WO2007031140A2 - Extrakte aus epimedium-arten, verfahren zu ihrer herstellung und verwendung - Google Patents

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WO2007031140A2
WO2007031140A2 PCT/EP2006/006929 EP2006006929W WO2007031140A2 WO 2007031140 A2 WO2007031140 A2 WO 2007031140A2 EP 2006006929 W EP2006006929 W EP 2006006929W WO 2007031140 A2 WO2007031140 A2 WO 2007031140A2
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Egon Koch
Clemens Erdelmeier
Hermann Hauer
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Dr. Willmar Schwabe Gmbh & Co. Kg
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    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K36/00Medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicines
    • A61K36/18Magnoliophyta (angiosperms)
    • A61K36/185Magnoliopsida (dicotyledons)
    • A61K36/29Berberidaceae (Barberry family), e.g. barberry, cohosh or mayapple
    • A61K36/296Epimedium
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61PSPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A61P15/08Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives for gonadal disorders or for enhancing fertility, e.g. inducers of ovulation or of spermatogenesis
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61PSPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00Drugs for disorders of the endocrine system
    • A61P5/24Drugs for disorders of the endocrine system of the sex hormones

Definitions

  • the present invention relates to special extracts (liquid and dry extracts) from Epimedium species, to processes for their preparation, to medicaments and foods containing them, in particular dietetic foods, nutritional supplements and "medical food” and “dietary supplements”, and to the use of the special extracts for Prophylaxis and treatment of disease states that are caused by a lack of estrogens or by a dysregulation of the sex hormone metabolism, in particular of the estrogen metabolism.
  • Irregular menstrual cycles typically occur in women around the age of 45 and mark the onset of menopause. This period characterized by changes in the endocrine system, which may extend over a period of up to 10 years, is known as menopause or climacteric. It is triggered by the decreasing responsiveness of the ovaries to gonadotropins and the cessation of regular follicular maturation. As a result, there is a decrease and finally the final discontinuation of ova ⁇ ellen Ostrogensynthese. Due to the lack of estrogen production develop various deficiency symptoms, such as hot flashes, palpitations, depression, anxiety, headaches, sleep disorders, irritability or concentration disorders. In addition to acute climacteric symptoms, long-term postmenopausal health problems such as osteoporosis and atrophy of the urogenital mucosa and increased susceptibility to cardiovascular disease, stroke, Develop Alzheimer's disease or certain tumor diseases.
  • HET for the treatment of vasomotor and mental climacteric complaints is no longer responsible and is now rejected by many women.
  • HET for the prophylaxis of osteoporosis is to assess, especially since it is usually a long-term treatment. For these reasons, there is a great need for alternative therapy options with a better benefit-risk profile.
  • Substances which interact with the endocrine system in humans or animals and thereby produce an estrogen-like effect by influencing hormone-regulated signaling pathways have been found in many plants. At least 20 different substance groups with estrogenic / anti-estrogenic egg properties from more than 300 plants from more than 16 plant families have been found so far. Most known phytoestrogens belong to the groups of isoflavones, lignans or cumestanes. For numerous phytoestrogens, selective estrogen receptor modulating (SERM) properties are described. In contrast to natural estrogen, these compounds have partial, organ-specific estrogenic activity.
  • SERM selective estrogen receptor modulating
  • phytoestrogens are particularly advantageous, the agomstisch on certain target organs act (eg bones, vessels) or target symptoms (eg hot flashes) act, but at the same time no or estrogen have antagonistic effects on the mammary gland or the uterus.
  • TCM Traditional Chinese medicine
  • epi-medium species ferns Berberidaceae
  • These are Epimedium brevicornum, E. sagittatum, E. pubescens, E. wushanense and E. koreanum, E. davidu, E. hunanense.
  • the first five Epimedium species are part of the Herba Epimedii monograph of the Chinese Pharmacopoeia (Pharmacopoea of the Peoples Republic of China, Vol. I, 2000) and are formulated as a preparation with renal fat for the treatment of impotence, limb weakness, rheumatic pains and climacteric Used complaints.
  • herbs of the Epimedium Gattunq are used by the physicians in the form of various preparations, but not in the form of extracts from extraction with organic solvents for the treatment of impotence, spermorrhea, micturition, fatigue, lumbar and knee pain, infertility, amenorrhoea , Senile depression, rheumatoid arthritis, cardiovascular failure, hypertension, chronic bronchitis, angina pectoris and other diseases.
  • H. Wu, EJLien and LL Lien Progress in Drug Research, Vol.60, 2-57, Ed E. Jucker, 2003).
  • Epimedium species contain primarily Prenylflavonglyko- side as main ingredients.
  • Icariin 1 is a major glycoside and is found in many Epimedium species.
  • Other constituents are its desmethyl analogue epimedoside A 2.
  • free prenylflavones such as icaritine and free nonprenylated flavones such as luteolin occur.
  • chemically non-uniform group of icarisides e.g. Icarisid I3, as a major component group (H.Wu, E.J.Lien and L.L. Lien, in Progress in Drug Research, Vol.60, 2-57, Ed E. Jucker, 2003).
  • US6238707 describes a composition of at least 10 different drugs which also contains epimedium for the treatment of hormonal disorders in women. It is obvious that only a small concentration of the epimedium ingredients can be present in this composition.
  • No. 6,750,248 (corresponding to WO03040134) describes micro-preparative methods for the production and isolation of estrogen-active substances from plants such as, for example, Epimedium species. Also claimed are three estrogen-active compounds that have been microproperatively isolated and characterized from Epimedium herb. It is not known which Epimedium species were included in the herb drug used.
  • the described methods for isolating the claimed estrogenic compounds are very expensive, uneconomical and technologically unusable. These include liquid-liquid distribution, solid-phase fractionation, thin-layer chromatography, flash chromatography, and high performance or high pressure liquid chromatography. For liquid-liquid distribution, however, no concrete suitable solvents are mentioned.
  • amino acid-like or alkaloid-like ingredients in simple Epimedium extracts could now be clearly detected by means of thin layer chromatography (Dragendorff and iodoplatinate reagent) and HPLC.
  • the main compound of this amine or Alkaloidfrakti- on the Aporphinalkaloid Magnoflorin was identified. Magnoflorm has weak curare-like and hypotensive properties. Such compounds may also have excelled cytotoxic properties.
  • These plant extracts are characterized by the fact that they have lower undesirable side effects compared to conventional estrogen-effective extracts and are free of toxicologically questionable amines or alkaloids.
  • Another object of the invention is to provide such extracts which also have improved pharmaceutical properties and thus are better galenically processable and optically acceptable.
  • Another object of the present invention is to provide methods of making these special extracts, as well as drugs and foods containing these special extracts.
  • Corresponding special extracts may e.g. from the following epi-medium species (Fern. Berberidaceae): Epimedium brevicornum, E. sagittatum, E. pubescens, E. wushanense and E. koreanum, E. davidii, E. hunanense, E. grandiflorum, E. acuminatum, E. lotorrhizum, E. wanshanense, E. fragesii, E. sutchuenense, E. diphyllum, E. sempervirens, E. baicaliquizhounense, E. caotum, E. glandulospilosum, E. zushanense, E.
  • Epimedlum species are Epimedium brevicornum, Epimedium sagittatum, Epimedium pubescens, Epimedium wushanense and Epimedium koreanum, which are approved as plants for the drug Herba Epidemii of the Chinese Pharmacopoeia.
  • Epimedium brevicornum for special extracts according to the invention from the leaves of Herba Epimedii, surprisingly, in the context of the present invention, particularly strong estrogenic effects were found.
  • the special extracts according to the invention could be obtained from primary extracts by further separation and purification. It was found that the observed pharmacological effects are caused by the interaction of the prenylated flavone compounds present in the extracts. Due to the strong depletion, in particular of the aporphinal cocoa magnoflorin, the special extracts according to the invention also have lower undesired side effects.
  • the Magnofloringehalt lies in the special invention ene ckenex Exerciseen at less than 0.1 wt .-%, preferably less than 0.05 wt .-% and in particular less than 0.01 wt .-%, based on the dry extract.
  • the preparation of the special extracts according to the invention is carried out by a method comprising:
  • extracts according to the invention having improved pharmaceutical properties can be prepared by pre-extracting (degreasing) the epimedium drug prior to the actual extraction of the special extract by means of an apolar solvent and thus removing lipophilic accompanying substances.
  • the cleaning step A) for the purpose of degreasing can be carried out by pre-extraction of the drug with apolar organic solvents, for example with alkanes, more preferably heptane, or with ethers, more preferably tert. Butyl methyl ether, or with mixtures of alkanes with esters, in particular mixtures of heptane with ethyl acetate of up to 50 wt .-%, or with supercritical CO 2 .
  • the degreased drug thus obtained is then available for further processing.
  • the primary extraction step (B) can be carried out by methods known per se with inorganic or organic solvents. like P. List and PC Schmidt, Technology of Herbal Remedies, Horsch. Verlagsgesellschaft mbH, Stuttgart 1984, Chapter 3, pages 85-95 (the disclosure of which is incorporated herein by express reference), for example with water, alcohols, esters and ketones, in particular methanol, ethanol, ethyl acetate, acetone, CO 2 etc ., And their mixtures, in particular with water, at temperatures from room temperature to 100 0 C with gentle to vigorous mixing within 10 Hin. up to 24 hours.
  • inorganic or organic solvents like P. List and PC Schmidt, Technology of Herbal Remedies, Congress. Verlagsgesellschaft mbH, Stuttgart 1984, Chapter 3, pages 85-95 (the disclosure of which is incorporated herein by express reference), for example with water, alcohols, esters and ketones, in particular methanol, ethanol, ethyl acetate, acetone, CO 2 etc ., And
  • the further cleaning step (C) extracts extract constituents with undesired effects.
  • a Flussig-Flussig distribution with e.g. Ethyl acetate / water, butanone / water, n-butanol / water or methyl ethyl ketone / water, etc.
  • adsorption desorption on ion exchanger e.g. Sephadex LH-20, Diaion HP20, Dowex or Lewatit performed.
  • solvents for the chromatographic separation depending on the particular solid phase, different polarity solvents, e.g.
  • the dry extracts according to the present invention have a dry residue level of at least 95% (m / m) based on the total weight of the dry extract.
  • m / m dry residue level
  • F. Gaedcke, B. Steinhoff, H. Blas ius, Phytopharma ka, Wis sen ttl. Verlagsgesellschaft mbH Stuttgart, 2000 are dry extracts (Extracta sicca) solid preparations which are prepared by evaporation of the solvent used for their preparation.
  • the ratio of drug to solvent in each extraction ranges from about 1: 7 to about 1:10.
  • the extraction in step B) is carried out twice.
  • the alcohols and ketones used in step B) are preferably used as 10-96% (v / v) or (w / w), especially 50-92% (v / v) or (w / w) aqueous mixtures.
  • the solvent used in step B) is preferably selected from the group consisting of aqueous ethanol, aqueous methanol, aqueous acetone and aqueous or water-saturated ethyl acetate.
  • the solvent used in step B) is 70% (v / v) (62% (w / w)) ethanol, 60% (w / w) ethanol or water saturated ethyl acetate.
  • the special extracts obtainable according to the invention, together with customary pharmaceutically acceptable excipients, can be converted into medicaments in the form of e.g. Capsules, film-coated tablets, tinctures and dragées can be processed, wherein filling, binding, blasting, lubricating and coating compositions for film-coated tablets and dragees as well as oils and fats can be used as filling compositions for capsules as customary pharmaceutically acceptable auxiliaries.
  • the special extracts obtainable according to the invention can be used to produce foods, in particular dietetic foods, food supplements and "medical food” and “dietary supplements” in the form of, for example, capsules, film tablets, tablets.
  • foods in particular dietetic foods, food supplements and "medical food” and “dietary supplements” in the form of, for example, capsules, film tablets, tablets.
  • the special extracts obtainable according to the invention can be used (for the preparation of medicaments or foods) for the prophylaxis and treatment of disease states which are caused by a lack of estrogens or by a dysregulation of the sex hormone metabolism, in particular estrogen metabolism.
  • the disease states may be selected from the group consisting of climacteric complaints, sex hormone dependent cancers, benign prostatic hyperplasia, osteoporosis, Alzheimer's disease and cardiovascular diseases, as well as erectile dysfunction and urinary incontinence, the cancers comprising breast cancer, prostate cancer and uterine cancer.
  • Suitable dose ranges for the special extract according to the invention are 10 mg to 5 g, more preferably 50 mg to 2 g of extract per day.
  • the examples given below illustrate the invention and are not intended to be limiting. All percentages are by weight unless otherwise specified.
  • Dragendorff reagent (compare H. Wagner, S. Bladt, Plant Drug Analysis, 2 nd ed., Springer-Verlag Berlin, Heidelberg, New York 1996, p 360)
  • Iodoplatinate reagent (compare H. Wagner, S. Bladt, Plant Drug Analysis, 2 nd ed., Springer-Verlag Berlin, Heidelberg, New York 1996, p 361)
  • Ad 2 When spraying with Jodplatmat the Magnoflorin (Rf range 0.2-0.3) turns purple. Detection limit: 0.01% by weight
  • magnoflorine content determined by HPLC in the total extract (extract 1) was 1.1% by weight, based on the dry extract.
  • the ethyl acetate extract contains a large number of flavonoid-type compounds, while amino- or alkaloid-type compounds are no longer detectable (detection limit 0.01% by weight). The latter are clearly detectable in the separated water phase.
  • Example 2 Preparation of a special dry extract from Herba Epimedii by Flussig-Flussig distribution with methyl ethyl ketone
  • the combined extraction solution obtained in a) was removed from the ethanol on a rotary evaporator at 50 ° C.
  • the aqueous residue was shaken out 3 ⁇ with 270 ml of methyl ethyl ketone each, the methyl ethyl ketone phases were combined and concentrated to dryness on a rotary evaporator.
  • the methyl ethyl ketone extract contains according to TLC and HPLC analysis a variety of flavonoid-like compounds, while amine or alkaloid-like compounds are no longer detectable (detection limit 0.01 wt .-%). The latter are clearly detectable in the separated water phase.
  • Example 3 Production of a special dry extract from Herba Epimedii by liquid-liquid distribution with n-butanol
  • the combined extraction solution obtained in a) was removed on a rotary evaporator at 50 0 C, the ethanol.
  • the aqueous residue was shaken out 3 ⁇ with 270 ml of n-butanol each time, and the n-butanol phases were combined and concentrated to dryness on a rotary evaporator.
  • n-butanol extract 21.1 g (7.0% on the drug, 45% on the total extract)
  • n-butanol extract contains according to TLC and HPLC analysis
  • Example 4 Extraction of Epimedium brevicornum with water-saturated ethyl acetate and preliminary degreasing of the drug 300 g of ground Epimedium brevicornum drug was initially tert with 2.1 kg. Butyl methyl ether at 50 0 C extracted (step A)). The obtained liquid extract was discarded. The remaining defatted drug was extracted after intermediate drying twice with in each case 2.1 kg of water-saturated ethyl acetate with intensive stirring (process step B)).
  • the extract obtained is comparatively brightly colored and has a very good powder flowability, characterized by a very low angle of repose.
  • the extract according to DC and HPLC analysis contains a variety of flavonoid-like compounds, while a- or alkaloid-like compounds are no longer detectable (detection limit 0.01 wt .-%). The latter are clearly detectable in the separated water phase.
  • Example 5 Preparation of a special dry extract from Herba Epimedii by adsorption of alkaloid-like ingredients to an ion exchanger
  • the extract obtained from amines or alkaloids thus obtained contains the same spectrum of flavonoid-like compounds as before treatment with the cation exchanger. Alkaloids or amines were no longer detectable (detection limit 0.01 wt .-%).
  • Example 6 Testing of the Prepared Specialty Dry Extracts For Estrogenic Activity was Performed With A Cellular Estrogen Receptor Assay Assay Using Human Endometrial Carcinoma Cell Lines ECC-I (Bergeron et al., Mol., Cell Endocellol 150, 179-187, 1999). The cells were incubated (37 ° C., 5% CO 2 in air) in DME medium (ICN, 1033126) with addition of fetal calf serum (5%), glutamine (2 mM), antibiotic / antimycotic solution (1%). , Sigma, A-9909) and insulin (0.25 U / ml).
  • the adharently growing cells were removed by trypsinization from the bottom of the tissue culture bottles and adjusted to a density of 5 ⁇ 10 5 cells / ml in complete culture medium. Per well of a 24 well tissue culture plate (TPP, # 9224), 500 ⁇ l of cell suspension was filled.
  • test medium DMEM-F12 [Sigma, D-2906] with addition of Charcol-stripped bovine calf serum [5%], Glutamine [2 mM] and antibiotic / antimycotic solutions were then cultured for a further 24 hours in 500 ⁇ l of fresh test medium, and after extracting 100 ⁇ l of medium, the extracts were added to 10 ⁇ l final concentration in a volume of 50 ⁇ l allocated to the cells give.
  • the cells suspended in ethanol were transferred into 4 ml each of Quicksafe A and the bound radioactivity was measured in a ⁇ -counter (Packard, Tri-Carb 2300 TR). All approaches were done in duplicates.
  • a ⁇ -counter Packard, Tri-Carb 2300 TR. All approaches were done in duplicates.
  • To determine nonspecific binding cells were incubated in the presence of 100 nM unlabelled estradiol. The blank used was samples without labeled estradiol. Percent inhibition of receptor binding was calculated in each case in comparison to a parallel tested solvent control (DMSO, 0.1%). The determination of the half-maximal inhibitory concentration (IC 50 ) was carried out by non-linear regression calculation.
  • the special dry extracts according to the invention are approximately 3 to 6 times more effective with respect to the reference extract. With respect to the value of pure 17 ⁇ -estradiol they are less effective. However, the concentrations of the phytostenes in the organism are many times greater than those of the body's own steroids (17 ⁇ -estradiol) in the above-mentioned conventional dosages, so that the effect of the special dry extracts in the organism corresponds approximately to that of 17 ⁇ -estradiol.

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft Spezialextrakte (Flüssigund Trockenextrakte) aus Epimedium-Arten, Verfahren zu ihrer Herstellung, diese enthaltende Arzneimittel und Lebensmittel, insbesondere diätetische Lebensmittel, Nahrungsergänzungsmittel sowie "Medical Food" und "Dietary Supplements", und Verwendung der Spezialextrakte zur Prophylaxe und Behandlung von Krankheitszuständen, die durch einen Mangel an Östrogenen oder durch eine Dysregulation des Geschlechtshormonstoffwechsels, insbesondere des Östrogenstoffwechsels verursacht werden.

Description

EXTRAKTE AUS Epimedium-ARTEN, VERFAHREN ZU IHRER HERSTELLUNG UND VERWENDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft Spezialextrakte (Flussig- und Trockenextrakte) aus Epimedium-Arten, Verfahren zu ihrer Herstellung, diese enthaltende Arzneimittel und Lebensmittel, insbesondere diätetische Lebensmittel, Nahrungserganzungsmit- tel sowie „Medical Food" und „Dietary Supplements", und Verwendung der Spezialextrakte zur Prophylaxe und Behandlung von Krankheitszustanden, die durch einen Mangel an Östrogenen o- der durch eine Dysregulation des Geschlechtshormonstoffwechsels, insbesondere des Ostrogenstoffwechsels verursacht wer- den.
Irreguläre Menstruationszyklen treten bei Frauen in der Regel ab etwa dem 45. Lebensjahr auf und markieren den Beginn der Menopause. Diese durch Umstellungen des endokrinen Systems gekennzeichnete Periode, die sich über einen Zeitraum von bis zu 10 Jahren erstrecken kann, ist bekannt unter den Begriffen Wechseljahre oder Klimakterium. Ausgelost wird sie durch die nachlassende Ansprechbarkeit der Ovarien auf Gonadotropine und die Einstellung der regelmäßigen Follikelreifung. In der Folge kommt es zu einer Abnahme und schließlich der endgültigen Einstellung der ovaπellen Ostrogensynthese. Aufgrund der fehlenden Ostrogenproduktion entwickeln sich verschiedene Mangelsymptome, z.B. Hitzewallungen, Herzrasen, Depression, Ängstlichkeit, Kopfschmerzen, Schlafstörungen, Reizbarkeit oder Konzentrationsstorungen . Neben den akuten klimakterischen Beschwerden können sich langfristig im Verlauf der Postmenopause weitere gesundheitliche Probleme wie Osteoporose und Atrophie der Urogenitalschleimhaut sowie eine erhöhte Anfälligkeit für Herz-Kreislaufkrankheiten, Schlaganfall, Alzheimersche Krankheit oder bestimmte Tumorerkrankungen entwickeln .
Es ist naheliegend, den bestehenden Mangelzustand durch Er- satz des fehlenden Hormons zu ersetzen und tatsächlich können klimakterische Beschwerden durch Östrogensubstitution (Östro- genersatztherapie, ÖET) wirksam behandelt werden können. Allerdings wird diese erwünschte Wirkung durch eine erhöhte Rate von Endometriumkarzinomen erkauft, die aber offenbar durch die Kombination (zyklisch oder kontinuierlich) mit einem Gestagen (Hormonersatztherapie, HET) vermindert werden kann. Diese Behandlung ist hoch effektiv zur Linderung von vasomotorischen und psychischen Beschwerden während des Klimakteriums. Auch eine günstige Beeinflussung der postmenopausalen Osteoporose durch eine HET gilt als bewiesen. Umstritten ist allerdings, ob die HET andere während der peri- und postmenopausalen Periode auftretenden gesundheitlichen Probleme positiv beeinflußt. In den letzten Jahren mehren sich allerdings Meldungen, nach denen diese Erwartungen nicht nur nicht er- füllt werden, sondern die Hormon-Substitutionstherapie sogar mit schwerwiegenden, nachteiligen gesundheitlichen Folgen einhergeht. Ernüchterung brachte zunächst die HERS-Studie (Hulley et al . , 1998; Graday et al., 2000), die demonstrierte, daß die HET bei Frauen mit vorbestehender koronarer Herzerkrankung das Auftreten von kardialen Ereignissen nicht verringert und im Gegenteil das Risiko für thromboembolische Erkrankungen und Gallenblasenoperationen erhöht. Eine erhöhte Rate von Myocardinfarkten fand sich auch in der HERS II- Studie (Graday et al., 2002; Hulley et al., 2002) und in der ERA-Studie konnte ein günstiger Einfluß auf die Progression einer bestehenden Atherosklerose durch eine ÖET oder HET nicht nachweisbar (Herrington et al., 2000; SCRIPT vom 24. März 2000, S. 21) . Im Jahre 2002 gab das amerikanischen National Heart, Lung, and Blood Institute die vorzeitige und so- fortige Einstellung der Women Health Initiative (WHI) Studie bekannt gab. Mit dieser Studie wurden Nutzen und Risiken einer HET bei insgesamt 16.608 Frauen im Alter zwischen 59 und 79 untersucht (Writing Group for the Women's Health Initiati- tive Investigators. JAMA 288, 321, 2002). Nachdem sich eine entsprechende Tendenz bei früheren Zwischenauswertungen bereits abzeichnet hatte, wurde offensichtlich, daß sich unter dieser Behandlung die Häufigkeit von Brustkrebs um 26 % erhöht. Zusätzlich nahm die Rate von Schlaganfällen ( +41 %), Herzattacken (+29 %), Thromboembolien (+100%) und die Gesamt- heit von kardiovaskulären Erkrankungen (+22 %) zu. Obwohl auch eine Verringerung von Kolonkarzinomen (-37 %), Oberschenkelhals-Frakturen (-33 %) und insgesamt von Frakturen (- 24 %) beobachtet wurde, war die Nutzen/Risiko-Abwägung eindeutig negativ (Russouw et al., 2002; Fletcher und Colditz, 2002) . Auch die One Million Women Studie in England zeigte, dass Frauen, die aktuell Hormone einnahmen, ein erhöhtes Risiko hatten, an einem Mammakarzinom zu erkranken und daran zu versterben (Million Women Study Collaborators, Lancet 362, 419, 2003).
Aufgrund der deutlich gewordenen schwerwiegenden Nebenwirkungen ist ein Einsatz der HET zur Behandlung von vasomotorischen und psychischen klimakterischen Beschwerden nicht mehr zu vertreten und wird inzwischen auch von vielen Frauen abge- lehnt. Ähnlich ist die Verwendung der HET zur Prophylaxe der Osteoporose zu beurteilen, zumal es sich dabei in der Regel um eine langjährige Behandlung handelt. Aus diesen Gründen besteht ein großer Bedarf an alternativen Therapiemöglichkeiten mit einem besseren Nutzen-Risiko-Profil.
Substanzen, welche bei Mensch oder Tier mit dem endokrinen System interagieren und dabei durch Beeinflussung von hormongesteuerten Signalwegen einen östrogenähnlichen Effekt hervorrufen, wurden in vielen Pflanzen gefunden. Mindestens 20 verschiedene Stoffgruppen mit östrogenen/antiöstrogenen Ei- genschaften aus mehr als 300 Pflanzen von mehr als 16 Pflan- zenfamilien wurden bis jetzt gefunden. Die meisten bekannten Phytoostrogene gehören zu den Gruppen der Isoflavone, Lignane oder Cumestane. Für zahlreiche Phytoostrogene werden selekti- ve Estrogenrezeptor-modulierende (SERM) Eigenschaften beschrieben. Im Gegensatz zu natürlichem Estrogen verfugen diese Verbindungen über partielle, organspezifische Östrogene Wirkqualltaten. Für die Anwendung zur Prophylaxe und Therapie von klimakterischen Beschwerden, Osteoporose oder kardio- vaskulären Erkrankungen sind vor allem Phytoostrogene vorteilhaft, die agomstisch auf bestimmte Zielorgane wirken (z.B. Knochen, Gefäße) bzw. Zielsymptome (z.B. Hitzewallungen) wirken, gleichzeitig aber keine oder Estrogen- antagonistische Effekte auf die Brustdruse oder die Gebarmut- ter ausüben.
Die traditionelle chinesische Medizin (TCM) kennt einige Epi- medium-Arten (Farn. Berberidaceae) , deren Kraut arzneilich verwendet wird. Diese sind Epimedium brevicornum, E. sagitta- tum, E. pubescens, E. wushanense und E. koreanum, E. davidu , E. hunanense. Die ersten fünf Epimedium-Arten sind Bestandteil der Monographie Herba Epimedii des chinesischen Arzneibuchs (Pharmacopoea of the peoples Republic of China, Vol. I, 2000) und werden arzneibuchgemaß als Zubereitung mit Nieren- fett zur Behandlung von Impotenz, Gliederschwache, rheumatischen Schmerzen sowie klimakterischen Beschwerden verwendet.
In der TCM werden Krauter der Epimedium-Gattunq von den Ärzten in Form verschiedenster Zubereitungen, jedoch nicht in Form von Extrakten aus der Extraktion mit organischen Losungsmitteln zur Behandlung von Impotenz, Spermatorrhoe, Mik- tionsstorungen, Abgespanntheit, Lenden- und Knieschmerzen, Unfruchtbarkeit, Amenorrhoe, Altersdepression, rheumatoider Arthritis, Herzkreislaufversagen, Bluthochdruck, chronischer Bronchitis, Angina Pectoris sowie weitere Erkrankungen einge- setzt (H. Wu, E.J.Lien and L. L. Lien, in Progress in Drug Research, Vol.60, 2-57,Ed. E. Jucker, 2003).
Epimedium-Arten enthalten in erster Linie Prenylflavonglyko- side als Hauptinhaltsstoffe. Hauptglykosid und in vielen Epimedium-Arten vorkommend ist das Icariin 1. Weitere Inhaltsstoffe sind sein Desmethylanaloges Epimedosid A 2. Weiterhin kommen freie Prenylflavone wie Icaritin, und freie nicht- prenylierte Flavone wie Luteolin vor. Schließlich ist noch die chemisch nicht einheitliche Gruppe der Icariside, z.B. Icarisid I 3, als Hauptkomponentengruppe zu erwähnen (H. Wu, E.J.Lien and L. L. Lien, in Progress in Drug Research, Vol.60, 2-57,Ed. E. Jucker, 2003).
Figure imgf000006_0001
1 R=Me Icariin
2 R=H Epimedosid A
Figure imgf000006_0002
3 R=Me Icarisid I
Für Zubereitungen aus Epimedium-Arten, die Icariin und die Gesamtflavonoidfraktion enthielten, konnten eine Reihe von pharmakologischen Effekten gezeigt werden: Beeinflussung der Hormonregulation und von immunologischen Funktionen, Antitu- moreigenschaften, Anti-Aging und Anti-Atherosklerose Aktivität (H. Wu, E.J.Lien and L. L. Lien, in Progress in Drug Re- search, Vol.60, 2-57,Ed. E. Jucker, 2003).
In der US6238707 wird eine Zusammensetzung von mindestens 10 verschiedenen Drogen beschrieben, die auch Epimedium enthält, zur Behandlung von hormonellen Störungen bei der Frau. Es ist offensichtlich, dass in dieser Zusammensetzung nur eine geringe Konzentration der Epimediuminhaltsstoffe vorhanden sein kann.
Die US 6,750,248 (entspr. WO03040134 ) beschreibt mikropräpara- tive Methoden zur Herstellung und Isolierung von östrogen- wirksamen Substanzen aus Pflanzen wie z.B. Epimedium-Arten . Beansprucht werden auch drei östrogenwirksame Verbindungen, die aus Epimedium-Kraut mikropräparativ isoliert und charakterisiert wurden. Es ist nicht bekannt, welche Epimedium- Arten in der verwendeten Krautdroge enthalten waren. Die beschriebenen Verfahren zur Isolierung der beanspruchten Östrogenen Verbindungen sind sehr aufwendig, unwirtschaftlich und technologisch nicht nutzbar. Diese umfassen Flüssig-Flüssig- Verteilung, Festphasen-Fraktionierung, Dünnschicht- Chromatographie, Flashchromatographie und Hochleistungs- oder Hochdruckflüssigkeitschromatographie. Zur Flüssig-Flüssig- Verteilung werden jedoch keinerlei konkrete geeignete Lösungsmittel erwähnt. Als Festphasen-Fraktionierung werden konkret (s. Beispiel 8) Polyamid, Diol, und C18 (=RP18) Pha- sen erwähnt und angewandt. Diese sind reine adsorptions- bzw. verteilungschromatographische Phasen und haben keinerlei Io- nentauschcharakter . Ionenaustauscher werden in der US 6,750,248 nicht erwähnt. Überraschenderweise konnten nun mittels dunnschichtchroma- tographischer Nachweisverfahren (Dragendorff- und Jodoplati- nat-Reagenz) und HPLC aminartige bzw. alkaloidartige Inhaltsstoffe in Epimedium-Einfachextrakten deutlich nachgewiesen werden. Als Hauptverbindung dieser Amin- bzw. Alkaloidfrakti- on wurde das Aporphinalkaloid Magnoflorin identifiziert. Magnoflorm besitzt schwache curare-ahnliche und blutdrucksenkende Eigenschaften. Solche Verbindungen können auch aus- gepagte zelltoxische Eigenschaften aufweisen.
Der vorliegenden Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, Pflan- zenspezialextrakte mit verbesserten pharmakologischen Wirkungen bereitzustellen, die zur Prophylaxe und Behandlung von Krankheitszustanden geeignet sind, die durch einen Mangel an Östrogenen oder durch eine Dysregulation des Geschlechtshormonstoffwechsels, insbesondere Ostrogenstoffwechsels verursacht werden. Diese Pflanzenspezialextrakte zeichnen sich dadurch aus, dass sie gegenüber üblichen ostrogenwirksamen Extrakten geringere unerwünschte Nebenwirkungen aufweisen und von toxikologisch bedenklichen Aminen bzw. Alkaloiden frei sind.
Eine weitere Aufgabe der Erfindung liegt darin, derartige Extrakte bereitzustellen, die zudem verbesserte pharmazeutische Eigenschaften aufweisen und somit besser galenisch verarbeitbar und optisch akzeptabel sind.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung von Verfahren zur Herstellung dieser Spezialex- trakte sowie von Arzneimitteln und Lebensmitteln, die diese Spezialextrakte enthalten.
Diese Aufgaben werden erfindungsgemaß durch die Spezialextrakte (Flussig- und Trockenextrakte) aus Epimedium-Arten ge- maß den Patentansprüchen 1-9, dem Verfahren zu ihrer Herstel- lung gemäß den Patentansprüchen 10-24, das Arzneimittel gemäß Patentanspruch 25, das Lebensmittel gemäß Patentanspruch 26, sowie die Verwendung der Spezialextrakte gemäß den Patentansprüchen 27-29 gelöst.
Entsprechende Spezialextrakte können z.B. aus folgenden Epi- medium-Arten (Farn. Berberidaceae) hergestellt werden: Epimedium brevicornum, E. sagittatum, E. pubescens, E. wushanense und E. koreanum, E. davidii , E. hunanense, E. grandiflorum, E. acuminatum, E. leotorrhizum, E. wanshanense, E. fragesii , E. sutchuenense, E. diphyllum, E. sempervirens, E. baicaliquiz- hounense, E. caotum, E. glandulospilosum, E. zushanense, E. reticulatum, E. baojingenensis, E. simplicifolium, E. elonga- tum, E. ecalcaratum, E. truncatum, E. haiyangense, E. platy- petalum und E. cantabrigiense.
Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung sind besonders bevorzugte Epimedlum-Arten Epimedium brevicornum, Epimedium sagittatum, Epimedium pubescens, Epimedium wushanense und Epimedium koreanum, die als Pflanzen für die Droge Herba Epi- medii des Chinesischen Arzneibuches zugelassen sind. Für erfindungsgemäße Spezialextrakte aus den Blättern von Herba Epimedii wurden überraschenderweise im Rahmen der vorliegenden Erfindung besonders starke Östrogene Wirkungen festge- stellt.
Die erfindungsgemäßen Spezialextrakte konnten aus Primärextrakten durch weitere Trennung und Aufreinigung erhalten werden. Es zeigte sich, dass die beobachteten pharmakologischen Effekte durch das Zusammenspiel der in den Extrakten vorliegenden prenylierten Flavonverbindungen verursacht werden. Durch die starke Abreicherung insbesondere des Aporphinalka- loids Magnoflorin weisen die erfindungsgemäßen Spezialextrakte zudem geringere unerwünschte Nebenwirkungen auf. Der Magnofloringehalt liegt bei den erfindungsgemäßen Spezialtro- ckenextrakten bei weniger als 0,1 Gew.-%, vorzugsweise weniger als 0,05 Gew.-% und insbesondere bei weniger als 0,01 Gew.-%, bezogen auf den Trockenextrakt.
Die Herstellung der erfindungsgemäßen Spezialextrakte erfolgt durch ein Verfahren umfassend:
A) einen optionalen Reinigungsschritt zwecks Entfettung der Droge
B) einen primären Extraktionsschritt C) mindestens einen weiteren Reinigungsschritt und ggf.
D) die Aufkonzentration des in C) erhaltenenen Flüssigextraktes zum Trockenextrakt.
Übliche Pflanzenextrakte sind bedingt durch lipophile Be- gleitstoffe (Fette, Wachse, Chlorophylle etc.) häufig klebrig oder weisen halbfeste Konsistenz auf und sind dunkel gefärbt. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform können erfindungsgemäße Extrakte mit verbesserten pharmazeutischen Eigenschaften hergestellt werden, indem die Epimediumdroge vor der eigent- liehen Extraktion des Spezialextraktes mittels eines apolaren Lösungsmittels vorextrahiert (entfettet) wird und somit lipophile Begleitstoffe entfernt werden.
Der Reinigungsschritt A) zwecks Entfettung kann durch Vorex- traktion der Droge mit apolaren organischen Lösungsmitteln durchgeführt werden, z.B. mit Alkanen, besonders bevorzugt Heptan, oder mit Ethern, besonders bevorzugt tert. Butyl- Methylether, oder mit Gemischen von Alkanen mit Estern, insbesondere Gemische von Heptan mit Ethylacetat von bis zu 50 Gew.-%, oder auch mit überkritischem CO2. Die so erhaltene entfettete Droge steht anschließend für die weitere Aufarbeitung zur Verfügung.
Der primäre Extraktionsschritt (B) kann nach an sich bekann- ten Verfahren mit anorganischen oder organischen Lösungsmit- teln wie sie bei P. List und P.C. Schmidt, Technologie pflanzlicher Arzneizubereitungen, Wissensch. Verlagsgesellschaft mbH, Stuttgart 1984, Kapitel 3, Seiten 85-95 (der Offenbarungsgehalt wird hierin durch ausdrückliche Bezugnahme eingeschlossen) beschrieben sind, z.B. mit Wasser, Alkoholen, Estern und Ketonen, insbesondere Methanol, Ethanol, Ethylace- tat, Aceton, CO2 etc., und deren Gemischen, insbesondere mit Wasser, bei Temperaturen von Raumtemperatur bis 1000C unter gelinder bis heftiger Durchmischung innerhalb von 10 Hin. bis 24 Std. durchgeführt werden.
Durch den weiteren erfmdungsgemaßen Reinigungsschritt (C) werden Extraktbestandteile mit unerwünschten Wirkungen abge- reichert. Dazu wird entweder eine Flussig-Flussig-Verteilung mit z.B. Ethylacetat/ Wasser, Butanon/Wasser, n-Butanol/Was- ser oder Methylethylketon/Wasser etc., oder eine Adsorption- Desorption an Ionenaustauscher, z.B. Sephadex LH-20, Diaion HP20, Dowex oder Lewatit durchgeführt. Als Losungsmittel für die chromatographische Abtrennung können hier in Abhängigkeit von der jeweiligen festen Phase Losungmittel unterschiedlicher Polarität wie z.B. Wasser, Methanol, Ethanol, andere Alkohole, Aceton, andere Ketone, Ethylacetat und deren Gemische verwendet werden. Diejenigen Fraktionen, welche die phyto- ostrogenen Bestandteile ohne die Bestandteile mit unerwunsch- ten Wirkungen enthalten, werden vereinigt, im Vakuum mehr oder weniger eingeengt zu Flussig- bzw. Spissumextrakten und ggf. (D)) gefriergetrocknet oder bei erhöhter Temperatur und vermindertem Druck z.B. im Trockenschrank vom Losungsmittel befreit, um einen Trockenextrakt zu erhalten.
Die Trockenextra kte gemäß der vorliegenden Erf indung haben e inen Trockenruckstand von mindestens 95% (m/m) be zogen auf die Gesamtmas se des Trockenextra kts . Gemäß F . Gaedcke , B . Steinhoff , H . Blas ius , Phytopharma ka , Wis senschaf tl . Verlags- gesell schaft mbH Stuttgart , 2000 sind Trockenextra kte (Extracta sicca) feste Zubereitungen, die durch Verdampfen des zu ihrer Herstellung verwendeten Losungsmittels hergestellt werden.
Das Verhältnis Droge zu Losungsmittel liegt bei jedem Extrahieren im Bereich von etwa 1:7 bis etwa 1:10.
In einer bevorzugten Ausfuhrungsform wird die Extraktion in Schritt B) zweimal ausgeführt.
Die in Schritt B) verwendeten Alkohole und Ketone werden vorzugsweise als 10-96 % (v/v) oder (w/w) , insbesondere 50-92 % (v/v) oder (w/w) wassrige Gemische eingesetzt.
Das in Schritt B) verwendete Lösungsmittel ist vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus wassrigem Ethanol, wassrigem Methanol, wassrigem Aceton und wassrigem oder was- sergesattigtem Ethylacetat. Insbesondere ist das in Schritt B) verwendete Losungsmittel 70 % (v/v) (62 % (w/w)) Ethanol, 60 % (w/w) Ethanol oder wassergesättigtes Ethylacetat.
Die erfindungsgemaß erhaltlichen Spezialextrakte können zusammen mit üblichen pharmazeutisch vertraglichen Hilfsstoffen zu Arzneimitteln in Form von z.B. Kapseln, Filmtabletten, Tinkturen und Dragees verarbeitet werden, wobei als übliche pharmazeutisch vertragliche Hilfsstoffe Füll-, Binde-, Spreng-, Schmier- und Uberzugsmittel für Filmtabletten und Dragees sowie Ole und Fette als Füllmassen für Kapseln verwendet werden können.
Des Weiteren können die erfindungsgemaß erhaltlichen Spezialextrakte zusammen mit üblichen Lebensmittelzusatzstoffen zu Lebensmitteln, insbesondere diätetischen Lebensmitteln, Nah- rungserganzungsmitteln sowie „Medical Food" und „Dietary Supplements" in Form von z.B. Kapseln, Filmtabletten, Tinktu- ren und Dragees verarbeitet werden, wobei die üblichen Lebensmittelzusatzstoffe, Farbstoffe, Konservierungsmittel, An- tioxidantien, Emulgatoren, Stabilisatoren, Säuerungsmittel, Geliermittel, Trägerstoffe, sowie sonstige nach der EU Rah- menrichtlinie 89/107 und den EU Richtlinien 95/2/EWG, sowie Änderungen 96/85/-, 98/72/- und 2001/5/EG zugelassene Zusatzstoffe umfassen.
Die erfindungsgemäß erhältlichen Spezialextrakte können (zur Herstellung von Arzneimitteln bzw. Lebensmitteln) zur Prophylaxe und Behandlung von Krankheitszuständen verwendet werden, die durch einen Mangel an Östrogenen oder durch eine Dysregu- lation des Geschlechtshormonstoffwechsels, insbesondere Ös- trogenstoffwechseis verursacht werden.
Die Krankheitszustände können aus der Gruppe bestehend aus klimakterischen Beschwerden, geschlechtshormonabhängigen Krebserkrankungen, benigne Prostatahyperplasie, Osteoporose, Alzheimerische Krankheit und Herz-Kreislauferkrankungen, so- wie erektile Dysfunktion und Harninkontinenz ausgewählt sein, wobei die Krebserkrankungen Brustkrebs, Prostatakrebs und Gebärmutterkrebs umfassen.
Mit den prenylierte Flavone umfassenden erfindungsgemäßen Spezialextrakten, wird somit ein Arzneimittel zur Verfügung gestellt, das zur Vorbeugung und/oder Bekämpfung von Krankheitszuständen, die durch einen Mangel an Östrogen oder durch eine Dysregulation des Geschlechtshormonstoffwechsels, insbesondere Östrogenstoffwechsels verursacht werden, sehr gut ge- eignet ist.
Geeignete Dosisbereiche für den erfindungsgemäßen Spezialex- trakt liegen bei 10 mg bis 5 g, besonders bevorzugt 50 mg bis 2 g Extrakt pro Tag. Die nachstehend angegebenen Beispiele erläutern die Erfindung und sind nicht beschränkend aufzufassen. Alle Prozentangaben beziehen sich auf das Gewicht, falls nichts Anderes angegeben ist.
HPLC-System zur Bestimmung der stickstoffhaltigen Verbindung
Magnoflorin:
HPLC-Methode (Nachweisgrenze 0,05 Gew.-%)
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DC-System zum Nachweis der stickstoffhaltigen Verbindung Magnoflorin in Epimedium-Extrakt
Stationäre Phase: Kieselgel F 254 Merck Mobile Phase: Ethylacetat-Ameisensäure-Essigsäure-Wasser
(100:11:11:27)
Detektion : 1. Dragendorff Reagenz (vgl. H.Wagner, S. Bladt, Plant Drug Analysis, 2nd ed., Springer-Verlag Berlin, Heidelberg, New York 1996, S. 360;) 2. Iodplatinat-Reagenz (vgl. H.Wagner, S. Bladt, Plant Drug Analysis, 2nd ed., Springer-Verlag Berlin, Heidelberg, New York 1996, S. 361;)
Zu 1. : Beim Besprühen der DC-Platte mit Dragendorff-Reagenz färbt sich das Magnoflorin (Rf-Bereich 0,2 - 0,3) orange.
Zu 2.: Beim Besprühen mit Jodplatmat färbt sich das Magnoflorin (Rf-Bereich 0,2-0,3) violett. Nachweisgrenze: 0,01 Gew.-%
Beispiel 1: Herstellung eines Spezialtrockenextraktes aus Herba Epimedii durch Flussig-Flussig-Verteilung mit Ethylace- tat
a) Extraktion (Verfahrensschritt B) )
300g gemahlene Blatter (4 mm) von Herba Epimedii wurden zwei- mal mit je 2,1 kg 70 % (v/v) (62 % (w/w) ) Ethanol versetzt, und je 1 h bei 500C unter intensivem Ruhren. Nach der Extraktion wurde jeweils über ein Supra Seitz 1500-Filter abgesaugt. Die beiden Extraktlosungen wurden vereinigt und davon zur Trockenruckstandbestimmung jeweils ein Aliquot am Rotati- onsverdampfer getrocknet. Es ergab sich ein Trockenruckstand von 47g entsprechend einer Ausbeute von 15,7 % (= Extrakt 1; Gesamtextrakt) .
Der Magnoflorin-Gehalt, bestimmt mit HPLC betrug im Gesamtex- trakt (Extrakt 1) 1,1 Gew.-% bezogen auf den Trockenextrakt.
b) Reinigung und Aufkonzentrieren zur Trockne (Verfahrens- schritte C) und D) ) Der in a) erhaltenen vereinigten Extraktionslosung wurde am Rotationsverdampfer bei 500C das Ethanol entzogen. Der wass- rige Ruckstand wurde 3x mit jeweils 225 ml Ethylacetat ausgeschüttelt, die Ethylacetat-Phasen vereinigt und am Rotations- Verdampfer zur Trockne eingeengt:
Ethylacetat-Extrakt (=Spezialtrockenextrakt 2) = 7,86 g (2,62 % bez. auf Droge; 16,7 % bez. auf Gesamtextrakt)
Der Ethylacetat-Extrakt enthalt gemäß DC- und HPLC-Analyse eine Vielzahl von flavonoidartigen Verbindungen, wahrend a- min- bzw. alkaloidartige Verbindungen nicht mehr nachweisbar sind (Nachweisgrenze 0,01 Gew.-%). Letztere sind in der abgetrennten Wasserphase deutlich nachweisbar.
Beispiel 2: Herstellung eines Spezialtrockenextraktes aus Herba Epimedii durch Flussig-Flussig-Verteilung mit Methyl- ethylketon
a) Extraktion (Verfahrensschritt B) )
wurde durchgeführt wie unter Beispiel 1 beschrieben.
b) Reinigung und Aufkonzentrieren zur Trockne (Verfahrens- schritte C) und D) )
Der in a) erhaltenen vereinigten Extraktionslosung wurde am Rotationsverdampfer bei 500C das Ethanol entzogen. Der wass- rige Ruckstand wurde 3x mit jeweils 270 ml Methylethylketon ausgeschüttelt, die Methylethylketon-Phasen vereinigt und am Rotationsverdampfer zur Trockne eingeengt:
Methylethylketon-Extrakt (Spezialtrockenextrakt 3) = 12,2 g (4,1 % bez. auf Droge; 26,0 % bez. auf Gesamtextrakt) Der Methylethylketon-Extrakt enthält gemäß DC- und HPLC- Analyse eine Vielzahl von flavonoidartigen Verbindungen, während amin- bzw. alkaloidartige Verbindungen nicht mehr nachweisbar sind (Nachweisgrenze 0,01 Gew.-%). Letztere sind in der abgetrennten Wasserphase deutlich nachweisbar.
Beispiel 3: Herstellung eines Spezialtrockenextraktes aus Herba Epimedii durch Flüssig-Flüssig-Verteilung mit n-Butanol
a) Extraktion (Verfahrensschritt B))
wurde durchgeführt wie unter Beispiel 1 beschrieben.
b) Reinigung und Aufkonzentrieren zur Trockne (Verfahrens- schritte C) und D) )
Der in a) erhaltenen vereinigten Extraktionslösung wurde am Rotationsverdampfer bei 500C das Ethanol entzogen. Der wäss- rige Rückstand wurde 3x mit jeweils 270 ml n-Butanol ausge- schüttelt, die n-Butanol-Phasen vereinigt und am Rotationsverdampfer zur Trockne eingeengt:
n-Butanol-Extrakt (Spezialtrockenextrakt 4) = 21,1 g (7,0 % bez. auf Droge; 45% bez. auf Gesamtextrakt)
Der n-Butanol-Extrakt enthält gemäß DC- und HPLC-Analyse eine
Vielzahl von flavonoidartigen Verbindungen, während amin- bzw. alkaloidartige Verbindungen nicht mehr nachweisbar sind
(Nachweisgrenze 0,01 Gew.-%). Letztere sind in der abgetrenn- ten Wasserphase deutlich nachweisbar.
Beispiel 4 : Extraktion von Epimedium brevicornum mit wassergesättigtem Ethylacetat und vorausgehender Entfettung der Droge 300 g gemahlene Epimedium brevicornum Droge wurde zunächst mit 2,1 kg tert. Butyl-Methylether bei 500C extrahiert (Verfahrensschritt A) ) . Der erhaltene Flüssigextrakt wurde verworfen. Die zurückgebliebene entfettete Droge wurde nach Zwi- schentrocknung zweimal mit je 2,1 kg wassergesättigtem Ethyl- acetat unter intensivem Rühren extrahiert (Verfahrensschritt B) ) . Die vereinigten Extraktlösungen wurden danach abfiltriert und die erhaltene Ethylacetat-Extraktlösung auf ca. 200 ml konzentriert und dreimal mit 80 ml ethylacetat-gesättigtem Wasser im Verhältnis ausgeschüttelt (Verfahrensschritt C) ) . Die abgetrennten und vereinigten Ethylacetat-Phasen wurden zur Trockene eingeengt (Verfahrensschritt D) ) :
Ausbeute: 5,6 g (1,9% bez. auf die Droge)
Der erhaltene Extrakt ist vergleichsweise deutlich hell gefärbt und weist eine sehr gute Pulverfließfähigkeit auf, ge- kennzeichneit durch einen sehr niedrigen Schüttwinkel.
Darüberhinaus enthält der Extrakt gemäß DC- und HPLC-Analyse eine Vielzahl von flavonoidartigen Verbindungen, während a- min- bzw. alkaloidartige Verbindungen nicht mehr nachweisbar sind (Nachweisgrenze 0,01 Gew.-%). Letztere sind in der abgetrennten Wasserphase deutlich nachweisbar.
Beispiel 5: Herstellung eines Spezialtrockenextraktes aus Herba Epimedii durch Adsorption alkaloidartiger Inhaltsstoffe an einen Ionentauscher
200 g einer mit 60% (m/m) Ethanol aus E. koreanum entsprechend Beispiel 1 erhaltenen Extraktlösung (mit 5% Trockensubstanzgehalt) (Verfahrensschritt B) ) wurden über einen mit Salzsäure regenerierten Kationenaustauscher Dowex HCR-W2 (20 ml) gegeben. Es wurde anschließend noch mit zwei Säulenvolu- mina 60% Ethanol nachgewaschen (Säulendimension: 2 cm I.D., 6 cm Lange) . Der gesammelte, saure Durchlauf wurde mit 1 M Natriumhydroxid auf pH 5,0 - 5,5 eingestellt (Verfahrensschritt C) ) . Schließlich wurde noch eingeengt und getrocknet (Verfahrensschritt D) ) .
Ausbeute: 9,46 g (94,6% des eingesetzten Extraktes)
Der so erhaltene von Ammen bzw. Alkaloiden befreite Extrakt enthalt das gleiche Spektrum flavonoidartiger Verbindungen wie vor der Behandlung mit dem Kationenaustauscher. Alkaloide bzw. Amine waren keine mehr nachweisbar (Nachweisgrenze 0,01 Gew.-%) .
Beispiel 6: Die Prüfung der hergestellten Spezialtrockenex- trakte auf estrogene Aktivität erfolgte mit einem zellularen Estrogenrezeptorbmdungsassay unter Verwendung der humanen Endometriumkarzinom-Zelllinien ECC-I (Bergeron et al., Mol. and Cell. Endocπnol . 150, 179-187, 1999). Die Zellen wurden im Brutschrank (37°C, 5% CO2 in Luft) in DME-Medium (ICN, 1033126) mit Zusatz von fötalem Kalberserum (5 %), Glutamin (2 mM) , Antibiotika/Antimykotika-Losung (1 %, Sigma, A-9909) und Insulin (0,25 U/ml) kultiviert. Vor der Versuchsdurchfuh- rung wurden die adharent wachsenden Zellen durch Trypsime- rung vom Boden der Gewebekulturflaschen abgelost und auf eine Dichte von 5xlO5 Zellen/ml in komplettem Kulturmedium eingestellt. Pro Vertiefung einer 24-Well Gewebekulturplatten (TPP, Nr. 9224) wurden 500 μl Zellsuspension eingefüllt. Nach 24 h wurden die Platten zentrifugiert (350g, 5 min, RT), das Medium verworfen und die Zellen zweimal mit Testmedium (DMEM- F12 [Sigma, D-2906] , mit Zusatz von Charcol-stripped bovinen Kalberserum [5 %], Glutamin [2 mM] und Antibioti- ka/Antimykotika-Losung gewaschen. Dann wurden die Zellen für weitere 24 Stunden in 500 μl frischem Testmedium kultiviert. Nach Abzug von 100 μl Medium wurden die Extrakte in 10-facher Endkonzentration in einem Volumen von 50 μl den Zellen zuge- geben. Eine Stunde spater wurde 2, 4 , 6, 7-3H-Estradiol (50μl xn 0,01 % Ethanol, Amersham, TRK 322) ebenfalls 10-facher Endkonzentration (3 nM) zu allen Substanzansatzen zupipettiert Nach einer Inkubation für 35 min bei 370C wurden die Uber- stände verworfen und 500 μl Phosphatpuffer (5 mM, pH 7,4 mit Zusatz von 0,5% bovine Serumalbumin, 0,25 mM Saccharose und 10 % Glycerol) zugegeben. Nach 30 min bei Raumtemperatur wurden die Zellen zweimal mit eiskaltem Phosphatpuffer ohne BSA gewaschen und dann 500 μl eiskaltes 96%iges Ethanol zuge- fugt. Die in Ethanol suspendierten Zellen wurde in je 4 ml Quicksafe A überfuhrt und die gebundene Radioaktivität in einem ß-Counter (Packard, Tri-Carb 2300 TR) gemessen. Alle Ansätze erfolgten in Duplikaten. Für die Bestimmung der unspezifischen Bindung wurden Zellen in Anwesenheit von 100 nM un- markiertem Estradiol inkubiert. Als Leerwert dienten Proben ohne markiertes Estradiol. Die prozentuale Hemmung der Rezeptorbindung wurde jeweils im Vergleich zu einer parallel getesteten Losungsmittelkontrolle (DMSO, 0,1%) berechnet. Die Ermittlung der halbmaximalen Hemmkonzentration (IC50) erfolg- te durch nicht lineare Regressionsberechnung.
Ergebnisse :
Tabelle 1:
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Die erfindungsgemäßen Spezialtrockenextrakte sind in Bezug auf den Vergleichsextrakt um das ca. 3- bis 6-fache wirksamer. In Bezug auf den Wert des reinen 17ß-Estradiols sind sie schwächer wirksam. Allerdings liegen bei den vorstehend angegebenen üblichen Dosierungen die Konzentrationen der Phyto- östrogene im Organismus um ein Vielfaches über denen von körpereigenen Steroiden (17ß-Estradiol) , so dass die Wirkung der Spezialtrockenextrakte im Organismus in etwa der des 17ß- Estradiols entspricht.

Claims

Patentansprüche
1. Spezialextrakt aus Epimedium-Arten mit einem Gehalt an Magnoflorin von weniger als 0,1 Gew.-%, bezogen auf den Tro- ckenextrakt , erhältlich durch
B) einen primären Extraktionsschritt der Epimedium-Art (en) mit einem anorganischen oder organischen Losungsmittel oder einem Gemisch davon, wobei eine Primarextraktlosung erhalten wird, C) mindestens einen Reinigungsschritt der in B) erhaltenen Primarextraktlosung, wobei zur Abreicherung der Stoffe mit unerwünschten Nebenwirkungen in dem Reinigungsschritt C) eine Flussig-Flüssig- Verteilung, gekennzeichnet durch ein- oder mehrmalige Vertei- lung der nachtraglich mit Wasser versetzten bzw. Wasser enthaltenden Primarextraktlosung zwischen Wasser und einem organischen Losungsmittel ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Ethylacetat, n-Butanol, Methylethylketon und Butanon und Vereinigen der erhaltenen organischen Losungsmittelphasen, oder eine Adsorption-Desorption an Ionenaustauscher durchgeführt wird, und gegebenenfalls
D) einen Schritt der Aufkonzentration zum Trockenextrakt der in C) erhaltenen organischen Losungsmittelphase (n) .
2. Spezialextrakt aus Epimedium-Arten nach Anspruch 1, wobei A) ein Reinigungsschritt zwecks Entfettung der Droge dem primären Extraktionsschritt B) vorgeschaltet ist.
3. Spezialextrakt aus Epimedium-Arten nach Anspruch 2, wo- bei der Reinigungsschritt zwecks Entfettung der Droge A) gekennzeichnet ist durch ein- oder mehrmaliges Extrahieren von einer oder mehreren Epimedium-Arten mit einem Losungsmittel ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus i) Alkanen, umfassend Heptan, ii) Ethern, umfassend tert. Butyl-Methylether, iii) Gemischen von Alkanen mit Estern, umfassend Gemische von Heptan mit Ethylacetat von bis zu 50%, iv) überkritischen Losungsmitteln, umfassend überkritisches CO2.
4. Spezialextrakt aus Epimedium-Arten nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei der primäre Extraktionsschritt B) gekennzeichnet ist durch ein- oder mehrmaliges Extrahieren von einer oder mehreren Epimedium-Arten mit einem Losungsmittel ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus i) Alkoholen und Ketonen einschließlich wassrigen Alkoholen und wassrigen Ketonen; und ii) Estern einschließlich wassrigen oder wassergesattig- ten Estern.
5. Spezialextrakt aus Epimedium-Arten nach Anspruch 4, wobei nach dem Verfahrensschritt B) zusatzlich filtriert und das organische Losungsmittel von der in Schritt i) erhaltenen alkoholischen oder ketonischen Extraktionslosung abgezogen wird und ein Ruckstand bzw. wassriger Rückstand erhalten wird.
6. Spezialextrakt aus Epimedium-Arten nach Anspruch 4, wobei nach dem Verfahrensschritt B) zusätzlich filtriert wird und Verfahrensschritt C) gekennzeichnet ist durch ein- oder mehrmalige direkte Verteilung des in Schritt ii) erhaltenen Esterextrakts mit Wasser oder Ester-gesattigtem Wasser und Vereinigen der erhaltenen organischen Losungsmittelphasen.
7. Spezialextrakt aus Epimedium-Arten nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei die in Verfahrensschritt C) erhaltene (n) organische (n) Losungsmittelphase (n) in Verfahrensschritt D) zur Trockne auf einen Trockenruckstand von mindestens 95% (m/m) bezogen auf die Gesamtmasse des Trockenex- trakts eingeengt werden, um einen Spezialtrockenextrakt zu erhalten .
8. Spezialextrakt nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei die Epimedium-Art ausgewählt ist aus Epimedium brevicornum, E. sagittatum , E. pubescens , E. wushanense, E.koreanum, E. davidii , E. hunanense, E. grandiflorum, E. acuminatum, E. Ie- otorrhizum, E. wanshanense, E. fragesii , E. sutchuenense, E. diphyllum, E. sempervirens , E. baicaliquizhounense, E. cao- tum, E. glandulospilosum , E. zushanense, E. reticulatum, E. baojingenensis , E. simplicifolium, E. elongatum, E. ecalcara- tum, E. truncatum, E. haiyangense, E. platypetalum und E. cantabrigiense .
9. Spezialextrakt nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei Epimedium brevicornum und/oder E. sagittatum und/oder pubescens und/oder E. wushanense und/oder E. koreanum verwendet wird.
10. Verfahren zur Herstellung eines Extraktes nach den Ansprüchen 1-9, umfassend
A) einen optionalen Reinigungsschritt zwecks Entfettung der Droge,
B) einen primären Extraktionsschritt der Epimedium-Art (en) mit einem anorganischen oder organischen Losungsmittel oder einem Gemisch davon, wobei eine Primarextraktlosung erhalten wird,
C) mindestens einen Reinigungsschritt der in B) erhaltenen Primarextraktlosung,
wobei zur Abreicherung der Stoffe mit unerwünschten Nebenwirkungen in dem Reinigungsschritt C) eine Flussig-Flussig- Verteilung, gekennzeichnet durch ein- oder mehrmalige Verteilung der nachtraglich mit Wasser versetzten bzw. Wasser ent- haltenden Primarextraktlosung zwischen Wasser und einem orga- nischen Lösungsmittel ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Ethylacetat, n-Butanol, Methylethylketon und Butanon und Vereinigen der erhaltenen organischen Lösungsmittelphasen, oder eine Adsorption-Desorption an Ionenaustauscher durchgeführt wird, wobei die gewünschten Inhaltsstoffe in organischen Lösungsmittelphase (n) als Flüssigextrakt erhalten werden, und gegebenenfalls
D) einen Schritt der Aufkonzentration zum Trockenextrakt der in C) erhaltenen organischen Lösungsmittelphase (n) .
11. Verfahren nach Anspruch 10, wobei Verfahrensschritt A) gekennzeichnet ist durch: ein- oder mehrmaliges Extrahieren von einer oder mehreren Epimedium-Arten mit einem Lösungsmittel ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus i) Alkanen, umfassend Heptan, ii) Ethern, umfassend tert. Butyl-Methylether, iii) Gemischen von Alkanen mit Estern, umfassend Gemische von Heptan mit Ethylacetat von bis zu 50 Gew.-%, iv) überkritischen Lösungsmitteln, umfassend überkritisches CO2.
12. Verfahren nach Anspruch 10 oder 11, wobei Verfahrensschritt B) gekennzeichnet ist durch: ein- oder mehrmaliges Extrahieren von einer oder mehreren Epimedium-Arten mit einem Lösungsmittel ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus i) Alkoholen und Ketonen einschließlich wässrigen Alkoholen und wässrigen Ketonen; und ii) Estern einschließlich wässrigen oder wassergesättigten Estern.
13. Verfahren nach Anspruch 12, wobei nach dem Verfahrensschritt B) zusätzlich filtriert wird und das organische Lö- sungsmittel von der in Schritt i) erhaltenen alkoholischen oder ketonischen Extraktionslosung abgezogen wird und ein Ruckstand bzw. wassriger Ruckstand erhalten wird.
14. Verfahren nach Anspruch 12, wobei nach dem Verfahrens- schritt B) zusätzlich filtriert wird und Verfahrensschritt B) gekennzeichnet ist durch ein- oder mehrmalige direkte Verteilung des in Schritt n) erhaltenen Esterextrakts mit Wasser oder Ester-gesattigtem Wasser und Vereinigen der erhaltenen organischen Losungsmittelphasen.
15. Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 14, wobei die im Verfahrensschritt C) erhaltene (n) organische (n) Losungsmittelphase (n) in Verfahrensschritt D) zur Trockne auf einen Trockenruckstand von mindestens 95% (m/m) bezogen auf die Ge- samtmasse des Trockenextrakts eingeengt werden, um einen Spezialtrockenextrakt zu erhalten.
16. Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 15, wobei die Extraktion in Verfahrensschritt B) zweimal ausgeführt wird.
17. Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 16, wobei das in Verfahrensschritt B) verwendete Losungsmittel wassriges Methanol oder wassriges Ethanol ist.
18. Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 16, wobei das m Verfahrensschritt B) verwendete Losungsmittel wassriges Aceton ist.
19. Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 18, wobei der in Verfahrensschritt B) verwendete Alkohol oder das in Verfahrensschritt B) verwendete Keton als 10-96 % (v/v) oder (w/w) wassriges Gemisch vorliegt.
20. Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 18, wobei der in Verfahrensschritt B) verwendete Alkohol oder das in Ver- fahrensschritt B) verwendete Keton als 50-92 % (v/v) oder (w/w) wassriges Gemisch vorliegt.
21. Verfahren nach Anspruch 17, wobei das in Verfahrens- schritt B) verwendete Losungsmittel 70 % (v/v) oder 60 %
(w/w) wassriges Ethanol ist.
22. Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 16, wobei das m Verfahrensschritt B) verwendete Losungsmittel Ethylacetat oder wassriges oder wassergesattigtes Ethylacetat ist.
23. Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 22, wobei die Epimedium-Art ausgewählt ist aus der Gruppe Epimedium brevi- cornum, E. sagittatum, E. pubescens, E. wushanense und E.koreanum, E. davidu , E. hunanense E. grandiflorum, E. acu- mmatum, E. leotorrhizum, E. wanshanense, E. fragesu , E. sutchuenense, E. diphyllum, E. sempervirens , E. baicaliquiz- hounense, E. caotum, E. glandulospilosum, E. zushanense, E. reticulatum, E. baoj ingenensis, E. simplicifolium, E. elonga- tum, E. ecalcaratum, E. truncatum, E. haiyangense, E. platy- petalum und E. cantabngiense.
24. Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 22, wobei E- pimedium brevicornum und/oder E. sagittatum und/oder pubes- cens und/oder E. wushanense und/oder E. koreanum verwendet wird.
25. Arzneimittel, umfassend einen Spezialextrakt nach einem der Ansprüche 1 bis 9und übliche pharmazeutisch vertragliche Hilfsstoffe.
26. Lebensmittel, umfassend einen Spezialextrakt nach einem der Ansprüche 1 bis 9und übliche Lebensmittelzusatzstoffe.
27. Verwendung eines Spezialextrakts nach einem der Ansprüche 1 bis 9, eines Arzneimittels nach Anspruch 25 zur Prophylaxe und Behandlung oder eines Lebensmittels nach Anspruch 26 zur Prophylaxe von Krankheitszuständen, die durch einen Man- gel an Östrogenen oder durch eine Dysregulation des Geschlechtshormonstoffwechsels, insbesondere Östrogenstoffwech- sels verursacht werden.
28. Verwendung nach Anspruch 27, wobei die Krankheitszu- stände aus der Gruppe bestehend aus klimakterischen Beschwerden, geschlechtshormonabhängigen Krebserkrankungen, benigner Prostatahyperplasie, Osteoporose, Alzheimerscher Krankheit und Herz-Kreislauferkrankungen, sowie erektile Dysfunktion und Harninkontinenz ausgewählt sind.
29. Verwendung nach Anspruch 28, wobei die geschlechtshormonabhängigen Krebserkrankungen aus der Gruppe bestehend aus Brustkrebs, Prostatakrebs und Gebärmutterkrebs ausgewählt sind.
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