WO2007028578A1 - Verfahren zur messung der permeation einer substanz durch eine barriere - Google Patents

Verfahren zur messung der permeation einer substanz durch eine barriere Download PDF

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WO2007028578A1
WO2007028578A1 PCT/EP2006/008660 EP2006008660W WO2007028578A1 WO 2007028578 A1 WO2007028578 A1 WO 2007028578A1 EP 2006008660 W EP2006008660 W EP 2006008660W WO 2007028578 A1 WO2007028578 A1 WO 2007028578A1
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permeation
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permeation barrier
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PCT/EP2006/008660
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Johannes Schmitt
Antje Konrad
Joachim NÖLLER
Thorsten Hartmann
Thomas Müller
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Nimbus Biotechnologie Gmbh
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    • G01N15/082—Investigating permeability by forcing a fluid through a sample
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    • G01N2015/0866—Sorption
    • G01N2015/0873—Dynamic sorption, e.g. with flow control means

Definitions

  • the present invention relates to a method for measuring the permeation of at least one substance contained in a solvent through a barrier and / or for determining permeation-influencing parameters, in particular for determining the permeability of the barrier for the at least one substance, as well as individual components and a kit for use in this procedure.
  • the permeation device is divided into two separate spatial units, the so-called Kompartimen- te.
  • Kompartimen- te the substance to be investigated is usually initially introduced on one side of the permeation barrier (in the donor compartment). With the onset of permeation, the concentration of the substance in the donor compartment gradually decreases while the substance accumulates in the acceptor compartment. The progression of the permeation process can be observed correspondingly via concentration measurements, at least until a concentration equilibrium has been established between the two compartments.
  • perfusion devices In addition to special permeation chambers (eg the so-called Ussing chamber), which are operated with isolated membrane vesicles or with organ tissue preparations as a barrier layer, among others, perfusion devices are also used which work with prepared intestinal areas of dead animals (Karlsson J.
  • Caco-2 cells and MDCK cells are used (Arthursson P., Epithelial Transport of Drugs in Cell Culture I: A Model for Studying the Passive Diffusion of Drugs over Intestinal Absorptive (Caco-2) Cells. J. Pharm. 1990; 79: 476-482; Arthursson P., Correlation between oral drug absorption in humans and apparent drug permeability coefficients in human intestinal epithelial (Caco-2) cells., Biochem., Biophys. Res.
  • the cells are cultured on permeable supports in special microtiter plates for a certain period of time. After formation of a monolayer cell layer, the cells are allowed to differentiate over a certain period of time and then take the natural permeation measurements. Depending on the cell type and cultivation conditions, this period is about 3 to 21 days. Subsequently, the cells are washed and submitted the actual measuring buffer on both sides of the cell layer. After addition of the substance to be measured on one side of the cell layer, samples are taken on the other side and the concentration of the substance to be examined is analyzed therein.
  • the schematic structure of a permeation measurement with a cell monolayer as a permeation barrier is shown in FIG.
  • the concentration measurements are usually carried out via an HPLC or LC / MS method.
  • the permeation can be measured both from the apical to the basolateral side and vice versa. Due to the morphology of the cells, this procedure allows conclusions to be drawn on the involvement of active transporter proteins in the permeation of the substance, since these transporter proteins are localized in the basolateral cell membrane. From these data, the so-called permeation coefficient can be calculated, which in turn correlates with in vivo data from the human body.
  • PAMPA Parallel Artificial Membrane Permeation Assay
  • the filter membranes are impregnated with mixtures of 1-20% lecithin in organic solvents (eg dodecane, hexadecane, 1, 9-decadiene), so that a lipophilic barrier layer is formed.
  • organic solvents eg dodecane, hexadecane, 1, 9-decadiene
  • a lipophilic barrier layer is formed.
  • This process reduces the diameter of the permeation barrier by using polycarbonate filter membranes with larger pore diameters (3 ⁇ m vs. 0.22 or 0.45 ⁇ m at Kansy) of 120 ⁇ m at Kansy to about 10 ⁇ m, thereby increasing the potential Throughput of substances per unit of time.
  • a method according to the invention is provided for investigating the permeation of a substance contained in a solvent through a barrier.
  • the simultaneous investigation of the permeation of several substances contained in a solvent is made possible by a method according to the invention.
  • a method according to the invention is eminently suitable for determining parameters influencing respiration, for example the permeability of the barrier for the at least one substance, which will be discussed later will be discussed in more detail. Permeation kinetics can also be determined with little effort by the method according to the invention.
  • An inventive method is characterized in particular by the fact that the permeation of the at least one substance is examined by using at least one luminescent probe.
  • luminescent is used as a generic term in particular for fluorescence and phosphorescence, but also for example for electro-, thermo- and chemiluminescence.
  • the at least one substance to be investigated is provided in a first step in a solvent on at least one side of a permeation barrier.
  • a permeation barrier This includes, inter alia, the possibility of providing different substances on both sides of the barrier and / or one or more identical substances on both sides of the barrier, in which latter case between the two sides of the barrier with respect to the substance or substance to be examined.
  • the substances to be examined must each have a concentration difference between the two sides of the barrier.
  • the at least one substance and the permeation barrier are allowed to interact for a certain period of time.
  • This incubation of the permeation barrier with the at least one substance contained in the solvent is followed in a further step by a measurement of luminescence signals of the at least one probe on at least one side of the permeation barrier.
  • the measured luminescence signals are modulated as a function of the respective concentration of the substance, it being absolutely necessary for the absorption spectra of the at least one substance to overlap with excitation and / or emission spectra of the at least one probe. In this way, statements about the concentration of the substance to be examined can be obtained on one or both sides of the permeation barrier, which in turn allows direct conclusions about the permeation of the substance through the barrier as well as on the various parameters influencing permeation.
  • the method according to the invention thus utilizes the so-called internal filter effect, in which the light absorption of substances can be determined indirectly via a weakening of luminescence intensities of suitable probes.
  • This phenomenon is based on the fact that the intensity of light rays, which are absorbed on the way to a suitable probe or on the way from the probe to a detector of other dissolved substances, that is, thus attenuated.
  • the overlap of excitation or emission wavelengths with the absorption band of the substance to be examined leads in the measurement at suitable wavelengths (ie in the range of the absorption band of the substance) to a modulation or attenuation of the luminescence intensity proportional to the concentration of the substances to be examined before and / or is behind the barrier.
  • the excitation light passes through the sample and is attenuated in the event of an overlap of the absorption spectrum of the substance to be examined with the excitation spectrum of the probe before it reaches the probe.
  • This is excited to luminesce and emits light, which in turn traverses the sample and is attenuated in the event of an overlap of the absorption spectrum of the substance with the emission spectrum of the probe.
  • the overall attenuation of the signal is proportional to the substance concentration in the sample.
  • WO 94/17388 describes the use of the internal filter effect for the determination of ions in liquids by means of a sensor membrane.
  • US 4,822,746 is concerned in general with the use of the internal filter effect for the determination of a ligand binding, whereby ligands here mean ions, substances or the like.
  • the ligand to be detected is made accessible to analysis by a suitable (color) reaction.
  • US Pat. No. 4,654,300 describes the use of such a quenching effect in immunoassays. In each of these cases, the internal filter effect is used for analytical purposes. However, this effect is in no case directly or exclusively caused by the substance to be investigated, as provided in a method according to the present invention.
  • a method according to the invention enables a continuous observation and measurement of a permeation process and is therefore particularly suitable for the measurement of permeation kinetics.
  • individual measurements can be made at a given time.
  • process steps such as sampling and sample transfer for the purpose of external concentration determinations can be dispensed with particular advantage.
  • Concentration changes with respect to a substance to be investigated as a result of a permeation process can thus be traced without difficulty on one side or on both sides of a permeation barrier at the same time.
  • a method according to the present invention is particularly suitable for use in the context of an automated, modern high throughput method.
  • a permeation barrier that can be used in a method according to the invention comprises, in a preferred embodiment, an artificial membrane.
  • the artificial membrane preferably comprises in a further development a porous carrier material, in particular a filter membrane.
  • the nature of the carrier material is basically not critical, so can be used, for example, porous plastics, silicates, glass, ceramics and metals.
  • the artificial membrane comprises organic material.
  • the organic material forms a layer on the surface of the porous support material and / or is present in the pores of the porous support material.
  • the organic material according to the invention is preferably lipophilic or hydrophobic.
  • the organic material is essentially at least one hydrocarbon having a preferred chain length of 8 or more carbons and / or at least one alcohol having a preferred chain length of 4 or more carbons. Hydrocarbons having chain lengths of more than 12 carbons, especially 14-16 carbons, are more preferred among those mentioned.
  • the organic material is essentially a lipid or a lipid mixture.
  • This may be a simple lipid layer, a so-called monolayer, or a double lipid layer, a so-called bilayer.
  • the composition of such lipid layers can be chosen freely depending on the desired application.
  • such lipid layers can be constructed to be substantially homogeneous, or different lipids, for example, can be used as constituents of the membrane layers, as a result of which, for example, the conditions of a native membrane are readjusted can.
  • the lipids or the lipid mixtures those which have membrane-bound, membrane-integral and / or trans-membrane proteins are more preferred.
  • Cells and / or cell fragments may also be preferred as the organic material, the cells then being present in particular in the form of a cell monolayer or cell monolayer. Particularly preferred is a monolayer of CACO-2 cells or of MDCK cells.
  • the permeation barrier comprises a non-artificial membrane instead of an artificial membrane, in particular a membrane of organ tissue. Preference is then given to barriers prepared from intestinal tissue, it also being possible in other cases for barriers prepared from skin tissue to be preferred.
  • the at least one luminescent probe is preferably part of the permeation barrier in preferred embodiments of the method according to the invention.
  • the porous support material of an artificial membrane, in particular the filter membrane is probe-marked.
  • the probe may be contained both in the carrier material and, in particular, also bound to it, preferably covalently.
  • the at least one probe may also be part of the organic material which, as already mentioned above, is present in particular as a layer on the surface of the porous carrier material and / or in the pores of the porous carrier material.
  • the at least one probe may also be preferred to apply the at least one probe to the barrier, in particular in FIG Shape of a segmenting, probe-labeled solid.
  • silicate beads provided with a probe are particularly well suited, but also sedimentable solids of glass, ceramic, silicate, metal and / or polymer material or of combinations of these materials are conceivable.
  • the at least one probe is contained in the solvent.
  • the probe is either used in dissolved form on one or both sides of the barrier or, which may be particularly preferred, in the form of a dispersible, non-sedimenting solid.
  • probe-marked polymer beads can be used as non-sedimenting solid.
  • the at least one probe is part of a gel which may also be disposed on one or both sides of the barrier.
  • the probe itself can be both inorganic and organic in nature.
  • examples here are inorganic nanoparticles, so-called “quantum dots", colorant-containing, dispersible or sedimentable and / or luminescent silicate or ceramic particles, organic dyes such as rhodamine or fluorescein, dye-containing, dispersible or sedimentable and / or luminescent polymer latices, organic dyes are among the named probes
  • luminescent proteins such as, for example, GFP or luminescent proteins whose luminescence properties change as a result of binding of substances, as is the case, for example, with HSA and AGP, are also conceivable as probes.
  • a method according to the invention is particularly preferably carried out in at least one permeation device.
  • Such preferably comprises at least one donor compartment in which the at least one substance is provided, at least one barrier and at least one acceptor compartment into which the substance can permeate.
  • the measurement of the luminescence signals can take place either only in the donor or in the acceptor compartment or in both compartments at the same time.
  • the at least one probe in the form of a probe-labeled insert into the at least one donor and / or acceptor compartment.
  • a probe-labeled insert is preferably matched in shape and size to a permeation device or a compartment of a permeation device, so that the at least one probe can be placed repeatedly in a defined position in the respective compartment.
  • This type of probe arrangement can also optionally be combined with one or more of the possibilities of the probe arrangement already mentioned.
  • a method according to the invention can also be used in incomplete, compartmentalized systems. For example, it is possible to provide a dialysis membrane with a probe and to follow the progression of a dialysis process continuously. In particular, it can be easily recognized when a dialysis process has been completed.
  • microtiter plates are particularly well suited.
  • the wells of microtiter plates are outstandingly suitable as compartments of a permeation device.
  • microtiter plates with 24, 48, 96, 384 and 1536 cavities can be used.
  • a system of two coordinated microtiter plates is used, wherein the cavities of a first plate in each case have a filter membrane (which can be used as part of an artificial membrane as mentioned above in a method according to the invention) and the second plate with the first sandwiched by juxtaposing can be combined.
  • the second plate is preferably the lower plate.
  • each cavity of the upper plate is associated with a vertically located underneath cavity of the lower plate (or vice versa).
  • the system of the two plates thus forms a permeation device with a plurality of adjacent donor and acceptor compartments.
  • the permeation direction that is to say the direction in which the permeating substance penetrates the permeation barrier, is, however, in principle freely selectable (for example, the upper plate with the filter membranes may be a donor or acceptor plate, but possibly also both at the same time).
  • the upper plate with the filter membranes may be a donor or acceptor plate, but possibly also both at the same time.
  • the permeation direction is marked by black arrows.
  • the measurable luminescence signal is proportional to the substance concentration. This can be converted in further steps, if necessary using calibrations, directly into the corresponding concentrations.
  • I 0 is the intensity of luminescence of a reference without substance (usually so only with buffer solution), and I is the luminescence intensity in the presence of the test substance.
  • concentration-proportional quantity c 'for the concentration c can thus be determined at each instant t by measuring two luminescence intensities.
  • the construction of a measuring arrangement "from above" is shown schematically in Fig. 2.
  • the permeation direction is marked therein by the black arrow, in the left permeation means is the permeating substance while the measurement in the right permeation means serves as a reference.
  • the permeability P can be determined using equation (2) (Wohnland F. and Faller B., High-Throughput Permeability pH Profiles and High-Throughput Alkanes / Waterlog P with Artificial Membranes, J. Med. Chem. 44, 2001 , 923-930).
  • V 0 and V A the volumes of donor and acceptor compartment
  • A is the Permeationsober Structure accessible (calculated by multiplying the total surface of the barrier used with its porosity)
  • t the selected incubation time
  • C A kzepto r and h is CGieic Weight are the substance concentrations in the acceptor compartment after an incubation time t and after equilibration, ie after the substance has evenly distributed in donor and acceptor compartment.
  • V D , V A and A are basically freely selectable, in practice, however, usually fixed by the measurement setup, t results from the chosen duration of the incubation.
  • the quantities to be determined by the method according to the invention are thus the concentrations c A acceptor and CGieichong-
  • the equilibrium concentration can be calculated at least approximately from the volume-averaged value of acceptor and donor concentration. For example, for equal volumes of solvent in the donor and acceptor compartments, a concentration of 0.5 M in the acceptor and in the donor compartment should have been established after the provision of a substance in the donor compartment at 1 M concentration after a certain time.
  • c'Gieic h gewicw filled donor and / or acceptor compartment with a solution with the calculated equilibrium concentration. From simple measurement of the luminescence intensity of the filled compartments and a reference value, the sought-after result then again according to equation (1)
  • a third, particularly preferred possibility for determining the concentration-proportional variable c'cieichites is the concentration-proportional magnitudes c ⁇ k z eptor and c ' D ⁇ nor by simultaneous measurement of the fluorescence intensities of a reference and a sample in the acceptor and donor compartment both "from above” and For different path lengths of the excitation and emission light through the sample, where appropriate, the concentration-proportional quantities must be normalized to this "from below”. With negligible binding of the substance to the permeation barrier, the caloric weight results from the mass balance, ie the volume-averaged value of acceptor and donor concentration.
  • the arrangement of a measuring arrangement for the simultaneous measurement "from above” and “from below” for determining the concentration-proportional magnitudes c ⁇ kzeptor and c'oonor is shown schematically in Fig. 3.
  • equation (4) is obtained, with the aid of which the permeability of a barrier can be conveniently determined.
  • This procedure also allows a quasi-simultaneous determination of the enrichment in the acceptor and the depletion in the donor cavity and thus also allows statements beyond the actual permeation coefficient. In this way, processes such as membrane retention during the permeation of a substance through a barrier can be monitored in a time-resolved manner.
  • the measurement of the luminescence signals takes place at one or more discrete wavelengths, in particular excitation and emission wavelengths.
  • discrete wavelengths in particular excitation and emission wavelengths.
  • entire spectra can be measured and conclusions can be drawn on the modulation of the respective signals of specific wavelengths.
  • the at least one luminescent probe preferably has fluorescent and / or phosphorescent properties.
  • the excitation of the respective fluorescence or phosphorescence either takes place with one or more defined wavelengths, or excitation spectra are recorded.
  • a luminescent probe can be used, which emits a signal without prior excitation of light.
  • a probe with electro-, thermo- and / or chemiluminescence can be used.
  • the use of probes with fluorescence and phosphorescence is particularly preferred, since this is established in the laboratory practice procedures that are very easy to handle.
  • a single probe or a single probe type is used.
  • such a combination of probes can be coupled to one another via the so-called Förster energy transfer.
  • the present invention also includes, in addition to the method already described, the use of various individual components in a method according to the present invention. These include
  • At least one microtiter plate in particular as a component of at least one permeation device, the use of at least one dye, in particular as at least one luminescent probe,
  • At least one porous carrier material preferably at least one filter membrane, in particular as a constituent of at least one permeation barrier
  • cells preferably in the form of a cell monolayer or a cell multilayer, in particular as a constituent of at least one permeation barrier,
  • cell fragments in particular as part of at least one permeation barrier and the use of at least one membrane of organ tissue, in particular as a permeation barrier.
  • kits for carrying out a method according to the invention comprises at least 2 members from the group with
  • At least one insert for introducing a luminescent probe into at least one compartment of a permeation device, in particular into the wells of a microtiter plate,
  • At least one porous carrier material in particular at least one filter membrane
  • At least one solvent at least one suitable buffer system
  • Cells in particular in the form of a cell monolayer or a cell multi-layer,
  • At least one non-artificial membrane in particular at least one membrane of organ tissue.
  • the individual components of the kit have already been explained in detail above. The relevant parts of the description are hereby incorporated by reference.
  • kits according to the invention may contain individual components separately as a "kit” in order to allow the user to combine them specifically for a very specific embodiment of a method according to the invention
  • the kit may be preferred for the kit to have a filter membrane which is already probe-marked and / or provided with an organic layer, for example composed of hydrocarbons, and directly in a novel membrane Method can be used.
  • the permeation of substances from any substance classes can be examined.
  • potential active substances in particular potential pharmaceutical and / or biological active substances, which can be used for therapy and / or diagnosis of various diseases can be investigated with the aid of the method according to the invention. It may also be, for example, peptides or proteins.
  • low molecular weight substances as frequently occurring in the case of potential pharmaceutical active substances, can also be investigated.
  • Fig. 1 Schematic structure of a permeation measurement with a
  • Fig. 4 Schematic representation of a luminescence measurement exclusively "from above” for the simultaneous determination of the concentration-proportional magnitudes c ⁇ kzeptor and cOonor- The permeation directions are marked by the black arrows.
  • Example 1 Preparation of a passivated, probe-labeled, fluorescence-active carrier
  • a porous silicate material (Nucleoprep 300-12 from Macherey-Nagel, Düren) are concentrated in a silane solution consisting of 9.2 ml of N- (2-aminoethyl) -3-aminopropyltrimethoxysilane (EDA) and 243 ⁇ l Acetic acid in 450 ml of deionized water and rotated slowly for three hours. Thereafter, the silicate material is sedimented, washed three times with deionized water and dried at 80 0 C.
  • a porous silicate material Nucleoprep 300-12 from Macherey-Nagel, Düren
  • the support is dispersed in 18 ml of carbonate buffer (pH 9.5) and mixed with 2 ml of a solution of rhodamine isothiocyanate (RITC) in carbonate buffer (final concentration 40 ⁇ mol / l) and rotated overnight. To remove unreacted RITC, it is first washed twice with carbonate buffer and finally three times with PBS (phosphate buffered saline, 10 mM sodium phosphate, 0.9% sodium chloride, pH 7.4).
  • PBS phosphate buffered saline, 10 mM sodium phosphate, 0.9% sodium chloride, pH 7.4
  • Acceptor plate are first filled for one hour with 150 .mu.l of a polyethyleneimine solution (1 mg / ml in deionized water). The two plates are put together to incubate the filter. The cavities are then washed 3 times with deionized water and poured into
  • Rebuilt carbonate buffer In a further step, the wells of donor and acceptor plate are filled with 150 .mu.l of a 10 .mu.mol / l solution of rhodamine isothiocyanate in carbonate buffer (pH 9.5) and placed in each other for two hours. It is then washed once with carbonate buffer and then with deionized water. Finally, the cavities are dried.
  • Example 3 Production of probe-marked filter plates with a hexadecan membrane
  • the filter plate (acceptor plate in this example) from Example 3 are each 150 ul PBS buffer pH 7.4, which contains 1% DMSO, pipetted.
  • the corresponding wells of the donor plate are each filled with 135 .mu.l of PBS buffer and 15 .mu.l of a 1, 0 mM substance solution in PBS buffer / DMSO (90:10 v: v).
  • Further cavities of the donor plate and the acceptor plate are filled only with a 1% solution of DMSO in PBS and serve as a reference for determining the fluorescence intensity I 0 .
  • the permeation of the substances is started by assembling the two plates. After 4 hours, the fluorescence intensities are measured in a measuring arrangement "from above" in the cavities of the acceptor plate, and the concentration-proportional magnitudes c ⁇ cceptor and c'cieichmati of the permeated substances were determined from the measured intensities according to the above-described procedure.
  • the investigated substances in the experiment were warfarin and carbamazepine, for which the following permeabilities could be determined by means of equation (3):
  • Example 5 Preparation of a microtiter plate with hexadecane membranes
  • Example 6 Determination of the Substance Permeation by the Hexadecane Membranes of a Microtiter Plate from Example 5, Read by UV Detection
  • Cavities of the donor plate as well as the acceptor plate are filled only with a 1% solution of DMSO in PBS buffer and serve as a reference.
  • the permeation of the substances is started by assembling the two plates. After 4 hours donor and acceptor plates are separated and an aliquot of 50 ⁇ l is transferred from the wells of the two plates to a UV transparent microtiter plate. The concentration of the substances is determined in a UV plate reader (SpektraMax plus 384 from Molecular Devices).
  • the investigated substances were desipramine, quinidine,
  • Example 7 Determination of the Substance Permeation by the Hexadecane Membranes of a Microtiter Plate from Example 5, Read through Probe-Labeled Silicate Beads
  • 115 ⁇ l of PBS reagent are added to several of the wells of the microtiter plate from Example 5 which are provided with filter membranes.
  • Buffer 20 .mu.l of the carrier suspension prepared in Example 1 (with 200 mg of solids per 1 ml of suspension) and 15 .mu.l of a 10% solution of DMSO in PBS buffer pipetted.
  • the corresponding wells of another microtiter plate (without filter membranes) are filled with 135 ⁇ l of PBS buffer and 15 ⁇ l of a 1.0 mM substance solution in PBS buffer / DMSO (90:10 v: v).
  • Some cavities of the microtiter plate from Example 5 act here as acceptor cavities, other than donor cavities.
  • microtiter plate from example 5 is filled with a 1% solution of DMSO in PBS as a reference, as are their corresponding cavities in the further microtiter plate.
  • the permeation of the substances is started by assembling the two plates. After 4 hours, the fluorescence intensities in the measuring arrangement "from above" are determined in all filled wells of the microtiter plate from Example 5. From these intensities, the concentration-proportional sizes of the permeated substance were determined.
  • the investigated substances were desipramine, quinidine,
  • the determined logarithmic permeabilities of the substances are shown in correlation to the measured values of the measurement from Example 6 in FIG. 5.
  • Example 8 Determination of the Substance Permeation by a Hexadecan Membrane on a Microtiter Plate from Example 5, continuously read out by dye-coated silicate beads
  • Example 8 two permeation directions are to be considered. In case 1, the substance permeates from “bottom to top” into the microtiter plate from example 5 (acceptor), in case 2 the substance permeates from the microtiter plate from example 5 (donor) from “top to bottom”.
  • the permeation of the substances is started by combining the two plates. At discrete time intervals of 5 min over a total time of 4 hours, the fluorescence intensities in the measurement geometry were measured "from above” in all filled wells of the microtiter plate from Example 5. From these intensities, the concentration-proportional sizes of the permeated substance were determined for each measured discrete time ,
  • the investigated substances were warfarin, carbamazepine and propranolol.
  • the obtained mean permeabilities of the substances were:
  • Example 9 Determination of the Substance Permeation by a Hexadecan Membrane on a Microtiter Plate from Example 5, Read Out by Dye-loaded Dispersible Polymer Particles.
  • 120 ⁇ l of PBS buffer, 15 ⁇ l of a 10% strength solution of DMSO in PBS buffer and 15 ⁇ l of a suspension of dye-loaded polystyrene particles (1 ⁇ m, 0.05 ⁇ m) are introduced into several wells of an acceptor plate prepared according to Example 5 %, Manufacturer
  • the corresponding wells of another microtiter plate serving as a donor plate are filled with 135 ⁇ l of PBS buffer and 15 ⁇ l of a 1.0 mM substance solution in PBS buffer / DMSO (90:10 v: v). Other cavities of the donor plate (and the corresponding ones on the
  • Acceptor plate are filled only with a 1% solution of DMSO in PBS and serve as a reference for determining the fluorescence intensity I 0 .
  • the permeation of the substances is started by assembling the two plates. After 4 hours, the fluorescence intensities of the dye-loaded polystyrene particles in the measurement geometry "from above" are measured in all filled wells of the acceptor plate.
  • warfarin was investigated u.a. the substance warfarin.

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Messung der Permeation mindestens einer in einem Lösungsmittel enthaltenen Substanz durch eine Permeationsbarriere und/oder zur Bestimmung permeationsbeeinflussender Parameter, insbesondere zur Bestimmung der Permeabilität der Barriere für die mindestens eine Substanz, unter Verwendung mindestens einer lumineszierenden Sonde, umfassend die Bereitstellung der mindestens einen Substanz auf einer Seite der Permeationsbarriere, Inkubation der Permeationsbarriere mit der mindestens einen, im Lösungsmittel enthaltenen Substanz und Messung von Lumineszenzsignalen der Sonde auf mindestens einer Seite der Permeationsbarriere, welche in Abhängigkeit von der jeweiligen Konzentration der Substanz moduliert sind, wobei das Anregungs- und/oder das Emissionsspektrum der mindestens einen Sonde mit dem Absorptionsspektrum der mindestens einen Substanz überlappt und einen Kit zur Verwendung in diesem Verfahren.

Description

Beschreibunα
Verfahren zur Messunq der Permeation einer Substanz durch eine Barriere
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Messung der Permeation mindestens einer in einem Lösungsmittel enthaltenen Substanz durch eine Barriere und/oder zur Bestimmung permeations- beeinflussender Parameter, insbesondere zur Bestimmung der Permeabilität der Barriere für die mindestens eine Substanz, sowie Einzelkomponenten und einen Kit zur Verwendung in diesem Verfahren.
In der pharmazeutischen Industrie werden potentielle Wirkstoffe unter anderem auf ihre Eigenschaften im ADME-Bereich (Absorption, Distribution, Metabolismus, Exkretion) getestet. Insbesondere die Aufnahme von Wirkstoffen in einen Organismus wie den menschlichen Körper ist Gegenstand intensiver Untersuchungen. Im Fall von oral applizierten Medikamenten spielt beispielsweise die Permeation des im Medikament ent- haltenen Wirkstoffs durch die Darmwand als natürliche Permeationsbar- riere eine wichtige Rolle. In den vergangenen Jahren wurde eine Vielzahl von Methoden entwickelt, um die Aufnahme eines Wirkstoffes in den menschlichen Körper zu messen. Insbesondere folgende Vorgehensweisen sind in der Literatur einschlägig beschrieben:
In Humanversuchen sind direkte Messungen der Permeation im menschlichen Körper vorgenommen worden. Dabei wurden drei verschiedene klinische Methoden verwendet, nämlich der sogenannte offene Ansatz (d. h. ohne Blockierung eines Darmabschnittes), der soge- nannte halboffene Ansatz (d. h. mit einem Blockierballon auf der proximalen Seite eines Darmabschnittes) und der sogenannte geschlossene Ansatz (mit zwei Blockierballons zur Schließung beider Seiten eines Darmabschnittes). In allen Fällen wurde über ein Drainagesystem der Wirkstoff appliziert, woraufhin in definierten Entfernungen Proben entnommen und auf ihren Wirkstoffgehalt hin untersucht wurden (Lenner- näs H., Human intestinal permeability, J. Pharm. Sei. 1998, 87, 403-410; Lennemäs H., Human jejunal effective permeability and its correlation with preclinical drug absorption modeis, J. Pharm. Pharmacol. 1997, 49, 627-638).
In vitro Ansätze nutzen dagegen häufig Permeationseinrichtungen, in denen die Permeation einer Substanz durch eine Barriere beobachtet wird. Durch die Barriere wird die Permeationseinrichtung in zwei voneinander getrennte Raumeinheiten geteilt, die sogenannten Kompartimen- te. Zur Durchführung einer Permeationsmessung wird die zu untersuchende Substanz üblicherweise auf einer Seite der Permeationsbarriere (im Donor-Kompartiment) vorgelegt. Mit beginnender Permeation sinkt allmählich die Konzentration der Substanz im Donor-Kompartiment, während sich die Substanz im Akzeptorkompartiment anreichert. Das Fortschreiten des Permeationsvorgangs kann entsprechend über Konzentrationsmessungen beobachtet werden, zumindest bis sich ein Konzentrationsgleichgewicht zwischen den beiden Kompartimenten einge- stellt hat.
Neben speziellen Permeationskammem (z. B. der sogenannten Ussing Kammer), die under anderem mit isolierten Membranvesikeln oder mit Organgewebepräparationen als Barriereschicht betrieben werden, fin- den auch Perfusionseinrichtungen eine Verwendung, die mit präparierten Darmbereichen von toten Tieren arbeiten (Karlsson J. und Arthursson P., A new diffusion chamber System for the determination of drug permeability coefficients across the human intestinal epithelium that are independent of the unstirred water layer, Biochim. Biophys. Acta 1992, 1111 , 204-210; Soderholm J. D., Hedman L., Arthursson P., Franzen L., Larsson J., Pantzar N., Permert J., Olaison G., Integrity and metabolism of human mueosa in vitro in the ussing chamber, Acta Physiol. Scand. 1998, 162, 47-56; Lennemäs H., Nylander S., Ungell A.L., Jejunal permeability: a comparison between the ussing chamber technique and the single-pass perfusion in humans, Pharm. Res. 1997, 14, 667-71 ; Arthursson P., Ungell A.L., Lofroth J. E., Selective paracellular permeability in two modeis of intestinal absorption: cultured monolayers human intestinal epithelial cells and rat intestinal Segments, Pharm. Res. 1993, 10, 1123-1129).
Diese Vorgehensweisen sind sehr umständlich und zeitintensiv und darüber hinaus nur für die Messung weniger Substanzen geeignet. Eine einfachere und vielseitigere Möglichkeit zur Bestimmung bzw. Abschätzung der Aufnahme von Substanzen in einen Organismus bietet die Messung der Permeation von Substanzen durch künstliche Permeati- onsbarrieren. So ist in den letzten Jahren beispielsweise der Einsatz von Zellmonolagen als Permeationsbarriere intensiv in der Literatur be- schrieben worden (Ungell A. L. and Karlsson J. (2003), Cell Cultures in drug discovery: an industrial perspective. In Drug bioavailability; Estimation of Solubility, Permeability, Absorption and Bioavailability, Van de Waterbeemd H., Lennerrnäs H., Arthursson P., eds., 90-131 , Wiley- VCH). Dabei finden insbesondere Caco-2-Zellen und MDCK-Zellen Anwendung (Arthursson P., Epithelial Transport of Drug in Cell Culture I: A Model for Studying the passive Diffusion of Drugs over Intestinal absorptive (Caco-2) Cells. J. Pharm. Sei. 1990; 79: 476-482; Arthursson P., Correlation between oral drug absorption in humans and apparent drug permeability coefficients in human intestinal epithelial (Caco-2) cells. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1991 , 175, 880-885; Cho MJ., Thompson D. P., Cramer CT., Vidmar TJ. , and Scieszka J. F., The madin-Darby Canine Kidney (MDCK) epithelial cell monolayer as a model cellular transport Barrier, Pharm. Res. 1989, 6, 71-77).
Die Zellen werden auf permeablen Trägermaterialien in speziellen Mikrotiterplatten für eine bestimmte Zeitdauer kultiviert. Nach Ausbildung einer monolagigen Zellschicht läßt man die Zellen sich über einen bestimmten Zeitraum ausdifferenzieren und nimmt anschließend die ei- gentlichen Permeationsmessungen vor. Je nach Zelltyp und Kultivierungsbedingungen beträgt dieser Zeitraum ca. 3 bis 21 Tage. Anschließend werden die Zellen gewaschen und der eigentliche Meßpuffer auf beiden Seiten der Zellschicht vorgelegt. Nach Zugabe der zu messen- den Substanz auf einer Seite der Zellschicht werden Proben auf der anderen Seite entnommen und darin die Konzentration der zu untersuchenden Substanz analysiert. Der schematische Aufbau einer Permeati- onsmessung mit einer Zellmonolage als Permeationsbarriere ist in Fig. 1 dargestellt.
Die Konzentrationsmessungen erfolgen üblicherweise über ein HPLC- oder ein LC/MS-Verfahren. Die Permeation kann sowohl von der apica- len zur basolateralen Seite als auch umgekehrt gemessen werden. Bedingt durch die Morphologie der Zellen erlaubt diese Vorgehensweise Rückschlüsse auf eine Beteiligung von aktiven Transporterproteinen an der Permeation des Stoffes, da diese Transporterproteine in der basolateralen Zellmembran lokalisiert sind. Aus diesen Daten läßt sich der sogenannte Permeationskoeffizient berechnen, der wiederum mit in vivo Daten aus dem menschlichen Körper korreliert.
Neben Zeilmonolagen werden in den letzten Jahren zunehmend auch weitere künstliche Permeationsbarrieren wie z. B. artifizielle Lipid- systeme verwendet. So wurde von Kansy und Mitarbeitern 1998 das sogenannte PAM PA-Verfahren beschrieben (PAMPA = Parallel Artificial Membrane Permeation Assay), bei dem die Permeation von chemischen Substanzen mit Hilfe poröser Filtermembranen gemessen wird (Kansy M. et al. (1998), Physicochemical high throughput Screening: parallel artificial membrane permeability assay in the description of passive absorption process, J. Med. Chem. 41 , 1007-1010). Die Filter- membranen werden dabei mit Mischungen von 1 - 20 % Lecithin in organischen Lösungsmitteln (z. B. Dodekan, Hexadekan, 1 ,9-Dekadien) imprägniert, so daß eine lipophile Trennschicht (Barriere) entsteht. 2001 wurde eine Modifikation des PAMPA-Verfahrens von Wohnsland und Faller (Wohnsland F. und Faller B., High-Throughput Permeability pH Profile and High-Throughput Alkane/Water log P with Artificial Membranes, J. Med. Chem. 44, 2001 , 923-930) beschrieben, bei der eine Hexadekanschicht zwischen zwei Wasserkompartimenten als Per- meationsbarriere benutzt wird. Dieses Verfahren reduziert den Durchmesser der Permeationsbarriere bei gleichzeitiger Verwendung von Po- lycarbonat-Filtermembranen mit größeren Porendurchmessern (3 μm vs. 0,22 bzw. 0,45 μm bei Kansy) von 120 μm bei Kansy auf etwa 10 μm und erhöht dadurch den möglichen Durchsatz an Substanzen pro Zeiteinheit.
In einer weiteren Modifikation des Verfahrens von Kansy werden an Stelle von Lecithin komplexe Lipidmischungen eingesetzt (Sugano K. et al., Optimized conditions of biomimetic artificial membrane permeability assay, Int. J. Pharm. 2001 , 228, 181-188). Eine solche spezielle Lipid- zusammensetzung simuliert besser den gastrointestinalen Trakt und sorgt so für eine höhere biologische Relevanz der Meßmethode. Diese Modifikation ist als biometrisches PAMPA- oder auch BAMPA-Verfahren (Biometrie Artificial Membrane Permeation Assay) in die Literatur eingegangen (Miret S., Abrahamse L., De Groene E. M., Comparison of in vitro modeis for the prediction of Compound absorption across the human instestinal mueosa, J. Biomolec. Screen 2004, 9, 598-606).
Alle beschriebenen Vorgehensweisen zur Untersuchung der Permeation haben gemeinsam, daß die Konzentrationsbestimmung der Substanz in der Probe nur diskontinuierlich vorgenommen werden kann. Um zu beurteilen, ob und inwieweit eine Substanz durch eine Barriere permeiert, ist die mindestens einmalige Entnahme einer Probe aus dem Akzeptor- kompartiment hinter der Barriere erforderlich, gefolgt von einem Transfer zu einem externen Analysegerät, in dem die Bestimmung der Substanzkonzentration in der Probe erfolgt. Insbesondere Messungen von Per- meationskinetiken sind so nur unter großem Aufwand durchzuführen. Für den Einsatz im Rahmen eines automatisierten, modernen Hochdurchsatzverfahrens, das gegebenenfalls die Untersuchung der Per- meation von hunderten bis tausenden von Substanzen täglich und insbesondere dabei auch die Messung der Permeationskinetiken ermög- liehen soll, sind die beschriebenen Untersuchungsmethoden gänzlich ungeeignet.
Der vorliegenden Erfindung liegt entsprechend die Aufgabe zugrunde, neue und verbesserte Mittel und Wege zur Untersuchung und Messung der Permeation einer Substanz durch eine Barriere bereitzustellen, die die genannten Nachteile des Standes der Technik nicht aufweisen. Die Untersuchungen bzw. Messungen sollen ohne großen Aufwand und möglichst anwenderfreundlich durchführbar sein und insbesondere auch auf einen hohen Probendurchsatz auslegbar sein.
Diese Aufgabe wird gelöst durch das Verfahren mit den Merkmalen des Anspruchs 1 und einen Kit zur Durchführung eines erfindungsgemäßen Verfahrens mit den Merkmalen des Anspruchs 34. Bevorzugte Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens sind in den abhängi- gen Ansprüchen 2 bis 25 dargestellt. Die Ansprüche 26 bis 33 betreffen die Verwendungen bestimmter Einzelkomponenten in einem Verfahren nach der vorliegenden Erfindung. Der Wortlaut sämtlicher Ansprüche wird hiermit durch Bezugnahme zum Inhalt dieser Beschreibung gemacht.
Ein erfindungsgemäßes Verfahren ist zur Untersuchung der Permeation einer in einem Lösungsmittel enthaltenen Substanz durch eine Barriere vorgesehen. Auch die gleichzeitige Untersuchung der Permeation mehrerer in einem Lösungsmittel enthaltenen Substanzen wird durch ein er- findungsgemäßes Verfahren ermöglicht. Insbesondere eignet sich ein erfindungsgemäßes Verfahren hervorragend zur Bestimmung per- meationsbeeinflussender Parameter wie beispielsweise der Permeabilität der Barriere für die mindestens eine Substanz, worauf später noch näher eingegangen wird. Auch Permeationskinetiken lassen sich ohne großen Aufwand mit dem erfindungsgemäßen Verfahren bestimmen.
Ein erfindungsgemäßes Verfahren zeichnet sich insbesondere dadurch aus, daß die Permeation der mindestens einen Substanz unter Verwendung mindestens einer lumineszierenden Sonde untersucht wird. Der Begriff „lumineszierend" wird dabei als Oberbegriff insbesondere für Fluoreszenz und Phosphoreszenz, aber auch beispielsweise für Elek- tro-, Thermo- und Chemolumineszenz verwendet.
Die mindestens eine zu untersuchende Substanz wird in einem ersten Schritt in einem Lösungsmittel auf mindestens einer Seite einer Permea- tionsbarriere bereitgestellt. Dies schließt unter anderem auch die Mög- lichkeit ein, verschiedene Substanzen auf beiden Seiten der Barriere und/oder eine oder mehrere gleiche Substanzen auf beiden Seiten der Barriere bereitzustellen, wobei in letzterem Fall zwischen den beiden Seiten der Barriere bezüglich der zu untersuchenden Substanz bzw. der zu untersuchenden Substanzen jeweils eine Konzentrationsdifferenz zwischen den beiden Seiten der Barriere bestehen muß.
Danach läßt man die mindestens eine Substanz und die Permeations- barriere über einen gewissen Zeitraum aufeinander einwirken. Auf diese Inkubation der Permeationsbarriere mit der mindestens einen im Lö- sungsmittel enthaltenen Substanz folgt in einem weiteren Schritt eine Messung von Lumineszenzsignalen der mindestens einen Sonde auf mindestens einer Seite der Permeationsbarriere. Die gemessenen Lumineszenzsignale sind in Abhängigkeit von der jeweiligen Konzentration der Substanz moduliert, wobei dafür zwingend erforderlich ist, daß die Absorptionsspektren der mindestens einen Substanz mit Anregungs- und/oder Emissionsspektren der mindestens einen Sonde überlappen. Auf diese Weise lassen sich Aussagen über die Konzentration der zu untersuchenden Substanz auf einer oder auf beiden Seiten der Permea- tionsbarriere gewinnen, was wiederum direkte Rückschlüsse auf die Permeation der Substanz durch die Barriere sowie auf die diversen permeationsbeeinflussenden Parameter zuläßt.
Das erfindungsgemäße Verfahren nutzt damit den sogenannten inneren Filtereffekt aus, bei welchem die Lichtabsorption von Substanzen auf indirektem Wege über eine Abschwächung von Lumineszenzintensitäten geeigneter Sonden bestimmbar ist. Dieses Phänomen beruht darauf, daß die Intensität von Lichtstrahlen, die auf dem Weg zu einer geeigneten Sonde bzw. auf dem Weg von der Sonde zu einem Detektor von anderen gelösten Substanzen absorbiert werden, das heißt also abgeschwächt werden. Die Überlappung von Anregungs- beziehungsweise Emissionswellenlängen mit der Absorptionsbande der zu untersuchenden Substanz führt bei der Messung bei geeigneten Wellenlängen (das heißt im Bereich der Absorptionsbande der Substanz) zu einer Modulation bzw. Abschwächung der Lumineszenzintensität, die proportional der Konzentration der zu untersuchenden Substanzen vor und/oder hinter der Barriere ist. Bei einer Messung durchquert das Anregungslicht die Probe und wird im Fall einer Überlappung des Absorptionsspektrums der zu untersuchenden Substanz mit dem Anregungsspektrum der Sonde abgeschwächt bevor es zur Sonde gelangt. Diese wird zur Lumineszenz angeregt und emittiert Licht, das wiederum die Probe durchquert und im Fall einer Überlappung des Absorptionsspektrums der Substanz mit dem Emissionsspektrum der Sonde abgeschwächt wird. Die Gesamtabschwächung des Signals ist proportional zur Substanzkonzentration in der Probe.
Der innere Filtereffekt wurde bereits für verschiedene analytische Methoden ausgenutzt. Beispielsweise beschreibt die WO 94/17388 die Nutzung des inneren Filtereffekts zur Bestimmung von Ionen in Flüssigkeiten mit Hilfe einer Sensormembran. Die US 4,822,746 befaßt sich allgemein mit der Nutzung des inneren Filtereffekts zur Bestimmung einer Ligandenbindung, wobei hier unter Liganden Ionen, Stoffe oder Ähnliches zu verstehen sind. Der nachzuweisende Ligand wird durch eine geeignete (Farb-)Reaktion einer Analyse zugänglich gemacht. Weiterhin beschreibt die US 4,654,300 die Nutzung eines derartigen Quench- effektes in Immunoassays. In jedem dieser genannten Fälle wird der innere Filtereffekt zu analytischen Zwecken genutzt. Dieser Effekt wird jedoch in keinem Fall direkt oder ausschließlich durch die zu untersuchende Substanz hervorgerufen, wie es in einem Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung vorgesehen ist.
Ein erfindungsgemäßes Verfahren ermöglicht eine kontinuierliche Beobachtung und Messung eines Permeationsvorgangs und eignet sich somit insbesondere auch für die Messung von Permeationskinetiken. Neben der kontinuierlichen Messung können natürlich auch Einzelmessungen zu einem gegebenen Zeitpunkt vorgenommen werden. Auf Verfahrensschritte wie beispielsweise Probenentnahme und Probentransfer zum Zwecke externer Konzentrationsbestimmungen kann mit besonderem Vorteil verzichtet werden. Durch einen Permeationsvorgang beding- te Konzentrationsänderungen bezüglich einer zu untersuchenden Substanz können somit problemlos auf einer Seite oder auch auf beiden Seiten einer Permeationsbarriere zugleich verfolgt werden. Damit eignet sich ein Verfahren nach der vorliegenden Erfindung insbesondere auch für den Einsatz im Rahmen eines automatisierten, modernen Hoch- durchsatzverfahrens.
Die Durchführung eines erfindungsgemäßen Verfahrens erfolgt vorzugsweise bei konstanter Temperatur, insbesondere in einem Temperaturbereich zwischen ca. 5 0C und ca. 40 0C. In dem genannten Tempera- turbereich kann weiter eine Temperatur von ca. 37 °C (also Körpertemperatur) besonders bevorzugt sein. In den meisten Fällen sind allerdings Messungen bei ca. 20 0C (Raumtemperatur) bevorzugt. Erfindungsgemäß wird das Verfahren vorzugsweise in wäßriger Lösung durchgeführt. Eine in einem erfindungsgemäßen Verfahren einsetzbare Permeations- barriere umfaßt in einer bevorzugten Ausführungsform eine artifizielle Membran. Die artifizielle Membran umfaßt in Weiterbildung bevorzugt ein poröses Trägermaterial, insbesondere eine Filtermembran. Die Beschaffenheit des Trägermaterials ist dabei grundsätzlich nicht kritisch, so lassen sich beispielsweise poröse Kunststoffe, Silikate, Glas, Keramik und Metalle einsetzen.
Weiter ist es bevorzugt, daß die artifizielle Membran organisches Material umfaßt. In bevorzugten Ausführungsformen bildet das organische Material eine Schicht auf der Oberfläche des porösen Trägermaterials aus und/oder liegt in den Poren des porösen Trägermaterials vor.
Das organische Material ist erfindungsgemäß vorzugsweise lipophil bzw. hydrophob. Insbesondere handelt es sich bei dem organischen Material im wesentlichen um mindestens einen Kohlenwasserstoff mit einer bevorzugten Kettenlänge von 8 oder mehr Kohlenstoffen und/oder um mindestens einen Alkohol mit einer bevorzugten Kettenlänge von 4 oder mehr Kohlenstoffen. Kohlenwasserstoffe mit Kettenlängen von mehr als 12 Kohlenstoffen, insbesondere mit 14 - 16 Kohlenstoffen, sind unter den genannten weiter bevorzugt.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei dem organischen Material im wesentlichen um ein Lipid oder um eine Lipid- mischung. Hierbei kann es sich um eine einfache Lipidschicht, einen sogenannten Monolayer, oder um eine doppelte Lipidschicht, einen sogenannten Bilayer, handeln. Die Zusammensetzung derartiger Lipidschich- ten kann je nach gewünschter Anwendung frei gewählt werden. Bei- spielsweise können derartige Lipidschichten weitgehend homogen aufgebaut sein, oder es können beispielsweise verschiedene Lipide als Bestandteile der Membranschichten eingesetzt werden, wodurch zum Beispiel die Gegebenheiten einer nativen Membran nachgestellt werden können. Unter den Lipiden oder den Lipidmischungen sind solche weiter bevorzugt, die membranständige, membranintegrale und/oder trans- membrane Proteine aufweisen.
Auch Zellen und/oder Zellfragmente können als organisches Material bevorzugt sein, wobei die Zellen dann insbesondere in Form einer ZeII- mono- oder einer Zellmultischicht vorliegen. Besonders bevorzugt ist eine Monoschicht aus CACO-2-Zellen oder aus MDCK-Zellen.
In bestimmten Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens kann es bevorzugt sein, daß die Permeationsbarriere an Stelle einer arti- fiziellen Membran eine nicht-artifizielle Membran umfaßt, insbesondere eine Membran aus Organgewebe. Bevorzugt sind dann aus Darmgewebe präparierte Barrieren, wobei in weiteren Fällen auch aus Hautgewebe präparierte Barrieren bevorzugt sein können.
Die mindestens eine lumineszierende Sonde ist in bevorzugten Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens vorzugsweise Bestandteil der Permeationsbarriere. In diesen Fällen ist es bevorzugt, daß das poröse Trägermaterial einer artifiziellen Membran, insbesondere die Filtermembran, sondenmarkiert ist. Die Sonde kann dabei sowohl im Trägermaterial enthalten als insbesondere auch an dieses, vorzugsweise kovalent, gebunden sein.
In weiteren bevorzugten Ausführungsformen kann die mindestens eine Sonde auch Bestandteil des organischen Materials sein, das, wie oben bereits erwähnt, insbesondere als Schicht auf der Oberfläche des porösen Trägermaterials und/oder in den Poren des porösen Trägermaterials vorliegt.
Neben der Möglichkeit, die mindestens eine Sonde als Bestandteil der Barriere einzusetzen, kann es allerdings auch bevorzugt sein, die mindestens eine Sonde auf die Barriere aufzubringen, insbesondere in Form eines segmentierenden, sondenmarkierten Feststoffs. Als solcher eignen sich beispielsweise mit einer Sonde versehene Silikatkügelchen besonders gut, es sind aber auch sedimentierbare Feststoffe aus Glas-, Keramik-, Silikat-, Metall- und/oder Polymermaterial oder aus Kombina- tionen dieser Materialien denkbar.
Weiterhin kann es auch bevorzugt sein, daß die mindestens eine Sonde im Lösungsmittel enthalten ist. In diesen Fällen wird die Sonde auf einer oder auf beiden Seiten der Barriere entweder in gelöster Form einge- setzt oder, was besonders bevorzugt sein kann, in Form eines disper- gierbaren, nicht-sedimentierenden Feststoffs. Als nicht sedimentierender Feststoff sind insbesondere sondenmarkierte Polymerkügelchen einsetzbar.
In weiteren Ausführungsformen kann es bevorzugt sein, daß die mindestens eine Sonde Bestandteil eines Gels ist, das ebenfalls auf einer oder auf beiden Seiten der Barriere angeordnet sein kann.
Selbstverständlich sind die genannten Möglichkeiten der Sonden- anordnung in einem erfindungsgemäßen Verfahren auch miteinander kombinierbar.
Die Sonde selbst kann sowohl anorganischer als auch organischer Natur sein. Beispiele sind hier anorganische Nanopartikel, sogenannte „Quantumdots", farbstoffhaltige, dispergierbare oder sedimentierbare und/oder lumineszente Silikat- oder Keramikpartikel, organische Farbstoffe wie Rhodamin oder Fluoreszein, farbstoffhaltige, dispergierbare oder sedimentierbare und/oder lumineszente Polymerlatices. Organische Farbstoffe sind unter den genannten Sonden bevorzugt. Es sind als Sonden aber auch lumineszente Proteine wie beispielsweise GFP oder lumineszente Proteine, deren Lumineszenzeigenschaften sich durch Bindung von Substanzen ändert, wie es beispielsweise bei HSA und AGP der Fall ist, denkbar. Ein erfindungsgemäßes Verfahren wird besonders bevorzugt in mindestens einer Permeationseinrichtung durchgeführt. Eine solche umfaßt vorzugsweise mindestens ein Donorkompartiment, in dem die mindes- tens eine Substanz bereitgestellt wird, mindestens eine Barriere und mindestens ein Akzeptorkompartiment, in das die Substanz permeieren kann. Die Messung der Lumineszenzsignale kann entweder nur im Do- nor- oder nur im Akzeptorkompartiment erfolgen oder in beiden Kompar- timenten gleichzeitig.
Insbesondere in einer Permeationseinrichtung besteht neben den bereits genannten Variationen der Sondenanordnung zusätzlich oder stattdessen auch die Möglichkeit, die mindestens eine Sonde in Form eines sondenmarkierten Einsatzes in das mindestens eine Donor- und/oder Akzeptorkompartiment einzubringen. Ein solcher Einsatz ist bevorzugt in Form und Größe auf eine Permeationseinrichtung bzw. ein Komparti- ment einer Permeationseinrichtung abgestimmt, so daß die mindestens eine Sonde wiederholbar in einer definierten Position im jeweiligen Kompartiment plaziert werden kann. Auch diese Art der Sondenanord- nung kann gegebenenfalls mit einer oder mehreren der bereits genannten Möglichkeiten der Sondenanordnung kombiniert werden.
Grundsätzlich ist ein erfindungsgemäßes Verfahren auch in nicht abgeschlossenen, kompartimentierten Systemen einsetzbar. So ist es bei- spielsweise möglich, eine Dialysemembran mit einer Sonde zu versehen und das Fortschreiten eines Dialysevorgangs kontinuierlich zu verfolgen. Insbesondere kann so leicht erkannt werden, wann ein Dialysevorgang abgeschlossen ist.
In besonders bevorzugten Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens wird dieses parallelisiert durchgeführt, was insbesondere auch in Kompartimenten benachbarter Permeationseinrichtungen möglich ist. Zur Durchführung eines erfindungsgemäßen Verfahrens, insbe- sondere eines parallelisiert durchgeführten Verfahrens, sind Mikroti- terplatten besonders gut geeignet. Die Kavitäten von Mikrotiterplatten eignen sich hervorragend als Kompartimente einer Permeationseinrich- tung. Einsetzbar sind beispielsweise Mikrotiterplatten mit 24, 48, 96, 384 und 1536 Kavitäten. Bevorzugt wird ein System aus zwei aufeinander abgestimmten Mikrotiterplatten verwendet, wobei die Kavitäten einer ersten Platte jeweils eine Filtermembran aufweisen (die wie oben ausgeführt in einem erfindungsgemäßen Verfahren als Bestandteil einer artifi- ziellen Membran dienen können) und die zweite Platte mit der ersten durch Aufeinanderstellen sandwichartig kombinierbar ist. Im kombinierten Zustand ist die zweite Platte bevorzugt die untere Platte. Vorzugsweise ist dann jeder Kavität der oberen Platte eine sich senkrecht darunter befindliche Kavität der unteren Platte zugeordnet (bzw. umgekehrt). Das System aus den beiden Platten bildet somit eine Permeationsein- richtung mit einer Vielzahl benachbarter Donor- und Akzeptorkomparti- mente.
Die Permeationsrichtung, also die Richtung, in der die permeierende Substanz die Permeationsbarriere durchdringt, ist dabei allerdings grundsätzlich frei wählbar (so kann z. B. die obere Platte mit den Filtermembranen Donor- oder Akzeptorplatte sein, gegebenenfalls aber auch beides zugleich). In den folgenden angegebenen Ausführungsformen ist grundsätzlich von einer Permeation von unten nach oben auszugehen, sofern es nicht anders angegeben ist. In den entsprechenden Zeichnun- gen (Fig. 2 bis Fig. 4) ist die Permeationsrichtung durch schwarze Pfeile markiert.
Bei der Messung von Lumineszenzsignalen in Mikrotiterplatten ist es möglich, die Messung in verschiedenen Meßanordnungen vorzu- nehmen. Zum einen kann es bevorzugt sein, das Anregungslicht aus Richtung der Plattenunterseite an die Sonde heranzuführen und das E- missionslicht aus Richtung der Plattenunterseite zu detektieren. Diese Anordnung wird im folgenden als Messung „von unten" bezeichnet wer- den. Die andere Möglichkeit besteht in einer Messung „von oben", bei der das Anregungslicht von der Plattenoberseite zur Sonde gelangt und das Emissionslicht aus Richtung der Plattenoberseite detektiert wird.
Das dabei meßbare Lumineszenzsignal ist proportional zur Substanzkonzentration. Diese kann in weiteren Schritten, bei Bedarf unter Verwendung von Kalibrierungen, direkt in die korrespondierenden Konzentrationen umgerechnet werden.
Die Grundlage zur Bestimmung der konzentrationsproportionalen Größe c1 liefert das Lambert-Beersche-Gesetz
c' = log I0 / l = ε c d (1 )
I0 ist dabei die Lumineszenzintensität einer Referenz ohne Substanz (in der Regel also nur mit Pufferlösung) und I die Lumineszenzintensität in Gegenwart der zu untersuchenden Substanz. Die zur Konzentration c konzentrationsproportionale Größe c' kann damit zu jedem Zeitpunkt t durch Messung zweier Lumineszenzintensitäten bestimmt werden. Der Aufbau einer Meßanordnung „von oben" ist als schematisch in Fig. 2 dargestellt. Die Permeationsrichtung ist darin durch den schwarzen Pfeil markiert. In der linken Permeationseinrichtung befindet sich die permeierende Substanz während die Messung in der rechten Permeationseinrichtung als Referenz dient.
Die Permeabilität P läßt sich mit Hilfe von Gleichung (2) bestimmen (Wohnsland F. und Faller B., High-Throughput Permeability pH Profile and High-Throughput Alkane/Water log P with Artificial Membranes, J. Med. Chem. 44, 2001 , 923-930).
P = In(I CAkzeptor )
Figure imgf000017_0001
C 'Gleichgewicht
(2) Hierbei sind V0 und VA die Volumina von Donor- bzw. Akzeptor- kompartiment, A ist die zugängliche Permeationsoberfläche (errechnet durch Multiplikation der Gesamtoberfläche der verwendeten Barriere mit deren Porosität), t ist die gewählte Inkubationszeit und CAkzeptor und CGieichgewicht sind die Substanzkonzentrationen im Akzeptorkompartiment nach einer Inkubationszeit t sowie nach Gleichgewichtseinstellung, also nachdem sich die Substanz gleichmäßig in Donor- und Akzeptorkompartiment verteilt hat.
VD, VA und A sind grundsätzlich frei wählbar, in der Praxis allerdings in der Regel durch den Meßaufbau fest vorgegeben, t ergibt sich aus der gewählten Dauer der Inkubation. Die durch das erfindungsgemäße Verfahren zu ermittelnden Größen sind damit die Konzentrationen cAkzeptor Und CGieichgewicht-
Der Quotient der beiden Konzentrationen CAkzeptor und CGieichgewicht in Gleichung (2) läßt sich durch den Quotienten aus den beiden unmittelbar durch das erfindungsgemäße Verfahren bestimmbaren konzentrations- proportionalen Größen c'AkzePtor und c'cieichgewicht ersetzen, was zu Gleichung (3) führt.
Figure imgf000018_0001
Zur Ermittlung der Permeabilität müssen damit aus den Größen c1 Akzeptor und CGieichgewicht nicht erst die tatsächlichen Substanzkonzentrationen ermittelt werden, was (wie oben bereits erwähnt) z.B. mit Hilfe von Kalibrierfunktionen erfolgen kann. Die zu bestimmende Größe cΑkzeptor läßt sich einfach zu einem beliebig bestimmbaren Zeitpunkt t durch Messung der Lumineszenzaktivität problemlos ermitteln. Zur Ermittlung der verbleibenden unbekannten Größe c'cieichgewicht stehen eine Reihe von Vorgehensweisen zur Verfügung.
In einem Fall wartet man nach Bestimmung der Größe cWeptor einfach ausreichend lange, bis sich ein Konzentrationsgleichgewicht zwischen Donor- und Akzeptorkavität eingestellt hat und mißt dann die Lumineszenzintensität I und I0. Aus Gleichung (1 ) ergibt sich die gesuchte Größe Cdeichgewicht analog zur bereits bestimmten Größe c'AkzePtor-
Eine weitere Möglichkeit zur Bestimmung von c'cieichgewicht kann insbesondere dann bevorzugt sein, wenn die Bindung der Substanz an die Permeationsbarriere vernachlässigbar ist. In diesem Fall läßt sich die Gleichgewichtskonzentration mindestens näherungsweise aus dem vo- lumengemittelten Wert von Akzeptor- und Donorkonzentration errech- nen. Bei beispielsweise gleichen Volumina Lösungsmittel in Donor- und Akzeptorkompartiment sollte sich beim Bereitstellen einer Substanz im Donorkompartiment in 1 M Konzentration nach einer gewissen Zeit eine Konzentration von jeweils 0,5 M im Akzeptor- und im Donor-Kom- partiment eingestellt haben. Zur Bestimmung von c'Gieichgewicw befüllt man Donor- und/oder Akzeptorkompartiment mit einer Lösung mit der rechnerischen Gleichgewichtskonzentration. Aus einfacher Messung der Lumineszenzintensität der befüllten Kompartimente und einem Referenzwert ergibt sich dann wiederum gemäß Gleichung (1 ) die gesuchte
Größe C'cieichgewicht-
Eine dritte, besonders bevorzugte Möglichkeit zur Bestimmung der konzentrationsproportionalen Größe c'cieichgewicht besteht darin, die konzentrationsproportionalen Größen cΑkzeptor und c'Dθnor durch gleichzeitige Messung der Fluoreszenzintensitäten einer Referenz und einer Probe in Akzeptor- und Donorkompartiment sowohl „von oben" als auch „von unten" zu bestimmen, wobei bei unterschiedlichen Weglängen des Anre- gungs- und Emissionslichts durch die Probe gegebenenfalls die konzentrationsproportionalen Größen auf diese normiert werden müssen. Bei vernachlässigbarer Bindung der Substanz an die Permeations- barriere ergibt sich cOieichgewicht aus der Massenbilanz, also dem volu- mengemittelten Wert von Akzeptor- und Donorkonzentration. Die Anordnung einer Meßanordnung zur gleichzeitigen Messung „von oben" und „von unten" zur Bestimmung der konzentrationsproportionalen Größen cΑkzeptor und c'oonor ist schematisch in Fig. 3 dargestellt.
Ersetzt man entsprechend in Gleichung (3) die Größe cOieichgewicht durch den volumengemittelten Wert von Akzeptor- und Donorkonzentration, so erhält man Gleichung (4), mit deren Hilfe die Permeabilität einer Barriere komfortabel bestimmt werden kann.
Figure imgf000020_0001
Diese Vorgehensweise ermöglicht auch eine quasisimultane Bestimmung der Anreicherung in der Akzeptor- und der Verarmung in der Donorkavität und erlaubt damit auch Aussagen über den eigentlichen Permeationskoeffizienten hinaus. So können auch Prozesse wie die bei der Permeation einer Substanz durch eine Barriere auftretende Memb- ranretention zeitaufgelöst verfolgt werden.
Dies ist auch gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens möglich, nach der die Messung der Lumineszenz ausschließlich „von oben" erfolgt. Die Anordnung für eine Lumineszenzmessung ausschließlich „von oben" zur simultanen Bestimmung der konzentrationsproportionalen Größen cΑkzeptor und cOonor ist schematisch in Fig. 4 dargestellt. Es werden dazu Messungen in 3 Permeationseinrichtungen (bei Verwendung eines Systems aus Mikroti- terplatten in drei Kavitäten) durchgeführt. Eine Referenzkavität dient zur Bestimmung der Lumineszenzintensität I0 einer Referenz ohne Substanz (die Referenzkavität in Fig. 4 rechts oben). Die Referenzkavi- tät enthält dabei nur Pufferlösung. Eine zweite Kavität (die Akzeptorka- vität in Fig. 4 links oben) dient zur Bestimmung der Lumineszenzintensität lAkzeptor- In ihr reichert sich Substanz an, die von unten durch eine Barriere permeiert. Eine dritte Kavität (die Donorkavität in Fig. 4 Mitte oben) dient zur Bestimmung der Lumineszenzintensität bonor- In ihr wurde Substanz bereitgestellt, die durch die Barriere nach unten permeiert.
Die konzentrationsproportionalen Größen werden in dieser Anordnung wie üblich gemäß c' Akzeptor = log Io / (Akzeptor und c'Donor = log I0 / bonor bestimmt. Dabei wird vorausgesetzt, daß die Anreicherung in der Akzeptor- und der Verarmung in der Donorkavität proportional zueinander verlaufen.
In einem erfindungsgemäßen Verfahren ist es allgemein bevorzugt, daß die Messung der Lumineszenzsignale bei einer oder mehreren diskreten Wellenlängen, insbesondere Anregungs- und Emissionswellenlängen erfolgt. Andererseits können jedoch auch gesamte Spektren gemessen werden und hieraus Rückschlüsse auf die Modulation der jeweiligen Signale bestimmter Wellenlängen gezogen werden.
Die mindestens eine lumineszierende Sonde weist bevorzugt fluoreszierende und/oder phosphoreszierende Eigenschaften auf. Hierbei erfolgt die Anregung der jeweiligen Fluoreszenz oder Phosphoreszenz entweder mit einer oder mehreren definierten Wellenlängen, oder es werden Anregungsspektren aufgenommen. Weiterhin kann als Sonde auch eine lumineszierende Sonde eingesetzt werden, welche ein Signal ohne vorherige Lichtanregung abstrahlt. Beispielsweise kann hierfür eine Sonde mit Elektro-, Thermo- und/oder Chemolumineszenz verwendet werden. Die Verwendung von Sonden mit Fluoreszenz und Phosphoreszenz ist jedoch besonders bevorzugt, da es sich hierbei um in der Laborpraxis etablierte Vorgehensweisen handelt, die sehr gut handhabbar sind. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird eine Einzelsonde bzw. eine einzelne Sondenart eingesetzt. Andererseits kann es auch bevorzugt sein, daß eine Kombination verschiedener Sonden verwendet wird. Eine solche Kombination von Sonden kann in einer bevorzugten Ausführungsform über den sogenannten Förster-Energietransfer miteinander gekoppelt sein.
Die vorliegende Erfindung umfaßt neben dem bereits beschriebenen Verfahren auch die Verwendung verschiedener Einzelkomponenten in einem Verfahren nach der vorliegenden Erfindung. Dazu zählen
- die Verwendung von mindestens einer Mikrotiterplatte, insbesondere als Bestandteil mindestens einer Permeationseinrichtung, - die Verwendung von mindestens einem Farbstoff, insbesondere als mindestens eine lumineszierende Sonde,
- die Verwendung eines Einsatzes zum Einbringen einer lumineszie- renden Sonde in ein Kompartiment einer Permeationseinrichtung,
- die Verwendung mindestens eines porösen Trägermaterials, bevor- zugt mindestens einer Filtermembran, insbesondere als Bestandteil mindestens einer Permeationsbarriere,
- die Verwendung mindestens eines Lipids oder einer Lipidmischung, insbesondere als Bestandteil mindestens einer Permeationsbarriere,
- die Verwendung mindestens eines Kohlenwasserstoffs mit einer be- vorzugten Kettenlänge von 8 oder mehr Kohlenstoffen und/oder mindestens eines Alkohols mit einer bevorzugten Kettenlänge von 4 oder mehr Kohlenstoffen, insbesondere als Bestandteil mindestens einer Permeationsbarriere,
- die Verwendung von Zellen, vorzugsweise in Form einer Zellmono- oder einer Zeilmultischicht, insbesondere als Bestandteil mindestens einer Permeationsbarriere,
- die Verwendung von Zellfragmenten, insbesondere als Bestandteil mindestens einer Permeationsbarriere und - die Verwendung mindestens einer Membran aus Organgewebe, insbesondere als Permeationsbarriere.
Alle angeführten, bevorzugt verwendbaren Komponenten wurden bereits oben ausführlich erläutert. Auf die entsprechenden Stellen der Beschreibung wird hiermit verwiesen und Bezug genommen.
Weiterhin umfaßt die Erfindung auch einen Kit zur Durchführung eines erfindungsgemäßen Verfahrens. Ein erfindungsgemäßer Kit umfaßt min- destens 2 Mitglieder aus der Gruppe mit
- mindestens einer Mikrotiterplatte,
- mindestens einer lumineszierenden Sonde,
- mindestens einem Einsatz zum Einbringen einer lumineszierenden Sonde in mindestens ein Kompartiment einer Permeationsein- richtung, insbesondere in die Kavitäten einer Mikrotiterplatte,
- mindestens einem porösen Trägermaterial, insbesondere mindestens einer Filtermembran,
- mindestens einem Lösungsmittel, - mindestens einem geeigneten Puffersystem,
- mindestens einem Kohlenwasserstoff mit einer bevorzugten Kettenlänge von 8 oder mehr Kohlenstoffen und/oder mindestens einem Alkohol mit einer bevorzugten Kettenlänge von 4 oder mehr Kohlenstoffen, - mindestens einem Lipid oder einer Lipidmischung,
- Zellen, insbesondere in Form einer Zellmono- oder einer Zellmulti- schicht,
- Zellfragmenten und
- mindestens einer nicht-artifiziellen Membran, insbesondere mindes- tens einer Membran aus Organgewebe. Auch die Einzelkomponenten des Kits wurden oben bereits ausführlich erläutert. Auf die entsprechenden Stellen der Beschreibung wird entsprechend hiermit verwiesen und Bezug genommen.
Ein erfindungsgemäßer Kit kann Einzelkomponenten separat als „Bausatz" enthalten, um dem Anwender die Möglichkeit zu geben, diese gezielt für eine ganz bestimmte Ausführungsform eines erfindungsgemäßen Verfahrens miteinander zu kombinieren. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Kits sind einzelne Be- standteile des Kits allerdings bereits für eine oder mehrere bestimmte Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens anwendungsfertig enthalten. So kann es beispielsweise bevorzugt sein, daß der Kit eine Filtermembran aufweist, die bereits sondenmarkiert und/oder mit einer organischen Schicht z. B. aus Kohlenwasserstoffen versehen ist und unmittelbar in einem erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzt werden kann.
Mit einem Verfahren und/oder einem Kit nach der vorliegenden Erfindung kann grundsätzlich die Permeation von Substanzen aus beliebigen Stoffklassen untersucht werden. Insbesondere können mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens potentielle Wirkstoffe, insbesondere potentielle pharmazeutische und/oder biologische Wirkstoffe, untersucht werden, die für Therapie und/oder Diagnostik verschiedener Krankheiten einsetzbar sind. Es kann sich hierbei beispielsweise auch um Peptide oder Proteine handeln. Insbesondere können auch niedermolekulare Stoffe, wie häufig bei potentiellen pharmazeutischen Wirkstoffen vorkommend, untersucht werden.
Weitere Merkmale der Erfindung ergeben sich aus den Zeichnungen sowie aus der nachfolgenden Beschreibung von bevorzugten Ausführungsformen in Verbindung mit den Unteransprüchen. Hierbei können die einzelnen Merkmale jeweils für sich oder zu mehreren in Kombination miteinander bei einer Ausführungsform der Erfindung verwirklicht sein. Die beschriebenen besonderen Ausführungsformen dienen lediglich zur Erläuterung und zum besseren Verständnis der Erfindung und sind in keiner Weise einschränkend zu verstehen. Auch die nachstehend beschriebenen Zeichnungen sind Bestandteil der vorliegenden Beschrei- bung, was hiermit durch ausdrückliche Bezugnahme bekräftigt wird.
In den Zeichnungen zeigen:
Fig. 1: Schematischer Aufbau einer Permeationsmessung mit einer
Zeilmonolage als Permeationsbarriere.
Fig. 2: Schematische Darstellung einer Meßanordnung „von o- ben". Die Permeationsrichtung ist durch den schwarzen Pfeil markiert. In der linken Permeationseinrichtung befindet sich die permeierende Substanz während die Messung in der rechten Permeationseinrichtung als Referenz dient.
Fig. 3: Schematische Darstellung einer Meßanordnung zur gleich- zeitigen Messung „von oben" und „von unten" zur Bestimmung der konzentrationsproportionalen Größen cΑkzeptor und C'DOΠOΓ- Die Permeationsrichtung ist durch den schwarzen Pfeil markiert.
Fig. 4: Schematische Darstellung einer Lumineszenzmessung ausschließlich „von oben" zur simultanen Bestimmung der konzentrationsproportionalen Größen cΑkzeptor und cOonor- Die Permeationsrichtungen sind durch die schwarzen Pfeile markiert.
Fig. 5: Korrelation der Messwerte aus den Beispielen 6 und 7 Fig. 6: Verlauf der gemäß Beispiel 8 ermittelten, konzentrationsproportionalen Größen für die Substanzen Warfarin, Propanolol und Carbamazepin
Beispiele
Beispiel 1 : Herstellung eines passivierten, sondenmarkierten, fluoreszenzaktiven Trägers
2 g eines porösen Silikatmaterials (Nucleoprep 300-12 von Macherey-Nagel, Düren) werden in eine Silanlösung, be- stehend aus 9,2 ml N-(2-Aminoethyl)-3Aminopropyl- trimethoxy-silan (EDA) und 243 μl konzentrierter Essigsäure in 450 ml entionisiertem Wasser gegeben und drei Stunden langsam rotiert. Danach wird das Silikatmaterial sedi- mentiert, dreimal mit entionisiertem Wasser gewaschen und bei 80 0C getrocknet.
Der Träger wird in 18 ml Carbonatpuffer (pH 9,5) dispergiert und mit 2 ml einer Lösung von Rhodamin-Isothiocyanat (RITC) in Carbonatpuffer (Endkonzentration 40 μmol/l) ver- setzt und über Nacht rotiert. Zur Entfernung von nicht umgesetztem RITC wird zunächst zweimal mit Carbonatpuffer und abschließend dreimal mit PBS (phosphate buffered saline, 10 mM Natriumphosphat, 0,9 % Natriumchlorid, pH 7,4) gewaschen.
Zur Passivierung wird der Träger mit 20 ml einer Lösung von Polyethylenglykolbisglycidylether (Mm ~ 526 g/mol) in PBS (3 % (w/v)) versetzt und über Nacht auf einem Überkopfro- tierer gedreht, woraufhin drei mal mit PBS gewaschen wird. Die Suspension wird abschließend auf einen 20 %igen Festkörpergehalt (200 mg Festkörper pro 1 ml Suspension) eingestellt.
Beispiel 2: Herstellung sondenmarkierterter Filterplatten
Die einzelnen Kavitäten eines kommerziell erhältlichen Systems aus zwei aufeinander abgestimmten Mikrotiterplatten (96well Permeation von Millipore mit einer Donor- und einer
Akzeptorplatte) werden zunächst für eine Stunde mit 150 μl einer Polyethyleniminlösung (1 mg/ml in entionisiertem Wasser) befüllt. Die beiden Platten werden ineinander gestellt, um den Filter zu inkubieren. Anschließend werden die Kavi- täten 3 mal mit entionisiertem Wasser gewaschen und in
Carbonatpuffer umgepuffert. In einem weiteren Schritt werden die Kavitäten von Donor und Akzeptorplatte mit 150 μl einer 10 μmol/l Lösung von Rhodamin-Isothiocyanat in Carbonatpuffer (pH 9,5) befüllt und für zwei Stunden ineinander gestellt. Anschließend wird einmal mit Carbonatpuffer und danach mit entionisiertem Wasser gewaschen. Abschließend werden die Kavitäten getrocknet.
Beispiel 3: Herstellung sondenmarkierter Filterplatten mit einer Hexa- decanmembran
In die einzelnen Kavitäten einer farbstoffbeschichteten Filterplatte aus Beispiel 2 werden 15 μl einer 5 %igen Lösung von Hexadecan in Heptan auf die Membranen gegeben. Man beläßt die Filterplatte so lange unter ständigem Luftabzug, bis die Heptanlösung verdampft ist. Es resultiert eine sondenmarkierte Filterplatte mit einer Schicht Hexadecan auf den Membranen (hier auch als Hexadecanmembran bezeichnet).
Beispiel 4: Bestimmung der Substanzpermeation durch eine Hexade- canmembran einer sondenmarkierten Filterplatte
In mehrere Kavitäten der Filterplatte (in diesem Beispiel Akzeptorplatte) aus Beispiel 3 werden jeweils 150 μl PBS- Puffer pH 7,4, welcher 1 % DMSO enthält, pipettiert. Die korrespondierenden Kavitäten der Donorplatte werden mit jeweils 135 μl PBS-Puffer und 15 μl einer 1 ,0 mM Substanzlösung in PBSPuffer/DMSO (90:10 v:v) gefüllt. Weitere Kavitäten der Donorplatte als auch der Akzeptorplatte werden nur mit einer 1 %igen Lösung von DMSO in PBS befüllt und dienen als Referenz zur Bestimmung der Fluoreszenzintensität I0.
Zur Bestimmung der konzentrationsproportionalen Größe c'Gieichgewicht werden sowohl einige Kavitäten der Donor- als auch die korrespondierenden Kavitäten der Akzeptorplatte mit 5E-5 molaren Lösungen (der rechnerischen Konzentration im Gleichgewicht) der zu untersuchenden Substanzen befüllt.
Die Permeation der Substanzen wird durch das Zusammenfügen der beiden Platten gestartet. Nach 4 Stunden werden in einer Meßanordnung „von oben" in den Kavitäten der Akzeptorplatte die Fluoreszenzintensitäten gemessen. Aus den gemessenen Intensitäten wurden gemäß der oben be- schriebenen Vorgehensweise die konzentrationsproportionalen Größen cΑkzeptor und c'cieichgewicht der permeierten Substanzen ermittelt. Die untersuchten Substanzen im Versuch waren Warfarin und Carbamazepin, für welche mit Hilfe von Gleichung (3) die folgenden Permeabilitäten bestimmt werden konnten:
logPwarfarin = - 4,3 und
I Og π Carbamazepin O,y.
Beispiel 5: Herstellung einer Mikrotiterplatte mit Hexadecanmembranen
In die mit Filtermembranen versehenen Kavitäten einer
Mikrotiterplatte eines kommerziell erhältlichen Systems aus zwei aufeinander abgestimmten Mikrotiterplatten, wie es auch in Beispiel 2 eingesetzt wurde, werden 15 μl einer 5 %igen Hexadecan-Lösung in Heptan auf die Membranen gegeben und die Filterplatte so lange unter ständigem Luftabzug belassen, bis die Heptanlösung verdampft ist. Man erhält eine Mikrotiterplatte mit einer Schicht Hexadecan auf den Membranen.
Beispiel 6: Bestimmung der Substanzpermeation durch die Hexadecanmembranen einer Mikrotiterplatte aus Beispiel 5, ausgelesen durch UV-Detektion
In die mit Filtermembranen versehenen Kavitäten der Mikro- titerplatte (fungiert hier als Akzeptorplatte) aus Beispiel 5 werden jeweils 135 μl PBS-Puffer pH 7,4 und 15 μL einer 10 %igen Lösung von DMSO in PBS-Puffer pipettiert. Die Kavitäten der korrespondierenden Donorplatte werden mit jeweils 135 μl PBS-Puffer und 15 μl einer 1 ,0 mM Substanz- lösung in PBS-Puffer/DMSO (90:10 v.v) gefüllt. Weitere 4
Kavitäten der Donorplatte als auch der Akzeptorplatte werden nur mit einer 1 %igen Lösung von DMSO in PBS-Puffer befüllt und dienen als Referenz. Die Permeation der Substanzen wird durch das Zusammenfügen der beiden Platten gestartet. Nach 4 Stunden werden Donor- und Akzeptorplatte getrennt, und ein Aliquot von 50 μl wird aus den Kavitäten der beiden Platten in eine UV- transparente Mikrotiterplatte überführt. In einem UV-Plattenleser (SpektraMax plus 384 von Molecular Devices) wird die Konzentration der Substanzen bestimmt.
Die untersuchten Substanzen waren Desipramin, Quinidin,
Testosteron, Furosemid, Terbutalin, Acyclovir, Ketoprofen, Carbamazepin, Amilorid, Metoprolol, Imipramin, Chloram- phenicol, Propranolol, Corticosterone, Naproxen, Sulfa- salazin, Verapamil, Progesteron und Warfarin. Die gemäß Gleichung (2) ermittelten logarithmierten Permeabilitäten der
Substanzen sind in Korrelation zu den gemessenen Werten der Messung aus Beispiel 7 in Fig. 5 dargestellt.
Beispiel 7: Bestimmung der Substanzpermeation durch die Hexadecan- membranen einer Mikrotiterplatte aus Beispiel 5, ausgelesen durch sondenmarkierte Silikatkügelchen
Analog zu dem in Fig. 4 dargestellten Vorgehen wird hier eine Anordnung gewählt, in der die konzentrations- proportionalen Größen durch simultane Messung der Fluoreszenzintensitäten in Akzeptor- und Donorkavitäten „von oben" bestimmt werden.
Dazu werden in mehrere der mit Filtermembranen versehe- nen Kavitäten der Mikrotiterplatte aus Beispiel 5 115 μl PBS-
Puffer, 20 μl der in Beispiel 1 hergestellten Trägersuspension (mit 200 mg Festkörper pro 1 ml Suspension) und 15 μl einer 10 %igen Lösung von DMSO in PBS-Puffer pipettiert. Die korrespondierenden Kavitäten einer weiteren Mikroti- terplatte (ohne Filtermembranen) werden mit 135 μl PBS- Puffer und 15 μl einer 1 ,0 mM Substanzlösung in PBS- Puffer/DMSO (90:10 v:v) gefüllt.
In weitere Kavitäten der Mikrotiterplatte aus Beispiel 5 werden 20 μl der in Beispiel 1 hergestellten Trägersuspension, 115 μl PBS-Puffer sowie 15 μl einer 1 ,0 mM Substanzlösung in PBS-Puffer/DMSO (90:10 v:v) pipettiert. In die korrespon- dierenden Kavitäten einer weiteren Mikrotiterplatte (ohne Filtermembranen) werden 15 μl einer 10 %igen Lösung von DMSO in PBS-Puffer und 135 μl PBS-Puffer pipettiert.
Einige Kavitäten der Mikrotiterplatte aus Beispiel 5 fungieren hier also als Akzeptorkavitäten, andere als Donorkavitäten.
Weitere Kavitäten der Mikrotiterplatte aus Beispiel 5 werden als Referenz wie ihre korrespondierenden Kavitäten in der weiteren Mikrotiterplatte mit einer 1 %igen Lösung von DMSO in PBS befüllt.
Die Permeation der Substanzen wird durch das Zusammenfügen der beiden Platten gestartet. Nach 4 Stunden werden in allen befüllten Kavitäten der Mikrotiterplatte aus Beispiel 5 die Fluoreszenzintensitäten in der Meßanordnung „von o- ben" bestimmt. Aus diesen Intensitäten wurden die konzentrationsproportionalen Größen der permeierten Substanz ermittelt.
Die untersuchten Substanzen waren Desipramin, Quinidin,
Testosteron, Furosemid, Terbutalin, Acyclovir, Ketoprofen, Carbamazepin, Amilorid, Metoprolol, Imipramin, Chloram- phenicol, Propranolol, Corticosterone, Naproxen, Sulfasal- azin, Verapamil, Progesteron und Warfarin. Die ermittelten logarithmierten Permeabilitäten der Substanzen sind in Korrelation zu den gemessenen Werten der Messung aus Beispiel 6 in Fig. 5 dargestellt.
Beispiel 8: Bestimmung der Substanzpermeation durch eine Hexa- decanmembran auf einer Mikrotiterplatte aus Beispiel 5, kontinuierlich ausgelesen durch farbstoffbeschichtete Silikatkugeln
Auch in Beispiel 8 sind zwei Permeationsrichtungen zu beachten. Im Fall 1 permeiert die Substanz von „unten nach oben" in die Mikrotiterplatte aus Beispiel 5 (Akzeptor), im Fall 2 permeiert die Substanz aus der Mikrotiterplatte aus Beispiel 5 (Donor) von „oben nach unten".
Für den Fall 1 werden in einige Kavitäten der Filterplatte aus Beispiel 5 115 μl PBS-Puffer pH 7,4, 20 μl der in Beispiel 1 hergestellten Trägersuspension und 15 μl einer 10 %igen Lösung von DMSO in PBS-Puffer pipettiert. Die korrespondierenden Kavitäten einer weiteren Platte werden mit 135 μ I PBS-Puffer und 15 μl einer 1 ,0 mM Substanzlösung in PBS- Puffer/DMSO (90:10 v:v) gefüllt.
Für den Fall 2 werden in weitere Kavitäten der Mikrotiterplatte aus Beispiel 5 20 μl der in Beispiel 1 hergestellten Trägersuspension, 115 μl PBS-Puffer sowie 15 μL einer 1 ,O mM Substanzlösung pipettiert. In die korrespondierenden Kavitäten der weiteren Platte werden 15 μl einer 10 %igen Lösung von DMSO in PBS-Puffer und 135 μL PBS-Puffer pipettiert.
Weitere Kavitäten der Mikrotiterplatte aus Beispiel 5 werden als Referenz wie ihre korrespondierenden Kavitäten in der weiteren Mikrotiterplatte mit einer 1 %igen Lösung von DMSO in PBS befüllt.
Die Permeation der Substanzen wird durch das Zusammen- fügen der beiden Platten gestartet. In diskreten Zeitintervallen von 5 min über eine Gesamtzeit von 4 Stunden hinweg wurden die Fluoreszenzintensitäten in der Messgeometrie „von oben" in allen befüllten Kavitäten der Mikrotiterplatte aus Beispiel 5 gemessen. Aus diesen Intensitäten wurden für jeden gemessenen diskreten Zeitpunkt die konzentrationsproportionalen Größen der permeierten Substanz ermittelt.
Die untersuchten Substanzen waren Warfarin, Carbamazepin und Propranolol. Die erhaltenen mittleren Permeabili- täten der Substanzen betrugen:
lOgPwarfarin = - 4,7 lOgPcarbamazepin 3,9 lOgPpropanolol = — 3,8
Die ermittelten Verläufe der konzentrationsproportionalen Größen der permeierenden Substanzen sind in Fig. 6 dargestellt, wobei jeweils die obere Meßkurve die Abnahme der Substanzkonzentration in einer Donorkavität und die untere Meßkurve die Zunahme der Substanzkonzentration in einer
Akzeptorkavität illustriert.
Beispiel 9: Bestimmung der Substanzpermeation durch eine Hexa- decanmembran auf einer Mikrotiterplatte aus Beispiel 5, ausgelesen durch farbstoffbeladene dispergierbare Polymerpartikel. In mehrere Kavitäten einer als Akzeptorplatte dienenden, gemäß Beispiel 5 hergestellten Mikrotiterplatte werden 120 μl PBS-Puffer, 15 μl einer 10 %igen Lösung von DMSO in PBS-Puffer und 15 μl einer Suspension von farbstoff- beladenen Polystyrolpartikeln (1 μm, 0,05 %, Hersteller
Estapor) gegeben. Die korrespondierenden Kavitäten einer weiteren, als Donorplatte dienenden Mikrotiterplatte werden mit 135 μl PBS-Puffer und 15 μl einer 1 ,0 mM Substanzlösung in PBS-Puffer/DMSO (90:10 v:v) befüllt. Weitere Ka- vitäten der Donorplatte (und die korrespondierenden auf der
Akzeptorplatte) werden nur mit einer 1 %igen Lösung von DMSO in PBS befüllt und dienen als Referenz zur Bestimmung der Fluoreszenzintensität I0.
Zur Bestimmung der konzentrationsproportionalen Größe cOieichgewicht werden sowohl einige Kavitäten der Donor- als auch die korrespondierenden Kavitäten der Akzeptorplatte mit 5E-5 molaren Lösungen (der rechnerischen Konzentration im Gleichgewicht) der zu untersuchenden Sub- stanzen befüllt.
Die Permeation der Substanzen wird durch das Zusammenfügen der beiden Platten gestartet. Nach 4 Stunden werden in allen befüllten Kavitäten der Akzeptorplatte die Fluores- zenzintensitäten der farbstoffbeladenen Polystyrolpartikel in der Messgeometrie „von oben" gemessen. Aus diesen Intensitäten wurden die konzentrationsproportionalen Größen der permeierten Substanz ermittelt.
Untersucht wurde u.a. die Substanz Warfarin. Die Permeabilität von Warfarin wurde mit logPwarfarin = -4,5 bestimmt.

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zur Messung der Permeation mindestens einer in einem Lösungsmittel enthaltenen Substanz durch eine Permeationsbarrie- re und/oder zur Bestimmung permeationsbeeinflussender Parameter, insbesondere zur Bestimmung der Permeabilität der Barriere für die mindestens eine Substanz, unter Verwendung mindestens einer lumineszierenden Sonde, umfassend
die Bereitstellung der mindestens einen Substanz auf einer
Seite der Permeationsbarriere,
Inkubation der Permeationsbarriere mit der mindestens einen, im Lösungsmittel enthaltenen Substanz und - Messung von Lumineszenzsignalen der Sonde auf mindestens einer Seite der Permeationsbarriere, welche in Abhängigkeit von der jeweiligen Konzentration der Substanz moduliert sind,
wobei das Anregungs- und/oder das Emissionsspektrum der min- destens einen Sonde mit dem Absorptionsspektrum der mindestens einen Substanz überlappt.
2. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, daß die Permeationsbarriere eine artifizielle Membran umfaßt.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die artifizielle Membran ein poröses Trägermaterial, insbesondere eine Filtermembran, umfaßt.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß die artifizielle Membran organisches Material umfaßt, insbesondere als Schicht auf der Oberfläche des porösen Trägermaterials und/oder in den Poren des porösen Trägermaterials.
5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem organischen Material im wesentlichen um mindestens einen Kohlenwasserstoff mit einer bevorzugten Kettenlänge von 8 oder mehr Kohlenstoffen und/oder um mindestens einen Alkohol mit einer bevorzugten Kettenlänge von 4 oder mehr Kohlenstoffen handelt.
6. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem organischen Material im wesentlichen um ein Lipid oder eine Lipidmischung handelt.
7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß das Lipid oder die Lipidmischung membranständige, membranintegrale und/oder transmembrane Proteine aufweist.
8. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem organischen Material im wesentlichen um Zellen handelt, wobei die Zellen insbesondere in Form einer Zellmono- oder einer Zellmultischicht vorliegen.
9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei der Zellmonoschicht um eine CACO-2- oder um eine MDCK- Monoschicht handelt.
10. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem organischen Material im wesentlichen um Zellfragmente handelt.
11. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, daß die Permeationsbarriere eine nicht-artifizielle Membran umfaßt, insbesondere eine Membran aus Organgewebe.
12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 11 , dadurch gekennzeichnet, daß die Permeationsbarriere aus einem Darmgewebe präpariert ist.
13. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 11 , dadurch gekennzeichnet, daß die Permeationsbarriere aus Hautgewebe präpariert ist.
14. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die mindestens eine Sonde Bestandteil der
Permeationsbarriere ist.
15. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß das poröse Trägermaterial einer artifiziellen Membran sondenmarkiert ist.
16. Verfahren nach einem der Ansprüche 14 oder 15, dadurch gekennzeichnet, daß das organische Material einer artifiziellen Membran sondenmarkiert ist.
17. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die mindestens eine Sonde auf die Permeationsbarriere aufgebracht ist, insbesondere in Form eines auf die Permeationsbarriere sedimentierten, sondenmarkierten Feststoffs.
18. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die mindestens eine Sonde im Lösungsmittel enthalten ist.
19. Verfahren einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die mindestens eine Sonde in einem Gel enthalten ist.
20. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß es in mindestens einer Permeationseinrich- tung durchgeführt wird, die mindestens ein Donorkompartiment, in dem die mindestens eine Substanz bereitgestellt wird, die Permea- tionsbarriere und mindestens ein Akzeptorkompartiment, in das die
Substanz gegebenenfalls mindestens teilweise permeiert, umfaßt.
21. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die mindestens eine Sonde in Form eines sondenmarkierten Einsatzes in das mindestens eine Donor- und/ oder in das mindestens eine Akzeptorkompartiment eingebracht wird.
22. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß es parallelisiert durchgeführt wird.
23. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Lumineszenzsignale bei einer oder mehreren diskreten Wellenlängen und/oder als Spektrum gemessen wer- den.
24. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die mindestens eine lumineszierende Sonde fluoreszierende und/oder phosphoreszierende Eigenschaften auf- weist.
25. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß eine einzelne Sonde oder eine Kombination von Sonden verwendet wird.
26. Verwendung von mindestens einer Mikrotiterplatte in einem Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, insbesondere als Bestandteil mindestens einer Permeationseinrichtung.
27. Verwendung von mindestens einem Farbstoff in einem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 25, insbesondere als mindestens eine lumineszierende Sonde.
28. Verwendung mindestens eines porösen Trägermaterials, insbesondere mindestens einer Filtermembran, in einem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 25, insbesondere als Bestandteil mindestens einer Permeationsbarriere.
29. Verwendung mindestens eines Lipids oder einer Lipidmischung in einem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 25, insbesondere als Bestandteil mindestens einer Permeationsbarriere.
30. Verwendung mindestens eines Kohlenwasserstoffs mit einer bevorzugten Kettenlänge von 8 oder mehr Kohlenstoffen und/oder mindestens eines Alkohols mit einer bevorzugten Kettenlänge von 4 oder mehr Kohlenstoffen in einem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 25, insbesondere als Bestandteil mindestens einer Permeationsbarriere.
31. Verwendung von Zellen, insbesondere in Form einer Zellmono- o- der einer Zeilmultischicht, in einem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 25, insbesondere als Bestandteil mindestens einer Permeationsbarriere.
32. Verwendung von Zellfragmenten in einem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 25, insbesondere als Bestandteil mindestens einer Permeationsbarriere.
33. Verwendung mindestens einer Membran aus Organgewebe in einem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 25, insbesondere als Permeationsbarriere.
34. Kit zur Durchführung eines Verfahrens gemäß einem der Ansprüche 1 bis 25, umfassend mindestens 2 Mitglieder aus der Gruppe mit
mindestens einer Mikrotiterplatte, mindestens einer lumineszierenden Sonde, mindestens einem porösen Trägermaterial, mindestens einem sondenmarkierten Einsatz, - mindestens einem Lösungsmittel, mindestens einem geeigneten Puffersystem, mindestens einem Kohlenwasserstoff mit einer bevorzugten Kettenlänge von 8 oder mehr Kohlenstoffen und/oder mindestens einem Alkohol mit einer bevorzugten Kettenlänge von 4 oder mehr Kohlenstoffen, mindestens einem Lipid oder einer Lipidmischung,
Zellen, insbesondere in Form einer Zellmono- oder einer ZeII- multischicht,
Zellfragmenten und - mindestens einer nicht-artifiziellen Membran, insbesondere mindestens einer Membran aus Organgewebe.
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