WO2007083823A1

WO2007083823A1 - マンネンタケ処理物のアンドロゲン受容体結合活性

Info

Publication number: WO2007083823A1
Application number: PCT/JP2007/051026
Authority: WO
Inventors: Ryuichirou Kondou; Kuniyoshi Shimizu; Jie Liu; Shoichiro Kumamoto; Fumiko Konishi; Yoshitarou Suimi; Masanori Noguchi
Original assignee: Kyushu University, National University Corporation; Chlorella Industry Company, Limited
Priority date: 2006-01-17
Filing date: 2007-01-17
Publication date: 2007-07-26
Also published as: JPWO2007083823A1

Abstract

本発明は、マンネンタケ抽出物を有効成分として含むアンドロゲン受容体結合物質に関する。本発明のアンドロゲン受容体結合物質は、アンドロゲン受容体を介するシグナルの研究試薬、又はアンドロゲン依存的な疾患もしくはアンドロゲン受容体を介する疾患の治療剤として有用である。

Description

明細書マンネンタケ処理物のアンドロゲン受容体結合活性技術分野 .

本発明は、マンネンタケ（霊芝）処理物を含むアンドロゲン受容体結合物質に関する。背景技術

マンネンタケ（霊芝）は、数々の薬効が伝承されており、特に癌に効くキノコとして知られている。マンネンタケには様々な生理作用を及ぼす物質が存在することが証明されている。

これまでに、本発明者は、マンネンタケのアルコール類等抽出物が、 5 ひーリダクターゼ活性の阻害作用を有し、前立腺癌、前立腺肥大症、男性型脱毛症、尋常性ァクネ、脂漏等の疾患に有効であることを見出している（特許第 3530880号 (JP3530880) , 国際公開第 2005/079164号パンフレツト）。

5 α—リダクターゼは男性ホルモンの主体であるテストステロンをジヒドロテストステロンに変換する酵素であることが知られている。そして、前立腺癌、前立腺肥大症、男性型脱毛症、尋常性ァタネ、脂漏等の疾患は、男性ホルモン刺激の増大に起因することが知られている。したがって、 5 ひ一リダクターゼの活性を阻害するマンネンタケ抽出物は、これらの疾患に対して有効な治療効果を有するものであるといえる。

最近、前立腺の増殖した肥大結節がアンドロゲン依存性を有していることが明らかにされたため、抗アンドロゲン剤が開発され、市販されている。

しかしながら、これまでに、マンネンタケ（霊芝）抽出物のアンドロゲン受容体に対する作用は研究されておらず、明らかにされていなかった。発明の開示

本発明は、アンドロゲン受容体結合物質を提供することを目的とする。詳しくは、マンネンタケ（霊芝）処理物を含むアンドロゲン受容体結合物質を提供することを目的とする。

また、本発明は、アンドロゲン受容体結合物質のスクリーニング方法を提供することを目的とする。

本発明者はマンネンタケ処理物の生理作用について鋭意研究を行った結果、マンネンタケ処理物が、アンドロゲン受容体結合活性を示すとともに前立腺癌細胞の細胞增殖抑制作用及び Z又は前立腺癌に対する抗腫瘍作用を有することを見出した。本発明は、以上の知見から完成されたものである。すなわち、本発明は以下に関する。

( 1 ) マンネンタケ処理物を含む、アンドロゲン受容体結合物質。

( 2 ) ラノスタン型トリテルペンを含む、アンドロゲン受容体結合物質。

上記ラノスタン型トリテルペンは、例えば、マンネンタケ由来のトリテルペンである。

( 3 ) Ganoderic acid TR, ganoderic acid DM , ganoderic acid A, ganoderic acid B, ganoderic acid C2, ganoderic acid D, ganoderic acid F, ganoderic acid H, ganoderic acid I, 5a-lanosta-7,9(ll)24-triene- 15a,26-dihydroxy-3-one、 ganoderol B、 lucidumol B， Ganoderiol A, 及び ganoderiol Fからなる群から選択される少なくとも一つを含む、アンドロゲン受容体結合物質。

上記物質のうち、'好ましくは ganoderol Bである。

上記（1 ) 〜（3 ) において、アンドロゲン受容体結合物質は、好ましくはァンドロゲン受容体アンタゴニストである。

( 4 ) 試験化合物の存在下又は非存在下において、マンネンタケ処理物とアンドロゲン受容体との結合活性を測定することを含む、アンドロゲン受容体結合物質のスクリ一二ング方法。

マンネンタケ処理物として、例えば、ラノスタン型トリテルペン又は Ganoderic acid TR, ganoderic acid DM , ganoderic acid A, ganoderic acid B, ganoderic acid C2, ganoderic acid D， ganoderic acid F, ganoderic acid H， ganoderic acid I, 5a-lanosta-7,9(ll)24-triene- 15a,26-dihydroxy-3-one ganoderol B、lucidumol B Ganoderiol A, 及び ganoderiol Fからなる群か選択される少なくとも一つを用いることができる。図面の簡単な説明

図 1は、 LNCaP細胞増殖に対する ganoderic acid DM (2)の効果を示す図である（n= 3)。 Tはテストステロン、 DHTはジヒドロテストステロン、「*」は T又は DHTに対して p<0.05、及び「**」は T又は DHTに対して p<0.01を示す。図 2は、 LNCaP細胞増殖に対する La (12)の効果を示す図である（n = 3)。 T はテストステロン、 DHTはジヒドロテストステロン、「*」は T又は DHTに対して p<0.05、及び「**」は T又は DHTに対して ρ<0·01を示す。

図 3は、 LNCaP細胞増殖に対する ganoderol B (13)の効果を示す図である（n = 3)。 Tはテストステロン、 DHTはジヒドロテストステロン、「*」'は T又は DHT に対して p<0.05、及び「**」は T又は DHTに対して pく 0.01を示す。

図 4は、アンドロゲン受容体（AR) への競合的結合に対する ganoderol B及ぴ DHTの効果を示す図である。「園」は ganoderol Bを示し、「▲」は DHTを示す。図 5は、テストステロンによる前立腺肥大への ganoderol Bの抑制効果を示す図である（n = 4)。それぞれのカラムは平均士 S.E.M.を示す。 Cは去勢ラット、 T はテストステロン、エタノール抽出物は G. のエタノール抽出物、及び

「*」は C + Tに対して pく 0.05を示す。

図 6は、アンド口ゲンで刺激した細胞培養液に Ganoderol Bを添加した際における PSA及びアンドロゲン受容体（AR) の発現解析結果を示す図である（平均土 SD、 n = 3)。パネル aは PSAの発現及ぴパネル bは ARの発現を示す。 Tはテストステロン及ぴ DHTはジヒドロテストステロンを示す発明を実施するための最良の形態

以下に本発明の実施の形態について説明する。以下の実施の形態は、本発明を説明するための例示であり、本発明は、その要旨を逸脱しない限り、さまざまな形態で実施をすることができる。なお、本明細書において引用した文献、及び公開公報、特許公報その他の特許文献は、参照として本明細書に組み込むものとする。また、本明細書は、本願優先権主張の基礎となる米国仮出願第 60/759,795 号の開示内容を包含する。本発明は、マンネンタケ（霊芝）処理物を有効成分として含むアンドロゲン受容体の結合物質に関する。

本発明のアンドロゲン受容体結合物質は、アンドロゲン受容体に結合し、受容体を介する作用に影響する。本発明の物質によるアンドロゲン受容体を介する作用への影響は、活性化効果であってもよいし、抑制効果であってもよい。受容体を介する作用の抑制効果は、例えば、前立腺癌細胞の増殖抑制効果（実施例 1 )、前立腺肥大防止効果（実施例 5 )、前立腺癌マーカーの発現抑制効果（実施例 6 ) 又はアンドロゲン受容体の発現抑制効果（実施例 6 ) として観察される。

また、本発明者はこれまでにマンネンタケ抽出物が 5 _α—リダクターゼ活性阻害作用を有することを明らかにしている。そこで、本発明のアンドロゲン受容体結合物質の 5 一リダクターゼ活性阻害作用を測定したところ、アンドロゲン受容体結合物質の中には当該作用を有するものと、当該作用を有しないものがあつた。したがって、本発明のアンドロゲン受容体結合物質のアンドロゲン受容体結合活性及び前立腺癌細胞に対する作用などは、 5 α—リダクターゼ活性阻害作用に依存する作用ではないといえる。すなわち、本発明によりマンネンタケ処理物の新しい作用機序が見出され、本発明はマンネンタケ処理物の新規用途を提供するものである。本発明のアンドロゲン受容体結合物質は、マンネンタケ処理物を有効成分として含有する。

本発明に用いるマンネンタケは、学名が Ganoderma lucidumであり、ヒダナシタケ目マンネンタケ科に属するキノコである。マンネンタケは、一般的に霊芝と呼ばれており、古来中国では霊芝又は芝草と呼ばれ、日本ではレイシ、サイワィタケと呼ばれることもある。

本発明において、マンネンタケ処理物は、マンネンタケを抽出処理、破砕処理などすることにより得られるものである。したがって、本発明のマンネンタケ処理物には、マンネンタケ抽出物、マンネンタケ破砕物又はこれらの粉末などが含まれる。

本発明のマンネンタケの抽出物を得るための抽出処理には、メタノール、 i2 _ へキサン、エタノール、エーテル、酢酸ェチル等の有機溶媒又は水が用いられる。また、抽出処理はマンネンタケを含浸させ放置することにより抽出する有機溶媒抽出法及びソックスレー抽出器を用いた加熱還流によるソックスレー抽出法を適用することができるが、これらの方法に限定されず、当業者であれば公知の抽出方法を適宜選択することができる。本発明のマンネンタケ抽出物は、抽出液、その濃縮液、濃縮液を乾固させた固体又はその粉末などのいずれの形態であってもよい。

例えば、メタノール抽出法については、霊芝子実体 5 . O gを破砕し、メタノール 6 O m lを加え、室温で一日放置し、抽出液を取り出し、残渣にさらにメタノールを加えて抽出する方法を採用することができる。この操作を合計 3回行い、得られた抽出液を合わせて濃縮及び乾固させることにより、抽出物を調製する。本発明のマンネンタケ破砕物を得るためには、ウイリーミルやボールミルで粉砕してもよいし、はさみ等で細かく切り刻んでも良い。本発明のマンネンタケ破砕物には、粉末状のマンネンタケが含まれる。また、本発明のマンネンタケ破砕物は、マンネンタケを爆砕処理することにより得ることもできる。爆砕処理により得られたマン不ンタケ破砕物も、本発明のマンネンタケ処理物に含まれる。また、本発明のマンネンタケ処理物は、アルコール飲料や清涼飲料等に上記マンネンタケ処理物を添加したような形態でもよい。

また、本発明においてマンネンタケ処理物は、シリカゲルカラムクロマトダラフィ一、逆相分取液体クロマトグラフィー、薄層クロマトグラフィー（TLC) などの各種クロマトグラフィ一によつて分画操作を繰り返すことにより、さらに単離及び精製することができるが、単離及び精製はこれらの方法に限定されるものではない。また、分画、単離、精製工程において、アンドロゲン受容体結合活性を指標に使用することもできる。さらに、所望の場合は、細胞増殖抑制作用、前立腺肥大防止作用、前立腺癌マーカーの発現抑制作用等を、本発明のマンネンタケ処理物の性質を確認するための指標に採用することもできる。

上記のように分画、単離、精製することにより、アンドロゲン受容体結合活性を有する本発明のマンネンタケ処理物を得ることができる。分離、単離、精製などにより得られた処理物（例えば、単離化合物）も、本発明のマンネンタケ処理物に含まれる。

本発明のマンネンタケ処理物は、好ましくはラノスタン型トリテルペンである。本明細書において、ラノスタン型トリテルペンは、下記式（I) で示すラノスタン骨格を有するトリテルペンである。本発明のラノスタン型トリテルペンは、上記のようにマンネンタケを処理することにより取得することができる。

本明細書において、ラノスタン型トリテルペン（トリテルぺノイド）には、例えば、 anoderic acid TR ganoderic acid DM、 ganoderic acid A、 ganoderic acid B、 ganoderic acid C2_S ganoderic acid D、 ganoderic acid ganoderic acid G、 ganoderic acid H、 ganoderic acid I及び ganoderenic acid A等のガノアリックァシッド体だけでなく、 5orlanosta-7,9(ll)24-triene-15a，26-dihydroxy-3-one、 ganoderol B lucidumol B、 sranoaermatrioL ganodermanontriol_N ganoderiol A 及び ganoderiol F等のアルコール体をも含まれる。

これらのトリテルペンの構造を下記に示す。

constituent Ri R₄ R₆

5a-lanosta- 7,9(11) '24- triene-15of ,26- dihydroxy-

0 OH CH₂ OH CH₃

-one

メ OH

Ganoderol β H CH₂ OH CH₃

"""IK

メ OH

lucidumol B H OH CH₃ CH₂ OH GH₃

'"""a

メ OH

ganodermafcriol H CH₂ OH CH₂ OH

H

ganodermanontriol 0 H OH OH CH₂ OH CH₃

OH

ganoderiol A H OH OH CH₂ OH CH₃ ganoderiol F 0 H CH₂ OH CH₂ OH

上記表中、「Δ ²⁴⁽²⁵⁾」は、 24位の炭素及び 25位の炭素が二重結合していることを意味する。

Ganoderic acid TR

Ganoderenic acid A

Ganoderic acid DM

constituent R₃ ganoderic acid A 0 OH H H

OH

ganoderic acid B 0 H

《 H

'H

ganoderic acid C2 OH H H ganoderic acid D 0 0 H H ganoderic acid F 0 0 OAc H ganoderic acid G 0 OH H

'、H

メ OH

ganoderic acid H 0 OAc H ganoderic ■ acid I 0 H OH

"π 上己のトリアルペンの中でも、 ganoderic acid TR, ganoderic acid DM ， ganoderic acid B, ganoderic acid D, lucidumol B, 5a-lanosta-7,9(ll)24-triene- 15a,26"dihydro y-3-one 、 ganoderol B 及ぴ ganoderiol Fは、極めて高いアンドロゲン受容体結合活性を示す。アンドロゲン受容体（以下、「アンドロゲンレセプター」、「AR」ともいう）は、核内ホルモン受容体の一つである。核内ホルモン受容体は、 DNA結合部位（DBD) とリガンド結合部位（LBD) の二つのドメインからなるタンパク質である。アンドロゲンがアンドロゲン受容体の LBDに結合すると、 LBDの構造変化によって DBDの構造が変化し、 DBDがアンドロゲン応答配列に結合する。そして、応答配列の下流に存在する標的遺伝子を転写活性化することにより、アンドロゲンによるアンドロゲン受容体を介する作用が発現する。アンドロゲン受容体結合物質は、アンドロゲン受容体に結合し、アンドロゲン受容体を介する作用を活性化する物質（ァゴ二スト）又は阻害する物質（アンタゴ-スト）を意味する。アンドロゲン受容体のァゴニストは、アンドロゲン受容体を介する遺伝子の転写を促進する作用、又はテストステロンゃジヒドロテストステロンによるアンドロゲン受容体を介する作用を促進する作用を有するものといえる。また、アンドロゲン受容体のアンタゴ-ストは、アンドロゲン受容体を介する遺伝子の転写を抑制する作用、又はテストステロンゃジヒドロテストステロンによるアンドログン受容体を介する作用を抑制する作用を有するものといえる。本発明においてアンドロゲン受容体結合物質は、好ましくはアンタゴニストである。本発明のアンドロゲン受容体結合物質は、医薬組成物として使用することもできるし、研究試薬として使用することもできる。

物質の有するアンドロゲン受容体への結合活性は、受容体結合アツセィにより確認することができる。受容体結合アツセィでは、アンドロゲン受容体、蛍光ラベルや放射ラベルした標識化標準物質及び試験物質を混合し、標識シグナルを測定することにより行うことができる。また、標準物質の偏光度を測定する蛍光偏光（FP) 法（実施例 1、実施例 4 ) により実施することもできる。受容体結合ァッセィでは、アンドロゲン受容体のリガンド結合部位（LBD)を利用してもよい。また、標準物質には、テストステロン、ジヒドロテストステロンの他、アンド口ゲン受容体に結合する物質を使用することができる。

また、アンドロゲン受容体結合物質の有するアンドロゲン受容体ァゴニスト活性及びアンタゴニスト活性を評価する方法は、例えば、レポーター遺伝子としてルシフェラーゼ遺伝子を用いるレポーター遺伝子アツセィを挙げることができる 1 これに限定されるわけではない。

また、アンドロゲン受容体のアンタゴニストは、細胞増殖抑制作用を有することが知られているため、細胞増殖抑制作用を指標に物質のアンタゴニスト活性を評価することもできる。この際、物質の細胞増殖抑制作用がアンドロゲン受容体を介する作用であることから、当該物質について、アンドロゲン受容体への結合アツセィ（実施例 2 ) を実施してもよい。

さらに、アンドロゲン受容体結合物質は、前立腺肥大の抑制作用（実施例 5 )、前立腺癌マーカー（PSA) の発現抑制作用（実施例 6 ) 又はアンドロゲン受容体の発現抑制作用（実施例 6 ) を有するため、アンドロゲン受容体結合物質の性質を上記作用を指標にして評価することもできる。また、本発明のアンドロゲン受容体結合物質は、前立腺肥大又は前立腺癌の治療若しくは予防、又はこれらの疾患の治療若しくは予防のための医薬組成物として有用であるといえる。

また、前述のように、本発明者はマンネンタケ抽出物が 5 ひ一リダクターゼ阻害活性を有することを明らかにしている。 5 ひ一リダクターゼは、テストステロンをジヒドロテストステロンに変換する酵素である。本発明のアンドロゲン受容体アンタゴニストの中には、 5 α—リダクターゼ阻害活性を示すものと、阻害活性を示さないものが混在していた（実施例 3 )。したがって、本発明のマンネンタケ処理物によるアンドロゲン受容体の拮抗作用は、これまでにない全く新しい機序を介する作用であると言える。本発明のアンドロゲン受容体結合物質に含有されるマンネンタケ処理物の量は、当業者であれば適宜設定することができるが、例えば、単位投薬量形状あたり 0.01 g〜 1000 mg、好ましくは O.l / g lOO mg より好ましくは 1 μ g〜： 10 mg とすることができる。

本発明のアンドロゲン受容体結合物質は、マンネンタケ処理物をそのまま用いてもよいし、薬学的に許容される担体により製剤化又は食品化してもよい。また、本発明のアンドロゲン受容体結合物質は、アルコール飲料や清涼飲料等にマンネンタケ処理物を添加した形態でもよい。製剤化等には、具体的には、製剤素材として慣用の各種有機又は無機担体物質が用いられる。固形製剤においては賦形剤、滑沢剤、結合剤、崩壊剤、増粘剤などが用いられ、液状製剤においては溶剤、分散剤、溶解補助剤、懸濁化剤、等張化剤、緩衝剤、無痛化剤などが用いられる。また、必要に応じて、防腐剤、抗酸化剤、着色剤、甘味剤などの添加物も用いることができる。

賦形剤の好適な例としては、例えば乳糖、白糖、 D-マンニトール、デンプン、結晶セルロース、軽質無水ケィ酸等が挙げられる。

滑沢剤の好適な例としては、例えばステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、タルク、コロイド、シリカ等が挙げられる。

結合剤の好適な例としては、例えば結晶セルロース、白糖、 D-マンニトール、デキストリン、ヒドロキシプロピノレセノレロース、ヒドロキシプロピノレメチノレセノレロース、ポリビエルピロリドン等が挙げられる。

崩壊剤の好適な例としては、例えばデンプン、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルスターチナトリゥム等が挙げられる。

増粘剤の好適な例としては、例えば天然ガム類、セルロース誘導体、アクリル酸重合体等が挙げられる。

溶剤の好適な例としては、例えば注射用水、アルコール、プロピレングリコール、マクロゴール、ゴマ油、トウモロコシ油等が挙げられる。

分散剤の好適な例としては、例えば Tween 80、 HCO 60、ポリエチレングリコール、カルボキシメチルセルロース、アルギン酸ナトリゥム等が挙げられる。溶解補助剤の好適な例としては、例えばポリエチレングリコール、プロピレングリコール、 D-マン-トール、安息香酸ベンジル、エタノール、トリスアミノメタン、コレステロール、トリエタノールァミン、炭酸ナトリウム、クェン酸ナトリゥム等が挙げられる。

懸濁化剤の好適な例としては、例えばステアリルトリエタノールァミン、ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリルアミノプロピオン酸、レシチン、塩化ベンザルコ二ゥム、塩化べンゼトニゥム、モノステアリン酸クセリセリン等の界面活性剤、例えばポリビュルアルコール、ポリビュルピロリドン、カルボキシメチルセル口ースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシメチノレセノレロース、ヒドロキシェチルセルロース、ヒド口キシプ口ピルセルロース等の親水性髙分子等が挙げられる。等張化剤の好適な例としては、例えば塩化ナトリウム、グリセリン、 D-マンニトール等が挙げられる。

緩衝剤の好適な例としては、例えばリン酸塩、酢酸塩、炭酸塩、クェン酸塩等の緩衝液等が挙げられる。

無痛化剤の好適な例としては、例えばべンジルアルコール等が挙げられる。防腐剤の好適な例としては、例えばパラォキシ安息香酸エステル類、クロロブタノール、ベンジルァノレコール、フエネチルアルコール、デヒドロ酢酸、ソルビン酸等が挙げられる。

抗酸化剤の好適な例としては、例えば亜硫酸塩、ァスコルビン酸等が挙げられる。

本発明のアンドロゲン受容体結合物質は、例えば、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、ドリンク剤などの経口投与形態の他、静脈内点滴、若しくは注射、あるいは筋肉内注射、経腸投与などの非経口投与形態で投与し得る。投与は全身経路による投与あるいは局所投与のいずれでもよい。また、本発明のアンドロゲン受容体結合物質を食品として摂取することもできる。

医薬製剤の具体例を以下に示すが、これに限定されるわけではない。

( 1 ) 錠剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤

本発明のアンドロゲン受容体結合物質に、例えば、賦形剤、崩壊剤、結合剤又は滑沢剤を添加して圧縮成型し、次いで必要に応じて味のマスキングを行う。腸溶性あるいは持続性を目的とするときは、所定のコーティングを行うことにより製造することができる。

( 2 ) 注射剤

本発明のアンドロゲン受容体結合物質を、例えば分散剤、保存剤、等張化剤等と共に水性注射剤として製造することができる。あるいは、ォリーブ油、ゴマ油、綿実油、コーン油等の植物油、プロピレングリコール等に溶解、懸濁あるいは乳化し、油性注射剤として製造することができる。

( 3 ) 外用剤本発明のアンドロゲン受容体結合物質を、固状、半固状又は液状の組成物とすることにより製造することができる。例えば、上記固状の組成物は、本発明のァンドロゲン受容体結合物質をそのまま、あるいは賦形剤、増粘剤等を添加、混合して粉状とすることにより製造される。

上記液状の組成物は、注射剤の場合とほとんど同様で、 .油性あるいは水性懸濁剤とすることにより製造される。半固状の組成物は、水性又は油性のゲル状、あるいは軟膏状のものがよい。 .また、これらの組成物はいずれも緩衝剤、防腐剤などを含んでいてもよい。

( 4 ) 座剤

本発明のアンドロゲン受容体結合物質を、油性又は水性の固状、半固状又は液状の組成物とすることにより製造することができる。このような組成物に用いる油性基剤としては、例えば高級脂肪酸のグリセリド（例えば、カカオ脂、ウイテプゾル類等）、中級脂肪酸（例えば、ミグリオール類等）、あるいは植物油（例えば、ゴマ油、大豆油、綿実油等）等が挙げられる。水性ゲル基剤としては、例えば天然ガム類、セルロース誘導体、ビニール重合体、アクリル酸重合体等が挙げられる。

本発明のアンドロゲン受容体結合物質は、当技術分野において従来から用いられている公知の抗腫瘍剤を含む他の治療薬と組み合わせて使用してもよい。このような使用は、本発明のアンドロゲン受容体結合物質を抗腫瘍剤として用いる際に特に有効である。従来から用いられている抗腫瘍剤の好適な例としては、アドリアマイシン、シスプラチン、コルヒチン、 CCNU ( Lmastine )、 BCNU (Carmustine)、ァクチノマイシン D、 5—フルォロゥラシル、チォテパ、サイトシンァラビノシド、シクロホスフアミド、マイトマイシン C等の 1又は 2種以上が挙げられる。

本発明のアンドロゲン受容体結合物質は、通常体重 1 K gあたり 1 日に 0.01 g〜 10000 mg、好ましくは〜； L000 mg、より好ましくは 1.0 g〜100 の投与量で 1から数回に分けて投与されるが、薬学的な有効量、投与方法又は投与手段及び投与期間は、投与対照の病理状態、性別、年齢、体重などによって左右され、当業者であれば適宜設定することができる。本発明のアンドロゲン受容体結合物質は、アンドロゲン受容体を介する作用に影響を与えることが可能であるので、アンドロゲン受容体を介するシグナルの研究試薬、又はアンドロゲン依存的な疾患もしくはアンドロゲン受容体を介する疾患の治療剤又は予防剤として有効である。アンドロゲン受容体を介する疾患としては、前立腺癌、前立腺肥大症、子宮癌、乳癌、二キビ、多毛症、男性型脱毛症、尋常性ァタネ、脂漏等が挙げられる。また、本発明のアンドロゲン受容体結合物質は、その他の医薬品、医薬部外品、化粧品、食品等への応用も可能であり、例えば、育毛料、養毛料等にも利用できる。さらに、本発明のマンネンタケ処理物は、アンドロゲン受容体に結合するため、アンドロゲン受容体結合物質のスクリーユング方法に使用することができる。すなわち、被験物質の存在下又は非存在下において、標識した本発明のマンネンタケ処理物とアンドロゲン受容体との結合活性を測定し、比較することにより、ァンドロゲン受容体に結合し、マンネンタケ処理物とアンドロゲン受容体との結合量を変化させる物質をスクリーユングすることができる。

例えば、アンド口ゲン受容体又はアンド口ゲン受容体リガンド結合部位を発現する細胞の培養液に本発明のマンネンタケ処理物を添加し、所定の時間インキュペートする。本発明のマンネンタケ処理物には、放射ラベル、蛍光ラベルなどで標識されたものを用いる。インキュベートの際に、被験物質も培養液に添加する。その後、細胞を回収し、アンドロゲン受容体に結合するマンネンタケ処理物の量を、放射活性、蛍光量などの標識を指標に測定する。そして、被験物質非存在下に比べて放射活性、蛍光量などが変化した被験物質を、アンドロゲン受容体結合物質として同定することができる。また、 FP 法を利用してスクリーニングしてもよい。 FP 法では、細胞を所定の時間インキュベートした後、偏光度を測定することにより、アンド口ゲン受容体結合物質を同定することができる。

前述のとおりアンドロゲン受容体は、細胞増殖、前立腺癌等に影響するため、本発明のスクリーニングでは、上記の受容体結合アツセィの他に、細胞増殖アツセィ、前立腺肥大測定、前立腺癌マーカー量の測定、アンドロゲン受容体発現量測定などにより結合活性を測定しても良い。以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、実施例により本発明を限定するものではない。実施例

以下の実施例ではマンネンタケエタノール抽出物から 1 8種の単離されたトリテルペンの効果について検討した。マンネンタケエタノーノレ抽出物

1 5 k gのマンネンタケ ( . lucidum) を乾燥させ、チップにした後、 1 2 6 リットルの 9 5 %エタノールを用いて、室温で攪拌しながら抽出した。得られたエタノール抽出液を、濾紙でろ過し、濃縮及び乾固し、合計 571グラム得た。 9 5 %エタノール抽出物は、シリカゲルカラムクロマトグラフィ一により分画を行レ、、薄層クロマトグラフィー（TLC) を指標に、 3 5グラムのトリテルぺノイド画分（TLC, シリカゲル、ヨウ素発色、展開溶媒：酢酸ェチル Αα-へキサン、 7 ： 3、 Rf 値 0.03-0.67) を得た。当該トリテルぺノィド画分を分取逆相 H P L C (Inertsil ODS-3, 20 X 250 mm) を繰り返すことによって、以下の 1 8種のトリテルぺノィド類を単離し、同定した。 Samples

(1) ganoderic acid TE

(2) ganoderic acid DM

(3) ganoderic acid A

(4) ganoderic acid B

(5) ganoderic acid C2

(6) ganoderic acid D

(7) ganoderic acid F

(8) ganoderic acid G

(9) ganoderic acid H

(10) ganoderic acid I

(11) ganoderenic acid A

(12) 5a-lanosta-7,9(ll)24-triene-15 ,26-dihydroxy3-one

(13) ganoderol B

(14) lucidumol B

(15) Ganodermatriol

(16) Ganodermanontriol

(17) ganoderiol A

(18) ganoderiol F

(1)〜（11)はアシッド体であり、（12)〜（18)はアルコール体である。なお、（12) の「5ot-lanosta-7，9(ll)24-triene- 15ot,26-dihydroxy-3-one」を、「La」と記す場合がある。実施例 1 ：前立腺癌細胞の増殖抑制効果

アンドロゲン受容体（AR)陽性ヒト前立腺癌 LNCaP細胞は ATCC (American Type Culture Collection) から入手した。細胞は、 10%ゥシ胎児血清（FBS) を添加した RPMI 1640中に、 37°C、 5% C0₂、 95%空気の加湿雰囲気下でィンキュペートした。細胞は、分割比 1:4で 5〜30回継代したものを用いた。細胞は、 2 X 10⁵個/ゥエルの濃度でステロイド枯渴（DCC-stripped) cFBSを添加した 24 ゥエルプレートに播種した。 2 4時間後、細胞を各濃度のマンネンタケ抽出物の存在下又は非存在下にコントロール（DMSO) 又はアンドロゲン（テストステロン（T) 又はジヒドロテストステロン（DHT) ) でさらに 3日間処置した。細胞増殖ァッセィ：細胞増殖は 3-amino-7-dimethylamino-2-methylr»lienazine T/JP2007/051026

(neutral red： NR) 法により測定した。 5 mg/mlの NR溶液を作製し、培養培地で 5 /z g/mlに希釈した。 NR抽出溶液は、水及ぴ 50 %ェタノール（1%酢酸）を使用して作製した。

培養培地を NR溶液に換え、 37°Cで 3時間培養した。続いて、 NR溶液を吸引し、細胞をリン酸緩衝生理食塩水（FBS) で 2回洗浄した。 500 mlの NR抽出溶液を各ゥヱルに添加し、室温で 2 0分間抽出処理を行った。各ゥヱルについて、 540 nmの吸光度を測定した。図 1〜3に、ヒト前立腺癌 LNCaP細胞に対するマンネンタケ抽出物の増殖抑制効果を示す。

ganoderic acid DM (2) (図 1 )、 La (12) (図 2 ) 及ぴ ganoderol B (13) (図 3 ) は顕著な細胞増殖抑制効果を示した。このうち、 ganoderol B (13)と La (12)は、テストステロン（T) とジヒドロテストステロン（DHT) を添加した場合は、細胞毒性を示さない濃度で、 T及び DHTにより誘導される細胞増殖促進に対して抑制効果を示した。

このように、マンネンタケ処理物を含む本発明のアンドロゲン受容体結合物質は、アンドロゲン依存的な前立腺細胞の増殖を抑制することが可能であることが示された。実施例 2 ：アンドロゲン受容体結合実験

アンドロゲン受容体競合アツセィ：エタノール抽出物のアンドロゲン受容体 (AR) への結合能は、蛍光偏光（FP) 法を利用して測定した。この測定方法では、室温下におけるヒト ARの精製再構成リガンド結合ドメイン（LBD) タンパク質と高親和性の蛍光リガンド（AL Green) との結合に対するエタノール抽出物の競合能を測定した。 FT 法は、概念的には、蛍光分子が他の分子に結合することに伴う回転速度の変化を利用して ARに対する試験化合物の相対親和性を定量することができる。つまり、アンドロゲン受容体一蛍光リガンドの結合複合体 2007/051026

(AE-AL Green) は、ゆつくりと回転し、高い F 値を有する。一方、競合リガンドの濃度が上昇すると > AR— AL Green複合体から AL Greenが移動されて遊離する。遊離した AL Greenは、早く回転するため、低い FP値を示す。測定される偏光は、遊離 AL Green分子及ぴ結合 AL Green分子の平均であるため、 KP 法により AR-LBDからの競合置換を測定することができる。

本競合アツセィを簡単に説明する。競合アツセィは、 Androgen receptor competitor assay, green (Invitrogen) を用いて行った。全ての試験化合物を、 DMSO又はエタノール中のストツク溶液として調製した。化合物を、 384ゥエルプレート上で 3ゥエルずつ、アツセィバッファーを用いて 20 _t Lの容量で、 0.01, 0.125， 1.25, 12.5, 25, 50, 100， 200又は 800 /χ Μの濃度に希釈した。最終 DMSO 濃度及び最終エタノール濃度は、いずれもキット製造元の推奨濃度を超えず、したがって、 DMSO及ぴエタノールは蛍光を変化させないと予想された。

20 μ 1容量の AR (ラット、最終 25 ηΜ) 及ぴ AL Green (最終 1 nM) を、連続的に希釈された試験化合物に添加した。続いて、プレートを暗中で約 4時間室温でインキュベートした。次に、偏光を、 485 nm励起及び 535 nm発光干渉フィノレタ一を用いて beacon 2000 fluorescence polarization instrument (Invitrogen) 上、偏光モードで測定した。偏光値（mP) は、試験化合物の濃度上昇に対してプロットした。

測定した IC50を表 1に示す。

表 1 アンドロゲン受容体結合活性に対するマンネンタケ G, luciduni) 由来の各化合物（1〜18) の IC₅oの比較

Compound IC₅₀ (μΜ)

ganoderic acid TR (1) 42 ganoderic acid DM (2) 21 ganoderic acid A (3) 350 ganoderic acid B (4) 88 ganoderic acid C2 (5) 371 ganoderic acid D (6) 31 ganoderic acid F (7) 322 ganoderic acid G (8) >100 ganoderic acid H (9) 189 ganoderic acid I (10) 303 ganoderenic acid A (11)

5a-lanosta-7，9(ll)，24-triene-15a，26-dihydroxy-3 -one (12) 13

ganoderol B (13) 15 lucidumol B (14) 74 ganodermatriol (15) >100 ganodermanontriol (16) >400 ganoderiol A (17) 470 ganoderiol F (18) 25

実施例 2で低い ICsoを示した ganoderic acid DM (2)、 La (12)、 ganoderol B (13)は、実施例 1において細胞増殖抑制作用を示した化合物である。

表 1に示すように、本発明のマンネンタケ処理物は、アンドロゲン受容体結合活性を有することが示された。

したがって、アンドログン受容体結合活性を有する本発明のマンネンタケ処理物は、アンドロゲン受容体と結合することで、アンドロゲン依存性の細胞の機能 (前立腺肥大症など）を阻害することができる。つまり、マンネンタケ処理物を含む本発明のアンドロゲン受容体結合物質は、前立腺肥大症等のアンドロゲン依存性の疾患の予防 ·改善に有効であるといえる実施例 3 : 5 α—リダクターゼ阻害活性

SD 系雌ラット肝臓をホモジナイズしたものからミク口ソーム画分を調製し、 -80°Cで凍結保存しているものを 5 α—リダクターゼ粗酵素液とした。

反応系は全量 300 1の系とした。 [4-14C]-テストステロン（8n Ci、 0.7 μ Μ、全テストステロン中の 0.5%程度が放射活性をもつ基質）及ぴコールド（非放射体）のテストステロンを含む 4.5 mMエタノール溶液 10 (反応系の最終濃度が 0.15 mM)、 1 mMジチォトレイオールを含む 20 mM リン酸 buffer (pH6.5) 220 μ 1、サンプル一 DMSO溶液 ΙΟ μ Ιを添加し、 37°C、 10分間インキュベートした。コントロールとしては DMSO のみを加えた。インキュベート後、 1 mM NADPH-buffer溶液 50 1 と、先に調製した 5ひ一リダクターゼ粗酵素液 10 μ 1 とを添加して反応をスタートした。 37°C、 10分間インキュベート後、 3M-NaOH 水溶液を 10 1添加して反応を止めた。エーテル 900 1を反応系に加えてボルテッタスで撹拌することによってステロイド類を抽出し、このうち 200 μ 1を TLC 板にアプライした（展開距離は 8 cm)。展開溶媒は酢酸ェチル： -へキサン（7 : 3) の混合溶媒で展開し、この TLC板上の放射活性をイメージングアナライザー (FRA-5000 RF、 Fuji Film Co. LTD.) で計測した。コント口ール（阻害剤なし）の活性を酵素活性 100%として、 5 α—リダクターゼ活性を以下のように計算した。

5ひ一リダクターゼ活性（％)

= (ジヒドロテストステロンのスポットの放射活性 ζ

アプライした位置から溶媒を展開させた上限までの TLC板全体の放射活性） X 100

5 α—リダクターゼ阻害活性（％)

= { (コントロールの活性一サンプルの活性） /コントロールの活性 } X 100 各化合物（表 1の化合物（1)〜（18) ) の 5 _α—リダクターゼ阻害活性は、表 2と表 3に示す。化合物の溶解度の制限で、 IC₅₀を測定できなかった化合物は、最大溶解度における 5ひーリダクターゼ阻害活性を測定した。アルコール体の 5 α—リダクターゼ阻害活性

以上の実施例の結果から、本発明のアンドロゲン受容体結合物質の有する 5ひ一リダクターゼ阻害活性と前立腺がん細胞の細胞増殖抑制効果との間に直接的な関係は見当たらなかった。細胞の増殖を抑制するには、様々な経路が存在している。特に前立腺がんについては、さらなる検討が必要である。実施例 4 ： ganoderol Bのアンドロゲンレセプター結合試験

本実施例では、大腸菌（E.coli)で発現された組み換えラット ARタンパク質を使用した（Pan Vera)。この ARタンパク質は、分子量は 48.4 KDaであり、ヒンジ領域とリガンド結合ドメイン（LBD)の両者を含み、チォレドキシンと融合している。 Pan Vera 社の AR LBDのアミノ酸配列はヒト AR LBDと同一である。

本実施例は実施例 2と同様の蛍光偏光法を用いて行った。競合アツセィは、市販のキットである、 Androgen receptor competitor assay, green (P3009、 Invitrogen) に添付の説明書に従って測定した。

各濃度の ganoderol Bは DMSOに溶解し、 20 ^ 1を 384ゥエルプレートに添加した。 DMSO の濃度は説明書で指示された濃度に従った。 AR (25 nM) と AL Greend nM) とを混合し、その 20 // 1をゥエルに添加した。プレートは喑所で、 4時間ィンキュベートした。 Beacon 2000蛍光偏光測定器で蛍光偏光を測定した。本アツセィを簡単に説明する。全ての試験化合物を、 DMSO中のストツク溶液として調製した。化合物を、 384ゥエルプレート上で 3ゥエルずつ、アツセィバッファーを用いて 20 の容量で、 0.001， 1.25, 12.5， 25, 50及び 100 /z Mに希釈した。最終 DMSO濃度は、いずれも製造元の推奨濃度を超えず、したがって、 DMSOは蛍光を変化させないと予想された。

20 1容量の AR (最終 25 ιιΜ) 及び AL Greenを、連続的に希釈された試験化合物に添加した。続いて、プレートを喑中で約 4時間室温でインキュベートした。次に、偏光を、 485 nm励起及ぴ 535 nm発光千渉フィルターを用いて beacon 2000 fluorescence polarization instrument ± 偏光モードで根 U定した。偏光値 (mP) は、試験化合物の濃度上昇に対してプロットした。

その結果、図 4に示すように、 ganoderol B (腿）は 15 Mの濃度で IC₅₀を示した。実施例 5 ： ganoderol Bの前立腺肥大抑制効果

SD系雄 3週齢ラットを一週間予備飼育した後、精巣を除去し、その 4日後より連日 8日間テストステロン lOO Ai g/dayを皮下投与した。それらの投与と同時に、各サンプル（コントロール、 Ganoderol B、マンネンタケエタノール抽出物）をゾンデにて強制経口投与した。ラットの飼育は室温 23.0 ± 0.5度、湿度 55 ± 5% で午前 7時より午後 Ί時までの 12時間を明期とした明暗サイクル下で行い、餌及び水は自由に与えた。 18時間絶食後、ペントバルビタール麻酔下で採血後、摘出した前立腺重量を測定した。

結果を図 5に示す。図 5に示したように、 ganoderol Bは 0.1mg/kg/日及ぴ 0.001 mg/kg/日投与で有意な前立腺肥大抑制効果が発揮された。

実施例 2〜 4の結果によると、 ganoderol Bは 5 a -reductase阻害活性が弱く、また、強いアンドロゲンレセプター結合能を示した。したがって、本実施例における ganoderol Bの前立腺肥大抑制効果は、アンドロゲンレセプターと結合した結果と予想できる。

本実施例により、マンネンタケ処理物を含む本発明のアンドロゲン受容体結合物質は、前立腺肥大の治療に有用であることが示された。実施例 6 ：前立腺癌細胞における ganoderol Bの PSA及ぴ AR発現への影響ヒト前立腺癌 LNCaP細胞を 10% FBS phenol red free RPMI1640 mediumで 3 日間前培養した。前培養した細胞を回収し、 5 % cFBS phenol red free RPMI1640 mediumで懸濁し、 2 X 10⁵ cells/mlの細胞懸濁液としたものを 24ゥエルに 3 mL ずつ播種した。 24 時間細胞をゥエルの底に接着させ、 5% cFBS phenol red free KPMI1640 mediumで培地交換するとともに、系内に 0.1%となるように DMSOに溶解させた各サンプルを添加した。 Ganoderol Bは最終濃度 40、 10及び 1 μ M、又は T若しくは DHTは 100 nMとなるようにゥエルに添加し、コントロールには DMSOのみを添加した。 4 日間培養後、 ISOGENを用いて細胞から total RNAを抽出した。 Total RNAが分解されていないことを変性ァガロースゲル電気泳動で確認した後、 oligo-dT primerを逆転写プライマーとし、 TaKaRa AMV Reverse Transcriptaseを用い逆転写反応を行った。次に cDNAをテンプレートとして、 PSA (前立腺特異抗原）又は ARから設計した特異的ブライマ一（配列番号 1〜4 ) を用いて Ex-Taq Polymerase (TaKaRa) により PGR 反応を行った。 PCR産物をァガロースゲル電気泳動し、増幅されたバンドの確認を行った。単一のパンドが確認できたものを、 Real-time PCRによる定量的解析を行った。

プライマー：

PSA 5'-GAGGTCCACACACTGAAGTT-3' (配列番号 1 )

5'-CCTCCTGAAGAATCGATTCCT-3' (配列番号 2 )

AR 5'-GTGGAAATAGATGGGCTTGA-3' (配列番号 3 )

5'-TCACACATTGAAGGCTATTGA-3' (配列番号 4 )

定量的解析の結果を図 6に示す。 PSAの発現解析結果をパネル aに示し、アンドロゲン受容体の発現解析結果をパネル bに示す。テストステロンと DHTを添加しない場合は（コントロール）、細胞の PSA発現が極めて少なかった。 100 nM のテストステロン又は 100 nMの DHTは、 PSAの発現が強くなった（T又は DHT)。テストステロン又は DHTと、 ganoderol Bとを同時に添加すると、 PSAの発現が抑制された。

また、特に DHTと ganoderol Bとを同時に添加したときは、アンドロゲンレセプターの発現は、コントロールより弱かった。

実施例 2〜 4において、 ganoderol Bは弱い 5 α—リダクターゼ阻害活性と強いアンドロゲンレセプター結合活性を示した。以上の実施例の結果から、 ganoderol Bはアンドロゲンレセプターと結合して、 PSAの発現を抑制して、細胞の増殖を抑制していると推定される。

PSAの発現量と前立腺癌の症状との関連性が知られているため、 PSAは前立腺癌の腫瘍マーカーとして前立腺癌の診断に用いられている。したがって、マンネンタケ抽出物により PSAの発現が抑制されたことから、マンネンタケ抽出物を含む本発明のアンドロゲン受容体結合物質は、前立腺癌に対する抗腫瘍効果を有する可能性が示された。配列表フリ一テキスト

配列番号 1 プライマー

配列番号 2 プライマー

配列番号 3 プライマー

配列番号 4 プライマー .産業上の利用の可能性

本発明により、マンネンタケ抽出物を有効成分として含むアンドロゲン受容体結合物質が提供される。

本発明のアンドロゲン受容体結合物質は、アンドロゲン受容体を介する作用に影響を与えることができるため、アンドロゲン受容体を介するシグナルの研究試薬、又はアンドロゲン依存的な疾患もしくはアンドロゲン受容体を介する疾患の治療剤、予防剤として有効であり、特に前立腺癌及び前立腺肥大症の治療に有効である。

また、本発明の抽出物の 5 ひ一リダクターゼ活性阻害作用を測定したところ、 5 ーリダクターゼ阻害活性を示すものと、阻害活性を示さないものが混在していた。したがって、マンネンタケ抽出物によるアンドロゲン受容体の拮抗作用は、これまでにない全く新しい機序を介する作用であると言える。すなわち、本発明により、新規のアンドロゲン受容体結合物質が提供される。

Claims

請求の範囲

1 . マンネンタケ処理物を含む、アンドロゲン受容体結合物質。

2 . ラノスタン型トリテルペンを含む、アンドロゲン受容体結合物質。

3 . ラノスタン型トリテルペンがマンネンタケ由来のものである、請求項 2に記載のアンドロゲン受容体結合物質。

4 . Ganoderic acid TR, ganoderic acia DM , ganoderic acia A, ganoderic acid

B, ganoderic acid C2, ganoderic acid D, ganoderic acid F, ganoderic acid H, ganoderic acid I， 5a-lanosta-7,9(ll)24-triene- 15 ,26-dihydroxy-3-one ganoderol B、 lucidumol B, Ganoderiol A，及び ganoderiol F力、らなる群から選択される少なくとも一つを含む、アンドロゲン受容体結合物質。

5 . ganoderol Bを含む、アンドロゲン受容体結合物質。

6 . アンドロゲン受容体アンタゴニストである、請求項 1〜 5のいずれか 1項に記載のアンドロゲン受容体結合物質。

7 . 試験化合物の存在下又は非存在下において、マンネンタケ処理物とアンド口ゲン受容体との結合活性を測定することを含む、アンドロゲン受容体結合物質のスクリ一ユング方法。