)及び（12b)中、 R2a、 R2b、 WG2は、前記と同義である。 X1は、ハロゲンを表 す。
X1に係る「ノヽロゲン」としては、前記 Bzの修飾体に係る「ノヽロゲン」と同じものを挙げ ることがでさる。
本工程は、リボ核酸誘導体（10)にホスホロアミダイト試薬を作用させて、 3'位の水 酸基をホスホロアミダイトイ匕する反応であり、公知の方法に従 、実施することができる 。必要に応じて、活性化剤を使用することもできる。使用する溶媒は、反応に関与し なければ特に限定されないが、例えば、ァセトニトリル、 THFを挙げることができる。
「ホスホロアミダイトイ匕試薬」の使用量は、リボ核酸誘導体（10)のモル量に対して、 0 . 8〜20倍モル量が適当であり、好ましくは 1〜10倍モル量である。「活性化剤」とし ては、例えば、 1H—テトラゾール、 5—ェチルチオテトラゾール、 5—べンジルメル力 プトー 1H—テトラゾール、 4, 5—ジクロロイミダゾール、 4, 5—ジシァノイミダゾール、 ベンゾトリアゾールトリフラート、イミダゾールトリフラート、ピリジ-ゥムトリフラート、 N, N—ジイソプロピルェチルァミン、 2, 4, 6—コリジン ZN—メチルイミダゾールを挙げ ることができる。「活性化剤」の使用量は、リボ核酸誘導体（10)のモル量に対して、 0 . 8〜20倍モル量が適当であり、好ましくは 1〜 10倍モル量である。反応温度は、 0 °C〜120°Cが適当である。反応時間は、使用する原料の種類、反応温度等によって 異なるが、通常 30分〜 24時間が適当である。
このようにして、製造されるホスホロアミダイトイ匕合物 (A)は、それ自体公知の手段、 例えば、濃縮、液性変換、転溶、溶媒抽出、結晶化、再結晶、分留、クロマトグラフィ 一により分離精製することができる。
II.オリゴ RNAの製法
ホスホロアミダイトイ匕合物 (A)を使用することによって、次の一般式 (B)で表されるォ リゴ RNA (以下、「オリゴ RNA (B)」という。）を製造することができる。
以下に詳述する。
[化 21]
Figure imgf000022_0001
式 (B)中、各 Bは、それぞれ独立して、核酸塩基又はその修飾体を表す。各 Qは、 それぞれ独立して、 O又は Sを表す。各 Rは、それぞれ独立して、 H、水酸基、ハロゲ ン、アルコキシ、アルキルチオ、アルキルァミノ、ジアルキルァミノ、ァルケ-ルォキシ 、アルケニルチオ、アルケニルァミノ、ジアルケニルアミ入アルキニルォキシ、アルキ 二ルチオ、アルキニルァミノ、ジアルキニルァミノ又はアルコキシアルキルォキシを表 すが、少なくとも 1つは水酸基を表す。 Zは、 H、リン酸基又はチォリン酸基を表す。 n は、 1〜200の範囲内にある整数を表す。
nは、 10〜： L00の範囲内にある整数が好ましぐまた、より好ましくは、 15〜50の範 囲内にある整数である。
Bで表される核酸塩基としては特に限定されるものではなぐ例えば、シトシン、ゥラ シル、チミン等のピリミジン塩基、アデニン、グァニン等のプリン塩基を挙げることがで きる。 Bの「修飾体」とは、核酸塩基が任意の置換基で置換されている基であり、 Bの修飾 体に係る置換基としては、例えば、ハロゲン、ァシル、アルキル、ァリールアルキル、 アルコキシ、アルコキシアルキル、ヒドロキシ、アミ入モノアルキルアミ入ジアルキル アミ入カルボキシ、シァ入ニトロを挙げることができ、これらが任意の位置に 1〜3個 置換されている。
Bの修飾体に係る「ノヽロゲン」、「ァシル」、「アルキル」、「ァリールアルキル」、「アル コキシ」、 「アルコキシアルキル」、 「ァミノ」、 「モノアルキルァミノ」、 「ジアルキルァミノ」 としては、前記 Bzの修飾体に係るそれらと同じものを挙げることができる。
Rに係る「ノヽロゲン」、「アルコキシ」、「アルキルァミノ」又は「ジアルキルァミノ」は、前 記 Bzの修飾体に係るそれらと同じものを挙げることができる。
Rに係る「アルコキシアルキルォキシ」、「アルキルチオ」の「アルキル」としては、前 記 Bzの修飾体に係る「アルキル」と同じものを挙げることができる。
Rに係る「アルコキシアルキルォキシ」の「アルコキシ」としては、前記 Bzの修飾体に 係る「アルコキシ」と同じものを挙げることができる。
Rに係る「ァルケ-ルォキシ」、「ァルケ-ルチオ」、「ァルケ-ルァミノ」、「ジァルケ- ルァミノ」の「ァルケニル」としては、例えば、直鎖状又は分枝鎖状の炭素数 2〜6のァ ルケ-ルを挙げることができる。具体的には、例えば、ビュル、ァリル、 1—プロべ-ル 、イソプロぺニル、 1ーブテニル、 2—ブテニル、 1 ペンテニル、 1一へキセニノレ等を 挙げることができる。
Rに係る「アルキ-ルォキシ」、「アルキ-ルチオ」、「アルキ -ルァミノ」、「ジアルキ -ルァミノ」の「アルキ -ル」としては、例えば、直鎖状又は分枝鎖状の炭素数 2〜4の アルキ-ルを挙げることができる。具体的には、例えば、ェチニル、 2—プロビュル、 1 プチ二ル等を挙げることができる。
ホスホロアミダイト化合物 (A)を用いるオリゴ RNA(B)の製法は、公知の方法に従 い行うことができる力 例えば、次に示す工程 A〜工程 Gの操作を実施することにより 、段階的に 3'から 5'の方向へ核酸モノマー化合物を縮合することにより行うことがで きる。
オリゴ RNA製法において、各 Rのうち少なくとも 1つが水酸基であるオリゴ RNA (B) を製造することができる。例えば、下記工程 Bにおいて、核酸モノマー化合物として全 てホスホロアミダイト化合物 (A)を使用することにより、各 Rが全て水酸基であるオリゴ RNA (B)を製造することができる。
下記工程に使用されている化合物及び試薬のうち、ホスホロアミダイト化合物 (A) 以外については、オリゴ RNA又はオリゴ DNAの合成に一般的に使用されているも のであれば特に限定されない。また、既存の核酸合成試薬を用いた場合と同様、す ベての工程をマニュアル又は市販の DNA自動合成機を用いて製造することができ る。自動合成機で行うことにより操作法の簡便化、また合成の正確性の点カゝら自動合 成機を用いる方法が望ましい。また、下記工程 A〜工程 Gに記載されている化合物 及び試薬のうち、核酸モノマー化合物以外については、オリゴ DNA又はオリゴ RNA の合成に一般的に使用されているものであれば特に限定されない。
(1) X@A:
次の一般式（18)で表される（オリゴ)核酸誘導体に酸を作用させることによって、 5' 位の水酸基の保護基を脱離して、次の一般式（19)で表されるオリゴ核酸誘導体を 製造する工程。
[化 22]
Figure imgf000024_0001
( 1 8 ) ( 1 9 ) 式（18)及び（19)中、各 Qは、それぞれ独立して、前記と同義である。 n、
Figure imgf000024_0002
WG2 は前記と同義である。各 Bxは、それぞれ独立して、保護基を有していてもよい核酸塩 基又はその修飾体を表す。各 R4は、それぞれ独立して、 H、ハロゲン、アルコキシ、 アルキルチオ、アルキルァミノ、ジアルキルァミノ、アルケニルォキシ、アルケニルチ ォ、アルケニルァミノ、ジアルケニルアミ入アルキニルォキシ、アルキニルチオ、アル キ-ルァミノ、ジアルキ-ルアミ入アルコキシアルキルォキシ又は次の一般式（20) で表される置換基を表す。
[化 23]
( 2 0 )
式（20)中、 WG1は、前記と同義である。
Eは、ァシル又は次の一般式（21)で表される置換基を表す。
[化 24]
■ リンカ一卜 相担体 （2 1 ) 式（21)中、 E1は、単結合又は次の一般式（22)で表される置換基を表す。
[化 25]
Figure imgf000025_0001
( 2 2 ) 式（22)中、 Q、 WG2は、前記と同義である。
Tは、 H、ァシルォキシ、ハロゲン、アルコキシ、アルキルチオ、アルキルァミノ、ジァ ルキルァミノ、アルケニルォキシ、アルケニルチオ、アルケニルァミノ、ジァルケニルァ ミ入アルキニルォキシ、アルキニルチオ、アルキニルァミノ、ジアルキニルアミ入ァ ルコキシアルキルォキシ、上記一般式（20)で表される置換基又は上記一般式（21) で表される置換基を表す。但し、 E又は Tのどちらか一方は、置換基（21)を表す。
Bxに係る「核酸塩基」としては、核酸の合成に使用されるものであれば特に制限さ れず、例えば、シトシン、ゥラシル、チミン等のピリミジン塩基、アデニン、グァニン等の プリン塩基を挙げることができる。
Bxに係る「核酸塩基」は、保護されていてもよぐなかでもアミノ基を有する核酸塩 基、例えば、アデニン、グァニン、シトシンは、ァミノ基が保護されているのが好ましい かかる「ァミノ基の保護基」としては、核酸の保護基として使用されるものであれば特 に制限されず、例えば、ベンゾィル、 4ーメトキシベンゾィル、ァセチル、プロピオ-ル 、ブチリル、イソブチリル、フエ二ルァセチル、フエノキシァセチル、 4—tert ブチル フエノキシァセチル、 4 イソプロピルフエノキシァセチル、（ジメチルァミノ）メチレンを 挙げることができる。
Bxの「修飾体」とは、核酸塩基が任意の置換基で置換されている基であり、 Bxの「 修飾体」に係る置換基としては、例えば、ハロゲン、ァシル、アルキル、ァリールアル キル、アルコキシ、アルコキシアルキル、ヒドロキシ、アミ入モノアルキルアミ入ジァ ルキルァミノ、カルボキシ、シァ入ニトロを挙げることができ、これらが任意の位置に 1 〜3個置換されている。
Bxの修飾体に係る「ノヽロゲン」、「ァシル」、「アルキル」、「ァリールアルキル」、「アル コキシ」、「アルコキシアルキル」、「モノアルキルァミノ」、「ジアルキルァミノ」としては、 前記 Bzの修飾体に係るそれらと同じものを挙げることができる。
R4に係る「ノヽロゲン」、「アルコキシ」、「アルキルァミノ」及び「ジアルキルァミノ」とし ては、前記 Bzの修飾体に係るそれらと同じものを挙げることができる。 ては、前記 Bzの修飾体に係る「アルキル」と同じものを挙げることができる。
R4に係る「アルコキシアルキルォキシ」の「アルコキシ」部分としては、前記 Bzの修 飾体に係る「アルコキシ」と同じものを挙げることができる。
R4に係る「ァルケ二ルォキシ」、「ァルケ二ルチオ」、「ァルケニルァミノ」、「ジァルケ
-ルァミノ」の「ァルケ-ル」部分としては、前記 Rに係る「ァルケニル」と同じものを挙 げることがでさる。
R4に係る「アルキ-ルォキシ」、「アルキ-ルチオ」、「アルキ -ルァミノ」、「ジアルキ -ルァミノ」の「アルキ -ル」部分としては、前記 Rに係る「アルキニル」と同じものを挙 げることがでさる。
R4に係る「アルキルァミノ」、「ァルケ-ルァミノ」、「アルキ-ルァミノ」は保護されて いてもよぐ力かる保護基はァミノ基の保護基として使用されるものであれば特に制限 されず、例えば、トリフルォロアセチル、ベンゾィル、 4—メトキシベンゾィル、ァセチル 、プロピオニル、ブチリル、イソブチリル、フエ二ルァセチル、フエノキシァセチル、 4 tert ブチルフエノキシァセチル、 4 イソプロピルフエノキシァセチル、（ジメチルァ ミノ)メチレンを挙げることができる。特に、トリフルォロアセチルが好ましい。
Eに係る「ァシル」としては、前記 Bzの修飾体に係る「ァシル」と同じものを挙げること ができる。
丁の「ァシルォキシ」に係る「ァシル」部分は、前記 Bzの修飾体に係る「ァシル」と同 じちのを挙げることができる。
Tに係る「ノヽロゲン」、「アルコキシ」、「アルキルァミノ」及び「ジアルキルァミノ」として は、前記 Bzの修飾体に係るそれらと同じものを挙げることができる。 は、前記 Bzの修飾体に係る「アルキル」と同じものを挙げることができる。
Tに係る「アルコキシアルキルォキシ」の「アルコキシ」部分としては、前記 Bzの修飾 体に係る「アルコキシ」と同じものを挙げることができる。
Tに係る「ァルケ-ルォキシ」、「ァルケ-ルチオ」、「ァルケ-ルァミノ」、「ジァルケ- ルァミノ」の「ァルケ-ル」部分としては、前記 Rに係る「ァルケ-ル」と同じものを挙げ ることがでさる。
Tに係る「アルキ-ルォキシ」、「アルキ-ルチオ」、「アルキ-ルァミノ」、「ジアルキ- ルァミノ」の「アルキニル」部分としては、前記 Rに係る「アルキ -ル」と同じものを挙げ ることがでさる。
Tに係る「アルキルァミノ」、「ァルケニルァミノ」、「アルキニルァミノ」は保護されて!ヽ てもよぐ力かる保護基はァミノ基の保護基として使用されるものであれば特に制限さ れず、例えば、トリフルォロアセチル、ベンゾィル、 4ーメトキシベンゾィル、ァセチル、 プロピオニル、ブチリル、イソブチリル、フエ二ルァセチル、フエノキシァセチル、 4 t ert ブチルフエノキシァセチル、 4 イソプロピルフエノキシァセチル、（ジメチルアミ ノ)メチレンを挙げることができる。特に、トリフルォロアセチルが好ましい。
本工程は、固相担体に担持された次の一般式（23a)、（23b)で表される核酸誘導 体 (n= lである核酸誘導体（18) )、又は、工程 A〜工程 Dの操作を行うことにより製 造される固相担体に担持されたオリゴ RNA若しくはオリゴ DNA (n= 2〜： LOOである オリゴ核酸誘導体（18) ) (以下、「固相担体に担持されているオリゴ核酸誘導体」とい う。 )に酸を作用させることにより実施することができる。
[化 26]
Figure imgf000028_0001
式（23a)及び（23b)中、 B は、前記置換基（2
Figure imgf000028_0002
1)を表す。 R2は、アシノレオキシを表す。 R4aは、 H、アシノレオキシ、ハロゲン、ァノレコキ シ、アルキルチオ、アルキルァミノ、ジアルキルァミノ、ァルケ-ルォキシ、ァルケ-ル チォ、アルケニルァミノ、ジアルケニルアミ入アルキニルォキシ、アルキニルチオ、ァ ルキニルァミノ、ジアルキ-ルアミ入アルコキシアルキルォキシ又は前記置換基（20 )を表す。
R2、 R4aの「ァシルォキシ」に係る「ァシル」部分としては、前記 Bzの修飾体に係る「 ァシル」と同じものを挙げることができる。
R4aに係る「ノヽロゲン」、「アルコキシ」、「アルキルァミノ」及び「ジアルキルァミノ」とし ては、前記 Bzの修飾体に係るそれらと同じものを挙げることができる。 ては、前記 Bzの修飾体に係る「アルキル」と同じものを挙げることができる。
R4aに係る「アルコキシアルキルォキシ」の「アルコキシ」部分としては、前記 Bzの修 飾体に係る「アルコキシ」と同じものを挙げることができる。
R4aに係る「ァルケ-ルォキシ」、「ァルケ-ルチオ」、「ァルケ-ルァミノ」、「ジァルケ
-ルァミノ」の「ァルケ-ル」部分としては、前記 Rに係る「ァルケニル」と同じものを挙 げることがでさる。
R4aに係る「アルキ-ルォキシ」、「アルキ-ルチオ」、「アルキ -ルァミノ」、「ジアルキ -ルァミノ」の「アルキ -ル」部分としては、前記 Rに係る「アルキニル」と同じものを挙 げることがでさる。
R4aに係る「ァミノ」、「アルキルァミノ」、「ァルケ-ルァミノ」、「アルキ-ルァミノ」は保 護されていてもよぐ力かる保護基はァミノ基の保護基として使用されるものであれば 特に制限されず、例えば、トリフルォロアセチル、ベンゾィル、 4—メトキシベンゾィル 、ァセチル、プロピオニル、ブチリル、イソブチリル、フエ二ルァセチル、フエノキシァセ チル、 4 tert ブチルフエノキシァセチル、 4 イソプロピルフエノキシァセチル、 （ ジメチルァミノ)メチレンを挙げることができる。特に、トリフルォロアセチルが好ましい
「固相担体」としては、例えば、定孔ガラス（controlled pore glass ; CPG)、ォキ サリル化—定孔ガラス（例えば、 Alulら， Nucleic Acids Research, Vol. 19, 15 27 (1991)を参照）、 TentaGel支持体ーァミノポリエチレングリコール誘導体ィ匕支持 体（例えば、 Wrightら， Tetrahedron Letters, Vol. 34, 3373 (1993)を参照）、
Poros ポリスチレン Zジビュルベンゼンのコポリマーを挙げることができる。
「リンカ一」としては、例えば、 3 ァミノプロピル、スクシ-ル、 2, 2'ージエタノール スルホ -ル、ロングチェーンアルキルアミノ（LCAA)を挙げることができる。
核酸誘導体（23a)、核酸誘導体（23b)は、公知の方法に従い製造される又は巿販 品として入手できる固相担体に担持された化合物であり、好ましい態様としては、例 えば、次の一般式（24)、（25)で表される核酸誘導体を挙げることができる。
[化 27]
Figure imgf000029_0001
( 2 4 ) ( 2 5 )
式（24)及び（25)中、 B、 Q、 R\ R4、 WG2は、前記と同義である。
X
R4が置換基（20)である核酸誘導体（24)、 （25)は、ホスホロアミダイト化合物 (A) から公知の方法に従 、製造することができる。 本工程に使用しうる「酸」としては、例えば、トリフルォロ酢酸、ジクロロ酢酸、トリクロ 口酢酸を挙げることができる。本工程に使用しうる酸は、 1〜5%の濃度になるように適 当な溶媒で希釈して使用することもできる。溶媒としては、反応に関与しなければ特 に限定されないが、ジクロロメタン、ァセトニトリル、水又はこれら任意の混合溶媒を挙 げることができる。上記反応における反応温度は、 20°C〜50°Cが好ましい。反応時 間は、（オリゴ)核酸誘導体 (18)の種類、使用する酸の種類、反応温度等によって異 なるが、通常 1分〜 1時間が適当である。使用する試薬の量は固相担体に担持され ているオリゴ核酸誘導体に対して 0. 8〜： LOO倍モル量が適当であり、好ましくは 1〜1 0倍モル量である。
(2)工程 B :
工程 Aにおいて製造されるオリゴ核酸誘導体（19)に、活性化剤を用いて核酸モノ マー化合物を縮合させ、次の一般式 (26)で表されるオリゴ核酸誘導体を製造するェ 程。
[化 28]
Figure imgf000030_0001
( 1 9 ) ( 2 6 )
式（19)及び（26)中、各 B、各 Q、各 R4、各 WG2は、それぞれ独立して、前記と同
X
義である。 E、 n、
Figure imgf000030_0002
Tは、前記と同義である。
本工程は、固相担体に担持されて！ヽるオリゴ核酸誘導体に核酸モノマー化合物と 活性化剤とを作用させることにより実施することができる。
「核酸モノマー化合物」としては、ホスホロアミダイト化合物 (A)又は次の一般式（27 )で表される核酸誘導体を挙げることができる。
Figure imgf000031_0001
( 2 7 )
式 (27)中、 は、保護基を有して
Figure imgf000031_0002
V、てもよ 、核酸塩基又はその修飾体を表す。
B に係る「核酸塩基」としては、核酸の合成に使用されるものであれば特に制限さ
Y
れず、例えば、シトシン、ゥラシル、チミン等のピリミジン塩基、アデニン、グァニン等の プリン塩基を挙げることができる。
B に係る「核酸塩基」は、保護されていてもよぐなかでもアミノ基を有する核酸塩基
Y
、例えば、アデニン、グァニン、シトシンは、ァミノ基が保護されているのが好ましい。 かかる「ァミノ基の保護基」としては、核酸の保護基として使用されるものであれば特 に制限されず、具体的には、例えば、ベンゾィル、 4—メトキシベンゾィル、ァセチル、 プロピオニル、ブチリル、イソブチリル、フエ二ルァセチル、フエノキシァセチル、 4 t ert ブチルフエノキシァセチル、 4 イソプロピルフエノキシァセチル、（ジメチルアミ ノ)メチレンを挙げることができる。
Bの「修飾体」とは、核酸塩基が任意の置換基で置換されている基であり、 Bの「
Y Y
修飾体」に係る置換基としては、例えば、ハロゲン、ァシル、アルキル、ァリールアル キル、アルコキシ、アルコキシアルキル、ヒドロキシ、アミ入モノアルキルアミ入ジァ ルキルァミノ、カルボキシ、シァ入ニトロを挙げることができ、これらが任意の位置に 1 〜3個置換されている。
B の修飾体に係る「ノヽロゲン」、 「ァシル」、 「アルキル」、 「ァリールアルキル」、 「アル γ
コキシ」、 「アルコキシアルキル」、 「モノアルキルァミノ」、 「ジアルキルァミノ」としては、 前記 Bzの修飾体に係るそれらと同じものを挙げることができる。
「活性化剤」としては、前記と同じものを挙げることができる。
反応溶媒としては、反応に関与しなければ特に限定されないが、例えば、ァセトニト リル、 THFを挙げることができる。上記反応における反応温度は、 20°C〜50°Cが好 ましい。反応時間は、オリゴ核酸誘導体 (19)の種類、使用する活性化剤の種類、反 応温度等によって異なるが、通常 1分〜 1時間が適当である。使用する試薬の量は 固相担体に担持されているオリゴ核酸誘導体に対して 0. 8〜： LOO倍モル量が適当で あり、好ましくは 1〜 10倍モル量である。
(3)工程 C :
工程 Bにお 、て未反応であるオリゴ核酸誘導体（ 19)の 5 '位の水酸基をキヤッピン グする工程。
[化 30]
Figure imgf000032_0001
( 1 9 ) ( 2 8 ) 式（19)及び（28)中、各 B、各 Q、各 R4、各 WG2は、それぞれ独立して、前記と同
X
義である。 R5は、メチル、フエノキシメチルを表す。 E、 n、 T、は、前記と同義である。 R 5は、メチル、フエノキシメチル、 tert—ブチルフエノキシメチルを表す。
本工程は、工程 Bにおいて未反応であった 5'位の水酸基を保護する反応であり、 固相担体に担持されているオリゴ核酸誘導体にキャップ化剤を作用することにより実 施することができる。
「キャップ化剤」としては、例えば、無水酢酸、フ ノキシ酢酸無水物又は tert—ブ チルフエノキシ酢酸無水物を挙げることができる。キャップ化剤は、 0. 05〜： LMの濃 度になるように適当な溶媒で希釈して使用することもできる。溶媒としては、反応に関 与しなければ特に限定されないが、ピリジン、ジクロロメタン、ァセトニトリル、 THF又 はこれら任意の混合溶媒を挙げることができる。また、本工程において必要に応じて 、「反応促進剤」として、例えば、 4—ジメチルァミノピリジン、 N—メチルイミダゾールを 使用することができる。上記反応における反応温度は、 20°C〜50°Cが好ましい。反 応時間は、オリゴ核酸誘導体（19)の種類、使用するキャップ化剤の種類、反応温度 等によって異なるが、通常 1分〜 30分が適当である。使用する試薬の量は固相担体 に担持されているオリゴ核酸誘導体に対して 0. 8〜： LOO倍モル量が適当であり、好 ましくは 1〜 10倍モル量である。
(4)工程 D :
工程 Bにおいて製造されるオリゴ核酸誘導体 (26)に酸化剤を作用させることによつ て亜リン酸基をリン酸基又はチォリン酸基に変換する工程。
[化 31]
Figure imgf000033_0001
( 2 6 ) ( 2 9 ) 式（26)及び（29)中、各 B、各 Q、各 R4、各 WG2は、それぞれ独立して、前記と同
X
義である。 E、 n、
Figure imgf000033_0002
Tは、前記と同義である。
本工程は、 3価のリンから 5価のリンに酸化剤を使用して変換する反応であり、固相 担体に担持されているオリゴ核酸誘導体に酸化剤を作用させることにより実施するこ とがでさる。
リンを酸素で酸化する場合には、「酸化剤」として、例えば、ヨウ素、 tert—プチルヒ ドロペルォキシドを使用することができる。該酸化剤は、 0. 05〜2Mの濃度になるよう に適当な溶媒で希釈して使用することができる。反応に使用する溶媒としては、反応 に関与しなければ特に限定されないが、ピリジン、 THF、水又はこれら任意の混合溶 媒を挙げることができる。例えば、ヨウ素 Z水 Zピリジン THFあるいはヨウ素 Zピリ ジン 酢酸や過酸化剤（t ブチルヒドロパーォキシド Zメチレンク口ライドなど）を用 いることがでさる。 また、リンを硫黄で酸ィ匕する場合には、「酸化剤」として、例えば、硫黄、 Beaucage 試薬（3H—1, 2 ベンゾジチオールー3 オン 1, 1 ジォキシド）、 3 アミノー 1 , 2, 4 ジチアゾール—5 チオン (ADTT)を使用することができる。該酸化剤は、 0. 05〜2Mの濃度になるように適当な溶媒で希釈して使用することができる。反応に 使用する溶媒としては、反応に関与しなければ特に限定されないが、例えば、ジクロ ロメタン、ァセトニトリル、ピリジン又はこれら任意の混合溶媒が挙げられる。
反応温度は、 20°C〜50°Cが好ましい。反応時間は、オリゴ核酸誘導体（26)の種 類、使用する酸化剤の種類、反応温度等によって異なるが、通常 1分〜 30分が適当 である。使用する試薬の量は固相担体に担持されているオリゴ核酸誘導体に対して 0. 8〜100倍モル量が適当であり、好ましくは 10〜50倍モル量である。
(5)工程 E :
工程 Dにお 、て製造されるオリゴ核酸誘導体 (29)を固相担体力 切り出し、各核 酸塩基部及び各リン酸基の保護基を脱離する工程。
[化 32]
Figure imgf000034_0001
( 2 9 ) ( 3 0 ) 式（29)及び（30)中、各 Β、各 Β、各 Q、各 R4、各 WG2は、それぞれ独立して、前
X
記と同義である。 E、 R、
Figure imgf000034_0002
n、 T、 Zは、前記と同義である。
切り出し工程は、所望の鎖長のオリゴ RNAを切り出し剤によって、固相担体及びリ ンカーから外す反応であり、所望の鎖長のオリゴ RNAが担持された固体担体に切り 出し剤を添加することにより実施することができる。本工程において、核酸塩基部の 保護基を脱離することができる。
「切り出し剤」としては、例えば、濃アンモニア水、メチルアミン等を挙げることができ る。本工程に使用しうる「切り出し剤」は、例えば、水、メタノール、エタノール、イソプ 口ピルアルコール、ァセトニトリル、 THF又はこれら任意の混合溶媒で希釈して使用 することもできる。なかでも、エタノールが好ましい。
反応温度は、 15°C〜75°Cが適当であり、好ましくは 15°C〜30°Cであり、より好まし くは 18°C〜25°Cである。脱保護反応時間は、 10分〜 30時間が適当であり、好ましく は 30分〜 24時間であり、より好ましくは 1〜4時間である。脱保護に使用される溶液 中の水酸化アンモ-ゥムの濃度は、 20〜30重量0 /0が適当であり、好ましくは 25〜3 0重量％であり、より好ましくは 28〜30重量％である。使用する試薬の量は、固相担 体に担持されているオリゴ核酸誘導体に対して 0. 8〜： LOO倍モル量が適当であり、 好ましくは 10〜 50倍モル量である。 (6)工程 F :
工程 Eにおいて製造されるオリゴ核酸誘導体（30)に、各リボースの 2'位水酸基の 保護基を脱離するための試薬を作用させることによって、次の一般式 (31)で表され るオリゴ核酸誘導体を製造する工程。
[化 33]
Figure imgf000035_0001
( 3 0 ) ( 3 1 ) 式（30)及び（31)中、各 B、各 Q、各 R、各 R4は、それぞれ独立して、前記と同義で ある。 n、 R\ Zは、前記と同義である。
本工程は、オリゴ核酸誘導体 (30)に、 2'位の水酸基の保護基を脱離する試薬を 作用させること〖こより実施することができる。 2'位の水酸基の保護基を脱離する工程 は、「2'位の水酸基の保護基を脱離する試薬」として、例えば、 TBAF、トリェチルァ ミントリハイドロフロリドを作用させることにより行うことができる。使用する「2'位の水酸 基の保護基を脱離する試薬」の量は除去される保護基に対して 1〜500倍モル量が 適当であり、好ましくは 5〜 10倍モル量である。使用する溶媒としては、反応に関与し なければ特に限定されないが、例えば、 THF、 N—メチルピロリドン、ピリジン、ジメチ ルスルホキシド又はこれら任意の混合溶媒を挙げることができる。反応溶媒の使用量 は、「2'位の水酸基の保護基を脱離する試薬」に対して、 0. 8〜： LOO倍モル量が適 当であり、好ましくは 1〜 10倍モル量である。反応温度は、 20°C〜80°Cが好ましい。 反応時間は、オリゴ核酸誘導体 (30)の種類、使用する 2'位の水酸基の保護基を脱 離する試薬の種類、反応温度等によって異なるが、通常 1時間〜 100時間が適当で ある。
必要であれば、本工程における副生成物であるアクリロニトリルを捕捉するため、ァ クリロ-トリルの捕捉剤として、例えば、ニトロアルカン、アルキルァミン、アミジン、チォ ール、チオール誘導体又はこれら任意の混合物を添加することができる。「ニトロアル カン」としては、直鎖状の炭素数 1〜6の-トロアルカンを挙げることができる。具体的 には、例えば、ニトロメタンを挙げることができる。「アルキルァミン」としては、例えば、 直鎖状の炭素数 1〜6のアルキルアミンを挙げることができる。具体的には、例えば、 メチルァミン、ェチルァミン、 n—プロピルァミン、 n—ブチルァミン、 n—ペンチルアミ ン、 n—へキシルァミンを挙げることができる。「アミジン」としては、例えば、ベンズアミ ジン、ホルムアミジンを挙げることができる。「チオール」としては、例えば、直鎖状の 炭素数 1〜6のチオールを挙げることができる。具体的には、例えば、メタンチオール 、エタンチオール、 1 プロパンチオール、 1 ブタンチオール、 1 ペンタンチォー ル、 1—へキサンチオールを挙げることができる。「チオール誘導体」としては、例えば 、同一又は異なる直鎖状の炭素数 1〜6のアルキルチオール基を有するアルコール 又はエーテルを挙げることができる。具体的には、例えば、 2—メルカプトエタノール、 4 メルカプト 1ーブタノール、 6 メルカプト 1一へキサノール、メルカプトメチル エーテル、 2 メルカプトェチルエーテル、 3 メルカプトプロピルエーテル、 4ーメノレ カプトブチルエーテル、 5—メルカプトペンチルエーテル、 6—メルカプトへキシルェ 一テルを挙げることができる。「アクリロニトリルの捕捉剤」の使用量としては、オリゴ核 酸誘導体（30)の種類等によって異なる力 オリゴ核酸誘導体（30)の各リボースの 2 位水酸基を保護している 2 シァノエトキシメチルに対して、 0. 8〜500倍モル量が 適当であり、好ましくは 1〜 10倍モル量である。
上記反応混合物から通常の分離精製手段、例えば、抽出、濃縮、中和、濾過、遠 心分離、再結晶、シリカゲルカラムクロマトグラフィー、薄層クロマトグラフィー、逆層 O DSカラムクロマトグラフィー、イオン交換カラムクロマトグラフィー、ゲノレろ過カラムクロ マトグラフィー、透析、限界ろ過などの手段を用いることにより、 5'位が保護されたオリ ゴ RNAを単離精製することができる。
(7)工程 G :
工程 Fにおいて製造されるオリゴ核酸誘導体 (31)の 5'位の水酸基を脱離するェ 程。
[化 34]
Figure imgf000037_0001
式（31)及び (B)中、各 B、各 Q、各 Rは、それぞれ独立して、前記と同義である。 n 、 R\ Zは、前記と同義である。
本工程は、最終的にオリゴ核酸誘導体 (31)の 5'位の水酸基の保護基を脱離する 反応であり、固体担体力 切り出されたオリゴ RNAに酸を作用させることにより実施 することができる。
本工程において使用しうる「酸」としては、例えば、トリクロ口酢酸、ジクロロ酢酸、酢 酸を挙げることができる。本工程に使用しうる酸は、適当な溶媒で希釈して使用する こともできる。溶媒としては、反応に関与しなければ特に限定されないが、ジクロロメタ ン、ァセトニトリル、水、 pHが 2〜5の緩衝液又はこれら任意の混合溶媒を挙げること ができる。緩衝液としては、例えば、酢酸緩衝液を挙げることができる。上記反応にお ける反応温度は、 20°C〜50°Cが好ましい。反応時間は、オリゴ核酸誘導体（31)の 種類、使用する酸の種類、反応温度等によって異なるが、通常 1分〜 1時間が適当 である。使用する試薬の量は固相担体に担持されているオリゴ核酸誘導体に対して
0. 8〜100倍モル量が適当であり、好ましくは 1〜 10倍モル量である。
[0030] (7) :
工程 Gにお 、て製造されるオリゴ RNA (B)を分離精製する工程。
「分離精製工程」とは、上記反応混合物から通常の分離精製手段、例えば、抽出、 濃縮、中和、濾過、遠心分離、再結晶、 C力 C の逆相カラムクロマトグラフィー、 C
8 18
力も c 逆相カートリッジカラム、陽イオン交換カラムクロマトグラフィー、陰イオン交
8 18
換カラムクロマトグラフィー、ゲルろ過カラムクロマトグラフィー、高速液体クロマトダラ フィ一、透析、限界ろ過などの手段を単独若しくは組み合わせて用いることにより、所 望のオリゴ RNA(B)を単離精製する工程である。
「溶出溶媒」としては、例えば、ァセトニトリル、メタノール、エタノール、イソプロピル アルコール、水の単独溶媒もしくは任意の比率の混合溶媒を挙げることができる。こ の場合添加物として、例えば、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、塩ィ匕ナトリウム、塩ィ匕 カリウム、酢酸アンモ-ゥム、酢酸トリェチルアンモ-ゥム、酢酸ナトリウム、酢酸力リウ ム、トリス塩酸、エチレンジァミン四酢酸を lmM〜2Mの濃度で添カ卩し、溶液の pHを 1〜9の範囲で調整することもできる。
[0031] 工程 A〜工程 Dの操作を繰り返すことにより、所望の鎖長のオリゴ RNA (B)を製造 することができる。なお、本製法においてオリゴ RNA (B)を製造するための出発原料 として、 R4aが置換基 (20)である核酸誘導体 (23a)、 R4 ¾若しくはァシルォキシで ある核酸誘導体（23a)、又は R2がァシルである核酸誘導体（23b)等を使用すること ができる。但し、出発原料として、 R4aが H若しくはァシルォキシである核酸誘導体（2 3a)、又は R2がァシルである核酸誘導体（23b)を使用した場合、核酸モノマー化合 物として、少なくとも 1つは本発明ホスホロアミダイトイ匕合物を使用する必要がある。 また、本製法において、工程 Eの操作を行う前に工程 Fの操作を行い、その後工程 Eの操作を行 、、次 、で工程 Gの操作を行うことによりオリゴ RNA (B)を単離精製す ることちでさる。
実施例 [0032] 以下に実施例を揚げて本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれらのみに限 定されない。
[0033] 参考例 1 クロロメチル 2 シァノエチルエーテル
工程 1 メチルチオメチル 2—シァノエチルエーテルの製造
3 ヒドロキシプロピオ-トリル 32g (450mmol)をジメチルスルホキシド 450mlに溶 解し、無水酢酸 324mL、酢酸 23 lmLを加え室温で 24時間攪拌した。炭酸水素ナト リウム 990gを水 4. 5Lに溶解したものを調製し、これに反応液を一時間かけて滴下し た。そのまま一時間攪拌し、反応液を酢酸ェチルにて抽出し、無水硫酸マグネシウム にて乾燥、溶媒留去し得られた油状物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにて精製 し、無色油状物のメチルチオメチル 2 シァノエチルエーテルを 4 lg得た（収率 70 %)。
'H-NMR CCDCl )： 2. 18 (s, 3H) ; 2. 66 (t, 2H, J = 6. 3Hz) ; 3. 77 (t, 2H,
3
J = 6. 3Hz) ;4. 69 (s, 2H)
工程 2 クロロメチル 2—シァノエチルエーテルの製诰
工程 1で得られたメチルチオメチル 2 シァノエチルエーテル 3. 3g (25mmol)を 70mLの塩化メチレンに溶解させ、氷冷下 2mL (25mmol)の塩化スルフリルを滴下 し、さらに室温にて一時間反応させた。反応後、溶媒を留去し真空中にて蒸留し、 目 的化合物を無色油状物として 2. 5g得た (収率 85%)。
沸点： 84— 85°C (0. 3Torr)
— NMR (CDC1 )： 2. 72 (t, 2H, J = 6. 3Hz) ; 3. 92 (t, 2H, J = 6. 3Hz)； 5
3
. 52 (s, 2H)
[0034] 参考例 2 5，— O— (4. 4，—ジメトキシトリチル） 2，— O— (2 シァノエトキシメチ ル）ゥリジン 3，一 O— (2 シァノエチル N. N ジイソプロピルホスホロアミダイト） 工程 1 5'— O— (4. 4'—ジメトキシトリチル） 2'— O—（2 シァノエトキシメチル) ゥリジンの製造
5，一 O— (4, 4，一ジメトキシトリチル）ゥリジン 546mg (lmmol)を 1, 2 ジクロロェ タン 4mLに溶解し、ジイソプロピルェチルァミン 452mg (3. 5mmol)をカ卩え、ついで 365mg (l. 2mmol)の二塩化ジブチルスズを加えた後、室温で一時間反応した。そ のの後後 8800°°CCににししククロロロロメメチチルル 22 シシァァノノエエチチルルエエーーテテルル 115555.. 44mmgg ((ll.. 33mmmmooll))をを滴滴 下下、、そそののまままま 3300分分間間攪攪拌拌ししたた。。反反応応終終了了後後、、飽飽和和炭炭酸酸水水素素ナナトトリリウウムム水水溶溶液液にに反反応応 液液をを加加ええ塩塩化化メメチチレレンンににてて抽抽出出をを行行いい無無水水硫硫酸酸ママググネネシシウウムムににてて乾乾燥燥、、溶溶媒媒留留去去しし 、、得得らられれたた混混合合物物をを 3300ggののシシリリカカゲゲルルカカララムムククロロママトトググララフフィィーーににてて精精製製しし、、 55''—— OO—— (( 44,, 44，，——ジジメメトトキキシシトトリリチチルル）） 22，，—— OO—— ((22 シシァァノノエエトトキキシシメメチチルル））ゥゥリリジジンンをを得得たた（（1199 77mmgg ;;収収率率 3344%%))。。
—— NNMMRR ((CCDDCC11 ))：： 22.. 4477 ((dd,, IIHH,, JJ == 77.. 88HHzz)) ;; 22.. 6699 ((tt,, 22HH,, JJ == 66.. 33HHzz)) ;; 33
33
.. 5555 ((dddd,, IIHH,, 1111.. 33,, 22.. 22HHzz)) ;; 33.. 6622 ((dddd,, IIHH,, 1111.. 33,, 22.. 22HHzz)) ;; 33.. 8833 ((ss,, 66HH))；； 33.. 8877 ((tt,, 22HH,, JJ == 66.. 33HHzz)) ;;44.. 0077——44.. 0088 ((mm,, IIHH)) ;;44.. 3322 ((dddd,, IIHH,, JJ== 55.. 33,, 11.. 99HHzz)) ;;44.. 5544 ((qq,, IIHH,, JJ == 55.. 33HHzz)) ;;44.. 9944,, 55.. 1111 ((22dd,, 22HH,, JJ == 66.. 99HHzz)) ;; 55.. 3322 ((dd ,, IIHH,, JJ == 88.. 22HHzz)) ;; 66.. 0000 ((dd,, IIHH,, JJ== ll.. 99HHzz)) ;; 66.. 8855—— 66.. 8888 ((mm,, 44HH)) ;; 77.. 2299—— 77.. 4411 ((mm,, 99HH)) ;; 88.. 0022 ((dd,, IIHH,, JJ == 88.. 22HHzz)) ;; 88.. 5533 ((bbrr.. ss,, IIHH))
EESSII--MMaassss :: 665522[[MM ++ NNaa]] ++
工工程程 22 55''——OO （（44.. 44''ーージジメメトトキキシシトトリリチチルル）） 22'' --00-- ((22 シシァァノノエエトトキキシシメメチチルル)) ゥゥリリジジンン 33，，一一 OO—— ((22 シシァァノノエエチチルル NN.. NN ジジイイソソププロロピピルルホホススホホロロアアミミダダイイトト））のの製製 造造
工工程程 11でで得得らられれたた 55，，—— OO—— ((44,, 44，，ーージジメメトトキキシシトトリリチチルル））ーー22，，—— OO——（（22 シシァァノノエエトト キキシシメメチチルル））ゥゥリリジジンン 220099mmgg ((00.. 333322mmmmooll))、、テテトトララゾゾーールル 2233mmgg ((00.. 333322mmmmooll))をを ァァセセトトニニトトリリルル 22mmLLにに溶溶解解しし 115500mmggのの（（00.. 449988mmmmooll))のの 22 シシァァノノエエチチルル NN,, NN,, NN '' ,, NN'' テテトトラライイソソププロロピピルルホホススホホロロジジアアミミダダイイトトをを滴滴下下しし、、 4455°°CCでで 11.. 55時時間間反反応応ささせせたた 。。反反応応後後、、飽飽和和炭炭酸酸水水素素ナナトトリリウウムム水水溶溶液液をを加加ええ酢酢酸酸ェェチチルルににてて抽抽出出しし、、無無水水硫硫酸酸 ママググネネシシウウムムににてて乾乾燥燥、、溶溶媒媒留留去去しし得得らられれたた混混合合物物をを 2200ggののシシリリカカゲゲルルカカララムムククロロママトト ググララフフィィ一一ににてて精精製製しし、、 目目的的化化合合物物をを得得たた（（220000mmgg ;;収収率率 7733%%))。。
EESSII--MMaassss :: 885522[[MM ++ NNaa]] ++
参参考考例例 33 22，，一一 OO——（（22 シシァァノノエエトトキキシシメメチチノノレレ））ゥゥリリジジンン
工工程程 11 33，，.. 55''——OO——((テテトトラライイソソププロロピピルルジジシシロロキキササンン 11.. 33 ジジィィルル））ーー22，，ーー00——（（
Figure imgf000040_0001
33'' ,, 55，，一一 OO—— ((テテトトラライイソソププロロピピルルジジシシロロキキササンン一一 11,, 33 ジジィィノノレレ））ゥゥリリジジンン 115500mmgg ((00.. 3mmol)をアルゴン雰囲気下 THF7mLに溶解し、メチルチオメチル 2 シァノエチ ルエーテル 54mg(0.4mmol)、モレキュラーシーブス 4A100mgをカ卩え、 10分攪拌 した。 0°Cにしトリフルォロメタンスルホン酸 10mg(0.06mmol)の THF2mL溶液を 加え攪拌した後、 N ョードスクシンイミド 92mg(0.4mmol)を加え、 1時間攪拌した 。反応液をセライトろ過し、塩化メチレンにて洗浄した後、有機相を 1Mのチォ硫酸水 素ナトリウム水溶液にて洗浄、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液にて洗浄し、無水硫酸 マグネシウムにて乾燥、溶媒留去した。得られた残渣を薄層クロマトグラフィーにて精 製し、 3', 5，— O— (テトライソプロピルジシロキサン— 1, 3 ジィル）— 2，— O— (2 ーシァノエトキシメチル）ゥリジンを得た（150mg；収率 85%)。
— NMR(CDC1 )： 0.97-1.12(m, 28H) ;2.68— 2.73 (m, 2H) ;3.78
3
-3.86 (m, 1H) ;3.96—4.05 (m, 2H) ;4.12—4.30 (m, 4H) ;5.0— 5.04 (m, 2H) ;5.70 (d, 1H, J = 8.2Hz) ;5.75 (s, 1H) ;7.90 (d, 1H, J = 8.2Hz) ;9.62 (br. s, 1H)
ESI-Mass:570[M + H] +
工程 2 2'— O—（2—シァノエトキシメチル）ゥリジンの製诰
工程 1で得られた 3，， 5，—O—(テトライソプロピルジシロキサン 1, 3 ジィル） 2， -0- (2 シァノエトキシメチル）ゥリジン 200mg(0.35mmol)をメタノール 2mL に溶解し、フッ化アンモ-ゥム 65mg(l.76mmol)をカ卩ぇ 50°Cにて 5時間加熱攪拌 した。放冷後ァセトニトリルを加え攪拌し、ろ過濃縮した。得られた残渣をシリカゲル力 ラムクロマトグラフィーにて精製し、 目的化合物を得た（108mg;収率 94%)。
— NMR(CD OD)： 2.72— 2.76 (t, 2H, J = 6.2Hz) ;3.68— 3.92 (m, 4
3
H) ;4.00-4.03 (m, 1H) ;4.26—4.32 (m, 2H) ;4.81—4.95 (m, 2H) ;5. 71 (d, 1H, J = 8.1Hz) ;6.00 (d, 1H, J = 3.3Hz) ;8.10 (d, 1H, J = 8.1Hz) ESI-Mass:350[M + Na] +
参考例 4 5，— O— (4.4，—ジメトキシトリチル） 2，— O— (2 シァノエトキシメチ ル)ゥリジンの製造
2，— O—（2 シァノエトキシメチル）ゥリジン 14g(43mmol)をピリジンで共沸し真 空ポンプで 30分乾燥した。 THF300mLに溶解し、アルゴン雰囲気下ピリジン 68g( 856mmol)、モレキュラーシーブス 4A20gをカロえ 10分攪拌した。これに 4, 4，一ジメ トキシトリチルクロライド 19. 6g (57. 8mmol)を 3回に分けて 1時間ごとに加え、さらに 1時間攪拌した。メタノール 10mLを加え 2分攪拌した後、セライトろ過し酢酸ェチル にて洗浄した。ろ液を濃縮後、残渣を酢酸ェチルに溶解し、飽和炭酸水素ナトリウム 水溶液と分液した。有機相を飽和塩ィ匕ナトリウム水溶液にて洗浄、無水硫酸マグネシ ゥムにて乾燥後溶媒留去した。得られた残渣をシリカゲルクロマトグラフィーにて精製 し、 目的化合物を得た（26. 5g ;収率 98%)。
参考例 5 ァセチル— 5， -0- (4. 4，—ジメトキシトリチル）—2，— O— (2—シ ァノエトキシメチノレ）シチジン 3 '— O—（2—シァノエチノレ N. N—ジイソプロピノレホ スホロアミダイト）
工程 1 ァセチル— 5， -0- (4. 4，—ジメトキシトリチル）—2， -0- (2—シァ ノエトキシメチル)シチジンの製诰
N4—ァセチルー 5， -0- (4, 4，—ジメトキシトリチル）シチジン 588mg (lmmol) を 1, 2—ジクロロェタン 4mLに溶解し、ジイソプロピルェチルァミン 452mg (3. 5mm ol)をカ卩え、ついで 365mg (l. 2mmol)の二塩化ジブチルスズを加えた後、室温で 一時間反応した。その後 80°Cにしクロロメチル 2—シァノエチルエーテル 155. 4m g (l. 3mmol)を滴下、そのまま 60分間攪拌した。反応終了後、飽和炭酸水素ナトリ ゥム水溶液に反応液をカ卩ぇ塩化メチレンにて抽出を行い無水硫酸マグネシウムにて 乾燥、溶媒留去し、得られた混合物を 30gのシリカゲルカラムクロマトグラフィーにて 精製し、 N4—ァセチル— 5， -0- (4, 4，—ジメトキシトリチル）—2， -0- (2—シァ ノエトキシメチル）シチジンを得た（219mg；収率 35%)。
— NMR (CDC1 )： 2. 19 (s, 3H) ; 2. 56 (d, 1H, J = 8. 8Hz) ; 2. 65 (t, 2H,
3
J = 6. 2Hz) ; 3. 55 (dd, 1H, 10. 5, 2. 5Hz) ; 3. 63 (dd, 1H, 10. 5, 2. 5Hz)； 3. 82 (s, 6H) ; 3. 86 (t, 2H, J = 6. 2Hz) ;4. 09—4. 14 (m, 1H) ;4. 28 (d, 1H , J = 5. 1Hz) ;4. 44—4. 49 (m, 1H) ;4. 97, 5. 24 (2d, 2H, J = 6. 9Hz) ; 5. 9 6 (s, 1H) ; 6. 86 -6. 88 (m, 4H) ; 7. 09 (d, 1H, J = 6. 9Hz) ; 7. 26— 7. 42 (m , 9H) ; 8. 48 (d, 1H, J = 6. 9Hz) ; 8. 59 (br. s, 1H)
ESI-Mass : 693 [M + Na] + 工程 2 ァセチル— 5'— O— (4. 4'—ジメトキシトリチル）—2' -0- (2 シァ ノエトキシメチル）シチジン 3'—O— (2 シァノエチル N. N—ジイソプロピルホス ホロアミダイト）の製造
工程 1で得られた N4—ァセチルー 5， -0- (4, 4，ージメトキシトリチル）ー2， -0 一（2 シァノエトキシメチル） シチジン 205mg (0. 306mmol)を塩化メチレン 2mL に溶解し、ジイソプロピルェチルァミン 105mg (0. 812mmol)をカ卩ぇ 2 シァノエチ ル N, N ジイソプロピルクロ口ホスホロアミダイト 116mg (0. 49mmol)を滴下し、室 温で 1時間反応させた。反応後、溶媒を留去し得られた混合物を 20gのシリカゲル力 ラムクロマトグラフィーにて精製し、 目的化合物を得た（242mg ;収率 91%)。
ESI-Mass : 871 [M + H] +
参考例 6 NA—ァセチノレー 2'— O—（2 シァノエトキシメチノレ）シチジン
工程 1 ァセチルー 3' . 5'— O— (テトライソプロピルジシロキサン一 1. 3 ジィ ル） 2'— O—（2—シァノエトキシメチル）シチジンの製诰
N4 ァセチノレ 3，， 5，一 O （テトライソプロピルジシロキサン 1 , 3 ジィル）シ チジン 1. OOg (l. 89mmol)とメチルチオメチル 2 シァノエチルエーテル 500mg (3. 79mmol)を混合し、トルエン 10mLと THFlOmLの混合溶媒に溶解した。つい でトリフルォロメタンスルホン酸銀 975mg (3. 79mmol)を加え、モレキュラーシーブ ス 4Aを加え、乾燥した。氷冷下、 N ブロモスクシンイミド 370mg (2. 08mmol)をカロ え、反応容器を遮光し、 10分間撹拌した。さらに N—プロモスクシンイミド 70mg (0. 3 9mmol)を追加し、 25分間撹拌した。反応終了後、塩化メチレンを加えて希釈し、飽 和炭酸水素ナトリウム水溶液にて洗浄を行い、無水硫酸ナトリウムにて乾燥、溶媒留 去し、得られた混合物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにて精製し、 N4—ァセチ ルー 3，， 5，一 O— (テトライソプロピルジシロキサン一 1, 3 ジィル）一 2，一 O— (2 シァノエトキシメチル)シチジンを得た。 (936mg；収率 81 %)。
— NMR (CDC1 ) ： 0. 90- 1. 11 (m, 28H) ; 2. 28 (s, 3H) ; 2. 62— 2. 79 (
3
m, 2H) ; 3. 78- 3. 89 (m, 1H) ; 3. 96—4. 04 (m, 2H) ;4. 19—4. 23 (m, 3H ) ;4. 30 (d, 1H, J= 13. 6Hz) ; 5. 00 (d, 1H, J = 6. 8Hz) ; 5. 09 (d, 1H, J=6. 8Hz) ; 5. 77 (s, 1H) ; 7. 44 (d, 1H, J = 7. 5Hz) ; 8. 30 (d, 1H, J = 7. 5Hz) ; 10 . 13 (s, 1H)
ESI-Mass : 611 [M + H] +
工程 2 N ァセチルー 2，—O—（2—シァノエトキシメチノレ)シチジンの製造
工程 1で得られた N4—ァセチノレー 3' , 5' O （テトライソプロピノレジシロキサン 1, 3 ジィル）— 2，— O— (2 シァノエトキシメチル）シチジン 500mg (0. 819mm ol)を THF2. 5mLとメタノール 2. 5mLの混合溶媒に溶解し、フッ化アンモ-ゥム 15 0mg (4. lOmmol)をカ卩え、 50°Cで 4時間反応させた。反応終了後、ァセトニトリルに て希釈、濾過し、溶媒を留去し得られた混合物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー にて精製し、 目的化合物を得た（210mg ;収率 70%)。
— NMR (D O)： 2. 13 (s, 3H) ; 2. 66— 2. 71 (m, 2H) ; 3. 72— 3. 78 (m, 3
2
H) ; 3. 90 (dd, 1H, 13. 0, 2. 6Hz) ;4. 06—4. 11 (m, 1H) ;4. 20 (dd, 1H, J = 7. 1, 5. 2Hz) ;4. 29 (dd, 1H, J = 5. 1, 2. 9Hz) ;4. 83 (d, 1H, J = 7. 2Hz) ;4. 94 (d, 1H, J = 7. 2Hz) ; 5. 95 (d, 1H, J = 2. 9Hz) ; 7. 25 (d, 1H, J = 7. 6 Hz) ; 8. 25 (d, 1H, J = 7. 6Hz)
ESI— Mass : 391 [M + Na] +
[0039] 参考例 7 N^—ァセチル— 5' O— (4. 4'—ジメトキシトリチル）—2' O— (2 シ ァノエトキシメチノレ)シチジンの製诰
2，—O— (2 シァノエトキシメチル）シチジン 9. 9g (26. 8mmol)をピリジンで共沸 し真空ポンプで 30分乾燥した。 THF190mLに溶解し、アルゴン雰囲気下ピリジン 4 3g (538mmol)、モレキュラーシーブス 4A20gをカ卩ぇ 10分攪拌した。これに 4, 4， - ジメトキシトリチルクロライド 11. 8g (34. 9mmol)を 3回に分けて 1時間ごとにカ卩え、さ らに 1時間攪拌した。メタノール 2mLを加え 2分攪拌した後、セライトろ過し酢酸ェチ ルにて洗浄した。ろ液をエバポレーターで濃縮後残渣を酢酸ェチルに溶解し、飽和 炭酸水素ナトリウム水溶液と分液した。有機相を飽和塩ィ匕ナトリウム水溶液にて洗浄 、無水硫酸マグネシウムにて乾燥後溶媒留去した。得られた残渣をシリカゲルクロマ トグラフィ一にて精製し、 目的化合物を得た（15g ;収率 83%)。
[0040] 参考例 8 N2—ァセチル— 5， -0- (4. 4，—ジメトキシトリチル）—2， O— (2 シ ァノエトキシメチル)グアノシン 3，一 O (2 シァノエチル N._N -ジイソプロピル ホスホロアミダイト）
工程 1 N2—ァセチルー 5，— O—（4. 4，ージメトキシトリチル）ー 2' -0-し 2—シァ
Figure imgf000045_0001
N2—ァセチルー 5， -0- (4, 4，—ジメトキシトリチル）グアノシン 627mg (lmmol) を 1, 2—ジクロロェタン 4mLに溶解し、ジイソプロピルェチルァミン 452mg (3. 5mm ol)をカ卩え、ついで 365mg (l. 2mmol)の二塩化ジブチルスズを加えた後、室温で 一時間反応した。その後 80°Cにしクロロメチル 2—シァノエチルエーテル 155. 4m g (l. 3mmol)を滴下、そのまま 60分間攪拌した。反応終了後、飽和炭酸水素ナトリ ゥム水溶液に反応液をカ卩ぇ塩化メチレンにて抽出を行い無水硫酸マグネシウムにて 乾燥、溶媒留去し、得られた混合物を 30gのシリカゲルカラムクロマトグラフィーにて 精製し、 N2—ァセチル— 5， -0- (4, 4，—ジメトキシトリチル）—2， -0- (2—シァ ノエトキシメチル）グアノシンを得た (450mg；収率 63%)。
— NMR (CDC1 )： 1. 92 (s, 3H) ; 2. 47— 2. 51 (m, 2H) ; 2. 68 (br. s, 1H)
3
; 3. 30 (dd, 1H, 10. 7, 3. 8Hz) ; 3. 47 (dd, 1H, 10. 7, 3. 8Hz) ; 3. 55— 3. 6 0 (m, 1H) ; 3. 65- 3. 70 (m, 1H) ; 3. 74, 3. 75 (2s, 6H) ;4. 22—4. 23 (m, 1 H) ;4. 55-4. 58 (m, 1H) ;4. 78, 4. 83 (2d, 2H, J = 7. 0Hz) ; 5. 01 (t, 1H, J = 5. 1Hz) ; 5. 99 (d, 1H, J = 5. 1Hz) ; 6. 76— 6. 79 (m, 4H) ; 7. 17— 7. 44 ( m, 9H) ; 7. 88 (s, 1H) ; 8. 36 (br. s, 1H) ; 12. 06 (br. s, 1H)
工程 2 N2—ァセチル— 5，— O— (4. 4，—ジメトキシトリチル）—2， -0- (2—シァ ノエトキシメチル）グアノシン 3 '— O— (2—シァノエチル N. N—ジイソプロピルホ スホロアミダイト）の製造
工程 1で得られた N2—ァセチルー 5， -0- (4, 4，ージメトキシトリチル）ー2， -0 - (2—シァノエトキシメチル）グアノシン 400mg (0. 563mmol)を塩化メチレン 2mL に溶解し、ジイソプロピルェチルァミン 181mg (l. 4mmol)をカ卩ぇ 2—シァノエチル N, N—ジイソプロピルクロ口ホスホロアミダイト 161mg (0. 68mmol)を滴下し、室温 で 1時間反応させた。反応後、溶媒を留去し得られた混合物を 20gのシリカゲルカラ ムクロマトグラフィーにて精製し、 目的化合物を得た (471mg ;収率 92%)。
参考例 9 Ns—ァセチル— 5，— O— ( 4，—ジメ上キシ HIチル 2，— O— 2—シ. ァノエトキシメチノレ）アデノシン 3，一O— (2—シァノエチノレ N. N—ジイソプロピノレ ホスホロアミダイト）
工程 1 Ns—ァセチル— 5，— O—（4. 4，ージメトキシトリチル）ー 2' -0-し 2—シァ
Figure imgf000046_0001
N6—ァセチル— 5，— O— (4, 4，—ジメトキシトリチル）アデノシン 22. Og (36. Om mol)を 1, 2—ジクロロェタン 170mLに溶解し、ジイソプロピルェチルァミン 16. 3g ( 126mmol)を加え、ついで 12. lg (39. 7mmol)の二塩化ジブチルスズをカ卩えた後 、室温で一時間反応した。その後 80°Cにし 15分間撹拌後、クロロメチル 2—シァノ ェチルエーテル 4. 30g (36. Ommol)を滴下、そのまま 30分間撹拌した。反応終了 後、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液に反応液を加え塩化メチレンにて抽出を行い無 水硫酸マグネシウムにて乾燥、溶媒留去し、得られた混合物をシリカゲルカラムクロ マトグラフィ一にて精製し、 N6—ァセチル一 5， -0- (4, 4，一ジメトキシトリチル） - 2，—O—（2—シァノエトキシメチル）アデノシンを得た。（7. 47g ;収率 33%)
— NMR (CDC1 )： 2. 51 (t, 2H, J = 6. 2Hz) ; 2. 58 (d, 1H, J = 5. 5Hz)； 2
3
. 61 (s, 3H) ; 3. 45 (dd, 1H, J= 10. 7, 4. OHz) ; 3. 54 (dd, 1H, J= 10. 7, 3. 2Hz) ; 3. 62- 3. 79 (m, 2H) ; 3. 79 (s, 6H) ;4. 25 (br. q, 1H, J〜4. 6Hz) ;4 . 59 (q, 1H, J = 5. 2Hz) ;4. 87—4. 94 (m, 3H) ; 6. 23 (d, 1H, J=4. 4Hz) ; 6 . 80-6. 83 (m, 4H) ; 7. 22— 7. 32 (m, 7H) ; 7. 40— 7. 43 (m, 2H) ; 8. 20 (s , 1H) ; 8. 61 (br. s, 1H) ; 8. 62 (s, 1H)
ESI-Mass : 695 [M + H] +
工程 2 Na—ァセチル— 5'— O— (4. 4'—ジメトキシトリチル）—2' -0- (2—シァ ノエトキシメチル）アデノシン 3，一 O— (2—シァノエチル N. N—ジイソプロピルホ スホロアミダイト）の製造
工程 1で得られた N6—ァセチルー 5， -0- (4, 4，ージメトキシトリチル）ー2， -0 — (2—シァノエトキシメチル）アデノシン 10. 0g (14. 4mmol)を塩化メチレン 75mL に溶解し、ジイソプロピルェチルァミン 4. 7g (36mmol)をカ卩ぇ 2—シァノエチル N, N—ジイソプロピルクロ口ホスホロアミダイト 4. 82g (20. 3mmol)を滴下し、室温で 1 時間反応させた。反応後、溶媒を 30mL程度残して留去し得られた反応混合物をシ リカゲルカラムクロマトグラフィーにて精製し、 目的化合物を得た（12. Og;収率 93%
)o
ESI-Mass:895[M + H] +
参考例 10 Na ァセチルー 2， -0- (2 シァノエトキシメチル）アデノシン
工程 1 Na ァセチルー 3，.5'—O—(テトライソプロピルジシロキサン 1.3 ジィ ル） 2'— O—（2—シァノエトキシメチル）アデノシンの製造
N—ョードスクシンイミド 245mg(l.09mmol)とトリフルォロメタンスルホン酸銀 280 mg(l.09mmol)を塩化メチレン 8mLに懸濁させ、モレキュラーシーブス 4Aをカロえ 、乾燥した。ここに、 N6 ァセチルー 3，， 5， -0- (テトライソプロピルジシロキサン一 1, 3 ジィル）アデノシン 400mg(0.73mmol)とメチルチオメチル 2 シァノエチ ルエーテル 145mg(l. llmmol)を塩化メチレン 4mLに溶解し、氷冷下で加えた。 そのまま 3時間撹拌した。反応終了後、塩化メチレンを加えて希釈し、チォ硫酸ナトリ ゥム水溶液と飽和炭酸水素ナトリウム水溶液にて洗浄を行 、、無水硫酸マグネシウム にて乾燥、溶媒留去し、得られた混合物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにて精 製し、 N6 ァセチルー 3，， 5，— O— (テトライソプロピルジシロキサン— 1, 3 ジィル ) -2' -0- (2 シァノエトキシメチル）アデノシンを得た。（201mg;収率 45%) — NMR(CDC1 )： 0.98-1.11 (m, 28H) ;2.62(s, 3H) ;2.69 (td, 2H,
3
6.5, J=l.5Hz) ;3.81-3.89 (m, 1H) ;4.02—4.09 (m, 2H) ;4.17(d, 1
H, J = 9.4Hz) ;4.28 (d, 1H, J=13.4Hz) ;4.50 (d, 1H, J=4.5Hz) ;4.67( dd, 1H, J = 8.8, 4.5Hz) ;5.02 (d, 1H, J = 7.0Hz) ;5.08 (d, 1H, J = 7. OH z) ;6. 10(s, 1H) ;8.34 (s, 1H);8.66 (s, 1H);8.67(s, 1H)
ESI-Mass:636[M + H] +
工程 2 Na—ァセチル一 2，一 O— (2—シァノエトキシメチル)アデノシンの製造
工程 1で得られた N6 ァセチルー 3，， 5， -0- (テトライソプロピルジシロキサン
I, 3 ジィル）一 2，一 O— (2 シァノエトキシメチル）アデノシン 300mg(0.47mm ol)を、酢酸 0. lmLと 0.5MTBAFの THF溶液 2mLの混合溶液に溶解し、室温で 2時間撹拌した。反応終了後、得られた反応混合物をシリカゲルカラムクロマトグラフ ィ一にて精製し、 目的化合物を得た。（160mg;収率 86%)。 H-NMR (DMSO-d6)： 2. 25 (s, 3H) ; 2. 53— 2. 68 (m, 2H) ; 3. 41— 3. 46 (m, 1H) ; 3. 56— 3. 64 (m, 2H) ; 3. 69— 3. 73 (m, 1H) ;4. 00—4. 01 (m , 1H) ;4. 36-4. 37 (m, 1H) ;4. 72—4. 78 (m, 3H) ; 5. 20 (bt, 2H) ; 5. 41 ( d, 1H, J = 5. 2Hz) ; 6. 17 (d, 1H, J = 5. 7Hz) ; 8. 66 (s, 1H) ; 8. 72 (s, 1H) ; 1 0. 72 (s, 1H)
ESI-Mass :415 [M + Na] +
[0043] 参考例 11 Ns ァセチルー 5，—O— (4. 4，ージメトキシトリチル）ー2，—O—（2—
N6 ァセチルー 2，— O— (2 シァノエトキシメチル）アデノシン 9. 50g (24. 2mm ol)を脱水ピリジン lOOmLに溶解し、濃縮して乾燥した後、アルゴン雰囲気下、脱水 ピリジン lOOmLに溶解した。氷冷下、 4, 4，—ジメトキシトリチルクロリド 10. 7g (31. 2mmol)を加え、室温で 1時間 20分反応した。反応終了後、塩化メチレンにて希釈し 、水にて洗浄を行い無水硫酸ナトリウムにて乾燥、溶媒留去し、得られた混合物をシ リカゲルカラムクロマトグラフィーにて精製し、 目的化合物を得た。 (13. 8g ;収率 82 %)
[0044] 参考例 12 N2—フエノキシァセチル一 5' -0- (4. 4'—ジメトキシトリチル） 2' - O—（2 シァノエトキシメチノレ）グアノシン 3 '— O—（2 シァノエチノレ N. N ジィ ソプロピルホスホロアミダイト）
工程 1 N2—フエノキシァセチルー 5' -0- (4. 4'ージメトキシトリチル） 2' -0-
N2 フエノキシァセチルー 5'— O— (4, 4'—ジメトキシトリチル）グアノシン 720mg (lmmol)を 1, 2 ジクロロェタン 4mLに溶解し、ジイソプロピルェチルァミン 452mg (3. 5mmol)を加え、ついで 365mg (l. 2mmol)の二塩化ジブチルスズをカ卩えた後 、室温で一時間反応した。その後 80°Cにしクロロメチル 2 シァノエチルエーテル 1 55. 4mg (l . 3mmol)を滴下、そのまま 60分間攪拌した。反応終了後、飽和炭酸水 素ナトリウム水溶液に反応液を加え塩化メチレンにて抽出を行い無水硫酸マグネシ ゥムにて乾燥、溶媒留去し、得られた混合物を 30gのシリカゲルカラムクロマトグラフィ 一にて精製し、 N2—フエノキシァセチル— 5， -0- (4, 4，—ジメトキシトリチル）—2 '-Ο- (2 シァノエトキシメチル）グアノシンを得た（384mg;収率 48%)。
— NMR(CDC1 )： 2.47-2.51 (m, 2H) ;2.58 (br. s, 1H) ;3.42 (dd, 1
3
H, 10.1, 3.8Hz) ;3.46 (dd, 1H, 10.1, 3.8Hz) ;3.53— 3.57 (m, 1H) ;3 .69-3.73 (m, 1H) ;3.77(s, 6H) ;4.24—4.26 (m, 1H) ;4.48—4.50 (m , 1H) ;4.61-4.65 (m, 2H) ;4.83, 4.87 (2d, 2H, J=7.0Hz) ;4.88 (t, 1 H, J = 5.7Hz) ;6.05 (d, 1H, J = 5.7Hz) ;6.80— 6.82 (m, 4H) ;6.92— 6. 96 (m, 3H) ;7.07— 7.11 (m, 2H) ;7.20— 7.42 (m, 9H) ;7.84 (s, 1H) ;8. 99 (s, 1H) ;11.81 (br. s, 1H)
ESI-Mass:825[M + Na] +
工程 2 N2—フエノキシァセチルー 5'—O—（4.4'ージメトキシトリチル） 2' -0- (2—シァノエトキシメチル）グアノシン 3'— O— (2—シァノエチル N. N—ジイソプ 口ピルホスホロアミダイトの製诰
工程 1で得られた N2—フエノキシァセチルー 5， -0- (4, 4，ージメトキシトリチル） — 2，一 O— (2 シァノエトキシメチル）グアノシン 320mg(0.399mmol)を塩化メチ レン 4mLに溶解し、ジイソプロピルェチルァミン 128.8mg(0.996mmol)を加え 2 —シァノエチル N, N—ジイソプロピルクロ口ホスホロアミダイト 141.5mg(0.598m mol)を滴下し、室温で 1時間反応させた。反応後、溶媒を留去し得られた混合物を 3 Ogのシリカゲルカラムクロマトグラフィーにて精製し、 目的化合物を得た（316mg;収 率 79%)。
ESI-Mass:1003[M + H] +
参考例 13 N2—フエノキシァセチルー 2' -0- (2 シァノエトキシメチル）グアノシ 工程 1 N2—フエノキシァセチルー 3'.5' -0- (テトライソプロピルジシロキサン 1 .3 ジィル） 2'— O—（2 シァノエトキシメチル）グアノシンの製造
N2 フエノキシァセチルー 3', 5，一 O— (テトライソプロピルジシロキサン一 1, 3- ジィル）グアノシン 2.0g(3. Ommol)を THF16mLに溶解し、メチルチオメチル 2 —シァノエチルエーテル 0.99g(7.6mmol)、モレキュラーシーブス 4A1. Ogをカロ え、アルゴン雰囲気下— 45°Cで 10分攪拌した。トリフルォロメタンスルホン酸 0.68g (4.5mmol)の THF5mL溶液をカ卩ぇ攪拌した後、 N—ョードスクシンイミド 1.02g(4 .5mmol)を加え、 15分攪拌した。反応液に飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加え、 ろ過後酢酸ェチルにて抽出、有機相を 1Mのチォ硫酸水素ナトリウム水溶液にて洗 浄、水、次いで飽和塩ィ匕ナトリウム水溶液にて洗浄し、無水硫酸マグネシウムにて乾 燥、溶媒留去した。得られた残渣をシリカゲルクロマトグラフィーにて精製し、 N2—フ エノキシァセチノレ一 3，， 5，一 O— (テトライソプロピルジシロキサン一 1, 3—ジィル） -2'-0- (2—シァノエトキシメチル）グアノシンを得た（2. Og;収率 89%)。
— NMR(CDC1 )： 0.99-1.11 (m, 28H) ;2.59— 2.77 (m, 2H) ;3.82
3
—4.05 (m, 3H) ;4.15 (d, 1H, J = 9.3Hz) ;4.25—4.35 (m, 2H) ;4.52—4 .56 (dd, 1H, J = 9.3, 4.3Hz) ;5.00, 5.07 (2d, 2H, J=7.2Hz) ;5.95(s, 1H)6.99-7.12(m, 3H) ;7.35— 7.40 (m, 2H) ;8.09 (s, 1H) ;9.38 (br. s , 1H) ;11.85 (br. s, 1H)
ESI-Mass:766[M + Na] +
工程 2 N2—フエノキシァセチルー 2'—O—（2—シァノエトキシメチル）グアノシンの 製诰
1MTBAF/THF溶液 2.83mL(2.83mmol)に酢酸 0.14mL(0.14mmol)を 加えた溶液を調整する。工程 1で得られた N2—フエノキシァセチル— 3，， 5，— O— ( テトライソプロピルジシロキサン一 1, 3—ジィル） -2' -0- (2—シァノエトキシメチ ル）グアノシン 1.0g(l.35mmol)を THF2.83mLに溶解し、上で調整した溶液を 加えアルゴン雰囲気下室温で 1時間攪拌した。反応液を減圧下濃縮後、塩化メチレ ンに溶解しシリカゲルクロマトグラフィーにのせ精製し、 目的化合物を得た。 (0.67g; 収率 99%)。
— NMR(DMSO— d6)： 2.59— 2.66 (m, 2H) ;3.41— 3.63 (m, 4H) ;3. 98 (m, 1H) ;4.32 (m, 1H) ;4.58—4.62 (t, 1H, J = 5.3Hz) ;4.71—4.78 ( dd, 2H, J=13. 1, 6.8Hz) ;4.87(s, 2H) ;5.12(s, 1H)5.37 (s, 1H) ;5.97 (d, 1H, J = 6. lHz)6.96-6.99 (m, 3H) ;7.28— 7.34 (m, 2H) ;8.30 (s, 1 H) ;11.78 (br. s, 2H)
ESI-Mass:500[M-H]" [0046] 参考例 14 N2—フエノキシァセチル— 5，— O— ( 4，—ジメ キシト JJチル 1— 2，— ,
Figure imgf000051_0001
Ν2 フエノキシァセチルー 2， -0- (2 シァノエトキシメチル）グアノシン 660mg ( 1. 32mmol)をピリジンで共沸し真空ポンプで 30分乾燥した。 THF9mLに溶解し、 アルゴン雰囲気下ピリジン 2. lg (26. 4mmol)、モレキュラーシーブス 4A600mgを 加え 10分攪拌した。これに 4, 4，一ジメトキシトリチルクロライド 540mg (l. 58mmol) を 3回に分けて 1時間ごとに加え、さらに 1時間攪拌した。メタノール 2mLをカ卩ぇ 2分 攪拌した後、セライトろ過し酢酸ェチルにて洗浄した。ろ液をエバポレーターで濃縮 後残渣を酢酸ェチルに溶解し、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液と分液した。有機相を 飽和塩化ナトリウム水溶液にて洗浄、無水硫酸マグネシウムにて乾燥後溶媒留去し た。得られた残渣をシリカゲルクロマトグラフィーにて精製し、 目的化合物を得た (80 Omg ;収率 75%)。
[0047] 参考例 15 Ns—ァセチル一 3' . 5'— O— (テトライソプロピルジシロキサン一 1. 3— ジィル）— 2，— O— (2—シァノエトキシメチル）アデノシン
工程 1 Na—ァセチル一 3' . 5'— O— (テトライソプロピルジシロキサン一 1. 3 ジィ ル） 2'— O メチルチオメチルアデノシンの製诰
N6 ァセチルー 3，， 5，— O— (テトライソプロピルジシロキサン— 1, 3 ジィル）ァ デノシン 2. OOg (3. 62mmol)をジメチルスルホキシド 25mLに溶解し、無水酢酸 17 . 5mL、酢酸 12. 5mLをカ卩ぇ室温で 14時間撹拌した。反応終了後、水 200mLに反 応液を加え、酢酸ェチルにて抽出を行い、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液にて洗浄 を行い、無水硫酸ナトリウムにて乾燥、溶媒留去し、得られた混合物をシリカゲルカラ ムクロマトグラフィーにて精製し、 N6 ァセチルー 3，， 5， -0- (テトライソプロピルジ シロキサン— 1, 3 ジィル）—2，—Ο—メチルチオメチルアデノシンを得た。 （1. 36g ；収率 61%)
— NMR (CDC1 )： 0. 96 - 1. 11 (m, 28H) ; 2. 20 (s, 3H) ; 2. 61 (s, 3H)；
3
4. 03 (dd, 1H, J= 13. 4, 2. 4Hz) ;4. 18 (d, 1H, J = 9. 1Hz) ;4. 27 (d, 1H, J = 13. 4Hz) ;4. 63-4. 71 (m, 2H) ; 5. 00 (d, 1H, J= l l. 5Hz) ; 5. 07 (d, 1H , J= l l. 5Hz) ; 6. 09 (s, 1H) ; 8. 31 (s, 1H) ; 8. 65 (s, 1H) ; 8. 69 (s, 1H) ESI-Mass : 635 [M + Na]
工程 2 Na ァセチルー 3，. 5'—O—(テトライソプロピルジシロキサン 1. 3 ジィ ル） 2'— O—（2—シァノエトキシメチル）アデノシンの製造
工程 1で得られた N6 ァセチルー 3，， 5， -0- (テトライソプロピルジシロキサン 1, 3 ジィル）—2，—Ο—メチルチオメチルアデノシン 1. 00g (l. 63mmol)を、 TH F25mLに溶解した。 3 ヒドロキシプロピオ-トリル 5. 88g (82. 7mmol)をカ卩え、モ レキユラーシーブス 4Aをカ卩えて乾燥し、— 45°Cに冷却した。 N ョードスクシンイミド 440mg (l. 96mmol)を加え、ついでトリフルォロメタンスルホン酸 490mg (3. 26m mol)を加えた後、 45°Cで 15分間撹拌した。反応終了後、冷却したままトリェチル アミンを加えて中和し、塩化メチレンにて希釈、チォ硫酸ナトリウム水溶液と飽和炭酸 水素ナトリウム水溶液にて洗浄を行い、無水硫酸ナトリウムにて乾燥、溶媒留去し、得 られた混合物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにて精製し、 目的化合物を得た。 ( 722mg ;収率 71%)。
参考例 16 シチジリル一「3 '→5 Ί ゥリジリル一「3 '→5 Ί ゥリジリル一「3 '→5 Ί アデ二リル一「3'→5Ί—シチジリル一「3'→5Ί—グァニリル一「3'→5Ί—シチ ジリル一「3，→5 Ί ゥリジリル一「3，→5 Ί グァニリル一「3，→5 Ί アデ二リル 「3，→5 Ί グァニリル一「3，→5 Ί ゥリジリル一「3，→5 Ί アデ二リル一「3，→5 ' 1 シチジリル一「3 '→5 Ί ゥリジリル一「3 '→5 Ί ゥリジリル一「3 '→5 Ί—シチ ジリルー「3，→5Ί—グァニリル一「3，→5，1 アデ二リル一「3，→5，1ーゥリジンの 製诰
市販の 2，/3，—Ο ベンゾィル—5，— Ο— (4, 4，—ジメトキシトリチル）ゥリジンを 担持した CPG固相担体（37mg, 1 μ mol)をグラスフィルター付きカラムに入れ、核 酸自動合成機 (Expedite™：アプライドバイォシステムズ社)を使用して、標記化合 物のオリゴ RNAの合成を行った。
核酸モノマー化合物として、 5，— O— (4, 4，ージメトキシトリチル）ー2，— O— (2— シァノエトキシメチル）ゥリジン 3，一 O— (2 シァノエチル N, N ジイソプロピル ホスホロアミダイト）、 N4—ァセチル— 5，— O— (4, 4，—ジメトキシトリチル）—2，— O 一（2 シァノエトキシメチル）シチジン 3，—O—（2 シァノエチノレ N, N ジイソ プロピルホスホロアミダイト）、 N6 ァセチル— 5，— O— (4, 4，—ジメトキシトリチル） — 2，— O— (2 シァノエトキシメチノレ）アデノシン 3，— O— (2 シァノエチノレ N, N ジイソプロピルホスホロアミダイト）、 N2—フエノキシァセチルー 5， -0- (4, 4， —ジメトキシトリチル） 2，一 O— (2 シァノエトキシメチル）グアノシン 3，一 O— (2 —シァノエチル N, N—ジイソプロピルホスホロアミダイト）を、縮合触媒として 5—ェ チルチオテトラゾールを、酸化剤としてヨウ素溶液を、キヤッビング溶液としてフエノキ シ酢酸無水物と N—メチルイミダゾール溶液を使用した。核酸モノマー化合物を 19 回縮合させた後、固相上で、 5'末端の水酸基の保護基の除去を行った後、切り出し 剤として、濃アンモニア水—エタノール混合液（3 : 1)を用いて、 40°C、 4時間かけて CPG固相担体からの切り出し及び各リン酸部位の保護基の脱離反応及び塩基の保 護基の除去を行った。反応混合物を減圧下、濃縮後、 10%の nn-—プロピルアミン 、 0. 6% のビス（2 メルカプトェチル）エーテルを含む 1Mのテトラブチルアンモ- ゥムフルオリドの THF溶液を用いて室温 1時間反応し、 2'位の水酸基の保護基を脱 離した。溶液を脱塩処理後、 DEAE—イオン交換榭脂 (TOYOPEARL DEAE— 650)にて精製し、高純度の目的化合物を得た（1120D ；収率 58%)。
260
ここで、 目的化合物の収量として、波長 260nmの紫外線の吸光度 (OD )を用い
260 た。以下、同様に吸光度 (OD )を目的化合物の収量とした。
260
MALDI—TOF— MS :計算値 6305. 9 [Μ + ΗΓ
実測値 6304. 8 [Μ+Η] +
試験例 1 Ν —ァセチノレー 2' -0- (2 シァノエトキシメチノレ）シチジン
50g (95mmol)の Ν4—ァセチルー 3，， 5，一 O— (テトライソプロピルジシロキサン - 1, 3 ジィル）シチジンを 500mL (142mmol)の THFに溶解し、 18. 64gのメチ ルチオメチル 2 シァノエチルエーテル、 40gのモレキュラーシーブス 4Aを加え、 アルゴン雰囲気下、 45°Cで 30分攪拌した。 21. 41g (142mmol)のトリフルォロメ タンスルホン酸を滴下した後、 31. 97g (142mmol)の N ョードスクシンイミドをカロえ 、 30分攪拌した。反応液にトリヱチルァミン 80mlを加え、ろ過後、酢酸ヱチルにて抽 出、有機層を 1Mのチォ硫酸水素ナトリウム水溶液、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液 、次いで飽和塩ィ匕ナトリウム水溶液にて洗浄し、無水硫酸ナトリウムにて乾燥、溶媒 "^^έした。
得られた残渣を 300mLの THFに溶解し、 18. 3g (110mmol)のトリエチルァミント リヒドロフロリドを加え 45°Cで 2時間攪拌した。生じた析出物を吸引ろ過にて回収し、 冷却した THFで洗浄、乾燥し目的化合物を得た。 (27g；収率 78%)。
ESI-Mass : 391. 3 [M + Na] +
[表 1]
Figure imgf000054_0001
リボースの 2'位水酸基が 1一（2 シァノエトキシ)ェチルで保護され、 3 '位水酸基 と 5 '水酸基がジシロキシルで保護されて 、るシチジン誘導体にぉ 、て、トリェチルァ ミントリヒドロフロリドを使用して、 3 '位水酸基と 5 '水酸基を保護して 、るジシロキシル を脱保護すると、シリカゲルカラム精製を行うことなく析出物として目的化合物を得る ことができた。
試験例 2 N2—フエノキシァセチルー 2' -0- (2 シァノエトキシメチル）グアノシン 47g (63mmol)の N2—フエノキシァセチルー 3，， 5，一 O— (テトライソプロピルジシ ロキサン一 1, 3 ジィル） 2， -0- (2 シァノエトキシメチル）グアノシンを 280m Lのァセトニトリルに溶解し、 15. 3g (95mmol)のトリエチルァミントリヒドロフロリドを 加え 35°Cで 2時間攪拌した。反応液をへキサン 100mlにて 2回抽出し、残ったァセト 二トリル層に 30mlの水を加え、室温で 5分攪拌した。生じた析出物を吸引ろ過にて 回収し、冷却した混媒 (水：ァセトニトリル = 1： 1)で洗浄、乾燥し目的化合物を得た。 (22g;収率 69%)。
ESI-Mass : 500[M-H] "
[表 2]
Figure imgf000054_0002
リボースの 2'位水酸基が 1一（2 シァノエトキシ)ェチルで保護され、 3 '位水酸基 と 5'水酸基がジシロキシルで保護されているグアノシン誘導体において、トリェチル ァミントリヒドロフロリドを使用して、 3 '位水酸基と 5 '水酸基を保護して 、るジシロキシ ルを脱保護すると、シリカゲルカラム精製を行うことなく析出物として目的化合物を得 ることがでさた。
[0051] 試験例 3 Na—ァセチルー 2， -0- (2—シァノエトキシメチル）アデノシン
44g (69mmol)の N6—ァセチルー 3，， 5，一 O— (テトライソプロピルジシロキサン - 1, 3—ジィル）一2，一Ο— (2—シァノエトキシメチル）アデノシンを、 150mLの TH Fに溶解し、 13.4g (83mmol)のトリエチルァミントリヒドロフロリドを 50mLの THFに 溶解したものを調製し、これを加え、 45°Cで 1時間撹拌した。反応終了後、 50mLの へキサンを加えて氷冷下で撹拌した。生じた析出物を吸引ろ過にて回収し、 目的化 合物を得た。（29g ;定量的)。
ESI— Mass :415. 4[M + Na] T
[表 3]
Figure imgf000055_0001
リボースの 2'位水酸基が 1一（2—シァノエトキシ)ェチルで保護され、 3 '位水酸基 と 5'水酸基がジシロキシルで保護されているアデノシン誘導体において、トリェチル ァミントリヒドロフロリドを使用して、 3 '位水酸基と 5 '水酸基を保護して 、るジシロキシ ルを脱保護すると、シリカゲルカラム精製を行うことなく析出物として目的化合物を得 ることがでさた。
産業上の利用可能性
[0052] 本発明によれば、リボ核酸誘導体（1)のリボースの 3'位水酸基と 5'位水酸基とを保 護して 、るケィ素置換基を脱離する工程にぉ 、て、 3級ァミンとフッ化水素酸との塩、 又は 3級ァミンとフッ化水素酸との混合物を作用させることによって、シリカゲルカラム による精製操作を行うことなぐ安価にし力も高純度でリボ核酸誘導体 (3)を析出物と して獲得することができる。
したがって、本発明によれば、オリゴ RNA (B)の製造に使用することができるホスホ 口アミダイトイ匕合物 (A)を、安価に製造することが可能である。

Claims

請求の範囲 [1] 次の一般式（1)で表されるリボ核酸誘導体に、次の一般式（2)で表される 3級ァミンと フッ化水素酸との塩、又は 3級ァミンとフッ化水素酸との混合物を作用させ、リボース の 3 '位水酸基と 5 '位水酸基とを保護して!/ヽるケィ素置換基を脱離することを特徴と する、次の一般式 (3)で表されるリボ核酸誘導体の製造方法。
[化 1]
、
Figure imgf000056_0001
式（1)、（2)及び (3)中、 Bzは、保護基を有していてもよい核酸塩基又はその修飾体 を表す。 R7a、 R7b、 R7cは、それぞれ同一若しくは異なって、アルキルを表す力 又は R7a、 R7b、 R7eが隣接する窒素原子と一緒になつて形成する、 2環性の飽和アミノ環基 を表す。 Xは、 1〜30の範囲内にある数を表す。 WG1は、電子吸引性基を表す。 Aは 、次の一般式 (4a)又は (4b)で表されるケィ素置換基を表す。
[化 2]
R6 R6 R6
Si-0-Si- — Si—
R6 R6 R6
( 4 a ) ( 4 b ) 式 (4a)及び (4b)中、 R6は、アルキルを表す。
[2] Xが 2〜15の範囲内にある数である、請求項 1記載のリボ核酸誘導体の製造方法。
[3] 3級ァミンとフッ化水素酸との塩がトリェチルァミントリヒドロフロリドである、請求項 1又 は 2のいずれかに記載のリボ核酸誘導体の製造方法。
[4] WG1がシァノである、請求項 1〜3のいずれかに記載のリボ核酸誘導体の製造方法
[5] 下記工程を含む、次の一般式 (A)で表されるホスホロアミダイトイ匕合物の製造方法。
[化 3] WG2
Figure imgf000057_0001
(A)
式 (A)中、 Bzは、保護基を有していてもよい核酸塩基又はその修飾体を表す。 R1は 、次の一般式 (5)で表される置換基を表す。
[化 4]
Figure imgf000057_0002
( 5 )
式（5)中、尺11、 R12、 R13は、同一又は異なって、水素又はアルコキシを表す。
R2a、 R2bは、同一若しくは異なって、アルキルを表すカゝ、又は、 R2a、 R2bが隣接する窒 素原子と一緒になつて形成する、 5〜6員の飽和アミノ環基を表す。力かる飽和アミノ 環基は、窒素原子の他に環構成原子として酸素原子又は硫黄原子を 1個有していて もよい。
Figure imgf000057_0003
WG2は、同一又は異なって、電子吸引性基を表す。
工程：
次の一般式（1)で表されるリボ核酸誘導体に、次の一般式（2)で表される 3級ァミンと フッ化水素酸との塩、又は 3級ァミンとフッ化水素酸との混合物を作用させリボースの 3 '位水酸基と 5 '位水酸基とを保護して ヽるケィ素置換基を脱離することを特徴とす る、次の一般式 (3)で表されるリボ核酸誘導体を製造する工程。
[化 5]
Figure imgf000057_0004
式（1)、（2)及び (3)中、 Bz、 WG1は、前記と同義である。 R7a、 R7b、 R7eは、それぞれ 同一若しくは異なって、アルキルを表すか、又は R7a、 R7b、 R7eが隣接する窒素原子と 一緒になつて形成する、 2環性の飽和アミノ環基を表す。 Xは、 1〜30の範囲内にあ る数を表す。 Aは、次の一般式 (4a)又は (4b)で表されるケィ素置換基を表す。
[化 6]
R6 R6
Si- 0- Si— — ト
R6 R6 R6
( 4 a ) ( 4 b )
式 (4a)及び (4b)中、 R6は、アルキルを表す。
[6] Xが 2〜 15の範囲内にある数である、請求項 5記載のホスホロアミダイトイ匕合物の製造 方法。
[7] 3級ァミンとフッ化水素酸との塩がトリェチルァミントリヒドロフロリドである、請求項 5又 は 6のいずれかに記載のホスホロアミダイト化合物の製造方法。
[8] WG1がシァノである、請求項 5〜7の!、ずれかに記載のホスホロアミダイトイ匕合物の製 造方法。
[9] 下記工程 a〜fを含む、次の一般式 (A)で表されるホスホロアミダイトイ匕合物の製造方 法。
[化 7]
Figure imgf000058_0001
(A)
式 (A)中、 Bzは、保護基を有していてもよい核酸塩基又はその修飾体を表す。 R1は 、次の一般式 (5)で表される置換基を表す。
[化 8]
Figure imgf000059_0001
( 5 )
式（5)中、尺11、 R12、 R13は、同一又は異なって、水素又はアルコキシを表す。
R2a、 R2bは、同一若しくは異なって、アルキルを表すカゝ、又は、 R2a、 R2bが隣接する窒 素原子と一緒になつて形成する、 5〜6員の飽和アミノ環基を表す。力かる飽和アミノ 環基は、窒素原子の他に環構成原子として酸素原子又は硫黄原子を 1個有していて もよい。
Figure imgf000059_0002
WG2は、同一又は異なって、電子吸引性基を表す。
工程 a :
次の一般式 (6)で表されるリボ核酸誘導体にアルキルィ匕試薬を作用させることによつ て、中性条件下において脱離するエーテル型保護基を 2'位の水酸基に導入した、 次の一般式（1)で表されるリボ核酸誘導体を製造する工程、
[化 9]
Figure imgf000059_0003
( 6 ) ( 1 )
式（1)及び (6)中、 Bz、 WG1は、前記と同義である。 Aは、次の一般式 (4a)又は (4b )で表されるケィ素置換基を表す。
[化 10]
R6 R6 R6
-Si - O - Si— -Si—
R6 R R6
( 4 a ) ( 4 b )
式 (4a)及び (4b)中、 R6は、アルキルを表す。
1Mb:
工程 aとは別に、リボ核酸誘導体 (6)にジメチルスルホキシドと酢酸と無水酢酸とを作 用させること〖こよって、次の一般式 (7)で表されるリボ核酸誘導体を製造する工程、
[化 11]
Figure imgf000060_0001
( 6 )
式 (6)及び（7)中、 A、 Bzは、前記と同義である。
工程 c :
工程 bにお 、て製造されるリボ核酸誘導体（7)に次の一般式 (8)で表されるアルコー ル化合物と酸と硫黄原子に対するハロゲン化剤とを作用させることによって、中性条 件下において脱離するエーテル型保護基を 2'位の水酸基に導入した、次の一般式 (1)で表されるリボ核酸誘導体を製造する工程、
[化 12]
Figure imgf000060_0002
式（1)、（7)及び (8)中、 A、 Bz、 WG1は、前記と同義である。
工程 d :
工程 a又は cにおいて製造される次の一般式（1)で表されるリボ核酸誘導体に、次の 一般式（2)で表される 3級ァミンとフッ化水素酸との塩、又は 3級ァミンとフッ化水素酸 との混合物を作用させリボースの 3 '位水酸基と 5 '位水酸基とを保護して ヽるケィ素 置換基を脱離することを特徴とする、次の一般式 (3)で表されるリボ核酸誘導体を製 造する工程、
[化 13]
Figure imgf000060_0003
( 1 ) ( 3 ) 式（1)、（2)及び（3)中、 A、 Bz、 WG1は、前記と同義である。 R7a、 R7b、 R7eは、それ ぞれ同一若しくは異なって、アルキルを表すか、又は R7a、 R7b、 R7eが隣接する窒素 原子と一緒になつて形成する、 2環性の飽和アミノ環基を表す。 Xは、 1〜30の範囲 内にある数を表す。
工程 e :
工程 dにお 、て製造されるリボ核酸誘導体 (3)の 5 '位の水酸基に酸性条件下にお!/ ' て脱離する保護基 (R1)を導入する、リボ核酸誘導体（10)を製造する工程、
[化 14]
Figure imgf000061_0001
( 3 ) ( 1 0 )
式（3)、（9)及び（10)中、 Bz、
Figure imgf000061_0002
WG1は、前記と同義である。 X3は、ハロゲンを表 す。
工程 f :
工程 eにおいて製造されるリボ核酸誘導体（10)にホスホロアミダイト化試薬と、必要 に応じて活性化剤とを作用させることによって、 3'位の水酸基がホスホロアミダイトイ匕 された、次の一般式 (A)で表されるホスホロアミダイトイ匕合物を製造する工程。
[化 15]
Figure imgf000061_0003
式（10)及び (A)中、 Bz、
Figure imgf000061_0004
WG1は、前記と同義である。 R2a、 R2bは、同一若しくは 異なって、アルキルを表す力 又は、 R2a、 R2bが隣接する窒素原子と一緒になつて形 成する、 5〜6員の飽和アミノ環基を表す。力かる飽和アミノ環基は、窒素原子の他に 環構成原子として酸素原子又は硫黄原子を 1個有していてもよい。 WG2は、電子吸 引性基を表す。
アルキル化試薬が、次の一般式（11)で表されるエーテルィ匕合物である、請求項 9記 載のホスホロアミダイトイ匕合物の製造方法。
[化 16]
Figure imgf000062_0001
式（11)中、 Lは、ハロゲン、ァリールチオ基、アルキルスルホキシド基又はアルキル チォ基を示し、 WG1は、電子吸引性基を表す。
[11] Xが 2〜15の範囲内にある数である、請求項 9又は 10のいずれかに記載のホスホロ アミダイト化合物の製造方法。
[12] 3級ァミンとフッ化水素酸との塩がトリェチルァミントリヒドロフロリドである、請求項 9〜 、Po 2
11の 、ずれかに記載のホスホロアミダイトイ匕合物の製造NP-ヽ ,方法。
[13] WG1がシァノである、請求項 9〜 12のいずれかに記載のホ b Rスホロアミダイトイ匕合物の
2
b
製造方法。
[14] ホスホロアミダイト化試薬が、次の一般式（12a)又は（12b)で表される化合物である 、請求項 9〜 13のいずれかに記載のホスホロアミダイトイ匕合物の製造方法。
[化 17]
X1
。 2b WG2.
R2a R2a
( 1 2 a ) ( 1 2 b ) 式（12a)及び（12b)中、 R a、 R bは、同一若しくは異なって、アルキルを表す力 又 は、 R2a、 R2bが隣接する窒素原子と一緒になつて形成する、 5〜6員の飽和アミノ環 基を表す。力かる飽和アミノ環基は、窒素原子の他に環構成原子として酸素原子又 は硫黄原子を 1個有していてもよい。 WG2は、電子吸引性基を表す。 X1は、ハロゲン を表す。
[15] 工程 fにおいて使用する活性化剤力 1H—テトラゾール、 5 ェチルチオテトラゾー ル、 5 べンジルメルカプト 1H—テトラゾール、 4, 5 ジクロロイミダゾール、 4, 5 —ジシァノイミダゾール、ベンゾトリアゾールトリフラート、イミダゾールトリフラート、ピリ ジ -ゥムトリフラート、 N, N—ジイソプロピルェチルァミン又は 2, 4, 6—コリジン/ N ーメチルイミダゾールである、請求項 9〜14の!、ずれかに記載のホスホロアミダイト化 合物の製造方法。
請求項 5〜 15のいずれかに記載の製造方法において製造されるホスホロアミダイト 化合物を使用することを特徴とする、次の一般式 (B)で表されるオリゴ RNAの製造 方法。
[化 18]
Figure imgf000063_0001
式 (B)中、各 Bは、それぞれ独立して、核酸塩基又はその修飾体を表す。各 Qは、そ れぞれ独立して、 O又は Sを表す。各 Rは、それぞれ独立して、 H、水酸基、ハロゲン 、アルコキシ、アルキルチオ、アルキルァミノ、ジアルキルァミノ、アルケニルォキシ、 アルケニルチオ、アルケニルァミノ、ジアルケニルアミ入アルキニルォキシ、アルキニ ルチオ、アルキ-ルァミノ、ジアルキ -ルァミノ又はアルコキシアルキルォキシを表す が、少なくとも 1つは水酸基を表す。 Zは、 H、リン酸基又はチォリン酸基を表す。 nは 、 1〜200の範囲内にある整数を表す。
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