CN102247300A - 人表皮生长因子纳米脂质体及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种人表皮生长因子纳米脂质体，含有脂质体微囊和包裹于其中的人表皮生长因子，人表皮生长因子与脂质体微囊的质量比为1∶50～1∶200。本发明还公开了一种制备人表皮生长因子纳米脂质体的方法。本发明采用磷脂和胆固醇为主要膜材，其类生物膜结构与皮肤相似，具有较好的表皮透过能力，且在制备工艺上更易于制备出粒径均匀、包封率较高的脂质载体。本发明将人表皮生长因子(hEGF)制备成纳米脂质体，可作为原料，辅以其他的生物活性物质如透明质酸等一起，通过相应的制备工艺，制成水剂、霜剂、乳剂等护肤品，达到皮肤损伤的快速修复，皱纹的修复与祛皱，防晒、辐射检验后的护理，敏感性皮肤护理、各类疤痕的去除修复等功效。

Description

人表皮生长因子纳米脂质体及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种化妆品的原料和制备方法，特别涉及一种脂质体材料及其制备方法。

背景技术

皮肤细胞衰老是皮肤疾病发病的基础，因此抗衰老既是美容的根本问题，也是皮肤保健的关键。随年龄增长，基底细胞分裂能力逐渐降低，而细胞凋亡则随年龄增长而增加。

人表皮生长因子(hEGF)，是人生长因子中的一种，是由53个氨基酸组成的相对分子量约为6200的小分子多肽。人表皮生长因子(hEGF)作为一种强有力的细胞分裂因子，具有多种生物活性。

主要表现为：

1、在体内刺激皮肤组织、角膜和气管上皮组织的生长繁殖；

2、加速角膜、皮肤等表皮创伤的修复；

3、抑制胃酸分泌；

4、促进人皮肤上皮细胞、角膜上皮细胞、哺乳动物上皮细胞生长；

5、增强表皮细胞的蛋白质、DNA、RNA的合成和细胞代谢等。

人表皮生长因子(hEGF)不仅具有促进皮肤和黏膜创伤的愈合，防治溃疡以及消炎镇痛的作用，而且能有效促进和调节表皮细胞的生长和增殖，人表皮细胞生长因子(hEGF)对保护和疗养皮肤、黏膜具有十分独特的功效。广泛应用于治疗烧伤、烫伤、手术伤、机械伤、皮肤溃疡、激光美容等。

人表皮生长因子(hEGF)在护肤保健化妆品中也具有广泛的应用价值和市场前景。人表皮生长因子(hEGF)在护肤保健化妆品中的作用如下：

①、嫩肤护肤作用。人表皮生长因子(hEGF)能促进皮肤细胞对营养物质的吸收，加速细胞的新陈代谢，促进皮肤细胞的分裂和增长，促进透明质酸和糖蛋白的合成。

②、促进细胞再生和组织修复。人表皮生长因子(hEGF)有促进皮肤和黏膜创伤面的愈合作用，并减少疤痕挛缩和皮肤畸形增生。用于治疗疤痕，尤其是痤疮后遗的疤痕疙瘩疗效较好。

③、防晒作用。人表皮生长因子(hEGF)能促进新生细胞的生长，替代受紫外线照伤的细胞，以降低皮肤中黑色素细胞的数量。

人表皮生长因子(hEGF)在化妆品中应用具有很好的安全性、经济性。临床实验发现人表皮生长因子(hEGF)虽然能很快诱导皮肤细胞中多角形细胞增殖，但经过一段时间后便达到生理平衡，细胞不再无限增殖，即人表皮生长因子(hEGF)具有使皮肤细胞更新又不导致细胞畸型的特性；人表皮生长因子(hEGF)价格虽然较昂贵，但它的作用剂量小只要有10-9克数量级的表皮生长因子(hEGF)存在就可发挥相应的功能，所以该类产品性能价格比极佳。

由于hEGF的分子量较大，不易穿过皮肤表皮到达真皮部位，且稳定性较差，因而对于具有缓控释作用的hEGF制剂的研究尤为重要。纳米脂质体是目前研究较多的一类药物传递系统，可作为蛋白多肽类药物的理想载体，具有增加蛋白多肽类药物体内外稳定性、体内外缓释等作用，同时还可以增加药物与局部组织的亲和性，减少刺激性。欧洲专利EP0637450A2中涉及到一种包埋药物的脂质载体方法，但其制备周期长，得到的脂质体粒径分散不均匀。

发明内容

为了解决现有技术中存在的问题，本发明提供一种人表皮生长因子纳米脂质体及其制备方法，解决现有技术中hEGF与外界环境的直接接触导致失活、hEGF不能迅速和完全被组织吸收，释放不稳定、长效的问题。

本发明的技术方案为：一种人表皮生长因子纳米脂质体，含有脂质体微囊和包裹于其中的人表皮生长因子，人表皮生长因子与脂质体微囊的质量比为1∶50～1∶200。

所述人表皮生长因子纳米脂质体的粒径为30～800nm，包封率在30％以上。

所述人表皮生长因子纳米脂质体为冻干粉形式，进一步包含甘露醇。

一种制备权利要求1所述人表皮生长因子纳米脂质体的方法，包括如下步骤：

(1)将hEGF溶于水中形成水相，将脂质材料(磷脂∶胆固醇＝4∶1-10∶1)溶于有机溶剂中形成油相；

(2)在超声条件下，将hEGF水溶液缓慢加入油相中，并持续超声形成均一乳白色的初乳；

(3)将初乳置于旋转蒸发仪中，将有机溶剂挥发完全，制成脂质薄膜；

(4)加入磷酸盐缓冲液，将脂质薄膜超声分散，得到均一乳白色混悬液；

(5)将此混悬液进行高压均质循环处理，即得hEGF纳米脂质体。

所述步骤(1)的有机溶剂是指氯仿或乙醚。

所述步骤(2)的超声频率为30～60kHz，超声时间为2～10min。

所述步骤(3)旋转蒸发的真空度为200～900mbar，温度为30～60℃。

所述步骤(4)的磷酸盐缓冲液pH6.8，具体制法为：取0.2mol/L磷酸二氢钾250ml，加0.2mol/LNaOH溶液118ml，用水稀释至1000ml即得。

所述步骤(5)的高压均质压力为100bar～1000bar，循环处理次数为4～20次，循环时采用冰水浴冷却。

本发明的有益效果是：1.hEGF分子量较大，不易透过皮肤表皮，而脂质体与皮肤有很强的亲和力，可明显改善药物的透皮吸收能力。

2.对hEGF采用脂质体进行包埋，由于磷脂的天然性，可使药物具有缓释作用，并且对皮肤无刺激性，安全性良好。

3.将hEGF包裹于脂质体中，可有效保持药物活性，提高药物的稳定性。

4.由hEGF和磷脂本身性质来看，制得的hEGF脂质体具有改善皮肤状况，促进新细胞再生的作用，可广泛应用于抗衰老、保湿、防晒和皮肤修复等化妆品中。

本发明采用磷脂和胆固醇为主要膜材，其类生物膜结构与皮肤相似，具有较好的表皮透过能力，且在制备工艺上更易于制备出粒径均匀、包封率较高的脂质载体。本发明制备周期较短，且得到的脂质体粒径分散均匀。本发明将人表皮生长因子(hEGF)制备成纳米脂质体，可作为原料，辅以其他的生物活性物质如透明质酸等一起，通过相应的制备工艺，制成水剂、霜剂、乳剂等护肤品，达到皮肤损伤的快速修复，皱纹的修复与祛皱，防晒、辐射检验后的护理，敏感性皮肤护理、各类疤痕的去除修复等功效。

附图说明

图1：流动相为乙腈∶水＝30∶70，0.1mg/mlhEGF HPLC液相谱图。

图2：流动相为乙腈∶水＝58∶42(加入三氟乙酸)0.6mg/mlhEGFHPLC液相谱图。

图3：1mg/mlhEGFHPLC出峰谱图。

图4：hEGFHPLC法得到的标准曲线图。

图5：薄膜分散法制备的纳米脂质体透射电镜照片。

图6：逆相蒸发法制备的纳米脂质体透射电镜照片。

图7：体外透皮实验中皮肤累积透过的量。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步的阐述，但本发明不局限于如下阐述的这些实施例。

在下面的实施例中，所使用的人表皮生长因子购于上海普洛康裕药物研究有限公司(纯度＞95％)。

HPLC标准曲线的建立

主要进行了对流动相条件的摸索，检测hEGF在不同流动相(乙腈∶水＝10∶90、30∶70、40∶60、58∶42、70∶30、80∶20；58∶42(每300ml流动相加入0.1ml三氟乙酸))色谱条件如下：

色谱柱：Vydac C18反相色谱柱；

检测波长：280nm；

流动相：不同比例乙腈/水

流速：1.0ml/min

除流动相为乙腈∶水＝58∶42(加入三氟乙酸)外，液相结果并不理想，以流动相为乙腈∶水＝30∶70，0.1mg/mlhEGF为例，谱图见图1；乙腈∶水＝58∶42(加入三氟乙酸)，0.6mg/mlhEGFHPLC液相谱图见图2。

因此建立检测包封率指标的方法：

色谱柱：Vydac C18反相色谱柱；

检测波长：280nm；

流动相：乙腈∶水＝30∶70(0.02％三氟乙酸pH＞2)

流速：1.0ml/min

配制1.0mg/ml、0.8mg/ml、0.6mg/ml、0.4mg/ml、0.2mg/ml、0.1mg/ml、0.5mg/ml的一系列hEGF水溶液，分别进样20μl得到hEGF峰面积(1mg/mlhEGFHPLC谱图见图3)，分别对每一浓度进行三次平行实验，将三次的峰面积取平均值后，以hEGF浓度(C)为横坐标，峰面积(A)为纵坐标回归(标准曲线见图4)，得到标准方程为：

y＝989817x-21941，R²＝0.9999。

将hEGF纳米脂质体在15000rmp高速离心20min，然后吸取上层清夜，用0.8μm的有机膜进行过滤后进样，检测得到游离药物含量；将制得的脂质体用甲醇进行10倍破乳，将清液过0.8μm滤膜进样，检测得到药物总含量。

由下式计算包封率：

包封率％＝(C_总-C_游)/C_总*100％

C_总：hEGF在纳米脂质体中的中浓度；

C_游：高速离心后hEGF的游离浓度；

实施例1

按处方量1ml单位计，处方如下：

处方一：

人表皮生长因子            1mg

卵磷脂                    182mg

胆固醇(药用级)            18mg

氯仿(分析纯)              5ml

磷酸盐缓冲液              1ml

精密称取182mg卵磷脂、18mg胆固醇(PC∶CHOL＝10∶1)溶于10ml氯仿超声(时间5min、频率53kHz)溶解，充分混合后，加入1mlhEGF水溶液(1mg/ml，药质比＝1∶100)，超声约4min混匀后成W/O型乳状液，减压(真空度800mbar、温度40℃)除去有机溶剂，形成胶状物质，再加入1ml磷酸盐缓冲液，超声10min后，得到1ml乳白色均一hEGF纳米脂质体。

制剂样品外观：乳白色均一液体

包封率结果：30.87％

脂质体形态观测方法：磷钨酸染色法

透射电镜型号：JEM-100CXII ELECTRON MICROSCOPE，JAPAN

实验方法：将制备的脂质体用蒸馏水稀释10倍左右，用专用铜网取样后用1％的磷钨酸染色，JEM-100CXII型透射电镜下观察粒子形态，见图5。

实施例2

处方二：

按处方量1ml单位计，处方如下：

人表皮生长因子            1mg

卵磷脂                    80mg

胆固醇(药用级)            20mg

氯仿(分析纯)              5ml

磷酸盐缓冲液              1ml

制备工艺参数：

精密称取80mg卵磷脂、20mg胆固醇(PC∶CHOL＝4∶1)溶于5ml氯仿超声(时间2min、频率35kHz)溶解，充分混合后，加入1mlhEGF水溶液(1mg/ml，药质比＝1∶100)，超声约4min混匀后成W/O型乳状液，减压(真空度750mbar、温度35℃)除去有机溶剂，形成胶状物质，再加入1ml磷酸盐缓冲液，超声10min后，得到1ml乳白色均一hEGF纳米脂质体。

制剂样品外观：乳白色均一液体

包封率结果：43.78％。

脂质体形态结果：见图6。

实施例3

处方三：

按处方量1ml单位计，处方如下：

人表皮生长因子            1mg

卵磷脂                    89mg

胆固醇(药用级)            11mg

氯仿(分析纯)              5ml

磷酸盐缓冲液              1ml

制备工艺参数：

精密称取89mg卵磷脂、11mg胆固醇(PC∶CHOL＝8∶1)溶于5ml氯仿超声(时间8min、频率53kHz)溶解，充分混合后，加入1mlhEGF水溶液(1mg/ml，药质比＝1∶100)，超声约6min混匀后成W/O型乳状液，减压(真空度800mbar、温度40℃)除去有机溶剂，形成胶状物质，再加入1ml磷酸盐缓冲液(pH6.8)，超声10min后，得到1ml乳白色均一hEGF纳米脂质体。

包封率结果：31.38％。

实施例4

处方四：

按处方量1ml单位计，处方如下：

人表皮生长因子            1mg

卵磷脂                    178mg

胆固醇(药用级)            22mg

氯仿(分析纯)              5ml

磷酸盐缓冲液              1ml

制备工艺参数：

精密称取178mg卵磷脂、22mg胆固醇(PC∶CHOL＝8∶1)溶于10ml氯仿超声(时间10min、频率60kHz)溶解，充分混合后，加入1mlhEGF水溶液(1mg/ml，药质比＝1∶200)，超声约5min混匀后成W/O型乳状液，减压(真空度850mbar、温度45℃)除去有机溶剂，形成胶状物质，再加入1ml磷酸盐缓冲液(pH6.8)，超声10min后，得到1ml乳白色均一hEGF纳米脂质体。

包封率结果：62.37％。

实施例5

处方五：

按处方量1ml单位计，处方如下：

人表皮生长因子            2mg

卵磷脂                    89mg

胆固醇(药用级)            11mg

氯仿(分析纯)              5ml

磷酸盐缓冲液              1ml

制备工艺参数：

精密称取89mg卵磷脂、11mg胆固醇(PC∶CHOL＝8∶1)溶于5ml氯仿超声(时间3min、频率43kHz)溶解，充分混合后，加入1mlhEGF水溶液(2mg/ml，药质比＝1∶50)，超声约10min混匀后成W/O型乳状液，减压(真空度600mbar、温度35℃)除去有机溶剂，形成胶状物质，再加入1ml磷酸盐缓冲液，超声10min后，得到乳白色均一hEGF纳米脂质体。

包封率结果：37.19％。

实施例6

体外透皮实验

采用逆相蒸发法制备hEGF纳米脂质体，制备得到的脂质体平均粒径为509nm。

1.离体皮肤的制备。

将小鼠断颈处死，先用手术剪将毛发剪短，再用8％的硫化钠进行脱毛，剪下背部皮肤，用手术刀去除皮下脂肪，用生理盐水反复冲洗，置于4℃的生理盐水中保存，备用。使用前用pH 7.4的PBS浸泡30min，再用PBS漂洗至洗液澄明，用滤纸吸干，备用。

2.PBS(7.4)缓冲液的制备。

取磷酸二氢钾1.36g，加0.1mol/L氢氧化钠溶液79ml，用水稀释至200ml，即得。

3.透皮试验。

采用改进的Franz药物透皮扩散试验仪进行试验，接收池容积6.5mL，透皮扩散面积2.8cm²，以PBS(pH 7.4)为扩散介质。将皮肤固定，分别均匀涂布hEGF脂质体，于200r·min^-1、(37±0.5)℃条件下进行试验，分别间隔一定时间取样0.5mL(同时补加等量同温PBS)。

4.皮肤中hEGF残留量的测定。

经皮扩散24h后，取下皮肤，用PBS(pH 7.4)洗去残留的制剂及接收液，再用滤纸吸干表面液体。剪取扩散区域的皮肤，立即称重、剪碎，加入PBS0.5mL，匀浆。然后加入氯仿2mL，涡旋1min，静置24h后，离心(10000r·min^-1)10min，取上清液，备用。沉淀用氯仿2mL反复洗4次，加入PBS萃取，离心后，合并上清液，检测hEGF的含量。进行多次实验取平均值。

实验结果：

皮肤累积透过：(见图7)

皮肤累积贮留量：

hEGF溶液：在t＝5.748时出峰，面积为9443.3，代入标准方程中y＝989817x-21941得到溶液的皮肤累积量为0.0158mg

hEGF脂质体：在t＝5.748时出峰，面积为16679.4，代入标准方程中y＝989817x-21941得到溶液的皮肤累积量为0.0195mg

实施例7

按实施例4工艺制备hEGF纳米脂质体，高压均质后进行粒径测定：

称取5.28g卵磷脂、0.66g胆固醇溶解于50ml氯仿中，超声溶解，加入10mlhEGF水溶液混合超声得到初乳。旋转蒸发除去氯仿得到白色胶状物质，加入20ml磷酸盐缓冲液进行水合，超声10min得到均一乳液。

条件1：在800bar压力下进行高压均质，分别取0次、2次、4次、8次、15次循环样品。

条件2：以相同工艺制备30ml空白脂质体，在500bar压力下进行高压均质，分别取0次、2次、4次、8次、15次循环取样品。

使用马尔文ZS90型Zeta电位/纳米激光粒度仪测定粒径指标得到结果如下：

hEGF包封率高，载药量增加，可以有效保护EGF活性，增加稳定性，提高hEGF的透皮能力和药效。

Claims (9)

1.一种人表皮生长因子纳米脂质体，其特征在于，所述脂质体含有脂质体微囊和包裹于其中的人表皮生长因子，人表皮生长因子与脂质体微囊的质量比为1∶50～1∶200。

2.根据权利要求1所述人表皮生长因子纳米脂质体，其特征在于，所述人表皮生长因子纳米脂质体的粒径为30～800nm。

3.根据权利要求1所述人表皮生长因子纳米脂质体，其特征在于，所述人表皮生长因子纳米脂质体为冻干粉形式。

4.一种制备权利要求1所述人表皮生长因子纳米脂质体的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)将hEGF溶于水中形成水相，将脂质材料溶于有机溶剂中形成油相；所述的有机溶剂是氯仿或乙醚；

(2)在超声条件下，将hEGF水溶液缓慢加入脂质材料油相溶液中，并持续超声形成均一乳白色的初乳；

(3)将初乳置于旋转蒸发仪中，将有机溶剂挥发完全，制成脂质薄膜；

(4)加入磷酸盐缓冲液，将脂质薄膜超声分散，得到均一乳白色混悬液；

(5)将此混悬液进行高压均质循环处理，即得人表皮生长因子纳米脂质体；。

5.根据权利要求4所述制备权利要求1所述人表皮生长因子纳米脂质体的方法，其特征在于，所述步骤(2)的超声频率为30～60kHz，超声时间为2～10min。

6.根据权利要求4所述制备权利要求1所述人表皮生长因子纳米脂质体的方法，其特征在于，所述步骤(3)旋转蒸发的真空度为200～900mbar，温度为30～60℃。

7.根据权利要求4所述制备权利要求1所述人表皮生长因子纳米脂质体的方法，其特征在于，所述步骤(4)的磷酸盐缓冲液pH6.8，具体制法为：取0.2mol/L磷酸二氢钾250ml，加0.2mol/LNaOH溶液118ml，用水稀释至1000ml即得。

8.根据权利要求4所述制备权利要求1所述人表皮生长因子纳米脂质体的方法，其特征在于，所述步骤(5)的高压均质压力为100bar～1000bar。

9.根据权利要求4所述制备权利要求1所述人表皮生长因子纳米脂质体的方法，其特征在于，所述步骤(5)循环处理次数为4～20次，循环时采用冰水浴冷却。

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