WO2007073704A1 - Uso tópico del factor de crecimiento epidermico en liposomas para prevenir la amputacion del pie diabético - Google Patents

Uso tópico del factor de crecimiento epidermico en liposomas para prevenir la amputacion del pie diabético Download PDF

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WO2007073704A1
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growth factor
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epidermal growth
lesions
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Rolando PÁEZ MEIRELES
Jorge Amador Berlanga Acosta
Blas Yamir Betancourt Rodriguez
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Centro De Ingeniería Genética Y Biotecnología
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Definitions

  • the present invention relates to topical formulations containing Epidermal Growth Factor encapsulated or associated with deformable or conventional liposomes to be applied on the surface and around chronic ischemic skin lesions, to prevent amputation of the diabetic foot.
  • Diabetes Mellitus and its complications are the main non-traumatic cause of amputations of the lower limbs.
  • This is a medical problem of increasing importance, since the incidence and prevalence of diabetes must grow in light of the aging populations and the increasingly sedentary lifestyle. In the course of their lives at least 15% of diabetics develop chronic foot ulcers, and of these it is estimated that 20% require limb amputation (Reiber GE, Boyko EJ, Smith DG (1995) Lower extremity foot ulcers and amputations in diabetes In: Harris MI, Cowie CC, Reiber G., Boyko E., Stern M., Bennett P., editors Diabetis in America, Washington, DC: US Government Pr ⁇ nting Office, 409-28; Moss SE, Klein R, Klein BE (1992) The prevalence and incidence of lower extremity amputation in a diabetic population. Arch lnt Med. 152: 610-6).
  • Adjuvant measures have also been used, such as hemorrhage therapy and vasoactive therapy, which have provided some favorable effect both in the chronicity phase and in exacerbations but that have not been generalized for the treatment of diabetic foot.
  • Hemorrhagic therapy is based on the prevalence shown in the diabetic patient of hemorrhageal alterations and their role in enhancing the infection.
  • vasoactive therapy has been used in local perfusion alterations, both due to macro- and micro-angiopathy, in which certain prostanoids act at the tissue level.
  • Another invention for the treatment of extensive acute skin lesions, such as venous ulcers, has been the creation of equivalent substitutes for human bioartificial skin.
  • the information on ischemic ulcers of the diabetic foot is limited, and it is hardly conceivable that these products can control the underlying ischemic process as a cause of the failure of scarring (New Skin for O ⁇ d. Developments in Biological Skin Substitutes. Arch Dermatol. 1998 134: 344-348).
  • Another alternative has been the application of growth factors.
  • FDA Federal Food and Drug Administration
  • FDA Federal Food and Drug Administration
  • PDGF platelet-derived growth factor
  • Liposomes have been proposed for use in a wide variety of topical applications since they facilitate the absorption of drugs through the skin, reduce the toxic effects associated with drugs and provide a longer release of these.
  • conventional liposomes that are composed of phospholipids and sterols can modulate the penetration of drugs since these vesicles, Although they generally do not penetrate the viable skin, they can accumulate in the stratum corneum and other more superficial layers of the skin (Barry BW (2001) Novel mechanisms and devices to enable successful transdermal drug delivery. Eur J Pharm Sci.
  • the present invention solves the aforementioned problem, through the use of topical formulations containing Epidermal Growth Factor encapsulated or associated with deformable or conventional liposomes, which allow a high bioavailability of the FCE in the deep tissue beneath skin lesions, similar to Ia obtained by infiltration of the FCE with hypodermic needles.
  • topical formulations containing Epidermal Growth Factor encapsulated or associated with deformable or conventional liposomes, which allow a high bioavailability of the FCE in the deep tissue beneath skin lesions, similar to Ia obtained by infiltration of the FCE with hypodermic needles.
  • the application of these topical formulations is carried out on the surface and around chronic ischemic skin lesions and has the advantage that it avoids the pain of the puncture and
  • Another aspect of the present invention relates to the topical pharmaceutical formulation, which contains an effective amount of Epidermal Growth Factor encapsulated or associated with deformable or conventional liposomes, in which the liposome is composed of one or more pharmaceutically acceptable lipids.
  • the FCE applied through the formulations of this invention is efficiently transported to the viable tissue under the lesions and is effectively protected against protease-mediated degradation, which are present at high levels in these diabetic foot injuries.
  • the effective amount of Epidermal Growth Factor is between 0.025 and 0.075 mg / gram of substance.
  • the formulations irreversibly allow the healing of chronic skin lesions, preventing the practice of amputations when there is no other alternative for the ischemic limb.
  • the liposome of the topical pharmaceutical formulation is composed of one or more pharmaceutically acceptable lipids selected from the group consisting of a neutral lipid, a negative charge lipid, a positive charge lipid, a polyethylene glycol conjugate lipid or a lipid conjugated to a carbohydrate.
  • Liposomes may also be composed of one or more pharmaceutically acceptable lipids and one or more non-ionic, zwitterionic, anionic or cationic surfactants.
  • Example 1 Obtaining of conventional liposomes loaded with FCE.
  • Phosphatidylcholine at a concentration of 10 mg / mL, was dissolved in absolute ethanol in a 50 mL round bottom balloon.
  • the lipid was dried by rotary evaporation at room temperature until a dry layer formed on the walls of the container.
  • To encapsulate the FCE in liposomes the dried lipid layer was hydrated by homogenization with a buffered solution containing FCE.
  • the preparation of liposomes loaded with FCE was subjected to several extrusion passes through a polyethylene carbonate membrane with pores of 100 nm in average diameter until the average size of the liposomes was around 100 nm .
  • the suspension was centrifuged at 100,000 xg for 40 min at 4 0 C. The supernatant was transferred to a clean tube and the precipitate was resuspended with a phosphate buffered saline solution. pH 7.2. The centrifugation was repeated once more under the same conditions and the supernatant was transferred to a clean tube and mixed with the supernatant of the first centrifugation. The precipitate (liposomes loaded with FCE) was resuspended in a phosphate buffered saline solution at pH 7.2. This final preparation was stored at 4 0 C until use.
  • a total of 85.8 mg of phosphatidylcholine and 11.7 mg of sodium deoxycholate were dissolved in 100 ⁇ l_ of lukewarm absolute ethanol, then they were diluted in 900 ⁇ l_ of phosphate buffer, and swirled until a homogeneous suspension of milky appearance
  • This liposome preparation was subjected to several extrusion passes through a polycarbonate membrane with pores of an average diameter of 100 nm until the average size of the liposomes was around 100 nm.
  • Example 2 Determination of the efficiency of incorporation of the FCE into the liposomes.
  • the preparations were centrifuged at high speed and the protein content in the precipitate (liposomes with incorporated FCE) and in the supernatant (free FCE) obtained was determined.
  • the liposome suspension was centrifuged at 100,000 xg for 40 min. at 4 0 C.
  • the supernatant was transferred to a clean tube and the precipitate was resuspended with a phosphate buffered saline solution at pH 7.2.
  • the centrifugation was repeated under the same conditions and the supernatant was transferred to a clean tube and mixed with the supernatant of the first centrifugation.
  • the precipitate was resuspended in 500 ⁇ L of a phosphate buffered saline solution at pH 7.2. Then, the protein present in the supernatant or the precipitate was extracted by adding 0.5% Triton X-100 to the samples and the protein content was quantified by correlation with the area under the curve of the absorbance at 226 nm by means of the reverse phase chromatography of high efficiency (RP-HPLC). Incorporation efficiency was calculated as the protein content ratio in the precipitate (liposomes with FCE incorporated) between the total protein content added at the start of the encapsulation process x 100%.
  • Example 3 Determination of the size and morphology of the liposomes.
  • Liposome samples were analyzed by transmission electron microscopy to determine the average size of the liposomes and their morphology.
  • the liposomes were visualized through negative staining with uranyl acetate.
  • the negatively stained samples were observed in a Jeol-JEM 2000EX transmission electron microscope that operated at 80 KV.
  • the micrographs of each liposome preparation were digitized using an image digitizer and the diameter of the liposomes contained in each micrograph was measured using the DIGIPAT version 3.3 program (EICISOFT, Havana, Cuba).
  • the particle size was averaged by the total number of liposomes present and was represented as the mean + the standard deviation of three independent determinations.
  • Both deformable and conventional liposomes loaded with FCE were constituted by a homogeneous population of spherical or ellipsoidal vesicles.
  • the average vesicle size was 130 ⁇ 7 nm and 123 ⁇ 4 nm, for conventional liposomes and deformable liposomes, respectively.
  • Example 4 Preparation of the gel of liposomes loaded with FCE.
  • the deformable or conventional liposomes loaded with FCE were diluted 1.5 times in phosphate buffer pH 7.2 and Carbomer (Carbopol 940) buffered to pH 7.2 was added at a final concentration of 1.25% (w / v).
  • the formulation also contained 0.02% (w / v) butyl hydroxytoluene (BHT), 0.1% (w / v) EDTA, 0.25% (w / v) methyl parahydroxybenzoate, 0.525% (w / v) benzyl alcohol, 0.2% ( w / v) sodium hydroxide and 3% (w / v) glycerol.
  • the suspensions had a viscosity of approximately 840 mPas and 730 mPas, for conventional liposomes and deformable liposomes, respectively.
  • Example 5 Demonstration of the protective effect of the encapsulation of the FCE in liposomes against the enzymatic degradation of the FCE in vitro.
  • This experiment had the objective of evaluating whether the encapsulation of the FCE in liposomes (conventional and deformable) is advantageous to preserve the integrity of the FCE in the proteolytic environment of the diabetic foot tissue.
  • biopsies of the ulcerated tissue of diabetic patients were taken after local anesthesia and they were resuspended with a phosphate buffered saline solution (PBS pH 7.2). A total of 25 ⁇ g of FCE in solution or encapsulated in liposomes was added to the samples and incubated for 20, 40, or 60 min at 37 ° C.
  • PBS pH 7.2 phosphate buffered saline solution
  • Example 6 Efficacy demonstrations of topical formulations containing FCE in experimental animal models of acute and controlled torpid lesions.
  • mice male Wistar rats of body weight between 225-250 grams. The animals were kept in controlled areas of the BIGerio del CIGB and under a stable lighting regime of 12 x 12 hours, cycles of air changes, as well as free access to the diet. Individual rats were housed in T3 boxes with bed replacement every 48 hours after sterilization. Induction of the ulcers: the animals were anesthetized with the combination of ketamine / xylazine intraperitoneally. The mechanical and chemical depilation of the area of the back from the retro-scapular space to the height of the sacrum was performed. The region was aseptized with a solution of iodine-povidone and isopropyl alcohol.
  • the territory of the skin to induce the ulcers was delimited with Chinese ink, to be able to induce total thickness, circular lesions with disposable biomes of 9 mm in diameter (AcuDrem, Fl, USA).
  • 6 symmetrical and equidistant lesions were created in each animal. After created, they were washed with sterile saline solution and their inner edge was delineated with indelible ink to calculate the area of the wound in zero time
  • the lesions of all the animals in each group were sanitized daily with 70% ethanol and sterile saline before applying the treatment if appropriate.
  • Group II-placebo (formulation of deformable liposomes that do not contain FCE) applied topically.
  • Group III- treatment by infiltration of an FCE solution containing 75 micrograms per microliter. The infiltrations were performed on the edges and bottom of the wound.
  • Time 0- represents 100% of the area of open lesion and 0% of contraction
  • Time 1- at 72 hours after induced Time 2- to 5th day of induced
  • Time 3- to 7th day of induced Time 4- to 9th day of induced.
  • This day is taken as the end of the study and for the sacrifice of the animals according to the previous experience of the spontaneous healing kinetics of these lesions.
  • the images of the edges of the lesions were digitized.
  • the area and percentage of contraction were calculated using the DIGIPAT image analysis program.
  • Statistical calculations Each parameter was performed using the SPSS package using the non-parametric Mann Whitney U test, establishing a significance level of p ⁇ 0.05.
  • the animals were sacrificed by an overdose of sodium pentobarbital.
  • Hematoxylin / eosin, van Giesson and trichrome stains were used.
  • the formulations based on liposomes exert the most potent of the contraction effects of the edges of the wounds, which in other words means that it exerts the most favorable effect on the acceleration of the total healing while the contraction represents the convergence. of several consolidated events that approximate the wound to the remodeling phase.
  • Table 4 the percentage of territory occupied by mature and organized granulation tissue of the ulcers in each experimental group can be observed. The calculations were performed on the samples collected in Time 4 quantifying the number of positive microscopic fields coinciding with the reactions of van Giesson and Masson's Trichrome in each sample. The assessments were performed by two pathologists independently and blindly. Table 4. Percentage of granulated territory at time 4 in each experimental group.
  • treatment with liposome-based formulations exerts the most potent of the effects on the process of establishment and maturation of granulation tissue, which corresponds to what is described for the wound contraction process described above.
  • the effect of the treatments was also studied on the process of epithelialization of the lesions.
  • the microscopic aspect of the epithelium was assessed considering the total re-epithelialization of the ulcer, the presence of a stratified epithelium, and the existence of a keratin stratum.
  • the lesions were subjected to a central longitudinal hemisection and included in the same paraffin block.
  • a total of 120 histological sections were studied per group, which essentially represent 60 lesions. The results are expressed in Table 5.
  • Table 5 Effect of treatments on the process of epithelialization of wounds.
  • groups IV, V, Vl and VII with the liposome formulations show the best indicators of epithelial response, given by total re-epithelialization and the maturity of the epithelium.
  • the experiment described below was carried out with the objective of evaluating the healing effect of the new topical pharmaceutical formulations based on deformable or conventional liposomes containing FCE in chronic lesions with a dark prognosis that simulate the lesion of diabetics.
  • Experimental biomodel male Wistar rats of body weight between 225-250 grams. The animals were kept in controlled areas of the BIGerio del CIGB and under a stable lighting regime of 12 x 12 hours, cycles of air changes, as well as free access to the diet. Individual rats were housed in T3 boxes with bed replacement every 48 hours after sterilization.
  • Induction of the ulcers The animals were anesthetized with the combination of ketamine / xylazine intraperitoneally. The mechanical and chemical depilation of the area of the back from the retro-scapular space to the height of the sacrum was performed. The region was aseptized with a solution of iodine-povidone and isopropyl alcohol. The territory of the skin to induce the ulcers was delimited with Chinese ink, to be able to induce total thickness, circular lesions with disposable biomes of 9 mm in diameter (AcuDrem, Fl, USA). 6 symmetrical and equidistant lesions were created in each animal as it was done for the previous study.
  • mice After created, they were washed with sterile saline solution and their inner edge was delineated with indelible ink for the calculation of the area of the wound in zero time. The lesions of all the animals in each group were sanitized daily with 70% ethanol and sterile saline before applying the treatment if appropriate.
  • Experimental groups After the ulcers were created, the animals were randomly assigned by means of a cross order of entry / group table to the following experimental groups: Group I- not treated. Group II-placebo (formulation of deformable liposomes that do not contain FCE) applied topically.
  • Group III- treatment by infiltration of an FCE solution containing 75 micrograms per milliliters. The infiltrations were performed on the edges and bottom of the wound.
  • Group IV- treatment with the formulation of traditional liposomes containing 25 micrograms of FCE per gram of substance.
  • Group VI- treatment with the formulation of deformable liposomes containing 25 micrograms of FCE per gram of substance.
  • Group VII- treatment with the formulation of deformable liposomes containing 75 micrograms of FCE per gram of substance.
  • Ten rats were included for each of the groups, so that 60 wounds were studied per group.
  • the treatments were performed daily, after sedation with diazepam intra-peritoneally of the animals.
  • Time 0- represents 100% of the area of open lesion and 0% of contraction
  • Time 1- at 72 hours of induced
  • Time 2- to 5 t0 day of induced
  • Time 3- to 7 or day of induced
  • Time 4- to 9 no day of induced
  • Time 5 to 12 days of induced and Time 6 to 15 days of created. This day is taken as the end of the study and for the sacrifice of the animals according to the previous experience of the spontaneous healing kinetics of these lesions.
  • the images of the edges of the lesions were digitized. The area and percentage of contraction were calculated using the DIGIPAT image analysis program.
  • the formulations based on liposomes exert the most potent of the contraction effects of the edges of the wounds, which in other words means that it exerts the most favorable effect on the acceleration of the total healing while the contraction represents the convergence. of several consolidated events that approximate the wound to the remodeling phase. Note that these wounds simulate the biochemical micro-environment of the diabetic wound in which the contraction mechanism is partially or totally abolished pathologically.
  • the effect of the treatments was also studied on the process of epithelialization of the lesions.
  • the microscopic aspect of the epithelium was assessed considering the total re-epithelialization of the ulcer, the presence of a stratified epithelium, and the existence of a keratin stratum.
  • the lesions were subjected to a central longitudinal hemisection and included in the same paraffin block.
  • a total of 120 histological sections were studied per group, which essentially represent 60 lesions. There was no need to eliminate any of the bacterial contamination lesions.
  • the results are expressed in Table 8. As can be seen, groups IV, V, Vl and VII with the liposome formulations show the best indicators of epithelial response, given by the total re-epithelialization and the maturity of the epithelium.
  • treatment with liposomes favors (/) the process of contraction of chronic wounds that faithfully simulate the biochemical environment of the diabetic patient ulcers; (/ ' /) the granulation process and its maturation. Notoriously, the treatment allows the establishment of a neo-formed vascular network and (///) moderately stimulates the process of re-epithelialization and differentiation of the epidermis in lesions that are usually resistant to re-epithelialization.
  • Example 7 Demonstration of efficacy of topical formulations containing FCE encapsulated in liposomes in patients with advanced diabetic foot ulcers.
  • the compassionate administration of conventional or deformable liposome formulations containing 25 or 75 micrograms of FCE per gram of substance in patients with diabetic foot ulcers have shown similar results to those obtained with the injectable formulation but with the advantage of avoiding the inconveniences of the injections.
  • the new formulation of deformable liposomes containing 75 micrograms of FCE per gram of substance was applied in a patient with diabetic foot ulcer, evidence of compromised blood flow and risk of major amputation. The product was administered topically after performing complete debridement of the ulcer.
  • the lesion was covered between clergy posts with a dressing and sterile bandage A satisfactory evolution was observed, being evident from the first week of treatment the appearance of a useful granulation tissue and contraction of the edges of the ulcer.
  • the product was effective to achieve complete epithelialization of the lesion and prevent amputation. No adverse reactions were identified during treatment.
  • the product was also administered topically after complete debridement of the ulcer.
  • the lesion was covered between the clergys with a sterile dressing and dressing. From the fourth administration of the product (applied 3 times a week), a substantial change in the appearance of the lesion was observed, in which a bleeding, productive granulation tissue began to prevail, which after a few days was covered by epithelium.
  • the patient was discharged from hospital and has evolved without relapse.

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Abstract

La presente invención está relacionada con el uso de formulaciones tópicas que contienen Factor de Crecimiento Epidérmico encapsulado o asociado a liposomas deformables o convencionales para ser aplicadas en la superficie y alrededor de lesiones cutáneas isquémicas crónicas. Las formulaciones de la presente invención, en contraste al estado de la técnica anterior, son útiles porque permiten una alta biodisponibilidad del Factor de Crecimiento Epidérmico en el tejido profundo debajo de la lesión y para prevenir la amputación del pie diabético.

Description

USE OF A TOPICAL COMPOSITION CONTAINING EPIDERMAL GROWTH FACTOR (EGF) FOR DIABETIC FOOT AMPUTATION PREVENTION
Campo de Ia técnica La presente invención se relaciona con formulaciones tópicas que contienen Factor de Crecimiento Epidérmico encapsulado o asociado a liposomas deformables o convencionales para ser aplicadas en Ia superficie y alrededor de lesiones cutáneas isquémicas crónicas, para prevenir Ia amputación del pie diabético.
Estado de Ia técnica anterior
La Diabetes Mellitus y sus complicaciones son Ia principal causa no traumática de las amputaciones de los miembros inferiores. Este es un problema médico de importancia cada vez mayor, ya que Ia incidencia y Ia prevalencia de Ia diabetes deben crecer a Ia luz del envejecimiento de las poblaciones y el estilo de vida cada vez más sedentario. En el transcurso de sus vidas al menos el 15% de los diabéticos desarrolla úlceras crónicas en los pies, y de éstos se estima que el 20% requiere Ia amputación del miembro (Reiber G. E., Boyko E. J., Smith D. G. (1995) Lower extremity foot ulcers and amputations in diabetes. In: Harris M. I., Cowie CC, Reiber G., Boyko E., Stern M., Bennett P., editors. Diabetis in America, Washington, DC: US Government Prínting Office, 409-28; Moss S.E., Klein R, Klein B.E. (1992) The prevalence and incidence of lower extremity amputation in a diabetic population. Arch lnt Med. 152:610-6).
Se han utilizado diversos métodos para el tratamiento del paciente con pie diabético que incluyen el control metabólico estricto, profilaxis de los factores de riesgo modificables, debridamiento, empleo de apositos, tratamiento antimicrobiano de las infecciones, eliminación de Ia presión del área lesionada, uso de injertos de piel, factores de crecimiento y el empleo de métodos de revascularización en caso de existir indicación. Luego del control metabólico estricto, el debridamiento es el paso más importante para Ia curación de las úlceras del diabético y es necesario realizarlo antes de cualquier otra modalidad de tratamiento local. Este consiste en Ia remoción de todo el tejido no viable e infectado (incluyendo huesos) de Ia región lesionada, así como el tejido calloso circundante. El empleo de apositos en las úlceras del pie diabético está bien establecido y aunque se han estudiado diversos tipos de apositos, se desconoce Ia superioridad de uno sobre otro. Además los estudios han sido pocos y más bien se han dirigido a úlceras de bajo grado por Io que se requieren más evidencias a partir de ensayos clínicos para demostrar Ia eficacia de estos métodos. Entre los nuevos tipos de apositos estudiados en ensayos clínicos controlados se encuentran los apositos que se basan en membrana polimérica semipermeable, promogran (matriz de colágeno), alginato, carboximetilcelulosa, hialuronan y presión subatmosférica (Eldor R., et al. (2004) New and experimental approaches to treatment of diabetic foot ulcers: a comprehensive review of emerging treatment strategies. Diabet Med. 21(11):1161- 73).
Se han empleado también medidas coadyuvantes, como la terapia hemorreológica y Ia terapia vasoactiva, que han brindado algún efecto favorable tanto en Ia fase de cronicidad como en las reagudizaciones pero que no se han generalizado para el tratamiento del pie diabético. La terapia hemorreológica tiene su fundamento en Ia prevalencia demostrada en el enfermo diabético de las alteraciones hemorreológicas y su papel potenciador de Ia infección. Por otro lado, Ia terapia vasoactiva se ha utilizado en las alteraciones locales de perfusión, tanto debidas a Ia macro- como a Ia micro-angiopatía, en las que actúan ciertos prostanoides a nivel tisular.
Para ciertos estados se han empleado los antiagregantes plaquetarios, y los agentes trombolíticos. Por otra parte, Ia técnica de revascularización en el paciente isquémico diabético o no diabético es riesgosa, costosa y no aplicable a todos los pacientes. Su indicación es muy limitada, al igual que Ia cirugía endovascular, Ia cual ha mostrado limitaciones de viabilidad, tanto en los sectores arteriales Aorto- Ilíaco como Fémoro-Popliteo, atribuibles a calcificación y mayor sectorialidad lesional.
Otro invento para el tratamiento de lesiones cutáneas agudas extensas, tales como las úlceras venosas, ha sido Ia creación de sustitutos equivalentes de piel bioartificial humana. Sin embargo, es limitada Ia información en úlceras isquémicas del pié diabético, y es poco concebible que estos productos puedan controlar el proceso isquémico que subyace como causa del fracaso de Ia cicatrización (New Skin for Oíd. Developments in Biological Skin Substitutes. Arch Dermatol. 1998 134:344-348). Otra alternativa ha sido Ia aplicación de factores de crecimiento. Recientemente Ia Administración Federal de Drogas y Alimentos (FDA) de EEUU, aprobó el uso del factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) recombinante humano, para estimular Ia cicatrización de úlceras neuropáticas del pié diabético. Sin embargo, los resultados del más reciente ensayo clínico a doble ciegas, multicéntrico y aleatorizado, en el que el PDGF, en forma de gel, fue aplicado en Ia superficie de las lesiones, demuestra una eficacia de sólo un 50% (Wieman TJ. , Smiell J. M., Su Y. (1998) Efficacy and safety of a topical gel formulation of recombinant human platelet-derived growth factor-BB (becaplermin) in patients with chronic neuropathic diabetic ulcers. A phase III randomized placebo-controlled double-blind study. Diabetes Care. 21(5):822-7). Otros aspectos marcan las limitaciones de Ia efectividad de este tratamiento. En particular, las lesiones tratadas en el ensayo fueron de sólo hasta grado III y IV y con un normal suministro de sangre arterial. Un aspecto crítico es el elevado índice de recurrencia (un 30% en tres meses) reportado en este ensayo.
Los resultados más satisfactorios en el tratamiento de las úlceras neuropáticas del pié diabético han sido descritos por Berlanga, J. y col. (WO 03/053458 A1). Dicha invención demuestra una alta efectividad (mayor que el 50%) en el tratamiento con Factor de Crecimiento Epidérmico (FCE) de lesiones de mayor grado (IV y V) y con un severo componente isquémico, previniendo Ia amputación del pié diabético. En el ensayo clínico el FCE fue infiltrado mediante agujas hipodérmicas dentro y alrededor de lesiones. El método de infiltración es muy efectivo en Ia administración del FCE ya que puede liberar una gran cantidad del FCE directamente en el tejido viable. Sin embargo, este método tiene como limitaciones importantes el dolor causado por el pinchazo, que conduce a que algunos pacientes abandonen el tratamiento, y el riesgo de ocurrir sepsis.
Los liposomas han sido propuestos para su uso en una gran variedad de aplicaciones tópicas ya que éstos facilitan Ia absorción de las drogas a través de Ia piel, reducen los efectos tóxicos asociados a las drogas y proveen una liberación más prolongada de éstas. Las propiedades de los liposomas, que determinan Ia eficiencia del transporte de las drogas por vía tópica, dependen en gran medida, entre otros factores, de su composición lipídica. Generalmente, se ha encontrado que los liposomas convencionales que están compuestos por fosfolípidos y esteróles pueden modular Ia penetración de las drogas ya que éstas vesículas, aunque generalmente no penetran en Ia piel viable, pueden acumularse en el estrato córneo y otras capas más superficiales de Ia piel (Barry B.W. (2001) Novel mechanisms and devices to enable successful transdermal drug delivery. Eur J Pharm Sci. 14(2):101-14; van den Bergh, B.A.I., de Vries, I.S., Bouwstra, JA, (1998) Interactions between liposomes and human stratum corneum studied by freeze-substitution electrón microscopy. Int. J. Pharm. 167, 57-67). Cuando se incluyen agentes tenso-activos como los detergentes en Ia estructura de las vesículas, los liposomas demuestran una mayor deformabilidad (liposomas deformables) y éstos pueden penetrar, de forma intacta y más eficiente a través de los poros del estrato córneo hasta capas profundas y viables de Ia piel (Cevc G., Schatzlein A., Richardsen H. (2002) Ultradeformable lipid vesicles can penétrate the skin and other semi-permeable barriers unfragmented. Evidence from double label CLSM experiments and direct size measurements. Biochim. Biophys. Acta 1564(1 ):21 -30; Cevc G. (2004) Lipid vesicles and other colloids as drug carriers on the skin. Adv Drug Deliv Rev. 56(5):675-711).
Sin embargo, Ia utilidad de los liposomas convencionales, compuestos por fosfolípidos y esteróles, para Ia administración por vía tópica de FCE ha sido demostrada en aplicaciones que difieren notablemente por su naturaleza de las descritas en esta invención. En particular, se ha descrito anteriormente por Uster, P. S. y col. (US 4944948) en estudios en conejos que Ia asociación de FCE a una dispersión de liposomas de gran viscosidad puede prolongar Ia concentración local de FCE en el sitio de aplicación. Se ha demostrado además que Ia formulación del FCE con Su Yu Ping, en el cual los liposomas son el principal componente, acelera, con respecto al tratamiento con FCE solo, Ia curación de pacientes con quemaduras de grado Il cuando el medicamento es aplicado por vía tópica (Liao Y., Guo L., Ding E.Y. (2003) A comparative study on burn wound healing treated by different methods of recombinant human epidermal growth factor. Zhongguo Xiu Fu Chong Jian Wai Ke Za Zhi 17(4):301-2). Por otro lado, no se ha descrito o propuesto el uso de los liposomas deformables para Ia aplicación tópica de FCE en lesiones cutáneas isquémicas crónicas de alto riesgo de amputación en pacientes de pié diabético. A pesar que se ha demostrado que estos liposomas cargados con otros fármacos pueden penetrar con mayor eficiencia en Ia piel normal, no puede deducirse de estas experiencias que éstos liposomas puedan transportar con suficiente eficacia el FCE hasta regiones profundas debajo de las lesiones cutáneas crónicas de grados IV y V neuropáticas o isquémicas de forma que permita su curación y Ia prevención de Ia amputación del pié diabético. La estructura de Ia piel en estas lesiones es muy diferente a Ia piel normal Io que puede modificar de forma adversa Ia penetrabilidad e integridad de los liposomas. Además, las composiciones farmacéuticas activas pueden ser degradadas enzimáticamente en mucha mayor medida, ya que el tejido de estas lesiones del pié diabético contienen un nivel de enzimas mucho mayor que el tejido de Ia piel normal (Yager D. R., Chen S. M., Ward S.I., et al. (1997) Ability of chronic wound fluids to degrade peptide growth factors is associated with increased levéis of enastase activity and disminished levéis of proteinase inhibitors. Wound Rep. Reg. 5:23-32).
No se ha demostrado, por Io tanto, una formulación efectiva que contenga FCE, para el tratamiento de las úlceras isquémicas crónicas del pié diabético que logre una alta biodisponibilidad del FCE en el tejido profundo debajo de Ia lesión, similar a Ia obtenida mediante Ia infiltración del FCE con agujas hipodérmicas, que evite la amputación de Ia extremidad, el dolor del pinchazo y Ia infección de Ia lesión.
Explicación de Ia invención.
La presente invención resuelve el problema antes mencionado, a través del uso de formulaciones tópicas que contienen Factor de Crecimiento Epidérmico encapsulado o asociado a liposomas deformables o convencionales, las cuales permiten una alta biodisponibilidad del FCE en el tejido profundo debajo de lesiones cutáneas, similar a Ia obtenida mediante Ia infiltración del FCE con agujas hipodérmicas. La aplicación de estas formulaciones tópicas se realiza en Ia superficie y alrededor de lesiones cutáneas isquémicas crónicas y tiene Ia ventaja de que evita el dolor del pinchazo y
Ia infección de Ia lesión.
Otro aspecto de Ia presente invención se refiere a Ia formulación farmacéutica tópica, Ia cual contiene una cantidad efectiva de Factor de Crecimiento Epidérmico encapsulado o asociado a liposomas deformables o convencionales, en Ia que el liposoma está compuesto por uno o más lípidos farmacéuticamente aceptables. El FCE aplicado a través de las formulaciones de esta invención es transportado eficientemente hacia el tejido viable debajo de las lesiones y es protegido eficazmente contra Ia degradación mediada por proteasas, las cuales están presentes en altos niveles en estas lesiones del pie diabético. En una realización preferida, Ia cantidad efectiva de Factor de Crecimiento Epidérmico está entre 0.025 y 0.075 mg/gramo de sustancia. Las formulaciones permiten de forma irreversible Ia cicatrización de lesiones cutáneas crónicas, previniendo Ia práctica de amputaciones cuando no existe otra alternativa para Ia extremidad isquémica.
En otra realización preferida, el liposoma de Ia formulación farmacéutica tópica está compuesto por uno o más lípidos farmacéuticamente aceptables seleccionados del grupo que consiste de un lípido neutro, un lípido de carga negativa, un lípido de carga positiva, un lípido conjugado a polietilenglicol o un lípido conjugado a un carbohidrato. Los liposomas también pueden estar compuestos por uno o más lípidos farmacéuticamente aceptables y uno o más agentes surfactantes no Iónicos, zwitteriónicos, aniónicos o catiónicos. {
Breve descripción de las figuras Figura 1. Esquema que representa Ia localización de las ulceras inducidas en el modelo animal.
Exposición detallada de modos de realización / Ejemplos
Ejemplo 1. Obtención de liposomas convencionales cargados con FCE. Fosfatidilcolina, a una concentración de 10 mg/mL, fue disuelta en etanol absoluto en un balón de 50 mL de fondo redondo. El lípido fue secado mediante roto- evaporación a temperatura ambiente hasta que se formó una capa seca en las paredes del recipiente. Para encapsular el FCE en liposomas, Ia capa seca de lípido fue hidratada mediante homogenización con una solución tamponada que contenía FCE. Para disminuir el tamaño de los liposomas, Ia preparación de liposomas cargados con FCE fue sometida a varios pases de extrusión a través de una membrana de pollcarbonato con poros de 100 nm de diámetro promedio hasta que el tamaño promedio de los liposomas estuvo alrededor de 100 nm. Para separar el FCE encapsulado en el liposoma del FCE no encapsulado, Ia suspensión fue centrifugada a 100 000 x g durante 40 min a 40C. El sobrenadante fue trasvasado a un tubo limpio y el precipitado fue resuspendido con una solución salina tamponada con fosfato a pH 7.2. La centrifugación se repitió una vez más en las mismas condiciones y el sobrenadante fue trasvasado a un tubo limpio y mezclado con el sobrenadante de Ia primera centrifugación. El precipitado (liposomas cargados con FCE) fue resuspendido en una solución salina tamponada con fosfato a pH 7.2. Esta preparación final fue almacenada a 40C hasta su uso.
Obtención de liposomas deformables cargados con FCE.
Un total de 85.8 mg de fosfatidilcolina y 11.7 mg de desoxicolato de sodio se disolvieron en 100 μl_ de etanol absoluto tibio, luego éstos se diluyeron en 900 μl_ de tampón fosfato, y se agitaron en forma de remolino hasta que se obtuvo una suspensión homogénea de apariencia lechosa. Esta preparación de liposomas fue sometida a varios pases de extrusión a través de una membrana de policarbonato con poros de 100 nm de diámetro promedio hasta que el tamaño promedio de los liposomas estuvo alrededor de 100 nm. Para cargar los liposomas deformables con el FCE se mezclaron 100 μl_ de los liposomas con 25 μl_ de varias cantidades (250, 500 o 1000 μg) de FCE y las mezclas fueron incubadas durante 24 h a 40C.
Ejemplo 2. Determinación de Ia eficiencia de incorporación del FCE a los liposomas.
Para determinar Ia eficiencia de incorporación del FCE a los liposomas, las preparaciones fueron centrifugadas a alta velocidad y se determinó el contenido de proteína en el precipitado (liposomas con FCE incorporado) y en el sobrenadante (FCE libre) obtenido. La suspensión de liposomas fue centrifugada a 100 000 x g durante 40 min. a 40C. El sobrenadante fue trasvasado a un tubo limpio y el precipitado fue resuspendido con una solución salina tamponada con fosfato a pH 7.2. La centrifugación se repitió en las mismas condiciones y el sobrenadante fue trasvasado a un tubo limpio y mezclado con el sobrenadante de Ia primera centrifugación. El precipitado fue resuspendido en 500 μL de una solución salina tamponada con fosfato a pH 7.2. A continuación se extrajo Ia proteína presente en el sobrenadante o el precipitado añadiendo 0.5% Tritón X-100 a las muestras y se cuantificó el contenido proteico por correlación con el área bajo Ia curva de Ia absorbancia a 226 nm mediante Ia cromatografía de fase reversa de alta eficiencia (RP-HPLC, por sus siglas en inglés). La eficiencia de incorporación se calculó como el cociente del contenido de proteína en el precipitado (liposomas con FCE incorporado) entre el contenido total de proteína añadido al inicio del proceso de encapsulación x 100%.
Tabla 1. Eficiencia de incorporación del FCE a los liposomas.
Figure imgf000009_0001
Ejemplo 3. Determinación del tamaño y Ia morfología de los liposomas.
Las muestras de liposomas fueron analizadas mediante microscopia electrónica de transmisión para determinar el tamaño promedio de los liposomas y su morfología. Los liposomas fueron visualizados a través de Ia tinción negativa con acetato de uranilo. Las muestras teñidas negativamente fueron observadas en un microscopio electrónico de transmisión Jeol-JEM 2000EX que operó a 80 KV. La micrografías de cada preparación de liposomas fueron digitalizadas mediante un digitalizador de imágenes y se midió el diámetro de los liposomas contenidos en cada micrografía utilizando el programa DIGIPAT versión 3.3 (EICISOFT, La Habana, Cuba). El tamaño de partícula fue promediado por el número total de liposomas presentes y se representó como Ia media + Ia desviación estándar de tres determinaciones independientes.
Tanto los liposomas deformables como los convencionales cargados con FCE estuvieron constituidos por una población homogénea de vesículas de forma esférica o elipsoidal. El tamaño promedio de las vesículas fue de 130±7 nm y 123±4 nm, para los liposomas convencionales y los liposomas deformables, respectivamente.
Ejemplo 4. Preparación del gel de liposomas cargados con FCE. Para preparar este gel, los liposomas deformables o convencionales cargados con FCE fueron diluidos 1.5 veces en tampón fosfato pH 7.2 y se añadió Carbomer (Carbopol 940) tamponado a pH 7.2 a una concentración final de 1.25% (p/v). La formulación contenía además 0.02% (p/v) hidroxitolueno de butilo (BHT), 0.1 % (p/v) EDTA, 0.25% (p/v) parahidroxibenzoato de metilo, 0.525% (p/v) alcohol bencílico, 0.2% (p/v) hidróxido de sodio y 3% (p/v) glicerol.
Las suspensiones tuvieron una viscosidad de aproximadamente 840 mPas y 730 mPas, para los liposomas convencionales y los liposomas deformables, respectivamente.
Ejemplo 5. Demostración del efecto protector de Ia encapsulación del FCE en liposomas contra Ia degradación enzimática del FCE in vitro. Este experimento tuvo el objetivo de evaluar si Ia encapsulación del FCE en liposomas (convencionales y deformables) es ventajosa para conservar Ia integridad del FCE en el ambiente proteolítico del tejido del pié diabético. Para esto se tomaron biopsias del tejido ulcerado de pacientes diabéticos después de Ia anestesia local y se resuspendieron con una solución salina tamponada con fosfato (PBS pH 7.2). Un total de 25 μg de FCE en solución o encapsulado en liposomas fue añadido a las muestras e incubado durante 20, 40, o 60 min a 370C. Para terminar Ia reacción se añadió 50% (v/v) ácido acético. Después de añadir Tritón X-100 al 5%, las muestras fueron centrifugadas a 4000 rpm durante 15 min y filtradas con filtros de un tamaño de poro de 0.2-0.45 μm. El contenido de FCE en las muestras fue cuantificado por correlación con el área bajo Ia curva de Ia absorbancia a 226 nm mediante RP-HPLC. El por ciento de FCE remanente fue calculado a partir del cociente entre el contenido de FCE en las muestras después de Ia incubación y el contenido de FCE añadido antes de esta x 100%. Los resultados mostrados en Ia Tabla 2 evidencian que después de su exposición a las biopsias del pié diabético las muestras que contiene el FCE encapsulado tanto en liposomas convencionales como en liposomas deformables preservan una mayor cantidad de FCE que las muestras que contienen FCE no encapsulado. Tabla 2. FCE remanente después de su incubación con biopsias del tejido ulcerado de pacientes diabéticos.
FCE remanente (%)
20 min 40 min 60 min
FCE encapsulado en liposomas 95.1 ± 1.1 83.4 + 4.7 58.6 ± 3.4 convencionales
FCE encapsulado en liposomas 93.4 ± 2.1 80.6 ± 3.8 55.9 ± 2.5 deformables
FCE 82.5 ± 2.5 66.9 ± 3.6 37.8 ± 1.3
Ejemplo 6. Demostraciones de eficacia de las formulaciones tópicas que contienen FCE en modelos animales experimentales de lesiones agudas y tórpidas controladas.
Modelo animal de lesiones experimentales agudas controladas.
El experimento que a continuación se describe se realizó con el objetivo de evaluar el efecto cicatrizante de Ia nueva formulación farmacéutica de uso tópico basada en liposomas deformables o convencionales que contienen FCE en lesiones agudas de pronóstico satisfactorio.
Biomodelo experimental: ratas Wistar machos de peso corporal entre 225-250 gramos. Los animales fueron mantenidos en áreas controladas del Bioterio del CIGB y bajo régimen estable de iluminación de 12 x 12 horas, ciclos de cambios de aire, así como libre acceso a Ia dieta. Se realizó alojamiento individual de las ratas en cajas T3 con reemplazo del encamado cada 48 horas previa esterilización. Inducción de las ulceras: los animales fueron anestesiados con Ia combinación de ketamina/xylazina por via intraperitoneal. Se realizó Ia depilación mecánica y química de Ia zona de Ia espalda desde el espacio retro-escapular hasta Ia altura del sacro. La región fue aseptizada con una solución de yodo-povidona y alcohol isopropílico. El territorio de Ia piel para inducir las ulceras fue delimitado con tinta china, para poder inducir lesiones de grosor total, circulares con biótomos desechables de 9 mm de diámetro (AcuDrem, Fl, USA). Como se indica en Ia Figura 1 , se crearon 6 lesiones simétricas y equidistantes en cada animal. Luego de creadas, se lavaron con solución salina estéril y su borde interno fue delineado con tinta indeleble para el calculo del área de Ia herida en tiempo cero. Las lesiones de todos los animales de cada grupo se higienizaron diariamente con etanol al 70% y salina estéril antes de aplicar el tratamiento en caso que correspondiese.
Grupos experimentales: Luego de creadas las ulceras, los animales fueron asignados aleatoriamente mediante una tabla de cruzamiento orden de entrada/grupo a los siguientes grupos experimentales:
Grupo I- no tratados.
Grupo II- placebo (formulación de liposomas deformables que no contienen FCE) aplicado tópicamente.
Grupo III- tratamiento mediante infiltración de una solución de FCE conteniendo 75 microgramos por microlitro. Las infiltraciones se realizaron sobre los bordes y fondo de Ia herida.
Grupo IV- tratamiento con Ia formulación de liposomas convencionales que contienen 25 microgramos de FCE por gramo de sustancia.
Grupo V- tratamiento con Ia formulación de liposomas convencionales que contienen 75 microgramos de FCE por gramo de sustancia.
Grupo Vl- tratamiento con Ia formulación de liposomas deformables que contienen
25 microgramos de FCE por gramo de sustancia. Grupo VII- tratamiento con Ia formulación de liposomas deformables que contienen
75 microgramos de FCE por gramo de sustancia.
Se incluyeron 10 ratas para cada uno de los grupos, de modo tal que se estudiaron
60 heridas por grupo. Los tratamientos se realizaron diariamente, previa sedación con diazepam por vía intra-peritoneal de los animales. Determinación del nivel de cierre de las heridas. Procesamiento histológico:
Las lesiones fueron calcadas en láminas transparentes de acetato para el cálculo cinético de Ia contracción en los siguientes tiempos: Tiempo 0- representa el 100% del área de lesión abierta y el 0% de contracción, Tiempo 1- a las 72 horas de inducidas, Tiempo 2- al 5to día de inducidas, Tiempo 3- al 7mo día de inducidas, Tiempo 4- al 9no día de inducidas. Se toma este día como final del estudio y para el sacrificio de los animales de acuerdo a Ia experiencia previa de Ia cinética espontánea de cicatrización de estas lesiones. Las imágenes de los bordes de las lesiones fueron digitalizados. El área y el porciento de contracción fueron calculados mediante el programa de análisis de imágenes DIGIPAT. Los cálculos estadísticos se cada parámetro se realizaron mediante el paquete SPSS empleando Ia prueba no paramétrica de Mann Whitney U, estableciendo un nivel de significación de p<0.05.
Los animales fueron sacrificados mediante una sobre-dosis de pentobarbital sódico
(250 mg/kg) vía intra-peritoneal. Las lesiones fueron resecadas desde el panículo carnoso y fijadas en formalina neutra al 10% para su posterior inclusión en parafina.
Se utilizaron las coloraciones de hematoxilina/eosina, van Giesson y tricrómica de
Masson. El numero de animales de cada grupo con un 100% de epitelización de Ia lesión, con epidermis estratificada y diferenciada fue considerado para cada grupo.
Los resultados de Ia cinética de contracción de las heridas se muestran en Ia Tabla
3 (los valores de contracción en mm se expresan en porciento sobre el calculo de máxima dilatación en Tiempo 0).
Tabla 3. Valores cinéticos de Ia contracción de las úlceras controladas agudas.
Figure imgf000013_0001
(*a) Significa diferencia estadística de p<0.05 con los grupos I y II. (*b) Significa diferencia estadística de p<0.05 con los grupos I, Il y III. (**) Significa diferencia estadística de p<0.01 con los grupos I, Il y III. Prueba de Mann-Whitney U.
Como puede observarse las formulaciones basadas en liposomas ejercen el más potente de los efectos de contracción de los bordes de las heridas Io que en otras palabras significa que ejerce el mas favorable efecto en Ia aceleración de Ia cicatrización total en tanto que Ia contracción representa Ia convergencia de varios eventos consolidados que aproximan Ia herida a Ia fase de remodelación. En Ia Tabla 4, puede observarse el porciento de territorio ocupado por tejido de granulación maduro y organizado de las ulceras en cada grupo experimental. Los cálculos se realizaron sobre las muestras colectadas en Tiempo 4 cuantificando el número de campos microscópicos positivos coincidentemente a las reacciones de van Giesson y Tricrómica de Masson en cada muestra. Las valoraciones se realizaron por dos patólogos de forma independiente y a ciegas. Tabla 4. Porciento de territorio granulado en tiempo 4 en cada grupo experimental.
Figure imgf000014_0001
Estudio de 60 heridas por grupo empleando las reacciones positivas a fibras colágenas.
Como puede observarse el tratamiento con las formulaciones basadas en liposomas ejerce el más potente de los efectos sobre el proceso de establecimiento y maduración del tejido de granulación, Io que viene a corresponderse con Io descrito para el proceso de contracción de las heridas antes descrito.
El efecto de los tratamientos fue también estudiado sobre el proceso de epitelización de las lesiones. Se valoró el aspecto microscópico del epitelio considerando Ia re- epitelización total de Ia ulcera, Ia presencia de un epitelio estratificado, y Ia existencia de un estrato de queratina. Para el estudio microscópico las lesiones fueron sometidas a una hemisección longitudinal central e incluidas en el mismo bloque de parafina. Se estudiaron un total de 120 cortes histológicos por grupo, que en esencia representan 60 lesiones. Los resultados se expresan en Ia Tabla 5. Tabla 5. Efecto de los tratamientos sobre el proceso de epitelización de las heridas.
Figure imgf000015_0001
Como es apreciable los grupos IV, V, Vl y VII con las formulaciones de los liposomas muestran los mejores indicadores de respuesta epitelial, dados por Ia re- epitelización total y por Ia madurez del epitelio.
Podemos concluir que el tratamiento con los liposomas favorece (i) el proceso de contracción de heridas agudas, controladas; (H) el proceso de granulación y su maduración; (Hi) el proceso de re-epitelización y de diferenciación de Ia epidermis y (/V) no estuvo asociado a la formación de tejido de granulación aberrante, de granulomas de fijación o cuerpo extraño. Modelo de Ulceras Cutáneas Crónicas.
El experimento que a continuación se describe se realizó con el objetivo de evaluar el efecto cicatrizante de las nuevas formulaciones farmacéuticas de uso tópico basada en liposomas deformables o convencionales que contienen FCE en lesiones crónicas de pronóstico sombrío que simulan Ia lesión de los diabéticos. Biomodelo experimental: ratas Wistar machos de peso corporal entre 225-250 gramos. Los animales fueron mantenidos en áreas controladas del Bioterio del CIGB y bajo régimen estable de iluminación de 12 x 12 horas, ciclos de cambios de aire, así como libre acceso a Ia dieta. Se realizó alojamiento individual de las ratas en cajas T3 con reemplazo del encamado cada 48 horas previa esterilización. Los animales habían sido previamente tratados durante dos meses con una solución de metilglioxal al 0.01 % para crear un ambiente de glicosilación comparable con el que ocurre en un paciente diabético de larga evolución. Entre otros daños orgánicos se describe el enlentecimiento del proceso de granulación y remodelación de las heridas (Berlanga J., Cibrian D., et al. (2005) Methylglyoxal administration induces diabetes-like microvascular changes and perturbs the healing process of cutaneous wounds. Clin Sci (Lond). 109(1):83-95).
Inducción de las ulceras: Los animales fueron anestesiados con Ia combinación de ketamina/xylazina por via intraperitoneal. Se realizó Ia depilación mecánica y química de Ia zona de Ia espalda desde el espacio retro-escapular hasta Ia altura del sacro. La región fue aseptizada con una solución de yodo-povidona y alcohol isopropílico. El territorio de Ia piel para inducir las ulceras fue delimitado con tinta china, para poder inducir lesiones de grosor total, circulares con biótomos desechables de 9 mm de diámetro (AcuDrem, Fl, USA). Se crearon 6 lesiones simétricas y equidistantes en cada animal tal y como se efectuó para el estudio previo. Luego de creadas, se lavaron con solución salina estéril y su borde interno fue delineado con tinta indeleble para el calculo del área de Ia herida en tiempo cero. Las lesiones de todos los animales de cada grupo se higienizaron diariamente con etanol al 70% y salina estéril antes de aplicar el tratamiento en caso que correspondiese. Grupos experimentales: Luego de creadas las ulceras los animales fueron asignados aleatoriamente mediante una tabla de cruzamiento orden de entrada/grupo a los siguientes grupos experimentales: Grupo I- no tratado. Grupo II- placebo (formulación de liposomas deformables que no contienen FCE) aplicado tópicamente.
Grupo III- tratamiento mediante infiltración de una solución de FCE conteniendo 75 microgramos por mililitros. Las infiltraciones se realizaron sobre los bordes y fondo de Ia herida. Grupo IV- tratamiento con Ia formulación de liposomas tradicionales que contienen 25 microgramos de FCE por gramo de sustancia.
Grupo V- tratamiento con Ia formulación de liposomas tradicionales que contienen 75 microgramos de FCE por gramo de sustancia.
Grupo VI- tratamiento con Ia formulación de liposomas deformables que contienen 25 microgramos de FCE por gramo de sustancia. Grupo VII- tratamiento con Ia formulación de liposomas deformables que contienen 75 microgramos de FCE por gramo de sustancia.
Se incluyeron 10 ratas para cada uno de los grupos, de modo tal que se estudiaron 60 heridas por grupo. Los tratamientos se realizaron diariamente, previa sedación con diazepam por vía intra-peritoneal de los animales.
Determinación del nivel de cierre de las heridas. Procesamiento histológico: Las lesiones fueron calcadas en láminas transparentes de acetato para el cálculo cinético de Ia contracción en los siguientes tiempos: Tiempo 0- representa el 100% del área de lesión abierta y el 0% de contracción, Tiempo 1- a las 72 horas de inducidas, Tiempo 2- al 5t0 día de inducidas, Tiempo 3- al 7mo día de inducidas, Tiempo 4- al 9no día de inducidas, Tiempo 5 a los 12 días de inducidas, y Tiempo 6 a los 15 días de creadas. Se toma este día como final del estudio y para el sacrificio de los animales de acuerdo a Ia experiencia previa de Ia cinética espontánea de cicatrización de estas lesiones. Las imágenes de los bordes de las lesiones fueron digitalizados. El área y el porciento de contracción fueron calculados mediante el programa de análisis de imágenes DIGIPAT. Los cálculos estadísticos se cada parámetro se realizaron mediante el paquete SPSS empleando Ia prueba no paramétrica de Mann Whitney U, estableciendo un nivel de significación de p<0.05. Los animales fueron sacrificados mediante una sobre-dosis de pentobarbital sódico (250 mg/kg) vía intra-peritoneal. Las lesiones fueron resecadas desde el panículo carnoso y fijadas en formalina neutra al 10% para su posterior inclusión en parafina. Se utilizaron las coloraciones de hematoxilina/eosina, van Giesson y tricrómica de Masson. El numero de animales de cada grupo con un 100% de epitelización de Ia lesión, con epidermis estratificada y diferenciada fue considerado para cada grupo. Los resultados de Ia cinética de contracción de las heridas se muestran en Ia Tabla 6 (los valores de contracción en mm se expresan en porciento sobre el calculo de máxima dilatación en Tiempo 0). Tabla 6. Valores cinéticos de Ia contracción de las úlceras crónicas.
Figure imgf000018_0001
(*) Significa diferencia estadística de p<0.05 con los grupos I y II. (**) Significa diferencia estadística de p<0.01 con los grupos I, Il y III. Prueba de Mann-Whitney U.
Como puede observarse las formulaciones basadas en liposomas ejercen el más potente de los efectos de contracción de los bordes de las heridas Io que en otras palabras significa que ejerce el mas favorable efecto en Ia aceleración de Ia cicatrización total en tanto que Ia contracción representa Ia convergencia de varios eventos consolidados que aproximan Ia herida a Ia fase de remodelación. Nótese que estas heridas simulan el micro-ambiente bioquímico de Ia herida diabética en los que el mecanismo de contracción se encuentra de forma patológica parcial o totalmente abolido.
Determinación de Ia concentración de FCE en el tejido viable profundo debajo de las lesiones cutáneas Para determinar Ia concentración de FCE se realizaron cortes histológicos del tejido profundo (1 cm) debajo de las lesiones a un tiempo de 20 min, 1 h, 4 h, 8 h, 16 h y 24 h después de producidas. El tejido fue homogeneizado en una solución salina tamponada con fosfato. La concentración de FCE fue determinada mediante un ensayo inmuno-enzimático (ELISA, por sus siglas en inglés). Como se muestra en Ia Tabla 6a, las formulaciones de FCE en liposomas permitieron el transporte de altas concentraciones de FCE (grupos experimentales IV, V, Vl y VII) a regiones profundas del tejido debajo de las lesiones, comparables a las obtenidas mediante el método de infiltración (grupo experimental III). Tabla 6a. Concentración de FCE en el tejido viable profundo debajo de las lesiones cutáneas.
Figure imgf000019_0001
(*) Significa diferencia estadística de p<0.05 con los grupos I y II. (**) Significa diferencia estadística de p<0.01 con los grupos I, Il y III. Prueba de Mann-Whitney
En Ia Tabla 7, puede observarse el porciento de territorio ocupado por tejido de granulación maduro y organizado de las ulceras crónicas en cada grupo experimental. Los cálculos se realizaron sobre las muestras colectadas en Tiempo 6 cuantificando el número de campos microscópicos positivos coincidentemente a las reacciones de van Giesson y Tricrómica de Masson en cada muestra. Las valoraciones se realizaron por dos patólogos y un consultante de forma independiente y a ciegas. Como puede observarse el tratamiento con las formulaciones basadas en liposomas ejerce el más potente de los efectos sobre el proceso de establecimiento y maduración del tejido de granulación, Io que viene a corresponderse con Io descrito para el proceso de contracción de las heridas antes descrito. Tabla 7. Porciento de territorio granulado en tiempo 4 en cada grupo experimental.
Figure imgf000020_0001
Estudio de 60 heridas por grupo empleando las reacciones positivas a fibras colágenas.
El efecto de los tratamientos fue también estudiado sobre el proceso de epitelización de las lesiones. Se valoró el aspecto microscópico del epitelio considerando Ia re- epitelización total de Ia ulcera, Ia presencia de un epitelio estratificado, y Ia existencia de un estrato de queratina. Para el estudio microscópico las lesiones fueron sometidas a una hemisección longitudinal central e incluidas en el mismo bloque de parafina. Se estudiaron un total de 120 cortes histológicos por grupo, que en esencia representan 60 lesiones. No hubo necesidad de eliminar ninguna de las lesiones por contaminación bacteriana. Los resultados se expresan en Ia Tabla 8. Como es apreciable los grupos IV, V, Vl y VII con las formulaciones de los liposomas muestran los mejores indicadores de respuesta epitelial, dados por Ia re- epitelización total y por Ia madurez del epitelio.
Tabla 8. Efecto de los tratamientos sobre el proceso de epitelización de las heridas.
Figure imgf000021_0001
Se puede concluir que el tratamiento con los liposomas favorece (/) el proceso de contracción de heridas crónicas que simulan fielmente el ambiente bioquímico de las ulceras del paciente diabético; (/'/) el proceso de granulación y su maduración. Notoriamente el tratamiento permite el establecimiento de una red vascular neo- formada y (///) estimula de forma moderada el proceso de re-epitelización y de diferenciación de Ia epidermis en lesiones que habitualmente son resistentes a Ia reepitelización.
Ejemplo 7. Demostración de eficacia de las formulaciones tópicas que contienen FCE encapsulado en liposomas en pacientes con úlceras avanzadas del pie diabético. La administración por compasión de las formulaciones de liposomas convencionales o deformables que contienen 25 o 75 microgramos de FCE por gramo de sustancia en pacientes con úlceras del pie diabético han mostrado resultados similares a los obtenidos con Ia formulación inyectable pero con Ia ventaja de evitar los inconvenientes de las inyecciones. La nueva formulación de liposomas deformables que contiene 75 microgramos de FCE por gramo de sustancia fue aplicada en un paciente con úlcera del pie diabético, evidencias de compromiso del flujo sanguíneo y riesgo de amputación mayor. El producto se administró tópicamente luego de realizar debridamiento completo de Ia úlcera. La lesión fue cubierta entre las curas con un aposito y vendaje estéril. Se observó una evolución satisfactoria, siendo evidente desde Ia primera semana de tratamiento Ia aparición de un tejido de granulación útil y contracción de los bordes de Ia úlcera. El producto fue efectivo para lograr epitelización completa de Ia lesión y prevenir Ia amputación. No se identificaron reacciones adversas durante el tratamiento.
Otro paciente diabético con lesiones cutáneas isquémicas en los miembros inferiores que excedían los 20 cm2 y con una profundidad que comprometía hasta el periostio fue tratado con Ia formulación de liposomas tradicionales que contiene 75 microgramos de FCE por gramo de sustancia. El producto fue igualmente administrado tópicamente luego de realizar el debridamiento completo de Ia úlcera. La lesión fue cubierta entre las curas con un aposito y vendaje estéril. A partir de Ia cuarta administración del producto (aplicado 3 veces a Ia semana), se observó un cambio sustancial del aspecto de Ia lesión, en Ia cual comenzó a prevalecer un tejido de granulación productivo, sangrante, que a los pocos días fue cubierto por epitelio. Al final del tratamiento de Ia epidermización total el paciente fue dado de alta hospitalaria y ha evolucionado sin recaídas.
Por otra parte, en un paciente diabético con úlceras avanzadas que tuvo intolerancia a las inyecciones locales y abandonó el tratamiento infiltrativo después de Ia tercera aplicación, comenzó a administrarse Ia nueva formulación de 25 microgramos de FCE con liposomas deformables. El paciente pudo continuar el tratamiento hasta el final manteniendo Ia evolución satisfactoria hasta lograr el cierre completo de Ia lesión. Este paciente no reportó complicaciones de su enfermedad ni reacciones adversas asociadas al tratamiento.

Claims

REIVINDICACIONES
USO TÓPICO DEL FACTOR DE CRECIMIENTO EPIDÉRMICO EN LIPOSOMAS PARA PREVENIR LA AMPUTACIÓN DEL PIE DIABÉTICO. 1. Uso de una cantidad efectiva de Factor de Crecimiento Epidérmico encapsulado o asociado a liposomas deformables o convencionales para Ia manufactura de una formulación farmacéutica tópica para el tratamiento de lesiones cutáneas isquémicas crónicas de grado IV y V en pacientes diabéticos.
2. El uso según Ia reivindicación 1 , donde se logra alta biodisponibilidad del Factor de Crecimiento Epidérmico en el tejido profundo debajo de las lesiones.
3. El uso según las reivindicaciones 1 y 2, para prevenir Ia amputación del pie diabético, en el que Ia formulación es aplicada en Ia superficie y alrededor de lesiones cutáneas isquémicas crónicas.
4. Formulación farmacéutica tópica que contiene una cantidad efectiva de Factor de Crecimiento Epidérmico encapsulado o asociado a liposomas deformables o convencionales, en Ia que el liposoma está compuesto por uno o más lípidos farmacéuticamente aceptables y logra alta biodisponibilidad del Factor en el tejido profundo debajo de lesiones cutáneas isquémicas crónicas y es útil en Ia prevención de Ia amputación del pie diabético.
5. Formulación farmacéutica tópica según Ia reivindicación 4, en el que Ia cantidad efectiva de Factor de Crecimiento Epidérmico está entre 0.025 y 0.075 mg / gramo de sustancia.
6. Formulación farmacéutica tópica según Ia reivindicación 4, en el que Ia cantidad efectiva de Factor de Crecimiento Epidérmico es 0.075 mg / gramo de sustancia.
7. Formulación farmacéutica tópica según Ia reivindicación 4, en Ia que el liposoma está compuesto por uno o más lípidos farmacéuticamente aceptables seleccionado del grupo que consiste de un lípido neutro, un lípido de carga negativa, un lípido de carga positiva, un lípido conjugado a polietilenglicol o un lípido conjugado a un carbohidrato.
8. Formulación farmacéutica tópica según Ia reivindicación 4, en Ia que el liposoma está compuesto por uno o más lípidos farmacéuticamente aceptables y uno o más agentes surfactantes no iónicos, zwitteriónicos, aniónicos o catiónicos.
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