WO2007055325A2 - 動脈硬化性疾患予防・治療薬および治療手段の評価方法 - Google Patents

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Hiromitsu Fuse
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Makiko Itasaka
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Kazuki Kubo
Hiromitsu Fuse
Koji Yamamoto
Makiko Itasaka
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    • G01N2800/32—Cardiovascular disorders
    • G01N2800/323—Arteriosclerosis, Stenosis

Definitions

  • the present invention relates to an action (for example, pharmacological activity (for example, enzyme activity) of exacerbating arteriosclerosis of a substance (particularly protein) having a property of exacerbating atherosclerosis present in arteriosclerotic lesions represented by ACAT.
  • pharmacological activity for example, enzyme activity
  • ACAT arteriosclerotic lesions represented by ACAT.
  • ACAT Alzheimer's disease .
  • ACAT inhibitors that inhibit the activity of ACAT are expected to be used as prophylactic and therapeutic agents for arteriosclerosis by lowering blood cholesterol and suppressing foam cell formation, and many ACAT inhibitors have been developed to date. Being
  • Avasimibe was recognized as an ACAT inhibitor that has anti-arterial stiffening effects such as lowering cholesterol esters in arteriosclerotic lesions in various animal models such as mice, rabbits, and hamsters in preclinical studies ( Non-patent document 1 3).
  • the results of anti-arteriosclerosis in these preclinical studies are accompanied by a decrease in plasma cholesterol due to inhibition of ACAT in the liver and small intestine, and Avasimibe inhibits ACAT in atherosclerotic lesions. No experimental results have been shown that directly indicate an arteriosclerotic effect.
  • Avasimibe is a force of clinical trials based on the results of these preclinical studies. Although it has been observed to have effects on blood lipids that are thought to be based on ACAT inhibition in the liver and small intestine (Non-patent Documents 4 5), In clinical trials investigating anti-arteriosclerotic effects, the development was discontinued without any effect (Non-patent Document 6).
  • Non-Patent Document 1 “Circulation, 2001, 103, p. 1778—1786”
  • Non-patent Document 2 “Atelostare mouth cis, 1998, 137, p. 77—85”
  • Non-Patent Document 3 "Atelostare mouth cis, 2001, 157th, p. 97-105"
  • Non-Patent Document 4 "Atelostare mouth cis, 2001, 157th, p. 137-144"
  • Non-Patent Document 5 “Atelostare mouth cis, 2003, No.171, p. 273-279”
  • Non-Patent Document 6 “Circulation, 2004, No. 110, p. 3372-3377” Disclosure of the Invention
  • arteriosclerotic lesions Compared to the case of using cultured cells, etc., arteriosclerotic lesions have complex components (cell type diversity, non-cellular necrotic lesions, lipid accumulation, fiber, etc.).
  • the composition varies greatly depending on the individual collected and the site of collection, and therefore the amount of ACAT originally present in the sample varies considerably. Even if the ACAT enzyme activity shows a low value, the ability to show low activity due to the low amount of ACAT in the sample originally, or the result of ACAT inhibitor strongly inhibiting the enzyme As a result, it is not clear whether the activity of ACAT enzyme was low.As a result, it is difficult to accurately evaluate the enzyme inhibitory activity of ACAT inhibitors. there were.
  • the inventor selected a protein whose expression level correlates with ACAT in an arteriosclerotic lesion as an index instead of the amount of ACAT protein (hereinafter referred to as a correction marker), and originally in the sample.
  • the initial ACAT protein amount in each sample is evaluated using the protein amount of the corresponding correction marker instead of the amount of ACAT expressed and used as an index to determine the initial ACAT protein amount between each sample. It was considered that the problem could be solved by correcting the difficulty of evaluating the inhibitory activity based on the variation of the above, and the present invention was completed after intensive studies. That is, the present invention
  • the value corresponding to the strength of the action of exacerbating arteriosclerosis of a substance having the property of exacerbating arteriosclerosis present in the collected mammal-derived arteriosclerotic lesion sample is determined as the arteriosclerotic lesion of the substance.
  • the value corrected with the amount in the arteriosclerotic lesion sample of the correction marker that does not affect the therapeutic agent or the therapeutic means to be evaluated varies directly with the amount of A therapeutic drug for treating arteriosclerosis characterized by a comparative evaluation of the samples collected in each of the group administered with the drug for improving arteriosclerotic lesions, the group treated with the therapeutic means, and the non-treated group or the non-treated group.
  • the correction value divided by the value corresponding to the expression level in the atherosclerotic lesion sample is compared and evaluated with respect to samples collected from the administration group of the target protein pharmacological activity inhibitor and the non-administration group.
  • ACAT Protein having the property of exacerbating arteriosclerosis
  • ACAT enzyme activity ACAT enzyme activity
  • a correction marker expressed in correlation with the expression of the target protein in atherosclerotic lesions The evaluation method according to (2) above, wherein the value corresponding to the expression level in each atherosclerotic lesion sample is the enzyme activity of the correction marker;
  • a clinical dose of the inhibitor comprising selecting an inhibitor dose that inhibits the pharmacological activity of the target protein with a significant difference from the control group. How to set
  • An arteriosclerosis in a mammal characterized in that an inhibitor of the pharmacological activity of the target protein is formulated so as to contain a clinical dose set by the method described in (7) above per dosage unit. Preventive and Z or treatment of sexually transmitted diseases;
  • the same method as the evaluation method established for ACAT can be applied to the evaluation of inhibitors of pharmacological activity of proteins having the property of exacerbating other arteriosclerosis existing in arteriosclerotic lesions. Furthermore, it can be applied not only to protein, but also to the evaluation of drugs or therapeutic means that improve arteriosclerotic disease by acting directly or indirectly on substances that have the property of exacerbating arteriosclerosis present in arteriosclerotic lesions. . In particular, it is a useful evaluation method when it is difficult to quantify the target protein, or when it is difficult to quantify a substance having the property of exacerbating arteriosclerosis.
  • the direct action of an inhibitor on the target protein in the collected arteriosclerotic lesion can be evaluated. Therefore, it is possible to appropriately evaluate the effectiveness of an inhibitor by direct action on such an arteriosclerotic lesion. For example, when an evaluation is performed based on a collected arterial effect lesion sample derived from a human patient. Based on the effective dose in this evaluation, the clinical dose in actual patients can be reasonably determined.
  • FIG. 1 is a graph showing the correlation between ACAT enzyme activity and protein concentration in WHHL rabbit atherosclerotic lesions.
  • FIG. 2 A graph showing the correlation between ACAT enzyme activity and tissue weight of WHHL rabbit atherosclerotic lesions.
  • FIG. 3 is a graph showing the correlation between ACAT enzyme activity and total cholesterol content in WHHL magpie atherosclerotic lesions.
  • FIG. 4 A graph showing the correlation between ACAT enzyme activity and free cholesterol content in WHHL Usagi atherosclerotic lesions.
  • FIG. 5 is a graph showing the correlation between ACAT enzyme activity and cholesterol ester content in WHHL Usagi atherosclerotic lesions.
  • FIG. 6 A graph showing the correlation between ACAT enzyme activity and BETA-GALACTOSIDASE-GLB1) activity in WHHL Usagi atherosclerotic lesions.
  • FIG. 7 is a graph showing the correlation between ACAT enzyme activity and LYSOSOMAL ACID LIPASE (L AL) activity in WHHL rush arteriosclerotic lesions.
  • FIG. 8 A graph showing the correlation between ACAT enzyme activity and CATHEPSIN D (CTSD) in WHHL Usagi atherosclerotic lesions.
  • FIG. 9 is a graph showing the effect of correction using a marker for correction of ACAT enzyme activity in an ACAT enzyme inhibition test of compound X atherosclerotic lesion.
  • FIG. 10 is a graph showing the effect of Compound X on the content of WHHL usagre aorta cholesterol ester.
  • Target Is sometimes expressed in arteriosclerotic lesions that are not particularly limited, and the effects (pharmacological activity, etc.) of the arteriosclerotic lesions can be increased by Substances that have exacerbating properties (proteins, lipids (derivatives containing cholesterol and its acids, derivatives containing lipids other than cholesterol and its acids), substances derived from infectious microorganisms of arteriosclerotic lesions, etc.), etc. In particular proteins).
  • the “protein having the property of exacerbating arteriosclerosis” (hereinafter sometimes referred to as “target protein”) to which the present invention is applied is expressed in arteriosclerotic lesions that are not particularly limited, and has a pharmacological activity. Proteins that have the property of exacerbating atherosclerotic lesions, such as the expansion of atherosclerotic lesions, are widely included. Examples of such proteins include ACAT, lipoprotein-binding phospholipase A2, lipoxygenase, matrix metalloprotease, cathebsin and the like.
  • Anti-arteriosclerotic action of a substance having the property of exacerbating arteriosclerosis is an action that the target substance exerts in vivo (for example, enzyme activity) Signal transduction function, lipid accumulation, infiltration and proliferation of inflammatory cells, inflammation reaction, progression or weakening of arteriosclerotic lesions, etc.), for example, when the target substance is a protein, its pharmacological activity Say.
  • the “pharmacological activity of a protein having a property of exacerbating arteriosclerosis” refers to a pharmacological activity (for example, enzyme activity, signal transduction function, etc.) that the target protein exerts in vivo.
  • pharmacological activity for example, enzyme activity, signal transduction function, etc.
  • ACAT it refers to the enzyme activity.
  • Treatment means '' refers to a drug or treatment means that directly or indirectly acts on the target ⁇ substance having the property of exacerbating arteriosclerosis '' to improve arteriosclerotic lesions. It is not particularly limited as long as it has a drug or therapeutic means.
  • the target substance is an enzyme protein
  • an enzyme inhibitor is the target drug.
  • the target substance is a lipid
  • lipid lowering drugs for example, statins, fibrates, etc.
  • the “inhibitor of the pharmacological activity of the target protein” refers to a drug having an activity that inhibits the “pharmacological activity” of the target “protein having the property of exacerbating arteriosclerosis”, and is not particularly limited. Absent.
  • the target protein is ACAT
  • an ACAT inhibitor is the target drug.
  • the ACAT inhibitor to which the present invention is applied is not particularly limited as long as it has ACAT inhibitory activity.
  • various types of ACAT inhibitors are known, and are widely recognized by those skilled in the art as forming a group as one characteristic drug.
  • an agent that directly or indirectly acts on a target substance to improve atherosclerotic lesions or “an inhibitor of the pharmacological activity of the target protein” or a control product (for example, a solvent) is used.
  • Mammals suffering from arteriosclerosis e.g. rabbits, sausages
  • samples collected from arteriosclerotic lesions are subjected to biochemical measurements.
  • the dosage can be appropriately set by a person skilled in the art based on in vitro data of the drug (inhibitor) and basic data such as blood concentration when administered to animals.
  • the route of administration of “agent that directly or indirectly acts on target substance to improve arteriosclerotic lesion” or “inhibitor of pharmacological activity of target protein” or control product is not particularly limited, and oral administration Intravenous administration and the like can be appropriately selected and administered.
  • arteriosclerosis may be artificially produced, for example, by feeding on a high cholesterol diet, or may be genetically spontaneous. Good.
  • An example of such an animal model is WHHL Usagi.
  • Collection of a sample from a lesion can be performed, for example, by collecting a lesion tissue piece from a removed aorta.
  • a patient's ability to collect arteriosclerotic lesion samples for example, carotid endarterectomy, catheter-type instruments (Directional oronary Atherectomy (D and A))
  • D and A catheter-type instruments
  • the collected sample is subjected to biochemical tests after appropriate treatment such as homogenization.
  • the measurement method of “arteriosclerosis exacerbation of a substance having the property of exacerbating arteriosclerosis” or “pharmacological activity of a protein having the property of exacerbating arteriosclerosis” is not particularly limited. Alternatively, it can be measured by a known measuring method or a method according to them according to the pharmacological activity.
  • the target protein is ACAT
  • the method for measuring the enzyme activity is not particularly limited, and a method usually used for measuring enzyme activity in this field is used.
  • the target substance is a lipid
  • the method for measuring the abundance of the lipid is not particularly limited, and a method usually used in the art for measuring the amount of lipid is used.
  • a certain amount of arteriosclerotic lesion sample is taken and, for example, a reaction buffer (eg 0.19 M Tris-HCl pH 7.5, 3 mM EDTA, Cholesterol 0.2 mg / ml, BSA 3 mg / ml) and water are mixed with a substrate solution containing a radioisotope-labeled ACAT substrate (eg [3H] 01eyl—CoA or other acyl-CoA) —quantitative temperature.
  • the reaction can be carried out at a lower temperature (around 37 ° C) for a certain period of time, and the reaction is stopped according to a conventional method, followed by measuring the radioactivity of the cholesterol ester fraction after fractionation.
  • the selection of the correction marker is important.
  • Conditions to be satisfied as a correction marker include: (a) The amount or expression level in an arteriosclerotic lesion corresponds to the strength of the action of the “target substance” present in the disease to exacerbate arteriosclerosis. Fluctuates in relation to the expression level (eg, its abundance) or the expression level of “target protein” (eg, ACAT), (b) has convenience in actual evaluation (eg, enzyme activity) And (c) can be quantitatively evaluated using this activity as an index), and (c) is not affected by the therapeutic agent (inhibitor) or therapeutic means to be evaluated.
  • a suitable correction marker can be selected by, for example, narrowing down the target by the following procedure (however, it is not limited to this).
  • the expression level correlates with the “target protein” present in arteriosclerotic lesions (for example, ACAT-1 which is a subtype in the case of target protein strength ACAT).
  • ACAT-1 which is a subtype in the case of target protein strength ACAT.
  • a convenient marker is selected as a correction marker.
  • a substrate capable of monitoring an enzyme reaction by a general detection system such as colorimetry and fluorescence and having available enzyme activity.
  • the expression level of the correction marker in the atherosclerotic lesion is determined to be “the pharmacological activity of the target protein” (eg, ACAT in an atherosclerotic lesion derived from a mammal (eg, rabbit, monkey, inu, human, etc.)). Those having a correlation with the enzyme activity) are selected.
  • the target protein eg, ACAT in an atherosclerotic lesion derived from a mammal (eg, rabbit, monkey, inu, human, etc.)
  • suitable correction markers selected in this way include, for example, lysosomal acid lipase (LAL), acid j8 galactosidase (GLB 1), cathebsin D (CTSD), etc.
  • LAL lysosomal acid lipase
  • LLB 1 acid j8 galactosidase
  • CSD cathebsin D
  • proteins include proteins.
  • a correction marker can be selected by the same method.
  • the correction marker is not particularly limited as long as it satisfies the conditions of the correction marker described later and may be other than a protein.
  • the correction by the correction marker in the present invention is initially present between samples when the “target substance” or “pharmacological activity of the target protein” (eg, ACAT enzyme activity) in the atherosclerotic lesion sample is directly compared. Since there is a large variation in the abundance (expression level) of the “target substance” (“target protein” (for example, ACAT)), the effect of improving the arteriosclerotic lesion (enzyme inhibition activity) by the drug or therapeutic means (ACAT inhibitor) This is done to compensate for points that cannot be evaluated accurately.
  • target substance e.g, ACAT enzyme activity
  • the value corresponding to the amount (expression amount) of the correction marker in the atherosclerotic lesion sample Is a value that fluctuates quantitatively in correlation with the expression level of the correction marker, and is a value that can detect the degree of expression of the correction marker by measuring the value.
  • the degree of the enzyme activity can be used as a value corresponding to the expression level of the correction marker in the atherosclerotic lesion sample.
  • Such enzyme activity can be measured by a conventional method (for example, the measurement method described in Examples described later) according to the enzyme activity.
  • the correction marker is not limited to those using enzyme activity as an index.
  • the value may be used as “a value corresponding to the expression level of the correction marker in the arteriosclerotic lesion sample”.
  • the amount of mRNA encoding the correction marker can be used.
  • the correction is performed as follows.
  • Target protein pharmacological activity for example, ACAT enzyme activity
  • the target protein pharmacological activity (“corrected target protein pharmacological activity after administration of inhibitor”) corrected by the correction marker for each atherosclerotic lesion sample is calculated by dividing by “value” (for example, enzyme activity of the correction marker).
  • the corrected target protein pharmacological activity was calculated in the same way, and the average value was calculated as Base corrected target protein pharmacological activity ".
  • the calculated target protein pharmacological activity after inhibitor administration for each atherosclerotic lesion sample that has already been calculated is converted to the ratio when the base corrected target protein pharmacological activity is 100%.
  • the “protein pharmacological activity ratio” (% of Control) is calculated.
  • Statistical processing of the corrected target protein pharmacological activity ratio after administration of the inhibitor obtained in each arteriosclerotic lesion sample eg, Student t-test, analysis of variance, etc.
  • the degree of inhibitory action of pharmacological activity is evaluated.
  • the correction marker selected according to the above method is expressed in the sample regardless of the origin of the sample, and is expressed in correlation with the protein amount of the target protein.
  • Activity as described above, "target protein corrected after inhibitor administration”
  • pharmacological activity ratio By conducting a comparative study in terms of “pharmacological activity ratio”, it is possible to quantitatively compare the inhibitory effect of the target protein on the pharmacological activity of an inhibitor not related to the origin of the sample. As a result, it is possible to accurately evaluate the intensity of the action of the inhibitor by correcting the variation in the amount of target protein between samples.
  • a “value corresponding to the strength of the target substance that exacerbates arteriosclerosis” measured for each arteriosclerotic lesion sample collected from a mammal in a drug administration group or a treatment group that improves arteriosclerotic lesions (for example, , The target substance abundance) is corrected (for example, divided) by the “value corresponding to the amount of the correction marker in the arteriosclerotic lesion sample”, and the target substance corrected by the correction marker for each arteriosclerotic lesion sample is corrected. Calculate atherosclerosis exacerbation effect.
  • the clinical dose in humans can be set.
  • the clinical dose can be set by selecting an inhibitor dose that inhibits the pharmacological activity of the target protein with a significant difference from the control group.
  • selecting the dose it is possible to set a clinical dose with a certain range by selecting two or more inhibitor doses that inhibit the pharmacological activity of the target protein with a significant difference from the control group.
  • the pharmacological activity inhibitory action of the target protein by the inhibitor according to the present invention was evaluated using a plurality of correction markers, and each evaluation result was statistically processed as a whole.
  • the clinical dose can also be determined according to the above procedure.
  • the ability to determine an effective dose (clinical dose in the case of medical use) of the "target protein pharmacological activity inhibitor" to be evaluated by the evaluation method of the present invention is based on this, for example, an artery
  • the dosage unit of the inhibitor for patients suffering from sclerosis can be determined.
  • a prophylactic / therapeutic agent for arteriosclerotic diseases can be produced by producing a pharmaceutical composition containing this clinical dose or higher dose.
  • an inhibitor of the pharmacological activity of a target protein is administered at a clinical dose (or Can be administered in the form of a pharmaceutical composition characterized by being formulated so as to contain.
  • arteriosclerotic diseases include ischemic heart diseases such as myocardial infarction and angina pectoris, cerebrovascular diseases such as cerebral bleeding and cerebral infarction, large blood vessel aortic aneurysm, lower limb obstructive arteriosclerosis Disease, etc.
  • a pharmaceutical composition can be formulated according to a conventional method. Such preparations can usually be produced by mixing and kneading the active ingredient with additives such as excipients, diluents and carriers.
  • parenteral includes subcutaneous injection, intravenous injection, intramuscular injection, intraperitoneal injection, infusion method, and the like.
  • injectable preparations for example, sterile injectable aqueous or oleaginous suspensions may be prepared according to methods known in the art using suitable dispersing or wetting agents and suspending agents.
  • the sterile injectable preparation may also be a sterile injectable solution or suspension in a non-toxic parenterally administrable diluent or solvent, for example, an aqueous solution.
  • a non-toxic parenterally administrable diluent or solvent for example, an aqueous solution.
  • acceptable vehicles or solvents include water, Ringer's solution, and isotonic saline.
  • sterile, fixed oils can usually be used as a solvent or suspending solvent.
  • any non-volatile oil or fatty acid can be used, including natural or synthetic or semi-synthetic fatty oils or fatty acids, and natural or synthetic or semi-synthetic mono-, di- or triglycerides.
  • Suppositories for rectal administration are solid at room temperature such as the drug and appropriate nonirritating excipients such as cocoa butter and polyethylene glycols, but are liquid at the intestinal temperature and melt in the rectum. It can be manufactured by mixing with those that release the.
  • Suitable bases eg, butyric acid polymer, glycolic acid polymer, butyric acid-glycolic acid copolymer, butyric acid polymer and glycolic acid polymer mixture, polyglycerol fatty acid ester, etc. It is also effective to form a sustained-release preparation in combination.
  • Solid dosage forms for oral administration include powders, granules, tablets (including orally disintegrating tablets), pills, capsules, films (including orally disintegrating films) and the like described above Power S can be raised.
  • Such dosage forms comprise an active ingredient compound and at least one additive such as sucrose, lactose (latatose), cellulose sugar, mannitol (D-manntoitol).
  • Maltitol dextran, starches (eg, corn starch), microcrystalline cellulose, agar, alginate, chitins, chitosans, pectins, tragacanth gums, gum arabic, gelatins, collagens, It can be produced by mixing and / or kneading casein, albumin, synthetic or semi-synthetic polymers or glycerides.
  • Such dosage forms may also contain further additives as usual, for example inert diluents, lubricants such as magnesium stearate, norabens, preservatives such as sorbic acid, ascorbic acid , A-tocopherol, cysteine and other antioxidants, disintegrants (eg, croscarmellose sodium), binders (eg, hydroxypropylcellulose), thickeners, buffering agents, sweeteners, flavoring agents, perfume Agents and the like. Tablets and pills can also be produced with an enteric coating.
  • inert diluents lubricants such as magnesium stearate, norabens, preservatives such as sorbic acid, ascorbic acid , A-tocopherol, cysteine and other antioxidants, disintegrants (eg, croscarmellose sodium), binders (eg, hydroxypropylcellulose), thickeners, buffering agents, sweeteners, flavoring agents, perfume Agents and the like.
  • liquid preparations for oral administration include pharmaceutically acceptable emulsions, syrups, elixirs, suspensions, solutions and the like, and these include inert diluents commonly used in the art such as water and, if necessary, Additives may be included.
  • These oral solutions can be produced according to conventional methods such as mixing an active ingredient compound, an inert diluent, and, if necessary, other additives.
  • Gene Logic From the database of genes expressed in 121 human atherosclerotic lesions (Gene Logic), we selected genes that correlate with the expression level of the ACAT subtype ACAT-1 gene present in atherosclerotic lesions, and correlated A protein corresponding to a gene having a high number and having an enzyme activity was selected as a correction marker.
  • ACAT inhibitor or vehicle was orally administered once a day for 3 days. About 2 hours after the final administration, after anesthesia and exsanguination, the aorta was removed and stored frozen. After thawing the cryopreserved aorta, a biopsy trepan was used to collect a tissue fragment at the site where the atherosclerotic lesion was present. Alternatively, the tissue pieces of arteriosclerotic lesions collected and cryopreserved using biopsy trepan at the time of aortic extraction were thawed and used for the subsequent experiments.
  • STE buffer 250 mM sucrose, 50 mM Tris-HCl pH 7.0, 1 mM EDTA—2Na, Leupeptin 2 ⁇ g / ml
  • the ACAT reaction was performed using a reaction buffer (0.19 M Tris-HCl pH 7.5, 3 mM EDTA, Choleste rol 0.2 mg / ml, BSA 3 mg / ml), the above “arteriosclerotic lesion sample”, and a substrate solution ([ 3H] Oleoy® CoA) and stirred, reacted at 37 ° C for 30 minutes.
  • This lipid fraction was fractionated with a thin-layer chromatograph, and the radioactivity (DPM) incorporated into the cholesteryl ester fraction was converted into liquid synthase. Measured with a chelation counter.
  • the radioactivity of the blank sample (with STE buffer in place of the homogenate) was also measured, and the value obtained by subtracting the blank radioactivity from the radioactivity of each sample was defined as the ACAT enzyme activity.
  • the protein concentration of the homogenate was measured using a BCA protein assay kit (PIERCE) with a known concentration of Bovine Serum Albumin as a standard.
  • Total cholesterol, free cholesterol, and cholesteryl ester in the homogenate were measured by the following procedure. Extract the total lipid from the homogenate according to a conventional method 'Recovery, using cholesterol E test KO (Wako Pure Chemical), free cholesterol E test KO (Wako Pure Chemical), measure total cholesterol and free cholesterol, total cholesterol in homogenate The free cholesterol content was calculated. Total cholesterol power Free cholesterol was subtracted, and the value was defined as the cholesteryl ester content. [0033] (4) Measurement of lysosomal acid lipase (LAL) activity
  • the substrate was kept at ° C, and 25 ⁇ L of 4-methylumbellyfery ⁇ ⁇ -galactopyranoside solution was added to each wenore as a substrate, reacted at 37 ° C for 30 minutes, and fluorescence of Ex355 / Em460 was measured with a fluorescence plate reader.
  • a buffer solution STE buf fer was prepared for reaction and fluorescence measurement was performed, and blank was used. The fluorescence activity of the sample was also subtracted from blank.
  • CTSD Cathebsin D
  • Atherosclerotic lesion sample homogenate 50 L on microplate for fluorescence measurement Ac- Gly- Lys- Pro- lie- Leu- Phe- Phe- Arg- Leu- Lys (Dnp)-D- Arg- NH2 solution as substrate 50 ⁇ L was dispensed, reacted at 37 ° C for 30 minutes, and Ex320 / Em405 fluorescence was measured with a fluorescence plate reader.
  • the buffer was prepared by reacting and reacting with the homogenate preparation buffer, and the fluorescence measurement was taken as blank, and the value obtained by subtracting the fluorescence power blank of the sample was taken as the sample activity.
  • the ACAT enzyme activity calculated by homogenate for each atherosclerotic lesion sample The amount of cholesterol, the amount of cholesterol, the lysosomal acid lipase (LAL) activity, the acid j8 galactosidase (GLB1) activity, and the cathebsin D (CTSD) activity were divided, and the corrected ACAT enzyme activity with each correction marker was calculated. Furthermore, the corrected ACAT enzyme activity ratio of the drug-treated rabbit sample was determined by setting the average value of the corrected ACAT enzyme activity of the rabbit-free sample without the drug (Control group) as 100%.
  • the ACAT enzyme activity was higher than the protein concentration (protein), lesion tissue weight (wet weight), total cholesterol content (TC), free cholesterol content (FC), and cholesteryl ester content (CE).
  • the three correction markers that were highly correlated with ACAT-1 at the gene expression level in human arteriosclerotic lesions that were highly correlated with activity and CTSD activity were also actually correlated with the enzyme activity levels in the rabbit atherosclerotic lesions was shown to be high.
  • ACAT enzyme activity and correction index protein concentration, lysosomal acid lipase (LAL) activity, acid j8 galactosidase (GLB1) activity, cathebsin D (CTSD) Activity
  • CTSD cathebsin D
  • LAL, GLB1, and CTSD were highly correlated with the ACAT enzyme activity compared to the protein concentration.
  • the ACAT enzyme activity which varied greatly in protein concentration correction, was reduced by correction with the three enzyme (LAL, GLB1, CTSD) activities, and the strength of action as an inhibitor could be accurately evaluated.
  • the ACAT enzyme activity in the compound X administration group was only 10 mg / kg with protein concentration correction and showed a suppression of p-value S0.022, whereas with GLB1 and CTSD correction, 10 mg / kg administration group.
  • Compound X (3, 10 mg / kg / d) was orally administered once a day for 12 weeks using 7-month-old WHHL rabbits, and the effect on arteriosclerosis was examined.
  • WHHL Usagi was examined for aortic sclerosis by intravascular ultrasound (IVUS) before drug administration, and was grouped based on aortic sclerosis, plasma cholesterol level and gender.
  • IVUS intravascular ultrasound
  • Blood samples were collected before the start of administration and at 1, 2, 4, 6, 8, 10, and 12 weeks of administration, and the total plasma cholesterol level was measured using an automatic biochemical analyzer. Cholesterol exposure was determined. After administration, the thoracic aorta is removed and used as an index of arteriosclerosis. The cholesterol ester content was measured.
  • Compound X exerted a clear anti-atherosclerotic effect in animal model studies by long-term treatment with doses of 3 and 10 mg / kg that inhibits atherosclerotic lesion ACAT (see study in 4 above) .
  • the present invention relates to the inhibitory action of an inhibitor of the pharmacological activity of the target protein on the pharmacological activity (eg, enzyme activity) of a protein having a property of exacerbating arteriosclerosis present in arteriosclerotic lesions typified by ACAT. It relates to a method for evaluation.
  • the present invention has an advantage that it is possible to set a clinical trial stage as well as a post-marketing clinical dose, it is possible to select a candidate compound in the research stage 'preclinical trial stage, and It is also useful for resetting the effective dose for the patient at the stage of administration.
  • the present invention is a substance having the property of exacerbating arteriosclerosis present in arteriosclerotic lesions.
  • a drug or treatment for improving arteriosclerotic lesions by acting directly or indirectly on the substance In contrast to the action of exacerbating general arteriosclerosis, a drug or treatment for improving arteriosclerotic lesions by acting directly or indirectly on the substance. It relates to a method for evaluating means.

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Description

明 細 書
動脈硬化性疾患予防 ·治療薬および治療手段の評価方法
技術分野
[0001] 本発明は、 ACATに代表される動脈硬化病変に存在する動脈硬化を増悪させる性 質を有する物質 (特にタンパク質)の動脈硬化を増悪させる作用（例えば、薬理活性 ( 例えば、酵素活性)）に対する、該物質に直接または間接的に作用して動脈硬化病 変を改善する薬剤または治療手段の効果 (例えば、当該標的タンパク質の薬理活性 の阻害薬による阻害作用）を評価するための方法に関するものである。 背景技術
[0002] ACAT (ァシルコェンザィム Aコレステロールァシル転移酵素）は、動脈硬化病巣の 形成、食事性コレステロールの吸収、リポタンパク合成等において重要な働きを担つ ている。そのため、 ACATの活性を阻害する ACAT阻害薬は、血中コレステロール低 下作用、泡沫細胞形成抑制を介した動脈硬化の予防，治療薬として期待され、多く の ACAT阻害薬の開発が現在までに試みられて 、る。
ACAT阻害薬を臨床評価する上で、 ACAT阻害薬がヒト動脈硬化病変に存在する A CATの酵素活性をどの程度阻害するかを評価することは、その有効用量を推定し、 適切に設計された評価プロトコルの下、候補薬物の臨床上の価値を正しく評価する 上で極めて重要と考えられる。
し力しながら、ヒトの動脈硬化病変は同じ患者であってもその部位により均質なもの ではなく極めて多様な性質を持つことから、部位により動脈硬化病変中の ACATの酵 素活性のバラツキが大きぐ薬物投与患者と薬物非投与患者力 採取した動脈硬化 病変中の ACATの酵素活性を測定して単純に比較しただけでは、薬物の阻害作用 の程度を検出することは極めて困難であると考えられており、さらに、動脈硬化病変 中の ACATタンパク量を直接的に測定することは困難であるため当該タンパク量によ る補正も容易ではなぐ従来このような評価は行われて来な力つた。
また、従来動脈硬化病変から採取した試料を用いて当該試料中の ACATに対する 薬剤の作用を評価することは、行われていない。これは、動脈硬化病変を摘出し AC AT活性測定に供する過程にお ヽて薬剤が酵素源から遊離すること、動脈硬化病変 の多様性により病変中 ACAT活性が大きくばらつくことなどにより、薬剤の阻害作用を 正確に評価することが難しいことが想定されたためと考えられる。
このため、従来は候補薬剤の血中脂質濃度の低下作用、動物モデル (例えば、 Wa tanabe heritable hyperlipidemic (WHHL)ゥサギが広く使用されて 、る）での候補薬剤 の長期投与後の動脈硬化病変自体の評価結果に基づいて、臨床試験に入らざるを 得ず、その効果がヒトでも反映されるのかは、臨床評価を相当程度進めてみて初めて わ力るというのが実情であり、前臨床データからの期待に反して満足できる臨床効果 が得られない場合も多ぐ新薬の効率的な創出の障害となっていた。
例えば、 Avasimibeは、前臨床試験ではマウス、ゥサギ、ハムスターなど各種動物モ デルにおいて動脈硬化病変中コレステロールエステルを低下させるなどの抗動脈硬 化作用を有する ACAT阻害薬であると認識されて 、た (非特許文献 1 3)。しかしな がら、これら前臨床試験での抗動脈硬化作用の成績は、肝臓や小腸の ACATを阻害 することによる血漿コレステロール低下を伴っており、 Avasimibeが動脈硬化病変中の ACATを阻害することにより抗動脈硬化作用を示していることを直接的に示す実験成 績は示されて 、なかった。
Avasimibeはこれら前臨床試験での成績をもとに臨床試験が実施された力 肝臓や 小腸の ACAT阻害に基づくと考えられる血中脂質への効果は認められたものの（非 特許文献 4 5)、抗動脈硬化作用を調べる臨床試験では効果を認めず開発を中止 した (非特許文献 6)。
非特許文献 1 :「サーキュレーション、 2001年、第 103卷、 p. 1778— 1786」 非特許文献 2 :「ァテロスタレ口シス、 1998年、第 137卷、 p. 77— 85」
非特許文献 3 :「ァテロスタレ口シス、 2001年、第 157卷、 p. 97—105」
非特許文献 4:「ァテロスタレ口シス、 2001年、第 157卷、 p. 137—144」
非特許文献 5 :「ァテロスタレ口シス、 2003年、第 171卷、 p. 273— 279」
非特許文献 6 :「サーキュレーション、 2004年、第 110卷、 p. 3372— 3377」 発明の開示
発明が解決しょうとする課題 [0003] 上記のような状況下、 ACAT阻害薬の臨床上の効果 (特に、臨床用量)を精度良く 推定するため、 ACAT阻害薬によるヒト動脈硬化病変に存在する ACATの酵素阻害 活性の程度を精度高く評価する方法の確立が望まれていた。また、 ACAT阻害薬だ けではなぐ動脈硬化病変試料に存在する ACAT以外のタンパク質等、動脈硬化を 増悪させる性質を有する物質一般の動脈硬化を増悪させる作用の強さを精度高く評 価する方法の確立が望まれて 、た。
課題を解決するための手段
[0004] 培養細胞などを用いる場合に比較すると、動脈硬化病変は複雑な構成成分 (細胞 種多様、細胞以外の壊死巣、脂質の蓄積、繊維質等)を有するため、動脈硬化病変 試料を採取した個体により、また、採取部位により、その組成は大きく異なり、そのた め元来その試料中に存在する ACATの量が相当程度異なるため、例えば、仮に ACA T阻害薬投与後の当該試料中の ACAT酵素活性が低い値を示したとしても、元来そ の試料中の ACATの存在量が少なかったために低い活性を示したの力、あるいは、 A CAT阻害薬が酵素を強く阻害したことの結果として低い活性を示したのかが明らかで はなぐ結果として示された ACAT酵素活性の絶対値のみカゝらでは、 ACAT阻害薬の 酵素阻害活性を正確に評価できな ヽことが、問題の所在であった。
カゝかる問題を解決する方法としては、例えば、採取された動脈硬化病変試料中に 存在する ACATタンパク量を測定して、当初の ACAT酵素活性を想定することにより、 ACAT阻害薬の酵素阻害活性の程度を評価することが考えられる。
し力しながら、例えば Western blot法のような常法によりタンパク量を測定する場合 には、組織由来の夾雑物の影響により測定範囲が狭ぐかつ、測定誤差が大きいと の問題があり、初期の目的を達成することはできな力つた。
一方、直接 ACATタンパク量を測定することに代えて、対応する mRNAの量を測定 することも考えられるが、安定した定量が困難であること、また、必ずしも mRNAの存 在量がタンパク量とは一致しないことから、これによつても初期の目的を達成すること はできなかった。
[0005] そこで、発明者は、 ACATタンパク量に代わる指標として、動脈硬化病変中の ACAT と発現量が相関するタンパク質を選択し (以後、補正マーカーという）、試料中に元来 発現して!/、る ACAT量に代えて、対応する補正マーカーのタンパク量を用いて各試 料中の当初の ACATタンパク量を評価し、これを指標として各試料間の当初 ACATタ ンパク量のバラツキに基づく阻害活性の評価の困難性を是正する補正を行うことによ り問題点を解決できるものと考え、鋭意検討の後、本発明を完成するに至った。 即ち、本発明は、
(1)採取された哺乳動物由来の動脈硬化病変試料に存在する動脈硬化を増悪さ せる性質を有する物質の動脈硬化を増悪させる作用の強さに対応する値を、当該物 質の動脈硬化病変における量に相関して変動し、かつ評価しょうとする治療薬あるい は治療手段の影響を受けない補正マーカーの動脈硬化病変試料における量で補正 した値を、該物質に直接または間接的に作用して動脈硬化病変を改善する薬剤の 投与群あるいは治療手段を施した群と非投与群あるいは非治療群の各々力 採取さ れた試料に関して比較評価することを特徴とする、動脈硬化治療薬あるいは治療手 段の効果の評価方法；
(2)採取された哺乳動物由来の動脈硬化病変試料に存在する動脈硬化を増悪さ せる性質を有するタンパク質の薬理活性を、当該標的タンパク質の動脈硬化病変に おける発現に相関して発現する補正マーカーの動脈硬化病変試料における発現量 に対応する値で除した補正値を、標的タンパク質の薬理活性の阻害薬の投与群と非 投与群の各々から採取された試料に関して比較評価することを特徴とする、当該阻 害薬による動脈硬化病変に存在する標的タンパク質の薬理活性阻害作用の評価方 法；
(3)「動脈硬化を増悪させる性質を有するタンパク質」が、 ACATであり、 「動脈硬化を増悪させる性質を有するタンパク質の薬理活性」が、 ACAT酵素活性で あり、
「標的タンパク質の薬理活性の阻害薬」が、 ACAT阻害薬である、上記 (2)に記載の 評価方法；
(4)「当該標的タンパク質の動脈硬化病変における発現に相関して発現する補正 マーカー」が、酵素活性を有するタンパク質である、上記（2)に記載の評価方法；
(5)当該標的タンパク質の動脈硬化病変における発現に相関して発現する補正マ 一力一の動脈硬化病変試料における発現量に対応する値が、当該補正マーカーの 酵素活性である、上記（2)に記載の評価方法；
(6)採取された動脈硬化病変試料が、ヒト由来のものである、上記（2)に記載の評 価方法；
(7)上記（6)に記載の評価方法による評価において、対照群に対して有意差をもつ て標的タンパク質の薬理活性を阻害する阻害薬用量を選択することからなる、当該 阻害薬の臨床用量の設定方法；
(8)標的タンパク質の薬理活性の阻害薬を、 1投与単位あたり上記 (7)に記載の方 法により設定された臨床用量含有するように製剤化したことを特徴とする、哺乳動物 における動脈硬化性疾患の予防および Zまたは治療剤；
(9)上記 (7)に記載の方法により設定された臨床用量の標的タンパク質の薬理活 性の阻害薬を、哺乳動物に投与することを特徴とする、動脈硬化性疾患の予防およ び Zまたは治療方法；
などを提供する。
発明の効果
[0007] 上記 ACATについて確立された評価方法と同様の手法は、動脈硬化病変中に存 在する他の動脈硬化を増悪させる性質を有するタンパク質の薬理活性の阻害薬の 評価にも適用できる。さらに、タンパク質のみならず、動脈硬化病変中に存在する動 脈硬化を増悪させる性質を有する物質に直接または間接的に作用して動脈硬化病 変を改善する薬剤あるいは治療手段の評価にも適用できる。取り分け、当該標的タン ノ^質の定量が困難な場合、また動脈硬化を増悪させる性質を有する物質の定量が 困難な場合に、有益な評価方法となる。
[0008] 本発明の評価方法においては、採取した動脈硬化病変中の標的タンパク質に対 する阻害薬の直接の作用を評価することができる。従って、係る動脈硬化病変への 直接作用による阻害薬の有効性を適切に評価することができ、例えば、採取されたヒ トの患者由来の動脈効果病変試料に基づいて評価を行った場合には、この評価に おける有効用量に基づ 、て実際の患者での臨床用量を合理的に決定することがで きる。 図面の簡単な説明
[0009] [図 1]WHHLゥサギ動脈硬化病変の ACAT酵素活性とタンパク濃度の相関を示す図 である。
[図 2]WHHLゥサギ動脈硬化病変の ACAT酵素活性と組織重量の相関を示す図であ る。
[図 3]WHHLゥサギ動脈硬化病変の ACAT酵素活性と総コレステロール含量の相関を 示す図である。
[図 4]WHHLゥサギ動脈硬化病変の ACAT酵素活性と遊離コレステロール含量の相 関を示す図である。
[図 5]WHHLゥサギ動脈硬化病変の ACAT酵素活性とコレステロールエステル含量の 相関を示す図である。
[図 6]WHHLゥサギ動脈硬化病変の ACAT酵素活性と BETA-GALACTOSIDASE- GLB1)活性の相関を示す図である。
[図 7]WHHLゥサギ動脈硬化病変の ACAT酵素活性と LYSOSOMAL ACID LIPASE(L AL)活性の相関を示す図である。
[図 8]WHHLゥサギ動脈硬化病変の ACAT酵素活性と CATHEPSIN D(CTSD)の相関 を示す図である。
[図 9]化合物 Xの動脈硬化病変 ACAT酵素阻害試験における ACAT酵素活性の補正 マーカーによる補正の効果を示す図である。
[図 10]化合物 Xの WHHLゥサギ大動脈コレステロールエステル含量に及ぼす影響を 示す図である。
発明を実施するための最良の形態
[0010] 上記で示された本発明の評価方法における種々の用語等を、以下に詳細に説明 する。但し、これらに限定する趣旨ではない。
「採取された哺乳動物由来の動脈硬化病変試料に存在する動脈硬化を増悪させる 性質を有する物質 (タンパク質)の作用 (薬理活性)の測定」
[0011] (a)動脈硬化を増悪させる性質を有する物質 (タンパク質）
本発明の適用対象となる「動脈硬化を増悪させる性質を有する物質」（以下「標的 物質」という場合がある）は、特に限定されるものではなぐ動脈硬化病変中に存在ま たは発現し、その作用（薬理活性等)の発揮により動脈硬化病変の拡大等、動脈硬 化病変を増悪させる性質を有する物質 (タンパク質、脂質 (コレステロールとその酸ィ匕 物を含む誘導体、コレステロール以外のクラスの脂質とその酸ィ匕物を含む誘導体）、 動脈硬化病巣の感染微生物由来物質など)等、特にタンパク質)が広く包含される。 力かる標的物質の動脈硬化病変中での存在量の定量が難しい場合に、取り分け本 発明の対象とすることが有利となる。
本発明の適用対象となる「動脈硬化を増悪させる性質を有するタンパク質」（以下「 標的タンパク質」という場合がある）は、特に限定されるものではなぐ動脈硬化病変 中で発現し、その薬理活性の発揮により動脈硬化病変の拡大等、動脈硬化病変を 増悪させる性質を有するタンパク質が広く包含される。このようなタンパク質としては、 例えば、 ACAT、リポタンパク結合型ホスホリパーゼ A2,リポキシゲナーゼ、マトリクスメ タロプロテアーゼ、カテブシンなどが挙げられる。
力かるタンパク質の動脈硬化病変中での存在量の定量が難しい場合に、取り分け 本発明の対象とすることが有利となる。
[0012] (b)動脈硬化を増悪させる性質を有する物質 (タンパク質)の動脈硬化を増悪させる 作用 (薬理活性）
「動脈硬化を増悪させる性質を有する物質の動脈硬化を増悪させる作用」（以下、「 動脈硬化増悪作用」という場合がある）とは、当該標的物質が生体内で発揮する作用 (例えば、酵素活性、シグナル伝達機能、脂質蓄積、炎症性細胞の浸潤や増殖や炎 症反応、動脈硬化病変の進展や脆弱化、等)をいい、例えば、標的物質がタンパク 質である場合は、その薬理活性をいう。
「動脈硬化を増悪させる性質を有するタンパク質の薬理活性」とは、当該標的タン パク質が生体内で発揮する薬理活性 (例えば、酵素活性、シグナル伝達機能、等)を いい、例えば、標的タンパク質が ACATである場合は、その酵素活性をいう。
[0013] (c)標的物質に直接または間接的に作用して動脈硬化病変を改善する薬剤または 治療手段および標的タンパク質の薬理活性の阻害薬
「標的物質に直接または間接的に作用して動脈硬化病変を改善する薬剤または治 療手段」とは、標的とする上記「動脈硬化を増悪させる性質を有する物質」に直接ま たは間接的に作用して動脈硬化病変を改善する薬剤または治療手段をいい、そのよ うな作用を有する薬剤または治療手段であれば、特に限定されるものではない。例え ば、標的物質が酵素タンパク質である場合には、酵素阻害薬が対象薬剤となる。例 えば、標的物質が脂質である場合には、脂質低下薬 (例えば、スタチン類、フィブラ ート類など)が対象薬剤となり、脂質を低下させるような外科的な手術などが、治療手 段となる。
「標的タンパク質の薬理活性の阻害薬」とは、標的とする上記「動脈硬化を増悪させ る性質を有するタンパク質」の「薬理活性」を阻害する活性を有する薬剤を ヽ、特に 限定されるものではない。例えば、標的タンパク質が ACATである場合には、 ACAT 阻害薬が対象薬剤となる。
本発明の適用対象となる ACAT阻害薬は、 ACAT阻害活性を有するものであれば 特に限定されない。現在までに ACAT阻害薬としては多種のものが知られており、一 つの特徴ある薬剤としてのグループを形成するものとして、当業者には広く認識され ている。例えば、 FR- 129169, CI— 1011、 F- 1394, F— 12511、 T- 2591, F CE— 28654、 K— 10085、 HL— 004、 NTE— 122、 FR— 186054、 (2E)— 3— { 3— [7 クロ口一 3— (2— { [4 フルォロ 2 (トリフルォロメチル）フエ-ル]ァミノ } — 2 ォキソェチル） 6 メチル 2 ォキソ 2H クロメン一 4—ィル]フエニル } アクリル酸、 N— (1—ペンチルー 4, 6 ジメチルインドリン— 7—ィル）—2, 2 ジメ チルプロパンアミド又は N—（1ーォクチルー 5 カルボキシメチルー 4, 6 ジメチル インドリン一 7—ィル） 2, 2 ジメチルプロパンアミド、等が知られている力 本発明 の対象となる「ACAT阻害薬」はこれらに限定されるものではない。本発明の評価方 法に付すことで、動脈硬化病変に存在する ACATの酵素阻害活性を正確に評価する ことができる。
(d)動脈硬化病変試料
本発明を実施するに当たっては、「標的物質に直接または間接的に作用して、動 脈硬化病変を改善する薬剤」または「標的タンパク質の薬理活性の阻害薬」もしくは 対照品 (例えば、溶媒)を動脈硬化症を罹患している哺乳動物 (例えば、ゥサギ、サ ル、ィヌ、ヒト、等）に一定期間投与後、動脈硬化病変から採取された試料を生化学 的測定に供する。
「標的物質に直接または間接的に作用して、動脈硬化病変を改善する治療手段」 を動脈硬化症を罹患している哺乳動物（例えば、ゥサギ、サル、ィヌ、ヒト、等）に施し て、一定期間処置後、処置群および対照 (非治療 Z非処置群)の動脈硬化病変から 採取された試料を生化学的測定に供する。
なお、「標的タンパク質の薬理活性の阻害薬」の投薬期間は、力かる薬剤 (阻害薬） の投与による、「標的物質」の存在量（「標的タンパク質」の発現量)そのものへの影響 を無視できる期間が好ましぐ一般には 7日間程度、より好ましくは 3日間程度の投薬 期間を設定するのが有利である。また、投与量は、当該薬剤（阻害薬)の in vitro data や動物に投与した場合の血中濃度、等の基礎データに基づいて、適宜当業者が設 定することができる。
ここで、「標的物質に直接または間接的に作用して、動脈硬化病変を改善する薬剤 」または「標的タンパク質の薬理活性の阻害薬」もしくは対照品の投与経路は特に限 定されず、経口投与、静脈内投与、等の経路を適宜選択して投与することができる。 また、ヒト以外の動物を試験に供する場合には、動脈硬化症は、例えば、高コレステ ロール食飼育による等、人為的に作り出したものでもよいし、また、遺伝的に自然発 症したものでもよい。そのような動物モデルとしては、例えば、 WHHLゥサギが挙げら れる。
病変からの試料の採取は、例えば、摘出した大動脈から、病変組織片を採取するこ とにより行うことができる。ヒトの患者力も動脈硬化病変試料を採取する場合には、例 えば、頸動脈内膜切除術（carotid endarterectomy)、カテーテル型の器具（Direction alし oronary Atherectomy(Dし A)カァ ~~ァノレ、 Plaque excision system (Foxhollow社) など）による動脈硬化病変の切除等、医療上適切な方法により採取された試料を評 価に供することが必要である。
採取された試料は、ホモジナイズ等の適当な処理の後に、生化学的試験に供され る。
(e)動脈硬化を増悪させる性質を有する物質 (タンパク質)の動脈硬化増悪作用（薬 理活性)の測定方法
本発明にお！、て、「動脈硬化を増悪させる性質を有する物質の動脈硬化増悪作用 」または「動脈硬化を増悪させる性質を有するタンパク質の薬理活性」の測定方法は 特に限定されるものではなぐ測定対象となる作用または薬理活性に応じて公知の 測定方法あるいはそれらに準じる方法で測定することができる。例えば、標的タンパ ク質が ACATである場合には、その酵素活性の測定方法は特に限定されるものでは なぐ当分野で酵素活性の測定に通常使用される方法が用いられる。例えば、標的 物質が脂質である場合には、その脂質の存在量の測定方法は特に限定されるもの ではなぐ当分野で脂質量の測定に通常使用される方法が用いられる。
具体的には、例えば、一定量の動脈硬化病変試料を取り、適切な溶媒中、例えば 、反応用緩衝液（e.g. 0.19 M Tris-HCl pH 7.5, 3 mM EDTA, Cholesterol 0.2 mg/ ml, BSA 3 mg/ml)と水との混合液中、ラジオアイソトープで標識ィ匕された ACATの基 質 (例えば、 [3H] 01eyl— CoA等のァシル— CoA)—定量を含む基質溶液と混合し、 適温下（37°C付近)で一定時間反応させた後、常法に従って反応を停止させ、分画 後コレステロールエステル画分の放射活性を測定することにより行うことができる。
[0016] 「補正マーカーの選択」
本発明を実施する上では、補正マーカーの選択が重要である。補正マーカーとし て満たすべき条件としては、（a)動脈硬化病変中での存在量または発現量が、当該病 変中に存在する「標的物質」の動脈硬化を増悪させる作用の強さに対応する値 (例え ば、その存在量)または「標的タンパク質」（例えば、 ACAT)の発現量に相関して変動 すること、（b)実際に評価を行うに際しての利便性を有すること (例えば、酵素活性を 有し、この活性を指標として定量的評価ができること)、（c)評価しょうとする治療薬（ 阻害薬)あるいは治療手段の影響を受けな 、等が挙げられる。
好適な補正マーカーの選択は、具体的には、例えば、以下のような手順で対象を 絞り込むことで行うことができる（但し、これに限定されるものではない)。
[0017] 1)遺伝子発現データベースを利用して、動脈硬化病変に存在する「標的タンパク 質」（標的タンパク質力 ACATである場合には、例えば、サブタイプである ACAT-1) と発現量が相関する遺伝子を選択する。原則として、相関性の高いもの力 順に補 正マーカー候補を絞り込むことが有利である。
[0018] 2)当該遺伝子がコードするタンパク質から、酵素活性を持つものを、補正マーカー として選択する。
[0019] 3)測定方法の簡便さ、特異性の観点から、利便性の高いものを補正マーカーとし て選択する。例えば、比色、蛍光など一般的な検出系により酵素反応をモニターでき る基質が入手可能な酵素活性を有するものを選択するのが有利である。また、補正 マーカーの酵素活性を測定する際に、その測定条件が、標的タンパク質の薬理活性 の評価や他の補正マーカーの定量に影響を与えないようなものを選択することが好 ましい。逆に標的タンパク質の薬理活性の測定条件が、補正マーカーの定量に影響 を与えな 、ものを選択することが同様に好ま 、。
[0020] 4)動脈硬化病変における補正マーカーの発現量が、哺乳動物 (例えば、ゥサギ、 サル、ィヌ、ヒト、等）由来の動脈硬化病変における「標的タンパク質の薬理活性」（例 えば、 ACAT酵素活性）と相関性を有するものを選択する。
[0021] 5)以上の観点力 対象を絞り込み、使用されるべき補正マーカーを選択する。
標的タンパク質が ACATである場合には、このようにして選択される好適な補正マー カーとしては、例えば、リソソーム酸性リパーゼ（LAL)、酸性 j8ガラクトシダーゼ（GLB 1)、カテブシン D (CTSD)、等のタンパク質が挙げられる。
「標的物質」が、タンパク質以外の場合でも、同様の方法で補正マーカーを選択で きる。補正マーカーは、後述の補正マーカーの条件を満たすものであれば、タンパク 質以外のものであってもよぐ特に限定されるものではない。
[0022] 「補正マーカーによる補正」
本発明における補正マーカーによる補正は、動脈硬化病変試料中の「標的物質」 または「標的タンパク質の薬理活性」（例えば、 ACAT酵素活性)を直接に比較検討し たのでは、試料間で当初存在する「標的物質」（「標的タンパク質」（例えば、 ACAT) ) の存在量 (発現量）に大きなバラツキがあるため、薬剤または治療手段 (ACAT阻害 薬)による動脈硬化病変改善作用（酵素阻害活性)を正確に評価できない点を補完 するために行われる。
ここで、「補正マーカーの動脈硬化病変試料における量 (発現量）に対応する値」と は、補正マーカーの発現量に相関して定量的に変動する値であって、当該値を測定 することで、補正マーカーの発現の程度を検知できる値を 、う。
例えば、使用される補正マーカーが酵素としての機能を有する場合には、その酵素 活性の程度を動脈硬化病変試料中における補正マーカーの発現量に対応する値と して用いることができる。かかる酵素活性は、当該酵素活性に応じて常法 (例えば、 後述の実施例で説明された測定方法）により測定することができる。但し、酵素活性 を指標とするものに補正マーカーが限定されるものではない。例えば、補正マーカー の発現量そのものが測定できる場合には、その値を「補正マーカーの動脈硬化病変 試料における発現量に対応する値」として用いてもよい。また、補正マーカーをコード する mRNA量を用いることができる場合がある。
補正は、例えば以下のように行われる。
阻害薬投与群の哺乳動物力 採取した動脈硬化病変試料毎に測定した「標的タン パク質の薬理活性」（例えば、 ACAT酵素活性)を、「補正マーカーの動脈硬化病変 試料における発現量に対応する値」（例えば、当該補正マーカーの酵素活性)で除し 、動脈硬化病変試料毎の当該補正マーカーにより補正された標的タンパク質薬理活 性（「阻害薬投与後補正標的タンパク質薬理活性」 )を算出する。
一方、阻害薬非投与群 (Control群)の哺乳動物から採取した動脈硬化病変試料群 に関しても同様に補正された標的タンパク質薬理活性を算出し、それらの平均値を 当該補正マーカーにおける補正時の「ベース補正標的タンパク質薬理活性」とする。 既に算出された動脈硬化病変試料毎の「阻害薬投与後補正標的タンパク質薬理 活性」を、「ベース補正標的タンパク質薬理活性」を 100%とした場合の比率に換算し、 「阻害薬投与後補正標的タンパク質薬理活性比率」（％ of Control)を算出する。 各動脈硬化病変試料で得られた「阻害薬投与後補正標的タンパク質薬理活性比 率」を常法により統計処理して (例えば、 Student t-検定，分散分析など）、当該阻害 薬の標的タンパク質の薬理活性の阻害作用の程度を評価する。
上記の方法に従って選択された補正マーカーは、試料の由来に関係なく当該試料 中に発現して 、る標的タンパク質のタンパク量に相関して発現して 、るため、測定さ れた標的タンパク質の薬理活性を、上記のように「阻害薬投与後補正標的タンパク質 薬理活性比率」に換算して比較検討することで、試料の由来に関係なぐ阻害薬によ る標的タンパク質の薬理活性の阻害作用を定量的に比較検討することができる。 これにより、試料間の標的タンパク質量のバラツキを補正して、阻害薬の作用の強 弱を正確に評価することができる。
同様に、動脈硬化病変を改善する薬剤投与群または治療処置群の哺乳動物から 採取した動脈硬化病変試料毎に測定した「標的物質の動脈硬化を増悪させる作用 の強さに対応する値」（例えば、標的物質の存在量)を、「補正マーカーの動脈硬化 病変試料における量に対応する値」で補正し (例えば、除し）、動脈硬化病変試料毎 の当該補正マーカーにより補正された標的物質の動脈硬化増悪作用を算出する。
[0024] 「臨床用量の設定」
本発明の評価をヒト由来の動脈硬化病変を用いて行った場合には、ヒトでの臨床用 量を設定することができる。
本発明による評価において、対照群に対して有意差をもって標的タンパク質の薬 理活性を阻害する阻害薬用量を選択することにより、臨床用量を設定することができ る。用量の選択に当たっては、対照群に対して有意差をもって標的タンパク質の薬 理活性を阻害する阻害薬用量を 2以上選択することにより、一定の幅を持った臨床 用量を設定することもできる。
なお、臨床用量の設定に当たっては、複数の補正マーカーを使用して本発明によ る当該阻害薬による標的タンパク質の薬理活性阻害作用の評価を行い、各評価結 果を全体として統計処理した上で、上記手法に従って臨床用量を決定することもでき る。
[0025] 本発明の評価方法により、評価対象となる「標的タンパク質の薬理活性の阻害薬」 の有効用量（医療用の場合は、臨床用量)を決定することができる力 これに基づい て例えば動脈硬化症を罹患している患者に対する阻害薬の一投与単位の投与量を 決定することができる。
従って、この臨床用量もしくはそれ以上の用量を含有する医薬用組成物を製造す ることで、動脈硬化性疾患の予防'治療剤を製造することができる。具体的には、標 的タンパク質の薬理活性の阻害薬を、 1投与単位あたり設定された臨床用量 (もしく はそれ以上)含有するように製剤化したことを特徴とする、医薬組成物の形で投与す ることがでさる。
ここで、「動脈硬化性疾患」としては、心筋梗塞、狭心症、等の虚血性心疾患、脳出 血、脳梗塞、等の脳血管疾患、大血管の大動脈瘤、下肢閉塞性動脈硬化症、等が 挙げられる。
[0026] 医薬用の組成物は通常の方法に従って製剤化することができる。かかる製剤は通 常活性成分を賦型剤、希釈剤，担体等の添加剤と混合 Z練合することにより製造す ることができる。本明細書において、非経口とは、皮下注射、静脈内注射、筋肉内注 射、腹腔内注射あるいは点滴法などを含むものである。注射用調剤、例えば、無菌 注射用水性懸濁物あるいは油性懸濁物は、適当な分散化剤または湿化剤及び懸濁 ィ匕剤を用いて当該分野で知られた方法で調製されうる。その無菌注射用調剤は、ま た、例えば水溶液などの非毒性の非経口投与することのできる希釈剤あるいは溶剤 中の無菌の注射のできる溶液または懸濁液であってもよい。使用することのできるベ ーヒクルあるいは溶剤として許されるものとしては、水、リンゲル液、等張食塩液など 力 Sあげられる。さらに、通常溶剤または懸濁化溶媒として無菌の不揮発性油も用いら れうる。このためには、いかなる不揮発性油も脂肪酸も使用でき、天然あるいは合成 あるいは半合成の脂肪性油又は脂肪酸、そして天然あるいは合成あるいは半合成の モノあるいはジあるいはトリグリセリド類も含められる。
直腸投与用の座剤は、その薬物と適当な非刺激性の補形剤、例えば、ココアバタ 一やポリエチレングリコール類といった常温では固体であるが腸管の温度では液体 で、直腸内で融解し、薬物を放出するものなどと混合して製造されることができる。 また、適当な基剤（例、酪酸の重合体、グリコール酸の重合体、酪酸ーグリコール酸 の共重合体、酪酸の重合体とグリコール酸の重合体との混合物、ポリグリセロール脂 肪酸エステル等)と組合わせ徐放性製剤とすることも有効である。
[0027] 経口投与用の固形投与剤型としては、粉剤、顆粒剤、錠剤（口腔内崩壊錠を含む） 、ピル剤、カプセル剤、フィルム剤（口腔内崩壊フィルムを含む)などの上記したもの 力 Sあげられる。そのような剤型の製剤は、活性成分化合物と、少なくとも一つの添カロ 物、例えば、ショ糖、乳糖 (ラタトース）、セルロース糖、マン-トール (D—マン-トー ル）、マルチトール、デキストラン、デンプン類（例、コーンスターチ）、微結晶セルロー ス、寒天、アルギネート類、キチン類、キトサン類、ぺクチン類、トラガントガム類、ァラ ビアゴム類、ゼラチン類、コラーゲン類、カゼイン、アルブミン、合成又は半合成のポリ マー類又はグリセリド類とを混合及び/又は練合することにより製造することができる 。そのような剤型物はまた、通常の如ぐさらなる添加物を含むことができ、例えば不 活性希釈剤、ステアリン酸マグネシウムなどの滑沢剤、ノ ラベン類、ソルビン酸などの 保存剤、ァスコルビン酸、 a—トコフエロール、システィンなどの抗酸化剤、崩壊剤（ 例、クロスカルメロースナトリウム）、結合剤（例、ヒドロキシプロピルセルロース）、増粘 剤、緩衝化剤、甘味付与剤、フレーバー付与剤、パーフューム剤などがあげられる。 錠剤及びピル剤はさらにェンテリックコーティングされて製造されることもできる。経口 投与用の液剤は、医薬として許容されるェマルジヨン剤、シロップ剤、エリキシル剤、 懸濁剤、溶液剤などがあげられ、それらは当該分野で普通用いられる不活性希釈剤 、例えば水及び必要により添加物を含んでいてよい。これら経口用液剤は、活性成 分化合物と不活性希釈剤、及び必要により他の添加剤を混合する等慣用方法に従 い製造することができる。
以下に実施例を挙げて本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれらに限定さ れるものではない。
実施例 1
[0028] 「試験方法」
1.遺伝子発現データベースを用いた補正マーカーの選択
121例のヒト動脈硬化病変における発現遺伝子に関するデータベース（Gene logic 社製)から、動脈硬化病変に存在する ACATサブタイプである ACAT-1の遺伝子と発 現量が相関する遺伝子を選択し、相関係数が高い遺伝子に対応するタンパクであり 、かつ、酵素活性を有するタンパクを補正マーカーとして選択した。
[0029] 2.動脈硬化病変試料の調製
「ACAT阻害薬の投与 ·動脈採取」
高コレステロール食飼育、或いは遺伝性高脂血症などにより大動脈に動脈硬化病 変を有するゥサギを用い、 ACAT阻害薬または媒体を 1日 1回、 3日間経口投与した。 最終投与約 2時間後に麻酔 ·放血致死後、大動脈を摘出し凍結保存した。 凍結保 存した大動脈を解凍後、生検トレパンを用いて動脈硬化病変存在部位組織片を採 取した。或いは、大動脈摘出時に生検トレパンを用いて採取 ·凍結保存した動脈硬 化病変の組織片を解凍し以後の実験に供した。
「動脈硬化病変ホモジネートの調製」
動脈硬化病変の組織片を剪刀でミンスし、これに STE buffer (250 mM sucrose, 50 mM Tris-HCl pH 7.0, 1 mM EDTA— 2Na, Leupeptin 2 μ g/ml)を一定量カ卩え、ホモジ ナイズ後、遠心分離 (4000rpm, 5min)により組織残渣を除いて得たホモジネートを生 化学測定の「動脈硬化病変試料」とした。
[0030] 3.各種生物活性の測定
(l)ACAT酵素活性の測定
ACATの反応は、反応用緩衝液（0.19 M Tris-HCl pH 7.5, 3 mM EDTA, Choleste rol 0.2 mg/ml, BSA 3 mg/ml)、上記「動脈硬化病変試料」、および、基質溶液 ([3H] Oleoy卜 CoA)を加え撹拌、 37°C30分間反応させ、この脂質画分をを薄層クロマトダラ フィ一にて分画し、 cholesteryl ester画分に取り込まれた放射活性（DPM)を液体シン チレーシヨンカウンターで測定した。 Blank用サンプル（ホモジネートの代わりに STE b ufferを入れたもの）の放射活性も測定し、各サンプルの放射活性から blankの放射活 性を引 、た値を ACAT酵素活性とした。
[0031] (2)タンパク濃度測定
ホモジネートのタンパク濃度は BCA protein assay kit (PIERCE社）を用い、既知濃 度の Bovine Serum Albuminを標準として測定した。
[0032] (3)コレステロール含量測定
ホモジネート中の総コレステロール、遊離コレステロール、コレステリルエステルを以 下の手順で測定した。常法に従いホモジネートから総脂質を抽出 '回収、コレステロ ール Eテストヮコー（和光純薬）、遊離コレステロール Eテストヮコー（和光純薬）を用い 、総コレステロール濃度及び遊離コレステロール濃度を測定、ホモジネート中総コレ ステロール、遊離コレステロール含量を算出した。総コレステロール力 遊離コレステ ロールを差し引 、た値をコレステリルエステル含量とした。 [0033] (4)リソソーム酸性リパーゼ (LAL)活性測定
S.Zhang等の報告（バイオケミカルジャーナル、第 348卷、 p621— 632)の方法を一 部改変して測定した。すなわち、蛍光測定用マイクロプレートに緩衝液 (0.4M sodium acetate pH5.5) 100 μ L、水 50 μ L、「動脈硬化病変試料」ホモジネート 25 μ Lを加えて 37°Cに保ち、基質として 4-methylumbellyferyl oleate溶液 25 μ Lを各ゥエルに添カロし、 37°Cで 30分反応させ、蛍光プレートリーダーで Ex355/Em460の蛍光を測定した。「動 脈硬化病変試料」ホモジネートの代わりにホモジネート調製用緩衝液をカ卩えて反応さ せ蛍光測定したものを blankとし、サンプルの蛍光力も blankを引いた値をサンプルの 活性とした。
[0034] (5)酸性 βガラクトシダーゼ (GLB1)活性測定
S.Scheriff等の報告（ジャーナルォブバイオロジカルケミストリー、 1995年、第 270卷 、 P27766— 27772)の方法を一部改変して測定した。すなわち、蛍光測定用マイク 口プレートに緩衝液 (80mM citrate- 160 mM sodium phosphate buffer (pH4.4))100 μ L、水 L、「動脈硬化病変試料」ホモジネート 25 Lを分注してシールし 37°Cに保 ち基質として 4- methylumbellyfery卜 β - galactopyranoside溶液 25 μ Lを各ウエノレに添 加し、 37°C30分間反応させ、蛍光プレートリーダーで Ex355/Em460の蛍光を測定し た。「動脈硬化病変試料」ホモジネートの代わりにホモジネート調製用緩衝液 STE buf ferをカ卩えて反応させ蛍光測定したものを blankとし、サンプルの蛍光力も blankを引い た値をサンプルの活性とした。
[0035] (6)カテブシン D (CTSD)活性測定
蛍光測定用マイクロプレートに「動脈硬化病変試料」ホモジネート 50 L、基質とし て Ac- Gly- Lys- Pro- lie- Leu- Phe- Phe- Arg- Leu- Lys (Dnp)- D- Arg- NH2溶液 50 μ L を分注して、 37°Cで 30分反応させ、蛍光プレートリーダーで Ex320/Em405の蛍光を 測定した。「動脈硬化病変試料」ホモジネートの代わりにホモジネート調製用緩衝液 をカロえて反応させ蛍光測定したものを blankとし、サンプルの蛍光力 blankを引いた 値をサンプルの活性とした。
[0036] 4. AC AT酵素活性の補正
動脈硬化病変試料毎にホモジネートにっ 、て算出した ACAT酵素活性を、タンパク 量、コレステロール量、リソソーム酸性リパーゼ（LAL)活性、酸性 j8ガラクトシダーゼ（ GLB1)活性、カテブシン D (CTSD)活性で除し、それぞれの補正マーカーによる補正 ACAT酵素活性を算出した。さら〖こ、薬剤無処置のゥサギサンプル (Control群）の補 正 ACAT酵素活性の平均値を 100%とし、薬剤処置ゥサギサンプルの補正 ACAT酵素 活性の比率 (％ of Control)を求めた。
「試験結果」
1.動脈硬化病変における発現が ACAT-1と相関する酵素の選択
相関係数が高く且つ酵素活性を有する酵素を選択し、さらに、その活性測定系構 築の利便性カゝらリソソーム酸性リパーゼ (LAL)、酸性 βガラクトシダーゼ (GLB1)、力 テプシン D (CTSD)を選択し (表 1)、各々活性測定系を設定した。
[表 1] 動脈硬化病変における発現量が ACAT-1と相関する遺伝子の選択
略号 相関係数
STEROL I-ACYLTRANSFERASE 1 (ACAT-1 ) S0AT1 1.000
ACID CERAMIDASE ASAH 1 0.708
CATHEPSIN S CTSS 0.699
BRANCHED- CHAIN AMINO TRANSFERASE 1 BCAT1 0.684
SPERMIDINE/SPERMINE N(1 )-ACETYL TRANSFERASE SAT 0.680
ARACHIDONATE 5 - LIPOXYGENASE AL0X5 0.678
CATHEPSIN L CTSL 0.677
PHSPHOLIPASE A2, GROUP VII PLA2G7 0.677
BERA-GALACTOSIDASE-1 GLB1 0.668
FRUCTOSE-1 ,6-BISPHOSPHATASE 1 FBP1 0.666
PALMITOYL- PROTEIN THIOESTERASE 1 PPT1 0.658
LACTAMASE, BETA LACTB 0.656
CATHEPSIN D CTSD 0.644
PHOSPHOGLYCERATE KINASE PGK1 0.644
GLUTATHIONE PEROXIDASE GPX1 0.642
ALPHA-GALACTOSIDASE A GLA 0.632
LYSOSOMAL ACID LIPASE LAL 0.631
SPHINGOSINE - 1 - PHOSPHATE LYASE 1 SGPLA1 0.623
2. WHHLゥサギ動脈硬化病変における ACAT酵素活性と各種指標との相関性 20サンプルの WHHLゥサギ大動脈動脈硬化病変部位にっ 、て、組織ホモジネート を調製し、 ACAT酵素活性及び各種指標（前記の 3種の補正マーカー、並びに、タン パク濃度 (protein)、病変組織重量 (wet weight),総コレステロール含量 (TC)、遊離コレ ステロール含量 (FC)、および、コレステリルエステル含量 (CE))を測定し、 ACAT酵素 活性との相関を調べた (図 1〜8)。
その結果、 ACAT酵素活性は、タンパク濃度 (protein)、病変組織重量 (wet weight), 総コレステロール含量 (TC)、遊離コレステロール含量 (FC)、コレステリルエステル含 量 (CE)に比べ、 GLB1活性， LAL活性， CTSD活性との相関が高ぐヒト動脈硬化病変 において遺伝子発現レベルで ACAT-1との相関の高かった 3種の補正マーカーが、 ゥサギ動脈硬化病変における酵素活性レベルにおいても、実際に相関性が高いこと が示された。
3. ACAT阻害薬の動脈硬化病変 ACAT酵素阻害試験における ACAT酵素活性の 補正マーカーによる補正の効果
(1)試験化合物
ACAT阻害薬として、以下の化合物（以下、化合物 Xという）を用いて試験を行った モノカルシウム ビス（（2E)— 3— {3— [7 クロ口一 3— (2— { [4 フルォロ一 2— (トリフルォロメチル）フエ-ル]アミノ } 2 ォキソェチル） 6 メチル 2 ォキソ 2H クロメン 4 ィル]フエ-ル}アクリル酸） · 3水和物
この化合物は、以下の通り合成された。なお、この試験化合物 Xは、国際特許出願 PCT/JP2005/003838号に開示されて!、る。
(2E)— 3—{3— [7 クロロー 3—（2— { [4 フルオロー 2 （トリフルォロメチル）フ ェニル]アミノ } 2 ォキソェチル） 6 メチル 2 ォキソ 2H クロメン 4ーィ ル]フエ-ル}アクリル酸ナトリウム（5. Og)、エタノール（45ml)、水（9ml)の混合物を 60°Cに加熱して溶解した。溶液中の不純物を除塵ろ過後、温めたエタノール Z水（5 /1、 6ml)で洗浄した。ろ液と洗液を合わせ 60°Cで攪拌しながらカルシウムクロリド（ 0. 524g)の水溶液（10ml)を滴下した。 60°Cで 3時間攪拌した後、 25°Cで 1時間攪 拌した。結晶をろ取し、エタノール Z水（1Z1、 10ml)および水（10ml X 3)で順次 洗浄して表題ィ匕合物 (4. 47g、収率: 89. 8%)を無色結晶として得た。得られた結晶 は図 1に示すような粉末 X線回折像を示し、結晶化度は 66%であった。
'H-NMR (300MHz, DMSO-d ) δ (ppm) : 2. 17 (3Η, s) , 3. 32 (2Η, br) ,
6
6. 47 (1H, d, J= 16Hz) , 6. 87 (1H, s) , 7. 21〜7. 23 (1H, m) , 7. 32〜7. 5 4 (6H, m) , 7. 66 (2H, s) , 9. 65 (1H, brs) .
[0040] (2)試験方法
30羽の WHHLゥサギを、対照群（媒体 · 0.5%メチルセルロース投与）、 ACAT阻害薬 である化合物 Xの 3mg/kg投与、及び 10mg/kg投与の各 10羽ずつ 3群に群分けし、 1 日 1回 3日間投薬後動脈硬化病変サンプルを採取、動脈硬化病変組織ホモジネート の ACAT酵素活性及び補正指標（タンパク濃度、リソソーム酸性リパーゼ (LAL)活性 、酸性 j8ガラクトシダーゼ (GLB1)活性、カテブシン D (CTSD)活性)を測定し、それぞ れの指標による補正 ACAT酵素活性を図 9に示した。
対照群において、 LAL,GLB1,CTSDともタンパク濃度に比べ ACAT酵素活性と高い 相関を示した。また、タンパク濃度補正では大きくばらついた ACAT酵素活性が、 3つ の酵素（LAL,GLB1,CTSD)活性による補正によりばらつきが小さくなり、阻害薬として の作用強度が正確に評価できるようになった。
その結果として、化合物 X投与群の ACAT酵素活性はタンパク濃度補正では 10 mg /kgで p値力 S0.022の抑制を示すにとどまったのに対し、 GLB1、 CTSD補正では 10 mg/ kg投与群で p値 0.002以下の顕著な抑制、さらに LAL補正では 3 mg/kgから有意な抑 制を検出することができ、阻害活性を精度良く評価することができた。
[0041] 4.化合物 Xの WHHLゥサギにおける抗動脈硬化作用試験
上述の WHHLゥサギを用いた動脈硬化病変 ACAT酵素阻害試験にぉ 、て阻害作 用を認めた 3及び 10mg/kgの化合物 Xの投与について、長期投与の抗動脈硬化作用 を調べた。
(試験方法）
7ヶ月齢の WHHLゥサギを用い、化合物 X (3, 10 mg/kg/d)を 1日 1回、 12週間経口 投与し動脈硬化症への影響を調べた。 WHHLゥサギは薬物投与前に血管内超音波 (IVUS)により大動脈の動脈硬化症を検査し、大動脈の動脈硬化症と血漿コレステロ ール値及び性別をもとに群分けした。
投与開始前、及び投与 1, 2, 4, 6, 8, 10, 12週目に採血し、生化学自動分析装置を 用いて血漿総コレステロール値を測定し、台形公式により投薬期間中の血漿総コレ ステロール暴露量を求めた。投薬後、胸部大動脈を摘出し、動脈硬化症の指標とし てコレステロールエステル含量を測定した。
(成績）
3及び 10 mg/kgの化合物 Xは投薬期間中の血漿総コレステロール暴露量に対して は低下傾向にとどまつたが（表 2)、胸部大動脈のコレステロールエステル含量を有 意に低下させた (図 10)。
[表 2]
WHHLゥサギにおける化合物 Xの血漿コレステロールに対する影響
Figure imgf000022_0001
平均値土標準誤差。 対照群に対する Wi l l iamsの片側検定にて有意差なし。 5.考察
3日間投与の試験（上記 3の試験を参照）で ACAT阻害薬である化合物 X力 WHHL ゥサギの動脈硬化病変 ACAT活性を用量依存性に阻害することを、補正マーカーを 利用することでより明確に評価することができた。
一方、化合物 Xは、動脈硬化病変 ACATを阻害する 3及び 10mg/kgの用量で長期間 処置することにより、動物モデル試験において明確な抗動脈硬化作用を発揮した (上 記 4の試験を参照）。
これらの成績から、 ACAT阻害薬について短期間投薬による動脈硬化病変に存在 する ACATの薬理活性の阻害作用を調べること〖こより、長期間処置を要する抗動脈 硬化作用の有効用量 (動脈硬化病変が採取されたものと同一の動物における）を知 ることができると考えられた。
このことは WHHLゥサギだけでなぐヒトにも適用可能と考えられ、短期間の ACAT阻 害薬処置によるヒト由来の動脈硬化病変 ACAT阻害作用を調べることにより、長期間 を要する抗動脈硬化作用試験や動脈硬化性疾患発症予防試験の有効用量、即ち、 臨床用量を推定することが可能と考えられる。また、その ACAT阻害剤がゥサギとヒト で同じ血中薬物濃度で効果を発揮すると仮定するならば、これら WHHLゥサギの有 効用量における血中の薬物濃度を調べておくことで、臨床試験での血中薬物濃度を 指標にヒトでの有効用量を推定することも可能と考えられる。
産業上の利用可能性
本発明は、 ACATに代表される動脈硬化病変に存在する動脈硬化を増悪させる性 質を有するタンパク質の薬理活性 (例えば、酵素活性）に対する、当該標的タンパク 質の薬理活性の阻害薬による阻害作用を評価するための方法に関するものである。 本発明により、臨床試験段階並びに市販後の臨床用量を設定することができるとの 利点があるが、研究段階'前臨床試験段階での候補化合物の選択や、医療の現場 で患者に当該阻害薬を投与する段階で、当該患者に対する有効量の再設定、等に も有用である。
また、本発明は動脈硬化病変に存在する動脈硬化を増悪させる性質を有する物質 一般の動脈硬化を増悪させる作用に対する、当該物質に直接または間接的に作用 して動脈硬化病変を改善する薬剤あるいは治療手段を評価するための方法に関す るものである。

Claims

請求の範囲
[1] 採取された哺乳動物由来の動脈硬化病変試料に存在する動脈硬化を増悪させる 性質を有する物質の動脈硬化を増悪させる作用の強さに対応する値を、当該物質の 動脈硬化病変における量に相関して変動し、かつ評価しょうとする治療薬あるいは治 療手段の影響を受けない補正マーカーの動脈硬化病変試料における量で補正した 値を、該物質に直接または間接的に作用して動脈硬化病変を改善する薬剤の投与 群あるいは治療手段を施した群と非投与群あるいは非治療群の各々から採取された 試料に関して比較評価することを特徴とする、動脈硬化治療薬あるいは治療手段の 効果の評価方法。
[2] 採取された哺乳動物由来の動脈硬化病変試料に存在する動脈硬化を増悪させる 性質を有するタンパク質の薬理活性を、当該標的タンパク質の動脈硬化病変におけ る発現に相関して発現する補正マーカーの動脈硬化病変試料における発現量に対 応する値で除した補正値を、標的タンパク質の薬理活性の阻害薬の投与群と非投与 群の各々から採取された試料に関して比較評価することを特徴とする、当該阻害薬 による動脈硬化病変に存在する標的タンパク質の薬理活性阻害作用の評価方法。
[3] 「動脈硬化を増悪させる性質を有するタンパク質」が、 ACATであり、
「動脈硬化を増悪させる性質を有するタンパク質の薬理活性」が、 ACAT酵素活性で あり、
「標的タンパク質の薬理活性の阻害薬」が、 ACAT阻害薬である、請求項 2に記載の 評価方法。
[4] 「当該標的タンパク質の動脈硬化病変における発現に相関して発現する補正マー カー」が、酵素活性を有するタンパク質である、請求項 2に記載の評価方法。
[5] 当該標的タンパク質の動脈硬化病変における発現に相関して発現する補正マーカ 一の動脈硬化病変試料における発現量に対応する値が、当該補正マーカーの酵素 活性である、請求項 2に記載の評価方法。
[6] 採取された動脈硬化病変試料が、ヒト由来のものである、請求項 2に記載の評価方 法。
[7] 請求項 6に記載の評価方法による評価において、対照群に対して有意差をもって 標的タンパク質の薬理活性を阻害する阻害薬用量を選択することからなる、当該阻 害薬の臨床用量の設定方法。
[8] 標的タンパク質の薬理活性の阻害薬を、 1投与単位あたり請求項 7に記載の方法 により設定された臨床用量含有するように製剤化したことを特徴とする、哺乳動物に おける動脈硬化性疾患の予防および Zまたは治療剤。
[9] 請求項 7に記載の方法により設定された臨床用量の標的タンパク質の薬理活性の 阻害薬を、哺乳動物に投与することを特徴とする、動脈硬化性疾患の予防および Z または治療方法。
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