RU2724956C1 - Способ сокультивирования клеток для формирования in vitro модели гемато-энцефалического барьера - Google Patents
Способ сокультивирования клеток для формирования in vitro модели гемато-энцефалического барьера Download PDFInfo
- Publication number
- RU2724956C1 RU2724956C1 RU2019134508A RU2019134508A RU2724956C1 RU 2724956 C1 RU2724956 C1 RU 2724956C1 RU 2019134508 A RU2019134508 A RU 2019134508A RU 2019134508 A RU2019134508 A RU 2019134508A RU 2724956 C1 RU2724956 C1 RU 2724956C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- cells
- hours
- ips
- membrane
- medium
- Prior art date
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Hematology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Изобретение относится к области медицины. Предложен способ сокультивирования iPS-EC клеток, перицитов и астроцитов для формирования клеточной модели гематоэнцефалического барьера (ГЭБ). Перициты засевают на нижнюю поверхность мембраны, покрытой внеклеточным матриксом, в плотности 2,5⋅10клеток/см. Незрелые iPS-EC клетки засевают на слой из перицитов в отношении 1 лунка 6-луночного планшета с незрелыми iPS-EC клетками на 24 мембранные вставки 96-луночного планшета в ЕС питательной среде с добавлением bFGF и ретиноевой кислоты. Засевают астроциты на верхнюю (внутреннюю) сторону мембранной вставки в плотности 2,5⋅10клеток/смв ЕС питательной среде с добавлением bFGF и ретиноевой кислоты. Через 24 часа меняют среду на ЕС питательную среду без добавок, инкубируют еще 24 часа. Изобретение обеспечивает создание моделей ГЭБ in vitro. 2 ил.
Description
Настоящее изобретение относится к клеточной биотехнологии, а именно касается способа со культивирования клеток для создания моделей гематоэнцефалического барьера (ГЭБ) для изучения транспорта и токсичности лекарственных средств in vitro.
В частности, заявляемое изобретение может быть реализовано в высокопроизводительных скринингах способности проникновения ксенобиотиков и лекарственных средств через ГЭБ.
Заявляемое решение может быть использовано в более широкой области для изучения миграции клеток или для исследования влияния различных химических веществ на клетки в условиях in vitro.
Из уровня техники известен патент WO 9105038, в котором описана модель ГЭБ, состоящая из конфлюентного монослоя микроваскулярных эндотелиальных клеток из любого позвоночного, культивируемых на пористой мембране в среде обогащенной факторами, выделяемыми астроцитами, или сокультивируемых с астроцитами, находящимися в нижнем компартменте.
Из уровня техники известен патент WO 2007072953, в котором описывается модель, состоящая из эндотелиальных клеток, культивируемых в присутствии перицитов и астроцитов. В данной модели первичные микроваскулярные эндотелиальные клетки мозга крысы высаживаются на верхнюю поверхность мембраны, а перициты культивируются на обратной стороне мембраны; первичные астроциты высаживают на дно нижнего компартмента.
Из уровня техники известен патент US 2008044847, описывающий модель, в которой первичные микроваскулярные эндотелиальные клетки мозга или эндотелиальные клетки, полученные из эмбриональных стволовых клеток, культивируются совместно с нейрональными прогениторными клетками.
Недостатками вышеописанных способов является использование в них первичных культур видов отличных от человека, что может вызывать видоспецифические различия в проницаемости и других свойствах этих моделей. К тому же использование первичных культур является трудоемким процессом и требует высокой экспертизы, что делает эти способы малопригодными для высокопроизводительного скрининга.
Другими недостатками способов является культивирование в статических условиях, что не отражает физиологических условий, в которых эндотелий сосудов подвергаются воздействию касательного напряжения.
Наиболее близким решением является способ, описывающий трехмерную трубчатую структуру с постоянным потоком питательной среды, имитирующим физиологическое касательное напряжение в кровеносных сосудах (WO 03025206) (прототип). В этой динамической модели используются различные монокультуры и совместное культивирование клеток различного типа, а именно эндотелиальных клеток мозга крысы, астроцитов крысы и эндотелиальных клеток мозга человека. Недостатком модели является использование одновременно только двух типов клеток, эндотелиальных клеток и астроцитов.
Техническая задача, на решение которой направлено настоящее изобретение, заключается в преодолении перечисленных выше недостатков посредством разработки способа сокультивирования клеток до момента образования каждым типом клеток сплошного монослоя с последующим изучением сформированной клеточной модели in vitro, в т.ч. в динамическом режиме ростовой среды.
Поставленная задача реализуется следующим образом:
Готовят необходимое количество мембранных вставок Transwell для 96-луночного планшета:
- покрывают нижнюю сторону мембраны раствором ВКМ (35 мкл/вставку) следующего состава: коллаген IV (20 мкг/мл) + агрин (4 мкг/мл) + энтактин (4 мкг/мл) + ламинин 511 (5 мкг/мл) + ламинин 411 (5 мкг/мл) в DPBS (Са2+/Mg2+) (фиг. 1);
- покрывают верхнюю сторону мембраны раствором ВКМ (35 мкл/вставку) следующего состава: ламинин 211(10 мкг/мл) в DPBS (Ca2+/Mg2+).
Планшеты с покрытыми ВКМ мембранными вставками хранят в асептических условиях при +2°С - +8°С до 4 недель. К мембранам добавляют 1xDPBS (Ca++/Mg++), чтобы предотвратить пересыхание мембран с ВКМ.
Для покрытия нижней стороны мембраны ВКМ или для посева клеток на нижнюю сторону мембраны, мембранную вставку Transwell переворачивают в лунке планшета вверх дном, наносят каплю (~35 мкл) раствора ВКМ или суспензии клеток, закрывают крышкой или пленкой Parafilm для предотвращения испарения среды, ставят в CO2-инкубатор на достаточное время для формирования ВКМ или для прикрепления клеток.
Дифференцировка iPS клеток
Дифференцировку клеток проводят в соответствии с детально описанным протоколом [Lippmann ES, 2012] (фиг. 1). Засевают iPS клетки линии IMR90 - 4 в 6-луночные планшеты в плотности 10000-15600 клеток/см2 в питательной среде Е8, содержащей 10 мкМ Y-27632 (День -1). Примерно через 24 часа после посева клеток меняют среду на Е6 питательную среду (День 0) для индукции дифференцировки. Меняют среду каждые 24 часа. Дифференцирут клетки в Е6 среде в течение 4 дней. Далее, меняют среду на ЕС питательную среду с добавлением 20 нг/мл bFGF и 10 мкМ ретиноевой кислоты (RA), инкубируют48 часов. После этого отбирают ЕС питательную среду, промывают клетки один раз DPBS и инкубируют с Аккутазой 20-25 минут. Осаждают клетки центрифугированием и далее пересаживают на слой Перицитов для селективной адгезии (3 пункт). Пересаживают клетки для селекции в отношении 1 лунка 6-луночного планшета с незрелыми дифференцированными клетками на 3 мембранных вставки (12-луночного планшета) или 24 мембранных вставки (96-луночного планшета).
Сокультивирование iPS-EC клеток, перицитов и астроцитов для формирования клеточной модели ГЭБ (фиг. 2).
Засевают перициты на нижнюю поверхность мембраны, покрытой ВКМ, в плотности 2,5*105 клеток/см2, в полной питательной среде (DMEM + 10% FBS). Ставят на 2 часа в СО2-инкубатор для прикрепления клеток. После этого, меняют среду на ЕС питательную среду, инкубируют еще 24 часа. Засевают незрелые (Immature) iPS-EC клетки (пункт 2) на слой из перицитов (в отношении 1 лунка 6-дуночного планшета с незрелыми iPS-EC клетками на 24 мембранные вставки 96-луночного планшета) в ЕС питательной среде с добавлением bFGF и ретиноевой кислоты. Дают клеткам прикрепиться в течение 2 часов в СО2-инкубаторе. После этого, переверачивают мембранные вставки в лунках в их нормальное положение (дном вниз), и засевают астроциты на верхнюю (внутреннюю) сторону мембранной вставки в плотности 2,5*105 клеток/см2, в ЕС питательной среде с добавлением bFGF и ретиноевой кислоты. Инкубируют 24 часа в ЕС питательной среде с добавлением bFGF и ретиноевой кислоты. Через 24 часа меняют среду на ЕС питательную среду без добавок, инкубируют еще 24 часа.
В результате формируется плотный клеточный барьер с физиологически релевантными значениями TEER (>2000 Ω⋅см2), которые сохраняются длительное время (более 3 дней).
Для наилучшего понимания сущности заявляемого изобретения ниже представлен перечень материалов и оборудования, используемых в настоящем описании:
«Трансвелл» («Transwell») - емкость для выращивания клеток или клеточных моделей, которые используются в микрофлюидных устройствах при проведении исследований клеточных моделей. Трансвеллы имеют форму цилиндра или усеченного конуса, объем от 100±25 мкл до 1,5±0,15 мл, верхний диаметр от 4,26±0,50 ммдо 24±0,5 мм, нижний диаметр от 4,26±0,50 мм до 24±0,5 мм, высоту от 6±0,5 мм до 20±0,5 мм, дно выполнено в виде пористой мембраны с диаметром пор от 0,4 до 8,0 мкм и плотностью пор от 1×105 до 1×108 пор на 1 см2. Трансвеллы могут быть выполнены из полиэстера, поликарбоната или политетрафторэтилена. Из уровня техники известны Трансвеллы фирмы Corning Inc. В настоящем изобретении используются Трансвеллы с толщиной мембраны 10 μm, материал мембраны поликарбонат (PC), диаметр пор в мембране 3 μm.
Клетки для сокультивирования: iPS(IMR)-EC (клетки микроваскулярного эндотелия головного мозга человека, дифференцированные из iPS клеток линии IMR90-4) (WiCell); imHBVP (иммортализованные перициты головного мозга человека) (Celther); fHA-hTERT (иммортализованные астроциты человека) (abm).
Культуральный пластик (Corning): Т25 флаконы; 6-луночныепланшеты; 96-луночные планшеты с мембранными вставками Transwell; 96-луночные планшеты.
Компоненты клеточной модели ГЭБ: Мембранные вставки Transwell для 96-луночного планшета.
Поверхность PC мембраны, обращенная в сторону нижнего отсека лунки ("сосудистый отсек"), покрыта следующими компонентами ВКМ: коллаген IV + агрин + энтактин + ламинин (411+511), для адгезии к поверхности мембраны перицитов и iPS-EC эндотелиальных клеток.
Поверхность PC мембраны, обращенная в сторону верхнего отсека лунки ("мозговой отсек"), покрыта следующими компонентами ВКМ: ламинин 211 для адгезии к поверхности мембраны астроцитов.
Компоненты ВКМ для клеточной модели ГЭБ: Ламинин 511 (BioLamina), Ламинин 411 (BioLamina), Коллаген IV (MERCK), Агрин (R&D Systems), Энтактин (R&D Systems), Ламинин 211 (BioLamina).
Компоненты ВКМ для моно-культур клеток:
Культивирование, поддержание iPS клеток - Matrigel (Corning);
Дифференцировка iPS клеток (со стадии селекции) - Коллаген IV (MERCK); Фибронектин (Sigma-Aldrich); fHA-hTERT; Внеклеточный матрикс - Applied Cell Extracellular Matrix (G422) (ABM).
Культуральная среда (средаи компоненты от Thermo Fisher Scientific, Sigma Aldrich, R&D Systems или ABM):
Питательная среда для iPS и iPS-EC клеток: E8 питательная среда с добавлением или без 10 мкМ Y-27632; Е6 питательная среда; ЕС питательная среда с добавлением или без 20 нг/мл bFGF и 10 мкМ ретиноевой кислоты;
Питательная среда для imHBVP - DMEM с добавлением 10% FBS и антибиотиков (если необходимо);
Питательная среда для fHA-hTERT - Prigrow IV (abm) с добавлением 10% FBS.
Культуральная среда (для сокультивирования iPS-EC клеток, перицитов и астроцитов): ЕС питательная среда.
Диссоциирующие растворы: Stem Pro Аккутаза (для imHBVP клеток и iPS-ЕС клеток перед стадией селекции); Версен (для iPS клеток); Трипсин/ЭДТА (для fHA-hTERT клеток).
Claims (1)
- Способ сокультивирования iPS-EC клеток, перицитов и астроцитов для формирования клеточной модели гематоэнцефалического барьера (ГЭБ), в котором перициты засевают на нижнюю поверхность мембраны, покрытой внеклеточным матриксом, в плотности 2,5*105 клеток/см2, в полной питательной среде DMEM+10% FBS, ставят на 2 часа в CO2-инкубатор для прикрепления клеток, меняют среду на ЕС питательную среду, инкубируют еще 24 часа, незрелые (Immature) iPS-EC клетки засевают на слой из перицитов в отношении 1 лунка 6-луночного планшета с незрелыми iPS-EC клетками на 24 мембранные вставки 96-луночного планшета в ЕС питательной среде с добавлением bFGF и ретиноевой кислоты, дают клеткам прикрепиться в течение 2 часов в СО2-инкубаторе, после чего переворачивают мембранные вставки в лунках дном вниз и засевают астроциты на верхнюю (внутреннюю) сторону мембранной вставки в плотности 2,5*105 клеток/см2 в ЕС питательной среде с добавлением bFGF и ретиноевой кислоты и инкубируют 24 часа в ЕС питательной среде с добавлением bFGF и ретиноевой кислоты, через 24 часа меняют среду на ЕС питательную среду без добавок, инкубируют еще 24 часа, при этом используют клетки микроваскулярного эндотелия головного мозга человека, дифференцированные из iPS клеток линии IMR90-4, иммортализованные перициты головного мозга человека и иммортализованные астроциты человека.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2019134508A RU2724956C1 (ru) | 2019-10-29 | 2019-10-29 | Способ сокультивирования клеток для формирования in vitro модели гемато-энцефалического барьера |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2019134508A RU2724956C1 (ru) | 2019-10-29 | 2019-10-29 | Способ сокультивирования клеток для формирования in vitro модели гемато-энцефалического барьера |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2724956C1 true RU2724956C1 (ru) | 2020-06-29 |
Family
ID=71509811
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2019134508A RU2724956C1 (ru) | 2019-10-29 | 2019-10-29 | Способ сокультивирования клеток для формирования in vitro модели гемато-энцефалического барьера |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2724956C1 (ru) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2814138C1 (ru) * | 2023-06-15 | 2024-02-22 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Казанский Государственный медицинский университет" Министерства здравоохранения Российской Федерации | Способ сокультивирования трехмерных клеточных культур нижних дыхательных путей человека для получения клеточной модели для исследований in vitro |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA2632139A1 (en) * | 2005-12-19 | 2007-06-28 | Pharmaco-Cell Company Ltd. | In-vitro model of blood-brain barrier, in-vitro model of diseased blood-brain barrier, and drug screening method, analysis method for functions of diseased blood-brain barrier, and analysis method for pathogenesis using the same |
| WO2017143049A1 (en) * | 2016-02-16 | 2017-08-24 | President And Fellows Of Harvard College | Improved blood-brain barrier endothelial cells derived from pluripotent stem cells for blood-brain barrier models |
| RU2017102573A (ru) * | 2014-06-27 | 2018-08-03 | Анджиокрин Биосайенс, Инк. | Клетки нервной системы, экспрессирующие e4orf1 аденовируса, и способы их получения и применения |
-
2019
- 2019-10-29 RU RU2019134508A patent/RU2724956C1/ru active
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA2632139A1 (en) * | 2005-12-19 | 2007-06-28 | Pharmaco-Cell Company Ltd. | In-vitro model of blood-brain barrier, in-vitro model of diseased blood-brain barrier, and drug screening method, analysis method for functions of diseased blood-brain barrier, and analysis method for pathogenesis using the same |
| RU2017102573A (ru) * | 2014-06-27 | 2018-08-03 | Анджиокрин Биосайенс, Инк. | Клетки нервной системы, экспрессирующие e4orf1 аденовируса, и способы их получения и применения |
| WO2017143049A1 (en) * | 2016-02-16 | 2017-08-24 | President And Fellows Of Harvard College | Improved blood-brain barrier endothelial cells derived from pluripotent stem cells for blood-brain barrier models |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| AL AHMAD A. et al. Maintaining blood-brain barrier integrity: pericytes perform better than astrocytes during prolonged oxygen deprivation. J Cell Physiol. 2009 Mar; 218(3): 612-22. * |
| ICell GlutaNeurons User’s Guide. Document DX21840. Cellular Dynamics International, Inc. 2017; p.1-15. * |
| ICell GlutaNeurons User’s Guide. Document DX21840. Cellular Dynamics International, Inc. 2017; p.1-15. AL AHMAD A. et al. Maintaining blood-brain barrier integrity: pericytes perform better than astrocytes during prolonged oxygen deprivation. J Cell Physiol. 2009 Mar; 218(3): 612-22. * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2814138C1 (ru) * | 2023-06-15 | 2024-02-22 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Казанский Государственный медицинский университет" Министерства здравоохранения Российской Федерации | Способ сокультивирования трехмерных клеточных культур нижних дыхательных путей человека для получения клеточной модели для исследований in vitro |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Kapałczyńska et al. | 2D and 3D cell cultures–a comparison of different types of cancer cell cultures | |
| Riccalton-Banks et al. | Long-term culture of functional liver tissue: three-dimensional coculture of primary hepatocytes and stellate cells | |
| Kim et al. | Fabrication of functional 3D hepatic tissues with polarized hepatocytes by stacking endothelial cell sheets in vitro | |
| Athanasiou et al. | Self-organization and the self-assembling process in tissue engineering | |
| Li et al. | Three-dimensional perfused cell culture | |
| Juhas et al. | Roles of adherent myogenic cells and dynamic culture in engineered muscle function and maintenance of satellite cells | |
| Uchihashi et al. | Osteoblast migration into type I collagen gel and differentiation to osteocyte-like cells within a self-produced mineralized matrix: a novel system for analyzing differentiation from osteoblast to osteocyte | |
| Kirkpatrick et al. | Cell culture models of higher complexity in tissue engineering and regenerative medicine | |
| US20190351098A1 (en) | Three-dimensional tissue body, method for producing same, and formation agent for three-dimensional tissue body | |
| EP3636746B1 (en) | Method for producing cell laminate | |
| CN105849254A (zh) | 用于纯化视网膜色素上皮细胞的方法 | |
| Pereira et al. | The third dimension: new developments in cell culture models for colorectal research | |
| Okudaira et al. | Formation of three-dimensional hepatic tissue by the bottom-up method using spheroids | |
| Gomes et al. | Cell-based in vitro models for studying blood–brain barrier (BBB) permeability | |
| JP2023133596A (ja) | 播種された肝細胞並びにその調製及び用途 | |
| Choi et al. | Successful mouse hepatocyte culture with sandwich collagen gel formation | |
| US8541235B2 (en) | Modified reconstituted basement membrane composition for assay system | |
| Åstrand et al. | Assembly of FN-silk with laminin-521 to integrate hPSCs into a three-dimensional culture for neural differentiation | |
| US11685900B2 (en) | Nanofiber-based long-term primary hepatocyte three-dimensional culture system and culturing method | |
| CN110740707B (zh) | 活组织模型装置、血管壁模型，血管壁模型装置及评价被检物质的方法 | |
| RU2724956C1 (ru) | Способ сокультивирования клеток для формирования in vitro модели гемато-энцефалического барьера | |
| Shuzui et al. | Maintenance of an undifferentiated state of human-induced pluripotent stem cells through botulinum hemagglutinin-mediated regulation of cell behavior | |
| He et al. | Modular assembly–based approach of loosely packing co-cultured hepatic tissue elements with endothelialization for liver tissue engineering | |
| JP2012239444A (ja) | 細胞培養担体、細胞培養担体の製造方法、及び細胞培養方法 | |
| EP2628790B1 (en) | Micro fluidic system for simulating in vivo-equivalent cell barriers |