WO2007014996A1 - Dispositif d'imagerie de fluorescence comportant une source lumineuse a deux longueurs d'onde et de puissance d'éclairement variable - Google Patents
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Abstract
Un dispositif d'imagerie de fluorescence comprend une source lumineuse (16) à deux longueurs d'onde et de puissance d'éclairement variable. La source lumineuse est en forme d'anneau et elle comporte une alternance de premières et secondes zones (16a, 16b) respectivement aptes à émettre des premier et second rayonnements lumineux ayant respectivement des première et seconde longueurs d'onde distinctes. Chacune des zones (16a, 16b) comporte, en outre, une pluralité de sources élémentaires de lumière, contrôlables indépendamment par des moyens de contrôle sélectif de l'éclairage (20) desdites sources élémentaires.
Description
Dispositif d'imagerie de fluorescence comportant une source lumineuse à deux longueurs d'onde et de puissance d'éclairement variable.
Domaine technique de l'invention
L'invention concerne un dispositif d'imagerie de fluorescence comportant une source lumineuse.
État de Ia technique
Les dispositifs d'imagerie de fluorescence sont, notamment, utilisés dans le domaine médical ou biologique. Ainsi, ils peuvent être utilisés in vivo, en effectuant, par exemple une imagerie de fluorescence de zones marquées d'un fluorophore couplé à un anticorps qui se fixe spécifiquement sur des tissus ou organes malades par exemple des tissus cancéreux. Ils peuvent également être utilisés pour réaliser de l'imagerie in vitro, par exemple pour la lecture de biopuces. Dans ce cas, les domaines concernés sont aussi bien la biologie végétale qu'animale. Par exemple, un dispositif d'imagerie de fluorescence peut être mis en œuvre pour suivre la progression de virus marqués d'un fluorophore dans les plantes.
De tels dispositifs emploient le phénomène de fluorescence. Ce phénomène se produit lorsqu'une molécule ré-émet, sous forme d'un signal lumineux de fluorescence, une partie de l'énergie emmagasinée par absorption d'un rayonnement lumineux, dit rayonnement lumineux d'excitation et provenant d'une source lumineuse telle qu'un laser, une lampe à arc ou des diodes électroluminescentes (LED). Le signal de fluorescence est, le plus souvent,
sous la forme d'un rayonnement ultraviolet ou visible ayant une longueur d'onde supérieure à celle du rayonnement lumineux d'excitation.
En effet, l'absorption d'énergie E2 provenant du rayonnement lumineux d'excitation provoque, dans la molécule, le passage d'un état fondamental à un état excité S2 de durée de vie très courte (de l'ordre de la nanoseconde), avec un changement d'orbital des électrons. Des changements conformationnels et des interactions avec les molécules voisines font alors passer la molécule de l'état excité S2 à un état excité plus stable S1 , ce passage correspondant à la conversion interne. Puis, la molécule passe ensuite de l'état excité S1 à l'état fondamental SO, en libérant un photon ayant une énergie E1 inférieure à l'énergie E2 de celui absorbé initialement par la molécule.
A titre d'illustration, un dispositif d'imagerie de fluorescence 1 selon l'art antérieur est représenté sur la figure 1. Il comporte une source lumineuse 2 destinée à émettre, en direction d'un échantillon fluorescent à analyser 3, au moins un rayonnement lumineux d'excitation 4. La source lumineuse 2 peut également émettre d'autres rayonnements 5 inutiles dans l'imagerie de fluorescence. Un filtre d'excitation 6 est, alors, disposé entre la source lumineuse 2 et l'échantillon 3 de manière à ne laisser passer que le rayonnement lumineux d'excitation 4. Lorsque le rayonnement 4 atteint l'échantillon 3, celui-ci ré-émet un signal de fluorescence 7 qui est détecté par un système d'imagerie 8. Pour éviter que le signal détecté ne soit perturbé par le rayonnement lumineux d'excitation 4, un filtre d'émission 9 est disposé entre l'échantillon 3 et le système d'imagerie 8, de manière à ne laisser qu'une très faible partie du rayonnement lumineux d'excitation 4.
Pour des échantillons ou des champs opératoires à observer de très petites dimensions, ie système d'imagerie est, par exemple, un microscope ou une
loupe binoculaire. Dans ce cas, il existe de très nombreuses sources lumineuses adaptées à ce type de matériel.
Par contre, pour des champs opératoires plus importants, le système d'imagerie 8 est généralement formé par un détecteur 2D de type caméra CCD, avec un grandissement adapté aux dimensions du champ observé. Il est, alors, difficile de trouver une source lumineuse adaptée à ce type de matériel, notamment pour couvrir un champ opératoire ayant un diamètre supérieur e 10cm.
En effet, dans ce type d'applications pour le domaine de l'imagerie de fluorescence, il existe de nombreuses contraintes que les systèmes d'imagerie de fluorescence avec les sources lumineuses actuelles, ne permettent pas de satisfaire. Ainsi, Ia puissance du rayonnement lumineux d'excitation doit être stable dans le temps et les utilisateurs des dispositifs d'imagerie de fluorescence souhaitent, généralement, pouvoir se servir de rayonnements lumineux d'excitation présentant deux plages de longueurs d'ondes distinctes. De plus, le filtre d'émission doit avoir un bon pouvoir de coupure pour le rayonnement lumineux d'excitation et il est généralement souhaitable d'obtenir une uniformité d'éclairage inférieure à ± 20% sur un champ opératoire présentant un diamètre de 100mm éclairé à une distance donnée.
Objet de l'invention
L'invention a pour but un dispositif d'imagerie de fluorescence remédiant aux inconvénients de l'art antérieur.
Plus particulièrement, l'invention a pour but un dispositif d'imagerie de fluorescence comportant une source lumineuse adaptée à des champs opératoires de dimensions relativement élevées.
Selon l'invention, ce but est atteint par les revendications annexées.
Plus particulièrement, ce but est atteint par le fait que la source lumineuse est en forme d'anneau et par le fait qu'elle comporte une alternance de premières et secondes zones respectivement aptes à émettre des premier et second rayonnements lumineux ayant respectivement des première et seconde longueurs d'onde distinctes, chacune des zones comportant une pluralité de sources élémentaires de lumière, contrôlables indépendamment par des moyens de contrôle sélectif de l'éclairage desdites sources élémentaires.
Description sommaire des dessins
D'autres avantages et caractéristiques ressortiront plus clairement de la description qui va suivre de modes particuliers de réalisation de l'invention donnés à titre d'exemples non limitatifs et représentés aux dessins annexés, dans lesquels :
La figure 1 illustre un mode particulier de réalisation d'un dispositif d'imagerie de fluorescence selon l'art antérieur.
La figure 2 représente schématiquement un mode particulier de réalisation d'un dispositif d'imagerie de fluorescence selon l'invention.
La figure 3 représente une vue de dessous de la source lumineuse en forme d'anneau du dispositif selon la figure 2. La figure 4 représente une première zone de la source lumineuse selon la figure 3.
Les figures 5 et 6 illustrent un fond blanc diffusant émettant un signal de fluorescence en réponse à un rayonnement lumineux d'excitation, avec respectivement un filtre d'émission et sans filtre d'émission. La figure 7 représente l'évolution de la puissance du rayonnement lumineux d'excitation reçue par un objet, en fonction du diamètre du support et pour différentes distances entre la source lumineuse et ledit objet, la source lumineuse comportant 140 sources élémentaires émettant un rayonnement lumineux avec une longueur d'onde de l'ordre de 470nm. La figure 8 représente l'évolution de la puissance du rayonnement lumineux d'excitation reçue par un objet en fonction du nombre de sources élémentaires activées.
Description de modes particuliers de réalisation
Dans un mode particulier de réalisation représenté sur la figure 2, un dispositif d'imagerie de fluorescence 10 comporte un bâti 11 muni d'au moins deux éléments verticaux 12a et 12b, parallèles entre eux et supportant un élément horizontal 13.
Un dispositif de mesure 14 d'un signal de fluorescence, tel qu'une caméra de type CCD, est solidaire, par sa partie supérieure, de l'élément horizontal 13 du bâti 11 et il est muni, en sa partie inférieure, d'un objectif 15. Une source lumineuse 16 en forme d'anneau est rendue solidaire du bâti 11 par l'intermédiaire des éléments verticaux 12a et 12b auxquels elle est fixée. Par ailleurs, différents types d'objectifs peuvent être adaptés sur le dispositif de mesure 14.
La source lumineuse 16 et le système de mesure 14 sont, de préférence, disposés de manière à être coaxiaux (axe A1 sur la figure 2) et l'objectif 15 du système de mesure 14 et la source lumineuse 16 sont dirigés vers un
support 17 destiné à recevoir un objet à analyser par fluorescence. Le support 17 est placé sous la source lumineuse 16. Il est, plus particulièrement, centré sur l'axe A1 , commun à la source lumineuse 16 et au système de mesure 14.
Comme représenté sur la figure 3, la source lumineuse 16 est sous la forme d'un anneau, ce qui présente l'avantage de rendre l'éclairement très uniforme. Préférentiellement, l'anneau présente un diamètre interne d1 supérieur ou égal à 100mm et un diamètre externe d2 inférieur ou égal à 300mm. Par ailleurs, la source lumineuse 16 comporte une alternance de premières et secondes zones 16a et 16b. Les premières et secondes zones 16a et 16b sont respectivement aptes à émettre des premier et second rayonnements lumineux, dits rayonnement lumineux d'excitation et ayant respectivement des première et seconde longueurs d'onde X1 et X2 distinctes. Préférentiellement, les première et seconde longueurs d'onde d'excitation X1 et X2 sont respectivement de l'ordre de 470nm et de l'ordre de 633nm. Par ailleurs, le terme "longueur d'onde d'excitation" ne doit pas être interprété comme étant limité à une valeur prédéterminée de longueur d'onde mais comme une bande spectrale relativement étroite centrée sur ladite longueur d'onde X1 ou X2. Lorsque X1 et X2 sont respectivement de l'ordre de 470nm et de l'ordre de 633nm, on peut considérer que les premières et secondes zones 16a et 16b de la source lumineuse 16 émettent des rayonnements d'excitation, respectivement bleu et rouge.
Les zones 16a et 16b peuvent être de section circulaire et elles peuvent être réparties uniformément dans l'anneau. Par ailleurs, chaque zone 16a et 16b comporte une pluralité de sources élémentaires de lumière. Ainsi, comme illustrée sur la figure 4, une première zone 16a, de section circulaire, comporte trente-cinq sources élémentaires 18 réparties uniformément et de manière concentrique à l'intérieur de la zone 16a. Les sources élémentaires 18 sont, par exemple, des diodes électroluminescentes.
De manière préférentielle, pour obtenir des premières et secondes zones 16a, 16bn respectivement aptes à émettre des premier et second rayonnements lumineux d'excitation avec respectivement des première et seconde longueurs d'onde X1 et X2 distinctes, un filtre, dit filtre d'excitation, peut être associé à chaque zone 16a et 16b de la source lumineuse 16. Ainsi, sur la figure 2, les deux zones 16a et 16b représentées sont munies de filtres d'excitation respectivement 19a et 19b et, sur la figure 3, chaque zone 16a ou 16b est munie d'un filtre d'excitation correspondant 19a ou 19b. Les filtres d'excitation 19a et 19b permettent, en particulier, de sélectionner la bande spectrale du rayonnement lumineux émis par la zone auquel est associé ledit filtre. Grâce aux filtres d'excitation, le support 17 n'est éclairé que par un rayonnement lumineux d'excitation prédéterminé, c'est-à-dire ayant une longueur d'onde prédéterminée et choisie par l'utilisateur, les rayonnements parasites étant bloqués par le filtre d'excitation correspondant.
Enfin, les sources élémentaires 18 sont contrôlables indépendamment. Le contrôle des sources élémentaires 18 est réalisé par des moyens de contrôle sélectif de l'éclairage desdites sources élémentaires. Ainsi, sur la figure 2, la source lumineuse 16 est connectée à un boîtier de contrôle 20 permettant de contrôler indépendamment les sources élémentaires de lumière 18 de chaque zone 16a et 16b. Les moyens de contrôle comportent, de préférence, des moyens d'activation des premières ou des secondes zones 16a ou 16b de la source lumineuse 16, permettant, ainsi, à l'utilisateur de choisir, entre les deux longueurs d'onde possibles X1 et X2, la longueur d'onde d'excitation du rayonnement d'excitation qui va être émis. Plus généralement, l'utilisateur choisit, entre les premières et les secondes zones 16a et 16b, le type de zones qu'il souhaite activer pour observer le phénomène de fluorescence. Lorsque X1 et K2 sont respectivement de l'ordre de 470nm et de l'ordre de 633nm, l'utilisateur choisit d'activer soit les zones émettant un rayonnement d'excitation bleu, soit les zones émettant un rayonnement d'excitation rouge.
Les moyens de contrôle comportent, également, de préférence, des moyens de sélection du nombre de sources élémentaires 18 des zones 16a ou 16b à activer. L'utilisateur peut alors choisir et ajuster la puissance du rayonnement lumineux d'excitation qui va être émis. La puissance d'éclairement de la source lumineuse 16 est donc variable.
Le système d'imagerie de fluorescence peut également comporter un filtre d'émission ne laissant passer que le signal de fluorescence. Ce filtre est disposé entre le support 17 et l'objectif 15. Dans un mode particulier de réalisation, le filtre d'émission peut, par exemple, comporter au moins des premier et second filtres élémentaires portés par une roue à filtres. Les filtres élémentaires d'émission sont alors choisis de manière à être aptes à bloquer respectivement les premier et second rayonnements lumineux d'excitation émis par les premières et secondes zones 16a et 16b de la source lumineuse 16. De plus, la roue à filtres peut être contrôlée pour placer, devant l'objectif 15, le filtre élémentaire correspondant au rayonnement lumineux d'excitation émis à un instant donné. Le dispositif d'imagerie représenté sur la figure 2 comporte, à titre d'illustration, une roue à filtres 21 désaxée par rapport à l'axe A1 et apte à tourner autour de l'élément vertical 12a. Un filtre élémentaire d'émission 22 est représenté sur la figure 2, en position devant l'objectif 15. La roue à filtres permet de changer instantanément le filtre d'émission selon la longueur d'onde d'excitation choisie par l'utilisateur. De plus, la roue à filtre et la liaison entre la roue à filtre et l'objectif 15 sont conçues de façon à être étanches à tout rayonnement lumineux ne passant pas par le filtre d'émission.
Comme représenté sur les figures 5 et 6, le pouvoir de coupure Pc des premier et second filtres élémentaires d'émission 22, utilisés dans le dispositif d'imagerie représenté sur la figure 2 et respectivement associés à des rayonnements lumineux d'excitation bleu et rouge, a été mesuré en utilisant, comme objet à analyser, un fond blanc 23 diffusant et faiblement
fluorescent. Le pouvoir de coupure Pc correspond au rapport entre le signal 24a détecté par un objectif 15 lorsqu'un filtre élémentaire 22 est disposé entre l'objectif et le fond 23 et le signal 24b détecté par l'objectif lorsqu'il n'y a pas de filtre élémentaire 22. Le pouvoir de coupure du premier filtre élémentaire, associé à la longueur d'onde de 470nm est de 9.10"6 tandis que le pouvoir de coupure Pc du second filtre élémentaire associé à la longueur d'onde de 633nm est de 5.10"6.
Un dispositif de mesure tel que celui représenté à la figure 2 peut également comporter des moyens de réglage de la distance entre la source lumineuse
16 et le support 17. Ainsi, la figure 7 représente l'évolution de la puissance du rayonnement lumineux d'excitation reçue par un objet disposé sur le support 17, le long d'un diamètre, pour différentes distances entre la source lumineuse 16 et ledit objet. La source lumineuse comporte, dans ce cas, 140 sources élémentaires de lumière 18 émettant un rayonnement lumineux bleu.
Des mesures ont été réalisées pour des distances entre la source lumineuse et le support, respectivement de 125mm (courbes A et B), de 135mm (courbes C et D) et de 145mm (Courbes E et F) et dans deux directions perpendiculaires. Les courbes A a F permettent de constater que plus la source lumineuse est proche de l'objet à analyser, plus l'uniformité d'éclairement se creuse au centre. A l'inverse, plus elle s'éloigne de l'objet, plus l'intensité augmente au centre. On observe le même phénomène lorsque les sources de lumières émettant un rayonnement lumineux rouge sont activées.
La puissance d'un rayonnement lumineux d'excitation, soit bleu, soit rouge, reçue au centre d'un champ opératoire de 100mm de diamètre, ainsi que les puissances maximale et minimale reçues par ledit champ opératoire ont été mesurées et reportées dans le tableau ci-dessous, pour un nombre de
sources élémentaires de lumière (diodes électroluminescentes ou LED) émettrices dudit rayonnement, variant de 140 à 24 (Essai 1 à 6).
Distance 135mm - Champ 100mm et rayonnement d'excitation bleu
Ecart positif = (Puissance maximale - Puissance au centre) / Puissance au centre
Ecart négatif = (Puissance minimale - Puissance au centre) / Puissance au centre.
Ces deux écarts reflètent l'uniformité ± d'éclairement en pourcentage.
Le tableau ci-dessus permet, ainsi, de constater, que pour tous les essais, l'uniformité ± d'éclairement est inférieure à 20% et que les écarts positifs et négatifs augmentent lorsque le nombre de sources de lumière élémentaires diminue. De plus, que ce soit avec un rayonnement d'excitation bleu ou un rayonnement d'excitation rouge, il est possible de réduire le champ utile pour améliorer l'uniformité. En passant, par exemple, à un diamètre de δOmmn, on obtient une uniformité ± d'éclairement inférieure à 10%.
La figure 8 illustre par ailleurs l'évolution de la puissance du rayonnement d'excitation reçue par un objet en fonction du nombre de sources élémentaires de lumière (LED émettant à 470nm) activées pour une distance entre la source lumineuse 16 et ledit objet de respectivement 145mm (Courbe G), 135mm (Courbe H) et 125mm (Courbe I). Dans les trois cas, la puissance d'éclairement varie linéairement en fonction du nombre de LED allumées.
Un dispositif d'imagerie de fluorescence selon l'invention présente l'avantage de comporter une source lumineuse, annulaire, avec deux longueurs d'onde distinctes, dites longueurs d'onde d'excitation. Une telle source lumineuse permet, plus particulièrement, à un utilisateur, de choisir la longueur d'onde
d'excitation permettant d'observer le phénomène de fluorescence et de régler, et éventuellement faire varier, la puissance d'éclairement. L'ensemble de ces éléments permettent alors d'obtenir une source lumineuse et, plus particulièrement, un dispositif d'imagerie de fluorescence particulièrement adapté à des champs opératoires de dimensions relativement élevées. Il permet également d'obtenir un éclairage uniforme sur un champ opératoire donné et cet éclairage reste uniforme lorsque la puissance d'éclairage varie et si la distance entre la source lumineuse et l'objet à analyser reste dans une fourchette donnée.
Claims
1. Dispositif d'imagerie de fluorescence (10) comportant au moins une source lumineuse (16), caractérisé en ce que la source lumineuse est en forme d'anneau et en ce qu'elle comporte une alternance de premières et secondes zones (16a, 16b) respectivement aptes à émettre des premier et second rayonnements lumineux ayant respectivement des première et seconde longueurs d'onde (X1, X2) distinctes, chacune des zones (16a, 16b) comportant une pluralité de sources élémentaires de lumière (17), contrôlables indépendamment par des moyens de contrôle sélectif de l'éclairage (20) desdites sources élémentaires (17).
2. Dispositif selon la revendication 1 , caractérisé en ce que les moyens de contrôle sélectif de l'éclairage (20) comportent des moyens d'activation des premières ou des secondes zones (16a, 16b).
3. Dispositif selon la revendication 2, caractérisé en ce que les moyens de contrôle sélectif de l'éclairage (20) comportent des moyens de sélection du nombre de sources élémentaires (17) desdites zones (16a, 16b) à activer.
4. Dispositif selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que les sources élémentaires de lumière (17) sont constituées par des diodes électroluminescentes.
5. Dispositif selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que l'anneau formant la source lumineuse (16) présente un diamètre interne (d^ supérieur ou égal à 100mm et un diamètre externe (d2) inférieur ou égal à 300mm.
6. Dispositif selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que les premières et secondes zones (16a, 16b) sont réparties uniformément dans l'anneau.
7. Dispositif selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce qu'un filtre (19a, 19b) est associé à chaque zone (16a, 16b) de la source lumineuse (16).
8. Dispositif selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisé en ce qu'il comporte au moins:
- un support (17) sur lequel est disposé un objet à analyser
- et un dispositif de mesure (14) du signal émis par l'objet en réponse à un rayonnement lumineux émis par la source lumineuse (16) et comportant un objectif (15).
9. Dispositif selon la revendication 8, caractérisé en ce que l'anneau formant la source lumineuse (16) et l'objectif (15) du dispositif de mesure (14) sont coaxiaux.
10. Dispositif selon l'une des revendications 8 à 9, caractérisé en ce qu'au moins un filtre d'émission ne laissant passer que le signal émis par l'objet est disposé entre le support (17) et l'objectif (15).
11. Dispositif selon la revendication 10, caractérisé en ce que le filtre d'émission comporte au moins des premier et second filtres élémentaires
(22) portés par une roue à filtres (21) et aptes à bloquer respectivement les premier et second rayonnements lumineux émis par la source lumineuse (16) et en ce que des moyens de contrôle de ladite roue permettent de placer devant l'objectif le filtre élémentaire (22) correspondant au rayonnement lumineux d'excitation émis.
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