WO2007020873A1 - 免疫不全ウイルス感染症の治療または予防のための核酸 - Google Patents

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WO2007020873A1
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Hideto Chono
Kazuya Matsumoto
Junichi Mineno
Ikunoshin Kato
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    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Definitions

  • the present invention relates to a nuclear acid construct useful for treating or preventing a disease caused by infection with an immunodeficiency virus.
  • HIV Human immunodeficiency virus
  • T cells a cell that express CD4 molecules, such as T cells, and destroys the cells.
  • CD4 + T cells helper T cells
  • cellular immunity decrease in the human body infected with HIV.
  • the patient becomes severely immunocompromised and develops an opportunistic infection such as potash-pneumonia. This condition is called acquired immunodeficiency syndrome (AIDS)!
  • AIDS acquired immunodeficiency syndrome
  • antiviral agents reverse transcriptase inhibitors, protease inhibitors, etc.
  • vaccines that block the HIV life cycle
  • several antiviral agents are available.
  • RNA decoys and ribozymes such as nucleic acids, transdominant mutant proteins, and proteins such as intracellular antibodies
  • Patent Document 1 U.S. Patent No. 583 7510
  • ribonuclease As a product exhibiting the above-mentioned cytotoxicity, but cell death of HIV-infected cells by ribonuclease has not been confirmed. Also, Human spleen-derived ribonuclease (RNasel), which is a typical ribonuclease, is known to be inhibited by a ribonuclease 'inhibitor present in the cytoplasm (Non-Patent Document 4) and cannot be said to be suitable for the above purpose.
  • RNasel Human spleen-derived ribonuclease
  • prokaryotic plasmids have been reported to have post-segregation killing (PSK) functions that kill the host from which the plasmid was dropped in order to maintain the plasmid in the host.
  • PSK post-segregation killing
  • These plasmids contain the toxin antitoxin gene.
  • Antitoxin binds with toxins in the cell and inactivates the toxin Antitoxin is easily degraded by proteases, and when the toxin is degraded by proteases, stable toxins are activated.
  • Such toxin antitoxin genes are also present in most prokaryotic chromosomes, respond to various stresses, and play a role in program cell death.
  • Patent Document 1 US Patent No. 5554528
  • Patent Document 2 US Patent No. 5837510 Specification
  • Patent Document 3 International Publication No. 2004Z113498 Pamphlet
  • Non-Patent Document 1 Human 'Gene' Therapy (Hum. Gene Therapy), II, p5 3-61 (1991)
  • Non-Patent Document 2 Procedidas ⁇ National ⁇ Academic ⁇ 'Sciences ⁇ Ob' USA (Proc. Natl. Acad. Sci. USA), 91st, p365-369 (19 94) )
  • Non-Patent Document 3 Human 'Gene' Therapy (Hum. Gene Therapy), No. 10, p 103-112 (1999)
  • Non-Patent Document 4 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95th, pl0407—10412 ( 1998)
  • Non-Patent Document 5 Molecular Cell, No.12, p913-920 (2003)
  • Non-Patent Document 6 Journal 'Ob' Biological 'Chemistry (J. Biol. Chem.), No. 279, P20678-20684 (2004)
  • the present invention has been made in view of the above prior art, and an object of the present invention is to provide a more effective method for treating HIV infection.
  • the present inventors connected a gene encoding a polypeptide having a single-stranded RNA-specific endoribonuclease activity downstream of a transcriptional regulatory sequence induced by a human immunodeficiency virus trans-acting factor.
  • a polypeptide having endoribonuclease activity specific to single-stranded RNA is induced by HIV infection, and the mRNA in the cell is degraded. It was found that HIV replication and infection of other cells could be prevented, and the present invention was completed.
  • [1] A transcriptional regulatory sequence whose transcription is induced by a human immunodeficiency virus trans-acting factor, and a single-stranded RNA-specific end ribonuclease activity arranged in a form in which expression can be controlled by the sequence.
  • a nucleic acid containing a gene encoding a polypeptide [2] a nucleic acid of [1] containing a transcriptional regulatory sequence whose transcription is induced by Tat protein and Z or Rev protein,
  • a method for producing a cell capable of suppressing replication of a human immunodeficiency virus comprising introducing any of the nucleic acids into a cell,
  • a method for treating or preventing human immunodeficiency virus infection which comprises introducing any of the nucleic acids into cells,
  • the present invention provides a nucleic acid construct capable of suppressing the replication of human immunodeficiency virus (HIV) in cells.
  • the nucleic acid construct is useful for the treatment of HIV infection.
  • FIG. 1 is a graph showing the amount of HIV-derived protein in the culture supernatant of HIV-infected cells.
  • FIG. 2 is a graph showing the amount of HIV-derived protein in the culture supernatant of HIV-infected cells.
  • FIG. 3 is a graph showing changes in the number of viable cells over time in the culture of HIV-infected cells.
  • the nucleic acid construct of the present invention comprises a transcription regulatory sequence whose transcription is induced by a human immunodeficiency virus trans-acting factor, and a single-stranded RNA-specific sequence arranged in a form in which expression can be controlled by the sequence. And a gene encoding a polypeptide having a novel endoribonuclease activity.
  • transcriptional regulatory sequences whose transcription is induced by human immunodeficiency virus trans-acting factors there are no particular limitations on transcriptional regulatory sequences whose transcription is induced by human immunodeficiency virus trans-acting factors.
  • transcriptional regulatory sequences whose transcription is induced by the Tat protein of HIV can be used.
  • Tat protein binds to a TAR (trans-activation responsive element) sequence present in RNA whose transcription has been initiated by the action of the HIV LTR promoter and activates transcription downstream of the TAR protein.
  • a transcriptional regulatory sequence having a TAR region base sequence downstream of the transcription start site can be used.
  • the HIV LTR or a transcriptional regulatory sequence obtained by appropriately modifying the LTR is used.
  • Examples of the modification include deletion of a binding site with a host cell-derived transcription factor present in the promoter and deletion of a region unnecessary for Tat-specific transcription.
  • the former modification can reduce the level of transcription unrelated to HIV infection by host-derived transcription factors.
  • Such modifications of transcriptional regulatory sequences are described in Non-Patent Document 2, for example.
  • Examples of the latter modification include deletion of the U5 region of LTR and the region downstream of the TAR sequence (part of R region and U5 region).
  • the nucleic acid of the present invention having such a deleted LTR is advantageous in preparing a high-titer retrovirus vector that retains the nucleic acid.
  • RRE Rev-responsible element
  • Rev protein which is a trans-acting factor derived from HIV (Non-patented Reference 3).
  • INS a region called INS, present in the gag and pol genes, suppresses transcription of HIV mRNA in the absence of Rev protein, but this inhibitory action is due to the interaction with RRE and Rev protein.
  • the polypeptide encoded by the nucleic acid can be obtained.
  • sequence interacting with the trans-acting factor derived from HIV is used in combination with a functional sequence in which the sequence is inherently incorporated, for example, a heterologous functional sequence that may be used together with a promoter. May be.
  • a sequence constructed by combining the above sequence with a promoter not derived from HIV and capable of initiating transcription of mRNA in a cell in which introduction of the nucleic acid of the present invention is desired is also used in the present invention. Is included.
  • the nucleic acid of the present invention comprises a polynucleotide having a single-stranded RNA-specific endoribonuclease activity in a form capable of controlling expression by the transcription regulatory sequence. It is created by connecting genes encoding peptide.
  • single-stranded RNA-specific endoribonuclease activity is defined as the 3'-side of ribonucleotide in a single-stranded nucleic acid containing at least one molecule of ribonucleotide as a constituent base. It means the activity of hydrolyzing phosphodiester bonds.
  • the nucleic acid hydrolyzed by the activity has a 3 ′ end having a hydroxyl group and a 5 ′ end having a phosphate group, a 3 ′ end having a phosphate group and a 5 ′ end having a hydroxyl group, or a 2 ′ or 3 ′ site. This produces a 5 'end with click phosphate and hydroxyl groups.
  • a polypeptide that cannot cleave a double-stranded nucleic acid such as a double-stranded RNA, RNA-DNA hybrid, etc.
  • the above substrate specificity is suitable for the present invention from the viewpoint of efficiently degrading the genome of HIV, which is a single-stranded RNA.
  • Particularly preferred are those having an activity of cleaving RNA specifically in its base sequence and those capable of degrading mRNA in a ribosome-independent manner.
  • the polypeptide include an enzyme called mRNA Intereferase such as MazF and PemK described later (Patent Document 2).
  • the polypeptide having sequence specificity and having the activity of degrading single-stranded RNA in a ribosome-independent manner used in the present invention does not specifically limit the present invention. It may be derived from.
  • the gene encoding the polypeptide can be isolated from the genome or plasmid of the microorganism.
  • genes encoding MazF and PemK which are endoribonucleases constituting the toxin-antitoxin toxin described in Non-Patent Documents 4 and 5, can be used in the present invention.
  • MazF is an enzyme that cleaves 5 and A / CA-3 'sequences in single-stranded RNA, and PemK mainly cleaves 5'-U / A (C, A or U) -3. Furthermore, it is high between the amino acid sequences of MazF and PemK described above from known databases! It is also possible to select a gene encoding an amino acid sequence having homology and isolate it for use in the present invention.
  • Polypeptides having the above-mentioned activity have already been found from many microorganisms including cyanobacteria and archaea [Bacillus subtilis 168 (NP-388347; 5'-U / ACAU-3 '), Neisseria meningitidis ATCC13O9O (NP_2750 29; 5 / ACU-3,), Deinococcus radiodurans Rl (NP—294385; 5, UU / CCUUU-3,), Micobacterium bovis BCG (NP—855664; 5, -U / CCUU-3,), Nostoc sp.
  • PCC7120 (NP—487251; 5'—U / ACA—3 ′), Enterococcus faecalis V583 (NP—816 859; 5, —U / ACAU—3 ′), Nitrosomonas europaea ATCC19718 (NP—841355; 5′—GA / AU-3 ', 5'- G / AAU-3', 5 AA / AU-3 'or 5 A / AAU-3), Pyrococcus hor ikoshii ATCC700860 (NP— 143082; 5, — U / GG— 3 ', 5'—U / UG—3 ′, 5′—U / GA—3 ′, 5′—A / GG-3 ′ or 5′-A / AG-3 ′): Katsuko's NCBI Protein Database The accession number of the polypeptide having the above activity and the base sequence that the polypeptide recognizes and cleaves are shown].
  • the endoribonuclease constituting the toxin antitoxin-type toxin is not inhibited by a cytoplasmic ribonuclease inhibitor such as a human placenta-derived ribonuclease inhibitor (Patent Document 3), proceed to the present invention. Suitable for use.
  • a cytoplasmic ribonuclease inhibitor such as a human placenta-derived ribonuclease inhibitor (Patent Document 3)
  • the cells do not synthesize new proteins, so that the cells are inhibited from growth and cell death is induced.
  • the enzyme does not degrade the rRNA in the ribosome state or the tRNA that forms a higher-order structure!
  • the HIV RNA is degraded in the cell into which the nucleic acid of the present invention has been introduced.
  • the cells can recover their ability to grow. Therefore, even if HIV has been integrated into the chromosome as a provirus, cells in a state in which virus replication has been prevented maintain their proliferative capacity.
  • the use of the above-mentioned endoribonuclease is advantageous in that it can prevent HIV replication and the onset of AIDS without greatly reducing the number of T cells in the living body.
  • Toxin The endoribonuclease that constitutes an antitoxin toxin is as short as 3-7 bases and recognizes the base sequence to cleave single-stranded RNA. Therefore, the endoribonuclease is expressed in cells. In this case, most of the mRNA in the cell is degraded and protein synthesis and cell proliferation in the cell are inhibited. In addition, RNA, which is the HIV genome, is also cleaved, preventing HIV replication and extracellular release (budding). In addition, since the expression of the polypeptide encoded by the HIV genome is also blocked, Tat protein released outside the cell can induce apoptosis in non-HIV infected cells. It is suppressed.
  • the nucleic acid construct of the present invention be introduced into a cell (cell group) containing HIV-infected cells, that is, a CD4-positive cell. It is. Therefore, in the present invention, gene transfer is carried out using CD4 positive cells (for example, T cells), progenitor cells that can be sorted into CD4 positive cells (for example, hematopoietic stem cells), or cell populations containing the aforementioned cells as target cells. Is done. In the present invention, it is preferable to target hematopoietic stem cells or a cell population containing the cells from the viewpoint of comprehensively introducing the nucleic acid construct into cells that may be infected with HIV.
  • CD4 positive cells for example, T cells
  • progenitor cells that can be sorted into CD4 positive cells
  • cell populations containing the aforementioned cells for example, hematopoietic stem cells
  • CD4-positive cells As long as the cells contain CD4-positive cells and their precursor cells, blood cells (peripheral blood cells, umbilical cord blood cells), bone marrow cells, and bone marrow cells collected from individuals that are not particularly limited are known methods. CD4 positive cells, CD4 positive cell progenitor cells, hematopoietic stem cells and the like fractionated by the above.
  • the method for introducing the nucleic acid construct of the present invention into a cell is not particularly limited.
  • the nucleic acid of the present invention may be incorporated into a plasmid vector or viral vector and then introduced into the cell by an appropriate method.
  • a plasmid vector When a plasmid vector is used, gene transfer methods such as calcium phosphate method, force ionic lipid method, ribosome method, and electoporation method can be used.
  • a virus vector such as a retrovirus vector, adenovirus vector, adeno-associated virus vector, or herpes virus vector, the target cell is infected under conditions suitable for each virus, and the nucleic acid of the present invention is used. Should be introduced.
  • a retroviral vector having the ability to incorporate the nucleic acid of the present invention onto a chromosome is suitable for the present invention.
  • the retrovirus vector used in the present invention is not particularly limited.
  • a replication-defective retrovirus vector is suitable for the present invention.
  • the vector is non-pathogenic, deficient in replication so that it cannot replicate in infected cells. These vectors can invade a host cell such as a vertebrate cell, particularly a mammalian cell, and stably incorporate the foreign gene inserted into the vector into its chromosomal DNA.
  • Known replication-defective retrovirus vectors include MFG vectors and ⁇ -SGC vectors (WO 92Z07943 International Publication Pamphlet), pBabe [Nucleic Acids Research, No. 18, pp.
  • lentiviral vectors include human immunodeficiency virus (HIV) -derived vectors [HIV vectors having wild type LTR (eg, US Pat. No. 56,65577) and HIV vectors having modified LTR (eg, pLenti6ZV5: manufactured by Invitrogen) )], Simian immunodeficiency virus (SIV) -derived vectors [for example, human 'gene' therapy, VIII, pl863-1874 (2000)], and the like are not limited thereto.
  • HAV human immunodeficiency virus
  • SIV Simian immunodeficiency virus
  • the retroviral vector may be prepared by a known method and used in the present invention!
  • Retrovirus-producing cells suitable for the retroviral vector to be used are cultured, and the culture supernatant is collected and used in the present invention.
  • the retrovirus-producing cells described above stably produce retrovirus particles in the supernatant, or transiently produce retrovirus particles by retrovirus vector plasmid transfection.
  • retrovirus-producing cells For the production of the above retrovirus-producing cells, known packaging cell lines such as PG13 (ATCC CRL—10686), PA317 (ATCC CRL—9078), GP + E—86 and GP + envAm—12 ( US Pat. No. 5,278,056), Psi-Crip [Proc. Natl. Ac ad. Sci. USA, No. 85, pp. 6460-6464 (1988)] and the like may be used. In addition, retrovirus-producing cells can be prepared using 293 cells or 293T cells with high transfection efficiency.
  • a retrovirus produced by pseudotyped packaging having an envelope derived from a virus different from that from which the genome of the retrovirus vector is derived can also be used.
  • Moroni mouse leukemia virus Moroni mouse leukemia virus
  • GaLV gibbon leukemia virus
  • VSV vesicular stomatitis virus
  • retro Will introduced enzyme genes involved in sugar chain synthesis A retrovirus vector produced on the surface of the cell and having a sugar chain-modified protein can be used in the present invention.
  • the above-mentioned various vectors are arranged downstream of the above-mentioned transcriptional regulatory sequence and the transcriptional regulatory sequence whose transcription is induced by the trans-acting factor of human immunodeficiency virus.
  • a gene encoding a polypeptide having a single-stranded RNA-specific endoribonuclease activity.
  • it can contain sequences such as an operator, an enhancer, a terminator and the like that control the transcription of the gene.
  • the nucleic acid of the present invention can be selected from suitable marker genes (for example, drug resistance genes, genes encoding fluorescent proteins, ⁇ -galactosidase, etc.) that enable selection of the transfected cells.
  • suitable marker genes for example, drug resistance genes, genes encoding fluorescent proteins, ⁇ -galactosidase, etc.
  • the nucleic acid of the present invention is equipped with a suicide gene for the purpose of excluding the transgenic cells when the treatment with the transgenic cells is completed, or when any side effects occur. May be.
  • ex vivo gene transfer in which a vector is introduced into a cell collected from an individual organism in vitro.
  • a viral vector the target cell collected from the living body is mixed with a viral vector such as a culture supernatant of a virus-producing cell or a purified viral vector from the supernatant. By incubating under conditions, gene transfer is achieved.
  • a vector capable of gene transfer in vivo such as an adenovirus vector
  • a vector containing the nucleic acid of the present invention may be directly administered to an individual.
  • a target cell When a retroviral vector is used for introduction of a ethas' vivo gene, a target cell can be infected with the retroviral vector with high efficiency in the presence of a functional substance having a retroviral binding activity.
  • Gene transfer methods using functional substances having retrovirus binding activity include, for example, WO 95Z26200 International Publication Non-Flett, WO 97/18318 International Publication Pamphlet, Nature Medicine ⁇ Section 2, 876— 882 (1996).
  • both the retroviral binding site and the target cell binding site are on the same molecule.
  • a method using a mixture of a functional substance having a retrovirus binding site and a functional substance having a target cell binding site can also be used.
  • the functional substance is not particularly limited as long as it has retrovirus binding activity and Z or target cell binding activity.
  • fibronectin-derived heparin-binding domain henolin II domain
  • fibroblast growth factor fibroblast growth factor
  • type V collagen fragment derivatives and variants of the above polypeptides
  • polylysine polylysine
  • DEAE dextran etc.
  • the functional substance having the target cell binding activity any substance having the ability to bind to a desired target cell can be used.
  • a polypeptide having a cell binding activity such as cytoskeletal protein
  • an antibody that recognizes a cell or cell surface biomolecule such as cytoskeletal protein
  • a growth factor such as IL-12
  • a cytodynamic force such as a cytodynamic force
  • One preferred embodiment of the present invention is a method of introducing a gene into a target cell in the presence of a functional substance containing a fibronectin-derived heparin-binding domain.
  • the functional substance is preferably a fibronectin fragment having both a cell adhesion domain and a heterogen binding domain.
  • the cell adhesion domain is particularly preferably a polypeptide that binds to VLA 5 and Z or VLA-4.
  • the fibronectin fragment described above can be prepared by means such as fibronectin-powered protease digestion purified from a living body, and can also be prepared by recombinant DNA technology.
  • a recombinant fibronectin fragment marketed by Takarabio as RetroNectin (registered trademark) is suitable for the present invention.
  • the present invention is useful for producing a cell composition useful for the treatment or prevention of human immunodeficiency virus infection. Furthermore, the present invention also provides a method for treating or preventing HIV infection using the above cell composition. That is, by administering to the individual a cell into which the nucleic acid of the present invention has been introduced, it is possible to reduce HIV-infected cells in the individual or to suppress HIV replication in the cell.
  • CD4 positive cells into which the nucleic acid of the present invention has been introduced and CD4 positive cells into which the nucleic acid of the present invention has been introduced
  • Progenitor cells of sex cells (hematopoietic stem cells, etc.) CD4 positive cells that are well-divided become downstream of transcriptional regulatory sequences when HIV-derived trans-acting factors are generated in the cells after HIV infection.
  • Expression of a gene encoding a polypeptide having a specific single-stranded RNA-specific endoribonuclease activity is induced, so that the generated polypeptide degrades intracellular mRNA and inhibits protein biosynthesis.
  • the RNA genome produced during HIV replication is also degraded. In this way, the translation of the polypeptide encoded in the HIV genome and the replication of the HIV genome are inhibited, thereby preventing the generation of new infectious HIV particles and infection of other cells.
  • an antitoxin gene is connected downstream of the promoter of an appropriate housekeeping gene (glycealdehyde aldehyde 3-phosphate dehydrogenase gene, ⁇ -actin gene, etc.), and a small amount of antitoxin in non-HIV-infected cells.
  • an appropriate housekeeping gene glycosyl alcohol dehydrogenase gene, ⁇ -actin gene, etc.
  • the activity of toxin is suppressed by the action of antitoxin by expressing the expression of.
  • the expression of toxin is promoted by the action of the above-mentioned trans-acting factor, and cytotoxicity is exhibited only when the expression level of antitoxin is exceeded. In this way, the selectivity of cytotoxicity against HIV-infected cells can be further improved.
  • HIV-infected cells have been reported by the action of enzymes (such as thymidine kinase) that have been reported previously to activate cytotoxic proteins (eg diphtheria toxin) and nontoxic precursors to cytotoxic compounds.
  • enzymes such as thymidine kinase
  • cytotoxic proteins eg diphtheria toxin
  • nontoxic precursors to cytotoxic compounds eg diphtheria toxin
  • toxins released after cell destruction and activated compounds may invade non-HIV-infected cells and show cytotoxicity.
  • the surrounding cells are less likely to be damaged.
  • Multi-drug combination therapy is the mainstream treatment for HIV infection.
  • HAART Multi-drug combination therapy
  • the present invention may be implemented in combination with the above-mentioned HAART.
  • a polypeptide having an endribonuclease activity is expressed in accordance with the expression of Tat.
  • the above nucleic acid construct exists in a cell in which HIV is integrated into the chromosome as a provirus! /
  • expression of a polypeptide having endoribonuclease activity is induced by Tat translated from this RNA, and single-stranded RNA in cells including the HIV genome Is disassembled. As a result, HIV replication and budding are prevented in the cells.
  • Non-patent Document 5 Normal protein synthesis resumes upon cessation, so the cell resumes proliferation if destroyed at this point.
  • the plasmid is a plasmid capable of expressing the Tat protein under the control of the CMV promoter Z.
  • Example 2 Construction of MazF expression plasmid
  • the regions encoding gag, sgGFP and RRE inserted in plasmid pQBI—LTRgagGFP were removed by double digestion with restriction enzymes Sall and Xba I.
  • a chemically synthesized DNA encoding the MazF protein having the base sequence shown in SEQ ID NO: 3 was inserted.
  • the thus constructed plasmid was designated as pQBI-LTRMazFcvl.
  • the plasmid is a plasmid capable of expressing MazF protein under the control of 5 'LTR of HIV.
  • the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3 encodes the amino acid sequence of MazF shown in SEQ ID NO: 1, and other than the ACA nucleotide sequence present in the MazF gene without changing the amino acid sequence of natural MazF. It is converted into the base sequence. Therefore, MazF RNA transcribed from this plasmid can be stably expressed in cells without being cleaved by MazF activity.
  • Each well of a 24 well collagen-coated plate was supplemented with 1 ⁇ 10 5 human 293TZ17 cells [ATCC CRL-11268] and cultured for 24 hours.
  • DMEM Dulbecco's modified Eagle medium
  • GEBCO urine fetal serum
  • Each well cell was then transfected with pQBI-LTRMazFcvl (0.25 g), or both pQBI-LTRMazFcvl and pQBI-TAT (0.25 ⁇ g each).
  • TransIT-293 manufactured by Mirus was used for plasmid introduction, and the operation was performed as described in the attached manual.
  • the expression of GFP protein was confirmed by simultaneous introduction of pQBI- LTRgagGFP and pQBI-TAT in the group introduced with pQBI- LTRgagGFP and pQBI-TAT set as controls. This confirmed that the LTR promoter activity was induced in a TAT-dependent manner.
  • the pQBI-LTRMazFc vl-only well did not show any difference from the control in the wells.
  • the pQBI-LT RMazF and pQBI-TAT co-introduced groups showed clear cell growth compared to the control. Suppression was observed.
  • Retrovirus vector plasmid pDON—AI (Takara Bio) LTR promoter To eliminate one activity, the 3 'LTR U3 region was deleted from the Nhel site to the Sacl site and reconstructed, and the LTR promoter activity A self-inactivating retroviral vector plasmid pSIN that disappeared was obtained. Cleave the Pmel site of pSIN, dephosphorylate using Alkaline Phosphatase E. coli C75 (Takarabio), and insert the above expression cassette using DNA ligation kit Mighty Mix (Takara Bio) did. The plasmid constructed in this way was named pSIN-HLTR-MazF.
  • pMT vector [Gene Therapy, Genesis, pp. 11, pp. 94-99 (2004)] the plasmid vector PMTD3 in which the U3 region of the 3 'LTR lacks the region spanning the 43rd to 309th bases Produced.
  • the U3-R region and U3-TAR region of HIV used as internal promoters were obtained by PCR using the plasmid pSIN-HLTR-MazF prepared in Example 4- (1), respectively.
  • SEQ ID NOs: 4 and 5 show the nucleotide sequences of the primers 5 ′ HIV1 U3 and 3 ′ HIV1 R used for amplification of the U3-R region, respectively.
  • the 5 ′ HIV1 U3 and the primer of the base sequence described in SEQ ID NO: 6, 3 ′ HIV1 TAR were used in combination.
  • Mlul Both PCR amplified fragment, respectively, were digested with BamHI and inserted between MlulZBamHI site PMTD, 2 kinds of retrovirus vector plasmid P MTD3- U3R, was constructed pMTD3- U3TAR [0048]
  • the gene encoding MazF was obtained by PCR using the above plasmid pSIN-HLTR-MazF as a cage.
  • the nucleotide sequences of the two primers, 5 'MazF, 3, and MazF used for amplification are shown in SEQ ID NOs: 7 and 8, respectively.
  • the obtained amplified fragment was digested with BglII and BamHI and inserted into the BamHI site of pMTD3-U3R and pMTD3-U3TAR.
  • the thus constructed MazF-expressing retroviral vector plasmids were named pMTD3-U3R-MazF and pMTD3-U3TAR-MazF, respectively.
  • an expression plasmid was constructed by inserting a gene encoding the fluorescent protein eGFP into PMTD3-U3R.
  • the eGFP gene excised by digestion with BamHI and Bglll from the plasmid P GemT-Easy-eGFP [Journal 'Ob' Gene 'Medicine (J. Gene Med.), Pp. 6, 724-733 (2004)]
  • the contained DNA fragment is inserted into the BamHI site of pMTD3—U3R and inserted into the BamHI site of the eGFP expression plasmids pMTD3—U3R and pMTD3—U3TAR.
  • Two types of retroviral vector plasmids pMTD3—U3R—GFP, pMTD3 — U3TAR— GFP was constructed.
  • An envelope expression plasmid used to produce a GaLV pseudotype virus was constructed by the following procedure. First, a DNA fragment encoding the envelope protein of GaLV virus was amplified by PCR using genomic DNA prepared from PG13 cells (ATCC CRL-10686) as a cage. The nucleotide sequences of the two primers, 5, KpnI, 3, and Clal used for amplification are shown in SEQ ID NOs: 9 and 10, respectively.
  • CEM-SS cells were cultured in RPMI 1640 (Life 'Technologies) supplemented with 10% FBS at 37 ° C in the presence of 5% CO. CE in the well of the 6-well cell culture plate
  • each retrovirus vector (virus supernatant) prepared in Example 6- (1) and polybrene with a final concentration of 8 ⁇ gZml was added 1 ml of each retrovirus vector (virus supernatant) prepared in Example 6- (1) and polybrene with a final concentration of 8 ⁇ gZml to M—SS cells (5 ⁇ 10 5 Z2ml medium). Furthermore, the plate was centrifuged for 99 minutes at 25 ° C and 2800 rpm using a CR322 centrifuge (manufactured by Jouan) to promote the adsorption of the retroviral vector to the cells. Incubate the cells after centrifugation for 2 hours at 37 ° C in the presence of 5% CO. Then, transfer the cells to a T25 flask.
  • Polyclonal cell lines transformed with each virus were prepared by selecting with eneticin (G418).
  • CEM-SS is transfected
  • CEM-SS cells Control is transformed with pMTD3-U3R-GFP virus
  • A, B, and C are pSIN-HLTR-MazF
  • Results are shown in cells transformed with pMTD3-U3R-MazF virus and pMTD3-U3TAR-MazF virus.
  • the vertical axis represents the amount of p24 protein (unit: ngZml).
  • After infection 4, 7, The number of viable cells on the 10th day (Day 4, Day 7, Day 10) was counted by trypan blue excretion test. The results are shown in Fig. 3. In Fig.
  • diamonds are CEM SS cells without gene transfer
  • X are cells transformed with pMTD3-U3R-GFP virus
  • squares, triangles, and circles are pSIN-HLTR-MazF and pMTD3-U3R-MazF viruses, respectively.
  • the results are shown in cells transformed with pMTD3-U3TAR-MazF virus.
  • Ordinate viable cell number unit: 10 4).
  • Example 7 Inhibition of cell proliferation by expressing various mRNA interference erases in a Tat-dependent manner
  • Genomic DNA of Nitrosomonas europaea ATCC19718 strain was obtained from ATCC (ATCC No. 19718D).
  • PCR was performed using 50 ng of Nitrosomonas europaea ATCC 19718 genomic DNA, primers N E1181 -F and NE1181—R, using Pyrobest DNA polymerase (Takara Bio Inc.) to obtain a 362 bp amplified DNA fragment. It was. This amplified fragment was digested with restriction enzymes Ndel and Xhol and subjected to agarose electrophoresis, and a 341 bp DNA fragment was recovered from the gel after electrophoresis. After digestion with restriction enzymes Ndel and Xhol !, E.
  • coli strain JM109 was transformed with the recombinant plasmid obtained by connecting the above-mentioned 341 bp DNA fragment to pET21a vector (Novagen).
  • a plasmid was prepared from the thus obtained colony of the transformant, its nucleotide sequence was confirmed, and the expression vector was designated as pET-NE1181.
  • the nucleotide sequence encoding the NE1181 polypeptide derived from Nitrosomonas europaea ATCC1 9718 inserted in the expression vector pET-NEl 181 is shown in SEQ ID NO: 13, and the amino acid sequence of the polypeptide is shown in SEQ ID NO: 14, respectively.
  • a polypeptide having a histidine monotag consisting of 8 amino acid residues including 6 histidines added to the C-terminal of the polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1. Is expressed. Polypeptide translated from NE1181 is cutting the RNA recognizes a 4 base sequence of GAAU or AAAU, was sure synthetic oligoribonucleotides as substrates 0
  • the NE1181 gene has a recognition sequence that cleaves the NE1181 polypeptide itself in its mRNA, a gene in which the recognition sequence is deleted by changing the codon so that the encoded amino acid sequence is not changed. Artificially synthesized. Sequence the base sequence of this gene The number 15 is shown. Next, the artificially synthesized NE 1181 gene was inserted into the BamHI site of the retroviral vector plasmid pMTD3-U3TAR prepared in Example 4. The thus constructed NE1181-expressing retroviral vector plasmid was named pMTD3-U3TAR-N4.
  • the amino acid sequence and base sequence of DR0662 derived from Deinococcus radioduran Rl strain were obtained from the NCBI database (accession No. NP-294385 and NC-0 01263). Based on the nucleotide sequence information of DR0662, primer DR0662-F (SEQ ID NO: 16) and primer DR0662-R (SEQ ID NO: 17) were respectively synthesized so that the DNA of the region encoding the entire polypeptide could be amplified by PCR.
  • Genomic DNA of Deinococcus radioduran Rl strain was obtained from ATCC (ATCC No. 13939D).
  • PCR using Pyrobest DNA polymerase (manufactured by Takara Bio Inc.) was carried out using 50 ng of Deinococcus radioduran Rl genomic DNA and primers DR0662-F and DR0662-R to obtain a 368 bp amplified DNA fragment.
  • This amplified fragment was digested with restriction enzymes Ndel and Xhol and subjected to agarose electrophoresis, and a 347 bp DNA fragment was recovered from the gel after the electrophoresis.
  • Escherichia coli JM109 was transformed with the recombinant plasmid obtained by connecting the above-mentioned 347 bp DNA fragment to the pET21a vector (manufactured by Novagen) digested with restriction enzymes Ndel and Xhol.
  • a plasmid was prepared from the thus obtained colony of the transformant, and its base sequence was confirmed.
  • the plasmid was designated as an expression vector pET-DR0662.
  • the nucleotide sequence encoding the thus obtained DR0662 polypeptide derived from Deinococcus radioduran Rl strain inserted into the expression vector pET-DR0662 is shown in SEQ ID NO: 18, and the amino acid sequence of the polypeptide is shown in SEQ ID NO: 19, respectively.
  • a histidine-one tag comprising 8 amino acid residues including 6 histidines at the C-terminus of the polypeptide of SEQ ID NO: 1
  • the added polypeptide is expressed. It was confirmed that the polypeptide translated from DR0662 recognizes the 7 nucleotide sequence of UUC CUUU and cleaves RNA using synthetic oligoribonucleotide as a substrate.
  • the DR0662 gene was obtained by PCR, and the PCR-amplified DR0662 gene was inserted into the BamHI site of the retroviral vector plasmid PMTD3-U3TAR prepared in Example 4.
  • the thus constructed DR0662 expression retrovirus vector plasmid was named pMTD3-U3TAR-D3.
  • the primers used for amplification of the DR0662 gene are shown in SEQ ID NOs: 20 and 21, respectively.
  • the pQBI-Tat described in Example 1 was digested with the restriction enzyme SacII-EcoRV, and after blunting, it was inserted into the Pmel site of the retrovirus vector plasmid pDON-AI to construct pDON-Tat.
  • pDON-Tat was digested with BamHI-Xhol to remove the SV40 promoter and the neomycin phosphotransferase gene, and the IRES-ZsGreen gene fragment was obtained from Clontech's pIRES2-ZsGree nl. It was inserted downstream of the Tat gene of Ta t to construct pDON-Tat-ZsGreen.
  • G3T-hi cells (Takara Bio Inc.) were placed in a 6 cm diameter plate containing DMEM supplemented with 10% urine fetal serum (FBS), and 10 ⁇ g of retroviral vector plasmid pDON —Tat — Transfection was carried out by the canoresin phosphate method using ZsGreen and Retro virus Packaging Kit Ampho (Takarano). After 8 hours from the start of the transformation, the medium was replaced with a fresh one and the culture was continued. The culture medium was changed again 24 hours after the start of transfection, and after 24 hours, the culture supernatant was collected and filtered through a 0.45 m filter, and this filtrate was used as a virus supernatant in the following experiments.
  • the virus vector-transfected cells express Tat protein and ZsGreen, a green fluorescent protein.
  • G3T-hi cells (Takara Bio Inc.) were placed on a 6cm diameter plate containing DMEM supplemented with 10% ushi fetal serum (FBS), and 10 ⁇ g of retroviral vector plasmid (pMTD 3—U3TAR—MazF ⁇ pMTD3—U3TAR—N4, pMTD3—U3TAR—D3) and Retrovirus Packaging Kit Ampho (manufactured by Takara Bio Inc.) was used to carry out transfection using the calcium phosphate method. After 8 hours from the start of the transformation, the culture medium was replaced with a fresh one and the culture was continued. The culture medium was changed again 24 hours after the start of transfection, and after 24 hours, the culture supernatant was collected and filtered through a 0.45 m filter, and this filtrate was used as a virus supernatant in the following experiments.
  • FBS ushi fetal serum
  • CEM cells were cultured in RPMI-1640 supplemented with 10% FBS at 37 ° C in the presence of 5% CO.
  • Retronectin Tropa Bio
  • Polyclonal cell lines transformed with each virus were prepared by culturing for 3 weeks in a medium containing ml of dienetin (G418).
  • RetroNectin (Takara Bio) according to the protocol, and 0.5 ml of the Tat-expressing retrovirus vector prepared in Example 8 was added to the well at 32 ° C, 2000 X g, The retrovirus vector was adsorbed on the retronectin-coated plate by centrifugation for 2 hours. After removal of the supernatant, Maz F, NE1181, and DR0662-expressing CEM cell lines prepared in Example 9 were prepared at 1 ⁇ 10 5 cells / ml, respectively, and infected with lml per well. As a control, the mRNA interferase gene was introduced, and CEM cells were used to similarly infect a Tat-expressing retroviral vector.
  • Example 8 mRNA degradation by MazF expression and analysis of ribosomal RNA
  • a vector in which MazF and fluorescent protein ZsGreen are expressed from one mRNA was prepared by the following procedure.
  • the pQBI-LTRMazFcvl described in Example 2 was used as a saddle, the MazF gene was obtained by PCR, and the PCR-amplified MazF gene was inserted into the Sacl-BamHI site of pIRES2-ZsGreenl from Clontech.
  • the thus constructed plasmid that simultaneously expresses MazF and ZsGreen was named pMazF-IZ.
  • the primers used for amplification of the MazF gene are shown in SEQ ID NOs: 22 and 23.
  • plasmid pLuc-IZ in which the luciferase gene was inserted into the Sacl-BamHI site of pIRES2-ZsGreenl was constructed.
  • Table 2 shows the fluorescence intensity values of the transfected cells by flow cytometer analysis. As shown in Table 2, it was shown that the expression of ZsGreen was suppressed in cells into which pMazF-IZ had been introduced! This is probably because mRNA was degraded by the action of expressed MazF and translation of ZsGreen was suppressed. On the other hand, 28s and 18s ribosomes by electrophoretic analysis Table 3 shows the proportions of RNA.
  • pMT-MazE by inserting the MazE gene having the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 24 into the BamHI-Xhol site of the pMT vector [Gene Therapy, 11: 94-99 (2004)] Built.
  • a fragment containing the SV40 promoter and the neomycin phosphotransferase gene obtained by digesting Sail-Xhol from pDON-AI was inserted into the Xhol site of pMT-MazE.
  • the obtained MazE-expressing retroviral vector plasmid was named pMSN-MazE.
  • G3T-hi cells (Takara Bio Inc.) were placed on a 6cm-diameter plate containing DMEM supplemented with 10% urine fetal serum (FBS), and 10 ⁇ g of retroviral vector plasmid pMSN — MazE And Retrovirus Packaging Kit Ampho (Takara Bio Inc.) were used for transfection by the calcium phosphate method. After 8 hours from the start of the transformation, the culture medium was replaced with a fresh one and the culture was continued. The culture medium was changed again 24 hours after the start of transfection, and after 24 hours, the culture supernatant was collected and filtered through a 0.45 m filter, and this filtrate was used as MSN-MazE virus supernatant.
  • FBS urine fetal serum
  • a polyclonal cell line 293-MazE that constitutively expresses MazE was prepared by culturing it in a medium containing mgZml of dienetin (G418) for 2 weeks.
  • neomycin phosphotransferase gene was removed from the pSIN-HLTR-MazF described in Example 4, and a retroviral vector plasmid pSINH-HLTR-MazF into which a hygromycin resistance gene was inserted was constructed instead.
  • G3T-hi cells (manufactured by Takara Bio Inc.) were placed in a 6 cm diameter plate containing DMEM supplemented with 10% urine fetal serum (FBS), and 10 ⁇ g of retroviral vector plasmid pSINH — HLTR — Transfection was performed by the canoresin phosphate method using MazF and Retro virus Packaging Kit Ampho (manufactured by Takara Bio Inc.). After 8 hours from the start of the transformation, the medium was replaced with a fresh one and the culture was continued.
  • FBS urine fetal serum
  • the medium was changed again 24 hours after the start of transfection, and after 24 hours, the culture supernatant was collected and filtered through a 0.45 m filter, and this filtrate was used as the SINH-HLTR-MazF virus supernatant.
  • Retronectin (Takara Bio Inc.) is coated on an untreated 24-well plate according to the protocol, and 0.5 ml of SINH-HLTR-MazF virus vector is added to the well and centrifuged at 32 ° C, 2000 g for 2 hours to express MazF.
  • the retroviral vector was adsorbed on the retronectin coat plate.
  • 293-MazE cells and 293 cells were prepared in IX 10 5 Zm 1 and infected with lml per well. 24:00 in the presence of 37 ° C and 5% CO
  • the transfected cells were cultured in 0.2 mgZml of hygromycin B-containing medium for 2 weeks to prepare polyclonal cell lines 293-MazE-Maz F and 293-MazF.
  • Retronectin manufactured by Takara Bio Inc.
  • 0.5 ml of the Tat-expressing retroviral vector prepared in Example 8 was transferred to the well and placed at 32 ° C, retroviral vector can be It was made to adsorb
  • 293-MazE-MazF and 293-MazF cell lines were prepared to 1 ⁇ 10 5 Zml and infected with lml per tool. As a control, 293 cells were also infected. Two days after the infection, cell growth was observed by microscopic observation.
  • the present invention provides a nucleic acid construct effective for the treatment and prevention of human immunodeficiency virus (HIV) infection.
  • Cells into which the nucleic acid construct has been introduced can inhibit HIV replication, and thus are effective in treating and preventing HIV infection.
  • HIV human immunodeficiency virus
  • SEQ ID NO 3 synthetic DNA encoding MazF.
  • Primer NE1181 F to amplify a DNA encoding NE1181 polypeptide.
  • SEQ ID NO 15 Synthetic DNA encoding NE1181 polypeptide.
  • Primer DR0662 F to amplify a DNA encoding DR0662 polypeptide.
  • Primer DR0662 R to amplify a DNA encoding DR0662 polypeptide.
  • SEQ ID NO 20 Primer to amplify a DNA encoding DR0662 polypeptide.
  • SEQ ID NO 21 Primer to amplify a DNA encoding DR0662 polypeptide.
  • SEQ ID NO 22 Primer to amplify a DNA encoding MazF.
  • SEQ ID NO: 23 Primer to amplify a DNA encoding MazF.

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Abstract

　ヒト免疫不全ウイルスのトランス作用因子により転写が誘導される転写調節配列と、前記配列により発現の制御が可能な形態に配置された一本鎖ＲＮＡ特異的なエンドリボヌクレア－ゼ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子とを含有する核酸、ならびに当該核酸を細胞に導入することを特徴とする、ヒト免疫不全ウイルスの複製が抑制される細胞の製造方法およびヒト免疫不全ウイルス感染症の治療または予防方法。

Description

明 細 書
免疫不全ウィルス感染症の治療または予防のための核酸
技術分野
[0001] 本発明は、免疫不全ウィルスの感染に起因する疾患の治療または予防に有用な核 酸構築物に関する。 背景技術
[0002] ヒト免疫不全ウィルス（human Immunodeficiency virus； HIV)は CD4分子を 発現する細胞、例えば T細胞に感染し、前記細胞を破壊する。このため、 HIVの感染 を受けたヒトの体内では CD4陽性 T細胞 (ヘルパー T細胞）の減少と細胞性免疫の 低下が起こる。ついには重度の免疫不全状態に陥り、カリ-肺炎のような日和見感染 症を発症する。この状態は後天性免疫不全症候群（acquired immunodeficiency syndrome ; AIDS)と称されて!/、る。
[0003] HIV感染症の治療方法として、 HIV生活環を遮断する抗ウィルス剤（逆転写酵素 阻害剤、プロテアーゼ阻害剤等)やワクチンの開発が行われており、いくつかの抗ゥ ィルス剤がすでに実用化されている。しかし、変異頻度の高い HIVでは感染した個 体内で前記の薬剤の効果の及ばない変異体の出現することがあり、必ずしも特効薬 として完成された状況にはない。別のアプローチである、 RNAデコイやリボザィムの ような核酸、トランスドミナント変異タンパクや細胞内抗体のようなタンパク質を有効成 分として HIVの増殖を阻止する遺伝子治療薬を開発する試みもいまだ完成の域に は達していない。
[0004] また、 HIVの感染した細胞に特異的に細胞死を起こさせる方法が考案されて 、る ( 例えば特許文献 1、非特許文献 1、 2、 3)。前記の方法は HIV由来の LTRプロモー ターの下流に細胞毒性を示す産物をコードする遺伝子を接続するものである力 こ れまでのところ臨床的に応用された例は知られていない。特許文献 2 (米国特許 583 7510号
)には前記の細胞毒性を示す産物としてリボヌクレアーゼを使用することが記載され ているが、リボヌクレアーゼによる HIV感染細胞の細胞死は確認されていない。また、 代表的なリボヌクレアーゼであるヒト脾臓由来リボヌクレアーゼ (RNasel)は細胞質に 存在するリボヌクレアーゼ 'インヒビターにより阻害されることが知られており（非特許 文献 4)、前記の目的に適したものとは言えない。
[0005] V、くつかの原核生物のプラスミドは、宿主でのプラスミドを維持するためにプラスミド が脱落した宿主を殺す post— segregation killing (PSK)の機能を有することが報 告されている。これらのプラスミドにはトキシン アンチトキシン遺伝子が存在している 。アンチトキシンは細胞内でトキシンと結合しトキシンを不活性ィ匕している力 アンチト キシンはプロテアーゼに対して分解されやすく、アンチトキシンがプロテアーゼにより 分解されると安定なトキシンが活性化される。このようなトキシン アンチトキシン遺伝 子はほとんどの原核生物のクロモソームにも存在し、さまざまなストレスに対応し、プロ グラム細胞死の機能を担っている。これらのトキシンの機能はまだすべて明らかにな つていないが、 mazE— mazF系のトキシンである MazF (非特許文献 5)、 peml— pe mK系トキシンである PemK (非特許文献 6)はどちらも配列特異的なリボヌクレアーゼ 活性を有することが知られている。さらに、これらのトキシンを利用して mRNAを分解 し、前記トキシンの切断する配列をあら力じめ除いておいた目的のタンパク質をコー ドする mRNA力 の翻訳だけを行わせ、高純度の目的タンパク質を取得する方法が 提案されている (特許文献 3)
[0006] 特許文献 1：米国特許第 5554528号明細書
特許文献 2：米国特許第 5837510号明細書
特許文献 3 :国際公開第 2004Z113498号パンフレット
非特許文献 1：ヒューマン'ジーン'セラピー（Hum. Gene Therapy)、第 2卷、 p5 3 - 61 (1991)
非特許文献 2：プロシーディンダス ·ォブ ·ナショナル ·ァカデミ一'ォブ ·サイエンシー ズ'ォブ 'USA (Proc. Natl. Acad. Sci. USA)、第 91卷、 p365— 369 (19 94)
非特許文献 3 :ヒューマン'ジーン'セラピー（Hum. Gene Therapy)、第 10卷、 p 103 - 112 (1999)
非特許文献 4 : Proc. Natl. Acad. Sci. USA、第 95卷、 pl0407— 10412 ( 1998)
非特許文献 5 :モレキユラ一'セル（Molecular Cell)、第 12卷、 p913— 920 (2003 )
非特許文献 6 :ジャーナル'ォブ 'バイオロジカル 'ケミストリー (J. Biol. Chem. )、 第 279卷、 P20678- 20684 (2004)
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0007] 本発明は上記従来技術を鑑みて行われたものであり、本発明の目的はより有効性 の高 、HIV感染症の治療方法を提供することにある。
課題を解決するための手段
[0008] 本発明者らは、ヒト免疫不全ウィルスのトランス作用因子により誘導される転写調節 配列の下流に一本鎖 RNA特異的なエンドリボヌクレアーゼ活性を有するポリべプチ ドをコードする遺伝子を接続した核酸構築物が導入された細胞では、 HIVの感染に よって一本鎖 RNA特異的なエンドリボヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドの発現 が誘導され、細胞内の mRNAが分解されること、この結果、前記細胞での HIVの複 製と他の細胞への感染が防止できることを見出し、本発明を完成させた。
[0009] すなわち、本発明は、
[1]ヒト免疫不全ウィルスのトランス作用因子により転写が誘導される転写調節配列と 、前記配列により発現の制御が可能な形態に配置された一本鎖 RNA特異的なェン ドリボヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子とを含有する核酸、 [2]Tatタンパク質および Zまたは Revタンパク質により転写が誘導される転写調節 配列を含有する [1]の核酸、
[3]ヒト免疫不全ウィルスの LTRの下流に一本鎖 RNA特異的なエンドリボヌクレア ゼ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子が配置されて 、る [1]の核酸、
[4]一本鎖 RNA特異的なエンドリボヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドが塩基配 列特異的に RNAを切断する活性を有するものである [1]の核酸、
[5]—本鎖 RNA特異的なエンドリボヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドが MazF タンパク質である [1]の核酸、 [6]ベクターに組み込まれている請求項 1〜4いずれか 1項に記載の核酸。
[7] [1]〜 [6]いずれかの核酸を細胞に導入することを特徴とする、ヒト免疫不全ウイ ルスの複製が抑制される細胞の製造方法、
[8]細胞が T細胞または T細胞前駆細胞を含む細胞集団である [7]の方法、
[9]核酸がウィルスベクターにより細胞に導入されることを特徴とする [7]の方法、 [10]レトロウイルスベクターまたはアデノウイルスベクターにより核酸が細胞に導入さ れる [9]の方法、
[11] [1]〜 [6]いずれかの核酸を細胞に導入することを特徴とする、ヒト免疫不全ゥ ィルス感染症の治療または予防方法、
に関する。
発明の効果
[0010] 本発明により、細胞内においてヒト免疫不全ウィルス (HIV)の複製を抑制すること を可能とする核酸構築物が提供される。前記の核酸構築物は、 HIV感染症の治療に 有用である。
図面の簡単な説明
[0011] [図 1]HIV感染細胞の培養上清中の、 HIV由来のタンパク質量を示す図である。
[図 2]HIV感染細胞の培養上清中の、 HIV由来のタンパク質量を示す図である。
[図 3]HIV感染細胞の培養における、生存細胞数の経時変化を示す図である。 発明を実施するための最良の形態
[0012] 本発明の核酸構築物は、ヒト免疫不全ウィルスのトランス作用因子により転写が誘 導される転写調節配列と、前記配列により発現の制御が可能な形態に配置された一 本鎖 RNA特異的なエンドリボヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドをコードする遺 伝子とにより構成されている。
[0013] ヒト免疫不全ウィルスのトランス作用因子により転写が誘導される転写調節配列に は特に限定はないが、例えば、 HIVの Tatタンパク質により転写が誘導される転写調 節配列を使用することができる。 Tatタンパク質は HIVの LTRプロモーターの作用に より転写が開始された RNA内に存在する TAR (trans -activation responsive element)配列に結合してそれより下流の転写を活性ィ匕することから、本発明には、 転写開始点の下流に TAR領域の塩基配列を有する転写調節配列を使用することが できる。特に好適には、 HIVの LTRや、前記 LTRに適切な改変を施した転写調節配 列が使用される。前記の改変としては、例えばプロモーター内に存在する宿主細胞 由来の転写因子との結合部位の欠失や Tat特異的な転写に不要な領域の欠失が例 示される。前者の改変により、宿主由来転写因子による、 HIV感染とは無関係な転写 のレベルを低下させることが可能である。このような転写調節配列の改変については 、例えば非特許文献 2に記載されている。また、後者の改変として LTRの U5領域や TAR配列より下流の領域 (R領域の一部及び U5領域)の欠失が例示される。このよ うな欠失 LTRを有する本発明の核酸は、当該核酸を保持する高タイターのレトロウイ ルスベクターを作製する際に有利である。
[0014] また、 HIVゲノムに存在する RRE (Rev -responsible element)は、 HIV由来の トランス作用因子である Revタンパク質との相互作用によってタンパク質の発現を促 進することが知られている（非特許文献 3)。さらに、 gag, pol遺伝子内に存在する IN Sと呼ばれる領域は、 Revタンパク質の非存在下では HIVの mRNAの転写を抑制し ているが、前記の RREならびに Revタンパク質との相互作用によってこの抑制作用 が解除されることが知られている [ジャーナル'ォブ 'ウイロロジー (J. Virol. )、第 66 卷、 p7176— 7182 (1992) ]。した力 ^つて、本発明の核酸にお ヽて、外来のポジぺプ チドをコードする遺伝子の 3'側にこれらの転写調節配列を^ aみ込むことにより、前記 核酸にコードされるポリペプチドを Revタンパク質依存的に、すなわち HIV感染依存 的〖こ発現させることができる。
[0015] 前記の HIV由来のトランス作用因子と相互作用する配列は、当該配列が本来的に 組み込まれている機能的配列、例えばプロモーターとともに使用してもよぐ異種の 機能的配列と組み合わせて使用してもよい。例えば、本発明の核酸の導入が望まれ る細胞において mRNAの転写を開始しうる、 HIV由来ではないプロモーターと前記 の配列を組み合わせて構築された配列も、本発明に使用される「転写調節配列」に 包含される。
[0016] 本発明の核酸は、上記の転写調節配列に、前記転写調節配列によって発現の制 御が可能な形態で一本鎖 RNA特異的なエンドリボヌクレア ゼ活性を有するポリべ プチドをコードする遺伝子を接続することにより作製される。
[0017] 本明細書において、一本鎖 RNA特異的なエンドリボヌクレア一ゼ活性とは、構成 塩基として少なくとも 1分子のリボヌクレオチドを含有する一本鎖核酸中の、リボヌタレ ォチドの 3 '側のリン酸ジエステル結合を加水分解する活性を意味する。前記活性に より加水分解された核酸は、水酸基を有する 3'末端とリン酸基を有する 5'末端、リン 酸基を有する 3'末端と水酸基を有する 5 '末端、もしくは 2' , 3'サイクリックホスフエ一 トと水酸基を有する 5'末端を生じる。本発明を特に限定するものではないが、二本鎖 核酸、例えば二本鎖 RNA、 RNA— DNAハイブリッド等は切断できないポリペプチド を本発明に使用することができる。前記の基質特異性は、一本鎖 RNAである HIVの ゲノムを効率よく分解するという観点力ゝら本発明に適している。特に好適には、 RNA をその塩基配列特異的に切断する活性を有するもの、リボソーム非依存的に mRNA を分解しうるものが本発明に使用される。前記のポリペプチドとしては、後述の MazF や PemKのような、 mRNA Intereferaseと称される酵素が例示される（特許文献 2)
[0018] 本発明に使用される、配列特異性を有し、リボソーム非依存的に一本鎖 RNAを分 解する活性を有するポリペプチドは、本発明を特に限定するものではないが、例えば 微生物由来のものであってもよい。この場合、前記ポリペプチドをコードする遺伝子 は微生物のゲノムやプラスミドより単離することができる。例えば、非特許文献 4、 5に 記載されたトキシン一アンチトキシン系のトキシンを構成するエンドリボヌクレアーゼで ある MazFや PemKをコードする遺伝子を本発明に使用することができる。 MazFは 一本鎖 RNA中の 5し A/CA-3'の配列を、 PemKは主に 5'-U/A(C,A or U)-3，を切断 する酵素である。さらに、公知のデータベースから前記の MazFや PemKのアミノ酸 配列との間に高！ヽ相同性を有するアミノ酸配列をコードする遺伝子を選択し、これを 単離して本発明に使用することもできる。すでに藍藻類や古細菌を含む多数の微生 物から前記の活性を有するポリペプチドが見出されている [Bacillus subtilis 168 (NP— 388347 ;5'- U/ACAU- 3')、 Neisseria meningitidis ATCC13O9O (NP_2750 29 ; 5し/ ACU- 3，）、 Deinococcus radiodurans Rl (NP— 294385 ; 5し UU/CCUUU- 3，）、 Micobacterium bovis BCG (NP— 855664;5，- U/CCUU- 3，）、 Nostoc sp. PCC7120 (NP— 487251 ;5'— U/ACA— 3')、 Enterococcus faecalis V583 (NP— 816 859 ;5，— U/ACAU— 3')、 Nitrosomonas europaea ATCC19718 (NP— 841355 ;5'— GA/AU- 3'、 5'- G/AAU- 3'、 5し AA/AU- 3'または 5し A/AAU- 3，）、 Pyrococcus hor ikoshii ATCC700860 (NP— 143082 ;5，— U/GG— 3'、 5'— U/UG— 3'、 5'— U/GA— 3'、 5'— A/GG- 3'または 5'- A/AG- 3')：カツコ内は NCBI Protein Databaseにおける前記 活性を有するポリペプチドの受託番号、ならびに該ポリペプチドが認識、切断する塩 基配列をそれぞれ示す]。好適には、本発明には MazFをコードする遺伝子が使用さ れる。 MazFのアミノ酸配列、ならびに MazFをコードする遺伝子の塩基配列をそれ ぞれ配列表の配列番号 1、 2に示す。
[0019] 前記の、トキシン アンチトキシン系のトキシンを構成するエンドリボヌクレアーゼは 、ヒト胎盤由来リボヌクレアーゼインヒビターのような、細胞質リボヌクレアーゼインヒビ ターにより阻害されることがないので (特許文献 3)、本発明への使用に適している。さ らに、前記のエンドリボヌクレアーゼを持続的に発現させた場合、細胞では新たな蛋 白質の合成が起こらなくなるため、細胞は増殖阻害を起こし、さらには細胞死が誘導 される。しカゝし前記酵素はリボソームを構成した状態の rRNAや高次構造を形成した tRNAを分解しな!、ため、本発明の核酸が導入された細胞にお!ヽて HIVの RNAが 分解、排除され、かつ前記のエンドリボヌクレアーゼの発現が停止すると、細胞は増 殖能を回復することができる。したがって、 HIVがプロウィルスとして染色体に組み込 まれた細胞であっても、ウィルスの複製が妨げられた状態の細胞は増殖能を維持し ている。生体内の T細胞数を大きく低下させることなく HIVの複製、 AIDS発症を防止 できる点で、前記のエンドリボヌクレアーゼの使用は有利である。
[0020] トキシン アンチトキシン系のトキシンを構成するエンドリボヌクレアーゼは 3〜7塩 基程度の短 、塩基配列を認識して一本鎖 RNAを切断することから、前記のエンドリ ボヌクレアーゼが細胞内で発現された場合には細胞内のほとんどの mRNAが分解さ れて細胞内でのタンパク質合成、細胞増殖が阻害される。また、 HIVのゲノムである RNAをも切断されるため、 HIVの複製、細胞外への放出（出芽)も防止される。さら に、 HIVゲノムにコードされているポリペプチドの発現も阻止されることから、たとえば 細胞外に放出された Tatタンパク質による HIV非感染細胞のアポトーシス誘発等も 抑制される。
[0021] HIV感染症の治療または予防のためには、本発明の核酸構築物は HIVの感染す る可能性のある細胞、すなわち CD4陽性細胞を含む細胞 (細胞群）に導入されること が望まれる。したがって、本発明では CD4陽性細胞 (たとえば T細胞)や CD4陽性細 胞に分ィ匕しうる前駆細胞 (たとえば造血幹細胞）、あるいは前記の細胞を含有する細 胞集団を標的細胞として遺伝子導入が実施される。 HIVの感染を受ける可能性のあ る細胞に網羅的に前記の核酸構築物を導入する観点から、本発明では造血幹細胞 または当該細胞を含有する細胞集団を標的とすることが好ましい。前記の細胞は、 C D4陽性細胞やその前駆細胞を含有するものであれば特に限定はなぐ個体より採 取された血液細胞 (末梢血細胞、臍帯血細胞)、骨髄細胞や、前記の細胞から公知 方法により分画された CD4陽性細胞、 CD4陽性細胞の前駆細胞、造血幹細胞等が 例示される。
[0022] 本発明の核酸構築物を細胞に導入する方法には特に限定はない。たとえば、本発 明の核酸をプラスミドベクターやウィルスベクターに組み込んだうえ、適切な方法で細 胞に導入すればよい。プラスミドベクターを使用する場合は、リン酸カルシウム法、力 チォニック .リピド法、リボソーム法、エレクト口ポーレーシヨン法等の遺伝子導入法が 使用できる。レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウィルスべク ター、ヘルぺスウィルスベクター等のウィルスベクターに組み込んだ場合には、各ゥ ィルスに適した条件で目的の細胞に感染させ、本発明の核酸を導入すればよい。本 発明の核酸を染色体上に組み込む能力を有するレトロウイルスベクターは本発明に 好適である。
[0023] レトロウイルスを使用する態様において、本発明に使用されるレトロウイルスベクター には特に限定はない。無制限な感染、遺伝子導入を防止する観点カゝらは、本発明に は複製能欠損レトロウイルスベクターが好適である。該ベクターは感染した細胞中で 自己複製できないように複製能を欠損させてあり、非病原性である。これらのベクター は脊椎動物細胞、特に、哺乳動物細胞のような宿主細胞に侵入し、その染色体 DN A中に、ベクターに挿入された外来遺伝子を安定に組み込むことができる。公知の複 製能欠損レトロウイルスベクターとしては、 MFGベクターや α— SGCベクター（WO 92Z07943号国際公開パンフレット）、 pBabe [Nucleic Acids Research、第 18 卷、第 3587〜3596頁（1990) ]、 pLXIN (クロンテック社製）、 pDON— AI (タカラ バイオ社製）等のレトロウイルスベクター、レンチウィルスベクターあるいはこれらを改 変したベクターが例示される。前記のレンチウィルスベクターとしてはヒト免疫不全ゥ ィルス (HIV)由来ベクター [野生型 LTRを有する HIVベクター（例えば米国特許 56 65577号）や改変された LTRを有する HIVベクター（例えば pLenti6ZV5：インビト ロジェン社製）]、サル免疫不全ウィルス（SIV)由来ベクター [例えばヒューマン'ジー ン 'セラピー、第 11卷、 pl863— 1874 (2000) ]等が例示される力 これらに限定さ れるものではない。
[0024] 前記のレトロウイルスベクターは公知の方法で調製し、本発明に使用すればよ!、。
調製方法には特に限定はなぐ使用するレトロウイルスベクターに適したレトロウィル ス産生細胞を培養し、その培養上清を採取して本発明に使用することができる。前記 のレトロウイルス産生細胞は安定にレトロウイルス粒子を上清中に生産するもの、レト ロウィルスベクタープラスミドのトランスフエクシヨンにより一過性にレトロウイルス粒子 を生産するものの 、ずれでも構わな 、。
[0025] 上記のレトロウイルス産生細胞の作製には公知のパッケージング細胞株、例えば P G13 (ATCC CRL— 10686)、 PA317 (ATCC CRL— 9078)、 GP+E— 86や GP + envAm— 12 (米国特許第 5, 278, 056号）、 Psi— Crip [Proc. Natl. Ac ad. Sci. USA、第 85卷、第 6460〜6464頁（1988) ]等を使用してもよい。また 、トランスフエクシヨン効率の高い 293細胞や 293T細胞を用いてレトロウイルス産生 細胞を作製することもできる。
[0026] 本発明には、当該レトロウイルスベクターのゲノムが由来するものとは異種のウィル ス由来のエンベロープを有する、シユードタイプ（pseudotyped)パッケージングによ つて作製されたレトロウイルスも使用することができる。例えばモロニ一マウス白血病 ウィルス (MoMLV)、テナガザル白血病ウィルス (GaLV)、水泡性口内炎ウィルス ( VSV)、ネコ内在性ウィルス (feline endogenous virus)由来のエンベロープゃェ ンべロープとして機能しうるタンパク質を有するシユードタイプレトロウイルスを使用す ることができる。さらに、糖鎖合成に関与する酵素遺伝子などを導入したレトロウィル ス産生細胞を用いて作製された、糖鎖修飾を受けたタンパクをその表面に有するレト ロウィルスベクターも本発明に使用できる。
[0027] 本発明では、上記の各種ベクター、好適には前記のレトロウイルスベクターに、ヒト 免疫不全ウィルスのトランス作用因子により転写が誘導される転写調節配列と、前記 の転写調節配列の下流に配置された一本鎖 RNA特異的なエンドリボヌクレアーゼ 活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子とが挿入される。さらに、前記遺伝子の 転写を制御するオペレーター、ェンハンサー、ターミネータ一等の配列を含有するこ とができる。また、前記の遺伝子とは独立して、本発明の核酸には遺伝子導入された 細胞の選択を可能にする適当なマーカー遺伝子 (例えば薬剤耐性遺伝子、蛍光タ ンパク質をコードする遺伝子、 β ガラクトシダーゼゃルシフェラーゼのようなレポ一 ターとして機能しうる酵素をコードする遺伝子等）、レセプター遺伝子等を有していて もよい。さら〖こ、本発明の核酸は遺伝子導入細胞による治療が完遂した場合、あるい は何らかの副作用が生じた場合に生体内力も遺伝子導入細胞を排除する目的で、 自殺遺伝子を搭載して!/ヽても良い。
[0028] 本発明の 1つの態様では、生物個体より採取された細胞に生体外でベクターを導 入するェクス 'ビボ (ex vivo)遺伝子導入が使用される。ウィルスベクターを使用す る場合、生体より採取された前記の標的細胞とウィルスベクター、たとえばウィルス産 生細胞の培養液上清や前記上清カゝら精製されたウィルスベクターとを混合し、適切 な条件でインキュベートすることにより、遺伝子の導入が達成される。イン'ビボ (in vi vo)で遺伝子導入可能なベクター、例えばアデノウイルスベクターを使用する場合に は、本発明の核酸を含有するベクターを個体に直接投与してもよい。
[0029] レトロウイルスベクターをェタス'ビボ遺伝子導入に使用する場合、レトロウイルス結 合活性を有する機能性物質の存在下に標的細胞にレトロウイルスベクターを高効率 で感染させることができる。
[0030] レトロウイルス結合活性を有する機能性物質を使用する遺伝子導入方法は、例え ば WO 95Z26200号国際公開ノ ンフレット、 WO 97/18318号国際公開パンフ レット、 Nature Medicineゝ第 2卷、第 876— 882頁（1996)等に記載されている。 当該方法には、レトロウイルス結合部位と標的細胞結合部位の両方を同一分子上に 有する機能性物質を使用する方法、レトロウイルス結合部位を有する機能性物質と 標的細胞結合部位とを有する機能性物質との混合物を使用する方法とがあり、本発 明には 、ずれの方法にも使用することができる。
[0031] 上記の機能性物質は、レトロウイルス結合活性および Zまたは標的細胞結合活性 を有するものであれば特に限定はない。例えば、フイブロネクチン由来のへパリン結 合ドメイン (へノ リン IIドメイン）、線維芽細胞増殖因子、 V型コラーゲンのフラグメン ト、前記のポリペプチドの誘導体や改変体、ポリリジン、 DEAEデキストランなどがレト ロウィルス結合活性を有する機能性物質として例示される。また、標的細胞結合活性 を有する機能性物質には、所望の標的細胞に結合する能力を有する任意の物質を 使用することができる。特に本発明を限定するものではないが、例えば、細胞結合活 性を有するポリペプチド (細胞骨格タンパク質等）、細胞もしくは細胞表面の生体分子 を認識する抗体、成長因子、サイト力イン、糖鎖等が標的細胞結合活性を有する機 能性物質として例示される。
[0032] 本発明の好適な態様の 1つとして、フイブロネクチン由来のへパリン結合ドメインを 含有する機能性物質の存在下に標的細胞への遺伝子導入を行う方法が挙げられる 。前記機能性物質は、好適には、細胞接着ドメインとへノ^ン結合ドメインの両者を有 するフイブロネクチンフラグメントが例示される。前記細胞接着ドメインとしては、 VLA 5および Zまたは VLA— 4への結合領域ポリペプチドが特に好適である。前記の フイブロネクチンフラグメントは、生体より精製されたフイブロネクチン力 プロテア一 ゼ消化などの手段で調製することができ、また、組換え DNA技術により作製すること ができる。例えば、レトロネクチン (登録商標）としてタカラバィォ社から発売されてい る組換えフイブロネクチンフラグメントは本発明に好適である。
[0033] 以上のように、本発明はヒト免疫不全ウィルス感染症の治療または予防に有用な細 胞組成物の製造に有用である。さらに、本発明により前記の細胞組成物を使用する、 HIV感染症の治療方法または予防方法も提供される。すなわち、本発明の核酸を導 入された細胞を個体に投与することにより、個体中の HIV感染細胞を減少させ、もし くは該細胞における HIVの複製を抑制することが可能となる。
[0034] 本発明の核酸が導入された CD4陽性細胞や、本発明の核酸が導入された CD4陽 性細胞の前駆細胞 (造血幹細胞等)力 分ィ匕した CD4陽性細胞は、 HIVの感染を受 けて細胞内に HIV由来のトランス作用因子が生成した場合には、転写調節配列の下 流に位置する一本鎖 RNA特異的なエンドリボヌクレアーゼ活性を有するポリべプチ ドをコードする遺伝子の発現が誘導されるため、生成したポリペプチドにより細胞内の mRNAが分解され、蛋白質の生合成が阻害される。この際、 HIVの複製過程で生成 される RNAゲノムも分解を受ける。このように、 HIVゲノムにコードされているポリぺプ チドの翻訳、 HIVゲノムの複製が阻害されることから、新たな感染性 HIV粒子の生成 と他の細胞への感染が防止される。
[0035] 前記の、 MazFや PemKのようなトキシン アンチトキシン系のトキシンを構成する エンドリボヌクレアーゼは、対応するアンチトキシン（MazEや Peml)が共存する場合 にはその活¾が抑制される。したがってトキシンであるエンドリボヌクレアーゼ遺伝子 を本発明に使用する場合にアンチトキシン遺伝子を併用することにより、非 HIV感染 細胞における、エンドリボヌクレアーゼ活性に起因する細胞毒性の発現を抑制または 制御することができる。前記の態様の一例としては、たとえば適当なハウスキーピング 遺伝子 (グリセ口アルデヒド 3リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子、 βーァクチン遺伝子等） のプロモーターの下流にアンチトキシン遺伝子を接続して非 HIV感染細胞において 微量のアンチトキシンを発現させておくことにより、トキシンの活性をアンチトキシンの 作用によって抑制することが考えられる。この細胞に HIVが感染した際には、前記の トランス作用因子の作用によってトキシンの発現が促進され、アンチトキシンの発現量 を上回った場合には初めて細胞毒性が発揮されるようになる。こうして、 HIV感染細 胞に対する細胞毒性の選択性をより向上させることができる。
[0036] 従来報告されていた、細胞毒性を有するタンパク質 (たとえばジフテリアトキシン等） や無毒の前駆体を細胞毒性を有する化合物に活性ィ匕する酵素 (たとえばチミジンキ ナーゼ等）の作用により HIV感染細胞を破壊する方法では、破壊後の細胞力 放出 されるトキシンや活性化されたィ匕合物が非 HIV感染細胞に侵入して細胞毒性を示す 可能性があるが、一本鎖 RNA特異的なエンドリボヌクレアーゼ活性を有するポリぺプ チドを使用する本発明の方法では、周囲の細胞が障害を受けるおそれは少ない。
[0037] 現在では、 3〜4種類の抗ウィルス薬 (逆転写酵素阻害剤、プロテアーゼ阻害剤等） を併用する多剤併用療法 (HAART)が HIV感染症の治療法の主流である。前記の 治療を行うことにより、 HIV感染患者血液中の HIV量は顕著に減少し、臨床症状の 改善が見られるようになる。しかし、ウィルス粒子の産生を積極的に行わない HIV感 染細胞 (長期生存型感染細胞：リザーバー）の存在のため、 HIVの完全な排除は困 難である。本発明は前記の HAARTと組み合わせて実施してもよ ヽ。
[0038] 本発明の核酸構築物が導入された導入された細胞では、 Tatの発現に応じてェン ドリボヌクレア ゼ活性を有するポリペプチドが発現される。 HIVがプロウィルスとして 染色体に組み込まれた細胞に前記の核酸構築物が存在して！/ヽる場合、プロウィルス 力 の RNAの転写が開始されるとこの RN Aから翻訳される Tatによってエンドリボヌ クレアーゼ活性を有するポリペプチドの発現が誘導され、 HIVゲノムを含む細胞内の 一本鎖 RNAが分解される。この結果、当該細胞では HIVの複製、出芽が阻止される 。 HIV由来の RNAが分解されて Tatの発現が停止し、かつ発現されていた Tatが細 胞から消失するとエンドリボヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドの発現も停止する 。一本鎖 RNAに特異的に作用するエンドリボヌクレア ゼ活性を有するポリペプチド を使用する本発明においては、細胞内のリボソームや tRNAが破壊されないため（非 特許文献 5)、前記ポリペプチドの発現の停止とともに通常のタンパク質合成が再開 されるため、この時点で破壊されて 、な 、細胞は増殖を再開する。
実施例
[0039] 以下に実施例をもって本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は実施例の範囲 に何ら限定されるものではな 、。
[0040] 実施例 1 Tat発現プラスミドの構築
プラスミド pQBI—tatGFP (Quantum Biotechnologies Inc.社製）より Tatゝ sg GFPのそれぞれをコードする領域を SacII、 EcoRIの二重消化によって除去したうえ 、 5，側に開始コドンを付加し、 3，側に終止コドンを新たに付加した Tatを挿入した。こ うして構築されたプラスミドを pQBI— TATと命名した。前記プラスミドは CMVプロモ 一ター Zェンノヽンサ一の制御下に Tatタンパク質を発現することができるプラスミドで ある。
[0041] 実施例 2 MazF発現プラスミドの構築 プラスミド pQBI—LTRgagGFP (Quantum Biotechnologies Inc.社製）に揷 入されている gag、 sgGFP、 RREのそれぞれをコードする領域を制限酵素 Sall、 Xba Iの二重消化によって除去したうえ、ここに配列表の配列番号 3に示す塩基配列の M azFタンパクをコードする、化学的に合成された DNAを挿入した。こうして構築された プラスミドを pQBI— LTRMazFcvlと命名した。
[0042] 前記プラスミドは HIVの 5' LTRの制御下に MazFタンパク質を発現することができ るプラスミドである。配列番号 3の塩基配列は、配列番号 1に示される MazFのァミノ 酸配列をコードし、かつ天然の MazFのアミノ酸配列を変化させることなしに MazF遺 伝子中に存在する ACAの塩基配列を他の塩基配列に変換したものである。したが つてこのプラスミドから転写される MazFの RNAは MazFの活性によって切断される ことはなぐ細胞内において安定的に MazFを発現させることができる。
[0043] 実施例 3 細胞へのプラスミドの導入
24ゥエルのコラーゲンコートプレートの各ゥエルに 1 X 105個のヒト 293TZ17細胞 [ ATCC CRL— 11268]を添カ卩し 24時間培養した。培地には 10%ゥシ胎仔血清（G IBCO社製）を含有するダルベッコ改変イーグル培地（DMEM、シグマ社製）を使用 した。次いで各ゥエルの細胞に pQBI— LTRMazFcvl (0. 25 g)、または pQBI— LTRMazFcvlと pQBI— TATの両方（各 0. 25 μ g)を導入した。プラスミドの導入に は TransIT— 293 (Mirus社製)を使用し、添付の説明書の記載どおりに操作を行つ た。なお、上記の操作は各群 2連で実施し、対照として MazF遺伝子を含まない pQB I - LTRgagGFP (Quantum Biotechnologies Inc.社製）と pQBI— TAT (各 0 . 25 g)を導入した群も設定した。
[0044] プラスミドが導入された細胞を 37°C、 5%COで 48時間培養した。培養終了後に顕
2
微鏡下で細胞を観察したところ、対照として設定した pQBI— LTRgagGFPと pQBI —TATを導入した群においては、 pQBI— LTRgagGFPと pQBI— TATを同時に導 入することによって GFPタンパクの発現が確認されたことから、 LTRのプロモーター 活性が TAT依存的に誘導されていることが確認された。また、 pQBI— LTRMazFc vlのみが導入されたゥエルでは対照との間に差は認められなかった力 pQBI— LT RMazFと pQBI— TATを同時に導入した群では対照に比較して明らかな細胞増殖 の抑制が認められた。このことは、 pQBI— LTRMazFからの MazFの発現が Tatタン ノ ク依存的に起こることを示している。すなわち、 Tatタンパク誘導性の LTRの制御 下に MazF遺伝子を配置した構築物により、 HIV感染細胞の増殖を抑制できること が示唆された。
[0045] 実施例 4 レトロウイルスベクタープラスミドの構築
(1) MazF発現レトロウイルスベクタープラスミド pSIN— HLTR MazFの構築 実施例 1で作製されたプラスミド pQBI - LTRMazFcvlを制限酵素 Stulと Xbalで 切断し、 HIV - LTR支配下に MazFが発現する発現カセット (約 1340bp)を獲得し
、 DNA Blunting Kit (タカラバイオ社製）で平滑化した。
[0046] レトロウイルスベクタープラスミド pDON— AI (タカラバイオ社製）の LTRプロモータ 一活性を消失させるため、 3' LTRの U3領域の Nhel部位から Sacl部位までを削除 して再構築し、 LTRプロモーター活性を消失した自己不活型レトロウイルスベクター プラスミド pSINを得た。 pSINの Pmel部位を切断し、 Alkaline Phosphatase E. coli C75 (タカラバィォ社製)を用いて脱リン酸ィ匕し、前記の発現カセットを DNA li gation kit Mighty Mix (タカラバイオ社製）を用いて挿入した。こうして構築され たプラスミドを pSIN— HLTR— MazFと命名した。
[0047] (2) MazF発現レトロウイルスベクタープラスミド pMTD3— U3R— MazF、 pMTD
3— U3TAR— MazFの構築
pMTベクター [ジーン'セラピー（Gene Therapy)、第 11卷、 94〜99頁（2004) ] の 3' LTRの U3領域について、当該領域 43〜309番目の塩基にわたる部分を欠損 させたプラスミドベクター PMTD3を作製した。内部プロモーターとして使用する HIV の U3— R領域および U3— TAR領域は、それぞれ実施例 4— (1)で作製されたブラ スミド pSIN— HLTR—MazFを铸型とした PCRにより取得した。 U3—R領域の増幅 に用いたプライマー、 5' HIV1 U3、 3' HIV1 Rの塩基配列をそれぞれ配列番号 4 、 5に示す。 U3— TAR領域の増幅には前記の 5' HIV1 U3と配列番号 6記載の塩 基配列のプライマー、 3' HIV1 TARを組み合わせて使用した。両 PCR増幅断片を それぞれ Mlul、 BamHIで消化して pMTDの MlulZBamHIサイト間に挿入し、 2種 のレトロウイルスベクタープラスミド PMTD3— U3R、 pMTD3— U3TARを構築した [0048] MazFをコードする遺伝子は上記のプラスミド pSIN— HLTR— MazFを铸型とした PCRにより取得した。増幅に用いた 2種のプライマー、 5' MazF、 3， MazFの塩基配 列をそれぞれ配列番号 7、 8に示す。得られた増幅断片を BglII、 BamHIで消化して pMTD3— U3R、 pMTD3— U3TARの BamHIサイトに挿入した。こうして構築され た MazF発現レトロウイルスベクタープラスミドをそれぞれ pMTD3— U3R— MazF、 pMTD3— U3TAR— MazFと命名した。
[0049] (3)対照レトロウイルスベクタープラスミドの構築
対照として使用するため、 PMTD3— U3Rに蛍光タンパク質である eGFPをコード する遺伝子を挿入した発現プラスミドを構築した。すなわち、プラスミド PGemT—Eas y— eGFP [ジャーナル'ォブ'ジーン'メディシン（J. Gene Med. )、第 6卷、 724〜 733頁（2004) ]より BamHI、 Bglll消化によって切り出した eGFP遺伝子を含む DN A断片を pMTD3— U3Rの BamHIサイトに挿入して eGFP発現プラスミドである pM TD3— U3R、 pMTD3— U3TARの BamHIサイトに挿入し 2種のレトロウイルスべク タープラスミド pMTD3— U3R— GFP、 pMTD3— U3TAR— GFPを構築した。
[0050] 実施例 5 MazF発現 CEM— SS細胞株の榭立
(l) GaLVシユードタイプウィルスを作製するために使用するエンベロープ発現ブラ スミドは下記の操作により構築した。まず、 GaLVウィルスのエンベロープタンパク質 をコードする DNA断片を PG13細胞（ATCC CRL— 10686)より調製したゲノム D NAを铸型とした PCRにより増幅した。増幅に用いた 2種のプライマー、 5，KpnI、 3， Clalの塩基配列をそれぞれ配列番号 9、 10に示す。アンフォト口ピック'エンベロープ 発現プラスミドである pVM—AE [Gene Therapy (ジーン セラピー）、第 10卷、 p7 06 - 711 (2003) ] ^Kpnl, Clalで消化し、エンベロープタンパクをコードする領域 のうち Rペプチド部分を除く部分を除去したプラスミド断片を作成した。上記の増幅断 片を Kpnl、 Clalで消化したものをこのプラスミド断片に挿入し、 GaLVエンベロープ 発現プラスミド、 pVM— GeRを得た。
[0051] (2) 10%ゥシ胎児血清（FBS)を添カ卩した DMEMを入れた 6cm径のプレートに 2 X 106個の 293T細胞を入れ、 4 μ gのレトロウイルスベクタープラスミド（実施例 4で作製 されたプラスミドの 、ずれか）、 4 μ gのパッケージングプラスミド pVM - GP [Gene T herapyゝ第 10卷、 p706— 711 (2003) ]、 GaLVエンベロープ発現プラスミド pVM — GeRを用いてリン酸カルシウム法によりトランスフエクシヨンを実施した。トランスフエ クシヨン開始 6時間後に培地を新鮮なものに交換して培養を継続した。 2日後に培養 上清を集めて 0. 45 μ mのフィルターでろ過し、このろ液をウィルス上清として以下の 実験に使用した。
[0052] CEM— SS細胞は 10%FBSを添カロした RPMI 1640 (ライフ'テクノロジーズ社製 )中、 37°C、 5%CO存在下で培養した。 6ゥエル細胞培養プレートのゥエル内の CE
2
M— SS細胞（5 X 105個 Z2ml培地）に対し、実施例 6— (1)で作製した各レトロウイ ルスベクター（ウィルス上清） 1mlと終濃度 8 μ gZmlのポリブレンを添カ卩し、さらにプ レートを CR322遠心分離機 (Jouan社製）を使用し、 25°C、 2800rpmで 99分間遠 心し、細胞へのレトロウイルスベクターの吸着を促した。遠心操作後の細胞を 37°C、 5%CO存在下で 2時間インキュベートした後、細胞を T25フラスコに移して 37°C、 5
2
%CO存在下での培養を継続した。 2日後、遺伝子導入された細胞を lmgZmlのジ
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エネティシン (G418)で選択することにより、各ウィルスで形質転換されたポリクローナ ルな細胞株を作製した。
[0053] 実施例 6 HIV感染
24ゥエル細胞培養プレートのゥエルに入れた、実施例 5で作製された各細胞株の 細胞 2 X 106個（/1ml培地）に種々の量の HIV— 1 Illb (p24タンパク量換算で 0. 2、 2、 20、 200ng)を接種し、 37°Cで 2時間培養した。細胞を PBSで洗浄した後に 1 Omlの RPMI (10%の FBSを含む）に懸濁して T25フラスコに移した。このフラスコ力 ら継時的に採取した培養上清について p24量を ELISA法 (p24 ELISA kit、パー キン'エルマ一社製)で定量し、 HIVの量を評価した。実験結果を図 1、図 2に示す。 図 1、図 2はそれぞれ感染 7、 10日後の結果である。図中、 CEM— SSは遺伝子導 入されて 、な 、CEM - SS細胞、 Controlは pMTD3— U3R— GFPウィルスで形 質転換されている細胞、 A, B、 Cはそれぞれ pSIN— HLTR— MazF、 pMTD3— U 3R - MazFウィルス、 pMTD3— U3TAR - MazFウィルスで开質転換された細胞 での結果を示す。縦軸は p24タンパク量 (単位: ngZml)である。また、感染後 4、 7、 10日目（Day 4、 Day 7、 Day 10)の生存細胞数をトリパンブルー排出試験により計測 した。この結果を図 3に示す。図 3において、菱形は遺伝子導入されていない CEM SS細胞、 Xは pMTD3— U3R—GFPウィルスで形質転換されている細胞、四角 、三角、丸はそれぞれ pSIN— HLTR— MazF、 pMTD3— U3R— MazFウィルス、 pMTD3— U3TAR— MazFウィルスで形質転換された細胞での結果を示す。縦軸 は生存細胞数 (単位： 104個）である。
[0054] 図 1、 2に示されるように、 MazF遺伝子を含有するレトロウイルスで形質転換されて いる細胞では、非遺伝子導入 CEM— SS細胞、対照として使用した MazF遺伝子を 含有しない PMTD3— U3R— GFPウィルスで形質転換された細胞と比較して培養 上清中の HIVの量が非常に低いことが明ら力となった。さらに、各群の細胞の増殖率 を比較すると、図 3から明らかなように、 MazF遺伝子を含有するレトロウイルスで形質 転換されている細胞は感染後 7日目以降に細胞増殖率が向上していることが示され た。このことは、これらの細胞では HIVに起因する細胞死が抑制されていることを示 唆している。また、 pSIN— HLTR— MazFゝ pMTD3— U3R— MazFウィルス、 pM TD3— U3TAR— MazFウィルスで形質転換された細胞に HIVを感染させ、 60日 間培養を継続した。培養上清には HIVは検出されな力つたが、細胞力も抽出した D NAには HIV由来の DNAが検出されたことから、 HIVはプロウィルスとして細胞内に 保持されていることが示された。このことから、本発明の核酸で形質転換された細胞 では HIVの感染を受けた後も、 HIVの複製と出芽が妨げられた状態で増殖して 、る ことが示唆された。
[0055] さらに、 HIV接種量を p24量換算で lOOOngまで増やして同様の感染試験を行い、 感染から 16日後に培養上清中の p24量を測定した。この場合も、 MazF遺伝子を有 する各レトロウイルスベクターで形質転換された細胞の培養上清中の P24量は非形 質転換細胞ならびに対照の量の 1Z1000以下であった。
[0056] 実施例 7 種々の mRNA Interf eraseを Tat依存的に発現させることによる細胞増 殖阻害
(1) N. europaea ATCC19718株由来 NE1181遺伝子の単離とレトロウイルス ベクタープラスミドの構築 Nitrosomonas europaea ATCC19718株由来 NE1181遺伝子について、そ こにコードされて 、るポリペプチドのアミノ酸配列および塩基配列を NCBI データべ ースより入手した（accession No. NP— 841237および NC— 004757)。 NE11 81の塩基配列情報より、ポリペプチド全長をコードする領域の DNAを PCRで増幅で きるように、プライマー NE 1181— F (配列番号 11 )およびプライマー NE 1181— R ( 配列番号 12)をそれぞれ合成した。
[0057] Nitrosomonas europaea ATCC19718株のゲノム DNAは ATCCより入手し た（ATCC No. 19718D)。
[0058] 50ngの Nitrosomonas europaea ATCC 19718株ゲノム DNA、プライマー N E1181 -F および NE1181— Rを使用し、 Pyrobest DNA polymerase (タカラ バイオ社製)を用いた PCRを実施して 362bpの増幅 DNA断片を得た。この増幅断 片を制限酵素 Ndelおよび Xholで消化してァガロース電気泳動に供し、泳動後のゲ ルより 341bpの DNA断片を回収した。制限酵素 Ndelおよび Xholで消化してお!、た pET21aベクター（ノバジェン社製）に上記の 341bpの DNA断片を接続して得られ た組換えプラスミドで大腸菌 JM109株をトランスフォーメーションした。こうして得られ た形質転換体のコロニーよりプラスミドを調製し、その塩基配列を確認したうえ、発現 ベクター pET— NE 1181と命名した。
[0059] 発現ベクター pET—NEl 181に挿入された Nitrosomonas europaea ATCC1 9718株由来 NE1181ポリペプチドをコードする塩基配列を配列番号 13に、該ポリ ペプチドのアミノ酸配列を配列番号 14にそれぞれ示す。なお、前記の発現ベクター p ET—NE1181によれば配列番号 1のアミノ酸配列のポリペプチドの C末端に 6残基 のヒスチジンを含む 8アミノ酸残基カゝらなるヒスチジン一タグが付加されたポリペプチド が発現される。 NE1181から翻訳されるポリペプチドは GAAUまたは AAAUの 4塩 基配列を認識して RNAを切断することを、合成オリゴリボヌクレオチドを基質として確 した 0
[0060] NE1181遺伝子はその mRNA中に NE1181ポリペプチド自身が切断する認識配 列を有するため、コードするアミノ酸配列を変化させな 、ようにコドンに変異を入れて 前記の認識配列を消去した遺伝子を人工合成した。この遺伝子の塩基配列を配列 番号 15に示す。次に、実施例 4で作製されたレトロウイルスベクタープラスミド pMTD 3— U3TARの BamHIサイトに人工合成した NE 1181遺伝子を挿入した。こうして構 築された NE1181発現レトロウイルスベクタープラスミドを pMTD3—U3TAR—N4 と命名した。
[0061] (2) Deinococcus radiodurans Rl由来 DR0662の単離レトロウイルスベクター プラスミドの構築
[0062] D. radioduran Rl株由来 DR0662、 M. bovis BCG株由来 Mb2014c H omolog の単離と発現プラスミドの構築
Deinococcus radioduran Rl株由来 DR0662のアミノ酸配列および塩基配列を NCBI データベースより入手した（accession No. NP— 294385および NC—0 01263)。 DR0662の塩基配列情報より、ポリペプチド全長をコードする領域の DN Aを PCRで増幅できるように、プライマー DR0662—F (配列番号 16)およびプライマ 一 DR0662—R (配列番号 17)をそれぞれ合成した。
[0063] Deinococcus radioduran Rl株のゲノム DNAは ATCCより入手した（ATCC No. 13939D)。 50ngの Deinococcus radioduran Rl株ゲノム DNA、プライ マー DR0662— F および DR0662— Rを使用し、 Pyrobest DNA polymerase (タカラバイオ社製)を用いた PCRを実施して 368bpの増幅 DNA断片を得た。この 増幅断片を制限酵素 Ndelおよび Xholで消化してァガロース電気泳動に供し、泳動 後のゲルより 347bpの DNA断片をゲルより回収した。制限酵素 Ndelおよび Xholで 消化しておいた pET21aベクター（ノバジェン社製）に上記の 347bpの DNA断片を 接続して得られた組換えプラスミドで大腸菌 JM109株をトランスフォーメーションした 。こうして得られた形質転換体のコロニーよりプラスミドを調製し、その塩基配列を確 認したうえ、発現ベクター pET— DR0662と命名した。
[0064] こうして得られた、発現ベクター pET—DR0662に挿入された Deinococcus radi oduran Rl株由来 DR0662ポリペプチドをコードする塩基配列を配列番号 18に、 該ポリペプチドのアミノ酸配列を配列番号 19にそれぞれ示す。なお、前記の発現べ クタ一 PET—DR0662および pET—Mb2014cHlgによれば配列番号 1のポリぺプ チドの C末端に 6残基のヒスチジンを含む 8アミノ酸残基力 なるヒスチジン一タグが 付加されたポリペプチドが発現される。 DR0662から翻訳されるポリペプチドは UUC CUUUの 7塩基配列を認識して RNAを切断することを合成オリゴリボヌクレオチドを 基質として確認した。
[0065] pET— DR0662を铸型として、 PCR法により DR0662遺伝子を取得し、実施例 4 で作製されたレトロウイルスベクタープラスミド PMTD3— U3TARの BamHIサイトに PCR増幅した DR0662遺伝子を挿入した。こうして構築された DR0662発現レトロゥ ィルスベクタープラスミドを pMTD3— U3TAR— D3と命名した。 DR0662遺伝子の 増幅に使用したプライマーを配列番号 20、 21に示す。
[0066] (3) Tat発現レトロウイルスベクターの作製
実施例 1に記載の pQBI— Tatを制限酵素 SacII - EcoRVで消化し、平滑化後レト ロウィルスベクタープラスミド pDON— AIの Pmel部位に挿入し、 pDON— Tatを構 築した。次に pDON— Tatを BamHI— Xholで消化して SV40プロモーターとネオマ イシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子を除去し、クロンテック社の pIRES2— ZsGree nlから IRES— ZsGreen遺伝子断片を獲得し、先の制限酵素消化した pDON— Ta tの Tat遺伝子の下流に挿入し、 pDON - Tat - ZsGreenを構築した。
[0067] 10%ゥシ胎児血清（FBS)を添カ卩した DMEMを入れた 6cm径のプレートに G3T— hi細胞（タカラバイオ社製）を入れ、 10 μ gのレトロウイルスベクタープラスミド pDON —Tat— ZsGreenと Retro virus Packaging Kit Ampho (タカラノィォ社製)を 用いてリン酸カノレシゥム法によりトランスフエクシヨンを実施した。トランスフエクシヨン開 始 8時間後に培地を新鮮なものに交換して培養を継続した。トランスフエクシヨン開始 24時間後に再度培地交換し、 24時間後に培養上清^^めて 0. 45 mのフィルタ 一でろ過し、このろ液をウィルス上清として以下の実験に使用した。このウィルスべク ター導入細胞からは Tatタンパク質と緑色蛍光タンパク質である ZsGreenが発現す る。
[0068] (4) MazF、 NE1181、または DR0662をコードする遺伝子を導入された CEM細胞 株の榭立
10%ゥシ胎児血清（FBS)を添カ卩した DMEMを入れた 6cm径のプレートに G3T— hi細胞（タカラバイオ社製）を入れ、 10 μ gのレトロウイルスベクタープラスミド（pMTD 3— U3TAR— MazFゝ pMTD3— U3TAR— N4、 pMTD3— U3TAR— D3のい ずれ力、）と Retrovirus Packaging Kit Ampho (タカラバイオ社製）を用いてリン 酸カルシウム法によりトランスフエクシヨンを実施した。トランスフエクシヨン開始 8時間 後に培地を新鮮なものに交換して培養を継続した。トランスフエクシヨン開始 24時間 後に再度培地交換し、 24時間後に培養上清を集めて 0. 45 mのフィルターでろ過 し、このろ液をウィルス上清として以下の実験に使用した。
[0069] CEM細胞は 10%FBSを添カ卩した RPMI— 1640中、 37°C、 5%CO存在下で培
2
養した。表面未処理 24穴プレートにレトロネクチン (タカラバイオ社製)をプロトコール に従いコーティングし、先のウィルス上清 0. 5mlをゥエルに加え、 32°C、 2000g、 2 時間の遠心操作により、レトロウイルスベクターをレトロネクチンコートプレートに吸着 させた。上清除去後、 1 X 105個 Zmlに調製した CEM細胞懸濁液 lmlを加え、 37°C 、 5%CO存在下で 24時間インキュベートした後、遺伝子導入された細胞を lmgZ
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mlのジエネティシン（G418)含有培地で 3週間培養することにより、各ウィルスで形質 転換されたポリクローナルな細胞株を作製した。
[0070] (5) MazF, NE1181、および DR0662の発現誘導による細胞増殖の阻害
(1)表面未処理 24穴プレートにレトロネクチン (タカラバイオ社製)をプロトコールに 従いコーティングし、実施例 8で作製された Tat発現レトロウイルスベクター 0. 5mlを ゥエルに加え、 32°C、 2000 X g、 2時間の遠心操作により、レトロウイルスベクターを レトロネクチンコートプレートに吸着させた。上清除去後、実施例 9で作製された Maz F、 NE1181、および DR0662発現 CEM細胞株をそれぞれ 1 X 105個/ ml〖こ調製 し、ゥエルあたり lml添カ卩して感染を行った。対照として mRNA interferase遺伝子 を導入して 、な 、CEM細胞を用い、同様に Tat発現レトロウイルスベクターを感染し た。感染から 2日後および 15日後、フローサイトメーターで ZsGreen陽性率を測定す ることにより、 Tat発現レトロウイルス感染効率を測定した。結果を表 1に示す。表 1に 示すとおり、 mRNA interferase遺伝子 MazF、 NE1181、および DR0662をコー ドする遺伝子が導入された CEM細胞にお ヽては、 Tatタンパク質依存的に遺伝子が 発現し、その結果 mRNAが分解に伴う細胞死が誘発され、 ZsGreen陽性率が低下 した。以上の結果より、 MazFとは異なる塩基配列特異性を有する mRNA Interfer aseの遺伝子を使用した場合も、同様に HIV感染細胞の増殖を抑制できることが示さ れた。
[表 1]
ZsGreen陽性率 （Tatウィルス陽性率） (%)
Day 2 Dayl5
MazF導人 CEM 6. 64 1. 38
NE 1181導人 CEM 28. 62 15. 96
DR0662導人 CEM 49. 51 13. 70
CEM 54. 31 43. 42
[0072] 実施例 8 MazF発現による mRNA分解とリボゾーム RNAの分析
(1) MazFと蛍光タンパク質 ZsGreenが 1つの mRN Aから発現するベクターは以下 の手順で作製した。実施例 2に記載の pQBI— LTRMazFcvlを铸型とし、 PCR法に より MazF遺伝子を取得し、クロンテック社の pIRES2— ZsGreenlの Sacl— BamHI サイトに PCR増幅した MazF遺伝子を挿入した。こうして構築された MazFと ZsGree nが同時に発現するプラスミドを pMazF— IZと命名した。 MazF遺伝子の増幅に使 用したプライマーを配列番号 22、 23に示す。また、対照として pIRES 2— ZsGreenl の Sacl— BamHIサイトにルシフェラーゼ遺伝子を挿入したプラスミド pLuc— IZを構 築した。
[0073] (2)ヒト 293細胞 (ATCC CRL— 1573)は 10%ゥシ胎児血清（FBS)を添加した DMEM培地で培養を行った。 24穴コラーゲンコートプレート（コ一-ング社製）に 2x 105個 Zmlに調製した 293細胞懸濁液をゥエルあたり 0. 5ml播種し、 24時間培養を 行った。先に記載した pMazF—IZおよび pLuc—IZを TransIT—293 (Mirus社製） を用いてトランスフエクシヨンし、 24、 48、 72時間後に蛍光タンパク質の発現をフロー サイトメーター FACS Vantage (ベタトン ·デッキンソン社製）で解析した。また、全 R NAを RNeasy micro (キアゲン社製）で回収した。回収した RNAは微量電気泳動 装置アジレント 2100バイオアナライザ (アジレント社製)で分析を行った。フローサイト メーター解析による遺伝子導入細胞の蛍光強度の値を表 2に示す。表 2に示すとおり 、 pMazF—IZを導入した細胞では ZsGreenの発現が抑制されて!、ることが示された 。これは、発現した MazFの作用により mRNAが分解され、 ZsGreenの翻訳が抑制 されたためであると考えられる。一方、全 RNAの電気泳動分析による 28sと 18sリボゾ ーム RNAの比率を表 3に示す。表 3に示すとおり、 pMazF— IZを導入した細胞と pL uc— IZを導入した細胞の 28sと 18sリボゾーム RNAの比率は同等であり、 MazFの 発現によりリボゾーム RNAは分解されて 、な 、ことが示された。
[0074] [表 2]
ZsGreen蛍光強度
24時間後 48時間後 72時間後
293細胞 2. 68 3. 67 3. 81
pMazF- IZ導入 293細胞 6. 88 15. 46 14. 2
し110-12導入293細胞 129. 44 450. 35 583, 94
[0075] [表 3]
rRNA比率（28s/18s)
24時間後 48時間後 72時間後
pMazF- IZ導入 293細胞 2. 1 2. 0 2. 2
し11(;-12導入293細胞 2. 1 2. 0 2. 3
[0076] 実施例 9 MazEによる MazFの活性の抑制
MazFのアンチトキシンである MazEを発現するレトロウイルスベクタープラスミド pM SN - MazEは以下の手順で構築した。
[0077] pMTベクター [ジーン'セラピー（Gene Therapy)、第 11卷、 94〜99頁（2004) ] の BamHI— Xhol部位に配列番号の 24に示す塩基配列の MazE遺伝子を挿入し p MT— MazEを構築した。 pMT— MazEの Xhol部位に pDON—AIから Sail— Xhol 消化して得た SV40プロモーターとネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子を含 む断片を挿入した。得られた MazE発現レトロウイルスベクタープラスミドを pMSN— MazEと命名した。
[0078] 10%ゥシ胎児血清（FBS)を添カ卩した DMEMを入れた 6cm径のプレートに G3T— hi細胞（タカラバイオ社製）を入れ、 10 μ gのレトロウイルスベクタープラスミド pMSN — MazEと Retrovirus Packaging Kit Ampho (タカラバイオ社製）を用いてリン 酸カルシウム法によりトランスフエクシヨンを実施した。トランスフエクシヨン開始 8時間 後に培地を新鮮なものに交換して培養を継続した。トランスフエクシヨン開始 24時間 後に再度培地交換し、 24時間後に培養上清を集めて 0. 45 mのフィルターでろ過 し、このろ液を MSN— MazEウィルス上清とした。表面未処理 24穴プレートにレトロ ネクチン（タカラバイオ社製）をプロトコールに従いコーティングし、 MSN— MazEウイ ノレスベクター 0. 5mlをウエノレにカロ免、 32。C、 2000g、 2時間の遠 、操作により、 Maz E発現レトロウイルスベクターをレトロネクチンコートプレートに吸着させた。上清除去 後、 293細胞を 1 X 105個 Zmlに調製し、ゥエルあたり lml添カ卩して感染を行った。 3 7°C、 5%CO存在下で 24時間インキュベートした後、遺伝子導入された細胞を 0. 5
2
mgZmlのジエネティシン（G418)含有培地で 2週間培養することにより、 MazEを恒 常発現するポリクローナルな細胞株 293— MazEを作製した。
[0079] 実施例 4記載の pSIN— HLTR—MazFからネオマイシンホスホトランスフェラーゼ 遺伝子を除去し、代わりにハイグロマイシン耐性遺伝子を挿入したレトロウイルスべク タープラスミド pSINH— HLTR— MazFを構築した。
[0080] 10%ゥシ胎児血清（FBS)を添カ卩した DMEMを入れた 6cm径のプレートに G3T— hi細胞（タカラバイオ社製）を入れ、 10 μ gのレトロウイルスベクタープラスミド pSINH — HLTR— MazFと Retro virus Packaging Kit Ampho (タカラバイオ社製）を 用いてリン酸カノレシゥム法によりトランスフエクシヨンを実施した。トランスフエクシヨン開 始 8時間後に培地を新鮮なものに交換して培養を継続した。トランスフエクシヨン開始 24時間後に再度培地交換し、 24時間後に培養上清^^めて 0. 45 mのフィルタ 一でろ過し、このろ液を SINH— HLTR— MazFウィルス上清とした。表面未処理 24 穴プレートにレトロネクチン（タカラバイオ社製）をプロトコールに従いコーティングし、 SINH— HLTR— MazFウィルスベクター 0. 5mlをゥエルに加え、 32°C、 2000g、 2 時間の遠心操作により、 MazF発現レトロウイルスベクターをレトロネクチンコートプレ ートに吸着させた。上清除去後、 293— MazE細胞および 293細胞を I X 105個 Zm 1に調製し、ゥエルあたり lml添カ卩して感染を行った。 37°C、 5%CO存在下で 24時
2
間インキュベートした後、遺伝子導入された細胞を 0. 2mgZmlのハイグロマイシン B 含有培地で 2週間培養することにより、ポリクローナルな細胞株 293— MazE— Maz Fおよび 293— MazFを作製した。
[0081] 表面未処理 24穴プレートにレトロネクチン（タカラバイオ社製）をプロトコールに従 ヽ コーティングし、実施例 8で作製された Tat発現レトロウイルスベクター 0. 5mlをゥェ ルにカロえ、 32°C、 2000g、 2時間の遠心操作により、レトロウイルスベクターをレトロネ クチンコートプレートに吸着させた。上清除去後、 293— MazE— MazFおよび 293 — MazF細胞株を 1 X 105個 Zmlに調製し、ゥヱルあたり lml添カ卩して感染を行った 。対照として 293細胞にも感染を行った。感染から 2日後顕微鏡観察により細胞の成 育を観察した。 293— MazF細胞では Tatタンパク質の働きにより MazFが発現し細 胞増殖が抑制されたが、 293— MazE— MazF細胞では、 MazFの作用が MazEに よって中和され、 293細胞と同等の生育を示した。真核生物においても MazEが Maz Fのアンチトキシンとして作用することが示された。
産業上の利用可能性
[0082] 本発明により、ヒト免疫不全ウィルス (HIV)感染症の治療、予防に有効な核酸構築 物が提供される。前記の核酸構築物が導入された細胞は HIVの複製を抑制すること ができることから、 HIV感染症の治療、予防に効果を示す。
配列表フリーテキスト
[0083] SEQ ID NO 3； synthetic DNA encoding MazF.
SEQ ID NO 4； Primer 5 ' HIV1 U3 to amplify a portion of HIV LTR.
SEQ ID NO 5； Primer 3 ' HIV1 R to amplify a portion of HIV LTR.
SEQ ID NO 6； Primer 3 ' HIV1 TAR to amplify a portion of HIV LTR.
SEQ ID NO 7； Primer 5 ' MazF to amplify a DNA encoding MazF.
SEQ ID NO 8； Primer 3 ' MazF to amplify a DNA encoding MazF.
SEQ ID NO 9； Primer 5 ' Kpnl to amplify a DNA encoding GaLV envelope.
SEQ ID NO 10 ； Primer 3 ' Clal to amplify a DNA encoding GaLV envelope.
SEQ ID NO 11 ； Primer NE1181— F to amplify a DNA encoding NE1181 polypeptide.
SEQ ID NO 12 ； Primer NE1181— R to amplify a DNA encoding NE1181 polypeptide.
SEQ ID NO 15 ； Synthetic DNA encoding NE1181 polypeptide.
SEQ ID NO 16 ； Primer DR0662— F to amplify a DNA encoding DR0662 polypeptide.
SEQ ID NO 17 ； Primer DR0662— R to amplify a DNA encoding DR0662 polypeptide.
SEQ ID NO 20 ； Primer to amplify a DNA encoding DR0662 polypeptide.
SEQ ID NO 21 ； Primer to amplify a DNA encoding DR0662 polypeptide.
SEQ ID NO 22 ； Primer to amplify a DNA encoding MazF. SEQ ID NO :23； Primer to amplify a DNA encoding MazF.

Claims

請求の範囲
[I] ヒト免疫不全ウィルスのトランス作用因子により転写が誘導される転写調節配列と、 前記配列により発現の制御が可能な形態に配置された一本鎖 RNA特異的なエンド リボヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子とを含有する核酸。
[2] Tatタンパク質および Zまたは Revタンパク質により転写が誘導される転写調節配 列を含有する請求項 1記載の核酸。
[3] ヒト免疫不全ウィルスの LTRの下流に一本鎖 RNA特異的なエンドリボヌクレアーゼ 活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子が配置されている請求項 1記載の核酸
[4] 一本鎖 RNA特異的なエンドリボヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドが塩基配列 特異的に RNAを切断する活性を有するものである請求項 1記載の核酸。
[5] 一本鎖 RNA特異的なエンドリボヌクレア ゼ活性を有するポリペプチドが MazFタ ンパク質である請求項 1記載の核酸。
[6] ベクターに組み込まれて!/ヽる請求項 1記載の核酸。
[7] 請求項 1記載の核酸を細胞に導入することを特徴とする、ヒト免疫不全ウィルスの複 製が抑制される細胞の製造方法。
[8] 細胞が T細胞または T細胞前駆細胞を含む細胞集団である請求項 7記載の方法。
[9] 核酸がウィルスベクターにより細胞に導入されることを特徴とする請求項 7記載の方 法。
[10] レトロウイルスベクターにより核酸が細胞に導入される請求項 9記載の方法。
[II] 請求項 1記載の核酸を細胞に導入することを特徴とする、ヒト免疫不全ウィルス感染 症の治療または予防方法。
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