WO2007088900A1 - 細胞死を誘導する２本鎖rna - Google Patents

細胞死を誘導する２本鎖rna Download PDF

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Tatsuhiro Ishida
Hiroshi Kiwada
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The University Of Tokushima
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    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
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    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering N.A.

Definitions

  • the present invention relates to a double-stranded RNA that induces cell death. More specifically, the present invention relates to a 21-30 base double-stranded RNA that induces cell death by destroying the Argonaute2 gene transcript mRNA in human cells, and a cell containing this double-stranded RNA. The present invention relates to a death-inducing agent and a method for inducing effective cell death such as cancer cells.
  • RNAi RNA interference
  • RNA interference is a double-strand RNA force consisting of a sense strand RNA and an antisense strand RNA that is homologous to a gene. It destroys the homologous part of the transcript (mRNA) of that gene.
  • mRNA transcript
  • This phenomenon was first proposed in 1999 by an experiment using nematodes (Non-patent Document 1). Later, it was shown that RNAi also occurs in mammalian early embryos and cultured mammalian cells, and it has been clarified that RNAi induction mechanisms also exist in mammalian cells (Non-patent Document 2). In 2001, it was shown that relatively short (21-23 bp) double-stranded RNA (siRNA) can induce RNAi in mammalian cell lines without showing cytotoxicity. (Non-Patent Document 3).
  • siRNA suppresses specific gene expression without showing toxicity, it is expected to be effective for the treatment of human diseases.
  • RISC RNA-induced silencing complex
  • RISC RNA-induced silencing complex
  • RNase activity a protein complex with RNase activity and a molecular weight of 250-500 kDa.
  • siRNA-protein complex binds to mRNA homologous to siRNA, and the siRNA-mRNA binding site is cleaved by RISC nuclease activity, resulting in target gene expression.
  • Is silencing eg, Non-Patent Documents 4-6).
  • Non-Patent Document 2 Ui-Tei, K. et al. FEBS Lett., 479: 79-82, 2000
  • Non-Patent Document 3 Elbashir, MS. Et al. Nature, 411: 494-498, 2001
  • Non-Patent Document 4 Martinez, J. et al. Cell, 110: 563-574, 2003
  • Non-Patent Document 5 Liu, J. et al. Science, 305: 1437-1441, 2004
  • Non-Patent Document 6 Rivas, F.V. et al. RNA 12: 340-349, 2005
  • An object of the present invention is to provide a new double-stranded RNA that can be used to selectively kill specific cells, using the suppression of target gene expression by RNAi as a mechanism of action. .
  • RISC is an indispensable molecule for mRNA silencing by RNAi, but it is deeply involved in maintaining cell homeostasis.
  • the inventors of the present application have conducted extensive research based on the working hypothesis that by suppressing the expression of RISC itself, cell homeostasis can be destroyed and cell death can be induced. As a result, it was confirmed that cell death was induced by suppressing the expression of Argonaute2 (Ago2) protein, one of the constituent proteins of RISC, with siRNA, and the present invention was completed.
  • Ago2 Argonaute2
  • the present invention selectively destroys the homeostasis maintenance function of RISC while maintaining the gene-silencing activity by siRNA-RISC even when the expression of Ago2 gene is suppressed by siRNA. This was completed based on the novel finding that cell death was induced.
  • the present invention provides, as a first invention, a double-stranded RNA of 18-30 bases that induces cell death by destroying the transcription product mRNA of the Argonaute2 gene in human cells.
  • the double-stranded RNA of the first invention is specifically as follows. That is, SEQ ID NO: 1 Argonaute2 gene cDNA consisting of nucleotide sequence:
  • the double-stranded RNA according to claim 1 comprising a sense strand RNA containing RNA corresponding to the 144th to 168th positions, and an antisense strand thereof.
  • RNA a double-stranded RNA comprising a sense strand RNA containing RNA corresponding to the 180-204 position sequence and its antisense strand RNA;
  • RNA a double-stranded RNA comprising a sense strand RNA containing RNA corresponding to the 791-815 position sequence and its antisense strand RNA;
  • RNA (4) a double-stranded RNA comprising a sense strand RNA containing RNA corresponding to the 798-822 position sequence and its antisense strand RNA;
  • these double-stranded RNAs are identical to each other. More specifically, these double-stranded RNAs are identical to each other.
  • Sense strand 5'-GGAGAACAAUCAAAUUACAGGCCAAAG-3, (SEQ ID NO: 2) Antisense strand: 3 -UACCUCUUGUUAGUUUAAUGUCCGGUU-5 '(SEQ ID NO: 3) [2] Sense strand: 5'-UGGACAUCCCCAAAAUUGACAUCUAAG-3, (SEQ ID NO: 4 ) Antisense strand: 3 -UAACCUGUAGGGGUUUUAACUGUAGAU-5 '(SEQ ID NO: 5) [3] Sense strand: 5'-ACAGAUUCCCAAAGGGUAAAGUUUAAG-3, (SEQ ID NO: 6) Antisense strand: 3 -UAUGUCUAAGGGUUUCCCAUUUCAAAU-5' (SEQ ID NO: 7) [ 4] Sense strand: 5'-CCCAAAGGGUAAAGUUUACCAAAGAAG-3, (SEQ ID NO: 8) Antisense strand: 3 -UA
  • the second invention is a cell death inducer containing an effective amount of the double-stranded RNA of the first invention.
  • the second invention is a cell death inducer containing one or more double-stranded RNAs selected from the double-stranded RNAs of (1) to (6) above, More specifically, it is a cell death inducer containing one or more double-stranded RNAs selected from the double-stranded RNAs of [1] to [6].
  • a third invention is a cell death induction method characterized by introducing the cell death inducer into a cell.
  • the cell is preferably a cancer cell or a neoplastic blood vessel endothelial cell.
  • the present invention provides a new means for inducing cell death.
  • double-stranded RNA of the present invention By introducing the double-stranded RNA of the present invention into a living body in a state in which it is bound to a delivery molecule that specifically binds to unwanted and harmful cells, it is possible to selectively kill unwanted and harmful cells. It becomes. Since single-stranded double-stranded RNA has been confirmed to be non-cytotoxic, it cannot be recognized by the dendritic molecule and cannot kill normal cells.
  • FIG. 1A is an electrophoretogram showing the results of introducing a double-stranded RNA into HT1080 cells and measuring Argonaute2 mRNA after each culture time by RT-PCT method.
  • double-stranded RNA for Argonaut e2 is introduced on the left side of each time, and double-stranded RNA for control is introduced on the right side of the cell.
  • Fig. 1B shows the results of measuring the expression of j3-actin in the same way.
  • C shows the results of confirming transfection efficiency by simultaneous transfection of the pGL3 modified vector.
  • FIG. 2 is a graph showing the cell viability of HT1080 cells in which double-stranded RNA has been introduced into cells over time.
  • FIG. 3 is a graph showing the cell growth rate of HT1080 cells in which double-stranded RNA has been introduced into the cells over time.
  • Fig. 4 is an electrophoretogram showing the results of measuring the Argonaute2 mRNA after each culture time by RT-PCT method after introducing double-stranded RNA into HUVEC cells.
  • RT-PCT method When left side force Ago2 and right side control (siNA) are introduced into the cells, the leftmost lane is treated with Lipofectamine 2000 alone.
  • the bottom of Fig. 4 is the result of measuring the expression of actin in the same way.
  • Figure 5 shows the cell viability of HUVEC cells transfected with double-stranded RNA over time. It is the shown graph.
  • FIG. 6 is a graph showing the cell growth rate of HUVEC cells in which double-stranded RNA has been introduced into cells over time.
  • FIG. 7 is a microscopic image obtained by observing the formation of a blood vessel-like structure by HUVEC cells in which double-stranded RNA was introduced into cells.
  • the double-stranded RNA of the present invention suppresses gene expression of Ago2 protein, which is one of RISC constituent proteins.
  • the cDNA sequence of the Ago2 gene is known (SEQ ID NO: 1), and double-stranded RNA can be designed based on this nucleotide sequence. That is, RNA corresponding to an arbitrary region of SEQ ID NO: 1 (sense strand RNA) and RNA (antisense strand RNA) complementary to this sense strand RNA are prepared. Specifically, the positions are 114th to region, 180th to region, 791 to region, 1233 to region, 1425 to region of SEQ ID NO: 1.
  • a sequence beginning with AA and having a length of 18 to 30 bases or a sequence having a length of 18 to 30 bases when AA is added to the 5 'side is selected.
  • the GC content of the sequence is preferably around 50%, for example, if it is selected to be 30-70%.
  • the present invention provides the following six types of double-stranded RNA as double-stranded RNA comprising a sequence that satisfies such conditions.
  • Sense strand 5'-GGAGAACAAUCAAAUUACAGGCCAAAG-3, (SEQ ID NO: 2)
  • Antisense strand 3 -UACCUCUUGUUAGUUUAAUGUCCGGUU-5 '(SEQ ID NO: 3)
  • Sense strand 5'-UGGACAUCCCCAAAAUUGACAUCUAAG-3 '(SEQ ID NO: 4)
  • Antisense strand 3 -UAACCUGUAGGGGUUUUAACUGUAGAU-5' (SEQ ID NO: 5)
  • Sense strand 5'-ACAGAUUCCCAAAGGGUAAAGUUUAAG-3, (SEQ ID NO: 6)
  • Antisense strand 3 -UAUGUCUAAGGGUUUCCCAUUUCAAAU-5 '(SEQ ID NO: 7)
  • Sense strand 5'-CCCAAAGGGUAAAGUUUACCAAAGAAG-3 '(SEQ ID NO: 8)
  • Antisense strand 3 -UAGGGUUUCCCAUUUCAAAUGGUUUCU-5' (SEQ ID NO: 9)
  • Sense strand 5'-GAAUCAUGGUCAAAGAUGAGAUAGCAG-3, (SEQ ID NO: 10)
  • Antisense strand 3 -UACUUAGUACCAGUUUCUACUCUACUG-5 '(SEQ ID NO: 11)
  • Antisense strand 3 -UUCGUGCCUUCAGGUAGACUU-5 ′ (SEQ ID NO: 13)
  • a double-stranded RNA can be obtained, for example, by a known method (for example, Carmthers (1982) Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 47: 411-418). ; Adams (1983) J. Am. Chem. Soc. 105: 661; Belousov (1997) Nucleic Acid Res. 25: 3440-3444; Frenkel (1995) Free Radic. Biol. Med. 19: 373-380; Blommers ( 1994) Biochemistry 33: 7886-7896; Narang (1979) Meth • Enzymol. 68:90; Brown (1979) Meth. Enzymol.
  • RNA can be synthesized by well-known chemical synthesis techniques such as those described in) and annealed into double strands.
  • Double-stranded RNA can also be prepared by a known Dicer method. That is, the coding region of the Ago2 gene cDNA (SEQ ID NO: 1) is incorporated into a vector or the like, the cDNA sense strand RNA and the antisense strand RNA are transcribed, and then annealed to produce a double-stranded RNA. Next, this double-stranded RNA is processed into a single-stranded (18-30 base) double-stranded RNA having a 2 base protruding end at the 3 ′ end by Dicer Enzyme belonging to the RNase III family.
  • Dicer Enzyme belonging to the RNase III family.
  • a second invention is a cell death inducer containing the above-mentioned 2-complementary RNA in an amount effective for inducing cell death.
  • the double-stranded RNA may contain a single species, but in order to improve cell death-inducing activity, it is preferable to contain two or more types of double-stranded RNA.
  • This cell death inducer can be prepared by mixing double-stranded RNA with a pharmaceutically acceptable carrier.
  • Carriers include ribosomes, lipid vesicles, micelles, diluents, excipients, wetting agents, buffers, suspension agents, lubricants, adjuvants, emulsifiers, disintegrants, absorbents, preservatives, surface active agents , Coloring agents, flavoring agents, sweetening agents and the like.
  • This cell death inducer is an injection, lyophilized product, tablet, hard capsule, soft capsule, granule, powder, pill, syrup, suppository, poultice, ointment, cream, It can take a dosage form such as eye drops.
  • the cell death inducer can be administered locally or systemically by any means known to those skilled in the art. Dosage is the year of the recipient It can be appropriately changed according to age, weight, health condition, sex, symptom, administration route, number of administrations, dosage form, etc., and a specific administration procedure can be set by those skilled in the art. For example, an adult can be administered 0.1 ⁇ g to 10 g, preferably 1 ⁇ g to lg, more preferably 10 ⁇ g to 100 mg 1 to 5 times a day when administered as a tablet.
  • a method of administering a double-stranded RNA expression vector can be employed in addition to a method of direct administration by injection.
  • vectors that can be used include adenovirus vectors, adeno-associated virus vectors, herpes quinores vectors, vaccinia vinores betaters, retro vinores betaters, and lentiwinole vectors.
  • a method may be adopted in which a phospholipid vesicle such as a ribosome retaining double-stranded RNA is introduced into a predetermined cell by the lipofussion method, and this cell is systemically administered, for example, into a vein or artery. it can.
  • a commercially available gene introduction kit for example, Adeno Express: Clontech
  • Cell death can be induced by introducing a double-stranded RNA or a cell death-inducing agent containing this double-stranded RNA into cells by the above method.
  • the target of cell death can be cancer cells or cancer neovascular endothelial cells that are unnecessary or harmful to the normal function of the living body.
  • a double-stranded RNA is allowed to act on the cancer cell using a carrier such as an antibody or ribosome, and the Ago2 gene of the cancer cell
  • a carrier such as an antibody or ribosome
  • the present inventors have shown that the use of cationic ribosome (TFL-3) can selectively deliver therapeutic genes to neovascular endothelial cells generated in the lung (Li, W.
  • anti-PEG-modified anti-peptides obtained by phage display were modified with several peptides with high accumulation and accumulation in new blood vessels.
  • Cancer drug-encapsulated ribosomes have also been reported to exert a high tumor growth-inhibiting effect (Kondo, ⁇ ⁇ et al., Int. J. Cancer, 108: 301-306, 2004; Assai, T. et al , FEBS Lett., 520: 167-17 0, 2002) 0
  • the inventors of the present application can release a double-stranded RNA in the cytoplasm immediately after its transfer into the cell.
  • the double-stranded RNA of the present invention can be transformed into a specific cell (for example, cancer).
  • Cells can be specifically delivered to angiogenic vascular endothelial cells, etc.) and these cells can be selectively killed.
  • RNA that did not reach the target cell is taken up by the liver 'spleen macrophage together with the carrier and degraded, so it is not toxic to normal cells.
  • siAgo2 double-stranded RNA targeting Ago2 was prepared.
  • Sense strand 5 GGAGAACAAUCAAAUUACAGGCCAAAG-3, (SEQ ID NO: 2) Antisense strand: 3 -UACCUCUUGUUAGUUUAAUGUCCGGUU-5 '(SEQ ID NO: 3) [2] Sense strand: 5'- UGGACAUCCCCAAAAUUGACAUCUAAG-3' (SEQ ID NO: 4) Antisense strand: 3 -UAACCUGUAGGGGUUUUAACUGUAGAU-5 '(SEQ ID NO: 5) [3] Sense strand: 5'-ACAGAUUCCCAAAGGGUAAAGUUUAAG-3, (SEQ ID NO: 6) Antisense strand: 3 -UAUGUCUAAGGGUUUCCCAUUUCAAAU-5' (SEQ ID NO: 7) [4 ] Sense strand: 5'-CCCAAAGGGUAAAGUUUACCAAAGAAG-3 '(SEQ ID NO: 8) Antisense strand: 3 -UAGG
  • Antisense strand 3 -UUCGUGCCUUCAGGUAGACUU-5 '(SEQ ID NO: 13)
  • the following double-stranded RNA known to suppress the expression of the Luciferase gene (pGL-3) as a controller (siNS: Non-patent document 3) was prepared.
  • Sense strand 5 and CUUACGCUGAGUACUUCGATT—3, (IJ number 14)
  • Double-stranded RNA consisting of the oligonucleotides of SEQ ID NOS: 12 and 13 and control double-stranded RNA (siNS) were prepared using Lipofectamine2000.
  • Lipofectamine2000 was used to introduce human fibrosarcoma cells HT1080.
  • the ratio of double-stranded RNA to Lipofectamine 2000 is 1: 5, and the double-stranded RNA concentration is 12.5 nM.
  • unintroduced double-stranded RNA was removed, and the amount of Ago2 gene mRNA was measured over time by RT-PCR.
  • the above double-stranded RNA is introduced into HT1080 cells using Lipofectamine 2000, and cell death of double-stranded RNA is induced by the MTT assay, which is widely used as a simple evaluation method for cell toxicity and cell proliferation. Activity was evaluated. As a result, as shown in FIG. 2, when siAgo2 [6] was used, the cell viability decreased significantly compared to the control (siNS).
  • the number of cells was measured to examine the degree of cell proliferation. As a result, as shown in FIG. 3, when siAgo2 [6] was used, the cell proliferation rate was significantly reduced compared to the control (siNS).
  • the double-stranded RNA of the present invention has a cell death induction (or growth suppression) activity of tumor cells.
  • the amount of Ago2 gene mRNA was measured over time in the same manner as in Example 1 except that HUVEC (a human umbilical vein endothelial cell) was used.
  • siAgo2 [6] was introduced into HUVEC cells using Lipofectamine2000.
  • the HUVEC cells after the 24-hour introduction treatment were seeded on a culture plate coated with Matrigel, and the formation of blood vessel-like structures was observed (tube formation assay).

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Abstract

　ヒト細胞内において、Argonaute2遺伝子の転写産物mRNAを破壊することによって当該細胞死を誘導する18-30塩基の２本鎖RNAを提供する。この２本鎖RNAは、例えば、癌治療の有効な材料となる。

Description

明 細 書
細胞死を誘導する 2本鎖 RNA
技術分野
[0001] 本願発明は、細胞死を誘導する 2本鎖 RNAに関するものである。さらに詳しくは、本 願発明は、ヒト細胞内において Argonaute2遺伝子の転写産物 mRNAを破壊すること によって細胞死を誘導する 21-30塩基の 2本鎖 RNAと、この 2本鎖 RNAを含有する細 胞死誘導剤、さらにはガン細胞等の効果的な細胞死を誘導する方法に関するもので ある。
背景技術
[0002] RNAiについて：
RNAi (RNA interference)とは、ある遺伝子と相同な、センス鎖 RNAとアンチセンス鎖 RNAとからなる 2本鎖 RNA (double-strand RNA)力 その遺伝子の転写産物（mRNA) の相同部分を破壊するという現象であり、 1999年に線虫を用いた実験によりはじめて 提唱された (非特許文献 1)。その後、マウス初期胚ゃ哺乳動物培養細胞でも RNAiが 起こることが示され、 RNAiの誘導機構は哺乳動物細胞にも存在することが明らかにさ れた（非特許文献 2)。そして 2001年には、比較的短い（21-23bp) 2本鎖 RNA (small in terfering RNA : siRNA)力 哺乳動物細胞系でも細胞毒性を示さずに RNAiを誘導でき ることが示されてレ、る（非特許文献 3)。
[0003] このように、 siRNAは毒性を示すことなく特定の遺伝子発現を抑制することから、ヒト 疾患の治療への有効性が期待されてレ、る。
RISCについて：
RISC (RNA-induced silencing complex : RNA誘導型サイレンシング複合体）は、 RNA 分解酵素活性を有する分子量 250〜500kDaのタンパク複合体である。 SiRNAを細胞 へ導入すると、このタンパク質複合体と結合し、 siRNA-タンパク質複合体が siRNAと 相同の mRNAに結合し、 RISCヌクレアーゼ活性により siRNA— mRNAの結合部位が切 断されて、標的遺伝子の発現が抑制（ gene silencing)される（例えば、非特許文 献 4— 6)。 非特許文献 l : Fire, A. et al. Nature, 391:806-811, 1998
非特許文献 2 : Ui-Tei， K. et al. FEBS Lett., 479:79-82, 2000
非特許文献 3 : Elbashir, MS. Et al. Nature, 411:494-498, 2001
非特許文献 4 : Martinez, J. et al. Cell, 110:563-574， 2003
非特許文献 5 : Liu, J. et al. Science, 305: 1437-1441, 2004
非特許文献 6 : Rivas, F.V. et al. RNA 12:340-349, 2005
発明の開示
[0004] 生体を正常な状態に保っため、不要あるいは有害な細胞（例えばガン細胞）を死滅 させるための手段や薬剤の開発が精力的に進められている。し力しながら、正常細 胞に毒性を示すことなぐ不要 ·有害な細胞を選択的に死滅させるための効果的な手 段や薬剤は極めて少ないのが現状である。
[0005] 本願発明は、 RNAiによる標的遺伝子の発現抑制を作用機序として、特定細胞を選 択的に死滅させるために使用することのできる新しい 2本鎖 RNAを提供することを課 題としている。
RISCは、前記のとおり、 RNAiによる mRNA切断（gene silencing)のための不可欠の 分子であるが、一方で、細胞の恒常性維持に深く関与している。
[0006] 本願発明者らは、この RISCそれ自体の発現を抑制することによって、細胞の恒常性 を破壊し、細胞死を誘導することが可能であるとの作業仮説のもと、鋭意研究の結果 、 RISCの構成タンパク質の一つである Argonaute2 (Ago2)タンパク質の発現を siRNA で抑制させることによって細胞死が誘導されることを確認し、本願発明を完成させた。
[0007] すなわち、本願発明は、 siRNAによって Ago2遺伝子の発現を抑制した場合であつ ても、 siRNA-RISCによる gene-silencing活性は維持されたまま、 RISCの恒常性維持機 能を選択的に破壊して細胞死が誘導されるという新規な知見に基づいて完成された ものである。
[0008] 本願発明は、第 1の発明として、ヒト細胞内において、 Argonaute2遺伝子の転写産 物 mRNAを破壊することによって細胞死を誘導する 18-30塩基の 2本鎖 RNAを提供す る。
[0009] 第 1発明の 2本鎖 RNAは、具体的には以下のとおりである。すなわち、配列番号 1の 塩基配列からなる Argonaute2遺伝子 cDNAの：
(1)第 144-168位配列に相当する RNAを含むセンス鎖 RNAと、そのアンチセンス鎖 RN Aとからなる請求項 1の 2本鎖 RNA、
(2)第 180-204位配列に相当する RNAを含むセンス鎖 RNAと、そのアンチセンス鎖 RN Aとからなる 2本鎖 RNA、
(3)第 791-815位配列に相当する RNAを含むセンス鎖 RNAと、そのアンチセンス鎖 RN Aとからなる 2本鎖 RNA、
(4)第 798-822位配列に相当する RNAを含むセンス鎖 RNAと、そのアンチセンス鎖 RN Aとからなる 2本鎖 RNA、
(5)第 1233-1257位配列に相当する RNAを含むセンス鎖 RNAと、そのアンチセンス鎖 RNAと力 なる 2本鎖 RNA、
(6)第 1425-1443位配列に相当する RNAを含むセンス鎖 RNAと、そのアンチセンス鎖 RNAと力 なる 2本鎖 RNA、
である。
これらの 2本鎖 RNAは、さらに具体的には、
[1]センス鎖： 5'-GGAGAACAAUCAAAUUACAGGCCAAAG-3，（配列番号 2) アンチセンス鎖： 3 -UACCUCUUGUUAGUUUAAUGUCCGGUU-5' (配列番号 3) [2]センス鎖： 5'-UGGACAUCCCCAAAAUUGACAUCUAAG-3，（配列番号 4) アンチセンス鎖： 3 -UAACCUGUAGGGGUUUUAACUGUAGAU-5' (配列番号 5) [3]センス鎖： 5'-ACAGAUUCCCAAAGGGUAAAGUUUAAG- 3，（配列番号 6) アンチセンス鎖： 3 -UAUGUCUAAGGGUUUCCCAUUUCAAAU-5' (配列番号 7) [4]センス鎖： 5'-CCCAAAGGGUAAAGUUUACCAAAGAAG- 3，（配列番号 8) アンチセンス鎖： 3 -UAGGGUUUCCCAUUUCAAAUGGUUUCU-5' (配列番号 9) [5]センス鎖： 5'-GAAUCAUGGUCAAAGAUGAGAUAGCAG-3，（配列番号 10) アンチセンス鎖： 3 -UACUUAGUACCAGUUUCUACUCUACUG-5' (配列番号 11) [6]センス鎖： 5'-GCACGGAAGUCCAUCUGAAUU-3，（配列番号 12)
アンチセンス鎖： 3 -UUCGUGCCUUCAGGUAGACUU-5' (配列番号 13)、 である。 [0011] 第 2の発明は、第 1発明の 2本鎖 RNAの有効量を含有する細胞死誘導剤である。
[0012] この第 2発明は、具体的には、前記 (1)から (6)の 2本鎖 RNAから選択される 1または 2 以上の 2本鎖 RNAを含有する細胞死誘導剤であり、さらに具体的には、前記 [1]から [ 6]の 2本鎖 RNAから選択される 1または 2以上の 2本鎖 RNAを含有する細胞死誘導剤 である。
[0013] 第 3の発明は、前記の細胞死誘導剤を細胞に導入することを特徴とする細胞死誘 導方法である。この第 3発明の方法においては、細胞がガン細胞またはガン新生血 管内皮細胞であることを好ましレ、態様としてレ、る。
[0014] 本願発明によって、細胞死を誘導させるための新しい手段が提供される。本願発明 の 2本鎖 RNAを、不要 ·有害な細胞に特異的に結合するデリバリー分子等に結合した 状態で生体内に導入することによって、不要'有害な細胞を選択的に死滅させること が可能となる。単鎖の 2本鎖 RNAは細胞毒性がないことが確認されているので、デリ ノ リー分子が認識しなレ、正常細胞を死滅させることがなレ、。
図面の簡単な説明
[0015] [図 1]図 1Aは、 HT1080細胞に 2本鎖 RNAを導入し、各培養時間の後の Argonaute2 mRNAを RT-PCT法で測定した結果を示す泳動図である。各時間の左側が Argonaut e2に対する 2本鎖 RNA、右側がコントロールの 2本鎖 RNAを細胞に導入した場合。図 1Bは j3—ァクチンの発現を同様に測定した結果であり、 Cは pGL3改変ベクターの同 時トランスフエクシヨンによりトランスフエクシヨン効率を確認した結果である。
[図 2]図 2は、 2本鎖 RNAを細胞に導入した HT1080細胞の細胞生存率を経時的に 示したグラフである。
[図 3]図 3は、 2本鎖 RNAを細胞に導入した HT1080細胞の細胞増殖率を経時的に 示したグラフである。
[図 4]図 4上は、 HUVEC細胞に 2本鎖 RNAを導入し、各培養時間の後の Argonaute2 mRNAを RT-PCT法で測定した結果を示す泳動図である。各時間の左側力 Ago2、 右側がコントロール（siNA)を細胞に導入した場合、左端レーンは Lipofectamine2000 単独処理である。図 4下は —ァクチンの発現を同様に測定した結果である。
[図 5]図 5は、 2本鎖 RNAを細胞に導入した HUVEC細胞の細胞生存率を経時的に 示したグラフである。
[図 6]図 6は、 2本鎖 RNAを細胞に導入した HUVEC細胞の細胞増殖率を経時的に 示したグラフである。
[図 7]図 7は、 2本鎖 RN Aを細胞に導入した HUVEC細胞による血管類似構造体の形 成を観察した顕微鏡像である。
発明を実施するための最良の形態
[0016] 本願発明の 2本鎖 RNAは、 RISC構成タンパク質の一つである Ago2タンパク質の遺 伝子発現を抑制するものである。 Ago2遺伝子の cDNA配列は公知（配列番号 1)であ り、この塩基配列に基づいて、 2本鎖 RNAを設計することができる。すなわち、配列番 号 1の任意領域に対応する RNA (センス鎖 RNA)と、このセンス鎖 RNAに相補的な RN A (アンチセンス鎖 RNA)を作製する。具体的には、配列番号 1の第 114位〜領域、第 180〜領域、第 791〜領域、第 1233〜領域、第 1425〜領域などである。
[0017] 選択した領域から、 AAで始まる配列であって長さが 18〜30塩基のもの、あるいは、 AAを 5'側に加えたときの長さが 18〜30塩基の配列を選択する。その配列の GC含量 は、例えば 30〜70%となるものを選択すればよぐ 50%前後が好ましい。また、その GC 分布に偏りがないものを選択するとよい。さらに、選択した配列の 3'側に dT又は Uの 2 残基のオーバーハングを加えるとよレ、。また、 BLASTサーチをおこなレ、、選択した配 列に類似した配列を有するタンパク質が存在しないことを確認することが好ましい。
[0018] このような条件を満たす配列からなる 2本鎖 RNAとして、本願発明は、以下の 6種類 の 2本鎖 RNAを提供する。
[1]センス鎖： 5'-GGAGAACAAUCAAAUUACAGGCCAAAG-3，（配列番号 2) アンチセンス鎖： 3 -UACCUCUUGUUAGUUUAAUGUCCGGUU-5' (配列番号 3)
[2]センス鎖： 5'- UGGACAUCCCCAAAAUUGACAUCUAAG- 3' (配列番号 4) アンチセンス鎖： 3 -UAACCUGUAGGGGUUUUAACUGUAGAU-5' (配列番号 5)
[3]センス鎖： 5'-ACAGAUUCCCAAAGGGUAAAGUUUAAG-3，（配列番号 6) アンチセンス鎖： 3 -UAUGUCUAAGGGUUUCCCAUUUCAAAU-5' (配列番号 7)
[4]センス鎖： 5'-CCCAAAGGGUAAAGUUUACCAAAGAAG-3' (配列番号 8) アンチセンス鎖： 3 -UAGGGUUUCCCAUUUCAAAUGGUUUCU-5' (配列番号 9) [5]センス鎖： 5'-GAAUCAUGGUCAAAGAUGAGAUAGCAG-3，（配列番号 10) アンチセンス鎖： 3 -UACUUAGUACCAGUUUCUACUCUACUG-5' (配列番号 11)
[6]センス鎖： 5'-GCACGGAAGUCCAUCUGAAUU-3，（配列番号 12)
アンチセンス鎖： 3 -UUCGUGCCUUCAGGUAGACUU-5' (配列番号 13) このような 2本鎖 RNAは、例えば、公知の方法（例えば Carmthers (1982) Cold Sprin g Harbor Symp. Quant. Biol. 47:411-418; Adams (1983) J. Am. Chem. Soc. 105:661; Belousov (1997) Nucleic Acid Res. 25:3440-3444; Frenkel (1995) Free Radic. Biol. Med. 19:373-380; Blommers (1994) Biochemistry 33:7886-7896; Narang (1979) Meth • Enzymol. 68:90; Brown (1979) Meth. Enzymol. 68:109; Beaucage (1981) Tetra. Lett . 22:1859;米国特許第 4,458,066号）に記載されているような周知の化学合成技術に より RNAを合成し、 2本鎖にァニールさせることによって作製することができる。
[0019] また、公知の Dicer法によって 2本鎖 RNAを作製することもできる。すなわち、 Ago2遺 伝子 cDNA (配列番号 1)のコード領域をベクター等に組み込み、 cDNAのセンス鎖 RN Aとアンチセンス鎖 RNAを転写させた後、アニーリングして 2本鎖 RNAを作製する。次 に、 RNase IIIファミリーに属する Dicer Enzymeにより、この 2本鎖 RNAを 3'末端側に 2 塩基の突出末端をもつ単鎖（18-30塩基）の 2本鎖 RNAにプロセッシングさせる。
[0020] 第 2の発明は、前記のとおりの 2補鎖 RNAを、それが細胞死を誘導するのに有効な 量、含有する細胞死誘導剤である。 2本鎖 RNAは単一種を含有するものであってもよ レ、が、細胞死の誘導活性を向上させるためには、 2種以上の 2本鎖 RNAを含有するこ とが好ましい。
[0021] この細胞死誘導剤は、 2本鎖 RNAを薬学的に許容できる担体と混合して調製するこ とができる。担体としては、リボソーム、脂質小胞体、ミセル等、希釈剤、賦形剤、湿潤 剤、緩衝剤、懸濁剤、潤滑剤、アジュバント、乳化剤、崩壊剤、吸収剤、保存料、界 面活性剤、着色料、着香料、または甘味料等を含む。
[0022] この細胞死誘導剤は、注射剤、凍結乾燥品、錠剤、硬カプセル剤、軟カプセル剤、 顆粒剤、散剤、丸剤、シロップ剤、坐剤、パップ剤、軟膏剤、クリーム剤、点眼剤等の 剤型をとることができる。また、この細胞死誘導剤は、当業者にとって既知である任意 の手段により、局所的または全身に投与することができる。投与量は、被投与者の年 齢、体重、健康状態、性別、症状、投与経路、投与回数、剤型などによって適宜に変 更することができ、具体的な投与手順は当業者により設定することができる。例えば、 成人には、錠剤として投与する場合に 0.1 μ g〜10g、好ましくは 1 μ g〜lg、さらに好ま しくは 10 μ g〜100mgを 1日に 1〜5回投与することができる。
[0023] この細胞死誘導剤を遺伝子治療剤として使用する場合は、注射により直接投与す る方法のほか、 2本鎖 RNAの発現ベクターを投与する方法を採用することもできる。 ベクターとしては、アデノウイルスベクター、アデノ関連ウィルスベクター、ヘルぺスゥ イノレスベクター、ワクシニアウイノレスベタター、レトロウイノレスベタター、レンチウイノレス ベクター等を使用することができる。また、 2本鎖 RNAを保持させたリボソームなどのリ ン脂質小胞体をリポフエクシヨン法により所定の細胞に導入し、この細胞を例えば静 脈内、動脈内等に全身投与する方法を採用することもできる。さらに、 2本鎖 RNAを 目的の組織または器官に導入するためには、市販の遺伝子導入キット（例えばアデ ノエクスプレス：クローンテック社）を用レ、ることもできる。
[0024] 以上の方法によって 2本鎖 RNA、またはこの 2本鎖 RNAを含有する細胞死誘導剤を 細胞に導入することによって、細胞死を誘導することができる。
[0025] 細胞死の対象は、生体の正常な機能に対して不要、または有害なガン細胞やガン 新生血管内皮細胞等とすることができる。例えば、特定のガン細胞表面でのみ発現 するタンパク質やガン細胞特異的な新生血管等を標的として、抗体やリボソーム等の 担体を用いてガン細胞に 2本鎖 RNAを作用させ、ガン細胞の Ago2遺伝子発現を選 択的に抑制させることによって、ガン細胞の死滅を誘導することができる。例えば、本 願発明者らは、カチォニックリボソーム (TFL-3)の使用によって、肺内に生じた新生 血管内皮細胞に選択的に治療用遺伝子を送達できることを示している（Li, W. et al.， Int. J. Pharm. 276:67-74, 2004) 0また、ファージディスプレイ法によって取得された 、新生血管に高レ、集積性を持つ数種のペプチドで PEG末端を修飾した抗ガン剤封 入リボソームが、高い腫瘍増殖抑制効果を発揮することも報告されている（Kondo, Μ· et al. , Int. J. Cancer, 108:301—306, 2004; Assai, T. et al.， FEBS Lett. , 520: 167 - 17 0, 2002) 0またさらに、本願発明者らは、細胞内に移行後に速やかに細胞質内に 2本 鎖 RNAを放出することのできる、内封薬物放出性をプログラムしたリボソームの開発 にも成功している（Moreira, J.N. et al., Pharm. Res. 19:265-269, 2002) 0これらの公 知技術の使用によって、本願発明の 2本鎖 RNAを特定の細胞（例えばガン細胞ゃガ ン新生血管内皮細胞など）へ特異的に送達させることが可能であり、それらの細胞を 選択的に死滅させることが可能である。
[0026] 標的の細胞に到達しなかった 2本鎖 RNAは担体とともに肝臓 '脾臓のマクロファー ジにより取り込まれて分解されるため、正常細胞に対する毒性はない。
[0027] なお、本願発明のその他の態様は、公知の文献等に基づいて当業者であれば容 易かつ確実に実施可能である。例えば、この発明の医薬組成物の調製は Remington' s Pharmaceutical ciences, 18th Edition, ed. A. Gennaro, Mack Publishing Co., Eas ton, PA, 1990に、遺伝子工学および分子生物学的技術は Sambrook and Maniatis, i n Molecular Clonmg-A Laboratory Manual, し old Spring Harbor Laboratory Press, N ew York, 1989; Ausubel, F. M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, N.Y, 1995等に記載されている。
[0028] 以下、実施例を示して本願発明に係る 2本鎖 RNAの作用効果について詳しく説明 する力 本願発明は以下の例に限定されるものではない。
実施例 1
[0029] ： HT1080細胞における 2本鎖 RNAの Ago2遺伝子発現抑制
以下の、 Ago2を標的とする 2本鎖 RNA (siAgo2)を調製した。
[1]センス鎖： 5し GGAGAACAAUCAAAUUACAGGCCAAAG- 3，（配列番号 2) アンチセンス鎖： 3 -UACCUCUUGUUAGUUUAAUGUCCGGUU-5' (配列番号 3) [2]センス鎖： 5'- UGGACAUCCCCAAAAUUGACAUCUAAG- 3' (配列番号 4) アンチセンス鎖： 3 -UAACCUGUAGGGGUUUUAACUGUAGAU-5' (配列番号 5) [3]センス鎖： 5'-ACAGAUUCCCAAAGGGUAAAGUUUAAG-3，（配列番号 6) アンチセンス鎖： 3 -UAUGUCUAAGGGUUUCCCAUUUCAAAU-5' (配列番号 7) [4]センス鎖： 5'-CCCAAAGGGUAAAGUUUACCAAAGAAG-3' (配列番号 8) アンチセンス鎖： 3 -UAGGGUUUCCCAUUUCAAAUGGUUUCU-5' (配列番号 9) [5]センス鎖： 5'- GAAUCAUGGUCAAAGAUGAGAUAGCAG- 3' (配列番号 10) アンチセンス鎖： 3 -UACUUAGUACCAGUUUCUACUCUACUG-5' (配列番号 11) [6]センス鎖： 5'-GCACGGAAGUCCAUCUGAAUU-3，（配列番号 12)
アンチセンス鎖： 3 -UUCGUGCCUUCAGGUAGACUU-5' (配列番号 13) また、コントローノレとして、 Luciferase遺伝子（pGL-3)を発現抑制することが既知の 以下の 2本鎖 RNA (siNS :非特許文献 3)を調製した。
[0030] センス鎖： 5し CUUACGCUGAGUACUUCGATT— 3，（酉己歹 IJ番号 14)
アンチセンス鎖： 3 -TTGAAUGCGACUCAUGAAGCU-5' (配列番号 15) 配列番号 12、 13のオリゴヌクレオチドからなる 2本鎖 RNA (siAgo2 [6])とコントロー ルの 2本鎖 RNA (siNS)を、 Lipofectamine2000を用いてヒト線維肉腫細胞 HT1080に導 入した。なお 2本鎖 RNAと Lipofectamine2000の割合は 1 : 5、 2本鎖 RNA濃度は 12.5 n Mである。 24時間の導入処理の後、未導入の 2本鎖 RNAを除去し、 RT-PCR法により Ago2遺伝子の mRNA量を経時的に測定した。
[0031] 結果は図 1に示したとおりである。 siAgo2 [6]の細胞導入によって、コントロール（siN
S)と比較して顕著な Ago2 mRNAの抑制が確認された（図 1A)。
[0032] また、 2本鎖 RNAによる発現抑制の特異性を確認するため、ハウスキーピング遺伝 子である iS —ァクチンの発現を測定した（図 1B)。さらに、 pDNAベクター（pGL3改変 ベクター）を同時にトランスフエクシヨンして、 2本鎖 RNAの細胞内導入効率を確認し た（図 1C)。その結果、非特異的な遺伝子発現の抑制はなぐまたトランスフエクショ ン効率にも問題がないことが確認、された。
[0033] さらに、前記の 2本鎖 RNAを Lipofectamine2000を用いて HT1080細胞に導入し、細 胞毒性、細胞増殖性の簡便な評価法として汎用されている MTT assayによって 2本鎖 RNAの細胞死誘導活性を評価した。その結果、図 2に示したとおり、 siAgo2 [6]を用い た場合、コントロール (siNS)と比較して細胞生存率は有意に減少した。
[0034] また、細胞の実数を測定して細胞増殖の程度を検討した。その結果、図 3に示した とおり、 siAgo2 [6]を用いた場合には、コントロール (siNS)と比較して細胞増殖率は有 意に減少した。
[0035] なお、 siAgo2 [1]— [5]を用いた場合にも同様の結果が得られた。
[0036] 以上の結果から、本願発明の 2本鎖 RNAが、腫瘍細胞の細胞死誘導（あるいは増 殖抑制）活性を有することが確認された。 実施例 2
[0037] ： HUVEC細胞における 2本鎖 RNAの Ago2遺伝子発現抑制
HUVEC (a human umbilical vein endothelial cell :ヒト臍帯血管内皮細胞）を用いた 以外は、実施例 1と同様にして Ago2遺伝子の mRNA量を経時的に測定した。
[0038] 結果は図 4に示したとおりである。 siAgo2 [6]の細胞導入によって、コントロール（siN
A)と比較して顕著な Ago2 mRNAの抑制が確認された（図 4上）。
[0039] また、 βーァクチンの発現を測定した結果（図 4下）、 siAgo2 [6]の細胞内導入によ る非特異的な遺伝子発現の抑制はないことも確認された。
[0040] さらに、実施例 1と同様にして、 2本鎖 RNAを導入した HUVEC細胞の細胞生存率（ 図 5)および細胞増殖率（図 6)を測定し、本願発明の 2本鎖 RNA (siAgo2 [6])が HUV
EC細胞に対しても細胞死誘導活性を有することが確認された。
[0041] なお、 siAgo2 [1]— [5]を用いた場合にも同様の結果が得られた。
実施例 3
[0042] ： HUVEC細胞による tube formation assay
siAgo2 [6]を、 Lipofectamine2000を用いて HUVEC細胞に導入した。 24時間の導入 処理の後の HUVEC細胞を、マトリゲルでコートした培養プレート上に撒き、血管類似 構造体の形成を観察した（tube formation assay)。
[0043] 結果は図 7に示したとおりであり、無処理、 Lipofectamine2000単独およびコントロー ル (siNA導入）では血管類似構造体の形成が観察されたが、 siAgo2 [6]を導入した H
UVEC細胞で血管類似構造体の形成は阻害された。
[0044] なお、 siAgo2 [1]— [5]を用いた場合にも同様の結果が得られた。
[0045] 以上の結果から、本願発明の 2本鎖 RNAが、がん新生血管の伸展を有効に抑制す ることが確認された。

Claims

請求の範囲
ヒト細胞内において、 Argonaute2遺伝子の転写産物 mRNAを破壊することによって細 胞死を誘導する 18-30塩基の 2本鎖 RNA。
配列番号 1の塩基配列からなる Argonaute2遺伝子 cDNAの第 144-168位配列に相当 する RNAを含むセンス鎖 RNAと、そのアンチセンス鎖 RNAと力 なる請求項 1の 2本鎖 RNA。
配列番号 1の塩基配列力 なる Argonaute2遺伝子 cDNAの第 180-204位配列に相当 する RNAを含むセンス鎖 RNAと、そのアンチセンス鎖 RNAと力らなる 2本鎖 RNA。 配列番号 1の塩基配列力 なる Argonaute2遺伝子 cDNAの第 791-815位配列に相当 する RNAを含むセンス鎖 RNAと、そのアンチセンス鎖 RNAと力らなる 2本鎖 RNA。 配列番号 1の塩基配列からなる Argonaute2遺伝子 cDNAの第 798-822位配列に相当 する RNAを含むセンス鎖 RNAと、そのアンチセンス鎖 RNAとからなる 2本鎖 RNA。 配列番号 1の塩基配列からなる Argonaute2遺伝子 cDNAの第 1233-1257位配列に相 当する RNAを含むセンス鎖 RNAと、そのアンチセンス鎖 RNAとからなる 2本鎖 RNA。 配列番号 1の塩基配列からなる Argonaute2遺伝子 cDNAの第 1425-1443位配列に相 当する RNAを含むセンス鎖 RNAと、そのアンチセンス鎖 RNAとからなる 2本鎖 RNA。 センス鎖 RNAが配列番 2の RNAであり、アンチセンス鎖 RNAが配列番号 3の RNAであ る請求項 2の 2本鎖 RNA。
センス鎖 RNAが配列番 4の RNAであり、アンチセンス鎖 RNAがと配列番号 5の RNAで ある請求項 3の 2本鎖 RNA。
センス鎖 RNAが配列番 6の RNAであり、アンチセンス鎖 RNAが配列番号 7の RNAであ る請求項 4の 2本鎖 RNA。
センス鎖 RNAが配列番 8の RNAであり、アンチセンス鎖 RNAが配列番号 9の RNAであ る請求項 5の 2本鎖 RNA。
センス鎖 RNAが配列番 10の RNAであり、アンチセンス鎖 RNAが配列番号 11の RNAで ある請求項 6の 2本鎖 RNA。
センス鎖 RNAが配列番 12の RNAであり、アンチセンス鎖 RNAが配列番号 13の RNAで ある請求項 7の 2本鎖 RNA。 [14] 請求項 1に記載の 2本鎖 RNAの有効量を含有する細胞死誘導剤。
[15] 請求項 2から 7に記載の 2本鎖 RNA力も選択される 1または 2以上の 2本鎖 RNAを含有 する請求項 14の細胞死誘導剤。
[16] 2本鎖 RNAが請求項 8から 13に記載の 2本鎖 RNAのいずれかである請求項 15の細 胞死誘導剤。
[17] 請求項 14、 15または 16に記載の細胞死誘導剤を細胞に導入することを特徴とする 細胞死誘導方法。
[18] 細胞がガン細胞である請求項 17の細胞死誘導方法。
[19] 細胞がガン新生血管内皮細胞である請求項 17の細胞死誘導方法。
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