WO2007060886A1 - 神経変性疾患治療薬 - Google Patents

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WO2007060886A1
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Hiroyoshi Ariga
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National University Corporation Hokkaido University
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    • C07H7/00—Compounds containing non-saccharide radicals linked to saccharide radicals by a carbon-to-carbon bond
    • C07H7/06—Heterocyclic radicals

Definitions

  • the present invention relates to a therapeutic agent for a neurodegenerative disease, and more specifically to a drug for treating Parkinson's disease.
  • Parkinson's disease In Parkinson's disease, dopamine neuron death in the midbrain occurs, the amount of donomin released to the striatum is reduced, and the balance with acetylcholine in the striatum is disrupted, thereby causing movement disorders To do.
  • Parkinson's disease has been confirmed to be caused by inhibition of oxidative stress and mitochondrial complex I (Non-Patent Documents 1 to 3). By suppressing inhibition of oxidative stress and mitochondrial complex I, Parkinson's disease Suggests that it can be treated.
  • the currently used treatment methods for Parkinson's disease are roughly classified into the following four.
  • Administer drugs that suppress the degradation system of dopamine For example, selegiline is known as a drug that inhibits the monoamine oxidase MAO involved in dopamine degradation.
  • Administer drugs that inhibit acetylcholine production by inhibiting the function of cholinergic nerves that are in an overexcited state (such as trihexylphezyl).
  • DJ-1 protein is present in a wide range of human cells including nerve cells and has an amino acid power of 189.
  • DJ-1 protein is an oncogene product, PARK7 (familial parkin Nson's disease is known to be related (Non-patent Document 4).
  • DJ-1 protein is known to have an effect of suppressing neuronal cell death caused by oxidative stress.
  • DJ-1 protein was injected at the same time as or after 6-hydroxydopamine injection into Parkinson's disease model rats injected with 6-hydroxydonomin that gives oxidative stress, dopamine neuronal cell death was suppressed, It has been reported that the abnormality is improved (Non-patent Document 5).
  • Non-Patent Document 1 Neurochem Res 2004 Mar, 29 (3); 569-577
  • Non-Patent Document 2 Neurochem Res 2003 Oct, 28 (10); 1563-1574
  • Non-Patent Document 3 Annals of Neurol 1996 Oct, 40 (4); 663-671
  • Non-Patent Document 4 Science. 2003 Jan, 299 (5604); 256-9
  • Non-Patent Document 5 Experimental Neulology. 2002, 175; 303- 317
  • Non-Patent Document 6 EMBO Reports. 2004 Feb, 5 (2); 213-8.
  • Non-Patent Document 7 Biochem Biophys Res Commun. 2004 Jul 23, 320 (2); 389-97.
  • An object of the present invention is to provide a neuronal cell death inhibitor and a therapeutic agent for neurodegenerative diseases, in particular, a drug for treating Parkinson's disease.
  • DJ-1 protein is related to Parkinson's disease (Non-patent document 4), has the effect of suppressing neuronal cell death due to oxidative stress (Non-patent document 5), and is also used in Parkinson's disease model rats. It has been known that DJ106 protein mutated by C106 does not suppress dominamine neuronal cell death (Non-patent Documents 6 and 7).
  • DJ-1 The activity of DJ-1 is regulated by the oxidation state of the 106th cysteine (C106), and it shifts from —SH (reduced) to SO 2, SO 2 —SO 2, depending on the degree of acid. DJ 1 is active in the former two (especially SO H type has the highest activity)
  • Type 2 3 is inactive.
  • the compound of the present invention has an inhibitory effect on nerve cell death caused by oxidative stress of DJ-1 protein.
  • R 1 may be the same or different, a hydrogen atom, an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, a hydroxymethyl group or a siloxymethyl group (CH 2 —O—SiR 6 , R 6 is a carbon number) 1-6
  • R 2 and R 3 may be the same or different, and may be a hydroxyl group, an alkoxy group, an aryloxy group, an acyloxy group ( — O—CO—R 7 and R 7 represent an alkyl group or aryl group having 1 to 6 carbon atoms) or a sulfo-loxy group (O—SO—R 8 , R 8 is a carbon number of 1 to 6).
  • M represents 0 or 1
  • R 4 represents a hydrogen atom or a acetyl group
  • R 5 represents a hydrogen atom, a hydroxyl group or a nitro group. It is a therapeutic agent for neurodegenerative diseases whose main component is a compound represented by
  • ⁇ R 11 is Yogu hydrogen atom be the same or different, a hydroxyl group, an alkoxy group
  • Aryloxy group, acyloxy group (one O—CO—R 14 , R 14 represents an alkyl group or aryl group having 1 to 6 carbon atoms) or sulfo-loxy group (—O—SO—R 15 , R 15 Is charcoal
  • R 12 is a hydrogen atom or — (CONH) R 16 (wherein R 16 is an alkyl group, an aryl group or — CH (CONH) (CH 2 SO 4 NH 3) (CH 2 CH 3 (CH 2 )) (Where q, r and
  • P represents 1 or 2.
  • R 13 represents a hydrogen atom, a hydroxyl group or an alkoxy group, n represents an integer of 0 to 2, and o represents 0 or 1.
  • a causal therapeutic agent having a mechanism different from conventional symptomatic therapeutic agents that are therapeutic agents for neurodegenerative diseases is provided.
  • new therapeutics or prevention of Parkinson's disease Medicine is provided.
  • the compound of the present invention is represented by the following formula (ii). Of these, (1) is preferred. These compounds have a common structure including a purine or pyrimidine residue and a sugar residue. When viewed from the viewpoint of binding to the active site of the DJ-1 protein, Does not make a difference.
  • IT may be the same or different, a hydrogen atom, an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, a hydroxymethyl group (—CH OH), a siloxymethyl group, or two R 1 groups.
  • Oxygen atom (a)
  • This siloxymethyl group is represented by —CH 2 —O—SiR 6 , wherein R 6 is a C 1-6 alkyl group.
  • a methyl group is preferred as the alkyl group, and a phenyl group is preferred as the aryl group! /.
  • R 2 and R 3 may be the same or different and each represents a hydroxyl group, an alkoxy group, an aryloxy group, an acyloxy group or a sulfonyloxy group, preferably a hydroxyl group.
  • a phenoxy group is preferable as the aryloxy group, preferably an alkoxy group having 1 to 6 carbon atoms.
  • the Ashiruokishi group - is represented by O-CO- R 7, wherein, R 7 is alkyl group or Ariru group having 1 to 6 carbon atoms, preferably an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms.
  • the alkyl group is preferably a methyl group, and the aryl group is preferably a phenyl group.
  • This sulfo-loxy group is represented by —O—SO—R 8 , wherein R 8 is a C 1-6 carbon atom.
  • R 2 and R 3 jointly represent an alkyl group or an aryl group, preferably an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms.
  • a methyl group is preferred as the alkyl group, and a phenyl group is preferred as the aryl group! /.
  • R 2 and R 3 jointly represent an alkyl group or an aryl group, preferably an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms.
  • a methyl group is preferred as the alkyl group, and a phenyl group is preferred as the aryl group! /.
  • n 0 or 1, preferably 0.
  • R 4 represents a hydrogen atom or a acetyl group (COCH 3), preferably a acetyl group.
  • R 5 represents a hydrogen atom, a hydroxyl group or a -tro group (one NO 2), preferably a -tro group.
  • Another compound of the present invention is represented by the following formula (Dich 3). This compound has a peptide bond with two carbon skeletons sandwiched from the benzene ring, and has a characteristic structure. Differences in the compounds in the formula are not significant and do not lead to differences.
  • R 9 to R U represent a hydrogen atom, a hydroxyl group, an alkoxy group, an aryloxy group, an acyloxy group, or a sulfo-oxy group, which may be the same or different.
  • Ashiruokishi group is represented by O-CO- R 14, wherein, R 14 is an alkyl group or Ariru group having 1 to 6 carbon atoms, preferably an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms. A methyl group is preferred as the alkyl group, and a phenyl group is preferred as the aryl group.
  • the sulfo-loxy group is represented by O—SO—R, where R is an alkyl having 1 to 6 carbon atoms.
  • a kill group or an aryl group preferably an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms.
  • the alkyl group is preferably a methyl group
  • the aryl group is preferably a phenyl group.
  • R 9 to R " preferably at least 1, more preferably 2, and most preferably all are hydrogen atoms.
  • R 9 and R 1C> are jointly expressed by the following formula (2) [Chemical 2]
  • R 12 represents a hydrogen atom or — (CONH) R 16 , preferably — (CONH) R 16 , p is 1 or
  • R 16 represents an alkyl group, an aryl group, or —CH 2 (CONH).
  • the alkyl group is preferably an alkyl having 1 to 6 carbon atoms.
  • R 12 is, for example, the following formula (Chemical Formula 4)
  • R 13 represents a hydrogen atom, a hydroxyl group or an alkoxy group, preferably a hydrogen atom.
  • a methoxy group is preferred as the alkoxy group.
  • n an integer of 0 to 2, preferably 0 or 1.
  • o 0 or 1, preferably 0.
  • the ability of the candidate compound to bind to the active site of the DJ-1 protein is based on the structure of the active site of the DJ-1 protein as follows. The determination was made based on the binding energy of the complex of the DJ-1 protein and the candidate compound by virtual computer screening.
  • the binding energy of the complex was calculated based on the PMF (Protein Mean Force) method.
  • the PMF method is a method for predicting the binding energy between a protein and a ligand by statistical analysis using a three-dimensional structure database.
  • a protein-ligand (compound) complex is set and set. Find the sum of the interaction energies in all pairs of atoms in the complex.
  • the PMF method used in this virtual screening is a method using the Leonard Jones potential.
  • the virtual screening includes the following steps.
  • First step Obtain information on the optimized structure of the active site of the DJ-1 protein.
  • Second step Information on the structure of the target compound is obtained.
  • Third step Determine the binding energy of the complex between the active site of the optimized structure and the compound while changing the conformer of the compound structure (docking step).
  • Information on the optimized structure of the active site of the DJ-1 protein is as follows: 1) Obtain information on X-ray structural analysis of the entire DJ-1 protein, 2) Modify the molecular structure from the obtained information, and By optimizing and 3) setting the C106 region of the DJ-1 protein as the active site.
  • Information on the X-ray structure of the entire DJ-1 protein was obtained from J. Biol. Chem. 278 pp. 3138 0 (2003).
  • Examples of processing for correcting the molecular structure of the entire DJ-1 protein from the obtained X-ray structure information include hydrogenation processing and water molecule processing.
  • the hydrogen addition process is a process for adding hydrogen atoms to the read X-ray structure information, and is necessary for obtaining an optimized structure reflecting hydrogen bonds.
  • the treatment of water molecules was optimized by removing the water molecules inside the protein after obtaining the three-dimensional structure of the entire DJ-1 protein, including the solvent and water molecules inside the protein. This is a process for obtaining a structure.
  • the binding energy of the complex with the compound can be calculated based on the direct binding between the DJ-1 protein and the compound, taking into account the effect of the water molecule on the optimized structure.
  • Sdf file power included in compound library A three-dimensional structure is obtained by correcting the hydrogen position by child dynamics calculation.
  • the docking process calculates the binding energy of the complex between each conformer of the compound and the active site of the optimized structure while changing the three-dimensional structure of the target compound. Seeking energy.
  • Changing the three-dimensional structure means changing the spatial arrangement while changing the twist of the bond of the compound, generating various conformers.
  • a low molecular weight compound having a binding energy with DJ-1 active site of ⁇ 60 kcalZ mol or less, particularly ⁇ 90 kcalZmol or less has a neuronal cell death inhibitory effect and a neurodegenerative disease therapeutic effect. I was strong.
  • DJ-1 SO type The transition to the over-oxidized form of
  • the compound of the present invention When the compound of the present invention is administered into a living body including a human, it eliminates active oxygen in nerve cells, suppresses its cell death, and functions as a nerve cell death inhibitor and a therapeutic drug for neurodegenerative diseases. This is considered to be because the compound of the present invention binds to the DJ-1 protein and enhances the anti-oxidative action of the DJ-1 protein, as will be described in Examples below.
  • the therapeutic agent for neurodegenerative diseases for suppressing dopamine neuronal cell death can pass through the vascular brain barrier, but generally, a compound having a nucleic acid structure can pass through the vascular brain barrier.
  • a compound containing a purine or pyrimidine residue and a sugar residue like the compound of the invention can be preferably used as a therapeutic agent for neurodegenerative diseases.
  • neurodegenerative diseases in which the compounds of the present invention can be used as therapeutic agents include Parkinson's disease, Alzheimer's disease, Huntington's chorea, ALS, stroke, etc., preferably Parkinson's disease. These neurodegenerative diseases are thought to be caused by neuronal cell death due to oxidative stress, and the compound of the present invention acts effectively.
  • the concentration of the compound of the present invention contained in the therapeutic agent for neurodegenerative disease is not particularly limited.
  • Book The therapeutic agent for neurodegenerative diseases of the invention can contain any component other than the above compound as long as the effects of the present invention are not impaired.
  • the administration method of the therapeutic agent for degenerative diseases of the present invention is not particularly limited (oral administration, injection administration, etc.), and the dosage form is not particularly limited (powder, tablet, injection solution, etc.).
  • the product was purified by silica gel column chromatography to obtain the corresponding amide as colorless crystals in a yield of 70%.
  • Each compound was subjected to mass spectrometry (Electrospray (ESI) mass spect ra) under the following conditions.
  • the equipment used and the conditions are as follows: JMS-700TZ (JEOL, Tokyo, Japan) four-sector (BE / BE) tandem mass spectrometer, fypicai measurement condition s are as follows: acceleration voltage, 5.0 kV; needle voltage , 3.24 kV; orifice 1 volt age, 0.0 kV; ring lens voltage, 60.0 V; desolvation temperature, 80.
  • Orifice 1 tem perature 230 ° C; sample flow rate, 22 ⁇ L / min; solvent, chloroform.
  • the binding energy of the complex with the active site of DJ-1 protein (that is, the peripheral region of the 106th cysteine residue) performed using the above analysis software FastDock (manufactured by Fujitsu Limited) is 91.3 kcal / mol (compound 1),-101.9 kcal / mol (compound 2), — 98.1 kcal / mol (compound 3), — 97.9 kcal / mol (compound 4) , — 103.4kcal / mol (Compound 5), —1 They were 02.91 kcal / mol (compound 6), -56.3 kcal / mol (compound 7), and +209.9 kcal / mol (compound 8).
  • 96-well plates were seeded with human neuronal cells SH-SY5Y (American Tissue Culture Collection, USA) and cultured to 80% confluence.
  • 6-hydroxy-pamine PBS solvent
  • PBS Wired Chemical Industries, Ltd.
  • FIG. 9 shows the cell viability when compounds 1 to 8 or sterilized water (control) was added. It can be seen that cell viability is increased when compounds 1 to 6 are added as compared to control and compound 7 and 8.
  • Human neuronal cells SH-SY5Y were seeded in 10 cm dishes and cultured to 80% confluence. Compounds 1-5 were added to bring the compound concentration to 10 M, or sterilized water was added. 24 hours after the addition of the compound or sterilized water, hydrogen peroxide was added to adjust the hydrogen peroxide concentration to 50 M. One hour after the addition of hydrogen peroxide, the fluorescent dye DCFH-DA (Dichlorofluorescein diacetate) was added and incubated for 15 minutes. Collect cells Then, the fluorescence intensity was measured by FACS, and the amount of intracellular hydrogen peroxide was determined.
  • DCFH-DA Dichlorofluorescein diacetate
  • Figure 10 shows the measurement results. In either case, it can be seen that when the compound and hydrogen peroxide are added, the fluorescence intensity is weaker, that is, the amount of hydrogen peroxide is smaller than when only hydrogen peroxide is added.
  • AffinixQ is a device that quantifies interactions between biomolecules on the nanodrum order by changing the frequency of the crystal oscillator. It utilizes the fact that there is a proportional relationship between the change in the frequency of the crystal unit and the weight attached to the surface of the crystal unit.
  • the compound was immobilized on the sensor chip, which is an oscillator, using an amino coupling reagent.
  • a sensor chip on which the compound was immobilized was immersed in a measuring tank containing 8 ml of PBS (phosphate buffer) and held until the frequency was constant. Thereafter, 8 ⁇ l of lmgZml of DJ-1 protein or BS A (bovine serum albumin) was added to the measurement tank.
  • PBS phosphate buffer
  • BS A bovine serum albumin
  • Figure 11 shows the measurement results of each frequency change. When DJ-1 was added, the frequency was significantly reduced compared to the case where BSA was added, indicating that DJ-1 and the compound were bound.
  • DJ-1 purified protein 0.5 mg was dissolved in PBSlml. Immediately add 1-5 of ImM compound 1, 5 or 7 to the DJ-1 protein solution 500 1 for 1 hour 4. Crotted at C. Then add 0.4 or 4 mM hydrogen peroxide (H 2 O 2) and leave at room temperature for 1 hour.
  • H 2 O 2 hydrogen peroxide
  • the hydrogen concentration was set to 0.2 mM or 2 mM. After further dialysis with PBS three times for a total of 4.5 hours, 0.5 g of DJ-1 protein was used for isoelectric focusing. The reagents used for isoelectric focusing are shown below.
  • Towbin 25 mM Tris, 192 mM Glycine
  • Fig. 12 shows the electrophoresis results. Compared to compound 8, it can be seen that compound 1 and compound 5 inhibit the transition of the DJ-1 protein to the acid form.
  • 6-Hydroxide-pamine induces oxidative stress by reducing the enzyme activity of Complexl and causing dysfunction.
  • the compounds identified this time were thought to suppress neuronal cell death due to acid stress by preventing the decrease in complexl activity, and the change in commplexl activity due to compound addition was measured.
  • Human neuronal cells SH-SY5Y were seeded in 10 cm dishes and cultured to 80% confluence. Compounds 1, 5 and 8 were added to make the compound concentration 1 ⁇ , or sterilized water was added. Twenty-four hours after addition of compound or sterilized water, 6 hydroxydopamine ( ⁇ S solvent) was added to give 6 hydroxydopamine concentration of 50 / ⁇ ⁇ , while the same amount of PBS (6-hydroxydopamine (Not included). Furthermore, the cells were collected 6 hours after 6-hydroxide-pamine-added caro. This cell suspension was disrupted in ice with a potter homogenizer 80 times.
  • Reaction buffer 6.65 mM NaH PO, 28.35 mM Na HPO, 5 mM MgCl, 5 mM EDTA
  • Fig. 13 shows Complexl activity when compounds 1, 5 and 8 or sterilized water (control) was added. It can be seen that Complex 1 activity is maintained when Compound 1 or 5 is added as compared to Control and Compound 8.
  • compounds 1, 5 and 8 were injected into the left substantia nigra of rats and their effects were examined.
  • 6mM6-hydroxydonomine (6-OHDA) alone or a mixture of each compound ImM in 6mM6-OHDA was added to the left substantia nigra (4.8 mmxl) in rats (Wister rat, male, 250 g). 8mm, 7.8mmdepth).
  • 6 mM 6-hydroxydonamine (6-OHDA) injected into the left substantia nigra of the rat the right substantia nigra is normal and the left side is oxidative stress-induced domino neuron death. Rats rotate clockwise due to volume imbalance and exhibit behavioral abnormalities typical of Parkinson's disease patients.
  • Rats Nine weeks later, when rats are injected with methamphetamine (Dainippon Pharmaceutical), which causes dopamine release, more dopamine is released into the striatum than dopamine-euron. Rats begin to rotate clockwise due to an imbalance in the amount of dopamine released from the left and right substantia nigra. Rats were placed in a rotor meter and the number of rotations was measured. Figure 14 shows the total number of revolutions in 60 minutes, and Figure 15 shows the number of revolutions over time every 5 minutes.
  • methamphetamine Dainippon Pharmaceutical
  • a slice of 20 ⁇ m in thickness was made with a crystal stat and submerged in 100 mM phosphate buffer (PBS-T) containing 0.3% Triton X-100.
  • PBS-T phosphate buffer
  • TH anti-tyrosine hydroxylase
  • Consistent enzyme and dopamine neuron marker (Sigma, 1: 20,000 dilution) and 4 days at 4 ° C, washed and washed with piotin-labeled anti-mouse IgG antibody (1: 2,000 dilution) at room temperature And reacted for 2 hours. Thereafter, avidin peroxidase color development was performed at room temperature for 1 hour using ABC kit (Vector Laboratories). After washing several times with PBS-T, the color was developed with 3,3 diaminobenzidine (DAB) containing nickel ammonia. The results are shown in Fig. 16. In the figure, the black stained area indicates the presence of dopamine neurons.
  • DAB 3,3 diaminobenzidine
  • 6- OHDA injected left substantia nigra does not have TH staining, so dopaminergic-the ability to see euron death right substantia nigra is 6- OHDA injected, so live dominin Sex-Euron is seen (Fig. 16 (1)).
  • the left substantia nigra injected with Compound 1 or 5 at the same time as 6-OHDA showed suppression of neuronal cell death at a reasonable rate (Fig. 16 (2) (3)).
  • Compound 8 was ineffective (Fig. 16 (4)).
  • a low molecular weight compound that binds to the active site of the DJ-1 protein ie, the peripheral region of the 106th cysteine residue
  • has a human neuronal death inhibitory effect (Example 1), mitochondrial complexl While maintaining activity (Example 5) and improving symptoms peculiar to Parkinson's disease patients in rats (Example 6), compound 7 with low binding capacity to the active site of DJ-1 protein
  • compound 8 that does not bind to the active site of the DJ-1 protein is ineffective in this way is a low molecular weight compound that exhibits a certain level of binding force at the active site of DJ-1. This indicates that the product has a neuronal cell death inhibitory effect and a Parkinson's disease therapeutic effect.
  • FIG. 2 is a view showing a mass spectrometry chart of Compound 2 (M.W. 329). Needle voltage: 3.24 V, Orifice voltage: 0 VV, Ring lens voltage: 60 V, Ion guide voltage: 3 V, Mobile phase solvent: CHC1 The molecular weight and measured value match.
  • FIG. 5 is a view showing a mass spectrometry chart of Compound 5 (M.W. 450). Needle voltage: 3.24 V, Orifice voltage: 0 V, Ring lens voltage: 60 V, Ion guide voltage: 3 V, Mobile phase solvent: C HC1 Molecular weight and measured values are consistent.
  • FIG. 8 is a view showing a mass spectrometry chart of Compound 8 (M.W. 604). Needle voltage: 3.24 V, Orifice voltage: 0 V, Ring lens voltage: 60 V, Ion guide voltage: 3 V, Mobile phase solvent: C HC1 Molecular weight and measured values are consistent.
  • FIG. 9 is a graph showing a cell death inhibitory effect of a test compound. [10] This is a graph showing the intracellular peracid-hydrogen scavenging effect of the test compound.
  • FIG. 11 is a graph showing a change in frequency of a test compound by Aff inixQ.
  • FIG. 13 is a graph showing the Complexl activity maintaining effect of a test compound.
  • FIG. 14 is a graph showing the total number of rotations of a model rat 60 minutes after injection of DJ-1 binding compound.
  • FIG. 15 is a graph showing the number of rotations of a model rat over time after every 5 minutes after injection of a DJ-1 binding compound.
  • FIG. 16 shows a photograph of staining with TH (a marker of dopamine nerve) in the rat midbrain injected with a 6-OHDA and DJ-1 conjugate compound.
  • TH a marker of dopamine nerve

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Abstract

　　【課題】　　神経細胞死抑止剤及び神経変性疾患治療薬、特にパーキンソン病を治療するための薬剤を提供する。 　【解決手段】　　ＤＪ-１タンパク質は、パーキンソン氏病と関連があることや酸化ストレスによる神経細胞死を抑制する効果を有することが知られていることから、ＤＪ-１タンパク質の活性部位（即ち、１０６番目のシステイン残基の周辺領域）に結合する低分子化合物を、解析ソフトウェアＦａｓｔＤｏｃｋ（富士通株式会社製）を用いてスクリーニングした。結合エネルギーが－６０ｋｃａｌ／ｍｏｌ以下の候補低分子化合物を用いて実際に各種試験を行ったところ、これらの化合物は神経変性疾患治療効果を示した。 　

Description

神経変性疾患治療薬
技術分野
[0001] この発明は、神経変性疾患治療薬に関し、より詳細にはパーキンソン病を治療する ための薬剤に関する。
背景技術
[0002] パーキンソン病は、中脳のドーパミン神経細胞死が起こり、線条体に放出されるドー ノミン量が減少し、線条体のアセチルコリンとのバランスが崩れて、それにより運動障 害が発症する。
また、パーキンソン病は、酸化ストレスとミトコンドリア複合体 Iの阻害によって生じるこ とが確認されており（非特許文献 1〜3)、酸化ストレスとミトコンドリア複合体 Iの阻害を 抑制することによって、パーキンソン病を治療できることを示唆している。
現在用いられているパーキンソン病治療法は、以下の 4つに大別される。
1)ドーパミンの補充療法である。ただし、ドーパミン自体の血液関門（BBB)透過性 は低 、ため、 BBB透過性の高!、ドーパミン前駆体である L-dopa (レボドパ）を投与す る。 L-dopaは、投与初期には優れた効果を示す力 L-dopa自体が神経細胞に酸ィ匕 ストレスを与え、逆に症状を悪ィ匕させることがある。
2)ドーパミンの分解系を抑制する薬剤を投与する。たとえば、ドーパミン分解に関 与するモノアミン酸ィ匕酵素 MAOを阻害する薬剤として、セレギリンが知られて 、る。
3)線条体の膜に存在して、ドーパミンを線条体内に取り込む機能を有するドーパミ ントランスポーターを活性ィ匕する薬剤を投与する。
4)過剰興奮状態となっているコリン作動性神経の機能を抑制することによって、ァ セチルコリン産生を抑制する薬剤（トリへキシルフエ-ジルなど）を投与する。
しかし、これらの治療法は、神経細胞死によるドーパミン量の減少に対する対症療 法であるため、神経細胞死自体を抑制する治療法が切望されて!、る。
[0003] 一方、 DJ-1タンパク質は、神経細胞を含む広範なヒト細胞に存在しており、 189の アミノ酸力もなる。 DJ-1タンパク質はガン遺伝子産物であり、 PARK7 (家族性パーキ ンソン氏病）と関連があることが知られて 、る（非特許文献 4)。
さらに、 DJ-1タンパク質は酸化ストレスによる神経細胞死を抑制する効果を有する ことが知られている。すなわち、酸化ストレスを与える 6—ヒドロキシドーノ ミンを注入さ れたパーキンソン病モデルラットに、 6—ヒドロキシドーパミンの注入と同時又は注入 後に DJ-1タンパク質を注入すると、ドーパミン神経細胞死が抑制され、行動異常が 改善されることが報告されて ヽる (非特許文献 5)。
また、パーキンソン病モデルラットに、 DJ-1タンパク質の C106変異体（106番目の アミノ酸残基が、システィン力 セリンに置換されたもの）は、ドーノ ミン神経細胞死を 抑制しな ヽことも報告されて ヽる (非特許文献 6及び 7)。
[0004] 非特許文献 1 : Neurochem Res 2004 Mar, 29(3);569- 577
非特許文献 2 : Neurochem Res 2003 Oct, 28(10);1563- 1574
非特許文献 3 : Annals of Neurol 1996 Oct, 40(4);663- 671
非特許文献 4 : Science. 2003 Jan, 299(5604);256- 9
非特許文献 5 : Experimental Neulology. 2002, 175;303- 317
非特許文献 6 : EMBO Reports. 2004 Feb, 5(2);213- 8.
非特許文献 7 : Biochem Biophys Res Commun. 2004 Jul 23, 320(2);389- 97.
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0005] 本発明は、神経細胞死抑止剤及び神経変性疾患治療薬、特にパーキンソン病を 治療するための薬剤を提供することを目的とする。
課題を解決するための手段
[0006] 本発明者らは、上記課題を解決するために、 DJ-1タンパク質に注目した。この DJ- 1タンパク質は、パーキンソン氏病と関連があること (非特許文献 4)、酸化ストレスによ る神経細胞死を抑制する効果を有すること (非特許文献 5)、更にパーキンソン病モ デルラットの DJ-1タンパク質を C106変異させたものはドーノ ミン神経細胞死を抑制 しな 、こと (非特許文献 6及び 7)等が知られて ヽた。
DJ— 1は 106番目のシスティン (C106)の酸化状態で活性が調節されており、— S H (還元型)から SO H、 SO Hへの酸ィ匕型に酸ィ匕程度により移行する。この内、 DJ 1が活性を有するのは前 2者（とりわけ、 SO H型が活性が最も高い)であり、 SO H
2 3 型は不活性である。
このことから、本発明者らは、 DJ-1タンパク質の活性部位 (即ち、 106番目のシステ イン残基の周辺領域）に結合する低分子化合物は、 SH、 SO H型に結合し、 SO
2 3
Hへの移行を阻害することにより、活性型 DJ— 1を維持すると考え、解析ソフトウェア FastDock (富士通株式会社製)を用いて候補ィ匕合物をスクリーニングした。
即ち、いくつかの候補低分子化合物を用いて、 DJ-1タンパク質の活性部位への結 合力を計算し、結合力（結合エネルギー）がある程度強い低分子化合物を選択し、そ の化合物を実際に各種試験を行った (後記の実施例参照)。
その結果、結合エネルギーが一定値以下（例えば、—60kcalZmol以下）のもの は、神経細胞死抑止硬化及び神経変性疾患治療効果があることを見出し、本発明を 完成させるに至った。
本発明の化合物は、 DJ-1タンパク質の酸化ストレスによる神経細胞死の抑制効果 を有するといえる。
即ち、本発明は、下記一般式 (化 1)
[化 1]
Figure imgf000004_0001
(式中、 R1は、同じであっても異なってもよぐ水素原子、炭素数 1〜6のアルキル基、 ヒドロキシメチル基若しくはシロキシメチル基（ CH -O-SiR6、R6は炭素数 1〜6
2 3
のアルキル基又はァリール基を表す。）、又は 2個の R1は共同して酸素原子（ = 0)を 表し、 R2及び R3は、同じであっても異なってもよぐ水酸基、アルコキシ基、ァリール ォキシ基、ァシルォキシ基（― O— CO— R7、 R7は炭素数 1〜6のアルキル基又はァ リール基を表す。）又はスルホ -ルォキシ基（ O— SO— R8、 R8は炭素数 1〜6の
2
アルキル基又はァリール基を表す。）を表し、但し、 R2と R3は共同して下式 (化 2) [化 2]
(1 ) 〇'
又は
< 〇z
Figure imgf000005_0001
を形成してもよぐ mは 0又は 1を表し、 R4は水素原子又はァセチル基を表し、 R5は水 素原子、水酸基又はニトロ基を表す。）で表される化合物を主成分とする神経変性疾 患治療薬である。
[0008] また本発明は、下記一般式 (化 3)
[化 3]
Figure imgf000005_0002
(式中、 〜 R11は、同じであっても異なってもよぐ水素原子、水酸基、アルコキシ基
、ァリールォキシ基、ァシルォキシ基（一 O— CO— R14、 R14は炭素数 1〜6のアルキ ル基又はァリール基を表す。）又はスルホ -ルォキシ基（— O— SO—R15、 R15は炭
2
素数 1〜6のアルキル基又はァリール基を表す。）を表し、但し、 R9及び R1C)は共同し て下式 (2)
[化 2]
(" ◦へ （2) ◦〜
< 又は を形成してもよぐ R12は水素原子又は—（CONH) R16 (式中、 R16はアルキル基、ァ リール基又は— CH (CONH ) (CH SO NH ) (CH CH (CH ) ) (式中、 q、 r及
2 q 2 2 2 r 2 3 2 s
び sは、 q+r + s = 2を満たす 0〜2の整数を表す。）を表し、 pは 1又は 2を表す。）を 表し、 R13は、水素原子、水酸基又はアルコキシ基を表し、 nは 0〜2の整数を表し、 o は 0又は 1を表す。 )で表される化合物を主成分とする神経変性疾患治療薬である。 発明の効果
[0009] 本発明により、これまでの神経変性疾患の治療薬である対症療法薬とは異なるメカ -ズムの原因療法薬が提供される。特に、パーキンソン病の新たな治療薬又は予防 薬が提供される。
発明を実施するための最良の形態
[0010] 本発明の化合物は下式 (ィ匕 1)で表される。この中で（1)が好ましい。これら化合物 はプリン又はピリミジン残基及び糖残基を含む共通の構造を有しており、 DJ-1タンパ ク質の活性部位との結合と 、う観点から見た場合に、これら化合物の違 、は著 、差 をもたらすものではない。
[化 1]
Figure imgf000006_0001
[0011] ITは、同じであっても異なってもよぐ水素原子、炭素数 1〜6のアルキル基、ヒドロ キシメチル基（— CH OH)、シロキシメチル基、又は 2個の R1は共同して酸素原子（
2
= o)を表し、好ましくは一方が水素原子で他方がヒドロキシメチル基を表す。
このシロキシメチル基は— CH -O-SiR6で表され、式中、 R6は炭素数 1〜6のァ
2 3
ルキル基又はァリール基、好ましくは炭素数 1〜6のアルキル基を表す。このアルキ ル基としてはメチル基が好ましぐァリール基としてはフ ニル基が好まし!/、。
[0012] R2及び R3は、同じであっても異なってもよぐ水酸基、アルコキシ基、ァリールォキ シ基、ァシルォキシ基又はスルホニルォキシ基、好ましくは水酸基を表す。
このアルコキシ基としては、炭素数が 1〜6のアルコキシ基が好ましぐァリールォキ シ基としては、フエノキシ基が好ましい。
このァシルォキシ基は— O— CO— R7で表され、式中、 R7は炭素数 1〜6のアルキ ル基又はァリール基、好ましくは炭素数 1〜6のアルキル基を表す。このアルキル基と してはメチル基が好ましぐァリール基としてはフエニル基が好ましい。
このスルホ -ルォキシ基は— O— SO— R8で表され、式中、 R8は炭素数 1〜6のァ
2
ルキル基又はァリール基、好ましくは炭素数 1〜6のアルキル基を表す。このアルキ ル基としてはメチル基が好ましぐァリール基としてはフ ニル基が好まし!/、。 [0013] また、 R2と R3は共同して下式 (化 2)
[化 2]
(" ◦へ （2) ◦〜
く ヌは H3C を形成してもよぐこれらは共同して式 (化 2) (1)を形成することが好ましい。
mは 0又は 1、好ましくは 0を表す。
R4は水素原子又はァセチル基（ COCH )、好ましくはァセチル基を表す。
3
R5は水素原子、水酸基又は-トロ基（一 NO )、好ましくは-トロ基を表す。
2
[0014] 本発明の別の化合物は下式 (ィヒ 3)で表される。この化合物はベンゼン環から炭素 骨格 2つを挟んでペプチド結合と 、う特徴的な構造を有しており、 DJ-1タンパク質の 活性部位との結合と 、う観点力 見た場合に、この一般式に含まれる化合物の違 ヽ は著し ヽ差をもたらすものではな 、。
[化 3]
Figure imgf000007_0001
R9〜RUは、同じであっても異なってもよぐ水素原子、水酸基、アルコキシ基、ァリ ールォキシ基、ァシルォキシ基又はスルホ -ルォキシ基を表す。
ァシルォキシ基は O— CO— R14で表され、式中、 R14は炭素数 1〜6のアルキル 基又はァリール基、好ましくは炭素数 1〜6のアルキル基を表す。このアルキル基とし てはメチル基が好ましぐァリール基としてはフ ニル基が好ましい。
スルホ -ルォキシ基は O— SO— R で表され、式中、 R は炭素数 1〜6のアル
2
キル基又はァリール基、好ましくは炭素数 1〜6のアルキル基を表す。このアルキル 基としてはメチル基が好ましぐァリール基としてはフ ニル基が好ましい。
[0015] R9〜R"のうち、好ましくは少なくとも 1つ、より好ましくは 2つ、最も好ましくは全ては 水素原子である。
R9及び R1C>は共同して下式 (2) [化 2]
〇、
Figure imgf000008_0001
を形成してもよぐこれらは共同して式 (化 2) (1)を形成することが好ましい。
R12は水素原子又は—（CONH) R16、好ましくは—（CONH) R16を表し、 pは 1又
P P
は 2、好ましくは 1を表す。式中、 R16はアルキル基、ァリール基又は—CH (CONH )
(CH SO NH ) (CH CH (CH ) )、好ましくは— CH (CONH ) (CH SO NH q 2 2 2 r 2 3 2 s 2 q 2 2 2
) (CH CH (CH ) )を表す。アルキル基としては好ましくは炭素数が 1〜6のアルキ r 2 3 2 s
ル基、ァリール基としては好ましくはフエ-ル基を表す。この式中、 q、 r及び sは、それ ぞれ独立して、 + + 3 = 2を満たす0〜2の整数を表し、好ましくは qは 1である。 R12 は、例えば、下式 (化 4)
[化 4]
Figure imgf000008_0002
で表される。
R13は、水素原子、水酸基又はアルコキシ基、好ましくは水素原子を表す。アルコキ シ基としてはメトキシ基が好ま U、。
nは 0〜2の整数、好ましくは 0又は 1を表す。
oは 0又は 1、好ましくは 0を表す。
候補ィ匕合物が DJ-1タンパク質の活性部位 (即ち、 106番目のシスティン残基の周 辺領域）に結合する力否かは、以下のように DJ-1タンパク質の活性部位の構造に基 づくコンピューターによるバーチャルスクリーニングによりの DJ-1タンパク質と候補ィ匕 合物との複合体の結合エネルギーに基づいて判断した。
このバーチャルスクリーニングは、解析ソフトウェア FastDock (富士通株式会社製） を用いて行った。この FastDockは、拡張 PMF法という評価関数を用いてタンパク質 と候補ィ匕合物との間の結合エネルギーの計算を行うためのソフトウェアである。ハード ウェアには BioServer (富士通株式会社製)を用 ヽた。
複合体の結合エネルギーは、 PMF (Protein Mean Force)手法に基づいて計算し た。 PMF手法とは、タンパク質とリガンドとの結合エネルギーを、三次元構造データ ベースを用いた統計解析により予測するための手法であって、タンパク質—リガンド（ 化合物)複合体を設定し、その設定された複合体の原子間の全組における相互作用 エネルギーの合計を求める。このバーチャルスクリーニングで用いられる PMF手法 は、レナードジョーンズポテンシャルを用いた手法である。
[0018] バーチャルスクリーニングは以下の工程から成る。
第一工程: DJ—1タンパク質の活性部位の最適化構造の情報を得る。
第二工程:対象とする化合物の構造の情報を得る。
第三工程:最適化構造の活性部位と、化合物との複合体の結合エネルギーを、化 合物の構造のコンフォーマーを変化させながら求める（ドッキング工程)。
[0019] [第一工程について]
DJ— 1タンパク質の活性部位の最適化構造の情報は、 1) DJ— 1タンパク質全体の X線構造解析の情報を得て、 2)得られた情報から分子構造を修正し、かつ全体構造 を最適化して、 3) DJ— 1タンパク質の C106領域を活性部位として設定する、ことによ り得られる。 DJ— 1タンパク質全体の X線構造の情報は、 J. Biol. Chem. 278 pp.3138 0 (2003)から得た。得られた X線構造の情報からの DJ—1タンパク質全体の分子構造 の修正を行うための処理の例には、水素付加処理、及び水分子の処理などが含まれ る。水素付加処理とは、読み込まれた X線構造の情報に水素原子を付加する処理で あって、水素結合を反映させた最適化構造を得るために必要となる処理である。水分 子の処理とは、溶媒及びタンパク質内部にある水分子を含んだ状態の、 DJ— 1タン ノ ク質全体の立体構造を得た後に、タンパク質内部の水分子を取り除いて最適化さ れた構造を得るための処理である。水分子の処理により、最適化構造に水分子の影 響を考慮に入れつつ、化合物との複合体の結合エネルギーが、 DJ—1タンパク質と 化合物との直接的な結合に基づいて算出されうる。
[第二工程について]
化合物ライブラリーに含まれる sdfファイル力 化合物の二次元構造を読み取り、分 子力学計算により水素位置の補正を行うことで三次元構造にする。
[第三工程について]
ドッキング工程は、対象とする化合物の三次元構造を変化させながら、化合物の各 コンフォーマーと、最適化された構造の活性部位との複合体の結合エネルギーをそ れぞれ計算し、もっとも低い結合エネルギーを求める。三次元構造を変化させるとは 、化合物の結合のねじれを変化させながら空間的な配置を変えることであり、種々の コンフォーマーを発生させる。
[0020] この計算と後述の実施例から、 DJ—1活性部位との結合エネルギーが— 60kcalZ mol以下、特に— 90kcalZmol以下の低分子化合物は、神経細胞死抑止効果及び 神経変性疾患治療効果があることがわ力つた。
DJ— 1活性部位と低分子化合物の結合エネルギーが— 60kcalZmol以下、特に — 90kcalZmol以下であることによって、強固な結合が維持され、後述の実施例に あるように、 DJ—1の SO H型への過剰酸化型への移行を抑制し、その結果、 DJ
3
1の生物活性が高められ、酸化ストレスによる神経細胞死を抑制することができた ためと考えられる。
[0021] 本発明の化合物をヒトを含む生体内に投与すると、神経細胞内の活性酸素を消去 し、その細胞死を抑制し、神経細胞死抑止剤及び神経変性疾患治療薬として機能 する。これは、本発明の化合物が DJ—1タンパク質に結合し、後述の実施例におい て示すように、 DJ—1タンパク質の抗酸ィ匕作用を高めるためであると考えられる。
[0022] 一方、ドーパミン神経細胞死を抑制するための神経変性疾患治療剤は血管脳関門 を通過できることが好ましいが、一般に核酸構造を有する化合物は血管脳関門を通 過することができるので、本発明の化合物のようにプリン又はピリミジン残基と糖残基 を含む化合物は神経変性疾患治療剤として好ましく用いられうる。
本発明の化合物が治療薬として用いられうる神経変性疾患の例には、パーキンソン 病、アルツハイマー病、ハンチントン舞踏病、 ALS、卒中などが含まれるが、好ましく はパーキンソン病である。これらの神経変性疾患は、酸化ストレスによる神経細胞死 が発症原因と考えられており、本発明の化合物が有効に作用する。
神経変性疾患治療薬に含まれる本発明の化合物の濃度は特に限定されない。本 発明の神経変性疾患治療薬は、本発明の効果を損なわない限り、前記化合物以外 に任意の成分を含むことができる。本発明の変性疾患治療薬の投与方法は特に限 定されず (経口投与、注射投与など)、またその剤型も特に限定されない (散剤、錠剤 、注射液剤など)。
実施例
[0023] 以下、実施例にて本発明を例証するが本発明を限定することを意図するものでは ない。
靈列 1
実施例で用 、るために DJ— 1に結合する化合物として下式の化合物 1〜6、 DJ— 1 との結合力が低 、ィ匕合物として下式の化合物 7及び DJ— 1に結合しな 、化合物とし て下式の化合物 8を用意した。
[化 5]
Figure imgf000011_0001
Figure imgf000011_0002
[0024] [化 6]
Figure imgf000011_0003
[化 7]
Figure imgf000012_0001
[0025] 入手先又は製法：
化合物 1〜4、 7 :愛知学院大学 薬学部 薬化学講座，廣田耕作氏
化合物 5 :星薬科大 薬品製造化学 ·本多利雄氏
ィ匕合物 6 : University of Sofia, Medicinal Cnemistry, Prof. Hnsto Daskalov 化合物 8 :東北大学 大学院薬学研究科 医薬資源化学 ·大島吉輝氏
[0026] 化合物 5 :下式のフヱネチルァミン（I) (1.0 mol)をベンゼンに溶解し、下式のカルボ ン酸 (Π) (1.1 mol)を室温にて徐々に加えた。この溶液を原料が消失するまで攪拌し
、ろ過や水洗等の処理をした後、生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにて精 製して、対応するアミドを無色結晶として収率 70%で得た。
[化 8]
Figure imgf000012_0002
( 1： ( Π )
[0027] 化合物 6： L-フエ-ルァラニン'メチルエステルヒドロキシクロライド（Fluka Chemical 社) 862mgを 0.2Mマレイン酸緩衝液に溶解し、 0.5N水酸化ナトリウムを用いて pH6.7に 調整した。サーモリシン（Fluka Chemical社） 10mgをカ卩え、ベンジルォキシカルボ-ル グリシン (Fluka Chemical社) 418mgをさらに加えた。反応溶液を 3時間混合し、 2- (2- ベンジロキシカルボ-ルァミノ ァセチルァミノ) -3-フエ-ル プロピオニック酸メチ ルエステルを得た。
前記 2-(2-ベンジロキシカルボ-ルァミノ ァセチルァミノ) -3-フエ-ル プロピオ- ック酸メチルエステル 370mgをメチルアルコール 50mlに溶解し水酸化ナトリウムを用い て溶液をアルカリ性にし、一晩室温にて混合した。さらに塩酸を用いて PH7.0に調整 した後、蒸発によって結晶 2-(2-ベンジルォキシカルボニルアミノーアセチルァミノ) -3 -フエニルプロピオニック酸を析出させた。
前記 2-(2-ベンジルォキシカルボ-ルァミノ ァセチルァミノ)- 3-フエ-ルプロピオ ニック酸 712mgを 0.2M重炭酸緩衝液 10mlに溶解させ、 5N塩酸で pH9.3に調整した。 そして α -キモトリブシン（Fluka Chemical社） 24mgを加え、さらに L-システインスルホ ンアミド (Fluka Chemical社) 334mgをカ卩えた。反応溶液を 2時間混合した後、ろ過して 生成物を得た。
[0028] これらの化合物は、財団法人科学技術教育協会（Foundation for Education of Scie nce and Technology)の構築する大学ィ匕合物データベース (The University Compoun d Data Base)に登録されており、同協会力 入手可能である。
[0029] それぞれの化合物につ 、て下記の条件で質量分析（Electrospray (ESI) mass spect ra)を行った。使用機器と条件は以下のとおりである： JMS-700TZ (JEOL, Tokyo, Jap an) four-sector (BE/BE) tandem mass spectrometer, fypicai measurement condition s are as follows: acceleration voltage, 5.0 kV; needle voltage, 3.24 kV; orifice 1 volt age, 0.0 kV; ring lens voltage, 60.0 V; desolvation temperature, 80。し； orifice 1 tem perature, 230°C; sample flow rate, 22 μ L/min; solvent, chloroform. For sample injec tion, a syringe pump (Harvard PHD 2000 Advanced Syringe Pump, Harvard Apparat us, Holliston, MA) was used. Mass spectra were recorded in the positive ion mode w ithin m/z 100-1500.
[0030] 化合物 1〜8の質量分析チャートを図 1〜8に示す。
なお、上述の解析ソフトウェア FastDock (富士通株式会社製)を用いて行った DJ- 1タンパク質の活性部位 (即ち、 106番目のシスティン残基の周辺領域）との複合体 の結合エネルギーは、それぞれ、 - 91.3kcal/mol(ィ匕合物 1)、 - 101.9kcal/mol(ィ匕合物 2 )、— 98.1kcal/mol(ィ匕合物 3)、— 97.9kcal/mol(ィ匕合物 4)、— 103.4kcal/mol(ィ匕合物 5)、—1 02.91kcal/mol(ィ匕合物 6)、 - 56.3kcal/mol (ィ匕合物 7)、 +209.9kcal/mol(ィ匕合物 8)であつ た。
[0031] 実施例 1
本実施例では、化合物 1〜8のヒト神経細胞 SH-SY5Yの細胞死の抑制効果を調 ベた。
96穴プレートにヒト神経細胞 SH— SY5Y (米国 'American Tissue Culture Collecti on)を播種して、 80%コンフルェントまで培養した。
滅菌水溶液中の化合物 1〜8をそれぞれ添加してサンプル濃度を 1 μ Μとし、コント ロール用に滅菌水を添カ卩した。
化合物 1〜8又は滅菌水添加の 24時間後に、それぞれに、 6-ヒドロキシド—パミン（ PBS溶媒）（和光純薬)を添加して 6-ヒドロキシド—パミン濃度を 100 Μとし、一方、 同量の PBS (6—ヒドロキシド一ノ ミンを含まない）を添カロした。さらに、 6—ヒドロキシド —パミン添カ卩の 40時間後に、 ΜΤΤアツセィを行うための Cell Counting Kit- 8を添カロ した。
3時間後に、波長 450nmにおける吸光度を測定して生存細胞数を計測した。化合 物 1〜8及びコントロールのそれぞれについて、「6—ヒドロキシドーパミンを添カ卩した 場合の生存細胞数 Z6—ヒドロキシドーパミンを添加していない場合の生存細胞数」 を求めて細胞生存率 (Viability)とした。
図 9に、化合物 1〜8又は滅菌水（コントロール)を添加した場合の細胞生存率を示 した。コントロール及びィ匕合物 7及び 8と比較して、化合物 1〜6を添カ卩した場合はい ずれも、細胞生存率が高まっていることがわかる。
[0032] 実施例 2
本実施例では、化合物 1〜5の過酸化水素消去効果を調べた。
10cmディッシュにヒト神経細胞 SH— SY5Yを播種して、 80%コンフルェントまで 培養した。化合物 1〜5をそれぞれ添加して化合物濃度を 10 Mとし、又は滅菌水 を添加した。化合物又は滅菌水添加の 24時間後に、過酸化水素を添加して過酸ィ匕 水素濃度を 50 Mとした。過酸化水素添加の 1時間後に、蛍光色素 DCFH-DA (D ichlorofluorescein diacetate)を添カ卩して 15分間インキュベートした。細胞を回収して 、蛍光強度を FACSで測定して、細胞内過酸化水素量を求めた。
図 10に測定結果を示す。いずれの場合も、化合物と過酸ィ匕水素を添加したときは 、過酸ィ匕水素だけを添加したときと比較して、蛍光強度が弱い、すなわち過酸化水素 量が少ないことがわかる。
[0033] 実施例 3
本実施例では、 AffinixQ (株式会社ィ-シアム）を用いて、化合物 1, 2, 4及び 6が DJ-1タンパク質に結合することを確認した。
AffinixQとは、生体分子間の相互作用を水晶発振子の周波数変化によりナノダラ ムオーダーで定量化する装置である。水晶振動子の振動数変化と、水晶振動子表 面に付着した重量との間に、比例関係があることを利用している。
発振子であるセンサーチップ上に、化合物をァミノカップリング試薬を用いて固定し た。 8mlの PBS (リン酸緩衝液）が入れられた測定槽に、化合物を固定したセンサー チップを浸し、振動数が一定になるまで保持した。その後、測定槽中に lmgZmlの DJ-1タンパク質又は BS A (bovine serum albumin)を 8 μ 1添カ卩した。
それぞれの振動数変化を測定した結果を、図 11に示す。 DJ— 1を添加した場合は 、 BSAを添加した場合と比較して、振動数が顕著に減少しており、 DJ-1と化合物が 結合していることを示す。
[0034] 実施例 4
本実施例では、化合物 1と化合物 5が DJ— 1の酸ィ匕型への移行を抑制していること を確認した。
0. 5mgの DJ— 1精製タンパク質を PBSlmlに溶解した。その DJ— 1タンパク質溶 液 500 1に ImMのィ匕合物 1、 5又は 7を 10 1カロえ、 1時間、 4。Cでローテ一卜した。 その後、 0. 4又は 4mMの過酸化水素（H O )を加え、 1時間室温に放置し、過酸ィ匕
2 2
水素濃度を 0. 2mM又は 2mMとした。さらに PBSで 3回、合計で 4. 5時間、透析を 行った後、 DJ— 1タンパク質 0. 5 g分を等電点電気泳動に使用した。等電点電気 泳動に用 ヽた試薬を以下に示す。
等電点電気泳動用ゲル溶液： 9.2 M Urea, 2 % NP- 40, 4 % acrylamide, 1 % Amphol ine Η 5—8; Amersham Bioscience),丄％ Ampnoline、pH «3—10； Amersham Bioscienc Sample Buffer: 5 M Urea, 2 M Thio Urea, 2 % NP— 40, 5 % Glycerin, 5 % 2— mercapt oethsnol, 1.6 % Ampholine (pH 5-8), 0.4 % Ampholine (pH 3.5-10)
保護液： 8 M Urea, 0.8 % Ampholine (pH 5-8), 0.2 % Ampholine (pH 3.5-10) 泳動 Buffer +極： 0.02 M Phosphoric acid
極： 0.02 M NaOH
Towbin: 25 mM Tris, 192 mM Glycine
図 12に泳動結果を示した。化合物 8と比較して化合物 1及び化合物 5では DJ— 1タ ンパク質の酸ィ匕型への移行が抑制されていることがわかる。
例 5
本実施例では、化合物 1, 5及び 8のミトコンドリア complexl活性の維持効果を調べ た。
6-ヒドロキシド—パミンは Complexlの酵素活性を低下させ機能障害を起こすことで 酸化ストレスを誘導する。今回同定したィ匕合物は complexl活性低下を防ぐことで、酸 ィ匕ストレスによる神経細胞死を抑制しているのではないかと考え、化合物添カ卩による c omplexl活性の変化を測定した。
10cmディッシュにヒト神経細胞 SH— SY5Yを播種して、 80%コンフルェントまで 培養した。化合物 1, 5及び 8をそれぞれ添加して化合物濃度を 1 μ Μとし、又は滅菌 水を添加した。化合物又は滅菌水添加の 24時間後に、 6 ヒドロキシドーパミン (ΡΒ S溶媒）を添カ卩して 6 ヒドロキシド—パミン濃度を 50 /ζ Μとし、一方、同量の PBS (6 —ヒドロキシド一パミンを含まない）を添カロした。さらに、 6—ヒドロキシド一パミン添カロ の 6時間後に細胞を回収した。この細胞懸濁液をポッターホモジナイザーで 80回、 氷中で破砕した。この破砕液を 4°C, 800 X gで 8分間遠心し、その上清をさらに 4°C , 11000 X gで 30分間遠心し、上清を除き、そのペレットに 0. 25Msucroseを 200 1加え、これをミトコンドリア画分とした。タンパク定量後、 100 g分のミトコンドリアタ ンパク質を reaction bufferの入ったキュベットに加え、全量で 480 μ 1にした。 37。Cで 3 分間インキュベートした後、 5mMNADHを 20 1キュベットに添カ卩し、吸光光度計を 用いて 340nmの吸光度の減少を 4分間測定した。 [0036] reaction bufferの組成ならびに Complexl活性の算出法を以下に示す。
Reaction buffer: 6.65 mM NaH PO , 28.35 mM Na HPO , 5 mM MgCl , 5 mM EDTA
2 4 2 4 2
, 1 mg/ml BSA, 2 ng/ml antimycine, 50 μ M ubiquinone 1, 2.65 mM NaCN
Complex 1活性（； z mol NADH oxidized/mg protein)= Δ A340 /4/6.22 X 1000 X 0.5 /0.1
ΔΑ340：測定前後の 340 nmの吸光度の差
4：測定時間 (分）
6.22： NADHの mmol分子吸光係数
0.5：キュベット中の溶液量（ml)
0.1 ：タンパク質量 (mg)
[0037] 図 13に、化合物 1, 5及び 8又は滅菌水（コントロール）を添カ卩した場合の Complexl 活性を示した。コントロール及びィ匕合物 8と比較して、化合物 1又は 5を添加した場合 には Complexl活性が維持されていることがわかる。
[0038] 実施例 6
本実施例では化合物 1, 5及び 8をラットの中脳左黒質に注射してその影響を調べ た。
(1) 6mM6 -ヒドロキシドノミン（6 - OHDA)単独、又は 6mM6 - OHDAに各化合 物 ImM加えた混合液を、ラット（Wister rat,ォス、 250g)の中脳左黒質（4. 8mmxl. 8mm, 7. 8mmdepth)に注射した。このラット中脳の左黒質に 6mM6—ヒドロキシド ノ ミン (6— OHDA)注入したラットでは右側黒質は正常、左側は酸化ストレス誘導ド ノ ミン神経細胞死が起こっているため、作用のドパミン量のアンバランスからラットは 時計回りに回転し、パーキンソン病患者特有の行動異常を示す。
9週間後、ラットにドパミン遊離を引き起こすメタンフェタミン (大日本製薬)を注射す ると、ドパミン-ユーロンより多量のドパミンが線条体に遊離される。左右黒質の放出 されるドパミン量のアンバランスにより、ラットは時計回りに回転を始める。ラットをロー ターメーターにいれ、この回転数を測定した。 60分での総回転数を図 14に、 5分毎 の時間経過による回転数を図 15に示す。
この図より、化合物 1又は 5を 6— OHDAと同時に注入すると、回転数の減少が観 察され、行動異常が 55— 65%抑制された。この抑制効率の割合は極めて高いとい える。一方、化合物 8はその効果がな力つた。即ち、パーキンソン病に見られる行動 異常が化合物 1, 5によって大幅に改善された。
[0039] (2)上記で行動異常テストを行ったラットを 10 mM PBS50 mlで還流後、 100 mMリン 酸バッファー（4%パラホルムアルデヒド、 0.35%グルタルアルデヒド、 0.2%ピクリン酸を 含む。） 300 mlで還流した。中脳黒質（SNpc)を取り出し、 4%パラホルムアルデヒドを 含んだ 100 mMリン酸バッファーで 2日間固定後、 100 mMリン酸バッファー（15%スク ロース、 0.1%アジドナトリウムを含む。 )に沈めた。クリスタルスタツトで厚さ 20 μ mに切 片を作成し、 0.3% Triton X-100を含んだ 100 mMリン酸バッファー (PBS-T)に沈めた この脳切片を抗チロシンヒドロキシラーゼ (TH：ドパミン整合性の酵素でドパミン神 経のマーカー、 Sigma社製、 1:20,000稀釈)と 4°Cで 3日反応させた後、洗浄し、ピオ チン標識抗マウス IgG抗体 (1:2,000稀釈)と室温、 2時間反応させた。その後、 ABC k it(Vector Laboratories)を使 、、アビジンペルォキシダーゼ発色を室温 1時間行った 。 PBS—Tで数回洗浄後、ニッケルアンモ-ゥムを有する 3,3し diaminobenzidine(DAB )で発色させた。その結果を図 16に示す。図中、黒く染色されたところはドパミン神経 の存在を示す。
6— OHDAのみが注射された左黒質では、 TH染色が見られないことから、ドパミン 性-ユーロン死が見られる力 右黒質は 6— OHDA注射をしていないので、生きたド ノ ミン性-ユーロンが見られる（図 16 (1) )。し力し、化合物 1又は 5を 6— OHDAと同 時注射した左黒質は、力なりの割合で神経細胞死の抑制が見られた（図 16 (2) (3) ) 。化合物 8はその効果がな力つた（図 16 (4) )。
[0040] 以上から、 DJ-1タンパク質の活性部位 (即ち、 106番目のシスティン残基の周辺領 域）に結合する低分子化合物が、ヒト神経細胞死抑止効果 (実施例 1)、ミトコンドリア c omplexl活性の維持効果 (実施例 5)及びラットにおけるパーキンソン病患者特有症 状の改善効果 (実施例 6)があったのに対し、 DJ— 1タンパク質の活性部位との結合 力が低い化合物 7や、 DJ-1タンパク質の活性部位に結合しない化合物 8がこのような 効果が無力つたことは、 DJ— 1の活性部位に一定以上の結合力を示す低分子化合 物が神経細胞死抑止効果及びパーキンソン病治療効果があることを示している。 図面の簡単な説明
[図 1]化合物 1 (M.W. 291)の質量分析チャートを示す図である。ニードル電圧: 2.4 kV 、オリフィス電圧: 0 V、リングレンズ電圧: 50 V、イオンガイド電圧: 3 V、移動相溶媒: C HC1： MeOH=4: l構造式力も計算した分子量よりも測定値が大きいが、糖部ラタトン環
3
が加水分解されカルボン酸になった構造を示す。
[図 2]化合物 2 (M.W. 329)の質量分析チャートを示す図である。ニードル電圧: 3.24 V、オリフィス電圧: 0 VV、リングレンズ電圧: 60 V、イオンガイド電圧: 3 V、移動相溶媒 ： CHC1 分子量と測定値が一致している。
3
[図 3]化合物 3 (M.W. 289)の質量分析チャートを示す図である。ニードル電圧: 2 V、 オリフィス電圧: 0 V、リングレンズ電圧: 50 V、イオンガイド電圧: 3 V、移動相溶媒: Me OH 化合物にナトリウムイオンがついた場合のピーク（289+23=312)が見られる。
[図 4]化合物 4 (M.W. 312)の質量分析チャートを示す図である。ニードル電圧: 3.4 V 、オリフィス電圧: 0 V、リングレンズ電圧: 50 V、イオンガイド電圧: 3 V、移動相溶媒: C HC1： MeOH=4: l 分子量と測定値が一致している。
3
[図 5]化合物 5 (M.W. 450)の質量分析チャートを示す図である。ニードル電圧: 3.24 V、オリフィス電圧: 0 V、リングレンズ電圧: 60 V、イオンガイド電圧: 3 V、移動相溶媒: C HC1 分子量と測定値が一致している。
3
[図 6]化合物 6 (M.W. 505)の質量分析チャートを示す図である。ニードル電圧: 2 V、 オリフィス電圧: 0 V、リングレンズ電圧: 80 V、イオンガイド電圧: 3 V、移動相溶媒: Me OH 化合物にナトリウムイオンがついた場合のピーク（505+23=528)が見られる。
[図 7]化合物 7 (M.W.391)の質量分析チャートを示す図である。ニードル電圧 2 V、ォ リフィス電圧： 0 V、リングレンズ電圧： 50 V、イオンガイド電圧： 3 V、移動相溶媒: MeO H 化合物にナトリウムイオンがついた場合のピーク（391+23=414)が見られる。
[図 8]化合物 8 (M.W. 604)の質量分析チャートを示す図である。ニードル電圧: 3.24 V、オリフィス電圧: 0 V、リングレンズ電圧: 60 V、イオンガイド電圧: 3 V、移動相溶媒: C HC1 分子量と測定値が一致している。
3
[図 9]試験化合物の細胞死抑制効果を示す図である。 圆 10]試験化合物の細胞内過酸ィ匕水素消去効果を示す図である。
[図 11] Aff inixQによる試験化合物の振動数変化を示す図である。
圆 12]試験化合物の DJ—1酸化抑制効果を示す図である。
[図 13]試験化合物の Complexl活性維持効果を示す図である。
[図 14]DJ-1結合ィ匕合物注射 60分後のモデルラットの総回転数を示す図である。
[図 15]DJ-1結合ィ匕合物注射後 5分毎の時間経過によるモデルラットの回転数を示す 図である。
[図 16]6-OHDAと DJ-1結合ィ匕合物を注射したラット中脳の TH (ドパミン神経のマーカ 一）による染色写真を示す。左側は注射した左黒質、右側は正常な右黒質を示す。 右の四角内は左黒質の拡大写真を示す。

Claims

請求の範囲 [1] 下記一般式 (化 1)
[化 1]
Figure imgf000021_0001
(式中、 R1は、同じであっても異なってもよぐ水素原子、炭素数 1〜6のアルキル基、 ヒドロキシメチル基若しくはシロキシメチル基（— CH -O-SiR6、R6は炭素数 1〜6
2 3
のアルキル基又はァリール基を表す。）、又は 2個の R1は共同して酸素原子（ = 0)を 表し、 R2及び R3は、同じであっても異なってもよぐ水酸基、アルコキシ基、ァリール ォキシ基、ァシルォキシ基（― O— CO— R7、 R7は炭素数 1〜6のアルキル基又はァ リール基を表す。）又はスルホ -ルォキシ基（— O— SO— R8、 R8は炭素数 1〜6の
2
アルキル基又はァリール基を表す。）を表し、但し、 R2と R3は共同して下式 (化 2) [化 2]
( 1 ) ◦
Figure imgf000021_0002
A〇 を形成してもよぐ mは 0又は 1を表し、 R4は水素原子又はァセチル基を表し、 R5は水 素原子、水酸基又はニトロ基を表す。）で表される化合物を主成分とする神経変性疾
[2] 下記一般式 (化 3)
[化 3]
Figure imgf000021_0003
(式中、 R9〜RUは、同じであっても異なってもよぐ水素原子、水酸基、アルコキシ基 、ァリールォキシ基、ァシルォキシ基（一 O— CO— R14、 R14は炭素数 1〜6のアルキ ル基又はァリール基を表す。）又はスルホ -ルォキシ基（— O— SO—R15、 R15は炭
2
素数 1〜6のアルキル基又はァリール基を表す。）を表し、但し、 R9及び R1Gは共同し て下式 (2)
[化 2]
Figure imgf000022_0001
を形成してもよぐ ま水素原子又は一（CONH) (式中、 はアルキル基、ァ
P
リール基又は— CH (CONH ) (CH SO NH ) (CH CH (CH ) ) (式中、 q、 r及
2 q 2 2 2 r 2 3 2 s
び sは、 q+r + s = 2を満たす 0〜2の整数を表す。）を表し、 pは 1又は 2を表す。）を 表し、 R13は、水素原子、水酸基又はアルコキシ基を表し、 nは 0〜2の整数を表し、 o は 0又は 1を表す。 )で表される化合物を主成分とする神経変性疾患治療薬。
[3] 下記一般式 (化 1)
[化 1]
Figure imgf000022_0002
(式中、 R1は、同じであっても異なってもよぐ水素原子、炭素数 1〜6のアルキル基、 ヒドロキシメチル基若しくはシロキシメチル基（— CH -O-SiR6、R6は炭素数 1〜6
2 3
のアルキル基又はァリール基を表す。）、又は 2個の R1は共同して酸素原子（ = 0)を 表し、 R2及び R3は、同じであっても異なってもよぐ水酸基、アルコキシ基、ァリール ォキシ基、ァシルォキシ基（― O— CO— R7、 R7は炭素数 1〜6のアルキル基又はァ リール基を表す。）又はスルホ -ルォキシ基（— O— SO— R8、 R8は炭素数 1〜6の
2
アルキル基又はァリール基を表す。）を表し、但し、 R2と R3は共同して下式 (化 2) [化 2]
Figure imgf000023_0001
を形成してもよぐ mは 0又は 1を表し、 R4は水素原子又はァセチル基を表し、 R5は水 素原子、水酸基又はニトロ基を表す。）で表される化合物。
下記一般式 (化 3)
[化 3]
Figure imgf000023_0002
(式中、 〜 R11は、同じであっても異なってもよぐ水素原子、水酸基、アルコキシ基
、ァリールォキシ基、ァシルォキシ基（一 O— CO— R14、 R14は炭素数 1〜6のアルキ ル基又はァリール基を表す。）又はスルホ -ルォキシ基（— O— SO—R15、 R15は炭
2
素数 1〜6のアルキル基又はァリール基を表す。）を表し、但し、 R9及び R1Gは共同し て下式 (2)
[化 2]
(" ◦へ （2) ◦〜
< 又は を形成してもよぐ R12は水素原子又は—（CONH) R16 (式中、 R16はアルキル基、ァ リール基又は— CH (CONH ) (CH SO NH ) (CH CH (CH ) ) (式中、 q、 r及
2 q 2 2 2 r 2 3 2 s
び sは、 q+r + s = 2を満たす 0〜2の整数を表す。）を表し、 pは 1又は 2を表す。）を 表し、 R13は、水素原子、水酸基又はアルコキシ基を表し、 nは 0〜2の整数を表し、 o は 0又は 1を表す。）で表される化合物。
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