WO2007072953A1 - 血液脳関門インヴィトロ・モデル、病態血液脳関門インヴィトロ・モデル、及びこれを用いた薬物スクリーニング方法、病態血液脳関門機能解析方法、病因解析方法 - Google Patents

血液脳関門インヴィトロ・モデル、病態血液脳関門インヴィトロ・モデル、及びこれを用いた薬物スクリーニング方法、病態血液脳関門機能解析方法、病因解析方法 Download PDF

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Shinsuke Nakagawa
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Definitions

  • the present invention relates to the blood-brain barrier (b l o o d— b r a i n b a r r i e r)
  • BBB blood brain barrier in vitro mouth model
  • ⁇ invitroJ or ⁇ in vitro '' means ⁇ in a glass container. '' Latin meaning, and as a biological term, a part of the living body is removed ⁇ ex vivo '' for various research purposes It refers to the state of being released. (See Iwanami Biology Dictionary, Iwanami Shoten, 1 Jan. 10, 998)
  • the present invention relates to a screening system for drugs that pass through the blood-brain barrier and act on the center, drugs that act on the blood-brain barrier itself, or drugs that do not expect the action at the center and move into the brain.
  • the present invention also relates to a blood-brain barrier in vitro model and a drug screening method using a pathologic blood-brain barrier in vitro model.
  • BBB blood-brainbarrier
  • the barrier function of the BBB is typified by tight junctions (tight junctions), which are intercellular adhesion structures of brain capillary endothelial cells, and the selective uptake (transport) mechanism is the energy source of neurons D-dal
  • tight junctions tight junctions
  • transport transport mechanism
  • the course type 1 glucose transporter (GLUT 1) is typical.
  • the barrier function and transport mechanism are also closely related to each other. For example, P-glycoprotein, which is structurally a member of a group of ABC transporters, acts as a pump. Tight junctions are also responsible for transport of small molecules selective to cations rather than anions (paracellular patch hway).
  • This unique BBB function maintains the homeostasis of nerve cells, but because of its existence, it becomes a major obstacle when trying to artificially apply some kind of treatment to the living body due to disease or other causes. Yes. It is a major barrier to the development of preventive and therapeutic drugs for central nervous system diseases (dementia, Alkheimer's disease, prion disease, stroke, etc.) that are urgently developed, and are effective in in vitro and cell culture experiments. Drug candidate compound Even if they are administered to living organisms such as laboratory animals, many of them cannot be transferred into the brain due to BBB, and cannot be used as actual therapeutic drugs, so they have to give up development.
  • the invitro BBB model has significant advantages. By optimizing the culture conditions, the disease state can be easily reproduced. Cerebral capillary endothelial cells that surround the central nervous system and protect homeostasis are related to various central nervous system diseases, and BBB dysfunction has recently been revealed one after another. ing.
  • the blood-brain barrier (b 1 ood- brainbarrier, BBB) is the site responsible for the onset of brain edema, and the release of the tit junction causes leakage of plasma proteins into the brain. Accumulation of water and electrolytes due to dysfunction such as transporters such as acid and aquaporins in the water channel develops the pathology (angiogenic brain edema).
  • the in vitro BBB model that reproduces the complex BBB in vivo is effective, as in the case of the drug-in-brain migration screening described so far.
  • the pathological environment can be easily reproduced and applied to pathogenesis analysis research.
  • the BBB drug permeability under the pathological condition is changing, and it is important to determine the drug permeability during the pathological condition.
  • the anatomical entity of the blood-brain barrier is tightly bound brain capillary endothelial cells, but it has been shown that perisite is closely involved in its function and maintenance.
  • perisite In vitro culture of brain capillary endothelial cells and astrosaids a1 ka 1 inephosphatase activity, ⁇ — glutamy ltranspeptidase activity increase, membrane resistance
  • Blood brain barrier functions such as elevation, enhancement of tight junction, expression of P-glycoprotein (S obueetal., 1 999; Maxw elleta 1., 1 987; S tannesseta 1., 1 99 7; F enarteta 1 1 998)
  • P-glycoprotein S obueetal., 1 999; Maxw elleta 1., 1 987; S tannesseta 1., 1 99 7; F enarteta 1 1 998
  • BBB tight junction proteins that are functional molecules of BBB. It is localized on the vascular endothelial cell luminal side (apical membrane lipid) and is the essential feature of the barrier function. Among them, Claudin (c 1 audin, Furuse et al.), Okunoretain (occludin, Furuse et al.), And ZO (zonu 1 aoccludens)-1 were found to be the main proteins of the barrier function. did.
  • the BBB tight junction is a barrier that separates the peripheral tissues (inside the brain capillaries) and the central nervous system (inside the brain parenchyma), but the luminal side membranes (brain side membranes) of the cerebral capillary crust cells facing different environments.
  • Apica 1 membrane lipid to contribute to the basal membrane side membrane (ba S o 1 atera 1 membrane lipids) asymmetric arrangement of functional molecules, such as transporters are located in the boundary of the (polarity, Thailand close Yankushiyon Fence function).
  • functional molecules such as transporters are located in the boundary of the (polarity, Thailand close Yankushiyon Fence function).
  • it is also a functional molecular unit responsible for intercellular transport (parace 1 1 u 1 artransport) of low-molecular substances that are selective for cationic substances.
  • MUP P 1 mi 1 ti 1 P, DZ doma inprotein
  • cAMP which is known as an enhancement factor
  • brain capillary endothelial cells that surround the central nervous system and protect homeostasis are related to various central nervous system diseases, and BBB dysfunction has recently been associated with the onset or pathological progression of the disease. It is revealed one after another. It is also important here that the blood-brain barrier in the body is composed of brain capillary endothelial cells, perisite, and astrocytes, and each cell has various effects under various pathological conditions. It is that you are. Incomplete BBB models that do not have BBB constituent cells, such as endothelial cells alone or endothelial cells and at-site co-culture systems, do not sufficiently reproduce BBB at the time of disease.
  • one object of the present invention is to move into the brain with a drug that acts on the center through the blood brain barrier, or a drug that acts on the blood brain barrier itself, or a drug that does not expect the action at the center. It is to provide a drug screening system. Another object of the present invention is to enable pathological analysis research and the above screening under pathological conditions by loading the screening system with various pathological environments.
  • the inventor of this application has conducted extensive research and succeeded in developing a blood-brain barrier model that closely approximates the living body and has a high degree of tight junction by co-culturing primary cultured brain capillary endothelial cells, perisite, and astrocytes. did.
  • the purpose of the present invention is the blood-brain barrier in vitro model according to the present invention described in claim 1, that is, a culture solution, a plate for holding the culture solution, a soaked in the culture solution, and the plate
  • a three-dimensional culture device comprising a filter arranged without contacting the bottom surface of the tube, the filter has many holes with a diameter of 0.35 to 0.4, and the primary cultured brain capillaries on the top surface of the filter Inoculate endothelial cells, seed the primary culture brain perisite on the lower surface of the filter, seed the primary culture on the inner surface of the plate, and co-culture with the normal culture medium. 'Achieved by the model.
  • the object is to provide a pathologic blood-brain barrier in vitro model according to the present invention according to claim 2, that is, a culture solution, a plate holding the culture solution, a dipping in the culture solution, and the A three-dimensional culture apparatus comprising: a filter disposed without contacting the bottom surface of the plate, and the filter has a large number of holes having a diameter of 0.35 to 0.45 / zm, and the top surface of the filter Seed the primary cultured brain capillary endothelial cells, seeded the primary cultured brain perisite on the lower surface of the filter, seeded the primary cultured astrocytes on the surface of the plate, and co-cultured with the culture solution corresponding to the specified pathological condition. It is also achieved by the in vitro model of the pathological blood-brain barrier in culture. .
  • the blood brain barrier in vitro model according to claim 1 is used, a drug is added to the upper part of the filter, and after a certain time, the filter Discloses a method for evaluating the ease of passage of a drug through the blood-brain barrier, which is performed by measuring the amount of the drug leaking to the lower part of the blood vessel.
  • a drug is added to the upper part of the filter, and after a certain period of time.
  • the present invention discloses a method for screening and evaluating drugs by collecting brain capillary endothelial cells, evaluating the properties of brain capillary endothelial cells after the addition of the drug, and comparing the properties with the properties of brain capillary endothelial cells before the addition. ing.
  • cultured brain capillary endothelial cells, brain perisite in the pathological blood-brain barrier in vitro model according to claim 2 and The pathological blood brain is compared to a cultured brain capillary endothelial cell, brain brain site, and astrocyte in the blood brain barrier in vitro model according to claim 1, respectively.
  • Disclosed is a method for analyzing the pathology of the barrier. '
  • cultured brain capillary endothelium, brain pericyte, and astrocyte in the pathological blood-brain barrier in vitro model according to claim 2 Is compared with the cultured brain capillary endothelial cells, brain perisite, and astrocyte in the blood-brain barrier in vitro model according to claim 1, respectively.
  • a method is disclosed.
  • cultured brain capillary endothelial cells, brain pericytos, and brain in the pathological blood-brain barrier in vitro model according to claim 2 A drug at the pathological blood-brain barrier, wherein the first mouth site is compared with the cultured brain capillary endothelial cells, brain pellet, and astrocyte in the blood-brain barrier in vitro model according to claim 1.
  • a drug at the pathological blood-brain barrier, wherein the first mouth site is compared with the cultured brain capillary endothelial cells, brain pellet, and astrocyte in the blood-brain barrier in vitro model according to claim 1.
  • brain capillary endothelium cells are seeded on a porous filter, a pericite is seeded on the back side of the filter, and an astrocyte is seeded on the inside of a plate serving as a filter tray.
  • a pericite is seeded on the back side of the filter
  • an astrocyte is seeded on the inside of a plate serving as a filter tray.
  • the present invention is an invitro BB Dell that is most similar to the living body, it is possible to efficiently develop a central nervous system drug that is currently being developed (a drug that acts on the center through the blood-brain barrier). become.
  • the present invention is a screening system for drugs that do not expect a central action and moves into the brain, it can contribute to the development of appropriate drug therapy and the development of new drugs. It is also useful for screening drugs that act on the blood-brain barrier itself.
  • FIG. 1 is an explanatory diagram showing various co-culture preparation methods.
  • Fig. 2 is a microscopic photograph for comparing primary cultured brain capillary endothelial cells with immortalized brain capillary crust cells.
  • Figure 3 is a graph showing the effect of cAMP on R B E C and G P 8.3.
  • FIG. 4 is a graph showing changes over time in the measurement results of transendothelial resistance for seven types of co-culture models prepared by the method shown in Example 4.
  • FIG. 5 is a graph comparing the measurement results of transdermal electrical resistance values for seven types of co-culture models prepared by the method shown in Example 4.
  • Fig. 6 shows the tannule composition of the tit junction in seven types of co-culture models prepared by the method shown in Example 4. It is a photograph showing the expression of the structure (o c c l u d i n, c l a u d i n—5, ZO-1).
  • FIG. 7 is a graph showing the electrical resistance value in the ischemia reperfusion model.
  • Figure 8 shows that ischemia-reperfusion injury (decrease in electrical resistance) was exacerbated by co-culture. It is a graph to show.
  • Fig. 9 is a graph showing that ischemia-reperfusion injury (increased NaF permeability) was exacerbated by co-culture.
  • FIG. 10 is a graph showing the effect of radical scavenger edaravone in the ischemia reperfusion BB model. '
  • FIG. 11 is a schematic diagram of an embodiment of a blood brain barrier in vitro model according to the present invention.
  • BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION Primary cultured brain capillary endothelial cells, primary cultured brain perisite, and primary cultured astrocytes are co-cultured in a three-dimensional culture apparatus containing a porous filter.
  • the blood brain barrier in vitro model of the present invention is obtained.
  • the blood brain barrier in vitro mouth model of the present invention has a highly developed tit junction, and is a reconstructed system of the blood brain barrier that more closely resembles a living body.
  • FIG. 11 is a schematic diagram of an embodiment of the blood brain barrier in vitro mouth model according to the present invention.
  • the culture solution 4 is accommodated in the container 3 and the filter 2 is immersed in a predetermined position in the culture solution 4 by the hanger 1 that suspends the filter 1.
  • the upper part of the filter 2 having many holes 2 a having a diameter of 0.4 ⁇ m is assumed as the blood vessel cavity side 10, and the lower part is assumed as the brain parenchyma side 20. That is, the primary cultured brain capillary endothelial cell E is seeded on the surface of the filter 2, the primary cultured brain pellet P is seeded on the back side of the filter 2, and the primary cultured astrocyte A is seeded below the filter 1.
  • the structure reproduces the blood-brain barrier in the living body best.
  • the porosity of the filter 2 allows crosstalk between the three types of cells, and it is also possible to reproduce the maintenance and regulation mechanism of the blood-brain barrier in a complex living body.
  • a diseased BBB kit can be easily prepared by changing the culture conditions of the BBB kit. That is, a BBB kit was prepared by changing the culture solution 4 of the BBB kit to actual pathological conditions, and changes in brain capillary endothelial cells E, pericytic P, and astrocyte A in this pathological BBB kit were By comparing with those cultivated in the culture medium, it is possible to determine the pathological analysis of BBB, the reactivity of the drug under the pathological condition, and the brain transferability.
  • Brain capillaries were seeded 3 7 ° C, 5% C02, 9 5% 20% Plasma derived urn (PD S) -DMEM / F 1 2 in b FGF (1 mg ZmL; B oehringer Manheim), heparin (1 0, 0 x g'ZmL; S i gma ) ⁇ genta ma cin (50 ⁇ g / m ', manufactured by Sigma), puromy cin (4 ⁇ g / mL; manufactured by Sigma)' in a culture solution (RBEC culture solution 1) Brain capillary endothelial cells were cultured for 2 days.
  • the brain capillary piece of Example 1 contains several percent perisite. Therefore, brain capillary vessels were seeded on collagen-coated dishes, and 10% fetalbovineserum (FBS) at 37 ° C, 5% C02 / 9 5% in the atmosphere — gentamacin (50 ⁇ g / mL) in DMEM. The perisite was grown by culturing in the added culture for one week. At this stage, brain capillary endothelial cells and perisite are mixed.
  • FBS fetalbovineserum
  • Subculture with 1 X trypsin-EDTA solution re-inoculate into a new 75 cm 2 flask, and once confluent, infiltrate again at 20 rpm for 1 hour to float and remove microglia to obtain astrocytes .
  • FIG. 1 is an explanatory diagram showing various co-culture preparation methods.
  • the brain capillary endothelial cells, perisite, and atlassite obtained in Example 1 were prepared using the registered trademark Transwe 1 1 (Corning Co., Ltd., 0.4 xmporesize) and the following various co-culture models were prepared. Produced.
  • Trans we ll Insa's polyester membrane surfaces were coated with col 1 agen (0. I mgz ml, fibronect ⁇ ne (0.1 mg ZmL) and placed in a dish upside down. 2. 0 X 104c e 1 l / cm2) was sown and cultivated for more than 6 hours.
  • the registered trademark Transwe 1 1 insert was installed in we 1 1 of 1 2_we llcu 1 ture pre- 5% C02 / 95%
  • 10% FBS—DMEM was cultured overnight with gent ama cin (50 ⁇ g / mL) and replaced with RBEC medium 2 the next day, as shown in (i) In this way, brain capillary endothelial cells E were seeded on the inside of a registered trademark Transwe 11 Insula.
  • Flavored JL3 ⁇ 43 ⁇ 41 is coated with poly-L-lysine solution and seeded with astrocyte A (1 0 X 1 05c e 1 I / cm 2) 3 7 ° C, 5% C02 / 9 Cultivation was performed overnight in a culture in which genta ma cin (50 ⁇ g Zm L) was added to 10% FBS-DMEM in 5% air.
  • po 1 yestermembrane [ti] [6 3 ⁇ 4r co 1 1 agen, 0.1 mg / 1), fibronectine (0.
  • Example 1 RBEC obtained in Example 1 and GP 8.3 obtained in Example 4 were seeded in 8-well culture slides with l X l OSc'e ll Zcm 2, and after 3 days, the culture solution was Removed and washed twice with PBS (—no). After washing, the mixture was fixed with 3% paraformaldehyde for 10 minutes at room temperature. Thereafter, it was treated with 0.2% triton-X solution for 10 minutes at room temperature. Treatment with 3% H202 solution for 3 minutes removed endogenous peroxidase activity. After washing twice with PBS (—no), blocking was performed with a 3% B SA-PBS (— / one) solution at room temperature for 30 minutes.
  • RBEC obtained in Example 1 of cell culture and GP 8.3 obtained in Example 4 were seeded on 8_wellcultureslide in 1 ⁇ 105 cell Zcm2 and cultured for 3 days.
  • the culture solution was removed and washed twice with PBS (—No). After washing, it was fixed with 3% paraformaldehyde for 10 minutes at room temperature. Thereafter, it was treated with 0.2% triton-X solution at room temperature for 10 minutes. After washing twice with PB S (— / —), it was blocked with a 3% B SA—PB S (— / one) solution at room temperature for 30 minutes. 0.
  • FIG. 2 is a microscopic observation photograph for comparing primary cultured brain capillary endothelial cells with immortalized brain capillary endothelial cells.
  • RBEC primary cultured brain capillary endothelial cells
  • TEER immortalized brain capillary endothelial cells
  • N a-F permeability Fig. 3
  • the culture solution was removed and washed twice with PBS (— / one).
  • we 1 1 in the lower part of the En contains assay buffer PBS (+ / +); Sigma, dg lucorse (4.5 mg / ml); Wako Pure Chemical Industries, HE PES ( 1 OmM); S i gma was filled with 1.5 mL. 1 ⁇ ⁇ g / m L sodi um—fluorescein (Na— F); assay buffer (0.5 mL) containing Sigma was added to the top of the insert (vessel side), and a new we every 20 minutes. 1 Moved the insert to 1.
  • the fluorescence intensity of the sample was measured using a fluorometer (manufactured by Shimadzu) (excitation wavelength: 485 nm, fluorescence wavelength: 530 nm), and the Na F concentration was calculated from the calibration curve. Clearance and permeability (P) were calculated according to De houck, I sobe et al. (D ehoucketa 1., 1 992; I sobeeta 1., 1 996).
  • Permeability coefficient (cm / min) ltl / ⁇ Sapper l / PSmembrane + l / PS trans.
  • PS is the slope of the straight line plotting clearance against time, and represents (transmission coefficient X (membrane surface area)
  • P app is the apparent transmission coefficient
  • P trans is the true transmission coefficient
  • Pmemb rane Represents the transmission coefficient of membrane only
  • Figure 3 is a graph showing the effect of cAMP on RB EC and GP 8.3. It was found that the resistance was high and the permeability of Na-F was low, and the enhancement of the tit junction function by cAMP observed in RB EC was not confirmed in GP8.3.
  • Example 6 Example 6 '
  • Fig. 4 is a graph showing the daily changes in the transdermal electrical resistance measurement results for the seven types of co-culture models produced by the method shown in Example 4, and Fig. 5 is produced by the method shown in Example 4.
  • 7 is a graph comparing the measurement results of transendothelial electrical resistance values for the seven types of co-culture models.
  • Transendothelium electrical resistance (TERs) was measured by ENDO HM (manufactured by WPI).
  • the electrical resistance value of each BBB model was measured from 2 days to 7 days after the model was created. For E 00, E0A, and E 0 P, the electrical resistance value of the membrane only, and for EA0, EAP, only the astrocyte was cultured.
  • EP 0 and EPA were calculated by subtracting the electrical resistance of membranes cultured only on the perisite.
  • EAA brain capillary endothelial cell monolayer culture system
  • EO P brain capillary endothelial cells and the pericytes
  • FIG. 6 is a photograph showing the expression of tit junction proteins (occludin, claudin-5, ZO-1) in seven types of co-culture models prepared by the method shown in Example 4. 6
  • Transwe 1 1 was used to make each BBB model. Three days later, the culture solution was removed, and the plate was washed twice with PBS (-/-). After washing, the cells on the back side were removed with a scalpel to remove the cells attached to the back side of the membrane. Thereafter, 300 ⁇ L of a cell lysate prepared by adding protease inhibitor (Sigma) to Ce 1 Lytic-M (S′igma) was added, and incubated on a shaker for 20 minutes.
  • protease inhibitor Sigma
  • the cell lysate was collected and centrifuged at 12,000,000 Xg for 15 minutes. The supernatant was collected, a part was used for protein quantification, and the rest was used as a sample.
  • the sample was added with Tris-HCl-5X sample buffer containing SDS and 2-mercaptoethanol, heat-treated at 95 ° C for 5 minutes, and stored at –80 ° C. The amount of protein in each sample was measured and separated by SDS-polyacrylamide electrophoresis (SDS-PAGE) so that the amount of protein was the same.
  • SDS-PAGE SDS-polyacrylamide electrophoresis
  • Cell culture endothelial cell monolayer culture system (E00) shown in (i) and (vi) of Example 5 of cell culture was contacted with brain capillary endothelial cells and perisite.
  • a co-culture system (EPA) with no astrocytes was prepared.
  • the prepared model was washed once with PBS (-/-) and then bubbled with nitrogen gas for 5 minutes. G 1 ucosefree.
  • K rebs— Ring buffer (143 mM N a C and 4.7 mM KC 1, 1.3) mM C a C 12, 1.2 mM Mg C 12, 1.0 mM N a H2P04, 25 mM N a HC03, 1 1 mM sucrose (all Wako Pure Chemicals) l OmM HEPES (S i gma) , PH 7.4), placed in Anerocult® A mini and incubated for 6 hours (ischemic period).
  • FIG. 7 is a graph showing the effect of radical scavenger edallabon in the ischemia-reperfusion BB model.
  • An ischemia reperfusion BB model was prepared by the method described above, and the effect of edaravone was examined.
  • Edaravone a radical scavenger, was added at the end of the ischemic period.
  • the decrease in the tit junction function (decreased TEER, increased NaF permeability) during ischemia-reperfusion was significantly suppressed by edaravone administration.

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Abstract

血液脳関門を通過して中枢に作用する薬物、あるいは血液脳関門自体に作用する薬物、あるいは中枢での作用を期待しない薬物で脳内に移行する薬物のスクリーニング系を提供することである。また、本発明の他の目的は、このスクリーニング系に様々な病態環境を負荷することで病態下における病因解析研究や上記スクリーニングを可能とすることである。培養液と、当該培養液を保持するプレートと、当該培養液に浸漬し、かつ、当該プレートの底面に接触しないで配置されたフィルターと、からなる立体培養装置を用い、当該フィルターが直径０．３５～０．４５μｍの穴を多数有し、当該フィルターの上面に初代培養脳毛細血管内皮細胞を播き、当該フィルターの下面に初代培養脳ペリサイトを播き、当該プレートの内面に初代培養アストロサイトを播き、通常の培養液で共培養してなる、血液脳関門インヴィトロ・モデルである。

Description

血液脳関門インヴィ トロ ·モデル、 病態血液脳関門インヴィ トロ ·モデル、 及 びこれを用いた薬物スクリーニング方法、 病態血液脳関門機能解析方法、'病因 解析方法
技術分野 本発明は、 血液脳関門 （b l o o d— b r a i n b a r r i e r)
(—般に、 「BBB」 と略して呼ばれている。） i n V i t r oモデル及び病態 血液脳関門インヴィ ト口 ·モデルに関する。
Γ i n v i t r o.J あるいは 「インヴィ トロ」 とは、 「ガラス容器の中で」 と いう.意味のラテン語で、 生物学用語としては種々の研究目的のために生体の一 部分が 「生体外に」 摘出 ·遊離されている状態をさす。 （岩波生物学辞典、 岩波 書店、 1 998年 1 1月 10日、 参照）
すなわち、 血液脳関門を通過して中枢に作用する薬物、 あるいは血液脳関門 自体に作用する薬物、 あるいは中枢での作用を期待しない薬物で脳内に移行す る薬物のスクリーニング系に関する。
また、 本発明は、 血液脳関門インヴィ トロ ·モデル及び病態血液脳関門イン ヴィ トロ ·モデルを用いた薬物スクリーニング方法に関する。 すなわち、 本発 明の血液脳関門インヴィ トロ 'モデルあるいはスクリーニング系に様々な病態 環境を負荷することで病態下における病因解析研究や上記スクリーニングを可 能とする。 背景技術 血液脳関門 （b l o o d— b r a i n b a r r i e r ； BBB) は、 繊細 な神経細胞が生きる、 脳という特異な環境における神経細胞の生存と活動のた めに進化した環境整備機構である。 血液から中枢神経系への物質の侵入の遮断 (関門） と取り込み （輸送） という二律背反を、 その構成単位である脳毛細血 管内皮細胞、 ァストロサイ ト （星状膠細胞） およびペリサイ ト （周皮細胞） の 3種類の細胞が機能的に一体となって克服した高度機能分化システムというこ とができる。 B B Bの関門機能は脳毛細血管内皮細胞の細胞間接着構造である タイ 卜ジャンクション （ t i g h t j u n c t i o n, 密着結合） に代表さ れ、 選択的な取り込み （輸送） 機構は神経細胞のエネルギー源である D—ダル コースの 1型グルコース トランスポ一ター （GLUT 1) が代表的である。 関 門機能と輸送機構はまた相互に密接に関連し合っていて、 例えば構造的に一群 の輸送分子群 （ABC t r a n s p o r t e r) の一員である P—糖タンパ ク （P—g l y c o p r o t e i n) はくみ出しポンプとして関門機能を担つ ているし、 タイ トジャンクションも陰イオンよりも陽イオンに選択的な低分子 輸送を担っている（細胞間隙輸送 p a r a c e l l u l a r p a t hwa y )。 タイ 卜ジャンクションが密に存在すること、 選択的な取り込みを担う担体 （ト ランスポーター） やイオンチャネルなど経細胞性輸送 （t r a n s c e 1 1 u 1 a r p a t hwa y) を担う輸送分子が管腔側 （a p i c a l 膜脂質） と基底膜側細胞膜 （b a s o l a t e r a l 膜脂質） において非対称的に分 布すること （極性） I BBBの機能的本態である。
この特異な BBB機能により、 神経細胞の恒常性は保たれているが、 その存 在のために、 疾病などの原因で人工的に生体に何らかの処理を施こそうとする 場合に大きな障害となっている。開発が急がれてレ、る中枢神経性疾患 (認知症、 アルクハイマー病、 プリオン病、 脳卒中など） の予防薬 ·治療薬開発の大きな 障壁となっており、 試験管内や細胞培養実験で作用が発見された薬物候補化合 物であっても、 実験動物など生体に投与すると、 その多くは BBBのために脳 内に移行できず、 実際の治療薬になり得ず、 開発を断念せざるを得なくなって いる。
一方、 多剤併用療法が主流になった現在、 ほとんど脳内に移行しないと考え られる薬物が、 薬物相互作用により脳内に移行し、 中枢性の副作用の原因にな ることも予想される。 '
以上のように、 薬物の BBB透過性の予測は非常に重要であるが、 BBBの 特異な機能のために、 脳内への移行性には一定の法則性が無く、 薬物の化学構 造や分子量などから予め判断できない。 薬物の脳内移行性を動物実験で検討す るには、 膨大な手間と費用がかかるだけでなく、 複雑な生体内で薬物の移行性 だけを正確に判断する事は困難である。 また、 動物実験で使用する薬物量は、 i n V i t r oに比べ多くの量が必要になり、 リード化合物の段喈で動物実 験に耐えうる化合物量を確保することは、 更なる時間と費用が必要になり現実 的ではない。 よって、 脳内で作用する薬物の新規開発、 および適正な薬物治療 のためには、 我々生体の複雑な BBBと、 近似的な機能を持つ試験管内再現シ ステムを用いて薬物の透過性を予測することが必要である。 脳内移行性を簡便 に検定する検査キッ卜があれば、 現在、 膨大な費用と時間をかけて行われてい る創薬研究の効率化が図られ、 より即応的で確実な創薬のスクリーニングシス テムが達成できる。
更に、 i n v i t r o B B Bモデルには大きな利点がある。 その培養条 件を最適化することにより、 病態を容易に再現できることである。 中枢神経を 取り巻き、 恒常性を守る脳毛細血管内皮細胞は、 様々な中枢神経性疾患と関係 があり、 BBBの機能障害が、 発症あるいは病態進行に密接に関与する疾患が 最近次々に明らかにされている。 例えば、 血液脳関門 （b 1 o o d— b r a i n b a r r i e r, BBB) は、 脳浮腫発症の責任部位であり、 タイ トジ ヤンクションの離開によって血漿タンパクが脳内への漏出し、 N a+、 グルタミ ン酸などの輸送体や水チャネルのアクアポリンなどの機能障害による水と電 解質の貯留が生じ病態を進展させる（血管原生脳浮腫)。 病態での B B B機能の 解析には、 これまで述べてきた薬物脳内移行性スクリーニングと同様に、 複雑 な生体内の BBBを再現した i n v i t r oの B B Bモデルが力を発揮する。 即ち i n v i t r o B B Bモデルの培養環境を変化させることにより、 容 易に病態環境を再現でき、 病因解析研究に応用できる。
また、 病態下における BBB薬物透過性は変化していると考えられ、 病態時 における'薬物透過性を判定することも重要である。
血液脳関門の解剖学的な実体は密着結合した脳毛細血管内皮細胞であるが、 その機能と維持にはァストロサイ トゃペリサイトが密接に関与していることが 明らかとなった。 I n V i t r oにおいて脳毛細血管内皮細胞とァストロサ ィ ドを共培養すると、 脳毛細血管內皮細胞に特異的な酵素である a 1 k a 1 i n e p h o s p h a t a s e活性、 γ — g l u t amy l t r a n s p e p t i d a s e活性の上昇 、 膜抵抗の上昇 、 t i g h t j u n c t i o n の増強 、 P糖蛋白質の発現 （S o b u e e t a l ., 1 999 ;Ma xw e l l e t a 1. , 1 987 ； S t a n n e s s e t a 1. , 1 99 7 ； F e n a r t e t a 1 1 998 )、 などの血液脳関門機能に特異的 な機能が増強するとの報告がありァストロサイ トの重要性を示している。 一方 で、 ペリサイ トの血液脳関門に果たす役割は不明な点が多いが、 近年になりべ リサイ トが BBBにおいて重要な役割をしている事が報告されている。
I n V i t r oにおいて血管内皮細胞とペリサイ トを共培養すると、 膜抵 抗が増強する （De n t e e t a l .， 2001) との報告は、 ペリサイ ト が血液脳関門の維持機構を構成する素子としての重要性を示すものである。 即 ち、 高度機能分化システムである BBBは、 内皮細胞単独では形成できず、 内 皮細胞、 ァストロサイ ト、 ペリサイ 卜の 3種細胞のクロストークにより初めて 構成され得ると考えられ、 これら 3種細胞を考慮したモデルが必要である。 し かし、これまでの BBB i n v i t r oモデルは、内皮細胞単層培養系や、 内皮細胞とァストロサイ 卜との共培養系などの不完全なモデルしか報告されて いない。
最近の研究成果により、 BBBの機能分子であるタイ トジャンクション構成 タンパク質群が明らかになった。血管内皮細胞管腔側（a p i c a l 膜脂質） に局在し関門機能の本態である。その中でも、クローディン（c 1 a u d i n、 F u r u s eら)、 ォクノレテイ ン (o c c l u d i n、 F u r u s eら)、 およ び Z O (z o n u 1 a o c c l u d e n s) - 1などが、 関門機能の主要な タンパク質である事が判明した。 BBBタイ トジャンクションは、末梢組織（脳 毛細血管内） と中枢神経系 （脳実質内） という異空間を隔てる関門であるが、 異なる環境にそれぞれ面した脳毛細血管內皮細胞の管腔側膜 （a p i c a 1膜 脂質） と基底膜側細胞膜 （b a S o 1 a t e r a 1膜脂質） の境界に位置して いて輸送体などの機能分子の非対称的な配列に寄与している （極性、 タイ トジ ヤンクシヨンのフェンス機能)。 また関門であると同時に、陽イオン性物質に選 択性のある低分子物質の細胞間隙輸送（p a r a c e 1 1 u 1 a r t r a n s p o r t ) を担う機能分子単位でもある。 事実、 細胞内でのシグナル伝達分子 との結合を介在する新しい PDZタンパクである MUP P 1 (mu 1 t i一 P, D Z d oma i n p r o t e i n) が発見され、 タイ トジャンクションは 従来考えられていたような静的な固定的な関門では無く、 細胞内情報伝達機構 という動的，機動的な機能分子であることが明らかにされつつある。 即ち、 B B B i n v i t r oモデルにおいて、タイ トジャンクション機能が保たれて いることは、 必要不可欠であるが、 これまで、 その利便性より用いられてきた 不死化脳毛細血管内皮細胞株は、 このタイ トジャンクション機能が保たれてい るか疑問がもたれる。 また、 関門機能だけではなく、 細胞極性の不保持、 薬物 への細胞応答などが不十分であると考えられる。 事実、 ラット不死化脳毛細血 管内皮細胞を用いた検討によると、 タイ トジャンクションタンパク質が、 細胞 一細胞間に集積しておらず、 電気抵抗値も非常に低い事が分かった。 よって、 不死化脳毛細血管内皮細胞を用いた血液脳関門モデルは不完全なモデルであり 正常な B B Bを反映していない。
また一方で、 内皮細胞のタイ トジャンクション機能を維持するために、 その 亢進因子として知られる c AM Pを細胞培養液に添加するモデルが報告されて いるが、 生理的なモデルと言い難く、 特に c AM Pを変動させる薬物のスクリ —エングにおいて、 問題があると考えられる。
また、 、中枢神経を取り巻き、 恒常性を守る脳毛細血管内皮細胞は、 様々な中 枢神経性疾患と関係があり、 B B Bの機能障害が、 発症あるいは病態進行に密 接に関与する疾患が最近次々に明らかにされている。ここでも重要となるのが、 生体の血液脳関門は、 脳毛細血管内皮細胞、 ペリサイ ト、 ァストロサイ トによ り構成されていて、 様々な病態下ではそれぞれの細胞が様々な影響を及ぼし合 つていることである。 内皮細胞単独、 あるいは内皮細胞とァス トロサイ トの共 培養系など、 B B B構成細胞がそろっていない不完全な B B Bモデルでは、 病 態時の B B Bを十分には再現していないと考えられる。 発明の開示 よって、本発明の 1つの目的は、血液脳関門を通過して中枢に作用する薬物、 あるいは血液脳関門自体に作用する薬物、 あるいは中枢での作用を期待しない 薬物で脳内に移行する薬物のスクリーユング系を提供することである。 また、 本発明の他の目的は、 このスクリーニング系に様々な病態環境を負荷すること で病態下における病因解析研究や上記スクリーニングを可能とすることである。 本出願の発明者は鋭意研究を行い、 初代培養脳毛細血管内皮細胞、 ペリサイ ト、 ァストロサイ トを共培養することにより、 生体に近似し、 高度な密着結合 を有する血液脳関門モデルの開発に成功した。 上記目的は、 請求項 1に記載の本発明に係る血液脳関門インヴィ トロ 'モデ ノレ、 すなわち、 培養液と、 当該培養液を保持するプレートと、 当該培養液に浸 漬し、 かつ、 当該プレートの底面に接触しないで配置されたフィルターと、 か らなる立体培養装置を用い、 当該フィルターが直径 0 . 3 5〜0 . 4 の 穴を多数有し、 当該フィルターの上面に初代培養脳毛細血管内皮細胞を播き、 当該フィルタ一の下面に初代培養脳ペリサイ トを播き、 当該プレートの内面に 初代培養ァス トロサイ トを播き、 通常の培養液で共培養してなる血液脳関門ィ ンヴィ ト口 'モデルによって、 達成される。
また、 上記目的は、 請求項 2に記載の本発明に係る病態血液脳関門インヴィ トロ ·モデル、 すなわち、 培養液と、 当該培養液を保持するプレートと、 当該 培養液に浸漬し、 かつ、 当該プレー卜の底面に接触しないで配置されたフィル ターと、 からなる立体培養装置を用い、 当該フィルタ一が直径 0 . 3 5〜0 . 4 5 /z mの穴を多数有し、 当該フィルターの上面に初代培養脳毛細血管内皮細 胞を播き、 当該フィルターの下面に初代培養脳ペリサイ トを播き、 当該プレー トの內面に初代培養ァストロサイ トを播き、 所定の病態条件に対応する培養液 で共培養してなる、 病態血液脳関門インヴィ トロ ·モデルによって、 も達成さ れる。 .
本発明の好ましい実施態様においては、 請求項 3に記載のように、 請求項 1 に記載の血液脳関門インヴィ トロ 'モデルを用い、 フィルターの上方部に薬物 を添加し、 一定時間後に、 当該フィルターの下方部に漏れ出た、 当該薬物の量 を測定して行う、 薬物の血液脳関門通過容易性評価方法を開示している。 本発明の他の好ましい実施態様においては、 請求項 4に記載のように、 請求 項 1に記載の血液脳関門インヴィ ト口 'モデルを用い、 フィルターの上方部に 薬物を添加し、 一定時間後に、 脳毛細血管内皮細胞を採取し、 当該薬物添加後 の脳毛細血管内皮細胞の性質を評価し、 添加前の脳毛細血管内皮細胞の性質と 比較して行う、 薬物のスクリーニング評価方法を開示している。 本発明のさらに他の好ましい実施態様においては、請求項 5に記載のように、 請求項 2に記載の病態血液脳関門インヴィ トロ 'モデルにおける培養脳毛細血 管内皮細胞、 脳ペリサイ ト、 及ぴァス ト口サイ トを、 それぞれ、 請求項 1に記 載の血液脳関門インヴィ トロ ·モデルにおける培養脳毛細血管内皮細胞、 '脳ぺ リサイ ト、 及びァストロサイ 卜と比較じて行う、 病態血液脳関門の病態解析方 法を開示している。 '
本発明の別の好ましい実施態様においては、 請求項 6に記載のように、 請求 項 2に記載の病態血液脳関門インヴィ トロ ·モデルにおける培養脳毛細血管内 皮細胞、 脳ペリサイ ト、 及びァストロサイ トを、 それぞれ、 請求項 1に記載の 血液脳関門インヴィ トロ ·モデルにおける培養脳毛細血管内皮細胞、 脳ぺリサ ィ ト、 及びァストロサイ 卜と比較して行う、 病態血液脳関門における薬物の反 応性評価方法を開示している。
本発明のさらに別の好ましい実施態様においては、請求項 7に記載のように、 請求項 2に記載の病態血液脳関門インヴィ トロ ·モデルにおける培養脳毛細血 管内皮細胞、 脳ペリサイ ト、 及ぴァスト口サイ トを、 それぞれ、 請求項 1に記 載の血液脳関門インヴィ トロ ·モデルにおける培養脳毛細血管内皮細胞、 脳ぺ リサイ ト、 及びァストロサイ 卜と比較して行う、 病態血液脳関門における薬物 の脳移行性評価方法を開示している。 (作用）
請求項 1に記載の本発明においては、 多孔質のフィルター上に脳毛細血管内 皮細胞を播き、 フィルタ一裏側にペリサイ トを播き、 フィルターの受け皿であ るプレートの内側にァストロサイ トを播くことで、 3種細胞間のクロストーク が可能となり、生体に近似した血液脳関門 i n V i t r oモデルが完成した。 また、 請求項 2に記載の本発明においては、 上記血液脳関門インヴィ トロ · モデルに様々な病態環境を負荷することにより病態血液脳関門ィンヴィ トロモ デルを得た。
本発明は生体に最も近似した i n v i t r oの B B デルであるから、 現在開発が急がれている中枢神経作用薬の開発 （血液脳関門を通過して中枢に 作用する薬物） が効率的に行えるようになる。 ' また、 本発明は中枢での作用を期待しない薬物で脳内に移行する薬物のスク リーニング系であるため、 適切な薬物療法の開発や新薬の開発に貢献できる。 また、 血液脳関門自体に作用する薬物のスクリーユングに有用である。
さらには、 本発明はこのスクリーユング系に様々な病態環境を負荷したもの であるため、病態下における病因解析研究や上記スクリーニングが可能となる。 図面の簡単な説明 図 1は種々の共培養作製方法を示す説明図である。
図 2は初代培養脳毛細血管内皮細胞と不死化脳毛細血管內皮細胞とを比較す るための顕微鏡観察写真である。
図 3は R B E Cと G P 8. 3に対する c AM Pの効果を示すグラフで ある。
図 4は実施例 4で示した方法で作製した 7種類の共培養モデルについて経内 皮電気抵抗値測定結果の経日変化を示すグラフである。
図 5は実施例 4で示した方法で作製した 7種類の共培養モデルについて経内 皮電気抵抗値の測定結果を比較したグラフである。
図 6は実施例 4で示した方法で作製した 7種類の共培養モデルにおけるタイ トジャンクション構成タンノヽ。ク質 （o c c l u d i n、 c l a u d i n— 5、 ZO- 1) の発現を示す写真である。
図 7は虚血再灌流モデルにおける電気抵抗値を示すグラフである。
図 8は共培養により虚血再灌流障害 （電気抵抗値の減少） が増悪したことを 示すグラフである。
図 9は共培養により虚血再灌流障害 （N a— F透過性の増加） が增悪したこ とを示すグラフである。
図 1 0は虚血再灌流 B B Bモデルにおけるラジカルスカベンジャー ·ェダラ ボンの効果を示すグラフである。 '
図 1 1は本発明に係る血液脳関門インヴィ トロ ·モデルの実施形態の概略図 である。 発明を実施するための最良の形態 初代培養脳毛細血管内皮細胞と、 初代培養脳ペリサイ ト、 初代培養ァストロ サイ トを、 多孔質のフィルタ一を含有する立体培養装置で、 共培養することに より本発明の血液脳関門インヴィ トロ ·モデルが得られる。 本発明の血液脳関 門インヴィ ト口 ·モデルは高度にタイ トジャンクションが発達しており、 より 生体に近似した血液脳関門の再構成系となっている。
図 1 1は本発明に係る血液脳関門インヴィ ト口 ·モデルの実施形態の概略図 である。 容器 3の中に培養液 4を収容し、 フィルタ一 2を吊るすハンガー 1に よって、フィルター 2を培養液 4の中の所定の位置に浸漬させている。直径 0 . 4 μ mの穴 2 aを多数持つフィルター 2の上部は血管腔側 1 0として想定され、 その下部は脳実質側 2 0として想定されている。 即ち、 フィルター 2の表面に 初代培養脳毛細血管内皮細胞 Eを播き、 フィルター 2の裏側に初代培養脳べリ サイ ト Pを播き、 更にそのフィルタ一 2の下方に初代培養ァストロサイ ト Aを 播く事で、 生体での血液脳関門を最も良く再現した構造であると考えられる。 また、 フィルター 2の多孔性により、 3種の細胞間のクロストークが可能であ り、 複雑な生体での血液脳関門の維持 ·調節機構をも再現する事が可能となつ ている。 3種細胞共培養により、 BBBの特徴である、 高度に発達したタイ トジヤン クションが內皮細胞に誘導されており、 薬物のスクリーユング等に耐えうる血 液脳関門再構成系が提供される。 この血液脳関門再構成系を用いる事で、 脳內 での作用を期待する薬物、 あるいは中枢での作用を期待しない薬物で脳内に移 行する薬が、 血液脳関門を通過できるかを容易に判断する事ができる。 即ち、 血管腔側 10である、フィルター 2の上部に当該薬物を添加し、一定時間後に、 フィルタ一 2の下部に漏れ出た薬物量を測定する事で判断できる。 また、 同様 にこの血液脳関門再構成系を用いる事で、 血液脳関門自体に作用する薬物のス クリーニングが容易に行う事ができる。 即ち、 血管腔側 10である、 フィルタ 一 2の上部に当該薬物を添加し、 一定時間後に、 脳毛細血管内皮細胞 Eの性質 を添加前後で比較する事で、 判断できる。
更には、 BBBキッ卜の培養条件を変化させることで容易に病態 BBBキッ 卜が作製できる。 即ち、 BBBキッ トの培養液 4を実際の病態条件に変えるこ とにより病態 BBBキットを作製し、 この病態 BBBキットにおける、 脳毛細 血管内皮細胞 E、 ペリサイ P、 ァストロサイ ト Aの変化を通常の培養液で培 養したそれらと比較することにより、 BBBの病態解析ならびに病態下におけ る薬物の反応性、 脳移行性が判断できる。 実施例 1
(脳毛細血管片の単離）
クリーンベンチ内で 3週齢のラットの脳を摘出し、 氷冷した P h o s p h a t e b u f f e r s a l i n e (― /一 ) (PB S 、一 /一 ) ； s ι g m a ) 中に入れ、 滅菌した濾紙上で、 硬膜、 小脳、 間脳、 脳幹などを取り除き大脳皮 質だけにした。 この大脳皮質を水冷した D u l b e c c o' s Mo d i f i e d E a g l e ' s Me d i um (DME ； S i g m a社製） 3mLに 入れ約 1 mm3 大の大きさにメスで細断した。 更に酵素 （c o l 1 a g e n a s e— c l a s s 2 (l mg /m l ;Wo r t h i n g t o n社製）、 300 x L DN a s e (1 5 μ g /m L ； S i g m a社製）） を含む 1 5 mLの DME Mを加え、 5 m Lピペットで 2 5回 u p— d o w nし懸濁した。 90分間 3 7 °C で振盪 'インキュベートした後、 1 OmLの DMEMを加え、 遠心した。 遠心 後の沈殿ペレツトを 20 % B S A ( S i gma社製） ZDMEM で遠心分離し、 下層のヘレ、ノ 卜に酵素 (c o l l a g e n a s e/d i s p a s e ( 1 m g mL ! B o e h r i n g e r M a n h e i m社 ) )、 DN a s e (6. 7 μ g /m L を含む 1 5mL DMEMで 懸濁し、 60分 3 7 °Cで振盪 ·インキ ュベー卜した。 その後 1 0 mLの DMEMを加え遠心し、 下層のペレットをあ らかじめ 3000 gで 1時間遠心したパーコール（3 3% ; P h a r ma c i a社製） に重層させ遠心分離した。 內皮層をシリンジで取り、 2回 DMEMで 洗浄し脳毛細血管片を得た。得られた脳毛細血管片には、 c o 1 1 a g e n (0. 1 m g / 1 ; S i gma社製)、 f i b r o n e c t i n e (0. 1 m g / m L ； S i gma社製） でコーティングしたディッシュに分離した脳毛細血管 片を播種した。 3 7°C、 5%C02ノ 9 5%大気下で 20% P l a s ma d e r i v e d s e r urn (PD S) -DMEM/F 1 2 に b FGF ( 1 m g ZmL ; B o e h r i n g e r M a n h e i m社製)、 h e p a r i n ( 1 0, 0 x g'ZmL ; S i gma社製) ^ g e n t a ma c i n {50 μ g / m ', S i g m a社製)、 p u r omy c i n ( 4 μ g /m L ； S i g m a社製) 'をカロ. えた培養液 （RBEC 培養液 1) で、 脳毛細血管内皮細胞を 2日間培養した。 3日目に p u r omy c i nを加えない培養液（ 20 % PD S— DMEM/F 1 2に b FGF (1 mg/mL)、 h e p a r i n (1 00 x g/mL)、 g e n t a m a c i n (50 μ g/mL) を加えた培養液； RB EC培養液 2) に置換し 80%コンフルェン卜になるまで培養した。 実施例 2 (脳毛細血管周皮細胞：ペリサイ ト）
実施例 1の脳毛細血管片には数パーセントペリサイ トが含まれている。 そこ で、コラーゲンコーティングしたディッシュに、脳毛細血管片を播き、 3 7°C、 5%C02/9 5%大気下 1 0% f e t a l b o v i n e s e r u m(F B S) — DMEMに g e n t a m a c i n (5 0 μ g/mL) を加えた培養液 にて 1週間培養し、 ペリサイ トを増殖させた。 この段階では、 脳毛細血管内皮 細胞とペリサイ トは混在している状態である。 次に、 I X トリプシン一 EDT A溶液 '（S i g m a社製） で細胞を剥ぎ、 コーティングなしのディッシュに播 き直しペリサイ トを単離した （内皮細胞は接着できず、 ペリサイ トだけが増殖 する）。 実施例 3
(ァス トロサイ ト）.
クリーンベンチ内で、 生後 1、 2日齢のラットから脳を取り出し、 氷冷した P B S (一ノー） 中にいれ、 滅菌した濾紙上で、 硬膜、 小脳、 間脳、 脳幹など を取り除き大脳皮質だけにした。 この大脳皮質 5 O mLのチューブに入れ、 氷 冷した DMEM 1 OmLを加えた。 2 0 Gのシリンジでゆつく り u p— d o w nし組織をバラバラにした。 しばらく静置した後、 上清 5 mLを別の 5 O mL チューブに入れた。 残りの細胞懸濁液 5 mLに更に 5 mLの DMEMを加え、 2 0 Gのシリンジで u p— d o w nした。 この操作を細胞塊が肉眼で確認でき なくなるまで繰り返し、 最後の細胞懸濁液 5 mLも加えた。 その後、 細胞懸濁 液を 7 0 μ mの登録商標セルス トレイナー （F a 1 c o n社製） に通した。 遠 心し細胞を集め 1 0% F B S— DMEMで再懸濁し、 7 5 c m2のフラスコに 播いた。 3 7°C、 5 %C 02/ 9 5%大気下 1 0% F B S—DMEN^: g e n t a m a c i n (5 0 /x gZmL) を加えた培養で培養し、 細胞がコンフル ェントになったら、 フラスコを 2 0 0 r p mで 1時間振盪し、 ミクログリアを 浮遊させ、 取り除いた。 1 X トリプシン—EDTA溶液で継代し、 新しい 7 5 c m2 のフラスコに播き直し、 コンフルェントになったら、 もう一度 2 0 0 r p mで 1時間浸透し、 ミクログリアを浮遊させ、 取り除き、 ァストロサイ トを 得た。
'
実施例 4 - (共培養作製方法）
図 1は種々の共培養作製方法を示す説明図である。 実施例 1で得られた、 脳 毛細血管内皮細胞、 ペリサイ ト、 ァス トロサイ トを、 登録商標 T r a n s w e 1 1 (C o r n i n g社製、 0. 4 x m p o r e s i z e ) を用い以下の 種々の共培養モデルを作製した。
(i) 脳毛細血管内皮細胞 Eの単層培養系 （E 00)
登録商標 T r a n s w e 1 1 ィンサ一卜の p o l y e s t e r m e m b r a n e [¾]ii]を c o l 1 a g e n d . l mg/ m l )、 f i b r o n e c t ι n e (0. l mgZmL).でコ一ティングし、 1 2— w e l l c u 1 t u r e プレート （C o r n i n g社製） の w e 1 1に設置した。 その後登録商標 T r a n s w e 1 1ィンサ一卜の内側に脳毛細血管内皮細胞 E ( 1. 5 X 1 05 c e 1 l /c m2) を播種し、 3 7°C、 5 %C O 2 9 5 %大気下、 RB E C培養 液 2で培養した。
(i i) 脳毛細血管内皮細胞 Eとァスト口サイ ト Aが非接触状態の共培養系 （E 0 A)
1 2— w e 1 1 c u l t u r eプレー卜の底面を p o 1 y— L— 1 y s i n e (S i gm a社製） 溶液でコーティングし、 ァストロサイ ト A ( 1. 0 X 1 05c e 1 \ / c m2) を播種し 3 7 °C、 5 % C 02/ 9 5 %大気下 1 0 % F B S— DMEMに g e n t a m a c i n (5 0 μ g/mL) を加えた培養で一 昼夜培養した。 翌日、 RB EC培養液 2に交換し、 （i) で示した方法で脳毛細 血管内皮細胞 Eを登録商標 T r a n s w e 1 1 インサートの内側に播種した。
(iii) 脳毛細血管内皮細胞 Eとァスト口サイ ト Aが接触した状態の共培養系 (ΕΑ0)
登録商標 T r a n s we l l ィンサ一卜の p o l y e s t e r m e m b r a n e两面を c o l 1 a g e n (0. I mgz m lノ、 f i b r o n e c t ι n e (0. 1 m gZmL)でコーティングし、上下逆にディッシュに設置した。 ァストロサイ ト A (2. 0 X 104c e 1 l /cm2) を播種し、 6時間以上培 養した。登録商標 T r a n s w e 1 1ィンサートを 1 2_we l l c u 1 t u r eプレ一卜の w e 1 1に設置し、 37。C、 5%C02/95 %大気下 10% F B S—DMEMに g e n t ama c i n ( 50 μ g/mL) をカ卩えた培養で 一昼夜培養した。 翌日、 RBEC培養液 2に交換し、 （i) で示した方法で脳毛 細血管内皮細胞 Eを登録商標 T r a n s w e 1 1インサ一卜の内側に播種した。
(iv)脳毛細血管内皮細胞 Eとペリサイ ト Pが非接触状態の共培養系（E0 P) 1 2— we l l c u l t u r eプレートの底面を c o l 1. a g e n 溶液で コーティングし、 ペリサイ ト P (1. 0 X 105c e 1 l /cm2) を播種し 3 7°C、 5%C02/95%大気下 10%F B S—DMEMに g e n t a m a c i n (50 μ g/mL) を加えた培養で一昼夜培養した。 翌日、 RBEC培養 液 2に交換し、 （i) で示した方法で脳毛細血管内皮細胞 Eを登録商標 T r a n s we 1 1インサートの内側に播種した。
(v)脳毛細血管内皮細胞 Eとペリサイ ト Pが接触した状態の共培養系（EP0) 登録商標 T r a n s w e 1 1ィンサートの p o l y e s t e r m e m b r a n ef¾][i]を c o l 1 a g e n { 0. lmg/ m l 、 f i b r o n e c t i n e (0. 1 mg/mL) でコーティングし、 上下逆にディッシュに設置した。 ペリサイ ト （2. 0 X 104c e 1 1 / c m2) を播種し、 6時間以上培養した。 登録商標 T r a n s w e 1 1インサートを 1 2— w e 1 1 c u l t u r eプ レー卜の we 1 1に設置し 37°C、 5%C02/95 %大気下 10%FB S— D MEMに g e n t a ma c i n (50 μ g/mL) を加えた培養で一昼夜培養 した。 翌日、 RB EC培養液 2に交換し、 （i) で示した方法で脳毛細血管内皮 細胞 Eを登録商標 T r a n s w e 1 1インサートの内側に播種した。
(vi) 脳毛細血管内皮細胞 Eとペリサイ ト Pが接触し、 ァストロサイ ト Aが非 接触状態の共培養系 （E PA) '
1 2— w e 1 1 c u l t u r eフレ—卜の JL¾¾1を p o l y— L— l y s i n e溶液でコーティングし、 ァストロサイ ト A (1 · 0 X 1 05c e 1 I / c m 2) を播種し 3 7°C、 5%C02/9 5%大気下 1 0 % F B S— DMEMに g e n t a ma c i n (50 ^ g Zm L )を加えた培養で一昼夜培養した。また、 同時に、 登録商標 T r a n s w e 1 1ィンサート （0. 4 /x m p o r e s i z e)の p o 1 y e s t e r m e m b r a n e [ti] [6 ¾r c o 1 1 a g e n、0. 1 m g / 1 )、 f i b r o n e c t i n e (0. l mg /m L) でコーティン グし、 上下逆にディッシュに設置した。 ペリサイ ト P (2. 0 X 1 04c e 1 1 /c m2) を播種し、 6 時間以上培養した。 登録商標 T r a n s w e 1 1 イン サートをァストロサイ ト Aを播種した、 1 2—w e 1 1 c u l t u r eプレー 卜の we 1 1に設置し 3 7°C、 5%C02ノ 9 5 %大気下 1 0%FB S—DME Mに g e n t a m a c i n (50 μ g /m L)を加えた培養で一昼夜培養した。 翌日、 RB EC培養液 2に交換し、 （i) で示した方法で脳毛細血管内皮細胞 E を登録商標 T r a n s w e 1 1ィンサー卜の内側に播種した。
(vii)脳毛細血管内皮細胞 Eとァストロサイ ト Aが接触し、ペリサイ ト Pが非 接触状態の共培養系 （EAP)
1 2— w e l l c u l t u r eプレートの底面を c o l 1 a g e n溶液で コ一ティングし、 ペリサイ ト P (1. 0 X 1 05c e 1 l /c m2) を播種し 3 7°C、 5%C02/9 5%大気下 1 0%FB S— DMEMに g e n t a m a c i n (50 μ g/mL) を加えた培養で一昼夜培養した。 また、 同時に登録商標 T r a n s w e l l イン" ^ "―ト (0. 4 /i m p o r e s i z eノ の p o l y e s t e r m e m b r a n e.両面を c o l l a g e n (0. 1 m g / m 1 ) N f i b r o n e c t i n e (0. 1 m g /m L ) でコーティングし、 上下逆に ディッシュに設置した。 ァストロサイ ト A (2. 0 X 1 04c e 1 1 / c m2) を播種し、 6時間以上培養した。
登録商標 T r a n s w e 1 1 インサートにァストロサイ ト Aを播種した、 1 2 -w e l l c u l t u r eプレー.卜の w e 1 1に設置し 3 7。C、 5%C02/ 9 5%大気下1 0% 83—0^^£1^に8 6 11 1 3 1113 0 1 1 (5 0 ^ g/m L) を加えた培養で一昼夜培養した。 翌日、 RB E C培養液 2に交換し、 （i) で示した方法で脳毛細血管内皮細胞 Eを登録商標 T r a n s w e 1 1インサー 卜の内側に播種した。 実施例 5
(不死化脳毛細血管内皮細胞と初代培養脳毛細血管内皮細胞の比較）
5— 1. 初代培養脳毛細血管内皮細胞と不死化脳毛細血管内皮細胞のフォンビ ルブランド因子 （vWF) の発現 （図 2)
細胞培養の実施例 1で得られた R B E Cならぴに実施例 4で得られた G P 8. 3を、 8― w e l l c u l t u r e s l i d e に l X l OSc'e l l Zc m 2 で播き、 3日後、 培養液を取り除いて、 P B S (—ノー） で 2回洗浄した。 洗浄後、 3%パラホルムアルデヒ ドで 1 0分間室温固定した。 その後 0. 2% t r i t o n— X溶液で 1 0分間室温処理した。 3 %H202溶液で 3分間処理 し内因性のペルォキシダ一ゼ活性を除いた。 P B S (—ノー） で 2回洗浄後、 3%B SA- P B S (—/一）溶液で室温 3 0分間ブロッキングした。 0. 1 % B S A- P B S (一/—) で洗浄後、 1 次抗体反応として、 a n t i _ vWF (S i g m a ) を用いて 3 7°C3 0分インキュベートした。 0. 1 %B SA_ P B S (一ノー） で 3回洗浄後、 2次抗体反応として、 ピオチン標識二次抗体 で 3 7°C 3 0分間インキュベートした。 その後、 0. 1 %B S A— P B S (― ノー） で 3回洗浄後、 バーオキシダ一ゼ標識ストレプトアビジン溶液で室温 1 0分間反応させた。最後に発色基質としてジァミノべンジジン四塩酸塩を用い、 顕微鏡で観察した。 図 2は初代培養脳毛細血管内皮細胞と不死化脳毛細血管内 皮細胞とを比較するための顕微鏡観察写真である。 尺8£。ならぴに<^ 8. 3は共に内皮細胞のマーカーである vW'F陽性を示した。
5— 2. 初代培養脳毛細血管內皮細胞と不死化脳毛細血管内皮細胞のタイ トジ ヤンクシヨン構成タンパク質の発現 （図 2)
細胞培養の実施例 1で得られた R B E Cならびに実施例 4で得られた G P 8. 3を、 8_we l l c u l t u r e s l i d eに l X 105c e l l Zcm2 で播き 3日間培養した。 培養液を取り除いて、 PB S (—ノー） で 2回洗浄し た。 洗浄後、 3%パラホルムアルデヒ ドで 10分間室温固定した。 その後 0. 2% t r i t o n—X溶液で 10分間室温処理した。 PB S (― /— ) で 2回 洗浄後、 3%B SA— PB S (—/一）溶液で室温 30分間ブロッキングした。 0. 1%B SA-PBS (― /— ) で洗浄後、 1次抗体反応として、 各タンパ ク質に特異的な抗体 （a n t i c l a u d i n— l ; Z yme d， a n t i c l a u d i n— 3 ； Z yme d, a n t ι c l a u d i n— 5 ; Z yme d, a n t ι o c c l u d i n ! BD B i o s c i e n c e , a n t i ZO- 1 ； Z y me d)を用いて 37 °C 30分インキュベートした。 0. 1%B SA-PB S (一/一） で 3回洗浄後、 2次抗体反応として、 A l e x a 488— c o n j u g a t e d I g G抗体で 37 °C 30分間インキュベー 卜した。 その後、 0. 1 %B S A— P B S (—/一） で 3回洗浄後、 L SM 5 P a s c a l (Z e i s s) で観察した。 図 2は初代培養脳毛細血管内皮細胞 と不死化脳毛細血管内皮細胞とを比較するための顕微鏡観察写真である。 その 結果、 RBECでは、 細胞—細胞間に全てのタイ トジャンクション構成タンパ ク質の集積が確認できたが、 GP 8. 3では ZO— 1のみ僅かに確認できた。 5-3. 初代培養脳毛細血管内皮細胞と不死化脳毛細血管内皮細胞の電気抵抗 (TEER) と N a— F透過性の検討 （図 3)
RBECならび GP 8. 3細胞がタイ ドジャンクション機能を保持している か検討するために以下の実験を行った。 また、 タイ トジャンクション機能を亢 進させる物質として知られる、 c AMPを負荷し、 その反応も検討した。 細胞 培養の実施例 1で得られた R B E Cならびに実施例 4で得られた G P 8.3を、 1 2— we l l t y p eの登録商標 T r a n s we l lに 1.5 X 105c e 1 1 / c m2 で播き、 3日間培養した。 c AMP (c p t— c AMP ： S i g m a社製） は 2日目に 250 /i Mで負荷し 1 2時間処置した。 TEERを EN DOHM (WP I社製）で測定した。その後、 N a—F透過性の実験を行った。 まず、 培養液を取り除いて、 PBS (—/一） で 2回洗浄した。 その後インサ 一卜の下部 （脳実質側）の w e 1 1には a s s a y b u f f e r PBS ( + / + ) ; S i gma、 d-g l u c o r s e (4. 5 m g /m L) ；和光純薬社 製、 HE PES (1 OmM) ； S i gmaを 1. 5mL満たした。 1 Ο μ g /m L s o d i um— f l u o r e s c e i n (Na— F) ; S i gma を含ん だ a s s a y b u f f e r ( 0. 5 m L ) をインサートの上部 （血管側） に 添加した後、 20分ごとに新しい we 1 1にインサートを移動した。 サンプル の蛍光強度は蛍光光度計 （島津制作） を用いて測定し （励起波長 485 nm、 蛍光波長 530 nm)、 検量線より N a— F濃度を算出した。 クリアランスと 透過係数 （P) の算出は De h o u c k、 I s o b eらに従った （D e h o u c k e t a 1. , 1 992 ; I s o b e e t a 1. , 1 996)。 クリァランスは血管側の c h amb e rから脳実質側の c h amb e rに移行 した N a—Fの量を； u Lで表し、 血管側に入れた Na— F、 の初濃度 [C] L と脳実質側に移行した N a—F、 EB Aの最終濃度 [C] Aから、 C l e a r a n c e ( L) = [C] AX VA/ [C] Lより算出した （VA：脳実質側 c h amb e rの容積 （1. 5mL))。 透過係数 ( c m/m i n) ltl/Ρ S a p p e r = l/ PSmemb r a n e + l/ P S t r a n sより求めた。 P Sは時間に対してクリアランスをプロットした直線の傾きで、 （透過係数 X (memb r a n eの表面積） を表している。 P a p pはみかけの透過係数、 P t r a n sは真の透過係数を表す。 Pmemb r a n eは、 memb r a n eのみの透過係数を表す。 図 3は RB ECと GP 8. 3に対する cAMPの効 果を示すグラフである。 その結果、 1 8 £じは0? 8. 3に比べ有意に電気抵 抗が高く、 N a— F透過性も低い事が判明した。また、 RB ECで観察される、 c AMPによるタイ トジャンクション機能の亢進作用が GP 8. 3では確認さ れなかつ'た。 実施例 6 '
初代培養脳毛細血管内皮細胞と初代培養脳ペリサイ ト、 ァストロサイ トを用 いた共培養の検討
6- 1. 経内皮電気抵抗 （図 4)
図 4は実施例 4で示した方法で作製した 7種類の共培養モデルについて経内 皮電気抵抗値測定結果の経日変化を示すグラフであり、 図 5は実施例 4で示し た方法で作製した 7種類の共培養モデルについて経内皮電気抵抗値の測定結果 を比較したグラフである。 経内皮電気抵抗 （T r a n s En d o t h e l i a 1 E l e c t r i c a l R e s i s t a n c e ; TEER) は ENDO HM (WP I社製） で測定した。 各 BBBモデルの電気抵抗値は、 モデル作成. 後 2日から 7日後まで測定し、 E 00、 E0A、 E 0 Pでは m e m b r a n e のみの電気抵抗値、 EA0、 EAPではァストロサイ トのみを培養させた me m b r a n eの電気抵抗値、 EP 0、 E P Aではペリサイ トのみを培養させた memb r a n eの電気抵抗値を差し引く事で算出した。 脳毛細血管内皮細胞 の単層培養系 （E00) に比べ、 脳毛細血管内皮細胞とァストロサイ トが非接 触状態の共培養系（E OA)、脳毛細血管内皮細胞とペリサイ 卜が非接触状態の 共培養系 （EO P)、脳毛細血管内皮細胞とペリサイ 卜が接触し、 ァストロサイ 卜が非接触状態の共培養系 （E PA) において、 経内皮電気抵抗値の有意な上 昇が認められ、 その中でも E P A型が最も高い値を示し 。，
6 - 2. ウェスタンブロッテイング （図 6)
図 6は実施例 4で示した方法で作製した 7種類の共培養モデルにおけるタイ トジャンクション構成タンパク質 （o c c l u d i n、 c l a u d i n— 5、 Z O— 1 ) の発現を示す写真である。 6 w e 1 1の登録商標 T r a n s w e 1 1を用レ、、 各 B B Bモデルを作 |¾した。 3日後、 培養液を取り除いて、 P B S (-/-) で 2回洗浄した。 洗浄後、 メンブランの裏側に貼り付いている細胞 を取り除くために、 メスで裏面の細胞を剥ぎ取った。 その後、 C e 1 L y t i c— M (S'i gm a ) に p r o t e a s e i n h i b i t o r c o c k t a i l (S i g m a ) を加えた細胞溶解液 3 0 0 μ Lを加え、 2 0分間シエー カー上でインキュベートした。 その後細胞溶解液を回収し、 1 2， 00 0 X g で 1 5分遠心した。 上清を回収し一部を蛋白定量に使用し、 残りをサンプルと した。 サンプルに S D Sと 2 _メルカプトエタノールを含むトリス塩酸 _ 5 X サンプルバッファーを加え、 9 5°Cで 5分間熱処理し、 — 8 0°Cで保存した。 各サンプルのタンパク質量を測定し、 タンパク質量が同量になるように、 SD S—ポリアクリルアミ ド電気泳動 （S D S— PAGE) で分離した。 次に PV D F膜にタンパク質を転写し、 1 % 登録商標 p e r f e c t b 1 o c k (M o B i T e c ) を含む 0. 1 % Tw e e n 2 0— T B S ( 1 0 0 mM N a C し 1 OmM T r i s— HC 1、） 溶液で室温 1時間ブロッキングした。 1次 抗体反応として、 各タンパク質に特異的な抗体 （a n t i _C l a u d i n— 5 ; Z ym e d、 a n t i — o c c l u d i n ； BD B i o s c i e n c e、 a n t i — Z O— 1 ； Z ym e d、 β— a c t i n ； S i g m a ) を用いて室 温 1時間インキュベートした。 0. 1 % Tw e e n 2 0—TB Sで 5分 X 3回 洗浄後、 2次抗体反応として、 h o r s e r a d i s h p e r o x i d a s e - c o n j u g a t e d a n t i I g G抗体で 1時間ィンキュベ一卜した。 0. 1 % 丁 6 6 11 20_丁85で5分 3回洗浄後、 EC L p 1 u s (ァ マシャム） で目的のバンドを検出した。 バンドの解析にば、 N I H i ma g i n gを用いた。 各共培養系の中で E PA型が最も o c c l u d i n、 c 1 a u d i n— 5、 ZO— 1の発現が亢進していた。
'
実施例 7 '
虚血再灌流 B B Bモデル
7— 1. 経内皮電気抵抗と N a— F透過性 （図 7、 8、 9)
細胞培養の実施例 5の （i)、 (vi) で示した、 共培養方法を用い脳毛細血管内 皮細胞の単層培養系 （E00)、 と脳毛細血管内皮細胞とペリサイ トが接触し、 ァストロサイ トが非接触状態の共培養系 （EPA) を作製した。 作製したモデ ルを PBS (-/-) で 1回洗浄後、 窒素ガスで 5分間バブリングした g 1 u c o s e f r e e . K r e b s— R i n g e r b u f f e r (143 mM N a Cし 4. 7 mM K C 1、 1. 3 mM C a C 12、 1. 2 mM M g C 12、 1. 0 mM N a H2P04、 25 mM N a HC03、 1 1 mM s u c r o s e (以上すベて和光純薬） l OmM HEPES (S i gma)、 p H 7. 4) で置換し、ァネロカルト登録商標 A m i n iに入れ 6時間インキュベートした (虚血期間）。 ィンキュベ一ト後 n o r ma l K r e b s— R i n g e r b u f f e r (143 mM N a C 1、 4. 7 mM K C 1、 1. 3 mM C a C 12、 1. 2 mM M g C 12、 1. 0 mM N a H2P04, 25 mM N a HC03、 1 1 mM d-g l u c o s e (S i gma) 1 0 mM HE P E S、 pH7. 4) に置換し、 3時間インキュベートした （再灌流期間）。 コントロー ノレとして上記操作を、全て n o r m a 1 K r e b s— R i n g e r b u f f e r を用いて 37°C、 95% a i r / 5%C02 下で行った。 虚血再灌流モ デルにおける電気抵抗値を図 7に示した。 虚血再灌流群では、 コントロール群 に比べ、 電気抵抗の低下、 N a _F透過性の增加が見られ、 タイ トジャンクシ ヨン機能が低下していることが判明した。 また、 このタイ トジャンクション機 能の低下は、 E 00群よりも、 EP A群がより顕著にタイ トジャンクション機 能の低下が見られたことから、 ペリサイ ト及ぴァストロサイ トが虚血再灌流障 害に対し、 影響を与えていることが考えられる （図 8、 9)。
7-2. 虚血再灌流 BBBモデルにおけるラジカルスカベンジャー ·エダラボ ンの効果 （図 10)
図 7は虚血再灌流 B B Bモデルにおけるラジカルスカベンジャー ·エダラボ ンの効果、を示すグラフである。 前記の方法で虚血再灌流 B B Bモデルを作製し エダラボンの効果を検討した。 ラジカルスカベンジャーであるエダラボンは、 虚血期間終了時に添加した。 図 10に示すように、 虚血再灌流におけるタイ ト ジャンクション機能の低下 （TEERの減少、 N a— F透過性の上昇） は、 ェ ダラボンの投与により有意に抑えられていた。

Claims

請 求 の 範 囲
1 . 培養液と、 当該培養液を保持するプレートと、 当該培養液に浸潰し、 か つ、 当該プレートの底面に接触しないで配置されたフィルターと、 からなる立 体培養装置を用い、
当該フィルターが直径 0 . 3 5〜 0 . 4 5 μ πιの穴を多数有し、 当該フィル ターの上面に初代培養脳毛細血管内皮細胞を播き、 当該フィルターの下面に初 代培養脳ペリサイ トを播き、 当該プレートの内面に初代培養ァストロサイ トを 播き、 通常の培養液で共培養してなる、 血液脳関門インヴィ ト口 ，モデル。
2 . 培養液と、 当該培養液を保持するプレートと、 当該培養液に浸漬し、 か つ、 当該プレートの底面に接触しないで配置されたフィルターと、 からなる立 体培養装置を用い、
当該フィルターが直径 0 . 3 5〜 0 . 4 5 μ mの穴を多数有し、 当該フィルタ 一の上面に初代培養脳毛細血管内皮細胞を播き、 当該フィルターの下面に初代 培養脳ペリサイトを播き、 当該プレートの内面に初代培養ァストロサイ トを播 き、 所定の病態条件に対応する培養液で共培養してなる、 病態血液脳関門イン ヴィ ト口 .モデノレ。
3 · 請求項 1に記載の血液脳関門インヴィ トロ ·モデルを用い、 フィルター の上方部に薬物を添加し、一定時間後に、当該ブイルターの下方部に漏れ出た、 当該薬物の量を測定して行う、 薬物の血液脳関門通過容易性評価方法。
4 . 請求項 1に記載の血液脳関門インヴィ ト口 ·モデルを用い、 フィルター の上方部に薬物を添加し、 一定時間後に、 脳毛細血管內皮細胞を採取し、 当該 薬物添加後の脳毛細血管内皮細胞の性質を評価し、 添加前の脳毛細血管内皮細 胞の性質と比較して行う、 薬物のスクリーニング評価方法。
5 . 請求項 2に記載の病態血液脳関門インヴィ ト口 ·モデルにおける培養脳 毛細血管内皮細胞、 脳ペリサイ ト、 及びァストロサイ トを、 それぞれ、 請求項 1に記載の血液脳関門インヴィ トロ'モデルにおける培養脳毛細血管内皮細胞、 脳ペリサイ ト、 及びァストロサイ 卜と比較して行う、 病態血液脳関門の病態解 析方法。
6 . 請求項 2に記載の病態血液脳関門インヴィ ト口 ·モデルにおける培養脳 毛細血管内皮細胞、 脳ペリサイ ト、 及びァストロサイ トを、 それぞれ、 請求項 1に記載の血液脳関門インヴィ トロ'モデルにおける培養脳毛細血管内皮細胞、 脳ペリサイ ト、 及びァストロサイ トと比較して行う、 病態血液脳関門における 薬物の反応性評価方法。
7 . 請求項 2に記載の病態血液脳関門インヴィ ト口 ·モデルにおける培養脳 毛細血管内皮細胞、 脳ペリサイ ト、 及びァストロサイ トを、 それぞれ、 請求項 1に記載の血液脳関門インヴィ ト口 ·モデルにおける培養脳毛細血管内皮細胞、 脳ペリサイ ト、 及ぴァス ト口サイ 卜と比較して行う、 病態血液脳関門における 薬物の脳移行性評価方法。
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