WO2006134198A2 - Aislamiento y caracterización del mutante csb3-1 de arabidopsis thaliana, y su uso como regulador de la resistencia en plantas a enfermedades producidas por patógenos biotróficos. - Google Patents

Aislamiento y caracterización del mutante csb3-1 de arabidopsis thaliana, y su uso como regulador de la resistencia en plantas a enfermedades producidas por patógenos biotróficos. Download PDF

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    • C12N9/88—Lyases (4.)

Definitions

  • the present invention falls within the technical field of plant biotechnology, and specifically refers to the identification and characterization of the csbS-l mutant of Arabidopsis thaliana, as well as its function in the regulation of resistance to diseases caused by biotrophic pathogens, and its applications in the generation of plants resistant to this type of pathogens.
  • Salicylic acid is an essential signal molecule that plays a central role in the induction of SAR (Delaney, TP, Uknes, S., Vernooij, B., Friedrich, L., Weymann, K., Negrotto, D ., Gaffney, T., Gut-Rella, M., Kessmann, H., Ward, E., and Ryals, J. (1994). A central role of salicylic acid in plant disease resistance. Science 266, 1247-1250 .). Numerous mutant plants involved in the accumulation or perception of SA show increased susceptibility to biotrophic pathogens, while the imitators that produce an excess of SA have an increase in resistance.
  • Arabidopsis thaliana mimics that are unable to activate SA-dependent defensive responses have been isolated (Durrant and Dong, 2004).
  • Arabidopsis enhanced disease susceptibility mutants exhibit enhanced susceptibility to several bacterial pathogens and alterations in PR-I gene expression.
  • Salicylic acid induction-deficient mutants of Arabidopsis express PR-2 and PR-5 and accumulate high levéis of camalexin after pathogen inoculation.
  • SID2 codes for an alleged isocorysmate synthase located in the chloroplast (Wildermuth et al., 2001), while EDS5 codes for a membrane-associated protein and located in the chloroplast that shows homology with MATE transporters (toxin extrusion and multiple drugs) (Nawrath et al., 2002).
  • SABP3 The tobaceous salicylic acid-binding protein 3 (SABP3) is the chloroplast carbonic anhydrase, which exhibits antioxidant activity and plays a role in the hypersensitive defense response. Proc Nati Acad Sci USA 99, 11640-11645 .; Ishikawa, A., Okamoto, H., Iwasaki, Y., and Asahi, T. (2001). A deficiency of coproporphyrinogen III oxidase cause s lesion formation in Arabidopsis. Plant J.
  • the Arabidopsis-accelerated cell death gene ACD2 encodes red chlorophyll catabolite reductase and suppresses the spread of disease symptoms. Proc. Nati Acad. Sci. USA 98, 771-776.).
  • a chloroplast-derived signal has been implicated in the control of SA and the pathogen-activated defensive response that depends on the presence of light or a photosynthetic functional chloroplast (Genoud, T., Buchala, AJ, Chua, NH. And Métraux , JP. (2002).
  • Phytochrome signalling modulates the SA-perceptive pathway in Arabidopsis. Plant J. 31, 87-95.).
  • the edsl and pad4 mimics (phytoalexin deficient4 [deficient emphytoalexin 4J) block the biosynthesis of SA triggered by infection with virulent pathogens (Feys, BJ., Moisan, LJ, Newman, MA, and Parker, JE (2001). Direct interaction between the Arabidopsis disease resistance signaling proteins, EDSl and PAD4.
  • Constitutive salicylic acid-dependent signaling in cprl and cpr6 mutants requires PAD4.
  • Constitutive disease res istance requires EDSl in the Arabidopsis mutants cprl and cpr6 and is partially EDSl-dependent in cpr5. Plant J. 26, 409-420.).
  • EDSl and PAD4 are required for resistance conferred by a subset of R genes (ie, TIR-NB-LRR).
  • Ankyrin NPRl repeat protein (which does not express PR-I) was initially identified in Arabidopsis through a genetic selection of mutants compromised in SAR (Cao, H., Glazebrook, J., Clarke, JD, Volko, S ., and Dong, X. (1997) .
  • NPR-I is an essential SAR regulator (Dong, X. (2004) NPRl, all things considered.
  • NPRl the spider in the web of induced resistance signaling pathways. Curr. Opin. Plant Biol. 7, 456-464.).
  • SA the redox imbalance of the cognate
  • NPRl translocates to the nucleus where it acts as a modulator of the expression of the PR gene through a selective interaction with members of the TGA subclass of the closing family ("zipper") of Basic leucines of transcription factors (Dong, 2004).
  • Zpper the TGA subclass of the closing family
  • a non-exhaustive list includes dirl ⁇ defective in induced resistance ⁇ [deficient in induced resistance I]; Maldonado, AM, Doerner, P., Dixon, RA, Lamb, CJ, and Cameron, RK (2002).
  • the dth9 mutant (detachment9 [detachment 9J) differs from nprl in that the expression of PR is unchanged.
  • the Arabidopsis ssil mutation restores pathogenesis-related gene expression in nprl plants and renders defensin gene expression salicylic acid dependent.
  • the Arabidopsis thaliana dihydroxyacetone phosphate reductase gene suppressor of fatty acid desaturase deficiency is required for glycerolipid metabolism and for the activation of systemic acquired resistance.
  • a gain-of-function mutation in a plant disease resistance gene leads to constitutive activation of downstream signal transduction pathways in suppressor of nprl-1, constitutive 1. Plant CeIl 15, 2636-2646.).
  • the sncl mutants ⁇ suppressor ofnprl-1, constitutive 1 [nprl-1 suppressor, constitutive IJ), snil (suppressor of nprl induciblel [suppressor of nprl inducible IJ) and ssi2 (suppressor ofSA insensitivity2 [suppressor of SA 2J insensitivity ) show constitutive PR expression and increased resistance against biotrophic pathogens.
  • the sonl mutant suppressor ofniml-1 [niml-I suppressor] provides SAR without induction of the PR gene and defines a new phenomenon that has been called resistance independent of SAR or ISR (Hammond-Kosack, KE, and Parker, JE (2003). Deciphering plant-pathogen communication: fresh perspectives for molecular resistance breeding. Curr. Opin. Biotechnol. 14, 177-193.).
  • An object of the present invention is the isolation and characterization of a mutant of the CSB 3 gene (SEQ. ID.NO. 2) of Arabidopsis thaliana, called csb3-l (derived from constitutive subtilisin3 [constitutive subtilisin 3J) (SEC. ID NO.1) with increased resistance to biotrophic pathogens and deregulated in the expression of a previously characterized gene promoter that controls the expression of a pathogen-inducible subtilisin protease (P69C).
  • CSB 3 was isolated by cloning based on the mapping and was shown to code for an l-hydroxy-2-methyl-2-butenyl-4-diphosphate synthase, an enzyme that controls one of the terminal stages of isopentenyl diphosphate biosynthesis (IPP) through the 4-phosphate route of 2-C-methyl-D-erythritol (MEP) that is produced in the chloroplast of the upper plants.
  • IPP isopentenyl diphosphate biosynthesis
  • MEP 2-C-methyl-D-erythritol
  • CSB3 controls the critical aspects of the route of resistance to disease mediated by SA against biotrophic pathogens.
  • Another object of the present invention is the use of the csb3-l mutant allele in plant species of agronomic interest, to obtain varieties resistant to diseases caused by biotrophic pathogens, inhibiting the CSB3 gene or the protein activity encoded by it. in order to increase the synthesis and accumulation of salicylic acid and therefore of resistance to biotrophic pathogens.
  • the P69C gene encodes a protease similar to subtilisin, originally identified in tomato plants (Jorda, L., and Vera, P. (2000). Local and systemic induction of two defenserelated subtilisin-like protease promoters in transgenic Arabidopsis plants Luciferin induction of PR gene expression. Plant Physiol. 124, 1049-1058.). Arabidopsis transgenic plants that contain a 2.5 kb region of the P69C 5 'promoter fused to the ®-glucuronidase (GUS) reporter gene reveals rapid transcriptional activation of this gene by SA and during the course of compatible and incompatible interactions with Pseudomonas syringae pv.
  • GUS ®-glucuronidase
  • tomato DC3000 (Pst DC3000) (Jordá et al., 2000). Induced expression is observed in local inoculated leaves (ie, after inoculation with Pst DC3000 carrying avrRpml (Pst DC3000 avrRpml)), as well as in non-inoculated distal leaves of the same plant. Interestingly, the expression induced in the inoculated leaves takes place at a distance from the area where the HR is executed. The expression of the P69C-GUS transgene occurs at points distributed throughout the leaf blade of both local and distal leaves, as visualized by the deposition of indigo blue derived from the X-gluc used as a substrate. .
  • Csb3 plants can be distinguished from wild plants, due to their characteristic atrophied phenotype and curly leaves (Figure IA). Histochemical staining was performed to determine GUS activity, to investigate the pattern of constitutive expression of the reporter gene in csb3 plants. As shown in Figures IB-C, no GUS activity was detected in the original wild seedlings. On the contrary, csb3 seedlings showed GUS staining in cotyledons and a more pronounced expression of GUS activity in rosette leaves of plants with full growth.
  • csb3 / csb3 plants were backcrossed with wild CSB3 / CSB3 plants containing the P69C-GUS transgene and the resulting progeny Fl and F2 were analyzed to determine GUS staining. Since the constitutive expression of GUS was absent in all the Fl plants analyzed, it was concluded that the constitutive expression of GUS mediated by csb3 was inherited as a recessive character.
  • the csb3 mutant has an increase in resistance against biotrophic pathogens but not against necrotophics.
  • Wild plants and csb3 were also exposed to the virulent bacterial pathogen Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 (Pst DC3000), another biotrophic pathogen from Arabidopsis. After inoculation, the growth rate of the pathogen was controlled in the infected leaves. The resulting growth curves are shown in Figure 2C.
  • the number of colony forming units of Pst DC3000 detected in csb3 plants was 30 to 60 times lower than the number detected in wild plants after 3 or 5 days of growth. Therefore, csb3 plants also show increased resistance against this bacterial pathogen.
  • NahG codes for a salicylate hydroxylase that blocks the accumulation of SA in the cytosol by degradation of SA to catechol (Delaney, TP, Uknes, S., Vernooij, B., Friedrich, L., Weymann, K., Negrotto, D. , Gaffhey, T., Gut-Rella, M., Kessmann, H., Ward, E., and Ryals, J. (1994). A central role of salicylic acid in plant disease resistance. Science 266, 1247-1250) . In the csb3 NahG plants, the increased resistance conferred by the csb3 mutation is again suppressed and the hypersensitivity of NahG to Pst DC3000 is imposed (Figure 3A).
  • dth9 Another mutant committed to SAR is dth9.
  • dth9 plants continue to retain the ability to express PR genes in response to SA or pathogenic attack (Mayda, E., Mauch-Mani, B., and Vera, P. (2000 )
  • Arabidopsis dth9 mutation identifies a gene involved in regulating disease susceptibility without affecting salicylic acid-dependent responses. Plant CeIl 12, 2119-2128.).
  • the double csb3 dth9 mutant plants showed increased susceptibility to Pst DC3000 attributable to the dth9 mutation (Figure 3A), but unlike nprl, the expression of the PR-I marker gene attributable to the csb3 mutation is maintained. intact (figure 3B), thus indicating that the resistance of csb3 also depends on DTH9.
  • the csb3 cprl mutant phenotype could suggest that the csb3 mutation and the cprl mutation contribute to its characteristic increase in SA accumulation and respective resistance increase phenotype through independent pathways after the 3 'end of accumulation of SA. All these observations reinforce the consideration that the synthesis and perception of SA are fundamental to the resistance associated with csb3.
  • the loss of the resistance increase conferred by the csb3 mutation is even more striking in the scs4 csb3 and scs9 csb3 plants.
  • the scs4 csb3 and scs9 csb3 plants become much more susceptible to Pst DC3000 than wild plants and allow a more than 100-fold increase in bacterial growth when compared to csb3 plants ( Figure 4C).
  • the hypersusceptibility of the scs9 csb3 to Pst DC3000 plants was even higher than that observed in nprl plants and comparable to that recorded for dth9 plants when a side-by-side experiment was performed; however, none of the scs mutations are allelic with respect to nprl, dth9 or any of the previously mentioned mimics.
  • genetic analyzes indicate that the four scs mutations are not allelic among them, are extragenic to csb3, and the phenotype conferred by each of the scs mutations is maintained even in the absence of the csb3 mutation.
  • SSLP single sequence length polymorphism markers
  • the CIWlO marker on chromosome 5 showed coaggregation with the csb3 phenotype. Further analysis of this region showed that the mutation was located between the ngal29 and MBK-5 markers, which are separated by 15 cM. To limit the region in which CSB 3 was located, the Cereon Genomics large insertion / deletion database was used to design SSLP markers.
  • CSB 3 was limited to two BAC clones (MUF9 and MUP24) comprising a 66 kb region containing 21 open reading frames (ORF) (Figure 5A).
  • the entire region of each of these genes was amplified from csb3 plants and the sequences of the PCR products were determined.
  • the sequence corresponding to the At5g60600 gene was identified as the only one to show a single point mutation.
  • This gene contains 20 exons and the csb3 mutation (hereafter csb3-1) represented a transition from G to A in the exon 19 coding chain that leads to a change of amino acids from GIy to Asp.
  • csb3-1 represented a transition from G to A in the exon 19 coding chain that leads to a change of amino acids from GIy to Asp.
  • CSB 3 is a single copy gene that codes for l-hydroxy-2-methyl-2-butenyl-4- diphosphate [HMBPP] synthase (HDS) located in the chloroplast that catalyzes the formation of HMBPP from 2.4 2-C-methyl-D-erythritol (MEcPP) cyclodiphosphate using a mechanism still unknown (Hecht, S., Eisenreich, W., Adam, P., Amslinger, S., Kis, K., Bacher, A. , Arigoni, D., and Rohdich, F. (2001). Studies on the nonmevalonate pathway to terpens: the role of the GcpE (IspG) protein. Proc. Nati. Acad.
  • HDS 2-C-methyl-D-erythritol
  • GcpE an essential enzyme of the nonmevalonate pathway of isoprenoid biosynthesis.
  • the HDS enzyme controls one of the terminal stages of the biosynthesis of isopentenyl diphosphate (IPP) and dimethylaryl diphosphate (DMAPP) through the 2-C-methyl-D-erythritol (MEP) 4-phosphate pathway independent of mevalonate that is produced in the chloroplast of the upper plants (figure 6).
  • the MEP pathway located in the plastid, together with the cytosolic mevalonate-dependent route (MVA) is responsible for the synthesis of isopentenyl diphosphate (IPP) and its dimethylaryl diphosphate isomer (DMAPP), the immediate precursors for biosynthesis of isoprenoides (Figure 6) (Rohmer, M. (1999).
  • the HDS enzyme is conserved in microorganisms in which it is known as GCPE (Kollas et al., 2002), despite the difference with the mature plant HDS enzyme that contains a large internal protein domain that is absent in the bacterial counterpart ( figure 5D). This additional domain can confer different regulatory or catalytic functions to the plant enzyme (Querol J, Campos N, Imperial S, Boronat A, Rodr ⁇ guez-Concep
  • Arabidopsis genes essential for seedling viability Isolation of insertional mutants and molecular cloning Genetics 159, 1765-1778.) Produce the same deadly albino seedling phenotype. This suggests that the MEP pathway is essential for the plant and that the csb3-l allele identified in the present invention is a partial loss of function and not a null mutant.
  • the Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation was used to introduce csb3-l plants into a cDNA that corresponds to At5g60600, under the control of the CaMV 35S promoter (construct 35S-CSB3) .
  • transgenic lines were generated with the 35SCSB3 construct and some of them were studied in detail. All the generated transgenic lines had lost the characteristic morphological phenotype attributable to the csb3-l mutation and had regained a natural external appearance (see Figure 7A). In addition, the transformants lost the constitutive expression of the P69CGUS gene ( Figure 7A), as well as the constitutive expression of the genes related to SA, that is, PR-I and GST6, which was characteristic of the non-transformed csb3-l plants ( Figure 7C). In addition, the expression of At5g606000 under the control of the 35S promoter in csb3-l transgenic plants suppresses the increase in resistance against Pst DC3000.
  • CSB 3 in response to infection by P. syringae was analyzed in wild plant leaves at different time intervals after inoculation and in a context that generates a compatible interaction (i.e., after inoculation with Pst DC3000) or an incompatible one (that is, after inoculating with Pst DC3000 ⁇ avrRpml)).
  • the presence of CSB 3 mRNA was studied by RT-PCR. These analyzes revealed that the infection with Pst DC3000 that carried the avirulence gene, avrRpml gene, and therefore, that incited an RH response in the inoculated tissue, was followed by a marked decrease in the level of accumulation of CSB mRNAs.
  • Phosmidomycin complements the increase in resistance of csb3-l plants against Psi DC3000.
  • An increase in the accumulation of the substrate (MEcPP) of the CSB3 / HDS enzyme or of any of the metabolic intermediates that precede the accumulation of MEcPP in the MEP pathway ( Figure 6) could be responsible for the increase in plant resistance csb3-l.
  • a decrease in the synthesis of the product (HMBPP) of the same enzyme could compromise the synthesis and accumulation of the final products (that is, IPP and DMAPP) ( Figure 6), which, in turn, can compromise the subsequent biosynthesis of the different isoprenoids that must be derived from the MEP route.
  • phosmidomycin treatments were carried out at much lower doses and for more restricted periods of time, than those used experimentally by others (Laule et al., 2003). Wild saplings and csb3-1 were sprayed once with a 25 ⁇ M or 50 ⁇ M solution of fosmidomycin at 48 hours and 24 hours before inoculation with Pst DC3000, and bacterial growth was recorded in plants inoculated at 0, 3 and 5 dpi The treated plants were also tested to determine the effect on the normal expression of the P69C-GUS gene.
  • csb3-l is a partial recessive mutation of loss of function that results in the activation of plant defenses. Consistent with the observed increase in resistance to biotrophic pathogens, csb3-l plants show increased accumulation of SA at rest and an additional ability to increase biosynthesis over wild levels after exposure to Pst DC3000.
  • csb3-l also requires components that function as transducers of the SA-derived defense signal (such as NPRl), as demonstrated by the imitating double plants csb3 nrpl that behave as nprl with respect to to the lack of PR gene expression and hypersusceptibility to infection with Pst DC3000.
  • NPRl the SA-derived defense signal
  • CSB 3 CSB 3 gene was identified.
  • CSB 3 complemented the csb3-1 mutation, as shown, by reducing the expression of PR genes, as well as reversing the increase in resistance in plants.
  • csb3-l transgenic expressing CSB 3 Figure 7 BC. Therefore, the CSB3 epistasis was confirmed again to the accumulation of SA and the expression of PR and increased resistance against Pst DC3000.
  • analysis of gene expression in wild plants revealed that CSB 3 is moderately expressed under resting conditions and expression is regulated by decrease after infection with Pst DC3000.
  • scs mutants In the effort to identify suppressors of the csb3-l mutant, in the present invention called scs mutants, csb3-l seeds were mutagenicized with EMS and M2 plants were selected to look for plants that had lost the characteristic dwarf phenotype and csb3 resistance -l versus Pst DC3000.
  • Four scs mutants were identified in which the increase in resistance to this pathogen was reversed to a level comparable to that achieved in wild plants (i.e., in scs2 and scs 11 plants; Figure 4) or even further inhibited to make these plants hypersusceptible to the same pathogen (that is, in scs9 and scsll plants; figure 4).
  • the identified scs mutants correspond to non-allelic recessive mutations that are extragenic with respect to the csb3 locus and conferred the same phenotype even in the absence of the csb3-l mutation.
  • the CSB 3 gene codes for l-hydroxy-2-methyl-2-butenyl-4-diphosphate [HMBPP] synthase that catalyzes the formation of HMBPP from 2-C-methyl-D-erythritol 2,4-cyclodiphosphate [MEcPP] (Kollas et al., 2002).
  • HMBPP l-hydroxy-2-methyl-2-butenyl-4-diphosphate
  • MEcPP 2-C-methyl-D-erythritol 2,4-cyclodiphosphate
  • This enzymatic activity controls one of the terminal stages of the biosynthesis of isopentenyl diphosphate [IPP] and its dimethylaryl diphosphate isomer [DMAPP] through the 2-C-methyl-D-erythritol (MEP) 4-phosphate pathway independent of the mevalonate that is produced in the chloroplast of the upper plants (figure 6).
  • the csb3-1 mutant is not predicted to be a null mutant, since other null alleles in the CSB 3 gene (i.e., csb3-2, and clb4 / csb3-3) are fatal.
  • the partial loss of function attributed to the substitution of GIy by Asp identified in the mutant protein csb3-l can be explained by taking into account that the introduction of an amino acid residue instead of a neutral one inside or near the motif 4Fe-4S, which is highly conserved in this type of enzymes, can alter a correct conformation in this domain which, in turn, can destabilize to some degree the correct folding of the enzyme. This coincides with the previous observation of other mutations that take place in the same region of the GCPE homologue of E. coli (Sauret-Güeto et al., 2003).
  • the activation of the SA pathway in the csbS-1 mutant is not due to a reduction of a compound that arises after the action of CSB3 / HDS that may compromise the subsequent enzymatic stages that lead to the biosynthesis of isoprenoids, but rather is the result of an excess accumulation of the direct substrate of HDS / CSB3, specifically MEcPP, or indirectly any of its immediate precursors.
  • fosmidomycin also affects the disease resistance response of wild plants against Pst DC3000, and treatment of plants with 50 ⁇ M of this inhibitor results in higher rates of bacterial growth (Figure 8A). This finding further reinforces the consideration that the same compound that accumulates excessively in csbS-1 plants and positively regulates the increase in resistance of the mutant is also important for normal disease resistance in wild plants.
  • E Levels of free SA and total SA in wild plants and csb3. The wild plants (wt) and csb3 were inoculated with Pst DC3000 or 10 mM MgSO 4 (test) and the amount of free SA and SA glycoside (SAG) determined 24 hours after inoculation. Each bar represents the average of three replicate samples with the standard deviation. Free SA and SA glycoside (SAG) were tested in the same samples.
  • Figure 2 Increased resistance of csb3 plants against biotrophic but not necrotrophic pathogens.
  • the plants were inoculated by applying 6 ⁇ l drops of spore suspension (5 x 10 6 spores / ml) of P. cucumerina to fully expanded leaves. Disease symptoms were evaluated 4 days after inoculation by determining the diameters Injury means on 3 sheets of 8 plants each time. The data points represent the average lesion size ⁇ SD of the measurements. The plants that carried the csb3 mutation were as resistant to this pathogen as wild plants.
  • (C) CSB 3 exon / intron structure The coding regions are indicated with thick lines. The positions of the csb3-l, csb3-2 and clb4 / csb3-3 mutations are shown at the top of each of the respective exons.
  • the insert presents the nucleotide exchange found in the csb3-l mutant and its influence on the protein sequence. The mutant allele is indicated below the wild sequence.
  • the capital letters mark the nucleotide sequences in the middle of exon 19.
  • the transition from "G" to "A” due to the mutagen is indicated in bold.
  • the deduced amino acid sequences are indicated as a code of individual letters below each nucleotide triplet and the bold letters mark the amino acid changes (G to D) in the protein sequences.
  • HDS hydroxymethylbutenyl-4-diphosphate synthase
  • GcpE hydroxymethylbutenyl-4-diphosphate synthase
  • conserved cysteine residues that are highly conserved in all HDS and GcpE enzymes are shown with an asterisk. Underlined are the conserved residues that comprise the badge ("signature") where the cluster [4Fe-4S] (Sauret-Güeto et al., 2003) is located. The glycine residue converted to aspartic residue in the csb3-l mutant is shown in bold in position 695 and is close to the conserved sequence that participates in the coordination of [4Fe-4S].
  • FIG. 6 Diagram of the metabolic route of mctyl-D-critritol 4-phosphate (MEP).
  • the abbreviations of the enzymes that catalyze each stage of the route are shown on the left side of the figure in bold as follows: 1-Deoxy-D-xylulose-5-phosphate synthase (DXS); 2C-methyl-D-erythritol-4-phosphate synthase (DXR); 4-diphosphocytidyl-2C-methyl-D-erythritol-4-phosphate synthase (CMS); 4-diphosphocytidyl-2C-methyl-D-erythritol kinase (CMK); 2C-methyl-D-erythritol-2,4-diphosphate synthase (MCS); 2C-methyl-D-erythritol-2,4-cyclodiphosphate reductase (HDS); l-hydroxy-2-methyl-buten
  • Figure 7 Complementation of csb3-l plants and regulation by decreasing the gene expression of CSB3 after infection with Pst DC3000.
  • A-C Phenotypic and molecular characterization of csb3-l plants stably transformed with a 35S-CSB3 gene construct.
  • A Morphological aspect of non-transformed csb3-l plants compared to two transgenic lines. Note the reversal towards a wild phenotype in the transgenic lines. Histochemical staining of the GUS activity directed by the P69C promoter on fully expanded rosette leaves obtained from non-transformed csb3-l plants and the two transgenic lines is shown in the same table.
  • Arabidopsis thaliana plants were grown in the soil or in plates containing Murashige and Skoog (MS) medium as described above (Marchda et al., 2000).
  • the csb3-l mutant was isolated in a selection to determine those constitutively expressing the P69C-GUS reporter gene in Columbia transgenic plants (CoI-0) subjected to mutagenesis with ethyl methanesulfonate (EMS), as described previously for other imitators (Mayda et al., 2000).
  • the mutant line csb3-l used in these experiments had been backcrossed at least four times with the original wild line.
  • the plants were grown in a growth chamber (19-23 ° C, fluorescent illumination of 100 ⁇ Em-2 sec-i) in a cycle of 10 hours of light and 14 hours of darkness. Unless otherwise indicated, fully expanded leaves of 4-week-old plants were used for all experiments. Staining to determine the presence of GUS activity was carried out as described above (Marchda et al., 2000).
  • Pseudomonas syringae pv was grown. tomato DC3000 and was prepared for inoculation as described above (Mayda et al., 2000). The plants were inoculated by the immersion method according to Tornero, P. and Dangl, JL (2001). A high-throughput method for quantifying growth of phytopathogenic bacteria in Arabidopsis thaliana. Plant J. 28: (4): 475-481 ..
  • the density of bacterial populations was determined by serial plate dilution culture on King's B medium supplemented with rifampicin (50 ⁇ g / ml) at 28 ° C and making a count of colony forming units at different times, as described above (Marchda et al., 2000). Data are reported as means and standard deviations of the logarithm (cfu / g fresh weight) of six to eight replicates. Resistance tests were performed against parasitic Hyaloperonospora in three-week-old plants sprayed with a suspension of 10 5 ml-1 conidiospores of tap water, as described previously (Marchda et al., 2000).
  • the density of the spores in the seedlings was assessed using a hemocytometer.
  • leaf samples were stained with trypan-lactophenol blue on different days after inoculation and examined under a microscope, as described above (Marchda et al., 2000).
  • three-week-old seedlings were transplanted into individual pots and grown at temperatures of 22 ° C during the day / 18 ° C at night with 12 hours of light every 24 hours.
  • cinerea (strain BMMl isolated from Pelargonium I Zonale) was grown on 19.5 g / 1 potato dextrose agar (Difco) at 20 0 C for 10 days. Conidia were collected and suspended in sterile PDS (12 g 1- ⁇ ; Difco). The plants were maintained at 100% RH and disease symptoms were evaluated 4 to 10 days after inoculation by determining the average lesion diameter in 3 leaves of 5 plants each time.
  • Crosses were made by cutting unopened buds and using the pistils as pollen containers. Backcrossing with the original transgenic line was performed using P69C-GUS plants as the pollen donor. Reciprocal crosses were also made. Fl and F2 plants were grown on MS plates and analyzed for GUS activity. Segregation of the phenotype in the F2 generation was analyzed to determine the adequacy of the fit with the chi-square test.
  • mutant alleles used throughout this study were nprl-1 (Cao et al. 1997), pad4-l, sid2-l (Wildermuth et al., 2001), eds5 (Nawrath et al., 2002) and dth9 (Mayda et al., 2000).
  • the transgenic plant in the Columbia ecotype
  • the double mutants csb3 nprl, csb3 pad4, csb3 sid2, csb3 eds5, csb3 dth9 and csb3 NahG were generated using csb3 as a pollen receptor.
  • the homozygous characteristic of the loci was confirmed using a molecular marker. for each of the alleles in segregating populations.
  • hypersusceptibility to Pst DC3000 was the criterion used to assess the homozygous characteristic. All double mimics were confirmed in the F3 generation.
  • RNA was isolated from wild plants and reverse transcribed using oligo (dT) primers, as described (Mayda, E., Tornero, P., Conejero, V., and Vera, P. (1999) A tomato homeobox gene (HD-Zip) is involved in limiting the spread of programmed cell death. Plant J. 20, 591-600.).
  • This cDNA was amplified by PCR using gene-specific primers designed to include the region before the 5 'end of the initiation codon and part of the 3' region that follows the termination codon of the CSB 3 gene.
  • the sequences of the direct primers and CSB 3 inverses used were: (5'-CTTCCTCTGGATCCTTCTCTTCTC-S ') and (5'-
  • the cDNA was cloned into the binary vector pBI121 (Clontech) under the control of the CaMV 35S constitutive promoter. From there the construct was transferred to pCAMBIA1300 resulting in pCAMBIA35SCSB3 which, in turn, was transferred to Agrobacterium and used to transform the csb3-l plants using the floral immersion method (Bechtold, N., Ellis, J. And Pelletier , G. (1993) In plant Agrobacterium mediated gene transfer by infiltration of adult Arabidopsis thaliana plants. CR Acad. Sci. Paris Life Sci. 316, 1194-1199.).
  • RNA samples of total RNA from leaf tissues were prepared using the Ambion Totally RNA kit (Austin, TX). Reverse transcription was performed using the RT kit for PCR from Clontech (Palo Alto, CA).
  • the sets of oligonucleotide primers (50 pmol each) used to amplify CSB3 were: CSB3PCR1 (5 GGAGGCCTTCTTGTGGATGG-3) / CSB3PCR2 (5'GCTGACCCAACGACCATGTTC-S ').
  • the primers used to amplify GST6 were GST6PCR1 (5'-ATGGCAGGAATCAAAGTTTCGGTCS ') / GST6PCR2 (5'- GAGATTCACTTAAAGAACCTTCTG -3').
  • the primers used to amplify PRl were PRlPCRl (5'-ATGAATTTTACTGGCTATTC-S ') / PR1PCR2 (5'- AACCCACATGTTCACGGCGGA-3').

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Abstract

La presente invención se encuadra dentro del campo técnico de la biotecnología vegetal, y en contacto se refiere a la identificación y caracterización del mutante csb3-l de Arabidopsis thaliana, así como su función en la regulación de la resistencia a enfermedades producidas por patógenos biotróficos, y sus aplicaciones en la generación de plantas resistentes a este tipo de patógenos.

Description

TÍTULO
AISLAMIENTO Y CARACTERIZACIÓN DEL MUTANTE csb3-l DE ARABIDOPSIS THALIANA, Y SU USO COMO REGULADOR DE LA RESISTENCIA EN PLANTAS A ENFERMEDADES PRODUCIDAS POR PATÓGENOS BIOTRÓFICOS.
La presente invención se encuadra dentro del campo técnico de la biotecnología vegetal, y en concreto se refiere a la identificación y caracterización del mutante csbS-l de Arabidopsis thaliana, así como su función en la regulación de la resistencia a enfermedades producidas por patógenos biotróficos, y sus aplicaciones en la generación de plantas resistentes a este tipo de patógenos.
ESTADO DE LA TÉCNICA
Las plantas reaccionan al ataque microbiano con una serie de defensas inducibles que están integradas por un complejo sistema de señalización. En la última década, se ha logrado un avance notable en la comprensión de los mecanismos moleculares con los cuales se defienden las plantas del ataque microbiano, mediante la clonación y la caracterización de factores de resistencia a la enfermedad de las plantas que reconocen la presencia de factores de avirulencia de patógenos que desencadenan la denominada respuesta hipersensible (RH) (Dangl, J.L., and Jones, J.D. (2001). Plant pathogens and integrated defence responses to infection. Nature 411, 826-833.). La RH puede confinar al patógeno invasor, previniendo así la diseminación de la infección (Agrios, G.N. (1988). Plant Pathology. Academic Press, London, U.K.). En la mayoría de los casos, el inicio de la RH produce la activación de la resistencia sistémica adquirida (SAR) (Ross, A.F. (1961). Systemic acquired resistance induced by localized virus infections in plants. Virology 14, 340-358.), una respuesta defensiva que proporciona una protección de larga duración en toda la planta frente a un amplio espectro de patógenos (Durrant, W. E., and Dong, X. (2004). Systemic acquired resistance. Ann. Rev. Phytopathol. 42, 185-209.). El ácido salicílico (SA) es una molécula señal esencial que desempeña un papel central en la inducción de la SAR (Delaney, T. P., Uknes, S., Vernooij, B., Friedrich, L., Weymann, K., Negrotto, D., Gaffney, T., Gut-Rella, M., Kessmann, H., Ward, E., and Ryals, J. (1994). A central role of salicylic acid in plant disease resistance. Science 266, 1247- 1250.). Numerosas plantas mutantes implicadas en la acumulación o percepción de SA muestran incremento de la susceptibilidad frente a patógenos biotróficos, mientras que los imitantes que producen un exceso de SA presentan un incremento de la resistencia. En particular, se han aislado varios imitantes de Arabidopsis thaliana que son incapaces de activar las respuestas defensivas dependientes de SA (Durrant y Dong, 2004). Los imitantes edsl6/sid2 (enhanced disease susceptibility 16 [incremento de la susceptibilidad a la enfermedad 16]/salycilic acid induction deficient2 [deficiente a la inducción por acido salicílico 2J) y edsδlsidl (Rogers, E.E., and Ausubel, F.M. (1997). Arabidopsis enhanced disease susceptibility mutants exhibit enhanced susceptibility to several bacterial pathogens and alterations in PR-I gene expression. Plant CeIl 9, 305- 316.; Nawrath, C, and Metraux, J.P. (1999). Salicylic acid induction-deficient mutants of Arabidopsis express PR-2 and PR-5 and accumulate high levéis of camalexin after pathogen inoculation. Plant CeIl 11, 1393-1404; Wildermuth, M.C., Dewdney, J., Wu, G., and Ausubel, F.M. (2001). Isochorismate synthase is required to synthesize salicylic acid for plant defence. Nature 414, 562-565.) no acumulan SA tras la inoculación con patógenos virulentos y avirulentos. SID2 codifica para una supuesta isocorismato sintasa localizada en el cloroplasto (Wildermuth et al., 2001), mientras que EDS5 codifica para una proteína asociada a la membrana y localizada en el cloroplasto que muestra homología con transportadores MATE (extrusión de toxinas y múltiples fármacos) (Nawrath et al., 2002). Estos hallazgos demuestran la existencia de una ruta de síntesis de SA localizada en el cloroplasto y revelaron la importancia de este orgánulo en aspectos críticos de mediación / control de la respuesta defensiva de las plantas (Shah, J. (2003). The salicylic acid loop in plant defense. Curr Opin Plant Biol 6, 365-371.). De hecho, las mutaciones en varios genes que codifican para proteínas localizadas en el cloroplasto dan como resultado una señalización defectuosa de SA (Kachroo, P., Shanklin, J., Shah, J., Whittle, E.J., and Klessig, D.F. (2001). A fatty acid desaturase modulates the activation of defense signaling pathways in plants. Proc. Nati. Acad. Sci. U S A 98, 9448-9453.; De León, I.P., Sanz, A., Hamberg, M., and Castresana, C. (2002). Involvement of the Arabidopsis alpha-DOXl fatty acid dioxygenase in protection against oxidative stress and cell death. Plant J. 29, 61-62.; Slaymaker, D.H., Navarre, D.A., Clark, D., del Pozo, O., Martin, G.B., and Klessig, D.F. (2002). The tobáceo salicylic acid-binding protein 3 (SABP3) is the chloroplast carbonic anhydrase, which exhibits antioxidant activity and plays a role in the hypersensitive defense response. Proc Nati Acad Sci U S A 99, 11640- 11645.; Ishikawa, A., Okamoto, H., Iwasaki, Y., and Asahi, T. (2001). A deficieney of coproporphyrinogen III oxidase causes lesión formation in Arabidopsis. Plant J. 27, 89- 99.; Mach, J.M., Castillo, A.R., Hoogstraten, R., and Greenberg, J.T. (2001). The Arabidopsis-accelerated cell death gene ACD2 encodes red chlorophyll catabolite reductase and suppresses the spread of disease symptoms. Proc. Nati. Acad. Sci. U S A 98, 771-776.). Además, se ha implicado una señal derivada del cloroplasto en el control del SA y la respuesta defensiva activada por patógenos que depende de la presencia de luz o un cloroplasto funcional fotosintético (Genoud, T., Buchala, A. J., Chua, N-H. and Métraux, J-P. (2002). Phytochrome signalling modulates the SA-perceptive pathway in Arabidopsis. Plant J. 31, 87-95.). Además, los imitantes edsl y pad4 (phytoalexin deficient4 [deficiente enfitoalexina 4J) bloquean la biosíntesis de SA desencadenada por la infección con patógenos virulentos (Feys, BJ., Moisan, L.J., Newman, M.A., and Parker, J. E. (2001). Direct interaction between the Arabidopsis disease resistance signaling proteins, EDSl and PAD4. EMBO J. 20, 5400-5411.; Jirage, D., Tootle, T.L., Reuber, T.L., Frost, L.N., Feys, BJ., Parker, J.E., Ausubel, F.M., and Glazebrook, J. (1999). Arabidopsis thaliana PAD4 encodes a lipase-like gene that is important for salicylic acid signaling. Proc. Nati. Acad. Sci. USA 96, 13583-13588.) y también la que se observa que se produce en diferentes imitantes con resistencia a la enfermedad (Jirage, D., Zhou, N., Cooper, B., Clarke, J.D., Dong, X., and Glazebrook, J. (2001). Constitutive salicylic acid-dependent signaling in cprl and cpr6 mutants requires PAD4. Plant J. 26, 395-407.; Clarke, J.D., Aarts, N., Feys, BJ., Dong, X., and Parker, J.E. (2001). Constitutive disease resistance requires EDSl in the Arabidopsis mutants cprl and cpr6 and is partially EDSl-dependent in cpr5. Plant J. 26, 409-420.). Se requieren EDSl y PAD4 para la resistencia conferida por un subconjunto de genes R (es decir, TIR-NB- LRR). Ambas proteínas tienen homología con las lipasas y ambas actúan después del extremo 5' de SID2 y EDS5 en la regulación de la síntesis de SA (Glazebrook, J., Rogers, E.E., and Ausubel, F.M. (1997). Use of Arabidopsis for genetic dissection of plant defense responses. Annu. Rev. Genet. 31, 547-569.; Jirage et al., 1999; Feys et al., 2001; Nawrath, C, Heck, S., Parinthawong, N., and Métraux, J-P. (2002). EDS5, an Essential Component of Salicylic Acid-Dependent Signaling for Disease Resistance in Arabidopsis, Is a Member of the MATE Transporter Family. Plant Cell 14, 275-286.). La proteína de repetición de anquirina NPRl (que no expresa PR-I) se identificó inicialmente en Arabidopsis a través de una selección genética de mutantes comprometidos en la SAR (Cao, H., Glazebrook, J., Clarke, J.D., Volko, S., and Dong, X. (1997). The Arabidopsis NPRl gene that controls systemic acquired resistance encodes a novel protein containing ankyrin repeats. CeIl 88, 57-63.). NPR-I es un regulador esencial de SAR (Dong, X. (2004) NPRl, all things considered. Current Opinión in Plant Biology, 7, 547-552.) y de la ruta de defensa independiente de SAR, ISR (respuesta sistémica inducida; Pieterse, C.M., and Van Loon, L.C. (2004). NPRl: the spider in the web of induced resistance signaling pathways. Curr. Opin. Plant Biol. 7, 456-464.). Con el tratamiento con SA y el desequilibrio redox del cognato, NPRl se transloca al núcleo donde actúa como modulador de la expresión del gen PR a través de una interacción selectiva con miembros de la subclase TGA de la familia de cierre ("zipper") de leucinas básicas de factores de transcripción (Dong, 2004). Además de nprl, se han identificado otros imitantes comprometidos en la SAR. Una lista no exhaustiva incluye dirl {defective in induced resistanceλ [deficiente en resistencia inducida I]; Maldonado, A.M., Doerner, P., Dixon, R.A., Lamb, C.J., and Cameron, R.K. (2002). A putative lipid transfer protein involved in systemic resistance signalling in Arabidopsis. Nature 419, 399-403.), que lleva una mutación en un gen que codifica para una proteína con similitud de secuencia con las proteínas de transferencia de lípidos y apunta en dirección a una señal basada en lípidos móviles que media la SAR. Asimismo, el mutante dth9 (detachment9 [desprendimiento 9J) difiere de nprl en que la expresión de PR está inalterada. El hecho de que el tratamiento con SA no restablezca la resistencia en las plantas dth9 susceptibles a la enfermedad, coloca a DTH9 por detrás de 3' de SA en una ruta paralela de NPRl . Además de esto, se han llevado a cabo varias selecciones genéticas para buscar supresores de un nprl que permite la identificación de componentes novedosos de la ruta de señalización de SAR, tales como SNIl, SNCl, SONl o SSI2 entre otros (Kachroo et al., 2001; Li, X., Clarke, J.D., Zhang, Y., and Dong, X. (2001). Activation of an EDSl-mediated R-gene pathway in the sncl mutant leads to constitutive, NPRl independent pathogen resistance. Mol. Plant Microbe Interact. 14, 1131-1139; Li, X., Zhang, Y., Clarke, J.D., Li, Y., and Dong, X. (1999). Identification and cloning of a negative regulator of systemic acquired resistance, SNIl, through a screen for suppressors of nprl-1. CeIl 98, 329-339.; Kim, H.S., and Delaney, T.P. (2002). Arabidopsis SONl is an F-box protein that regulates a novel induced defense response independent of both salicylic acid and systemic acquired resistance. Plant CeIl 14, 1469-1482.; Shah, J., Kachroo, P., and Klessig, D.F. (1999). The Arabidopsis ssil mutation restores pathogenesis-related gene expression in nprl plants and renders defensin gene expression salicylic acid dependent. Plant CeIl 11, 191-206.; Nandi, A., Welti, R., and Shah, J. (2004). The Arabidopsis thaliana dihydroxyacetone phosphate reductase gene suppressor of fatty acid desaturase deficiency is required for glycerolipid metabolism and for the activation of systemic acquired resistance. Plant CeIl 16, 465-477.; Zhang, Y., Goritschnig, S., Dong, X., and Li, X. (2003). A gain-of-function mutation in a plant disease resistance gene leads to constitutive activation of downstream signal transduction pathways in suppressor of nprl-1, constitutive 1. Plant CeIl 15, 2636- 2646.). Curiosamente, los mutantes sncl {suppressor ofnprl-1, constitutive 1 [supresor de nprl-1, constitutivo IJ), snil (suppressor of nprl induciblel [supresor de nprl inducible IJ) y ssi2 (suppressor ofSA insensitivity2 [supresor de insensibilidad de SA 2J) muestran expresión de PR constitutiva y aumento de la resistencia frente a patógenos biotróficos. Por el contrario, el mutante sonl (suppressor ofniml-1 [supresor de niml- I]) aporta SAR sin inducción del gen PR y define un nuevo fenómeno que se ha denominado resistencia independiente de SAR o ISR (Hammond-Kosack, K.E., and Parker, J.E. (2003). Deciphering plant-pathogen communication: fresh perspectives for molecular resistance breeding. Curr. Opin. Biotechnol. 14, 177-193.).
DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
Un objeto de la presente invención lo constituye el aislamiento y la caracterización de un mutante del gen CSB 3 (SEC. ID.NO. 2) de Arabidopsis thaliana, denominado csb3-l (derivado de constitutive subtilisin3 [subtilisina constitutiva 3J) (SEC. ID. NO.1) con incremento de la resistencia a patógenos biotróficos y desregulada en la expresión de un promotor génico caracterizado previamente que controla la expresión de una proteasa subtilisina inducible por patógeno (P69C). CSB 3 se aisló mediante clonación basada en el mapeo y se demostró que codifica para una l-hidroxi-2-metil-2-butenil-4-difosfato sintasa, una enzima que controla una de las etapas terminales de la biosíntesis de difosfato de isopentenilo (IPP) a través de la ruta de 4-fosfato de 2-C-metil-D-eritritol (MEP) que se produce en el cloroplasto de las plantas superiores. A través del análisis de epistasis con otros mutantes caracterizados relacionados con la defensa, junto con el aislamiento y la caracterización de supresores extragénicos del mutante csb3 y la complementación farmacológica del fenotipo de incremento de resistencia de plantas csb3, se propone que CSB3 controla los aspectos críticos de la ruta de resistencia a la enfermedad mediada por SA frente a patógenos biotróficos. Otro objeto de la presente invención consiste en la utilización del alelo mutante csb3-l en especies vegetales de interés agronómico, para la obtención de variedades resistentes a enfermedades producidas por patógenos biotróficos, inhibiendo el gen CSB3 o la actividad de la proteína por él codificada con el fin de incrementar la síntesis y acumulación de ácido salicílico y por ende de la resistencia a patógenos biotróficos.
Aislamiento del mutante csb3
El gen P69C codifica para una proteasa similar a la subtilisina, originalmente identificada en las plantas de tomate (Jorda, L., and Vera, P. (2000). Local and systemic induction of two defenserelated subtilisin-like protease promoters in transgenic Arabidopsis plants. Luciferin induction of PR gene expression. Plant Physiol. 124, 1049- 1058.). Las plantas transgénicas de Arabidopsis que contienen una región de 2,5 kb del promotor 5' de P69C fusionada al gen indicador de ®-glucuronidasa (GUS) revela una rápida activación transcripcional de este gen mediante SA y durante el transcurso de interacciones compatibles e incompatibles con Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 (Pst DC3000) (Jordá et al., 2000). Se observa expresión inducida en las hojas locales inoculadas (es decir, tras inoculación con Pst DC3000 que lleva avrRpml (Pst DC3000 avrRpml)), así como en hojas distales no inoculadas de la misma planta. Curiosamente, la expresión inducida en las hojas inoculadas tiene lugar a una distancia de la zona donde se ejecuta la RH. La expresión del transgén P69C-GUS se produce en puntos distribuidos a todo lo largo de la lámina de la hoja de tanto las hojas locales como las distales, tal como se visualiza mediante la deposición del azul añil derivado de la X- gluc utilizada como sustrato. Este patrón de expresión es distinto al observado para otros genes regulados por SA, tales como PR-I, cuya expresión inducida es sumamente delimitada y concéntrica a los tejidos que rodean la lesión de RH (Bowling, S.A., Guo, A., Cao, H., Gordon, S., Klessig, D.F., and Dong, X. (1994). A mutation in Arabidopsis that leads to constitutive expression of systemic acquired resistance. Plant CeIl 6, 1845- 1857.). Con el fin de identificar las señales y los mecanismos implicados en la ruta que conduce a la distinta activación del promotor de P69C y de estudiar el impacto que esta ruta puede tener sobre la resistencia a la enfermedad, la investigación se dirigió a la búsqueda de imitantes utilizando plantas transgénicas de Arabidopsis que albergan el constructo génico P69C-GUS. La idea fue que mediante la selección de los imitantes que muestran expresión del gen indicador en plantas sanas no inoculadas, se podrían identificar las mutaciones que afectan a la respuesta defensiva. Para ello, se sometió a mutagénesis una de las líneas transgénicas homocigóticas que contienen una única inserción de P69C- GUS con metanosulfato de etilo (EMS) y se seleccionaron aproximadamente 12800 semillas M2 para individuos con actividad GUS elevada de manera constitutiva. Estos imitantes se denominaron csb (constitutive subtilisin [subtilisina constitutiva]). Se seleccionó un mutante con gran expresión de GUS, denominado csb3, el cual se describe detalladamente en la presente invención. Las plantas csb3 pueden distinguirse de las plantas salvajes, debido a su característico fenotipo atrofiado y hojas rizadas (figura IA). Se llevó a cabo tinción histoquímica para determinar la actividad GUS, para investigar el patrón de expresión constitutiva de gen indicador en las plantas csb3. Tal como se muestra en las figuras IB-C, no se detectó actividad GUS en los plantones salvajes originales. Por el contrario, los plantones csb3 mostraron tinción de GUS en los cotiledones y una expresión más pronunciada de actividad GUS en hojas en roseta de plantas con crecimiento completo.
Como la aplicación local de SA induce la expresión de P69C-GUS en plantas salvajes de Arabidopsis (Jordá et al., 2000), se estableció la hipótesis de que la acumulación de SA podría estar aumentada en las plantas csb3. En un primer lugar se estableció la expresión de varios genes inducibles por SA (PR-I, PR-2 y GST6) en plantas csb3. Los análisis tipo Northern mostrados en la figura ID revelaron que la expresión de los genes seleccionados estaba en todos los casos incrementada en plantas csb3 intactas, pero no en plantas salvajes, apuntando por tanto en dirección a una activación constitutiva de la señalización dependiente de SA en el mutante csb3. Por el contrario, la expresión del gen marcador de jasmonato / etileno, PDFl.2, no estaba alterado en las plantas csb3 (figura ID).
El hecho de que la expresión génica regulada por SA está activada en plantas csb3 intactas sugirió una alteración de la acumulación de SA en las plantas csb3. Por tanto, se examinaron los niveles de SA libre y de glucósido-salicilato conjugado (SAG) en tejidos de hoja de plantas csb3 y salvajes (figura IE). En las hojas no inoculadas de plantas csb3, se observó un aumento de ocho veces en el contenido en SAG cuando se comparaba con las plantas salvajes. No se encontraron diferencias significativas en las concentraciones de SA libre. Sin embargo, en el tejido de hoja infectada, a los 3 días después de la inoculación (d.p.i) con Pst DC3000, las cantidades de SA libre aumentaron once veces en las plantas csb3 mientras que sólo aumentaron tres veces en las plantas salvajes. Se observaron aumentos proporcionales similares en la cantidad de SAG entre plantas csb3 y salvajes tras la inoculación (figura IE). Este hallazgo sugiere que la mutación csb3 no sólo confiere un incremento de la acumulación de SA en condiciones de reposo, sino también hace que las plantas tiendan más a aumentar la síntesis y la acumulación de esta molécula tras la infección.
Para analizar el patrón de herencia de la mutación csb3, se sometieron a retrocruzamiento plantas csb3/csb3 con plantas salvajes CSB3/CSB3 que contienen el transgén P69C-GUS y se analizó la progenie resultante Fl y F2 para determinar la tinción de GUS. Como la expresión constitutiva de GUS estaba ausente en todas las plantas Fl analizadas, se concluyó que la expresión constitutiva de GUS mediada por csb3 se heredaba como un carácter recesivo. En las plantas F2, la expresión estaba presente en 67 de 240 plantas (3:1, que no expresan: que expresan de manera constitutiva; -2= 0,4, 0,l>P>0,5), lo que apoya la conclusión de que csb3 es una mutación recesiva y lo que indica que un único locus es responsable del fenotipo csb3.
El mutante csb3 tiene un incremento de la resistencia frente a patógenos biotrófícos pero no frente a necrotófícos.
Con el fin de determinar si existe una relación entre la ruta de señales que median la activación de P69C-GUS y que median la resistencia a la enfermedad, se analizó la respuesta de plantas csb3 y salvajes frente a diferentes patógenos que generan enfermedad en Arabidopsis. La respuesta de plantas csb3 frente al oomiceto biotrófico obligatorio Hyaloperonospora parasítica comparado con la respuesta de plantas salvajes se muestra en la figura 2A-B. Se inocularon 25 plantas csb3, así como 25 plantas salvajes con el aislado de H. parasítica NOCO (105 conidiosporas/ml), que es virulento sobre Arabidopsis CoI-O. Se sometió a ensayo el crecimiento del patógeno mediante la observación directa de hifas teñidas en hojas infectadas (figura 2A) y mediante el recuento de los conidios producidos sobre hojas infectadas (figura 2B). Ambas mediciones revelaron una diferencia significativa en el crecimiento de patógenos entre plantas salvajes y csb3. Mientras las plantas salvajes tuvieron una fuerte colonización por los oomicetos y permitieron su ciclo de vida completo (formación de oosporas sexuales y conidios asexuales en los conidióforos), las plantas csb3 inhibieron drásticamente el crecimiento de este patógeno. Esto indica que la resistencia frente a este patógeno biotrófico se incrementó drásticamente o se bloqueó la susceptibilidad como consecuencia de la mutación en el locus CSB 3.
También se expusieron las plantas salvajes y csb3 al patógeno bacteriano virulento Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 (Pst DC3000), otro patógeno biotrófico de Arabidopsis. Tras la inoculación, la velocidad de crecimiento del patógeno se controló en las hojas infectadas. Las curvas de crecimiento resultantes se muestran en la figura 2C. El número de unidades formadoras de colonias de Pst DC3000 detectadas en plantas csb3 fue de 30 a 60 veces inferior al número detectado en las plantas salvajes tras 3 ó 5 días de crecimiento. Por tanto, las plantas csb3 muestran también incremento de la resistencia frente a este patógeno bacteriano.
La susceptibilidad de las plantas csb3 frente a patógenos se analizó adicionalmente utilizando Plectospharella cucumerina, un patógeno necrotrófico de Arabidopsis. La infección de plantas salvajes por P. cucumerina conduce a una fuerte degradación del tejido de la hoja, manifestada como lesiones extensas que aumentan de diámetro a medida que la infección progresa a lo largo de la hoja inoculada. No se observaron diferencias en la extensión de la lesión entre las plantas csb3 y salvajes (figura 2D). Para determinar si la mutación csb3 podía provocar cambios en la susceptibilidad frente a otro patógeno necrotrófico, se inocularon plantas csb3 y salvajes con Botrytis cinérea. La enfermedad se puntuó entre 5 y 10 días después de la inoculación mediante el seguimiento de la extensión de la necrosis y la muerte que aparece en las hojas inoculadas. Tanto las plantas salvajes como las plantas csb3 eran sumamente susceptibles a Botrytis, y todas las plantas mostraban necrosis acompañada por proliferación extensa de micelios fúngicos (figuras 2E y 2F). Por tanto, la mutación csb3 parecía no afectar a la susceptibilidad de la planta frente a patógenos necrotróficos. Basándose en el fenotipo del mutante recesivo csb3, podría establecerse la hipótesis de que CSB3 podría regular negativamente determinados aspectos de la respuesta defensiva frente a patógenos biotróficos.
Respuesta de dobles mutantes csb3 frente a Pst DC3000 Para proporcionar perspectivas adicionales de la señalización activada por csb3, se generó una serie de dobles mutantes entre csb3 y diferentes mutantes con afectación en la ruta relacionada con SA. Se investigó la respuesta de resistencia frente a Pst DC3000 para todos estos mutantes (figura 3). La mutación pad4 compromete la acumulación de SA desencadenada por la infección por P. syringae virulento (Feys et al., 2001; Jirage et al., 1999) y por tanto, suprime la acumulación de SA alcanzada en otros imitantes resistentes a patógenos biotróficos (Jirage et al., 2001). Tal como se muestra en las figuras 3 A y 3B, tanto el incremento de la resistencia frente a Pst DC3000, así como la expresión constitutiva del gen PR- 1 inducible por SA conferida por la mutación csb3 están suprimidas en las plantas dobles imitantes csb3 pad4. Estos datos muestran que se requiere completamente PAD4 para la señalización en plantas csb3. Los imitantes sid2 y eds5 de Arabidopsis presentan alteración en la síntesis y acumulación de SA que se produce en el cloroplasto a través de las rutas del corismato e isocorismato y ambas plantas imitantes muestran aumento de la susceptibilidad frente a los patógenos (Nawrath y Métraux, 1999; Wildermuth et al., 2001). En las plantas csb3 sid2, así como plantas csb3 eds5, la resistencia frente a Pst DC3000 conferida por csb3 en el aislamiento está notablemente reducida (figura 3A). Por tanto, la expresión constitutiva del gen marcador PR-I observada en plantas csb3 estaba bloqueada en csb3 sid2 y en un grado menor también en plantas csb3 eds5 (figura 3B). Por tanto, el incremento de la resistencia de las plantas csb3 depende de la síntesis de SA que tiene lugar en el cloroplasto mediante la acción de SID2 y EDS5. Para ampliar adicionalmente nuestra comprensión del papel de SA para el incremento de la resistencia de las plantas csb3, el transgén NahG se sometió a introgresión en plantas csb3. NahG codifica para una salicilato hidroxilasa que bloquea la acumulación de SA en el citosol mediante degradación de SA a catecol (Delaney, T. P., Uknes, S., Vernooij, B., Friedrich, L., Weymann, K., Negrotto, D., Gaffhey, T., Gut-Rella, M., Kessmann, H., Ward, E., and Ryals, J. (1994). A central role of salicylic acid in plant disease resistance. Science 266, 1247-1250). En las plantas csb3 NahG, se suprime de nuevo la resistencia aumentada conferida por la mutación csb3 y se impone la hipersusceptibilidad de NahG frente a Pst DC3000 (figura 3A). De manera similar, desaparece la expresión constitutiva del gen PR-I cuando el transgén NahG está presente (figura 3B). El mutante nprl se identificó por el aumento de su susceptibilidad frente a patógenos biotróficos y su incapacidad para organizar una respuesta SAR o expresar PR- 1 en la respuesta frente al tratamiento con SA (Cao et al., 1997). Se ha mostrado que NPRl desempeña un papel clave en la mediación de muchas respuestas defensivas (Dong, 2004). Curiosamente, las plantas csb3 nprl siguieron siendo tan susceptibles a Pst DC3000 como las plantas nprl (figura 3A) y la expresión del gen PR-I también estaba inhibida (figura 3B). Esto indica que la resistencia mediada por SA de csb3 requiere una proteína funcional NPRl . Otro mutante comprometido con la SAR es dth9. Sin embargo, a diferencia de las plantas nprl, las plantas dth9 siguen conservando la capacidad para expresar los genes PR en respuesta a SA o al ataque patogénico (Mayda, E., Mauch- Mani, B., and Vera, P. (2000). Arabidopsis dth9 mutation identifies a gene involved in regulating disease susceptibility without affecting salicylic acid-dependent responses. Plant CeIl 12, 2119-2128.). De nuevo, las plantas dobles mutantes csb3 dth9 mostraron el incremento de la susceptibilidad frente a Pst DC3000 atribuible a la mutación dth9 (figura 3A), pero a diferencia de nprl, la expresión del gen marcador PR-I atribuible a la mutación csb3 se mantiene intacta (figura 3B), indicando así que la resistencia de csb3 también depende de DTH9.
La expresión constitutiva de actividad GUS, dirigida por el promotor de P69C tal como se observa en plantas csb3, también está suprimida en todos los dobles mutantes generados, excepto csb3 dth9, y se ejemplifica en la figura 3C para las plantas csb3 NahG. Otro mutante interesante analizado por epistasis fue cprl. Las plantas cprl son más resistentes a Pst DC3000, tienen niveles elevados de SA, muestran expresión constitutiva del gen PR- 1 y también muestran una tendencia de crecimiento anómala (Bowling et al., 1994). Por tanto, cprl comparte con csb3 varios aspectos de resistencia a la enfermedad y tamaño de crecimiento. Curiosamente, cuando la mutación cprl se sometió a introgresión en el resto ("background") csb3, las plantas dobles mutantes csb3 cprl resultantes mostraban efectos aditivos que dieron como resultado un fenotipo extremadamente enano. Las plantas dobles mutantes homocigóticas nunca alcanzaron la fase reproductiva y, por tanto, tenían que propagarse en estado heterocigótico. Por tanto, el fenotipo del mutante csb3 cprl podría sugerir que la mutación csb3 y la mutación cprl contribuyen a su característico aumento de la acumulación de SA y respectivo fenotipo de incremento de la resistencia a través de rutas independientes después del extremo 3' de acumulación de SA. Todas estas observaciones refuerzan la consideración de que la síntesis y la percepción de SA son fundamentales para la resistencia asociada a csb3.
Aislamiento de supresores de csb3. Para elucidar adicionalmente el papel funcional de csb3 en la respuesta defensiva de la planta, se llevó a cabo una búsqueda de supresores de csb3 mediante la selección de imitantes que carecen de fenotipo de incremento de la resistencia conferido por la mutación csb3. La identificación de supresores del fenotipo csb3 con una reversión correspondiente en la respuesta de resistencia indicaría que el papel de CSB3 en la participación a la resistencia mediada por SA está bajo estricto control genético. Por tanto, las semillas csb3 homocigóticas volvieron a someterse a mutagénesis con EMS y aproximadamente 10000 semillas M2 se hicieron crecer y se seleccionaron para identificar individuos que ya no mostraban el incremento de la resistencia frente a Pst DC3000 atribuible a la mutación csb3. Esta selección permitió el aislamiento de cuatro imitantes scs (supresores de csb3) (concretamente scs2, scs4, scs9 y scsll; figura 4). Los cuatro dobles imitantes scs csb3 identificados han perdido el fenotipo enano morfológico distinguible de csb3 y son similares a las plantas salvajes en cuanto a la arquitectura y la tendencia de crecimiento de la planta (figura 4A). Por tanto, la expresión constitutiva del gen P69C-GUS (figura 4A) y la del gen PR-I, ambas atribuibles a la mutación csb3, estaban suprimidas en los dobles imitantes scs csb3. Además, el registro comparativo de la velocidad de crecimiento de Pst DC3000 en hojas infectadas de plantas salvajes, csb3 y scs csb3 reveló que los imitantes scs csb3 han perdido el incremento de la resistencia frente a Pst DC3000 que era característico del mutante csb3 original (figuras 4B-C). En este caso, la resistencia frente a Pst DC3000 alcanzada en plantas scs2 csb3 y scsll csb3 es similar a la observada en plantas salvajes, apoyando un título de crecimiento bacteriano de más de 8 a 40 veces el observado en plantas csb3 (figura 4B). La pérdida del incremento de la resistencia conferido por la mutación csb3 es incluso más llamativa en las plantas scs4 csb3 y scs9 csb3. Las plantas scs4 csb3 y scs9 csb3 se vuelven mucho más susceptibles a Pst DC3000 que las plantas salvajes y permiten un aumento de más de 100 veces en el crecimiento bacteriano cuando se compara con las plantas csb3 (figura 4C). La hipersusceptibilidad de las plantas scs9 csb3 a Pst DC3000 fue incluso superior a la observada en plantas nprl y comparable a la registrada para las plantas dth9 cuando se realizó un experimento lado a lado; sin embargo, ninguna de las mutaciones scs son alélicas con respecto a nprl, dth9 o cualquiera de los imitantes mencionados previamente. Además, los análisis genéticos indican que las cuatro mutaciones scs no son alélicas entre ellas, son extragénicas a csb3, y el fenotipo conferido por cada una de las mutaciones scs se mantiene incluso en ausencia de la mutación csb3. En resumen, estos resultados refuerzan la hipótesis de que CSB3 es un componente importante de la ruta de resistencia a la enfermedad mediada por SA en Arabidopsis y su papel en la ruta está controlado adicionalmente por los productos génicos de SCS. Clonación basada en el mapeo de CSB3 Para definir la posición de CSB 3 en el mapa cromosómico, el mutante csb3, que está en un resto CoI-O, se cruzó con plantas Landsberg erecta (Ler) salvajes. Las plantas imitantes csb3 homocigóticas se identificaron entre la progenie F2 por su fenotipo morfológico característico. Se examinó la población de mapeo de F2 seleccionada para determinar la segregación de marcadores moleculares basados en PCR. Para el mapeo inicial, se probaron 38 plantas F2 con marcadores de polimorfismo de longitud de secuencia única (SSLPS) de cada uno de los cinco cromosomas (Bell, CJ., and Ecker, J.R. (1994). Assignment of 30 microsatellite loci to the linkage map of Arabidopsis. Genomics 19, 137-144.). El marcador CIWlO en el cromosoma 5 mostró cosegregación con el fenotipo csb3. El análisis adicional de esta región mostró que la mutación se localizaba entre los marcadores ngal29 y MBK-5, que están separados por 15 cM. Para limitar la región en la que estaba localizado CSB 3, se utilizó la base de datos de inserciones / deleciones grandes de Cereon Genomics para diseñar marcadores SSLP. Después de seleccionar 748 plantas F2, se limitó CSB 3 a dos clones BAC (MUF9 y MUP24) que comprenden una región de 66 kb que contenía 21 marcos de lectura abiertos (ORF) (figura 5A). La región completa de cada uno de estos genes se amplificó a partir de plantas csb3 y se determinaron las secuencias de los productos de PCR. La secuencia correspondiente al gen At5g60600 se identificó como la única en mostrar una única mutación puntual. Este gen contiene 20 exones y la mutación csb3 (a partir de ahora csb3-l) representaba una transición de G a A en la cadena codificante del exón 19 que conduce a un cambio de aminoácidos de GIy a Asp. En las figuras 5A-C, se facilita una visión general de la estrategia de mapeo y la estructura génica.
CSB 3 es un gen de única copia que codifica para la l-hidroxi-2-metil-2-butenil-4- difosfato [HMBPP] sintasa (HDS) localizada en el cloroplasto que cataliza la formación de HMBPP a partir de 2,4-ciclodifosfato de 2-C-metil-D-eritritol (MEcPP) mediante un mecanismo todavía desconocido (Hecht, S., Eisenreich, W., Adam, P., Amslinger, S., Kis, K., Bacher, A., Arigoni, D., and Rohdich, F. (2001). Studies on the nonmevalonate pathway to terpens: the role of the GcpE (IspG) protein. Proc. Nati. Acad. Sci. USA 98, 14837-14842.; Kollas, A. -K., Duin, E. C, Eberl, M., Altincicek, B., Hintz, M., Reichenberg, A., Henschker, D., Henne, A., Steinbrecher, J., Ostrovsky, D. N., et al. (2002). Functional characterization of GcpE, an essential enzyme of the nonmevalonate pathway of isoprenoid biosynthesis. FEBS Lett. 532, 432-436.). La enzima HDS controla una de las etapas terminales de la biosíntesis de difosfato de isopentenilo (IPP) y difosfato de dimetilalilo (DMAPP) a través de la ruta de 4-fosfato de 2-C-metil-D- eritritol (MEP) independiente de mevalonato que se produce en el cloroplasto de las plantas superiores (figura 6). La ruta de MEP localizada en el plástido, junto con la ruta dependiente de mevalonato citosólico (MVA), se encargan de la síntesis de difosfato de isopentenilo (IPP) y su isómero difosfato de dimetilalilo (DMAPP), los precursores inmediatos para la biosíntesis de isoprenoides (figura 6) (Rohmer, M. (1999). The discovery of a mevalonate-independent pathway for isoprenoid biosynthesis in bacteria, algae and higher plants. Nat. Prod. Rep. 16, 565-574.). La enzima HDS está conservada en microorganismos en los que se conoce como GCPE (Kollas et al., 2002), a pesar de la diferencia con la enzima HDS de planta madura que contiene un dominio proteico interno grande que está ausente en el homólogo bacteriano (figura 5D). Este dominio adicional puede conferir distintas funciones reguladoras o catalíticas a la enzima de la planta (Querol J, Campos N, Imperial S, Boronat A, Rodríguez-Concepción M (2002). Functional analysis of the Arabidopsis thaliana GCPE protein involved in plastid isoprenoid biosynthesis. FEBS Lett. 514: 343-346.). Las enzimas vegetales y microbianas muestran una región de aminoácidos sumamente conservada cercana al extremo C-terminal en la que se localiza un conjunto de residuos Cys convencionales que participan en el ensamblaje de una agrupación ("cluster") [4Fe-4S] (aminoácidos 640 a 684, figura 5D). La identificación de diferentes mutaciones en Escherichia coli localizadas en el interior o cerca del motivo 4Fe-4S señalan a esta región como crítica para la función enzimática (Sauret-Güeto S, Ramos- Valdivia A, Ibanez E, Boronat A, Rodríguez Concepción M. (2003) Identification of lethal mutations in Escherichia coli genes encoding enzymes of the methylerythritolphosphate pathway. Biochem Biophys Res Commun. 307, 408-415.). Como la mutación csb3-l identificada está cerca de este motivo (figura 5D), puede argumentarse que la mutación introduce una alteración estructural que puede desestabilizar el plegamiento y, a su vez, la función correcta del cluster Fe-S.
Se identificó una inserción de ADN-T de Arabidopsis (SALK 017595) en el gen CSB 3, en la presente invención denominada como csb3-2 (figura 5C). Esta mutación altera CSB 3 a nivel del 16° exón. Curiosamente, las plantas heterocigóticas para esta inserción de ADN-T segregaron plantones albinos que eran mortales. Además, en una búsqueda de imitantes con afectación del desarrollo del cloroplasto, muy recientemente (Gutiérrez- Nava, M.L., Gillmor, C.S., Jiménez, L.F., Guevara-García, A., and León, P. (2004). CHLOROPLAST BIOGÉNESIS genes act cell and noncell autonomously in early chloroplast development. Plant Physiol. 135, 471→482.) identificaron que el mutante clb4 {chloroplast biogénesis [biogénesis de cloroplasto]) llevaba una mutación inducida por EMS en el mismo locus en el que el cambio de transición da como resultado la aparición de un codón de terminación prematuro en el exón 9 (figura 5C). Para dar uniformidad, este último alelo se denominó para la presente invención csb3- 3/clb4. De manera similar a csb3-2, los plantones albinos con mutación csb3-3/clb4 también eran mortales (Gutiérrez-Nava et al., 2004). Es interesante observar aquí que otros imitantes de ADN-T que alteran los ORF de otros genes de la ruta de MEP (Budziszewski, GJ., et al. (2001). Arabidopsis genes essential for seedling viability: Isolation of insertional mutants and molecular cloning. Genetics 159, 1765-1778.) producen el mismo fenotipo albino mortal de plantones. Esto sugiere que la ruta de MEP es esencial para la planta y que el alelo csb3-l identificado en la presente invención es una pérdida parcial de función y no un mutante nulo. Para confirmar que At5g60600 se corresponde con el gen CSB 3, se utilizó la transformación mediada por Agrobacterium tumefaciens para introducir en las plantas csb3-l un ADNc que se corresponde con At5g60600, bajo el control del promotor 35S de CaMV (constructo 35S-CSB3). Se generaron varias líneas transgénicas con el constructo 35SCSB3 y se estudiaron algunas de ellas detalladamente. Todas las líneas transgénicas generadas habían perdido el fenotipo morfológico característico atribuible a la mutación csb3-l y habían recuperado un aspecto externo natural (véase la figura 7A). Además, los transformantes perdieron la expresión constitutiva del gen P69CGUS (figura 7A), así como la expresión constitutiva de los genes relacionados con SA, es decir, PR-I y GST6, que era característica de las plantas csb3-l no transformadas (figura 7C). Además, la expresión de At5g606000 bajo el control del promotor 35S en las plantas transgénicas csb3-l suprime el incremento de la resistencia frente a Pst DC3000. En estas plantas transgénicas, la resistencia frente a Pst DC3000 vuelve a niveles similares a los alcanzados en plantas salvajes (figura 7B). La complementación completa de todos los aspectos diferentes del fenotipo csb3 confirma que At5g60600 es equivalente a CSB 3. La expresión de CSB3 se inhibe parcialmente por la infección por Pst DC3000.
La expresión de CSB 3 en respuesta a la infección por P. syringae se analizó en hojas de plantas salvajes a diferentes intervalos de tiempo tras la inoculación y en un contexto que genera una interacción compatible (es decir, tras la inoculación con Pst DC3000) o una incompatible (es decir, tras inocular con Pst DC3000 {avrRpml)). Se estudió la presencia de ARNm de CSB 3 mediante RT-PCR. Estos análisis revelaron que la infección por Pst DC3000 que llevaba el gen de la avirulencia, gen avrRpml, y por tanto, que incitaba una respuesta RH en el tejido inoculado, le seguía una disminución marcada en el nivel de acumulación de los ARNm de CSB 3 (figura 7D). Esta reducción ya se observaba a las 24 h después de la inoculación y se mantenía posteriormente incluso después de 48 horas después de la inoculación. De manera concomitante e inversamente correlacionada con esta reducción, el gen marcador inducible por SA, PR-I, estaba regulado por incremento. Se registraron resultados similares, aunque con un efecto menos intenso, en una interacción compatible tal que la que sigue a la inoculación con Pst DC3000 que carece de avrRpml (figura 7D). Además, la expresión de CSB3 en plantas csb3-l también reveló una reducción de los niveles en el estado estacionario de su ARNm comparado con las plantas salvajes (figura 7D). Por tanto, la regulación por disminución de la expresión de CSB 3 tras la infección bacteriana o en el resto mutante, se correlaciona de manera inversa con la expresión inducida de PR-I.
La fosmidomicina complementa el incremento de la resistencia de plantas csb3-l frente a Psí DC3000. Un aumento en la acumulación del sustrato (MEcPP) de la enzima CSB3/HDS o de cualquiera de los productos intermedios metabólicos que preceden la acumulación de MEcPP en la ruta de MEP (figura 6) podría ser responsable del incremento de la resistencia de las plantas csb3-l. De manera alternativa, una disminución de la síntesis del producto (HMBPP) de la misma enzima podría comprometer la síntesis y la acumulación de los productos finales (es decir, IPP y DMAPP) (figura 6), que, a su vez, pueden comprometer la posterior biosíntesis de los diferentes isoprenoides que deben derivarse de la ruta de MEP. Esta última posibilidad también puede ser responsable del incremento de la resistencia de las plantas csb3-l. Para estudiar cualquiera de estas dos posibilidades, se estudió el impacto de un inhibidor de la ruta de MEP sobre el incremento de la resistencia a la enfermedad de las plantas csb3-l frente a Pst DC3000. Para este enfoque, se utilizó fosmidomicina [ácido 3-(N-formil-N-hidroxiamino)- propilfosfónico], un inhibidor competitivo de DXR, la enzima que controla la segunda etapa implicada en la ruta de MEP (figura 6) y que reduce los niveles de los productos finales de esta ruta (es decir, IPP y DMAPP) (Schwender, J., Müller, C, Zeidler, J., and Lichtenthaler, H.K. (1999). Cloning and heterologous expression of a cDNA encoding 1 - deoxy-D-xylulose- 5 phosphate reductoisomerase of Arabidopsis thaliana. FEBS Lett. 455, 140-144.; Laule, O., Fürholz, A., Chang, H., Zhu, T., Wang, X., Heifetz, P.B., Gruissem, W., and Lange, M. (2003). Crosstalk between cytosolic and plastidial pathways of isoprenoid biosynthesis in Arabidopsis thaliana. Proc. Nati. Acad. Sci. USA 100, 6866-6871.). Para desligar esta respuesta de la derivada de una detención del desarrollo del cloroplasto, los tratamientos con fosmidomicina se llevaron a cabo a dosis mucho menores y durante periodos de tiempo más restringidos, que aquellos utilizados experimentalmente por otros (Laule et al., 2003). Los plantones salvajes y csb3-l se rociaron una vez con una disolución 25 μM o 50 μM de fosmidomicina a las 48 horas y a las 24 horas antes de su inoculación con Pst DC3000, y se registró el crecimiento bacteriano en las plantas inoculadas a 0, 3 y 5 d.p.i. Las plantas tratadas también se sometieron a ensayo para determinar el efecto sobre la expresión normal del gen P69C- GUS. Tal como se muestra en la figura 8A, un tratamiento de fosmidomicina 25 μM sobre las plantas csb3-l fue suficiente para reducir notablemente el incremento de la resistencia frente a Pst DC3000. Esta inhibición fue incluso más evidente tras un tratamiento con fosmidomicina 50 μM que suprimió completamente el incremento de la resistencia atribuida a la mutación csb3-l (figura 8A). Con esta última concentración de inhibidor, la respuesta de resistencia observada del mutante era comparable con la alcanzada en las plantas salvajes no tratadas. Los tratamientos de las plantas csb3-l con fosmidomicina 5 μM también provocaron una reducción del incremento de la resistencia de las plantas csb3-l que sólo se observó a los 5 días después de la inoculación con Pst DC3000, por tanto indicativo de un efecto relacionado con la dosis para la acción inhibidora de la fosmidomicina sobre la resistencia observada. La fosmidomicina, a una concentración de 50 μM también mostró un efecto inhibidor sobre la resistencia normal de las plantas salvajes frente a Pst DC3000, haciendo que las plantas se volvieran más susceptibles a este patógeno virulento (figura 8A). No se probaron dosis mayores de este inhibidor, ya que pueden tener un efecto colateral de desarrollo / homeostasis del cloroplasto que puede conducir a efectos secundarios no deseados. Este efecto inhibidor de la fosmidomicina sobre el incremento de la resistencia de las plantas csbS-l frente al crecimiento bacteriano también estuvo acompañado de la regulación por disminución de la expresión constitutiva del transgén P69C-GUS (figura 8B) y de la de los genes marcadores PR-I y GST6 (figura 8C).
Por tanto, puede concluirse que el incremento de la resistencia de las plantas csbS-l parece no estar relacionado con una reducción de IPP y su isómero DMAPP, sino más bien con el resultado de una acumulación en exceso del sustrato directo de HDS/CSB3, concretamente MEcPP, o de cualquiera de sus precursores inmediatos. Además, el mismo compuesto parece ejercer un efecto sobre el control de al menos la magnitud de la resistencia de las plantas salvajes frente a la infección por Pst DC3000. Por tanto, en la presente invención se ha identificado un mutante novedoso del gen CSB 3 de Arabidopsis thaliana, denominado csb3-l, que muestra altos niveles de resistencia frente a los patógenos biotróficos P. syringae y H. parasítica mientras que conserva la susceptibilidad normal frente a los patógenos necrotróficos P. cucumerina y B. cinérea, lo cual es útil para la obtención de plantas resistentes a enfermedades producidas por patógenos biotróficos. Los análisis fenotípicos y genéticos indican que csb3-l es una mutación recesiva parcial de pérdida de función que da como resultado la activación de las defensas de las plantas. De manera coherente con el incremento observado de la resistencia hacia patógenos biotróficos, las plantas csb3-l muestran incremento de la acumulación de SA en condiciones de reposo y una capacidad adicional para aumentar la biosíntesis sobre los niveles salvajes tras la exposición a Pst DC3000. Esta observación ofrece una explicación de por qué las plantas csb3-l también muestran activación constitutiva de varios genes marcadores relacionados con la defensa (por ejemplo, PRl, PR2 y GST6) que finalmente se controlan mediante la ruta de señalización mediada por SA (Durrant y Dong, 2004). Fue particularmente instructivo en la comprensión del papel de CSB 3 en esta ruta de defensa, la observación de que SA se requiere absolutamente para la resistencia conferida por csb3-l, tal como se deduce de la supresión de este fenotipo en varios dobles imitantes que se generaron. Los niveles de transcrito génico PR-I en estado estacionario, la expresión de P69C-GUS y el incremento de la resistencia frente a Pst DC3000 se suprimieron de manera llamativa en los dobles imitantes csb3 pad4, csb3 sid2, csb3 eds5 y csb3 NahG si se compara con los observados en las plantas homocigóticas csb3-l. Todas estas observaciones indican que el hecho de mantener intacta la síntesis y acumulación de SA es fundamental para el incremento de la resistencia a la enfermedad en las plantas csb3-l. Por tanto, estos estudios indican que el control mediado por csb3-l de la respuesta defensiva dependiente de SA parece actuar en alguna fase en los primeros acontecimientos de la interacción planta-patógeno. Además, el incremento de la resistencia de csb3-l también requiere componentes que funcionan como transductores de la señal de defensa derivada de SA (tal como NPRl), tal como se demuestra por las plantas dobles imitantes csb3 nrpl que se comportan como nprl con respecto a la falta de la expresión del gen PR y la hipersusceptibilidad a la infección por Pst DC3000.
Además, la reversión del fenotipo de resistencia, desde resistente hasta hipersusceptible, sin una supresión del nivel de transcrito génico PR- 1 en estado estacionario en el doble mutante csb3 dth9, revela una necesidad también de una ruta intacta dependiente de DTH9, después del extremo 3' de acumulación de SA para la resistencia asociada a csb3- 1. Por tanto, se requiere que ambas rutas NPRl y DTH9 estén intactas para regular la resistencia a la enfermedad en las plantas csb3-l. Curiosamente, el fenotipo de resistencia a la enfermedad de las plantas csb3-l está acompañado de la aparición de una tendencia de crecimiento anómala manifestada en forma de enanismo, que está acompañada de la presencia de hojas rizadas en roseta. Esta alteración del desarrollo es también una característica de otros diversos imitantes de Arabidopsis entre los que destacan los imitantes cpr (constitutive expressor ofPR genes [que expresa de manera constitutiva los genes PR]) (Durrant y Dong, 2004). Al igual que csb3-l, los imitantes cpr son más resistentes al crecimiento de patógenos biotróficos, muestran expresión constitutiva del gen PR- 1 y son completamente dependientes de la acumulación de SA (Bowling et al., 1994). Sin embargo, a diferencia de csb3-l, los imitantes cpr muestran independencia de NPRl para el incremento de la resistencia y para expresar las defensas (Clarke, J.D., Volko, S.M., Ledford, H., Ausubel, F.M., and Dong, X. (2000). Roles of salicylic acid, jasmonic acid, and ethylene in cpr-induced resistance in Arabidopsis. Plant CeIl 12, 2175-2190.). Además, la generación de plantas dobles mutantes csb3 cprl reveló que ambas mutaciones son aditivas, dando como resultado plantas que muestran un fenotipo extremadamente aberrante que nunca alcanza la fase reproductiva. Por tanto, las mutaciones csb3-l y cprl pueden contribuir a su característico aumento de la acumulación de SA y sus respectivos fenotipos de incremento de la resistencia a través de rutas independientes.
Utilizando una estrategia de clonación posicional, se identificó el gen CSB 3. CSB 3 complementó la mutación csb3-l, tal como se muestra, mediante la reducción de la expresión de los genes PR, así como la reversión del incremento de la resistencia en plantas transgénicas csb3-l que expresan CSB 3 (figura 7 A-C). Por tanto, se volvió a confirmar la epistasis de CSB3 a la acumulación de SA y la expresión de PR e incremento de la resistencia frente a Pst DC3000. Además, el análisis de la expresión génica en plantas salvajes reveló que CSB 3 se expresa de manera moderada en condiciones de reposo y la expresión está regulada por disminución tras la infección por Pst DC3000. Esta regulación por disminución es más pronunciada durante una interacción incompatible, tal como la provocada durante la infección por Pst DC3000 (avrRpml). Esta regulación por disminución se correlaciona de manera inversa, tanto en el tiempo como en la intensidad, con la inducción observada de los genes regulados por SA (por ejemplo, PR-I) durante la misma interacción planta-patógeno (figura 7D). Estas observaciones sugieren que la regulación por disminución del transcrito CSB3 podría estar implicada funcionalmente en la acumulación de SA y la activación de las defensas de las plantas tras la inducción del patógeno y puede coincidir con CSB3 que actúa como regulador negativo de la ruta dependiente de SA que conduce a la resistencia frente a patógenos biotróficos en plantas salvajes.
En el esfuerzo por identificar supresores del mutante csb3-l, en la presente invención denominados mutantes scs, se sometieron a mutagénesis semillas csb3-l con EMS y se seleccionaron plantas M2 para buscar plantas que habían perdido el característico fenotipo enano y la resistencia de csb3-l frente a Pst DC3000. Se identificaron cuatro mutantes scs en los que el incremento de la resistencia frente a este patógeno estaba revertido hasta un nivel comparable al alcanzado en plantas salvajes (es decir, en plantas scs2 y scs 11 ; figura 4) o incluso inhibido adicionalmente para hacer estas plantas hipersusceptibles al mismo patógeno (es decir, en plantas scs9 y scsll ; figura 4). Los mutantes scs identificados se corresponden con mutaciones recesivas no alélicas que son extragénicas con respecto al locus csb3 y conferían el mismo fenotipo incluso en ausencia de la mutación csb3-l. Estas observaciones proporcionan pruebas adicionales de que CSB3 es un regulador importante de la respuesta de resistencia a la enfermedad mediada por SA en Arabidopsis. Asimismo, estos resultados sugieren que el papel de CSB3 en la respuesta de resistencia a la enfermedad está bajo estricto control, tal como se determina mediante la identificación de los reguladores SCS. La caracterización y clonación adicionales del supresor scs ayudarán a comprender en detalle cómo funciona esta regulación durante la respuesta de resistencia a la enfermedad. El gen CSB 3 codifica para la l-hidroxi-2-metil-2-butenil-4-difosfato [HMBPP] sintasa que cataliza la formación de HMBPP a partir de 2,4-ciclodifosfato de 2-C-metil-D- eritritol [MEcPP] (Kollas et al., 2002). Esta actividad enzimática controla una de las etapas terminales de la biosíntesis de difosfato de isopentenilo [IPP] y su isómero difosfato de dimetilalilo [DMAPP] a través de la ruta del 4-fosfato de 2-C-metil-D- eritritol (MEP) independiente del mevalonato que se produce en el cloroplasto de las plantas superiores (figura 6). La ruta de MEP localizada en el plástido, junto con la ruta dependiente de mevalonato citosólico (MVA), se encargan de la síntesis de precursores de isoprenoides, a partir de los cuales se origina una plétora de diferentes compuestos, metabolitos y hormonas vegetales (Rohmer, 1999). No se pronostica que el mutante csb3-l sea un mutante nulo, ya que otros alelos nulos en el gen CSB 3 (es decir, csb3-2, y clb4/csb3-3) son mortales. Por tanto, la pérdida parcial de función atribuida a la sustitución de GIy por Asp identificada en la proteína mutante csb3-l puede explicarse si se tiene en cuenta que la introducción de un residuo de aminoácidoácido en lugar de uno neutro en el interior o cerca del motivo 4Fe-4S, que está sumamente conservado en este tipo de enzimas, puede alterar una conformación correcta en este dominio que, a su vez, puede desestabilizar en cierto grado el correcto plegamiento de la enzima. Esto coincide con la observación previa de otras mutaciones que tienen lugar en la misma región del homólogo GCPE de E. coli (Sauret-Güeto et al., 2003). Como la pérdida de función asociada con la mutación csb3-l da como resultado la activación de la ruta del SA que conduce al incremento de la resistencia observado, se deduce que el desmantelamiento de un compuesto aguas debajo de HDS/CSB3 (debido a la reducción de la actividad enzimática de la enzima csb3-l) o, alternativamente, el exceso de acumulación de un compuesto previo a la acción de la enzima HDS/CSB3 (tal como MEcPP o cualquiera de sus precursores metabólicos antes del extremo 5') debe tener una función en la respuesta defensiva controlada por SA. Se probó esta conjetura examinando el efecto de un inhibidor de la ruta de MEP (es decir, fosmidomicina) sobre el incremento de la resistencia de plantas csb3-l, así como sobre la resistencia normal alcanzada en plantas salvajes. La fosmidomicina bloquea la actividad de DXR, la enzima que controla la segunda etapa implicada de la ruta de MEP (figura 6) y por tanto, inhibe la ruta en un paso previo a la acción de HDS/CSB3 (Schwender et al., 1999; Laule et al., 2003). Se observó que el efecto inhibidor de la fosmidomicina puede complementar completamente el fenotipo de incremento de la resistencia asociado a csbS-l, así como la expresión de los genes relacionados con la defensa (figura 8). Por tanto, sugiere que la activación de la ruta de SA en el mutante csbS-l no se debe a una reducción de un compuesto que surge posterior a la acción de CSB3/HDS que puede comprometer las posteriores etapas enzimáticas que conducen a la biosíntesis de isoprenoides, sino más bien es el resultado de una acumulación en exceso del sustrato directo de HDS/CSB3, concretamente MEcPP, o indirectamente cualquiera de sus precursores inmediatos. Además, la fosmidomicina también afecta a la respuesta de resistencia a la enfermedad de las plantas salvajes frente a Pst DC3000, y los tratamientos de plantas con 50 μM de este inhibidor dan como resultado tasas superiores de crecimiento bacteriano (figura 8A). Este hallazgo refuerza adicionalmente la consideración de que el mismo compuesto que se acumula en exceso en las plantas csbS-l y regula positivamente el incremento de la resistencia del mutante también es importante para una resistencia normal a la enfermedad en plantas salvajes.
En resumen, estos resultados apuntan en dirección a la participación de una señal / factor cloroplástico, derivado de una de las etapas intermedias iniciales de la ruta de MEP, en el control de la ruta de SA activada por patógenos que conduce a la resistencia a la enfermedad frente a patógenos biotróficos. Esto apoya la importancia del cloroplasto en la mediación de los aspectos críticos de la respuesta defensiva de la planta. Los desafíos para el futuro son determinar qué molécula(s) exacta(s) es (son) responsable(s) del control observado de la ruta de SA y cómo está controlada su acción mediante el producto de los genes SCS identificados en la presente invención.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS.
Figura 1. Caracterización de plantas csb3 y comparación con plantas salvajes.
(A) Comparación del aspecto externo de las plantas csb3 (derecha) y plantas salvajes (wt) (izquierda). Las plantas se fotografiaron cuando tenían 3,5 semanas de edad.
(B) Tinción histoquímica de la actividad GUS dirigida por el promotor de P69C en un plantón transgénico salvaje de 14 días de edad (izquierda) y plantones csb3 (derecha). (C) Hoja en roseta completamente expandida procedente de una planta transgénica salvaje (izquierda) y plantas csb3 (derecha) teñidas para determinar la actividad GUS.
(D) Expresión de los genes marcadores PR-I, PR-2, GST6 y PDF 1.2 en plantas salvajes y csb3. (E) Niveles de SA libre y SA total en plantas salvajes y csb3. Las plantas salvajes (wt) y csb3 se inocularon con Pst DC3000 o con MgSO4 10 mM (prueba) y la cantidad de SA libre y glucósido de SA (SAG) determinados 24 horas tras la inoculación. Cada barra representa la media de tres muestras de replicado con la desviación estándar. Se sometieron a ensayo el SA libre y el glucósido de SA (SAG) en las mismas muestras.
Figura 2. Incremento de la resistencia de plantas csb3 frente a patógenos biotrófícos pero no necrotrófícos.
(A) Respuesta de resistencia de plantas imitantes csb3 y salvajes es de Arabidopsis frente a Hyaloperonospora parasítica virulenta. Siete días después de la inoculación por rociado de plantas de 2 semanas de edad con 105 conidiosporas por mililitro de agua, se tiñeron las hojas con azul de tripano-lactofenol y se observaron con un microscopio para revelar el característico crecimiento extenso de hifas. El crecimiento de este patógeno presentaba una inhibición llamativa en las plantas csb3.
(B) Para cuantificar la resistencia frente a H. parasítica, se hizo un recuento de la producción de conidios 7 días después de la inoculación con ayuda de un hemocitómetro.
Las plantas que llevaban la mutación csb3 eran sumamente resistentes a este patógeno.
(C) Crecimiento de Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 en plantas salvajes y csb3. Se inocularon plantas de dos semanas de edad mediante inmersión en una suspensión bacteriana, y se determinó el título de bacterias, medido como unidades formadoras de colonias (ufe) por peso fresco, a los 0, 3, y 5 días después de la infección para plantas salvajes y csb3. Se tomaron ocho muestras para cada genotipo en cada punto de tiempo. Los puntos de datos representan la media ± la desviación estándar de los logaritmos. El experimento se repitió tres veces con resultados similares. Las plantas que llevaban la mutación csb3 eran sumamente resistentes a este patógeno. (D) Respuesta de resistencia de plantas salvajes y csb3 frente a Plectosphaerella cucumerina. Se inocularon las plantas aplicando gotas de 6 μl de suspensión de esporas (5 x 106 esporas/ml) de P. cucumerina a hojas completamente expandidas. Se evaluaron los síntomas de enfermedad 4 días después de la inoculación determinando los diámetros medios de lesión en 3 hojas de 8 plantas cada vez. Los puntos de datos representan el tamaño medio de lesión ± DE de las medidas. Las plantas que llevaban la mutación csb3 eran tan resistentes a este patógeno como las plantas salvajes.
(E) Hojas de plantas salvajes y csb3 a los 4 días después de la inoculación con una gota de 6 μl de esporas de Botrytis cinérea (2,5 x 104 conidias/ml).
(F) Se midió el tamaño de lesión generado por Botrytis cinérea a los 4 días después de la inoculación. Los puntos de datos representan el tamaño medio de lesión ± DE de las medidas procedentes de un mínimo de 30 lesiones. Este experimento se repitió tres veces con resultados similares, wt, salvaje. Las plantas que llevaban la mutación csb3 eran tan resistentes a este patógeno como las plantas salvajes.
Figura 3. Efecto de mutaciones relacionadas con SA sobre la respuesta de resistencia a la enfermedad de plantas csb3.
(A) Crecimiento de Pst DC3000 en los dobles imitantes csb3 pad4, csb3 sid2, csb3 eds5, csb3 nahG, csb3 dth9, csb3 nprl comparado con el crecimiento en imitantes sencillos y plantas salvajes. Se registró el crecimiento bacteriano en muestras de hojas que se recogieron inmediatamente después de la infección, a los 3 días después de la inoculación (d.p.i) y a los 5 d.p.i. Se tomaron ocho muestras para cada genotipo en cada punto de tiempo. El experimento se repitió dos veces con resultados similares. (B) Análisis de RT-PCR de la expresión génica de PR-I y GST6 en imitantes relacionados con SA, así como en dobles imitantes csb3 y plantas salvajes. El gel inferior muestra una RT-PCR para el gen de mantenimiento ("housekeeping") eIF4α utilizado en la presente invención como un control de carga.
(C) Hoja en roseta completamente expandida procedente de una planta original salvaje (centro), plantas csb3 (izquierda) y plantas csb3 nahG (derecha) teñidas para determinar la actividad GUS dirigida por el promotor del gen P69C.
Figura 4. Caracterización de supresores de csb3.
(A) Cuadro superior: fenotipos morfológicos de los imitantes scs que actúan como supresores del fenotipo csb3. Se hicieron crecer todas las plantas en paralelo en el suelo y se fotografiaron cuando tenían 4 semanas de edad. Cuadro inferior: supresión de la expresión del gen indicador P69C-GUS inducida por csb3 en hojas procedentes de imitantes supresores scs. (B-C) Incremento de la susceptibilidad a la enfermedad frente a Pst DC3000 de los diferentes imitantes scs. Se registró el crecimiento bacteriano a los 0, 3 y 5 días después de la inoculación (d.p.i). El experimento se repitió dos veces con resultados similares.
Figura 5. Clonación posicional y estructura de CSB3.
(A) Región de 0,8 Mb en el cromosoma 5 con BAC superpuestos, flanqueados por los marcadores de SSLP, Ngal29 y MBK-5, utilizados para la detección de recombinaciones en 1496 cromosomas.
(B) Localización de CSB 3 en la región secuenciada correspondiente al clon de BAC, MUF9. CSB 3 estaba situado entre dos marcadores de SSLP que comprenden una región de 66 kb.
(C) Estructura de exón/intrón de CSB 3. Las regiones codificantes están indicadas con líneas gruesas. Las posiciones de las mutaciones csb3-l, csb3-2 y clb4/csb3-3 se muestran en la parte superior de cada uno de los exones respectivos. El inserto presenta el intercambio de nucleótidos encontrado en el mutante csb3-l y su influencia sobre la secuencia proteica. El alelo mutante está indicado debajo de la secuencia salvaje. Las letras mayúsculas marcan las secuencias nucleotídicas en la mitad del exón 19. La transición de "G" a "A" debida al mutágeno está indicada en negrita. Las secuencias de aminoácidos deducidas están indicadas como un código de letras individuales debajo de cada triplete de nucleótidos y las letras en negrita marcan los cambios de aminoácidos (G a D) en las secuencias proteicas.
(D) Secuencia de aminoácidos deducida de la enzima hidroximetilbutenil-4-difosfato sintasa (HDS, también denominada GcpE en los microorganismos) asociada a plástido codificada por CSB 3. La secuencia señal pronosticada para el transporte de plástido (programa ChloroP) se muestra subrayada en el extremo N-terminal. En cursiva, se muestran las regiones homologas entre homólogos HDS de planta y el homólogo GcpE procedente de microorganismos. El dominio proteico comprendido entre estos dos dominios conservados es específico de la planta, ya que no está presente en la enzima GcpE procedente de microorganismos. En el extremo C-terminal, se muestran con un asterisco los residuos de cisteína conservados que están sumamente conservados en todas las enzimas HDS y GcpE. Subrayados están los residuos conservados que comprenden el distintivo ("signature") donde se halla el cluster [4Fe-4S] (Sauret-Güeto et al., 2003). El residuo de glicina convertido en residuo aspártico en el mutante csb3-l se muestra en negrita en la posición 695 y está cerca de la secuencia conservada que participa en la coordinación de [4Fe-4S].
Figura 6. Diagrama de la ruta metabólica de 4-fosfato de mctil-D-critritol (MEP). Las abreviaturas de las enzimas que catalizan cada etapa de la ruta se muestran en el lado izquierdo de la figura en negrita tal como sigue: 1 -desoxi-D-xilulosa-5-fosfato sintasa (DXS); 2C-metil-D-eritritol-4-fosfato sintasa (DXR); 4-difosfocitidil-2C-metil-D- eritritol-4-fosfato sintasa (CMS); 4-difosfocitidil-2C-metil-D-eritritol cinasa (CMK); 2C- metil-D-eritritol-2,4-difosfato sintasa (MCS); 2C-metil-D-eritritol-2,4-ciclodifosfato reductasa (HDS); l-hidroxi-2-metil-butenilo reductasa-4-difosfato (HDR); isopentenil- difosfato isomerasa (IDI). Los nombres de algunos de los mutantes encontrados están indicados en el lado derecho del diagrama. La posición de la mutación csb3 se muestra. También se indica la posición en la que se sabe que la fosmidomicina inhibe la ruta.
Figura 7. Complementación de plantas csb3-l y regulación por disminución de la expresión gέnica de CSB3 tras la infección por Pst DC3000.
(A-C) Caracterización fenotípica y molecular de plantas csb3-l transformadas de manera estable con un constructo génico 35S-CSB3. (A) Aspecto morfológico de plantas csb3-l no transformadas comparado con dos líneas transgénicas. Obsérvese la reversión hacia un fenotipo salvaje en las líneas transgénicas. La tinción histoquímica de la actividad GUS dirigida por el promotor de P69C en hojas en roseta completamente expandidas obtenidas de plantas csb3-l no transformadas y de las dos líneas transgénicas se muestra en el mismo cuadro.
(B) Respuesta de resistencia frente a Pst DC3000 de dos líneas transgénicas csb3 independientes (línea 1.1 y línea 5.6) transformadas de manera estable con un constructo génico 35 S-CSB 3 y comparación de la respuesta de resistencia observada en el tipo salvaje (wt) y el mutante csb3-l. Obsérvese que las líneas transgénicas han perdido el incremento de la resistencia asociada con la mutación csb3-l. Se registró el crecimiento bacteriano a los 0, 3 y 5 días después de la inoculación (d.p.i). El experimento se repitió dos veces con resultados similares.
(C) Análisis de RT-PCR de la expresión génica de PR-I y GST6 en plantas csb3-l así como en plantas salvajes y en las líneas transgénicas (líneas 1.1 y 5.6) que expresan el constructo génico 35 S-CSB 3. Obsérvese que las plantas transgénicas ya no expresan de manera constitutiva los genes marcadores relacionados con SA. El gel inferior muestra una RT-PCR para el gen de mantenimiento eIF4α utilizado en la presente invención como control de carga.
(D) Análisis de RT-PCR de la expresión génica de CSB 3 y PR-I en plantas salvajes tras la infección por Pst DC3000 que llevan o no el gen de avirulencia avrRpml. Los números indican las horas tras la inoculación. El nivel de expresión de estos dos genes también se analizó en plantas csb3-l sanas y se muestra a la izquierda para comparar. El gel inferior muestra una RT-PCR para el gen de mantenimiento eIF4α utilizado en la presente invención como control de carga. El experimento se repitió dos veces con resultados similares.
Figura 8. Complementación farmacológica del incremento de la resistencia de csb3- 1 con fosmidomicina.
(A) Se rociaron plantones salvajes (wt) y csb3-l de Arabidopsis una vez a las 48 horas y a las 24 horas antes de su exposición a Pst DC3000 con una solución tampón complementada con fosmidomicina 25 μM o 50 μM (+ fosm). Los controles se trataron de manera similar con solución tampón sola. Las plantas se expusieron a Pst DC3000 y se registró el crecimiento del patógeno a los 0, 3 y 5 días después de la inoculación (d.p.i). (B) Efecto del tratamiento con fosmidomicina (25 μM, tratados tal como se indica en (A) sobre la expresión constitutiva de P69C-GUS en plantones csb3-l (derecha) comparado con plantones csb3-l tratados con tampón (izquierda).
(C) Efecto del tratamiento con fosmidomicina (25 μM, tratados tal como se indica en (A) sobre la expresión constitutiva de genes marcadores regulados por SA en plantones csb3- 1 de Arabidopsis comparado con plantones csb3-l tratados con tampón.
EXPOSICIÓN DETALLADA DE UN MODO DE REALIZACIÓN Plantas, condiciones de crecimiento y tratamientos
Se hicieron crecer plantas de Arabidopsis thaliana en el suelo o en placas que contienen medio de Murashige y Skoog (MS) tal como se describió anteriormente (Mayda et al., 2000). El mutante csb3-l se aisló en una selección para determinar los que expresan de manera constitutiva el gen indicador P69C-GUS en plantas transgénicas Columbia (CoI- 0) sometidas a mutagénesis con metanosulfonato de etilo (EMS), tal como se describió anteriormente para otros imitantes (Mayda et al., 2000). La línea mutante csb3-l utilizada en estos experimentos se había sometido a retrocruzamiento al menos cuatro veces con la línea original salvaje. Se hicieron crecer las plantas en una cámara de crecimiento (19- 23°C, iluminación fluorescente de 100 μEm-2 seg-i) en un ciclo de 10 horas de luz y 14 horas de oscuridad. A menos que se indique lo contrario, se utilizaron hojas expandidas completamente de plantas de 4 semanas de edad para todos los experimentos. La tinción para determinar la presencia de actividad GUS se llevó a cabo tal como se describió anteriormente (Mayda et al., 2000).
Infección patogénica
Se hizo crecer Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 y se preparó para su inoculación tal como se describió anteriormente (Mayda et al., 2000). Las plantas se inocularon mediante el método de inmersión según Tornero, P. and Dangl, J. L. (2001). A high-throughput method for quantifying growth of phytopathogenic bacteria in Arabidopsis thaliana. Plant J. 28: (4): 475- 481..La densidad de las poblaciones bacterianas se determinó mediante cultivo en placa de diluciones en serie sobre medio B de King complementado con rifampicina (50 μg/ml) a 28°C y haciendo un recuento de las unidades formadoras de colonias en diferentes tiempos, tal como se describió anteriormente (Mayda et al., 2000). Los datos se notifican como medias y desviaciones estándar del logaritmo (ufc/g de peso fresco) de seis a ocho replicados. Se realizaron ensayos de resistencia frente a Hyaloperonospora parasítica en plantas de tres semanas de edad rociadas con una suspensión de 105 conidiosporas ml-1 de agua del grifo, tal como se describió anteriormente (Mayda et al., 2000). Al séptimo día, se valoró la densidad de las esporas en las plántulas (siete macetas por tratamiento, cada maceta tratada por separado) utilizando un hemocitómetro. Alternativamente, se tiñeron muestras de hojas con azul de tripano-lactofenol en días diferentes después de la inoculación y se examinaron bajo el microscopio, tal como se describió anteriormente (Mayda et al., 2000). Para la resistencia frente a Plectosphaerella y Botrytis, se trasplantaron plantones de tres semanas de edad a macetas individuales y se cultivaron a temperaturas de 22°C de día / 18°C de noche con 12 h de luz cada 24 h. Cuando las plantas tenían una edad de 6 semanas, se inocularon aplicando gotas de 6 μl de suspensión de esporas de Plectosphaerella cucumerina (5 x 106 esporas ml-i) o de Botrytis cinérea (2,5 x 104 conidias ml-i) a 3 hojas completamente expandidas por planta. Se aisló P. cucumerina de Arabidopsis con infección salvaje (registro Landsberg erecta), y se hizo crecer sobre 19,5 g/L de agar dextrosa de patata (Difco, Detroit, MI) a temperatura ambiente durante 2 semanas antes de recoger las esporas y suspenderlas en MgSO4 10 mM. B. cinérea (cepa BMMl, aislada de Pelargonium zonalé) se hizo crecer sobre 19,5 g/1 de agar dextrosa de patata (Difco) a 200C durante 10 días. Las conidias se recogieron y se suspendieron en PDS estéril (12 g 1-Í; Difco). Las plantas se mantuvieron al 100% de HR y se evaluaron los síntomas de enfermedad de 4 a 10 días después de la inoculación determinando el diámetro medio de lesión en 3 hojas de 5 plantas cada vez.
Análisis genético
Se realizaron cruces cortando brotes no abiertos y utilizando los pistilos como recipientes para polen. Se realizaron retrocruzamientos con la línea transgénica original utilizando plantas P69C-GUS como el donante de polen. También se realizaron cruces recíprocos. Las plantas Fl y F2 se hicieron crecer en placas MS y se analizaron para determinar la actividad GUS. Se analizó la segregación del fenotipo en la generación F2 para determinar la adecuación del ajuste con la prueba de chi-cuadrado.
Clonación basada en el mapeo Se cruzó una planta csb3 (en el resto de Columbia) con Landsberg erecta, y se seleccionaron para el mapeo imitantes homocigóticos csb3 entre la progenie F2 segregante. Se identificaron plantones recombinantes utilizando los marcadores de polimorfismo de longitud de secuencia única (SSLP) según el protocolo descrito por Bell y Ecker (1994) y con nuevos marcadores tal como se informó en el sitio web de la base de datos de Arabidopsis (www.arabidopsis.org).
Generación de dobles mutantes
Los alelos de mutantes utilizados en todo este estudio fueron nprl-1 (Cao et al. 1997), pad4-l, sid2-l (Wildermuth et al., 2001), eds5 (Nawrath et al., 2002) y dth9 (Mayda et al., 2000). Se ha descrito la planta transgénica (en el ecotipo Columbia) que expresa el gen bacteriano NahG. Los dobles mutantes csb3 nprl, csb3 pad4, csb3 sid2, csb3 eds5, csb3 dth9 y csb3 NahG se generaron utilizando csb3 como receptor del polen. La característica homocigótica de los loci se confirmó utilizando un marcador molecular para cada uno de los alelos en las poblaciones segregantes. Para el mutante doble que contiene dth9, la hipersusceptibilidad a Pst DC3000 fue el criterio utilizado para valorar la característica homocigótica. Todos los dobles imitantes se confirmaron en la generación F3.
Clonación de ADNc y complementación inversa
Se utilizó la secuencia genómica como la base para la clonación del ADNc de CSB3. Se aisló el ARN poli(A+) de plantas salvajes y se transcribió de manera inversa utilizando cebadores oligo(dT), tal como se ha descrito (Mayda, E., Tornero, P., Conejero, V., and Vera, P. (1999). A tomato homeobox gene (HD-Zip) is involved in limiting the spread of programmed cell death. Plant J. 20, 591-600.). Este ADNc se amplificó mediante PCR utilizando cebadores específicos de genes diseñados para incluir la región antes del extremo 5' del codón de iniciación y parte de la región 3' que sigue al codón de terminación del gen CSB 3. Las secuencias de los cebadores directos e inversos de CSB 3 utilizados fueron: (5'-CTTCCTCTGGATCCTTCTCTTCTC-S') y (5'-
GGACACTAGTTCAAAATGATGATG-3'), respectivamente. El ADNc se clonó en el vector binario pBI121 (Clontech) bajo el control del promotor constitutivo 35S de CaMV. Desde allí se transfirió el constructo a pCAMBIA1300 dando como resultado pCAMBIA35SCSB3 que, a su vez, se transfirió a Agrobacterium y se utilizó para transformar las plantas csb3-l mediante el método de inmersión floral (Bechtold, N., Ellis, J. And Pelletier, G. (1993). In planta Agrobacterium mediated gene transfer by infiltration of adult Arabidopsis thaliana plants. C. R. Acad. Sci. París Life Sci. 316, 1194-1199.).
Determinación de SA.
Se determinó el contenido libre y conjugado de SA en las hojas, en extractos metanólicos mediante análisis con HPLC tal como se describió anteriormente (Mayda et al., 1999).
Análisis de la expresión Para analizar el nivel de expresión génica mediante PCR mediada por transcriptasa inversa, se prepararon muestras de ARN total procedente de tejidos de hoja utilizando el kit Totally RNA de Ambion (Austin, TX). La transcripción inversa se llevó a cabo utilizando el kit de RT para PCR de Clontech (Palo Alto, CA). Los conjuntos de cebadores oligonucleotídicos (50 pmol cada uno) utilizados para amplificar CSB3 fueron: CSB3PCR1 (5 GGAGGCCTTCTTGTGGATGG-3 ) / CSB3PCR2 (5'GCTGACCCAACGACCATGTTC-S'). LOS cebadores utilizados para amplificar GST6 fueron GST6PCR1 (5'-ATGGCAGGAATCAAAGTTTCGGTCS') / GST6PCR2 (5'- GAGATTCACTTAAAGAACCTTCTG -3'). Los cebadores utilizados para amplificar PRl fueron PRlPCRl (5'-ATGAATTTTACTGGCTATTC-S') / PR1PCR2 (5'- AACCCACATGTTCACGGCGGA-3 ').

Claims

REIVINDICACIONES
1. Un alelo mutante del gen CSB 3 de Arabidopsis thaliana, denominado csb3-l, caracterizado por su secuencia SEC. ID. NO. 1 , en la que presenta una sustitución de un residuo de Glicina por uno de Acido Aspártico en la posición 695.
2. Mutante csb3-l según la reivindicación 1, caracterizado por conferir a las plantas resistencia frente a enfermedades producidas por patógenos biotróficos.
3. Mutante csb3-l según reivindicaciones anteriores, caracterizado por conferir expresión constitutiva de los genes PR- 1, PR-2 y GST6, completamente dependiente de la acumulación de ácido salicílico.
4. Utilización del alelo mutante csb3-l en especies vegetales de interés agronómico, para la obtención de plantas resistentes a enfermedades producidas por patógenos biotróficos.
5. Utilización de C SB 3 como regulador negativo de la respuesta de resistencia a la enfermedad, mediada por ácido salicílico, frente a patógenos biotróficos.
6. Plantas transgénicas caracterizadas por incorporar el gen CSB3 en las que el gen incorporado se ha manipulado genéticamente de forma que se reprime o altera su expresión génica o bien su funcionalidad, confiriéndolas una mayor resistencia a patógenos biotróficos.
7. Plantas imitantes csb3-l caracterizadas porque el aumento de resistencia que presentan frente a patógenos biotróficos, viene determinado por la perdida de función del gen CSB3 y por tanto de la enzima l-hidroxi-2-metil-2-butenil-4-difosfato sintasa por él codificada y que debe resultar en una sobre-acumulación de su sustrato in mediato, es decir el 2,4-ciclodifosfato de 2-C-metil-D-eritritol o de alguno de los intermediarios metabolicos que le preceden según la ruta MEP.
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