WO2007017540A1 - Nuevo reactivo de biotina, métodos para su preparación y mareaje, y aplicaciones - Google Patents

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Javier MUÑOZ SILES
Maria Fernandez Fernandez
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Definitions

  • New biotin reagent methods for its preparation and marking, and applications.
  • the invention falls within the area of Organic Chemistry and Biochemistry with application in the Biotechnology and Biomedicine sectors. More specifically, it refers to the development of a new biotin reagent and its use in the preparation of labeled derivatives as well as its binding to biomolecules.
  • Biotin (vitamin H) is a water soluble molecule that is found at low concentrations in the blood and tissues. Its biological function is to act as a transport molecule of the carboxyl group. Biotin is covalently bound to the enzyme pyruvate carboxylase. An activated carboxyl group, derived from a bicarbonate ion, is coupled to biotin through a reaction that requires a supply of energy from the hydrolysis of an ATP molecule. This carboxyl group is then transferred to the pyruvate methyl group forming oxaloacetate.
  • the affinity between avidin and biotin has a large number of applications, for example, the avidin-biotin complex has been used as a detection system where the target molecule is combined with biotin through its terminal carboxyl group, in this way biotinylated molecules can be easily detected and separated from the solution.Biotinylation of the target molecule can be carried out without changing the biological or physicochemical properties of the target molecule and without affecting the binding capacity of biotin to Avidin
  • streptavidin (or avidin) and biotin (Gitlin, G .; Bayer, EA and Wilchek, M. 1987, Biochem. J. 242, 923-926, Gitlin, G .; Bayer, EA and Wilchek, M. 1988, Biochem. J. 250, 291-294) is well known, in fact it is one of the strongest, within non-covalent biological interactions.
  • Biotin-streptavidin affinity is one of the most used in molecular, immunological and cellular assays. Streptavidin can be detected and quantified with a high degree of sensitivity in the complex formed, for example by marking it with an enzyme or a fluorescent or radioactive label. Streptavidin mapping has also been used to detect proteins on the cell surface, to visualize and quantify blots and carry out ELISA-type assays (P. Vincent, Journal of Immunological Methods, ⁇ 65; 177-182, 1993).
  • Streptavidin can also be immobilized on a surface so as to capture biotinylated molecules or cells. These surfaces can be used to detect the molecules of interest from complex mixtures. Therefore, the streptavidin-biotin interaction has been widely used in a large number of separation, purification and isolation processes, such as affinity chromatography, etc. This same approach has been used to carry out studies of interactions between biomolecules through the use of biosensors based on surface plasmon resonance (SPR).
  • SPR surface plasmon resonance
  • oligonucleotides and nucleic acids are frequently used in many molecular biology procedures and in many other techniques such as sequencing, amplification, cDNA preparation and nucleic acid purification.
  • This methodology has been adapted for use in solid phase, using a support covered with streptavidin.
  • Streptavidin-biotin magnetic microparticles have also been prepared for use in PCR (polymerase chain reaction) (Hultman et al, Nucleic Acids Res. 17: 4937-4946, 1989). This method is of great interest, results in good yields and is easily automated compared to traditional methods of purification based on precipitation and centrifugation.
  • Biotin is a non-aromatic heterocyclic compound with a 4-carboxybutyl tail.
  • biotin binds through 4-carboxybutyl to a linker (spacer) that can be associated with a biomolecule (protein, carbohydrates, DNA, lipid, drug, etc.).
  • linker spacer
  • biomolecule protein, carbohydrates, DNA, lipid, drug, etc.
  • All the procedures described to carry out the reaction between the biotin and the amino group of the molecule under study use the adjuvants typical of the formation of the peptide bond such as NHS and EDC, activators of amino and carboxyl groups respectively.
  • the yields described in the literature for this process are low (30%) and the procedure tedious.
  • New biotin reagent methods for its preparation and marking, and applications.
  • One aspect of the present invention relates to a new biotin reagent, biotin chloride or 5 - ((3a5 r , 45 ⁇ , 6a, S) -2-oxo-hexahydro-lH ' -thieno [3, 4- d] imidazol-4-yl) pentanoyl.
  • another aspect of the present invention refers to the method for the preparation of this biotin reagent that allows its reaction in a quick and simple way with any correctly functionalized biomolecule, as well as its marking with a marker.
  • the method of preparation of biotin chloride described is easy to carry out and, in addition, high yields, high reactivity and great application are obtained with it.
  • the preparation of biotin chloride is a simple procedure that involves a single stage consisting of the addition of thionyl chloride to biotin. A solid immediately precipitates, which is the reaction product that is easily isolated, for example by simple vacuum filtration. The yield obtained is 75%.
  • Another aspect contemplated by the invention is the mapping of biotin chloride.
  • the marking can be done with a fluorescent marker or a radioactive marker.
  • Fluorescent marking consists of a simple procedure that involves a single stage, that is, the addition of fluorophore to a solution of biotin chloride in the appropriate solvent (10% DMF (dimethylformamide) or DMSO (dimethyl sulfoxide) and 90% solvent in which the fluorophore is soluble).
  • the fluorophores 2,6-diaminopyridine, a fluorescent marker that absorbs Ultraviolet-Visible, can be used. After the necessary time, 6 hours, a precipitate forms which is obtained by simple methods such as filtering. 100% yields are obtained.
  • Both the new biotin reagent and the biotinylated marker can be linked to a large number of biomolecules (proteins, enzymes, peptides, oligosaccharides or lipids) which allows their use in studies to analyze their involvement in biological processes or in the preparation of systems Diagnostic
  • This process can be carried out in a simple and consistent way in a single step, that is, the addition of the biomolecule to a solution of the biotin chloride in the appropriate solvent (10% DMF (dimethylformamide) or DMSO (dimethyl sulfoxide) and 90% solvent in which the biomolecule is soluble). 95% yields are obtained.
  • FIG. 1 Fluorescent marking of biotin chloride (2) with 2,6-diaminopyridine (3).
  • thionyl chloride SOCl 2
  • biotin chloride (2) is obtained, which is marked when 2,6-diaminopyridine (3) is added, obtaining the biotinylated marker (4) with a yield of 100 %.

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Abstract

Nuevo reactivo de biotina, métodos para su preparación y mareaje, y aplicaciones. La presente invención presenta un nuevo reactivo de biotina, el cloruro de biotina o cloruro de 5-((3aSr,4>Sr,6a1S)-2-oxo-hexaliidro-lH-tieno[3,4-d]imidazol-4-il)pentanoilo, su preparación en una sola etapa, así como su mareaje también en una sola etapa. Además, tanto el cloruro de biotina como el marcador biotinilado pueden unirse a un amplio número de biomoléculas (proteínas, enzimas, péptidos, oligosacáridos o lípidos) lo que permite su utilización en estudios para analizar la implicación de dichas biomoléculas en procesos biológicos así como su utilización en la preparación de sistemas de diagnóstico.

Description

Nuevo reactivo de biotina, métodos para su preparación y mareaje, y aplicaciones.
OBJETO DE LA INVENCIÓN:
La invención se encuadra dentro del área de la Química Orgánica y Bioquímica con aplicación en los sectores de Biotecnología y Biomedicina. Más concretamente se refiere al desarrollo de un nuevo reactivo de biotina y su utilización en la preparación de derivados marcados así como a su unión a biomoléculas.
ESTADO DE LA TÉCNICA:
La biotina (vitamina H) es una molécula soluble en agua que se encuentra a bajas concentraciones en la sangre y en los tejidos. Su función biológica es actuar como una molécula transportadora del grupo carboxilo. La biotina se encuentra unida covalentemente a la enzima piruvato carboxilasa. Un grupo carboxilo activado, derivado de un ion bicarbonato, se acopla a la biotina a través de una reacción que requiere un aporte de energía procedente de la hidrólisis de una molécula de ATP. A continuación este grupo carboxilo se trasfiere al grupo metilo del piruvato formando oxalacetato.
La biotina también se une con una alta afinidad a avidina, glicoproteína de 63 Kda, y a otras proteínas relacionadas como streptavidina, proteína no glicosidada (X¿=10 "15 M, Green NM. Adv. Prot. Chem.1975; 29, 85-133.). La afinidad entre avidina y biotina presenta un gran número de aplicaciones, por ejemplo, el complejo avidina-biotina ha sido utilizado como sistema de detección donde la molécula diana está combinada con la biotina a través de su grupo carboxilo terminal, de esta forma las moléculas biotiniladas pueden ser fácilmente detectadas y separadas de la solución. La biotinilización de la molécula diana puede llevarse a cabo sin cambiar las propiedades biológicas o físico-químicas de la molécula diana y sin afectar la capacidad de unión de la biotina a la avidina. La fuerte interacción entre streptavidina (o avidina) y biotina (Gitlin, G.; Bayer, E. A. and Wilchek, M. 1987, Biochem. J. 242, 923-926, Gitlin, G.; Bayer, E. A. and Wilchek, M. 1988, Biochem. J. 250, 291-294 ) es bien conocida, de hecho es una de las más fuertes, dentro de las interacciones biológicas no covalentes.
La unión tiene lugar rápidamente y es estable en un amplio rango de pH, temperatura y condiciones desnaturalizantes, lo cual ha permitido el desarrollo de un amplio y diverso número de aplicaciones utilizando la tecnología streptavidina-biotina o avidina-biotina. (Savage et al., Avidin-Biotin Chemistry: A Handbook, 1992:1-23, Rockford, Pierce Chemical Company).
La afinidad biotina-streptavidina es una de las más utilizadas en ensayos moleculares, inmunológicos y celulares. La streptavidina puede detectarse y cuantificarse con un alto grado de sensibilidad en el complejo formado, por ejemplo marcándola con una enzima o un marcador fluorescente o radiactivo. El mareaje de streptavidina también ha sido utilizado para detectar proteínas en la superficie celular, para visualizar y cuantificar blots y llevar a cabo ensayos tipo ELISA (P. Vincent, Journal of Immunological Methods,\65; 177-182, 1993).
La streptavidina también puede ser inmovilizada en una superficie de modo que permita capturar moléculas o células biotiniladas. Estas superficies pueden ser utilizadas para detectar las moléculas de interés a partir de mezclas complejas. Por ello la interacción streptavidina-biotina ha sido ampliamente utilizada en gran número de procesos de separación, purificación y aislamiento, como por ejemplo por cromatografía de afinidad, etc. Esta misma aproximación se ha utilizado para llevar a cabo estudios de interacciones entre biomoléculas mediante la utilización de biosensores basados en la resonancia de plasmón de superficie (SPR).
La inmovilización de oligonucleótidos y ácidos nucleicos es frecuentemente utilizada en muchos procedimientos de biología molecular y en muchas otras técnicas como secuenciación, amplificación, preparación del cDNA y purificación de ácidos nucleicos. Esta metodología ha sido adaptada para su uso en fase sólida, utilizando un soporte cubierto con streptavidina. También se han preparado micropartículas magnéticas de streptavidina-biotina para su utilización en PCR (polymerase chain reaction) (Hultman et al, Nucleic Acids Res. 17:4937-4946, 1989). Este método presenta gran interés, da lugar a buenos rendimientos y se automatiza fácilmente comparado con los métodos tradicionales de purificación basados en la precipitación y centrifugación.
La mayor parte de las aplicaciones están basadas en la unión irreversible streptavidina-biotina, sin embargo en aquellos casos en los que sea necesaria la disociación del complejo también es posible llevarla a cabo y recuperar de esta forma las moléculas o células biotiniladas (Lee et al., Anal Biochem. 206:206-207, 1992, Elgar et al, DNA Sequence 2:219-226, 1992, and Conrad et al., Nucleic Acids Res. 20:6423-6424, 1992 and Tong et al., Λ«α/. Chem. 64:2672-2677, 1992).
La biotina es un compuesto heterocíclico no aromático con una cola de 4- carboxibutilo. En los derivados la biotina se une a través del 4-carboxibutilo a un conector (espaciador) que puede ser asociado a una biomolécula (protema, carbohidratos, DNA, lípido, fármaco, etc.). Todos los procedimientos descritos para llevar a cabo la reacción entre la biotina y el grupo amino de la molécula objeto de estudio utilizan los coadyuvantes típicos de la formación del enlace peptídico como son NHS y EDC, activantes de grupos amino y carboxilo respectivamente. Los rendimientos descritos en la bibliografía para este proceso son bajos (30 %) y el procedimiento tedioso.
Por otro lado, para poder utilizar estas moléculas en el estudio de procesos biológicos es importante marcar estas moléculas para de esta forma poder hacer un seguimiento de las mismas. El método más sencillo y rápido de mareaje de los biomoléculas es la introducción de un fluoróforo. Uno de los marcadores fluorescentes utilizados en la bibliografía es la 2,6-diaminopiridina, en cuya estructura, la presencia de los dos grupos amino permite por una parte su unión a la biomolécula convenientemente funcionalizada, y por otra parte su posterior unión a una molécula de biotina, que se une fuertemente y de manera selectiva a la avidina. Toomre y col' (Glycobiology, 8; 653-663, 1994) emplean la biotina y la 2,6-diaminopiridina con coadyuvantes típicos de la formación del enlace peptídico como son NHS y EDC. Los rendimientos descritos en la bibliografía para este proceso son del 31% (esquema 1).
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Esquema 1. Formación de un glicoconjugado fluorescente con apertura del anillo del oligosacárido.
DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
Nuevo reactivo de biotina, métodos para su preparación y mareaje, y aplicaciones.
Un aspecto de la presente invención se refiere a un nuevo reactivo de biotina, el cloruro de biotina o cloruro de 5-((3a5r,45í,6a,S)-2-oxo-hexahidro-lH'-tieno[3,4- d]imidazol-4-il)pentanoilo. Así mismo, otro aspecto de la presente invención hace referencia al método para la preparación de este reactivo de biotina que permite su reacción de una forma rápida y sencilla con cualquier biomolécula correctamente funcionalizada, así como su mareaje con un marcador.
El método de preparación de cloruro de biotina que se describe es de fácil realización y, además, con él se obtienen altos rendimientos, alta reactividad y gran aplicación. La preparación del cloruro de biotina es un procedimiento sencillo que conlleva una sola etapa que consiste en la adición de cloruro de tionilo a la biotina. Inmediatamente precipita un sólido que es el producto de reacción que se aisla fácilmente, por ejemplo mediante una simple filtración a vacío. El rendimiento obtenido es del 75%.
Otro aspecto que contempla la invención es el mareaje del cloruro de biotina. El mareaje puede realizarse con un marcador fluorescente o un marcador radiactivo. El mareaje fluorescente consiste en un procedimiento sencillo que conlleva una sola etapa, es decir la adición del fluoróforo a una disolución del cloruro de biotina en el disolvente apropiado (10% DMF (dimetilformamida) o DMSO (dimetilsulfóxido) y 90% disolvente en el que sea soluble el fluoróforo). Entre los fluoróforos puede utilizarse la 2,6-diaminopiridina, marcador fluorescente que absorbe al Ultravioleta- Visible. Trascurrido el tiempo necesario, 6 horas, se forma un precipitado que se obtiene por métodos sencillos como es el filtrado. Se obtienen rendimientos del 100 %.
Tanto el nuevo reactivo de biotina como el marcador biotinilado pueden ser unidos a un amplio número de biomoléculas (proteínas, enzimas, péptidos, oligosacáridos o lípidos) lo que permite su utilización en estudios para analizar su implicación en procesos biológicos o en la preparación de sistemas de diagnóstico. Este proceso puede llevarse a cabo de una forma sencilla y consistente en una sola etapa, es decir la adición de la biomolécula a una disolución del cloruro de biotina en el disolvente apropiado (10% DMF (dimetilformamida) o DMSO (dimetilsulfóxido) y 90% disolvente en el que sea soluble la biomolécula). Se obtienen rendimientos del 95 %. BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
Figura 1. Mareaje fluorescente del cloruro de biotina (2) con 2,6-diaminopiridina (3). Mediante la adición de cloruro de tionilo (SOCl2) a la biotina (1) se obtiene cloruro de biotina (2) que queda marcado al añadirse 2,6-diaminopiridina (3) obteniéndose el marcador biotinilado (4) con un rendimiento del 100%.
Figura 2. Preparación de una biomolécula biotinilada (6) utilizando el nuevo cloruro de biotina (2). Mediante la adición de la biomolécula (5) a una disolución de cloruro de biotina (2) se obtiene la molécula biotinilada (6) con un rendimiento del 95%.
> MODODEREALIZARLA INVENCION
La presente invención se ilustra adicionalmente mediante los siguientes ejemplos, los cuales no son limitativos de su alcance, que viene definido exclusivamente por la nota reivindicatoría adjunta.
Ejemplo 1. Preparación del cloruro de biotina
A I g (4,09 mmol) de biotina, en un matraz de fondo redondo provisto de un núcleo de agitación magnética, se le añadieron 8 mi (109,7 mmol) de cloruro de tionilo. La disolución del sólido fue inmediata. A los pocos segundos precipitó el cloruro de ácido en forma de sólido blanco. El sólido se filtró a vacío. Se eliminaron los restos de cloruro de tionilo con alto vacío y el sólido se lavó con acetona. Rendimiento 75%.
Análisis calculado para C10Hi5ClN2O2S: C: 45,71%; H: 5,75%; N: 10,66%; S: 12,20%.
Encontrado: C: 40,45%; H: 5,44%; N: 9,31%; S: 10,74%. EM: m/z 78 (100), 63 (92), 45 (16), 184 (10), 112 (8), 85 (7), 97 (7), 144 (6), 166 (6), 226 (2), 244 (2), 60 (48). IR: 3250, 1702, 1653, 1481, 1319, 1271.
1H-RMN (500 MHz, DMSO): 6,44 (sa, 2H, -NH); 4,31 (dd, IH3J=4,5 y7,7 Hz, H- 1'); 4,13 (dd, IH, J = 4,4 y 7,8 Hz, H-5'); 3,42 (ddd, IH, J= 1,7, 2,8 y 6,0 Hz, H- 6'); 2,80 (dd, IH,J= 5,0 y 12,5 Hz, H-8'β); 2,57 (d, IH,J= 12,4Hz,H-8'α); 2,18 (t, 2H, J= 7,3 Hz, H-2); 1,76 (m, IH, H-5'α); 1,64 (m, 3H, H-4 yH-5α); 1,49 (m, 2H, H-3).
13C-RMN (125 MHz, DMSO): 174,78 (COOH), 163,55 (C-3'), 68,25 (C-5'), 66,93 (C-I'), 60,64 (C-6'), 44,90 (C-2), 38,90 (C-8'), 33,49 (C-3), 33,18 (C-4), 29,77 (C-5).
Ejemplo 2. Mareaje fluorescente del cloruro de biotina
En un matraz de fondo redondo y provisto de un núcleo de agitación, se colocaron 0,3 g (2,7 mmol) de 2,6-diaminopiridina y ImI (7,2 mmol) de trietilamina disueltos en 10 mi de diclorometano seco. La mezcla se agitó hasta disolución. A esta solución se adicionó lentamente una solución formada por 0,35 g (1,33 mmol) de cloruro de biotina en 15 mi de diclorometano seco y 2 mi de dimetilsulfóxido. Se agitó durante 6 h y se obtuvo un precipitado blanco, se filtró a vacío y se lavó con acetona. Rendimiento 100 %.
Análisis calculado para C15H2IN5O2S: C: 53,71%; H: 6,31%; N: 20,88%; S: 9,56%.
Encontrado: C: 53,74%; H: 6,28%; N: 20,84%; S: 9,56%.
IR (v en cm"1): 3407, 3275, 1684, 1659, 1641, 1459, 1399. EM: m/z 63 (100), 78 (71), 45 (20), 109 (20), 97 (16), 85 (10), 184 (10), 244 (2).
1H-RMN (500 MHz, ^DMSO): 6,99 (t, IH, J= 7,8 Hz, H-4'); 6,44 (s, IH, NH2);
6,36 (s, IH, NH2); 5,58 (d, 2H, J= 7,8 Hz, H-3' y H-5'); 5,31 (sa, 3H, -NH, H-2" y
H-4"); 4,29 (dd, 1H, J= 5,1, J= 7,6 Hz5 H-I"); 4,11 (dddd, IH, J= 1,7, J= 3,3, J=
5,5, J= 7,7 Hz, H-5"); 3,43 (dddd, IH, J= 1,7, J= 3,3, J= 5,5, J= 7,7 Hz, H-5"); 2,80 (dd, IH, J= 5,0, J= 12,4 Hz, H-8"β); 2,56 (d, IH, J= 12,4 Hz, H-8"α); 2,18 (t,
2H, J= 7,3 Hz, H-2); 1,76 (m, IH, H-5'α); 1,64 (m, 3H, H-4 y H-5α); 1,49 (m, 2H,
H-3). 13C-RMN (125 MHz, Í/¿-DMSO): 180,21 (C-I), 168,30 (C-3"), 164,22 (C-6' y C- T), 143,85 (C-4'), 100,71 (C-3' y C-5'), 66,62 (C-5"), 65,81 (C-I "), 64,74 (C-6"), 60,99 (C-8") 39,08 (C-2), 33,70 (C-3), 33,62 (C-4), 30,13 (C-5).
Ejemplo 3. Preparación de biomolécula biotinilada con cloruro de biotina.
En un matraz de fondo redondo y provisto de un núcleo de agitación se colocaron 50 mg (0,16 mmol) de p-anilin-iV-acetilglucosaminopiranósido y 1 mL de trietilamina disueltos en 10 mL de agua. La mezcla se agitó hasta disolución. A esta solución se adicionó lentamente una solución formada por 42 mg (0,16 mmol) de cloruro de biotina en 1 mL N,iV-dimetilformamida. Se continuó la agitación durante 72 h. Transcurrido este tiempo se eliminó el disolvente a alto vacío. Rendimiento 95 %
Análisis calculado para C15H21N5O2S: C: 53,52%; H: 6,36%; N: 10,40%; S: 5,95%. Encontrado: C: 53,62%; H: 6,24%; N: 10,84%; S: 5,56%. IR (v en cm4): 3297, 3051, 2934, 2847, 1701, 1650.
1H-RMN (500 MHz, ^6-DMSO): 10,20 (s, IH, Ar-NH-CO); 8,49 (s, 3H, OH); 8,20 (d, IH, J = 1,8 Hz, NH-CO-CH3); 7.45 (d, 2H, J = 9,1 Hz, H-3" y H-5"); 6,87 (d, 2H, J= 9,1 Hz, H-2" y H-6"), 6,45 (s, IH, H-3'), 6,39 (s, IH, H-I'), 4,9 (IH, d, J= 8,5 Hz, H-2'"); 4,31 (dd, IH, J= 5,4, J= 7,4 Hz, H-6'a); 4,13 (dddd, IH, J= 1,6, J = 1,9, J= 2,8, J= 7,6 Hz, H-3'a); 3,67 (dd, IH, J= 1,8, J= 10,3 Hz, H-3'"); 3,41 (dd, 2H, J= 5, J= 12,4 Hz, H-4'" y 5'"); 3,22 (m, 3H, H-6'" y OH-CH2); 2,89 (dd, IH, J= 5,1, J= 12,4 Hz, H-6'β); 2,75 (d, IH, J= 12,4 Hz, H-6'α); 2,56 (ddd, IH, J = 1,7, J= 2,7, J= 6 Hz, H-4'); 2,2 (t, 2H, J= 7,4 Hz, H-2); 2,15 (s, 3H, NHCOCH3); 1 ,76 (m, IH, H-5); 1 ,64 (m, 3H, H-4 y H-5); 1 ,49 (m, 2H, H-3).
13C-RMN (125 MHz, ^DMSO): 175,0 (C-I), 169,9 (NHCO-CH3), 165,2 (C-2'), 163,0 (C-4"), 135,3 (C-I'), 125,7 (C-2" y C-6"); 120,5 (C-3" y C-5"); 105,1 (C- 2'"); 82,4 (C-6'")5 78,3 (C-4'"), 76,4 (C-5'"); 67,2 (C-3 'a); 65,3 (C-6'a); 66,2 (C- 4'); 61,0 (C-6'); 59,3 (C-3'"); 40,1 (C-2), 39,2 (CH2OH); 31,0 (C-3), 28,6 (C-4), 28,1 (C-5); 25,0 (NHCOCH3).

Claims

> REIVINDICACIONES
1. Reactivo de biotina caracterizado por ser cloruro de biotina o cloruro de 5- ((3a5,41S'56aS)-2-oxo-hexahidro-lH-tieno[3,4-d]imidazol-4-il)pentanoilo.
2. Método de preparación de cloruro de biotina, que comprende los siguientes pasos: a) adición de cloruro de tionilo a biotina b) precipitado del cloruro de biotina c) obtención del sólido precipitado d) eliminación de restos de cloruro de tionilo e) lavado del sólido
3. Método de preparación de cloruro de biotina, según la reivindicación 2, caracterizado porque la obtención del sólido precipitado se realiza por filtrado al vacío.
4. Método de preparación de cloruro de biotina, según la reivindicación 2, caracterizado porque la eliminación de los restos de cloruro de tionilo se realiza mediante alto vacío.
5. Método de preparación de cloruro de biotina, según la reivindicación 2, caracterizado porque el lavado del sólido se realiza con acetona.
6. Método de mareaje de cloruro de biotina que comprende los siguientes pasos: a) disolución del marcador b) adición del marcador al cloruro de biotina en presencia del disolvente adecuado c) obtención del precipitado d) lavado del precipitado
7. Método de mareaje de cloruro de biotina, según reivindicación 6, caracterizado porque el disolvente utilizado es un 10% de dimetilformamida o de dimetilsulfóxido y un 90% de disolvente en el que sea soluble el marcador
8. Método de mareaje de cloruro de biotina, según reivindicación 6, caracterizado porque el mareaje se realiza con un fluoróforo.
9. Método de mareaje de cloruro de biotina, según reivindicación 8, caracterizado porque el fluoróforo utilizado es 2,6-diaminopiridina.
10. Método de mareaje de cloruro de biotina, según reivindicación 6, caracterizado porque la agitación se realiza durante 6 horas.
11. Método de mareaje de cloruro de biotina, según reivindicación 6, caracterizado porque la obtención del sólido precipitado se realiza por filtración a vacío.
12. Método de preparación de cloruro de biotina, según la reivindicación 6, caracterizado porque el lavado del sólido se realiza con acetona.
13. Método de preparación de moléculas biotiniladas que comprende los siguientes pasos: a) disolución de la biomolécula b) adición de la biomolécula al cloruro de biotina en presencia del disolvente adecuado c) obtención del precipitado
14. Método de preparación de moléculas biotiniladas, según reivindicación 13, caracterizado porque el disolvente utilizado es un 10% de dimetilformamida o de dimetilsulfóxido y un 90% de disolvente en el que sea soluble la biomolécula.
15. Método de preparación de moléculas biotiniladas, según reivindicación 13, caracterizado porque la obtención del precipitado se realiza mediante filtración.
16. Método de preparación de moléculas biotiniladas, según reivindicación 13, caracterizado porque las biomoléculas son proteínas, enzimas, péptidos, oligosacáridos o lípidos.
17. Método de preparación de moléculas biotiniladas, según reivindicación 13, caracterizado porque el cloruro de biotina está marcado.
18. Uso de cloruro de biotina, según reivindicaciones anteriores, en el estudio de la implicación de biomoléculas o análogos de las mismas en procesos biológicos.
19. Uso de cloruro de biotina, según reivindicaciones 1 a 17, para la elaboración de sistemas de diagnóstico.
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