WO2007074198A1 - Péptidos inhibidores selectivos de la actividad biológica de la calcineurina - Google Patents

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Juan Miguel Redondo Moya
Antonio RODRÍGUEZ MÁRQUEZ
Sara MARTÍNEZ MARTÍNEZ
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Consejo Superior De Investigaciones
Fundaciones Centro Nacional De Investigaciones Cardiovasculares
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Definitions

  • the present invention falls within the biotechnology sector applied to the area of human health and more specifically is based on the surprising utility of the peptides, LxVPcI, c3 and c4 as efficient selective inhibitors of the Calcineurin (CN) signaling pathway - NFAT and phosphatase activity of the CN.
  • Such compounds are useful immunosuppressants and serve as the basis for the elaboration of therapeutic compositions for the prophylaxis and treatment of human diseases that occur with activation of T lymphocytes, such as, but not limited to, autoimmune diseases, inflammation and allergy or rejection situations. to transplants
  • these peptides and related genetic and biological material can be useful tools for the development of assays to find compounds that have selective CN antagonistic activity.
  • the Calcium / Calcineurin / NFAT route plays a prominent role in a large number of important biological processes, including the development and functioning of the immune and nervous systems, vasculature formation, cardiac valve morphogenesis and muscle growth and development (1- 5) .
  • the calcium signals activate the calcineurin phosphatase (CN), which dephosphorylates the transcription factors NFATcI, NFATc2, NFATc3 and NFATc4 (HUGO nomenclature). This induces its translocation from the cytoplasm to the nucleus and increases its ability to bind to DNA, causing gene expression NFAT dependent (6).
  • CN calcineurin phosphatase
  • the calcineurin also known as the protein phosphatase 2B, is a heterodimer that consists of a catalytic subunit (CnA) strongly linked to a regulatory subunit (CnB).
  • CnA is composed of a catalytic domain and another regulator that contains the binding sequence with CnB, a calmodulin binding domain (CaM) and an autoinhibitory segment (7).
  • CnA phosphatase activity is regulated by a complex formed by Ca 2+ , CnB and CaM; both regulatory proteins are essential for this activity (7,8).
  • the CN can bind to both phosphorylated and dephosphorylated NFAT (9,10); and although the inactive CN can join the NFATs, the union is stronger with the activated CN (11).
  • this interaction has been located within the N-terminal regulatory domain, which is conserved in all four members (12-14).
  • the motifs conserved within the regulatory domain of NFATc2 were analyzed by mutational analysis, defining the SPRIEIT sequence as the calcineurin anchor site (15).
  • residues conserved in the corresponding sequences of the other members of NFAT were identified, defining the reason PxIxIT (see Fig. IA), which appears to be functional in all members of NFAT regulated by CN (11,16-18) .
  • NFAT was first described as an essential factor for the expression of the IL-2 gene (19), and subsequently it has been implicated in the regulation of many other genes necessary for an effective immune response (20-23).
  • immunosuppressive drugs such as Ciclosporin A (CsA) and FK506 (24)
  • CsA Ciclosporin A
  • FK506 FK506
  • FK506 is the most frequent method to block the CN-NFAT signaling route, since they inhibit the enzymatic activity of CN (24). However, this strategy also inhibits other non-NFAT-dependent routes of
  • PxIxIT which has a high affinity for CN, is able to selectively inhibit the NFAT-dependent signaling path without affecting the rest of the CN-activated pathways (29).
  • the present invention relates to new peptides and derivatives thereof useful as selective antagonists (inhibitors) of the CN-NFAT signaling pathway and more specifically as immunosuppressants (in addition, it has been found that they are inhibitors of CN phosphatase activity) .
  • the invention also relates to therapeutic compositions comprising said peptides, to tests to find compounds that have activity, preferably, selective antagonist of the biological action of CN on NFAT and the use of said peptides for the prophylaxis and treatment of human diseases that occur with activation of T lymphocytes, such as, but not limited to, autoimmune diseases, inflammation and allergy or transplant rejection situations. Likewise, it relates to genetic tools and methods • production of such peptides.
  • FIG. IA Schematic representation of the NH2 ⁇ terminal regulatory domain and the CN interaction sequences of the different NFATs.
  • the conserved regions between the different members of NFAT are shown as follows: SP-I, SP-2 and SP-3 are repetitive serine-proline motifs susceptible to phosphorylation; SRR-I and SRR-2 are regions rich in serine; and NLS is the nuclear localization sequence.
  • the two regions involved in CN binding, called PxIxIT and LxVP motifs, are shown in black, and the sequences corresponding to these motifs in each of the four members of human NFAT are shown below;
  • the amino acids conserved between the different members are shown in bold.
  • FIG. IB Amino acid sequences of the peptides used as positive (VIVIT) or negative (SCRAMBLED) competition control for in vitro binding experiments.
  • FIG. 2. Comparison of CN binding to NFATcI and NFATc2 in vitro.
  • FIG. 2A. The binding of NFATcI and NFATc2 to CN is dependent on the concentration of NFAT. A fixed concentration of CN (20 nM) was tested against decreasing concentrations of the regulatory domains of NFATc2 or NFATcI fused to GST (Glutathione-S-Transferase) in pull-down tests. Bound CN was shown by western blotting using a monoclonal antibody against CnA. Due to the high amounts of NFATcI bound CN, two different exposures (upper and lower panel respectively) are shown to clearly show the interaction
  • NFATcI-CN The bound CN was quantified by densitometry, data shown in the graph below as units of relative intensity of CN bound to each concentration of NFAT.
  • FIG. 3. Analysis of the in vitro interaction of CN with the PxIxIT and LxVP peptides fused to GST.
  • GST-peptide fusion proteins that contain the PxIxIT or LxVP of NFATcl and NFATc2 were used in pull-down tests.
  • GST or GST proteins fused to the mutated LxVPcI peptide (AxAA) were used as negative controls.
  • Bound CN was detected by western blotting and the amount of GST fusion proteins used was analyzed by staining total proteins on SDS-PAGE gels.
  • FIG. 4. Effect of PxIxIT and LxVP peptides derived from NFATcl and NFATc2 in the in vitro interaction of NFAT and CN.
  • FIG. 4A - CN bound to GST-NFATc2 in the presence of competing peptides at 32 ⁇ M or 200 ⁇ M.
  • the mutLxVPcl peptide contains the LxVP motif of NFATcl with the Leucine, Valine and Proline residues substituted by Alanine.
  • FIG. 4B - CN bound to GST-NFATc2 in the presence of high concentrations of competing peptides.
  • the control peptide SCRAMBLED (SC) was used as a negative control.
  • the lower panel shows unbound (free) CN in 1/3 of the supernatants obtained after the binding reaction.
  • FIG. 4C- CN bound to GST-NFATcI in the presence of competing peptides at 32 ⁇ M or 200 ⁇ M.
  • FIG. 5. Comparison of the capacity of VIVIT peptides
  • LxVPcI and PxIxITc2 to block the binding of CN to NFATc2.
  • the binding of GST-NFATc2 to CN was competed by increasing concentrations of the VIVIT, LxVPcI or PxIxITc2 peptides.
  • the upper panels show the amount of CN attached to GST-
  • FIG. 6. Competition of the NFATcI-CN and NFATc2- interaction
  • FIG. 6A The peptides corresponding to the LxVP motifs of NFATcI, c2, c3 and c4
  • FIG. 6B In vitro binding of GST-NFAT-CN in the presence of 100 ⁇ M of each peptide
  • PxIxIT The united and free CN is shown.
  • the sequences of the peptides are detailed in FIG. one.
  • FIG. 7 Cross-competition of the GST-PxIxITc2-CN or GST-LxVPcl-CN interaction by the PxIxITc2 and LxVPcI peptides.
  • GST fusion proteins containing PxIxITc2 or LxVPcI peptides were used in CN pull-down assays in the presence of free competing peptides as indicated.
  • the SCRAMBLED peptide (SC: • 200 ⁇ M) was used as a negative competition control, and the effect of the VIVIT peptide (12 ⁇ M) was also analyzed. For better detection of the poor CN bound to GST-PxIxITc2, twice as much GST-PxIxITc2 as GST-LxVPcI was used.
  • FIG. 8 In vivo blocking of the regulation of NFATc2 by the LxVPcI peptide.
  • HeLa cells NFAT negative
  • the mutated peptide LxVPcI mutLxVPcl fused to GFP was used as a control.
  • FIG. 8A Transfected HeLa cells were stimulated or not with PMA (20 ng / ml) plus calcium ionophore (lo) (1 ⁇ M) (PMA + Io) for Ih.
  • Total cell extracts were analyzed by western blotting using an antibody against HA to detect NFATc2 (upper panel) or an anti-GFP serum to control the expression of GFP fusion proteins
  • NFATc2 (left) and staining of NFATc2 (right). The percentage of cells showing a cytosolic distribution of NFATc2 is indicated (at least 130 cells were counted per transfection).
  • FIG. 9.- The LxVPcI peptide is a potent inhibitor of CN phosphatase activity.
  • the phosphatase activity of the CN on the RII phosphopeptide substrate was measured in the absence and presence of different peptides (PxIxITc2, LxVPcI and mutLxVPcl). The results were comparable to those obtained in the presence of 10 ⁇ M of the CsA / CyP inhibitor complex. Data are represented in phosphate picomoles released during the reaction, and are expressed as the mean +/- SD of an experiment, and were performed in duplicate. A representative experiment of the three tests performed is presented.
  • FIG. 10. The LxVP peptide increases the phosphatase activity of CN on the pNPP substrate.
  • the hydrolysis capacity of pNPP phosphate group exerted by CN was analyzed in the presence of increasing amounts of the LxVPcI peptide.
  • This graph represents the average of three experiments and allows to calculate the EC50 (Effective Concentration for 50% effect) of the peptide by CN, close to 6.5mM.
  • FIG. 11.- The interaction of the LxVP peptide with CN requires the presence of the heterodimer.
  • the ⁇ in vitro 'interaction of the CnA and CnB subunits, separately or forming the heterodimer is compared to the GST protein that carries the LxVPcI peptide sequence fused at its C-terminal end.
  • the figure shows that LxVPcI only joins CN when the two subunits, CnA plus CnB, are present.
  • the binding of the different CN subunits to the GST protein was analyzed.
  • FIG. 12. The LxVPcI peptide prevents the interaction between CN and immunosuppressive drugs.
  • the interaction assay was performed using GST-Cyclophilin A (panel A) or GST-FKBP12
  • the present invention is based on the fact that the inventors have found the surprising utility of peptides, LxVPcI, LxVPc3 and LxVPc4 as efficient selective inhibitors of the CN-NFAT signaling pathway and more specifically as useful base immunosuppressive compounds for the elaboration of therapeutic compositions for the prophylaxis and treatment of human diseases that occur with T lymphocyte activation, such as, but not limited to, autoimmune diseases, inflammation and allergy or transplant rejection situations.
  • these peptides and the genetic material and Biologically related can be useful tools for the development of assays to find compounds that have Calcineurin selective antagonist activity (hereinafter CN).
  • LxVPc2 peptide is a very weak competitor of the CN to NFAT binding, suggesting that the NFATc2-CN interaction could be mainly due to the PxIxIT motif.
  • the LxVP motif of NFATcI has different characteristics. This LxVP peptide binds much more efficiently to CN than the PxIxIT motifs of NFATcI and NFATc2 (FIG. 3). It is also capable of inhibiting in vitro the interaction of CN with both NFATs and the translocation of NFATc2 into activated cells (FIGs. 4-6 and
  • FIG. 8 The great ability of LxVPcI to interfere in NFATc2-CN complexes both in vitro and in vivo is one of the most surprising results of this invention.
  • LxVP peptides based on the NFATcI, NFATc3 and NFATc4 sequences have also proven to be efficient competitors of the in vitro interaction of CN with NFATcI or
  • NFATcI, NFATc3 and NFATc4 possess an aromatic amino acid adjacent to the nucleus of the LxVP motif (Tyrosine, Phenylalanine and Tyrosine, respectively). Another difference in the sequences is the presence in NFATc2 of a Proline residue adjacent to the C-terminal end of the core of the LxVP motif, which results in two consecutive residues of
  • LxVPcI peptide binds directly to CN and inhibits its phosphatase activity at levels similar to CsA (see Figure 9, Example 7).
  • the use of this LxVPcI peptide as an immunosuppressant has clear advantages over CsA and FK506 immunosuppressive agents.
  • the administration of the LxVPcI peptide inhibits the phosphatase activity of CN, without affecting other non-CN-dependent cellular processes and that could be responsible for some of the side effects associated with treatment with the drugs CsA and FK506 (31-33); requiring the dimeric structure (CnA + CnB) to join the CN.
  • treatment with this peptide serves to distinguish between Side effects due to inhibition of CN phosphatase activity from those that are independent of CN.
  • a first aspect of the present invention is an amino acid sequence, capable of selectively inhibiting the CN-NFAT signaling pathway, which comprises the amino acid sequence (aá)
  • Ri is an aromatic aa of the type Tyrosine o-Fénrlalanina
  • R2 is an amino acid of the Alanine or Serine type
  • R3 is not the amino acid Proline (hereinafter we will call this amino acid sequence the basic nucleus of the invention).
  • Said amino acid sequence constitutes the basic starting nucleus for the constitution of all those compounds capable of selectively inhibiting the CN-NFAT signaling pathway and more specifically capable of inhibiting the biological action of the CN on at least the NFATcI transcription factors. and NFATc2.
  • Another preferred aspect of the present invention is an amino acid sequence, capable of selectively inhibiting the CN-NFAT signaling pathway and more specifically capable of inhibiting the biological action of CN on NFATcI and NFATc2 transcription factors, which possesses the nucleus.
  • basic of the invention and belongs to the following group: a) sequence of aa SEQ ID NO 18 (LxVPcI) or SEQ ID NO 21 (LxVPc3) or SEQ ID NO 22 (LxVPc4), b) aa sequence analogous to the sequence of a ) c) aa sequence comprising any sequence belonging to (a) or (b).
  • analogous is intended to include any sequence of aá that can be isolated or constructed based on aa sequences shown in the present invention, for example, by the introduction of aa, conservative or non-conservative substitutions, including the insertion of one or more amino acids, the addition of one or more aa, at any of the ends of the molecule or the deletion of one or more aá, at any end or inside the sequence as long as this does not modify the basic core of the invention and that constitutes a peptide capable of selectively inhibiting the CN-NFAT signaling pathway and more specifically able to inhibit the biological action of the CN on the transcription factors NFATcI and NFATc2.
  • an analogous aa sequence is substantially homologous to the aa sequence discussed above.
  • the expression "substantially homologous” means that the sequences of aa in question have a degree of identity of at least 40%, preferably of at least 85%, or more preferably of At least 95%.
  • a particular aspect of the invention is a peptide capable of selectively inhibiting the CN-NFAT signaling pathway and more specifically capable of inhibiting the biological action of Calcineurin on the NFATcI and NFATc2 transcription factors, and comprising the amino acid sequence SEQ ID NO 18 or a sequence of analogous or substantially analogous to SEQ ID NO 18.
  • Another particular aspect of the invention is a peptide capable of selectively inhibiting the CN-NFAT signaling pathway and more specifically capable of inhibiting the biological action of the CN on the NFATcI and NFATc2 transcription factors, and comprising the sequence of a SEQ ID NO 21 or a sequence of analogous or substantially analogous to SEQ ID NO 21.
  • a particular aspect of the invention is a peptide capable of selectively inhibiting the CN-NFAT signaling pathway and more specifically capable of inhibiting the biological action of the CN on the NFATcI and NFATc2 transcription factors, and comprising the sequence of aa SEQ ID NO 22 or a sequence of analogous or substantially analogous to SEQ ID NO 22.
  • any of the aa sequences of the present invention can be obtained by gene expression of the nucleotide sequences that allow the coding of their residues, as well as by their chemical synthesis. Some modifications may be important to stabilize the peptide in future pharmaceutical formulations in which it is incorporated for administration to an individual or for its usefulness as a research tool. Similarly one or more nucleotides of the codon corresponding to each residue of interest is substituted.
  • the aa sequences of the peptides of the invention and the nucleotide sequences encoding them comprise a series of sequences that any person skilled in the art can routinely obtain, without undue experimentation, from the information provided in the present invention
  • substitutions or modifications suitable for carrying out the various aspects of the present invention can be determined by routine experimentation to obtain peptides with the structural and functional properties described for example by comparing protein-protein interactions by in vitro or in vivo competition assays. using CN with any of the cl-c4 NFATs.
  • deletion, insertion and substitution can be made to express and produce the final construction of the desired peptide by DNA mutations and genetic engineering techniques. using host cells that comprise said nucleotide sequences.
  • another aspect of the present invention comprises a nucleotide sequence capable of encoding the aa sequence of the LxVPcI or LxVPc3 or LxVPc4 peptides of the present invention consisting of a nucleotide sequence selected from one of the following groups: a) nucleotide sequence SEQ ID NO 5 and / or its complementary sequence SEQ ID NO 6, b) nucleotide sequence and / or its complementary sequence encoding the amino acid sequence SEQ ID NO 21, c) nucleotide sequence and / or its complementary sequence coding for amino acid sequence SEQ ID NO 22, d) nucleotide sequence analogous to sequence (a), or (b) or (c), e) nucleotide sequence comprising any sequence belonging to (a ), (b), (c) and (d).
  • a particular aspect of the invention is a nucleotide sequence capable of encoding an amino acid or peptide sequence that can selectively inhibit the CN-NFAT signaling pathway, and more specifically, inhibit the biological action of the CN on NFATcI transcription factors. and NFATc2, and comprising the nucleotide sequence SEQ ID NO 5 and / or its complementary sequence SEQ ID NO 6.
  • nucleotide sequence described in the present invention may also be linked or fused, if necessary and to allow better isolation or detection of the expressed peptide, to a DNA sequence encoding a peptide capable of being used for isolation or detection of said peptide.
  • another particular aspect of the present invention is a genetic construct that further comprises a nucleotide sequence selected from the nucleotide sequence SEQ ID NO 5 and / or its complementary sequence SEQ ID NO 6, or the sequence nucleotide encoding the LxVPc3 peptide, or the nucleotide sequence encoding the LxVPc4 peptide, any other nucleotide sequence encoding a peptide or peptide sequence that allows the isolation or detection of the expressed peptide / s .
  • nucleotide sequence and genetic construction of the present invention can be obtained by employing techniques widely known to any person skilled in the art (34). Said nucleotide sequences may be integrated into an expression vector that allows their regulation under conditions suitable for the production of the corresponding peptides or proteins that are a pharmaceutical active ingredient.
  • yet another aspect of the present invention is a gene expression vector comprising the nucleotide sequence LxVPcI and / or its complementary sequence or the nucleotide sequence LxVPc3 and / or its complementary sequence or the nucleotide sequence LxVPc4 and / or its complementary sequence or the LxVPcI genetic construct or the genetic construct
  • LxVPc3 or the LxVPc4 genetic construct of the present invention which allows the expression of said construction in the cytoplasm of a cell of the invention.
  • the LxVPcI expression vector or the LxVpc3 expression vector or the LxVPc4 vector of the present invention comprises, in addition to the LxVPcI nucleotide sequence and / or its complementary sequence or the sequence of nucleotides LxVPc3 and / or its complementary sequence or the nucleotide sequence LxVPc4 and / or its complementary sequence or the genetic construction LxVPcI or the genetic construction LxVPc3 or the genetic construction LxVPc4 of the present invention, a promoter that directs its transcription, to which it is operably linked, and other necessary or appropriate sequences that control and regulate said transcription and, where appropriate, the translation of the product of interest, for example, transcription initiation and termination signals, polyadenylation signal, origin of replication, binding sequences to ribosomes, coding sequences of transcriptional regulators, transcriptional silencers, repressors, etc.
  • Examples of appropriate expression vectors can be selected according to the conditions and needs of each specific use among cell expression plasmids that may also contain markers usable to select cells transfected or transformed with the gene or genes of interest.
  • the choice of the vector will depend on the host cell and the type of use to be performed.
  • said vector is a plasmid or a viral vector.
  • the obtaining of said vector can be carried out by conventional methods known to those skilled in the art as well as for the transformation of microorganisms and eukaryotic cells, different methods can be used, such as, but not limited to, chemical transformation, electroporation, microinjection, among others.
  • One strategy could be to use lentivirus to infect the target cells, as it is already being attempted in gene therapy by Ralph et al. (35).
  • These mentioned nucleotide sequences can be used in a gene therapy process in which by any technique or procedure the integration of them into the cells of a human patient is allowed.
  • This objective can be achieved by administering to these cells a gene construct comprising one or more of said nucleotide sequences mentioned in order to transform said cells allowing their expression inside them so that the signaling pathway is inhibited.
  • said gene construct may be included within a vector, such as, for example, an expression vector or a transfer vector.
  • both the nucleotide sequence, gene construct or expression vector can be used as a medicament to protect human host cells in a treatment procedure and prophylaxis of in vivo or ex vivo gene therapy of a human being affected by a disease. which is exacerbating the immune response.
  • the gene therapy procedures can be applied directly to the patient by administering one of these nucleotide sequences as a medicine, or exacerbated immune system cells could be extracted from a human being and once ex vivo transform them with the nucleotide sequences and then return them to the be human or keep them ex vivo for later use.
  • Biopharmaceutical tools and gene therapy procedures are sufficiently known to a person skilled in the art in such a way that with the information described in the present invention they can be developed without undue effort.
  • a further aspect of the present invention is a transformed cell comprising a LxVPcI nucleotide sequence and / or its complementary sequence or an LxVPc3 nucleotide sequence and / or its complementary sequence or a nucleotide sequence
  • LxVPc3 or an LxVPc4 vector of the present invention which is capable of expressing the LxVPcI peptide or the LxVPc3 peptide or the LxVPc4 peptide, respectively of the present invention under suitable conditions.
  • LxVPc3 or the LxVPc4 cell of the invention can be a prokaryotic or eukaryotic cell depending on the specific needs and can be prepared by a person skilled in the art with the information described in the present invention.
  • These cells may be useful for the production of peptides with CN-NFAT signaling pathway inhibitory activity that may be the basis of a pharmaceutical composition, for recombinant amplification of said nucleotide sequences or may be useful per se as cells. in gene therapy.
  • the nucleotide sequence, genetic construct, expression vector, transformed cells and the LxVPcI, c3 or c4 peptide of the present invention can be used directly or by their genetic expression in host cells for the development of identification systems. or screening of pharmaceutical compounds regulators signaling pathway CN- NFAT, more specifically the biological action of CN on 'transcription factors NFATcI and NFATc2 selective, preferably antagonists of CN-NFAT by determining the effect of the addition of a potential compound over said activity. In these tests you can use different combinations, one or more, of the potential possible forms of the LxVPcI, c3 or c4 peptides.
  • the direct use of the LxVPcI, c3 or c4 peptide of the present invention can be used, after its extraction and purification, in an in vitro protein interaction or binding assay.
  • the proteins or fragments thereof involved in the interaction for which it is desired to identify regulatory compounds can be used together; while the interaction of said proteins can be assessed for example by Western blot (see examples).
  • the compounds to be identified can be of different origin: natural (plants, prokaryotic, etc.) or synthetic.
  • This screening system can measure or detect (quantitatively or qualitatively) the competitive binding of a candidate compound to a signal peptide by direct or indirect marking of any of the elements of said system.
  • another aspect of the present invention is a procedure or test for the identification or screening of new regulatory pharmaceutical compounds, preferably selective antagonists, of the CN-NFAT signaling pathway, more specifically of the biological action of the CN on the transcription factors
  • NFATcI and NFATc2 comprising the use of the nucleotide sequence, gene construct, expression vector, host cells and / or peptides of the present invention in isolation or in one of their possible combinations.
  • Another aspect of the present invention is an identification test for pharmaceutical compounds in which the process is an identification test for pharmaceutical compounds in which the process is an in vitro test or is an in vivo test, such as a co-immunoprecipitation or immunodetection assay.
  • the term "selective" refers to the ability of the Peptide of the invention to act as an antagonist of CN activity is considerably greater than its ability to act as antagonists of other proteins and, on the other hand, that more specific peptides can be selected to inhibit different activities of the same CN protein.
  • another aspect of the invention is a pharmaceutical composition useful for the treatment of diseases, hereinafter pharmaceutical composition of the invention, together with, optionally, one or more pharmaceutically acceptable adjuvants and / or vehicles, comprising any of the aforementioned peptides (SEQs ID No. 18, 21 and 22) including their analogs and substantially analogs or any other compound comprising the basic nucleus, or comprising any of the nucleotide sequences, gene constructs or expression vectors mentioned above, or mixtures thereof and that are capable of selectively inhibiting the CN-NFAT signaling pathway, which run with CN activation, and preferably, by way of illustration and without limiting the scope of the invention, with the activation of the immune system.
  • pharmaceutical composition of the invention together with, optionally, one or more pharmaceutically acceptable adjuvants and / or vehicles, comprising any of the aforementioned peptides (SEQs ID No. 18, 21 and 22) including their analogs and substantially analogs or any other compound comprising the basic nucleus, or comprising any of the nu
  • compositions are the adjuvants and vehicles known to those skilled in the art and commonly used in the elaboration of therapeutic compositions.
  • composition provided by this invention may be administered by any appropriate route of administration, for which said composition will be formulated in the pharmaceutical form appropriate to the route of administration chosen.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be used in a treatment method in isolation or in conjunction with other pharmaceutical compounds.
  • Another aspect of the present invention is the use of the pharmaceutical composition of the invention in the prophylaxis and treatment of human diseases that occur with CN activation, and preferably, by way of illustration and without limiting the scope of the invention, with T lymphocyte activation, such as, for example, autoimmune diseases, inflammation, allergy or transplant rejection situations.
  • Another aspect of the invention is the use of the pharmaceutical composition of the invention as a tool for basic research for the isolation of new CN substrates important for calcium-mediated signaling in different species.
  • NFATc2 To analyze the interaction capacity of NFATcI and NFATc2 with the CN, in vitro binding assays were performed. The bound CN was compared at decreasing concentrations of the purified recombinant regulatory domains of NFATcI or NFATc2 fused to the GST protein (GST-NFATcI and GST-NFATc2 respectively). Quantification by densitometry of the bound CN indicated that NFATcI has CN binding capacity of the submicromolar order, and that the affinity of NFATc2 appears to be much lower than that of NFATcI (FIG. 2A). Complementary experiments were performed in which the concentration of CN was varied.
  • Example 2 The CN binding capacity to the LxVPcI motif is greater than the PxIxIT motifs.
  • LxVPcI to CN was studied using a GST-mutLxVPcl construct, in which each conserved residue was replaced by Alanine; GST-mutLxVPcl was unable to bind CN (FIG. 3).
  • PxIxITcI and PxIxITc2 could be responsible for the greater strength in the interaction of CN with NFATcI versus NFATc2.
  • Example 3 Effect of the PxIxIT and LxVP peptides on the NPAT-CN In v ⁇ tro interaction.
  • Example 4.- The LxVPcI peptide is a potent inhibitor of CN and NFAT binding.
  • Example 5 Cross competition between the different CN binding sequences of the NFATs.
  • the ability of the LxVPcI peptide to compete the binding of CN to NFATc2 was surprising. To deepen this fact, new competition experiments were performed, this time to analyze the ability of the peptides to compete CN binding to GST-peptide fusion proteins.
  • the LxVPcI peptide competed the CN binding to GST-PxIxITc2, as well as the PxIxITc2 and VIVIT peptides (peptide derived from the PxIxIT sequence) competed the CN binding to GST-LxVPcI (FIG. 7).
  • a wild-type NFATc2 expression vector was co-transfected together with another encoding GFP-LxVP fusion proteins. or GFP-PxIxIT of
  • the HeLa cell line was used because it lacks endogenous NFAT expression.
  • the GFP-VIVIT or GFT-mutLxVPcl fusion proteins, respectively, were used as positive and negative control.
  • NFATc2 nuclear translocation inhibitor As with the dephosphorylation of NFATc2, the greatest effect NFATc2 nuclear translocation inhibitor was achieved with the expression of GFP-VIVIT and GFP-LxVPcI: 92% and 77% of cells with cytosolic staining of NFATc2, respectively.
  • GFP-PxIxITc2 or GFP-PXIXITCI partially inhibited the nuclear translocation of NFATc2: Between 33% and 39% of positive GFP cells showed cytosolic localization of NFATc2 after activation (Fig. 7B), data concordant with those published by Aramburu et al. (fifteen) .
  • Example 7 The LxVPcI peptide is an inhibitor of CN phosphatase activity on one of its physiological substrates, the RII peptide.
  • Example 8 The LxVPcI peptide is an activator of CN phosphatase activity on pNPP (para-nitrophenyl phosphate).
  • the LxVPcI peptide blocks the phosphatase activity of CN on the RII peptide (Fig. 9) (24). Due to this similarity in its action, the question was raised as to whether the LxVPcI peptide would behave similarly to drugs when its effect on the phosphatase activity of CN was analyzed using pNPP as a substrate. This small molecule binds directly to its active CN site. For the immunosuppressive complexes CsA / CyPA and FK506 / FKBP12 it has been described that their presence increases the phosphatase activity of the enzyme on the pNPP (36,24).
  • Table I compares the effect exerted by the LxVPcI peptide on that obtained in the presence of the CsA / CypA complex, which is described to increase the dephosphorylation of pNPP by part of CN.
  • the mutated LxVPcI peptide, CsA and cyclophilin A have been used separately.
  • Example 9 The LxVPcI peptide requires the dimeric structure (CnA + CnB) to bind to the CN phosphatase. Crystallographic analysis of the CsA / CyPA and FK506 / FKBP12 complexes bound to the CN revealed that immunosuppressive complexes interact with amino acids of both subunits of the CN heterodimer, the catalytic subunit
  • CnA the regulatory subunit
  • CnB the regulatory subunit
  • Example 10 The LxVPcI peptide blocks the interaction between CN and immunosuppressive drugs.
  • the LxVPcI peptide exhibits a behavior with respect to its action on CN similar to that described for the CsA / CyPA and FK506 / FKBP12 complexes.
  • the amount of CN that interacts with drugs bound to GST-CyPA or GST-FKBP12 decreases progressively (Fig. 12).
  • the GST-NFATcI constructs expressing the NFATcI regulatory region (1-418 aa) fused to the glutathione S-transferase (GST) protein was generously supplied by Dr. A. Rao (12).
  • the GST-NFATc2 construct was generated by phase subcloning from a cDNA encoding the sequence from amino acid 4 to 385 of NFATc2 in a pGEX4T3 (Amersham Biosciences) vector digested with BamHl-Smal:
  • GST-peptide and GFP-peptide expression vectors were generated by phase cloning in the digested vector pGEX (Amersham Biosciences) or pEGFP-C (Clontech) of ringed oligonucleotides with protruding ends encoding the different peptide sequences.
  • the pEF-BOS HA-NFATc2 expression plasmid has been previously described (39), and encodes the complete NFATc2 protein fused to the HA epitope ⁇ influenza virus hemagglutinin) at its NH 2 -terminal end.
  • Constructs expressing GST fused immunophilins were created from described constructs (human FKBP12: 41; Cyclophilin A: 42). Constructs expressing CnA and CnB fused separately to GST were generated using amplified PCR products from total eukaryotic cell RNA. The different CnA deletions were created by mutating the DNA sequence encoding the amino acid from the indicated position to a termination codon by directed mutagenesis using Stratagene's ⁇ Quikchange mutagenesis kit 'following the manufacturer's instructions.
  • HeLa cells were cultured in Dulbecco medium modified by Eagle (DMEM) (Gibco) supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS) (Sigma). The day before transfection, the cells were seeded in 6-well plates to reach a confluence of 80% at the time of transfection. The cells were transfected with 18 ng of pEF-BOS HA-NFATc2 plus 1.1 ⁇ g of the GFP-peptide plasmids with 4 ⁇ l of Plus reagent plus 6 ⁇ l of Lipofectamine reagent (Invitrogen) for 3 hours in 1 ml of medium OPTIMEM (Gibco). Through flow cytometry the efficiency of tran'sfection was quantified as the percentage of cells expressing GFP. Similar transfection efficiencies were obtained for the different constructs and in independent experiments.
  • DMEM Dulbecco medium modified by Eagle
  • FBS fetal bovine serum
  • the HeLa culture medium was replaced by DMEM + 1% FBS.
  • HeLa cells were transfected as described in the previous section using 1.2 ⁇ g of the GFP-peptide expression plasmids together with 40 ng of pEF-BOS HA-NFATc2. Two hours before stimulation, the culture medium was replaced with DMEM + 1% FBS. After stimulating for 30 'with calcium ionophore A23187 (1 ⁇ M) and CaCl 2 (3mM), the cells were fixed at room temperature for 10' with a 10% solution of formaldehyde in PBS containing 4% sucrose. They were subsequently washed three times with PBS and permeabilized at room temperature for 10 'with a solution of PBS with 0.25% Triton X-IOO.
  • the cells were then incubated for 20 'with a blocking buffer (10% BSA in PBS) and subsequently with a 1: 500 solution of the 12CA5 antibody (anti-HA) for 1 hour.
  • the subcellular localization of the NFATs was detected using a fluorescence microscope (Axiovert-200, Zeiss) using a mouse anti-IgG conjugated with the fluorochrome Alexa 594 (Molecular Probes) as a secondary antibody.
  • the percentage of cells with a cytosolic or nuclear distribution of NFAT was calculated using no less than 130 positive cells per transfection. In vitro binding assays of CN-NFAT.
  • GST fusion proteins were expressed in E.coli BL21 protease deficient strain (DE3). They were purified using the glutathione (GSH) -Sepharose B beads (Amersham Biosciences) reagent. CN binding to these GST fusion proteins was used to perform pull-down assays, which were performed as explained below. A variable amount of the balls containing the GST fusion proteins fused to the NFAT regulatory domains (1-2 ⁇ g) or the peptides (10-30 ⁇ g) was used.
  • Laemmli buffer was added to the supernatants (unbound fraction) and stored for later analysis.
  • the balls were washed five times with cold and freshly prepared buffer and Laemmli buffer was added; the samples were boiled to separate bound proteins (bound fraction).
  • the bound and unbound fractions were loaded into 10% gels of SDS-polyacrylamide and separated by electrophoresis under reducing conditions.
  • Calcineurin was detected by western blotting using an anti-CnA mouse monoclonal antibody (clone G182-1847, PharMingen). Where indicated, the amount of CN bound to the GST fusion proteins was quantified by densitometry using the Quantity One (BIO-RAD) program.
  • the peptides were synthesized in the Proteomics Service of the Center for Molecular Biology "Severo Ochoa” CSIC-UAM.
  • amino acids are abbreviated using the one-letter codes accepted in the field, in the form shown below:

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Abstract

La presente invención se encuadra en el sector de la biotecnologia aplicada al área de la salud humana y más concretamente se basa en la sorprendente utilidad de los péptidos, LxVPc1, c3 y c4 como eficientes inhibidores selectivos de la ruta de señalización Calcineurina (CN) - NFAT y de la actividad fosfatasa de la CN. Dichos compuestos son útiles immunosupre sores y sirven de base para la elaboración de composiciones terapéuticas para la profilaxis y el tratamiento de enfermedades humanas que cursen con activación de linfocitos T, tales como, pero sin limitarnos a, enfermedades autoinmunes, inflamación y alergia o situaciones de rechazo a transplantes. Igualmente, estos péptidos y el material genético y biológico relacionado pueden constituir útiles herramientas para el desarrollo de ensayos para encontrar compuestos que tengan actividad antagonista selectiva de la CN.

Description

TITULO
PÉPTIDOS INHIBIDORES SELECTIVOS DE LA ACTIVIDAD BIOLÓGICA
DE LA CALCINEURINA
SECTOR DE LA TÉCNICA
La presente invención se encuadra en el sector de la biotecnologia aplicada al área de la salud humana y más concretamente se basa en la sorprendente utilidad de los péptidos, LxVPcI, c3 y c4 como eficientes inhibidores selectivos de la ruta de- señalización Calcineurina (CN) - NFAT y de la actividad fosfatasa de la CN. Dichos compuestos son útiles immunosupresores y sirven de base para la elaboración de composiciones terapéuticas para la profilaxis y el tratamiento de enfermedades humanas que cursen con activación de linfocitos T, tales como, pero sin limitarnos a, enfermedades autoinmunes, inflamación y alergia o situaciones de rechazo a transplantes. Igualmente, estos péptidos y el material genético y biológico relacionado pueden constituir útiles herramientas para el desarrollo de ensayos para encontrar compuestos que tengan actividad antagonista selectiva de la CN.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
La ruta Calcio/Calcineurina/NFAT desempeña un papel destacado en una gran cantidad de procesos biológicos importantes, incluyendo el desarrollo y funcionamiento de los sistemas inmune y nervioso, formación de la vasculatura, morfogénesis de las válvulas cardiacas y crecimiento y desarrollo muscular (1-5) . Las señales de calcio activan a la fosfatasa calcineurina (CN) , que desfosforila a los factores de transcripción NFATcI, NFATc2, NFATc3 y NFATc4 (nomenclatura HUGO) . Esto induce su translocación desde el citoplasma al núcleo y aumenta su capacidad de unión al ADN, provocando la expresión génica dependiente de NFAT (6) . La unión de CN a los NFATs es por lo tanto un paso esencial en la activación de esta familia de factores de transcripción.
La calcineurina, también conocida como la proteina fosfatasa 2B, es un heterodimero que consta de una subunidad catalitica (CnA) fuertemente unida a una subunidad reguladora (CnB) . La CnA se compone de un dominio catalítico y otro regulador que contiene la secuencia de unión con la CnB, un dominio de unión de calmodulina (CaM) y un segmento autoinhibidor (7) . La actividad fosfatasa de CnA se regula por un complejo formado por Ca2+, CnB y CaM; ambas proteinas reguladoras son esenciales para esta actividad (7,8). La CN puede unirse tanto a NFAT fosforilado como desfosforilado (9,10); y aunque la CN inactiva puede unirse a los NFAT, la unión es más fuerte con la CN activada (11) . En los NFAT, esta interacción ha sido localizada dentro del dominio regulador N-terminal, que está conservado en los cuatro miembros (12-14) . Mediante análisis mutacional se analizaron los motivos conservados dentro del dominio regulador de NFATc2, definiéndose la secuencia SPRIEIT como el sitio de anclaje de calcineurina (15) . En estudios posteriores se identificaron los residuos conservados en las secuencias correspondientes de los demás miembros de NFAT, definiéndose el motivo PxIxIT (ver Fig. IA) , que parece ser funcional en todos los miembros de NFAT regulados por CN (11,16-18) .
NFAT se describió por primera vez como un factor esencial para la expresión del gen de la IL-2 (19) , y posteriormente se ha implicado en la regulación de muchos otros genes necesarios para una respuesta inmune eficaz (20-23) . El descubrimiento de que CN es la diana intracelular de las drogas inmunosupresoras, como Ciclosporina A (CsA) y FK506 (24) , resaltó aún más la importancia de NFAT en el sistema inmune asi como de la ruta Ca2+/CN/NFAT (25-27) . El empleo de estas drogas, CsA y
FK506, es el método más frecuente para bloquear la ruta de señalización CN-NFAT, ya que inhiben la actividad enzimática de CN (24) . Sin embargo, esta estrategia también inhibe otras rutas no relacionadas con NFAT dependientes de
CN, lo que se asocia con los efectos secundarios severos que desencadena su uso clínico (28) . Se ha visto mediante estudios usando péptidos inhibidores que el bloqueo especifico de las interacciones proteina-proteina es terapéuticamente prometedor para el tratamiento de enfermedades donde esté implicada la ruta CN-NFAT. El péptido VIVIT, cuya secuencia está basada en el motivo
PxIxIT y que posee una elevada afinidad por CN, es capaz de inhibir selectivamente la ruta de señalización dependiente de NFAT sin afectar al resto de vias activadas por CN (29) .
Sin embargo, en los últimos años se han descrito numerosas proteínas que se unen a CN que presentan, la mayoría de ellas, un motivo similar al PxIxIT dentro de la zona de interacción con CN (30) . El péptido VIVIT podría por lo tanto bloquear tanto la interacción CN-NFAT como la de CN con otras proteínas. Por el contrario, el motivo LxVP - que participa en la interacción de NFAT con la CN activada - se ha descrito solamente en NFAT. Por lo tanto, el efecto bloqueante tanto in vitro como in vivo que aqui se describe muestra que el empleo de péptidos derivados de estos motivos posee un efecto inhibidor selectivo' potencial en la ruta CN-NFAT, cubriendo pues, la necesidad de encontrar moléculas altamente selectivas capaces de inhibir la ruta CN-NFAT . DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Breve descripción de la invención
La presente invención se refiere a nuevos péptidos y a derivados de los mismos útiles como antagonistas (inhibidores) selectivos de la ruta de señalización CN-NFAT y más concretamente como inmunosupresores (además, se ha observado que son inhibidores de la actividad fosfatasa de la CN) . La invención también se refiere a composiciones terapéuticas que comprenden dichos péptidos, a ensayos para encontrar compuestos que tengan actividad, preferentemente, antagonista selectiva de la acción biológica de CN sobre NFAT y el uso de dichos péptidos para la profilaxis y tratamiento de enfermedades humanas que cursen con activación de linfocitos T, tales como, pero sin limitación, enfermedades autoinmunes, inflamación y alergia o situaciones de rechazo a transplantes. De la misma forma, se refiere a herramientas genéticas y métodos • de producción de dichos péptidos.
DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
FIG. IA.- Representación esquemática del dominio regulador NH2~terminal y de las secuencias de interacción con CN de los diferentes NFATs. Las regiones conservadas entre los diferentes miembros de NFAT se muestran como sigue: SP-I, SP-2 y SP-3 son motivos repetitivos de serina-prolina susceptibles de fosforilación; SRR-I y SRR-2 son regiones ricas en serina; y NLS es la secuencia de localización nuclear. Las dos regiones implicadas en la unión a CN, denominadas motivos PxIxIT y LxVP se muestran en negro, y por debajo se muestran las secuencias correspondientes a estos motivos en cada uno de los cuatro miembros de NFAT humano; los aminoácidos conservados entre los diferentes miembros se muestran en negrita. Los residuos indicados se sustituyeron por alaninas para producir el correspondiente péptido LxVPcI mutante. Las abreviaturas empleadas para los diferentes motivos PxIxIT y LxVP se muestran a la derecha. FIG. IB.- Secuencias de aminoácidos de los péptidos usados como control positivo (VIVIT) o negativo (SCRAMBLED) de competición para los experimentos de unión in vitro.
FIG. 2.- Comparación de la unión de CN a NFATcI y NFATc2 in vitro. FIG. 2A.- La unión de NFATcI y NFATc2 a CN es dependiente de la concentración de NFAT. Se ensayó una concentración fija de CN (20 nM) frente a concentraciones decrecientes de los dominios reguladores de NFATc2 o NFATcI fusionados a GST (Glutathione-S- Transferase) en ensayos de pull-down. La CN unida se mostró mediante western blot usando un anticuerpo monoclonal frente a CnA. Debido a las altas cantidades de CN unida a NFATcI se muestran dos exposiciones diferentes (panel superior e inferior respectivamente) para mostrar claramente la interacción
NFATcI-CN. Se cuantificó la CN unida mediante densitometria, dato mostrado en el gráfico inferior como unidades de intensidad relativa de CN unida a cada concentración de NFAT. FIG 2B.- La unión de CN-NFAT es dependiente de la concentración de CN. Se ensayaron cantidades fijas de GST-NFATc2 (izquierda) ó GST-NFATcI
(derecha) con concentraciones decrecientes de CN (20, 10, 5 y 2,5 nM de CN) . La CN se detectó usando un anticuerpo monoclonal frente a CnA: la CN unida se muestra en el panel superior; y en el inferior se muestra la CN no unida
(libre) en 1/3 de los sobrenadantes obtenidos tras la reacción de unión. La tinción de las membranas de western blot con Ponceau Red confirmó que se usaron las mismas cantidades de las proteínas de fusión de GST en las reacciones (panel intermedio) .
FIG. 3.- Análisis de la interacción in vitro de CN con los péptidos PxIxIT y LxVP fusionados a GST. Las proteínas de fusión GST-péptido que contienen las secuencias PxIxIT ó LxVP de NFATcl y NFATc2 se utilizaron en ensayos de pull- down. Las proteinas GST o GST fusionada al péptido LxVPcI mutado (AxAA) se usaron como controles negativos. La CN unida se detectó mediante western blot y la cantidad usada de las proteinas de fusión de GST se analizó mediante tinción de proteinas totales en geles SDS-PAGE. FIG. 4.- Efecto de los péptidos PxIxIT y LxVP derivados de NFATcl y NFATc2 en la interacción in vitro de NFAT y CN. Se realizaron los ensayos de unión GST-NFAT-CN en presencia de los péptidos sintéticos indicados, y se detectó la CN unida mediante western blot usado un anticuerpo monoclonal frente a CnA. FIG. 4A.- CN unida a GST-NFATc2 en presencia de los péptidos competidores a 32 μM o 200 μM. El péptido mutLxVPcl contiene el motivo LxVP de NFATcl con los residuos Leucina, Valina y Prolina sustituidos por Alanina. FIG. 4B.- CN unida a GST-NFATc2 en presencia de altas concentraciones de péptidos competidores. Se usó como control negativo el péptido control SCRAMBLED (SC) . El panel inferior muestra la CN no unida (libre) en 1/3 de los sobrenadantes obtenidos tras la reacción de unión. FIG. 4C-, CN unida a GST-NFATcI en presencia de los péptidos competidores a 32 μM ó 200 μM.
FIG. 5.- Comparación de la capacidad de los péptidos VIVIT,
LxVPcI y PxIxITc2 para bloquear la unión de CN a NFATc2. La unión de GST-NFATc2 a CN se competía por concentraciones crecientes de los péptidos VIVIT, LxVPcI o PxIxITc2. Los paneles superiores muestran la cantidad de CN unida a GST-
NFATc2 mientras que los inferiores muestran la CN no unida
(libre) en 1/3 de los sobrenadantes obtenidos tras la reacción de unión. La CN unida se cuantificó mediante análisis densitométrico con el software Quantity One (BIO-
RAD) , datos que se presentan en el gráfico mostrando las curvas de inhibición de cada péptido competidor para la unión de CN a GST-NFATc2. El 100% de CN unida se asimila a la cantidad de CN unida a GST-NFATc2 en ausencia de péptido competidor.
FIG. 6.- Competición de la interacción NFATcI-CN y NFATc2-
CN por péptidos que mimetizan los motivos PxIxIT y LxVP de NFATcI, c2, c3 y c4. FIG. 6A.- Los péptidos correspondientes a los motivos LxVP de NFATcI, c2, c3 y c4
(32 μM) se usaron para competir In vitro la unión de CN a
GST-NFATc2 (izquierda) o GST-NFATcI (derecha) . Debido a la elevada cantidad de CN unida a NFATcI, se muestran dos exposiciones diferentes (paneles superiores y centrales) para mostrar claramente el efecto de los péptidos sobre la interacción de NFATcI y CN. Los paneles inferiores muestran la CN no unida (libre) en 1/3 de los sobrenadantes obtenidos tras la reacción de unión. FIG. 6B.-, Unión in vitro de GST-NFAT-CN en presencia de 100 μM de cada péptido
PxIxIT. Se muestra la CN unida y la libre. Las secuencias de los péptidos se detallan en la FIG. 1.
FIG. 7- Competición cruzada de la interacción GST-PxIxITc2- CN ó GST-LxVPcl-CN por los péptidos PxIxITc2 y LxVPcI. Se usaron las proteínas de fusión de GST conteniendo los péptidos PxIxITc2 o LxVPcI en ensayos de pull-down de CN en presencia de los péptidos competidores libres como se indica. Se usó el péptido SCRAMBLED (SC: • 200 μM) como control negativo de competición, y también se analizó el efecto del péptido VIVIT (12 μM) . Para una mejor detección de la escasa CN unida a GST-PxIxITc2, se empleó el doble de GST-PxIxITc2 que de GST-LxVPcI.
FIG. 8.- Bloqueo in vivo de la regulación de NFATc2 por el péptido LxVPcI. Se co-transfectaron las células HeLa (NFAT negativas) con las construcciones HA-NFATc2 wild type y las proteínas de fusión de GFP con los péptidos PxIxIT o LxVP derivados de NFATc2 o NFATcI. Se empleó como control el péptido mutado LxVPcI (mutLxVPcl) fusionado a GFP. FIG. 8A.- Las células HeLa transfectadas se estimularon o no con PMA (20 ng/ml) más ionóforo de calcio (lo) (1 μM) (PMA+Io) durante Ih. Los extractos celulares totales se analizaron mediante western blot usando un anticuerpo frente a HA para detectar NFATc2 (panel superior) ó un suero anti-GFP para controlar la expresión de las proteínas de fusión a GFP
(panel inferior) . La movilidad electroforética de las bandas superiores (fosforilado) e inferiores
(desfosforilado) corresponde al estado de fosforilación de
NFATc2. Los extractos de las células que expresaban solo la proteina parental GFP se muestran con los carriles φ. Los asteriscos señalan bandas inespecificas. FIG. 8B.-
Localización subcelular de NFATc2 en las células HeLa transfectadas tratadas con Io durante 30 minutos. Las imágenes de la inmunofluorescencia muestran campos representativos de células que expresaban la correspondiente proteina de fusión de GFP-péptido
(izquierda) y la tinción de NFATc2 (derecha) . Se indica el porcentaje de células que mostraban una distribución citosólica de NFATc2 (se contaron al menos 130 células por transfección) .
FIG. 9.- El péptido LxVPcI es un potente inhibidor de la actividad fosfatasa de la CN. La actividad fosfatasa de la CN sobre el sustrato fosfopéptido RII fue medida en ausencia y presencia de diferentes péptidos (PxIxITc2, LxVPcI y mutLxVPcl) . Los resultados fueron comparables a los obtenidos en presencia de 10 μM del complejo inhibidor CsA/CyP. Los datos se representan en picomoles de fosfatos liberados durante la reacción, y son expresados como la media +/- SD de un experimento, y fueron realizados por duplicado. Se presenta un experimento representativo de los tres ensayos realizados.
FIG. 10.- El péptido LxVP aumenta la actividad fosfatasa de CN sobre el sustrato pNPP. La capacidad de hidrólisis del grupo fosfato del pNPP ejercida por CN se analizó en presencia de cantidades crecientes del péptido LxVPcI . Esta gráfica representa la media de tres experimentos y permite calcular la EC50 (Effective Concentration for 50% effect) del péptido por CN, próxima a 6,5mM.
FIG. 11.- La interacción del péptido LxVP con CN requiere la presencia del heterodimero. En este ensayo se compara la interacción Λin vitro' de las subunidades CnA y CnB, por separado o formando el heterodimero, a la proteina GST que lleva fusionada la secuencia del péptido LxVPcI en su extremo C-terminal. En la figura se observa que LxVPcI sólo une CN cuando las dos subunidades, CnA más CnB, están presentes. Como control de especificidad se analizó la unión de las diferentes subunidades de CN a la proteina GST.
FIG. 12.- El péptido LxVPcI impide la interacción entre CN y las drogas inmunosupresoras. El ensayo de interacción se realizó utilizando GST-Ciclofilina A (panel A) o GST-FKBP12
(panel B) en presencia de cantidades crecientes del péptido LxVPcI salvaje o mutado. Como control (C) se utilizó un péptido control que no une CN.
Descripción detallada de la invención
La presente invención se basa en que los inventores han encontrado la sorprendente utilidad de los péptidos, LxVPcI, LxVPc3 y LxVPc4 como eficientes inhibidores selectivos de la ruta de señalización CN-NFAT y más concretamente como útiles compuestos inmunosupresores base para la elaboración de composiciones terapéuticas para la profilaxis y el tratamiento de enfermedades humanas que cursen con activación de linfocitos T, tales como, pero sin limitarnos a, enfermedades autoinmunes, inflamación y alergia o situaciones de rechazo a transplantes. Igualmente, estos péptidos y el material genético y biológico relacionado pueden constituir útiles herramientas para el desarrollo de ensayos para encontrar compuestos que tengan actividad antagonista selectiva de la Calcineurina (en adelante CN) . En la presente invención se ha comparado la interacción de NFATcI y NFATc2 con la CN activa. En los análisis semicuantitativos se muestra claramente que la interacción de CN con NFATcI es más fuerte que con NFATc2. Por otro lado, los experimentos de competición utilizando péptidos basados en los sitios LxVP de los diferentes NFATs sugieren que NFATc3 y NFATc4 tendrían una capacidad de interacción con CN similar a la de NFATcI. Por lo tanto, mientras que el motivo PxIxIT es el principal sitio de anclaje de CN en NFATc2, la presencia de sitios LxVP funcionales en NFATcI, NFATc3 y NFATc4 contribuye a una interacción NFAT-CN más fuerte.
Adicionalmente se ha visto que el péptido LxVPc2 es un competidor muy débil de la unión de CN a NFAT, lo que sugiere que la interacción NFATc2-CN pudiera deberse principalmente al motivo PxIxIT. El motivo LxVP de NFATcI presenta unas características diferentes. Este péptido LxVP se une mucho más eficientemente a CN que los motivos PxIxIT de NFATcI y NFATc2 (FIG. 3) . También es capaz de inhibir in vitro la interacción de CN con ambos NFATs y la translocación de NFATc2 en células activadas (FIGs. 4-6 y
FIG. 8) . La gran capacidad de LxVPcI para interferir en los complejos NFATc2-CN tanto in vitro como in vivo es uno de los resultados más sorprendentes de esta invención. Los péptidos LxVP basados en las secuencias de NFATcI, NFATc3 y NFATc4 también han demostrado ser unos competidores eficientes de la interacción in vitro de CN con NFATcI ó
NFATc2. Seria pues esperable que la expresión en células de los péptidos LxVPc3 y LxVPc4 acarrease un efecto similar al observado con el péptido LxVPcI sobre la activación de NFATc2.
Por otro lado, en esta invención se presenta claras evidencias de que los residuos conservados en los motivos LxVP, Leucina, Valina y Prolina, son esenciales para la interacción de NFATcI con CN. Sin embargo, el hecho de que el motivo LxVPc2 también presente conservados estos aminoácidos indica que otros residuos presentes en dicho motivo han de ser importantes en la interacción proteina- proteina. Más allá de los tres residuos conservados, sólo
NFATcI, NFATc3 y NFATc4 poseen un aminoácido aromático adyacente al núcleo del motivo LxVP (Tirosina, Fenilalanina y Tirosina, respectivamente) . Otra diferencia en las secuencias es la presencia en NFATc2 de un residuo de Prolina adyacente al extremo C-terminal del núcleo del motivo LxVP, lo que da lugar a dos residuos consecutivos de
Prolina de los que carecen el resto de miembros de NFAT.
Esto hace que las diferencias en las regiones que flanquean el núcleo del motivo puedan explicar el comportamiento diferencial que posee el LxVPc2 comparado con LxVPcI,
LxVPc3 y LxVPc4.
Otro resultado sorprendente de la presente invención es que el péptido LxVPcI se une directamente a CN e inhibe su actividad fosfatasa a niveles similares a CsA (ver Figura 9, Ejemplo 7) . Asi, el uso de este péptido LxVPcI como inmunosupresor presentarla claras ventajas frente a los agentes inmunosupresores CsA y FK506. La administración del péptido LxVPcI inhibirla la actividad fosfatasa de CN, sin que afectase a otros procesos celulares no dependientes de CN y que podrían ser los responsables de algunos de los efectos secundarios asociados al tratamiento con los fármacos CsA y FK506 (31-33) ; requiriendo la estructura dimérica (CnA+CnB) para unirse a la CN. Además, el tratamiento con este péptido servirla para distinguir entre los efectos secundarios debidos a la inhibición de la actividad fosfatasa CN de los que son independientes de CN.
Por lo tanto, un primer aspecto de la presente invención lo constituye una secuencia de aminoácidos, capaz de inhibir selectivamente la ruta de señalización CN-NFAT, que comprende la secuencia de aminoácidos (aá)
R1-L-R2-V-P-R3,
donde Ri es un aá aromático del tipo Tirosina o- Fénrlalanina; R2 es un aminoácido del tipo Alanina o Serina y R3 no es el aminoácido Prolina (en adelante a esta secuencia de aminoácidos lo llamaremos núcleo básico de la invención) . Dicha secuencia de aminoácidos constituye el núcleo básico de partida para la constitución de todos aquellos compuestos capaces de inhibir selectivamente la ruta de señalización CN-NFAT y más concretamente capaces de inhibir la acción biológica de la CN sobre, al menos, los factores de transcripción NFATcI y NFATc2. Otro aspecto preferente de la presente invención lo constituye una secuencia de aminoácidos, capaz de inhibir selectivamente la ruta de señalización CN-NFAT y más concretamente capaz de inhibir la acción biológica de la CN sobre los factores de transcripción NFATcI y NFATc2, que posee el núcleo básico de la invención y pertenece al siguiente grupo: a) secuencia de aá SEQ ID NO 18 (LxVPcI) o SEQ ID NO 21 (LxVPc3) o SEQ ID NO 22 (LxVPc4) , b) secuencia de aá análoga a la secuencia de a) c) secuencia de aá que comprende una secuencia cualquiera perteneciente a (a) o (b) .
En el sentido utilizado en esta descripción, el termino "análoga" pretende incluir cualquier secuencia de aá que pueda ser aislada o construida en base a las secuencias de aá mostradas en la presente invención, por ejemplo, mediante la introducción de sustituciones de aá, conservativas o no conservativas, incluyendo la inserción de uno o más aminoácidos, la adición de uno o más aá, en cualquiera de los extremos de la molécula o la delección de uno o más aá, en cualquier extremo o en el interior de la secuencia siempre y cuando esto no modifique el núcleo básico de la invención y que constituya un péptido capaz de inhibir selectivamente la ruta de señalización CN-NFAT y más concretamente capaz de inhibir la acción biológica de la CN sobre los factores de transcripción NFATcI y NFATc2.
En general, una secuencia de aá análoga es sustancialmente homologa a la secuencia de aá comentada anteriormente. En el sentido utilizado en esta descripción, la expresión "sustancialmente homologa" significa que las secuencias de aá en cuestión tengan un grado de identidad de, al menos, un 40%, preferentemente de, al menos, un 85%, o más preferentemente de, al menos, un 95%.
Un aspecto particular de la invención lo constituye un péptido capaz de inhibir selectivamente la ruta de señalización CN-NFAT y más concretamente capaz de inhibir la acción biológica de la Calcineurina sobre los factores de transcripción NFATcI y NFATc2, y que comprenda la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO 18 o una secuencia de aá análoga o sustanciamente análoga a la SEQ ID NO 18.
Otro aspecto particular de la invención lo constituye un péptido capaz de inhibir selectivamente la ruta de señalización CN-NFAT y más concretamente capaz de inhibir la acción biológica de la CN sobre los factores de transcripción NFATcI y NFATc2, y que comprenda la secuencia de aá SEQ ID NO 21 o una secuencia de aá análoga o sustanciamente análoga a la SEQ ID NO 21.
Un aspecto particular más de la invención lo constituye un péptido capaz de inhibir selectivamente la ruta de señalización CN-NFAT y más concretamente capaz de inhibir la acción biológica de la CN sobre los factores de transcripción NFATcI y NFATc2, y que comprenda la secuencia de aá SEQ ID NO 22 o una secuencia de aá análoga o sustancialmente análoga a la SEQ ID NO 22.
Cualquiera de las secuencias de aá de la presente invención puede ser obtenida mediante la expresión génica de las secuencias de nucleótidos que permiten la codificación de sus residuos, asi como mediante su síntesis química. Algunas modificaciones pueden ser importantes para estabilizar el péptido en futuras formulaciones farmacéuticas en las que se incorpore para su administración a un individuo o para su utilidad como herramienta de investigación. De igual forma se sustituye uno ó más nucleótidos del codón correspondiente a cada residuo de interés.
Por consiguiente, las secuencias de aá de los péptidos de la invención y las secuencias de nucleótidos codificantes de las mismas comprenden una serie de secuencias que cualquier experto en materia puede obtener de forma rutinaria, sin excesiva experimentación, a partir de la información suministrada en la presente invención.
Dichas sustituciones o modificaciones adecuadas para llevar a cabo los diversos aspectos de la presente invención se pueden determinar mediante experimentación de rutina para obtener péptidos con las propiedades estructurales y funcionales descritas por ejemplo comparando las interacciones proteina-proteina mediante ensayos de competición i n vitro o in vivo utilizando CN con cualquiera de los NFATs cl-c4.
Se puede hacer cualquier combinación de deleción, inserción y sustitución para llegar a expresar y producir la construcción final del péptido deseado mediante mutaciones en el ADN y técnicas de ingeniería genética utilizando células huésped que comprendan dichas secuencias de nucleótidos.
Por lo tanto, otro aspecto de la presente invención comprende una secuencia de nucleótidos capaz de codificar la secuencia de aá de los péptidos LxVPcI o LxVPc3 o LxVPc4 de la presente invención constituida por una secuencia de nucleótidos seleccionado de uno de los siguientes grupos: a) secuencia de nucleótidos SEQ ID NO 5 y/o su secuencia complementaria SEQ ID NO 6, b) secuencia de nucleótidos y/o su secuencia complementaria que codifica para la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO 21, c) secuencia de nucleótidos y/o su secuencia complementaria que codifica para la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO 22, d) secuencia de nucleótidos análoga a la secuencia (a), o (b) o (c), e) secuencia de nucleótidos que comprende una secuencia cualquiera perteneciente de (a) , (b) , (c) y (d) . Un aspecto particular de la invención lo constituye una secuencia de nucleótidos capaz de codificar una secuencia de aminoácidos o péptidos que pueden inhibir selectivamente la ruta de señalización CN-NFAT, y más concretamente, inhibir la acción biológica de la CN sobre los factores de transcripción NFATcI y NFATc2, y que comprenda la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO 5 y/o su secuencia complementaria SEQ ID NO 6.
La secuencia de nucleótidos descrito en la presente invención también puede estar unida o fusionada, en caso necesario y para permitir un mejor aislamiento o detección del péptido expresado, a una secuencia de ADN que codifica para un péptido susceptible de ser utilizado con fines de aislamiento o detección de dicho péptido. Por lo tanto, otro aspecto particular de la presente invención lo constituye una construcción genética que comprende además de una secuencia de nucleótidos selecciona-da entre la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO 5 y/o su secuencia complementaria SEQ ID NO 6, o la secuencia de nucleótidos que codifica para el péptido LxVPc3, o la secuencia de nucleótidos que codifica para el péptido LxVPc4, cualquier otra secuencia de nucleótidos codificante de un péptido o secuencia peptidica que permita el aislamiento o la detección del/de los péptido/s expresado/s .
La secuencia de nucleótidos y la construcción genética de la presente invención pueden obtenerse mediante el empleo de técnicas ampliamente conocidas por cualquier experto en la materia (34) . Dichas secuencias de nucleótidos pueden estar integradas en un vector de expresión que permite la regulación de las mismas en condiciones adecuadas para la producción de los péptidos o proteínas correspondientes que son un principio activo farmacéutico .
Por lo tanto, otro aspecto más de la presente invención lo constituye un vector de expresión génica que comprende la secuencia de nucleótidos LxVPcI y/o su secuencia complementaria o la secuencia de nucleótidos LxVPc3 y/o su secuencia complementaria o la secuencia de nucleótidos LxVPc4 y/o su secuencia complementaria o la construcción genética LxVPcI o la construcción genética
LxVPc3 o la construcción genética LxVPc4 de la presente invención y que permite la expresión de dicha construcción en el citoplasma de una célula de la invención.
En general, el vector de expresión LxVPcI o el vector de expresión LxVpc3 o el vector LxVPc4 de la presente invención comprende, además de la secuencia de nucleótidos LxVPcI y/o su secuencia complementaria o la secuencia de nucleótidos LxVPc3 y/o su secuencia complementaria o la secuencia de nucleótidos LxVPc4 y/o su secuencia complementaria o la construcción genética LxVPcI o la construcción genética LxVPc3 o la construcción genética LxVPc4 de la presente invención, un promotor que dirige su transcripción, al que está operativamente enlazado, y otras secuencias necesarias o apropiadas que controlan y regulan dicha transcripción y, en su caso, la traducción del producto de interés, por ejemplo, señales de inicio y terminación de transcripción, señal de poliadenilación, origen de replicación, secuencias de unión a ribosomas, secuencias codificantes de reguladores transcripcionales, silenciadores transcripcionales, represores, etc. Ejemplos de vectores de expresión apropiados pueden seleccionarse de acuerdo con las condiciones y necesidades de cada uso concreto entre plásmidos de expresión de células que pueden contener, además, marcadores utilizables para seleccionar las células transfectadas o transformadas con el gen o genes de interés. La elección del vector dependerá de la célula hospedadora y del tipo de uso que se quiera realizar.
Por tanto, según un modo de realización particular de la presente invención dicho vector es un plásmido o un vector viral. La obtención de dicho vector puede realizarse por métodos convencionales conocidos por los expertos en la materia al igual que para la transformación de los microorganismos y células eucariotas se pueden utilizar diferentes métodos como, pero sin limitación, transformación química, electroporación, microinyección, entre otros. Una estrategia podría ser la de utilizar lentivirus para infectar las células diana, tal y como ya está siendo intentado en terapia génica por Ralph et al. (35) . Estas secuencias de nucleótidos mencionados pueden ser utilizadas en un proceso de terapia génica en el que mediante cualquier técnica o procedimiento se permita la integración de los mismos en las células de un paciente humano. Este objetivo puede conseguirse mediante la administración a estas células de una construcción génica que comprende una o varias de dichas secuencias de nucleótidos mencionados con el fin de transformar dichas células permitiendo su expresión en el interior de las mismas de manera que se inhiba la ruta de señalización CN- NFAT. Ventajosamente, dicha construcción génica puede estar incluida dentro de un vector, tal como, por ejemplo, un vector de expresión o un vector de transferencia.
De esta forma, tanto la secuencia de nucleótidos, construcción génica o el vector de expresión pueden utilizarse como un medicamento para proteger células humanas huésped en un procedimiento de tratamiento y profilaxis de terapia génica in vivo o ex vivo de un ser humano afectado por una enfermedad que cursa con exacerbación de la respuesta inmune. Los procedimientos de terapia génica pueden aplicarse directamente sobre el paciente administrando como un medicamento una de estas mencionadas secuencias de nucleótidos, o podria extraerse de un ser humano células del sistema inmune exacerbadas y una vez ex vivo transformarlas con las secuencias de nucleótidos y posteriormente devolverlas al ser humano o mantenerlas ex vivo para usos posteriores.
Las herramientas biofarmacéuticas y los procedimientos de terapia génica son suficientemente conocidas por un experto del sector de la técnica de tal forma que con la información descrita en la presente invención pueden desarrollarse sin excesivo esfuerzo.
Un aspecto adicional de la presente invención lo constituye una célula transformada que comprende una secuencia de nucleótidos LxVPcI y/o su secuencia complementaria o una secuencia de nucleótidos LxVPc3 y/o su secuencia complementaria o una secuencia de nucleótidos
LxVPc4 y/o su secuencia complementaria o una construcción genética LxVPcI o una construcción genética LxVPc3 o una construcción genética LxVPc4 o un vector LxVPcI o un vector
LxVPc3 o un vector LxVPc4 de la presente invención y que es capaz de expresar el péptido LxVPcI o el péptido LxVPc3 o el péptido LxVPc4, respectivamente de la presente invención en condiciones adecuadas-. La célula LxVPcI o la célula
LxVPc3 o la célula LxVPc4 de la invención puede ser una célula procariota o eucariota en función de las necesidades concretas y pueden ser elaboradas por un experto en la materia con la información descrita en la presente invención.
Estas células pueden ser útiles para la producción de los péptidos con actividad inhibidora de la ruta de señalización de CN-NFAT que pueden ser la base de una composición farmacéutica, para la amplificación recombinante de dichas secuencias de nucleótidos o pueden ser útiles per se como células en terapia génica.
Por otro lado, la secuencia de nucleótidos, construcción genética, vector de expresión, las células transformadas y el péptido LxVPcI, c3 o c4 de la presente invención pueden ser utilizados directamente o mediante su expresión genética en células huésped para la elaboración de sistemas de identificación o screening de compuestos farmacéuticos reguladores de la ruta de señalización CN- NFAT, más concretamente de la acción biológica de la CN sobre' los factores de transcripción NFATcI y NFATc2, preferentemente antagonistas selectivos de CN-NFAT mediante la determinación del efecto de la adición de un potencial compuesto sobre dicha actividad. En estos ensayos se pueden utilizar distintas combinaciones, uno o más, de las potenciales formas posibles de los péptidos LxVPcI, c3 o c4. El uso directo del péptido LxVPcI, c3 o c4, de la presente invención puede utilizarse, después de su extracción y purificación, en un ensayo in vitro de interacción o unión de proteínas. En estos ensayos se puede utilizar conjuntamente las proteínas o fragmentos de las mismas implicadas en la interacción para la que se desea identificar compuestos reguladores; mientras que la interacción de dichas proteínas se puede valorar por ejemplo mediante Western blot (ver ejemplos) . Los compuestos a identificar pueden ser de distinto origen: natural (plantas, procariota, etc.) o sintético. Este sistema de screening puede medir o detectar (cuantitativa o cualitativamente) la unión competitiva de un compuesto candidato a un péptido señal mediante mareaje directo o indirecto de alguno de los elementos de dicho sistema.
Por lo tanto, otro aspecto de la presente invención lo constituye un procedimiento o ensayo de identificación o screening de nuevos compuestos farmacéuticos reguladores, preferentemente antagonistas selectivos, de la ruta de señalización CN-NFAT, más concretamente de la acción biológica de la CN sobre los factores de transcripción
NFATcI y NFATc2 y que comprende el uso de la secuencia de nucleótidos, construcción génica, vector de expresión, las células huésped y/o los péptidos de la presente invención de forma aislada o en una de sus combinaciones posibles.
Otro aspecto de la presente invención lo constituye un ensayo de identificación de compuestos farmacéuticos en el que el procedimiento es un ensayo de identificación de compuestos farmacéuticos en el que el procedimiento es un ensayo in vitro o es un ensayo in vivo, como por ejemplo, un ensayo de co-inmunoprecipitación o de inmunodetección.
Tal y como se utiliza en la presente invención el término "selectivo" se refiere a que la capacidad del péptido de la invención de actuar como antagonista de la actividad de CN es considerablemente mayor que su capacidad de actuar como antagonistas de otras proteínas y, por otro lado, a que pueden seleccionarse péptidos más específicos para inhibir distintas actividades de la misma proteina CN.
Por lo tanto, otro aspecto de la invención lo constituye una composición farmacéutica útil para el tratamiento de enfermedades, en adelante composición farmacéutica de la invención, junto con, opcionalmente, uno o más adyuvantes • y/o vehículos farmacéuticamente aceptables, que comprende cualquiera de los péptidos anteriormente mencionados (SEQs ID No 18, 21 y 22) incluyendo sus análogos y sustancialmente análogos o cualquier otro compuesto que comprenda el núcleo básico, o bien que comprende cualquiera de las secuencias de nucleótidos, construcciones génicas o vectores de expresión anteriormente mencionados, o sus mezclas y que sean capaces de inhibir selectivamente la ruta de señalización CN-NFAT, que cursen con activación de la CN, y preferentemente, a titulo ilustrativo y sin que limite el alcance de la invención, con la activación del sistema inmunológico.
Los adyuvantes y vehículos farmacéuticamente aceptables que pueden ser utilizados en dichas composiciones son los adyuvantes y vehículos conocidos por los técnicos en la materia y utilizados habitualmente en la elaboración de composiciones terapéuticas.
La composición farmacéutica proporcionada por esta invención puede ser administrada por cualquier via de administración apropiada, para lo cual dicha composición se formulará en la forma farmacéutica adecuada a la via de administración elegida.
La composición farmacéutica de la presente invención puede utilizarse en un método de tratamiento de forma aislada o conjuntamente con otros compuestos farmacéuticos. Otro aspecto de la presente invención lo constituye el uso de la composición farmacéutica de la invención en la profilaxis y tratamiento de enfermedades humanas que cursen con activación de la CN, y preferentemente, a titulo ilustrativo y sin que limite el alcance de la invención, con activación de linfocitos T, tales como, por ejemplo, enfermedades autoinmunes, inflamación, alergia o situaciones de rechazo a transplantes.
Finalmente, otro aspecto de la invención lo constituye el uso de la composición farmacéutica de la invención como herramienta para la investigación básica para el aislamiento de nuevos sustratos de CN importantes para la señalización mediada por Calcio en diferentes especies.
- A continuación los siguientes ejemplos y figuras sirven para ilustrar pero no limitan la presente invención.
EJEMPLOS DE REALIZACIÓN
Ejemplol.- La unión de CN a NFATcI es más fuerte que a
NFATc2 Para analizar la capacidad de interacción de NFATcI y NFATc2 con la CN se realizaron ensayos de unión in vitro. Se comparó la CN unida a concentraciones decrecientes de los dominios reguladores recombinantes purificados de NFATcI o NFATc2 fusionados a la proteina GST (GST-NFATcI y GST-NFATc2 respectivamente) . La cuantificación mediante densitometria de la CN unida indicó que NFATcI tiene capacidad de unión a CN del orden submicromolar, y que la afinidad de NFATc2 parece ser mucho más baja que la de NFATcI (FIG. 2A) . Se realizaron experimentos complementarios en los que se varió la concentración de CN. En cada caso, la cantidad de CN unida a las proteínas de fusión GST-NFAT decrecia a medida que la concentración de CN era progresivamente disminuida. Sin embargo, y concordando con los resultados obtenidos variando las concentraciones de GST-NFAT, a cada concentración de CN ensayada, la unión a NFATcI era más fuerte que a NFATc2 (FIG. 2B) .
Ejemplo 2,- La capacidad unión de CN al motivo LxVPcI es mayor que a los motivos PxIxIT.
Estas diferencias de unión de CN podrían deberse a una capacidad diferencial de unión de CN a los sitios PxIxIT y
LxVP de NFATcI y NFATc2. Los segundos sitios de unión de CN muestran una homología limitada entre los diferentes miembros de NFAT, aunque su alineamiento indica que existen tres residuos conservados en todos los miembros (Leucina,
Valina y Prolina) (FIG. IA) . Para probar la capacidad de interacción de cada secuencia independiente PxIxIT y LxVP con CN, fusionamos la proteina GST con los motivos PxIxIT y
LxVP de NFATcI y NFATc2 (FIG. IA) , y los usamos en experimentos de pull-down con CN (FIG. 3) . La cantidad de
CN unida a GST-LxVPcI era mucho mayor que la unida a GST-
PxIxITcI o GST-PxIxITc2, mientras que GST-LxVPc2 era incapaz de unir CN en las mismas condiciones experimentales . La relevancia de los aminoácidos conservados (Valina, Leucina y Prolina) para la unión de
LxVPcI a CN se estudió usando una construcción GST- mutLxVPcl, en la cual cada residuo conservado se reemplazó por Alanina; GST-mutLxVPcl fue incapaz de unir CN (FIG. 3) .
Este resultado sugiere que la mayor capacidad de unión de
CN al motivo LxVP de NFATcI (con relación a los motivos
PxIxITcI y PxIxITc2) podría ser la responsable de la mayor fortaleza en la interacción de CN con NFATcI versus NFATc2.
Ejemplo 3.- Efecto de los péptidos PxIxIT y LxVP en la interacción NPAT-CN In v±tro.
Dadas las diferencias en la capacidad de interacción de CN con los sitios PxIxIT y LxVP, se evaluó la capacidad de los péptidos correspondientes a dichas secuencias para competir la unión de GST-NFATcI con CN in vitro . Los péptidos sintéticos correspondientes a las secuencias de unión de CN LxVP y PxIxIT de NFATcI y NFATc2 se muestran en la Fig. IA. La cantidad de CN unida a GST NFAT se detectó mediante análisis por western blot. En estos ensayos, el péptido VIVIT (FIG. IB) , una secuencia altamente especifica seleccionada mediante una librería combinatorial de péptidos (29), se usó como un potente competidor control. Los péptidos PxIxIT correspondientes a NFATcI y NFATc2
(PxIxITcI y PxIxITc2, respectivamente) tenían una potencia similar desplazando la unión de NFATc2 y CN (FIG. 4A), pero existían claras diferencias entre los dos péptidos basados en las secuencias LxVP. LxVPcI, el péptido que contenia la secuencia LxVP de NFATcI, interfería la unión de CN a
NFATc2. Este efecto era incluso más fuerte que el causado por la secuencia PxIxITc2, descrita como el sitio de anclaje de CN a este NFAT (FIG. 4A) . Por contra, la misma concentración del péptido LxVP especifico de NFATc2 (LxVPc2) no fue capaz de competir la unión de NFATc2 con CN
(FIG. 4A, panel izquierdo) . En estos ensayos, el péptido mutLxVPcl no afectó a la unión de NFATc2 y CN, indicando que estos residuos son necesarios para competir la unión de
NFAT a CN in vitro. Estos resultados sugieren que LxVPc2 no interacciona con CN, o más en profundidad, que su capacidad de interacción con CN es mucho más débil que la de LxVPcI. Para ahondar en este punto, incrementamos la concentración de péptidos competidores en las reacciones de unión. Como se muestra en la FIG. 4B, mientras que una concentración de 100 μM de PxIxITcI, PxIxITc2 o LxVPcI bloqueaba eficientemente la interacción de CN con NFATc2, LxVPc2 era incapaz de afectar a la unión a esta concentración, y usando concentraciones tan elevadas como 300 μM sólo producía una inhibición parcial. Por otro lado, tanto péptido control mutLxVPcl como otro péptido que contenia una distribución aleatoria de los aminoácidos del VIVIT
(scrambled) (Ver FIG. IB) fueron incapaces de afectar la unión de CN a NFATc2, incluso a las concentraciones de péptido más elevadas .
Los péptidos que impidieron la interacción CN-NFATc2 fueron también capaces de inhibir la unión de NFATcI a CN (Fig. 4C) . Consistentemente con la capacidad de unión diferencial observada de CN a NFATcI y NFATc2 (FIG. 2), los péptidos, incluso a 200 μM, fueron menos efectivos compitiendo la unión de CN con NFATcI que con NFATc2 (FIG. 4C) . Estos resultados refuerzan aun más la hipótesis de que la afinidad global de NFATcI por CN es mayor que la de NFATc2.
Ejemplo 4.- El péptido LxVPcI es un potente inhibidor de la unión de CN y NFAT.
Experimentos de competición "dosis-dependiente" confirmaron que el péptido LxVPcI es más potente que el LxVPc2 compitiendo la unión de GST-NFATc2 a CN (FIG. 5) . En estos experimentos, la cantidad de CN unida se analizó mediante cuantificación computerizada de ensayos de western blot. El péptido VIVIT, usado como control positivo, fue el competidor más potente (Fig. 5, panel izquierdo) . Una concentración de 50 μM del péptido LxVPcI bloqueó totalmente la unión, mientras que la misma concentración de PxIxITc2 produjo sólo un efecto inhibidor parcial (FIG. 5, panel central y derecho) . Las diferencias entre la capacidad inhibidora de los péptidos LxVPcI y LxVPc2 hicieron ampliar el estudio a los motivos LxVP de los restantes miembros de NFAT. Los péptidos sintéticos correspondientes a las secuencias LxVP de NFATcI, c3 y c4 inhibieron la interacción de GST-NFATcI con CN de un modo similar cuando se usaron a 32 μM (FIG. 6A) ; solo los péptidos LxVPc2 y mutLxVPcl (usado como control negativo) no fueron capaces de alterar . la unión NFAT-CN a esa concentración. En experimentos paralelos, usamos los péptidos basados en las secuencias PxIxIT de todos los miembros de NFAT como competidores . Como se muestra en la FIG. 6B, una dosis de 100 μM de todos los péptidos PxIxIT (tres veces mayor que la concentración usada para los péptidos LxVP) fue capaz de bloquear la interacción de CN con NFATcI o NFATc2, mientras que el péptido control SCRAMBLED no fue capaz de hacerlo. De todos los péptidos correspondientes a las dos secuencias de anclaje de los diferentes NFAT, sólo el LxVPc2 no compitió eficientemente la interacción in vitro de CN con NFATcI o NFATc2; los demás péptidos LxVP se han demostrado mejores competidores que los péptidos PxIxIT.
Ejemplo 5.- Competición cruzada entre las diferentes secuencias de unión a CN de los NFATs . La capacidad que poseía el péptido LxVPcI para competir la unión de CN a NFATc2 (FIG. 4, 5 y 6) resultaba sorprendente. Para profundizar en este hecho, se realizaron nuevos experimentos de competición, esta vez para analizar la capacidad de los péptidos para competir la unión de CN a unas proteínas de fusión de GST-péptido. El péptido LxVPcI compitió la unión de CN a GST-PxIxITc2, asi como los péptidos PxIxITc2 y VIVIT (péptido derivado de la secuencia PxIxIT) compitieron la unión de CN a GST-LxVPcI (FIG. 7) . Dada la falta de similitudes claras entre estos dos motivos de NFAT, el resultado sugiere que las secuencias de CN que interaccionan con los motivos PxIxIT y LxVP de NFAT deben ser interdependientes de algún modo. Ejemplo 6.- La expresión in vivo del péptido LxVPcI bloquea la activación de NFATc2.
Para analizar si los péptidos derivados de los sitios de unión de CN a NFATcI tenian la capacidad de regular NFATc2 en células vivas, se co-transfectó un vector de expresión de NFATc2 wild type junto con otro que codificaba para las proteinas de fusión GFP-LxVP o GFP-PxIxIT de
NFATcI y NFATc2. Se usó la linea celular HeLa porque carece de expresión endógena de NFAT. Como control positivo y negativo se usaron las proteinas de- fusión GFP-VIVIT o GFT- mutLxVPcl, respectivamente.
El análisis mediante western blot de extractos celulares totales mostró que la expresión de GFP-LxVPcI bloqueaba la desfosforilación de NFATc2 inducida mediante incremento del calcio intracelular (FIG. 8A) , por el contrario, la expresión de GFP, GFP-LxVPc2 o GFP-mutLxVPcl no tenia ningún efecto. Sin embargo, y en aparente discrepancia con datos previamente publicados (15) , no se detectó ningún efecto significativo sobre la desfosforilación de NFATc2 cuando se expresaron las construcciones GFP-PXIXITS (datos no mostrados) . Dado que la causa de esta discrepancia podría ser la presencia de
NFATG2 en células GFP negativas, se analizó mediante inmunofluorescencia el efecto directo de las construcciones GFP-péptidos en la translocación nuclear de NFATc2. El análisis de inmunofluorescencias control de células no estimuladas demostró que NFATc2 se encontraba en el citoplasma de las células transfectadas con las diferentes construcciones GFP (dato no mostrado) . En la mayoría de las células transfectadas con la construcción GFP-péptido control, NFATc2 se localizaba en el núcleo tras la activación con ionóforo de calcio, mostrando sólo un 9% de células tinción citosólica de NFATc2 (FIG. 8B) . Al igual que con la desfosforilación de NFATc2, el mayor efecto inhibidor sobre la translocación nuclear de NFATc2 se lograba con la expresión de GFP-VIVIT y GFP-LxVPcI: 92% y 77% de células con tinción citosólica de NFATc2 , respectivamente. Además, se observó que la expresión de GFP-PxIxITc2 o GFP-PXIXITCI inhibía parcialmente la translocación nuclear de NFATc2 : Entre el 33% y el 39% de células GFP positivas mostraban localización citosólica de NFATc2 tras la activación (Fig. 7B) , dato concordante con los publicados por Aramburu et al. (15) . Estos resultados también estaban de acuerdo con los estudios de unión in vitro, e indicaban claramente que el péptido LxVPcI mantenía su capacidad para interaccionar fuertemente con CN e inhibir su interacción con NFATc2 in vivo, evitando la desfosforilación y translocación nuclear de NFATc2.
Ejemplo 7.- El péptido LxVPcI es un inhibidor de la actividad fosfatasa de la CN sobre uno de sus sustratos fisiológicos , el péptido RII .
Los resultados observados en la Fig. 6C muestran que LxVPcI es más efectivo como inhibidor de la interacción
NFAT/CN en presencia de CaM. En estas condiciones el dominio de autoinhibición de CN se encontrarla fuera del centro activo. Por lo tanto, se planteó la pregunta de si el péptido LxVPcI podría tener una influencia sobre la actividad fosfatasa de CN. Para analizar esto, se midió la actividad fosfatasa de la calcineurina in vitro en presencia de distintos péptidos . De acuerdo a resultados previos (15) , se encontró que el péptido PxIxIT fracasaba en la inhibición de la actividad fosfatasa (Figura 9) . Sin embargo, y de forma marcada, la adición del péptido LxVPcI
(pero no su versión mutada) bloqueaba severamente in vitro la actividad fosfatasa de CN sobre su sustrato fisiológico: el péptido fosforilado de la subunidad reguladora II de la proteina quinasa dependiente de cAMP (péptido RII) . Este nuevo hallazgo sugiere que el péptido LxVPcI podría unirse cerca del centro activo de CN o que la interacción de LxVPcI con CN podría afectar a la conformación activa de CN.
Ejemplo 8. - El péptido LxVPcI es un activador de la actividad fosfatasa de la CN sobre pNPP (para- nitrofenilfosfato) .
Al igual que sucede con las drogas inmunosupresoras CsA y FK506, el péptido LxVPcI bloquea la actividad fosfatasa de CN sobre el péptido RII (Fig.9) (24). Debido a esta similitud en su acción, se planteó la pregunta de si el péptido LxVPcI se comportarla de forma similar a las drogas cuando se analizaba su efecto sobre la actividad fosfatasa de CN utilizando como sustrato el pNPP. Esta molécula de pequeño tamaño se une directamente a su sitio activo de CN. Para los complejos inmunosupresores CsA/CyPA y FK506/FKBP12 se ha descrito que su presencia incrementa la actividad fosfatasa de la enzima sobre el pNPP (36,24) . Este efecto contrapuesto de los complejos drogas/inmunofilinas sobre la actividad CN sobre pNPP que sugería que las drogas inhibían la actividad fosfatasa de forma no competitiva, sin afectar al centro activo, fue posteriormente demostrado mediante un exhaustivo análisis enzimático (37). Como se muestra en la Fig.10 la adición del péptido LxVPcI también tiene un efecto activador sobre la desfosforilación de pNPP mediada por CN. En la tabla I se indica tanto la activación de CN mediada por cantidades crecientes del péptido LxVPcI como el incremento de la actividad fosfatasa inducido por el complejo CsA/CyPA . En la tabla I se compara el efecto ejercido por el péptido LxVPcI al obtenido en presencia del complejo CsA/CypA, que está descrito que aumenta la desfosforilación de pNPP por parte de CN. Como controles negativos se han empleado el péptido LxVPcI mutado, CsA y ciclofilina A por separado.
Tabla I.- Efecto sobre la actividad fosfatasa de CN sobre pNPP en presencia de diferentes péptidos.
Tabla I. péptido % actividad CN none 100.Ot 0.0
0.1 mM LxVP 168.0 * 9.6
1.0 mMLxVP 172.7+18.6
1.0 mMLxVPmut 94.3*3,5
0.01 mM CsA 106,3 í 7.5
0.01 mM CypA 103.3 f 7.1
0.01 mM CsA+ CypA 197.3 ±18.0
Ejemplo 9.- El péptido LxVPcI requiere la estructura dimérica (CnA+CnB) para unirse a la fosfatasa CN. El análisis cristalográfico de los complejos CsA/CyPA y FK506/FKBP12 unidos a la CN reveló que los complejos inmunosupresores interaccionan con aminoácidos de ambas subunidades del heterodimero CN, la subunidad catalítica
(CnA) y la subunidad reguladora (CnB) (38). Para analizar los requerimientos de estructura de la interacción del péptido LxVPcI con CN se realizaron ensayos de unión in vitro. Para ello se expresaron en bacterias distintas proteinas truncadas de CnA (Fig. 11) asi como de la subunidad CnB, que posteriormente se purificaron y emplearon en estos ensayos. Se comparó la CnA unida al péptido LxVPcI fusionado a la proteina GST (GST-LxVPcI) en presencia o ausencia de la CnB. La proteina CnA 347 que no presenta el dominio de unión a CnB fue incapaz de unirse a
GST-LxVPcI (Fig.11). Sin embargo, la proteina CnA 389, que mantiene el dominio de unión a CnB, interacciona de forma especifica con GST-LxVPcI únicamente cuando se añade la subunidad CnB en el ensayo. Estos resultados claramente demuestran que la interacción del péptido LxVPcI con la fosfatasa requiere la estructura heterodimérica de CN, formada por las subunidades CnA y CnB.
Ejemplo 10.- El péptido LxVPcI bloquea la interacción entre CN y las drogas inmunosupresoras .
Como se ha visto previamente el péptido LxVPcI presenta un comportamiento con respecto a su acción sobre CN similar al descrito para los complejos CsA/ CyPA y FK506/FKBP12. Para confirmar estos datos se quiso averiguar si el péptido LxVPcI era capaz de desplazar la interacción in vitro de CN con los complejos droga/inmunofilina. En presencia de concentraciones crecientes del péptido LxVPcI, y no de su versión mutada (mutLxVPcl) , la cantidad de CN que interacciona con las drogas unidas a GST-CyPA o GST- FKBP12 disminuye progresivamente (Fig. 12) . Estos resultados indicaron que el péptido LxVPcI compite con los complejos droga/inmunofilina por su interacción con CN.
Materiales y métodos
Construcciones génicas
Las construcciones GST-NFATcI que expresa la región reguladora de NFATcI (1-418 aa) fusionada a la proteina glutathíone S-transferase (GST) fue generosamente suministrada por la Dra. A. Rao (12) . La construcción GST- NFATc2 se generó mediante subclonaje en fase a partir de un cDNA que codificaba la secuencia desde el aminoácido 4 hasta el 385 de NFATc2 en un vector pGEX4T3 (Amersham Biosciences) digerido con BamHl-Smal:
Las vectores de expresión GST-péptido y GFP-péptido se generaron mediante clonaje en fase en el vector digerido pGEX (Amersham Biosciences) o pEGFP-C (Clontech) de oligonucleótidos anillados con extremos protuberantes que codificaban las diferentes secuencias peptidicas .
El plásmido de expresión pEF-BOS HA-NFATc2 se ha descrito previamente (39) , y codifica la proteina NFATc2 completa fusionada al epitopo HA {influenza virus hemagglutinin) en su extremo NH2-terminal.
La construcción que expresa CN (CnA en tándem con CnB) fusionada a GST, para su posterior purificación y empleo en los ensayos de actividad enzimática frente a pNPP, se generó a partir- de un plásmido previo ya descrito (40)- que expresa CN fusionada a un epitopo de 6 histidinas.
Las construcciones que expresan las inmunofilinas fusionadas a GST se crearon a partir de construcciones descritas (FKBP12 humana: 41; Ciclofilina A: 42) . Las construcciones que expresan CnA y CnB fusionadas por separado a GST se generaron utilizando productos de PCR amplificados a partir de ARN total de células eucariotas. Las diferentes deleciones de CnA se crearon mutando el secuencia de ADN que codifica para el aminoácido de la posición indicada a un codón de terminación mediante mutagénesis dirigida empleando λQuikchange mutagenesis kit' de Stratagene siguiendo las indicaciones del fabricante.
Transfección y análisis mediante Western Blot de extractos celulares .
Las células HeLa se cultivaron en medio Dulbecco modificado por Eagle (DMEM) (Gibco) completado con suero fetal bovino (FBS) (Sigma) al 10%. El dia anterior a la transfección, las células se sembraron en placas de 6 pocilios para que alcanzasen una confluencia del 80% en el momento de la transfección. Las células se transfectaron con 18 ng de pEF-BOS HA-NFATc2 mas 1,1 μg de los plásmidos GFP-péptido con 4 μl de reactivo Plus más 6 μl de reactivo Lipofectamina (Invitrogen) durante 3 horas en 1 mi de medio OPTIMEM (Gibco) . Mediante citometría de flujo se cuantificó la eficiencia de tran'sfección como el porcentaje de células que expresaban GFP. Se obtuvieron eficiencias de transfección similares para las diferentes construcciones y en experimentos independientes .
Veinticuatro horas después de la transfección, el medio de cultivo de las HeLa se reemplazó por DMEM+1%FBS.
Tras dos horas más, las células se estimularon durante 1 hora usando 20 ng/ml de PMA {phorbol 12 myristrate 13 acetato) (Sigma) más 1 μM de ionóforo de calcio A23187
(Sigma) y 3 mM de CaCl2. A continuación las células se lavaron usando un tampón fosfato salino frió (PBS) y se obtuvieron los extractos celulares usando un tampón de rotura [20 mM Hepes pH 7,6 con 0,4 M de NaCl, 1 mM EDTA, 3 mM EGTA, 1 μM DTT (dithiothreitol) , 1 mM PMSF
(phenylmethylsulfonyl fluoride) , 100 μM benzamidina, 1 μg/ml de pepstatina, 1 μg/ml de aprotinina y 1% de Tritón
X-100] . Las proteínas celulares se extrajeron durante 15' usando una noria y posteriormente se centrifugaron a 14000xg durante 15' . Todos los pasos anteriores se realizaron a 40C. Tras la centrifugación, se añadió tampón
Laemmli a los sobrenadantes obtenidos. Los extractos celulares totales se hirvieron durante 10' y se cargaron en geles de poliacrilamida con SDS (sodium dodecyl sulphate) (6% para NFAT y 10% para CN activa o GFP) . Las proteínas se separaron mediante electroforesis en condiciones reductoras . Los geles de proteínas se transfirieron a membranas de nitrocelulosa y se incubaron durante Ih a temperatura ambiente con una solución de bloqueo [10% (peso/volumen) de leche desnatada en PBS] . Tras algunos lavados con PBS-T (0,1% de Tween-20 en PBS), las membranas se incubaron durante 2 horas con la solución de anticuerpo primario respectiva: anti-HA monoclonal de ratón 12CA5
[0,05% (vol/vol) ] en PBS-T con 1% de albúmina sérica bovina (BSA) para detectar NFATc2; o el anti-GFP policlonal de conejo suministrado por el Dr. I. Crespo [0,1% (vol/vol) ] en PBS-T con 5% de leche desnatada. Posteriormente se lavaron las membranas tres veces durante 5' cada vez con PBS-T, y se incubaron durante 1 hora con los anticuerpos hechos en cabra anti-IgG de ratón (Pierce) o anti-IgG de conejo (Pierce) conjugados con peroxidasa. Tras tres lavados con PBS-T y uno adicional con H2O, el anticuerpo unido a las membranas se detectó mediante el sistema ECL (Amersham Biosciences) .
Inmunofluorescencias
Las células HeLa se transfectaron como se describe en el apartado anterior usando 1,2 μg de los plásmidos de expresión GFP-péptido junto con 40 ng de pEF-BOS HA-NFATc2. Dos horas antes de la estimulación, se reemplazó el medio de cultivo por DMEM+1%FBS. Tras estimular durante 30' con ionóforo de calcio A23187 (1 μM) y CaCl2 (3mM) , las células se fijaron a temperatura ambiente durante 10' con una solución al 10% de formaldehido en PBS conteniendo un 4% de sacarosa. Posteriormente se lavaron tres veces con PBS y se permeabilizaron a temperatura ambiente durante 10' con una solución de PBS con 0,25% de Tritón X-IOO. A continuación se incubaron las células durante 20' con un tampón de bloqueo (10% BSA en PBS) y posteriormente con una solución 1:500 del anticuerpo 12CA5 (anti-HA) durante 1 hora. La localización subcelular de los NFATs se detectó usando un microscopio de fluorescencia (Axiovert-200, Zeiss) utilizando un anti-IgG de ratón conjugado con el fluorocromo Alexa 594 (Molecular Probes) como anticuerpo secundario. Se calculó el porcentaje de células con una distribución citosólica o nuclear de NFAT usando no menos de 130 células positivas por transfección. Ensayos de unión in vitro de CN-NFAT.
Las proteínas de fusión de GST se expresaron en la cepa deficiente de proteasas de E.coli BL21(DE3). Se purificaron usando el reactivo glutathione (GSH) -Sepharose B beads (Amersham Biosciences) . La unión de CN a estas proteínas de fusión de GST se usó para realizar ensayos de pull-down, que se realizaron como se explica a continuación. Se empleó una cantidad variable de las bolas que contenían las proteínas de fusión de GST fusionadas a los dominios reguladores de NFAT (1-2 μg) o a los péptidos (10-30 μg) . Éstas se lavaron dos veces con el tampón de unión (20 mM Tris pH 8, 100 mM NaCl, 1,5 mM CaCl2, 6 mM MgCl2, 1 mM PMSF, 1 μM DTT, 1 μg/ml de aprotinina, 1 μg/ml de pepstatina, 100 μM de benzamidina y 0,2% de Tritón X- 100) y posteriormente se incubaron durante 30' en una noria a 4°C con una solución de 20 nM de Calcineurina (Sigma) más 600 nM de Calmodulina (Sigma) en tampón de unión con o sin el péptido correspondiente. A continuación se centrifugaron brevemente las muestras a 4°C. Se añadió tampón Laemmli a los sobrenadantes (fracción no unida) y se guardaron para su posterior análisis. Las bolas se lavaron cinco veces con tampón de unión frío y recién preparado y se añadió tampón Laemmli; las muestras se hirvieron para separar las proteínas unidas (fracción unida) . Las fracciones unida y no unida se cargaron en geles al 10% de SDS-poliacrilamida y se separaron mediante electroforesis en condiciones reductoras . La Calcineurina se detectó mediante western blot usando un anticuerpo monoclonal de ratón anti-CnA (clon G182-1847, PharMingen) . Donde se indica, la cantidad de CN unida a las proteínas de fusión de GST se cuantificó mediante densitometría usando el programa Quantity One (BIO-RAD) .
En los ensayos de la FIG.12, previo a la adición de CN y CaM, las inmunofilinas fusionadas a GST se incubaron con su correspondiente droga inmunosupresora, CsA o FK506 (LC Laboratories) . Con respecto a los experimentos de la FIG.11, se emplearon CnA y CnB fusionadas a GST (ver apartado "construcciones génicas") , purificadas a partir de bacterias y posteriormente digeridas con una proteasa comercial (PreScission protease, Amersham) para eliminar la porción GST. En estos ensayos la subunidad CnA se detectó mediante western blot usando el anticuerpo policlonal de conejo anti-CnA (Chemicon, cuyo epitopo se encuentra en la • región N-terminal de CnA) . Para la detección de la subunidad CnB se utilizó un anticuerpo monoclonal comercial (Upstate) .
Los péptidos se sintetizaron en el Servicio de Proteomica del Centro de Biología Molecular "Severo Ochoa" CSIC-UAM.
Ensayo de actividad fostatasa de CN sobre el sustrato RII.
El efecto de los péptidos indicados (Ejemplo 7, Figura 9) en la actividad enzimática de CN sobre el péptido RII se analizó empleando el Kit de ensayo "Biomol green calcineurin" de Biomol de acuerdo a las instrucciones del fabricante. La combinación de CsA (Sandoz) más ciclofilina
(CyP) (Sigma) se empleó para inhibir in vitro la actividad de Calcineurina.
Ensayo de actividad fostatasa de CN sobre pNPP (para- nitrofenilfosfato) .
El efecto del péptido (Ejemplo 8, Figura 10 y tabla I) en la actividad enzimática de CN sobre el pNPP se realizó según el protocolo descrito (43) utilizando 30 nM de CN humana, expresada en bacterias y posteriormente purificada, incubando con 60 mM de pNPP durante 30 minutos a 30°C en presencia de cantidades crecientes del péptido LxVPcI . En paralelo se utilizaron tanto el péptido LxVPcI mutado, CsA ó ciclofilina A (controles negativos) como la combinación ciclofilina A más CsA (control positivo) . La cantidad de producto de la reacción enzimática a pH básico (para- nitrofenolato=PNP) se midió por absorbancia a 405 nm, convirtiendo este valor numérico en concentración mediante la interpolación a partir de una recta patrón de PNP.
En esta solicitud, sobre todo en las figuras, los aminoácidos se abrevian utilizando los códigos de una letra aceptados en el campo, en la forma que se muestra a continuación:
A = Ala = Alanina
C = Cys = Cisteina
D = Asp = Acido aspártico
E = GIu = Acido glutámico
F = Phe = Fenilalanina
GIy = Glicina
H = His = Histina
I = He = Isoleucina
K = Lys = Lisina
L = Leu = Leucina
M = Met = Metionina
N = Asn = Asparagina
P = Pro = Prolina
Q = GIn = Glutamina
R = Arg = Arginina
S = Ser = Serina
T = Thr = Treonina
V = Val = Valina
W Trp = Triptófano
Y = Tyr = Tirosina Bibliografía
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Claims

REIVINDICACIONES
1. Secuencia de aminoácidos, para inhibir selectivamente la ruta de señalización de la Calcineurina (CN) sobre los factores de transcripción NFAT (CN-NFAT) , caracterizada porque comprende la secuencia de aminoácidos
Ri-L-R2-V-P-R3,
donde R1 es un aminoácido aromático del tipo Tirosina o Fenilalanina; R2 es un aminoácido del tipo Alanina o Serina y R3 no es el aminoácido Prolina.
2. Secuencia de aminoácidos según la reivindicación 1 caracterizada porque dichos factores de transcripción son, al menos, NFATcI y NFATc2.
3.- Secuencia de aminoácidos según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, caracterizada porque está constituida por una secuencia de aminoácidos perteneciente al siguiente grupo: a) secuencia de aminoácidos SEQ ID NO 18, b) secuencia de aminoácidos análoga a la secuencia de a) , y c) secuencia de aminoácidos que comprende una secuencia cualquiera perteneciente a (a) o (b) .
4.- Secuencia de aminoácidos según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, caracterizada porque está constituida por una secuencia de aminoácidos perteneciente al siguiente grupo: a) secuencia de aminoácidos SEQ ID NO 21, b) secuencia de aminoácidos análoga a la secuencia de a) , y c) secuencia de aminoácidos que comprende una secuencia cualquiera perteneciente a (a) o (b) .
5.- Secuencia de aminoácidos según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, caracterizada porque está constituida por una secuencia de aminoácidos perteneciente al siguiente grupo: a) secuencia de aminoácidos SEQ ID NO 22, b) secuencia de aminoácidos análoga a la secuencia de a), y c) secuencia de aá que comprende una secuencia cualquiera perteneciente a (a) o (b) .
6.- Secuencia de nucleótidos capaz de codificar una secuencia de aminoácidos según cualquiera de las reivindicaciones 1 a la 5.
7.- Secuencia de nucleótidos según la reivindicación 6, donde dicha secuencia está seleccionada de uno de los siguientes grupos: a) secuencia de nucleótidos SEQ ID NO 5 y/o su secuencia de nucleótidos complementaria SEQ ID NO 6, b) secuencia de nucleótidos que codifica para la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO 21, c) secuencia de nucleótidos que codifica para la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO 22, d) secuencia de nucleótidos análoga a la secuencia (a) , o (b) o (C), e) secuencia de nucleótidos que comprende una secuencia cualquiera perteneciente de (a) , (b) , (c) y (d) .
8.- Secuencia de nucleótidos según la reivindicación 7, donde dicha secuencia es la SEQ ID NO 5 y/o la SEQ ID NO 6.
9.- Construcción genética caracterizada porque comprende una secuencia de nucleótidos según cualquiera de las reivindicaciones 6 a la 8.
10.- Construcción genética según la reivindicación 9 caracterizada porque además comprende una secuencia de nucleótidos codificante de un péptido o secuencia peptidica que permita el aislamiento o la detección del péptido expresado.
11.- Vector de expresión génica que comprenda una secuencia de nucleótidos según cualquiera de las reivindicaciones 6 a la 8 o la construcción génica según las reivindicaciones 9 y 10.
12.- Vector de expresión génica según la reivindicación 11, donde dicho vector es un plásmido.
13.- Célula transformada que contiene una secuencia de nucleótidos según cualquiera de las reivindicaciones 6 a la 8, la construcción génica según las reivindicaciones 9 y 10 o el vector de expresión según cualquiera de las reivindicaciones 11 y 12.
14.- Procedimiento de identificación de nuevos compuestos farmacéuticos capaces de inhibir la acción biológica de la Calcineurina sobre los factores de transcripción NFATcI y NFATc2, que comprende el uso de un péptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a la 5, una secuencia de nucleótidos .según cualquiera de las reivindicaciones 6 a la 8, la construcción génica según las reivindicaciones 9 y 10, el vector de expresión según cualquiera de las reivindicaciones 11 y 12 o la célula transformada según la reivindicación 13.
15.- Procedimiento de identificación de nuevos compuestos según la reivindicación 14, donde dichos compuestos son antagonistas selectivos de la actividad biológica de Calcineurina A.
16.- Procedimiento de identificación de nuevos compuestos según la reivindicación 14, donde dicho procedimiento es un ensayo in vitro de interacción o unión de proteínas.
17.- Procedimiento de identificación de nuevos compuestos según la reivindicación 14, donde dicho procedimiento es un ensayo in vivo de interacción o unión de proteínas.
18.- Uso de un elemento o mezcla de elementos según las reivindicaciones 1 a la 13 en la elaboración de un medicamento para el tratamiento o profilaxis de enfermedades que cursen con activación de la Calcineurina.
19.- Composición farmacéutica útil para el tratamiento de enfermedades caracterizada porque comprende un elemento o mezcla de elementos según las reivindicaciones 1 a la 13, junto con, opcionalmente, uno o más adyuvantes y/o vehículos farmacéuticamente aceptables .
20.- Composición farmacéutica según la reivindicación 19, donde dicho elemento es una secuencia de aminoácidos según cualquiera de las reivindicaciones 1 a la 5.
21.- Composición farmacéutica según la reivindicación 19, donde dicho elemento es una secuencia de nucleótidos según cualquiera de las reivindicaciones 6 a la 8.
22.- Composición farmacéutica según la reivindicación 19, donde dicho elemento es una construcción genética según cualquiera de las reivindicaciones 9 ó 10.
23.- Composición farmacéutica según la reivindicación 19, donde dicho elemento es un vector de expresión según cualquiera de las reivindicaciones 11 ó 12.
24.- Composición farmacéutica según la reivindicación 19, donde dicho elemento es una célula transformada según la reivindicación 13.
25.- Uso de la composición farmacéutica según las reivindicaciones 19 a 24 para el tratamiento o profilaxis de enfermedades que cursen con activación de la Calcineurina .
26.- Uso de la composición farmacéutica según las reivindicaciones 19 a la 24, para el tratamiento de enfermedades que cursan con activación de linfocitos T y pertenecen al siguiente grupo: enfermedades autoinmunes, inflamación, alergia o situaciones de rechazo a transplantes .
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