ES2267390B1 - Aislamiento y caracterizacion de mutante csb3-1 de arabidopsis thaliana, y su uso como regulador de la resistencia en plantas a enfermedades producidas por patogenos biotroficos. - Google Patents
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Abstract
Aislamiento y caracterización del mutante csb3-1 de Arabidopsis thaliana, y su uso como regulador de la resistencia en plantas a enfermedades producidas por patógenos biotróficos. La presente invención se encuadra dentro del campo técnico de la biotecnología vegetal, y en concreto se refiere a la identificación y caracterización del mutante csb3-1 de Arabidopsis thaliana, así como su función en la regulación de la resistencia a enfermedades producidas por patógenos biotróficos, y sus aplicaciones en la generación de plantas resistentes a este tipo de patógenos.
Description
Aislamiento y caracterización del mutante
csb3-1 de Arabidopsis thaliana, y su
uso como regulador de la resistencia en plantas a enfermedades
producidas por patógenos biotróficos.
La presente invención se encuadra dentro del
campo técnico de la biotecnología vegetal, y en concreto se refiere
a la identificación y caracterización del mutante
csb3-1 de Arabidopsis thaliana, así
como su función en la regulación de la resistencia a enfermedades
producidas por patógenos biotróficos, y sus aplicaciones en la
generación de plantas resistentes a este tipo de patógenos.
Las plantas reaccionan al ataque microbiano con
una serie de defensas inducibles que están integradas por un
complejo sistema de señalización. En la última década, se ha
logrado un avance notable en la comprensión de los mecanismos
moleculares con los cuales se defienden las plantas del ataque
microbiano, mediante la clonación y la caracterización de factores
de resistencia a la enfermedad de las plantas que reconocen la
presencia de factores de avirulencia de patógenos que desencadenan
la denominada respuesta hipersensible (RH) (Dangl, J.L., and Jones,
J.D. (2001). Plant pathogens and integrated defence responses to
infection. Nature 411, 826-833.). La RH puede
confinar al patógeno invasor, previniendo así la diseminación de la
infección (Agrios, G.N. (1988). Plant Pathology. Academic Press,
London, U.K.). En la mayoría de los casos, el inicio de la RH
produce la activación de la resistencia sistémica adquirida (SAR)
(Ross, A.F. (1961). Systemic acquired resistance induced by
localized virus infections in plants. Virology 14,
340-358.), una respuesta defensiva que proporciona
una protección de larga duración en toda la planta frente a un
amplio espectro de patógenos (Durrant, W.E., and Dong, X. (2004).
Systemic acquired resistance. Ann. Rev. Phytopathol. 42,
185-209.). El ácido salicílico (SA) es una molécula
señal esencial que desempeña un papel central en la inducción de la
SAR (Delaney, T. P., Uknes, S., Vernooij, B., Friedrich, L.,
Weymann, K., Negrotto, D., Gaffney, T., Gut-Rella,
M., Kessmann, H., Ward, E., and Ryals, J. (1994). A central role of
salicylic acid in plant disease resistance. Science 266,
1247-1250.). Numerosas plantas mutantes implicadas
en la acumulación o percepción de SA muestran incremento de la
susceptibilidad frente a patógenos biotróficos, mientras que los
mutantes que producen un exceso de SA presentan un incremento de la
resistencia. En particular, se han aislado varios mutantes de
Arabidopsis thaliana que son incapaces de activar las
respuestas defensivas dependientes de SA (Durrant y Dong, 2004).
Los mutantes eds16/sid2 (enhanced disease susceptibility16
[incremento de la susceptibilidad a la enfermedad 16]/salycilic
acid induction deficient2 [deficiente a la inducción por ácido
salicílico 2]) y eds5/sid1 (Rogers, E.E., and Ausubel,
F.M. (1997). Arabidopsis enhanced disease susceptibility mutants
exhibit enhanced susceptibility to several bacterial pathogens and
alterations in PR-1 gene expression. Plant Cell 9,
305-316.; Nawrath, C., and Metraux, J.P. (1999).
Salicylic acid induction-deficient mutants of
Arabidopsis express PR-2 and PR-5
and accumulate high levels of camalexin after pathogen inoculation.
Plant Cell 11, 1393-1404; Wildermuth, M.C., Dewdney,
J., Wu, G., and Ausubel, F.M. (2001). Isochorismate synthase is
required to synthesize salicylic acid for plant defence. Nature
414, 562-565.) no acumulan SA tras la inoculación
con patógenos virulentos y avirulentos. SID2 codifica para
una supuesta isocorismato sintasa localizada en el cloroplasto
(Wildermuth et al., 2001), mientras que EDS5 codifica
para una proteína asociada a la membrana y localizada en el
cloroplasto que muestra homología con transportadores MATE
(extrusión de toxinas y múltiples fármacos) (Nawrath et al.,
2002). Estos hallazgos demuestran la existencia de una ruta de
síntesis de SA localizada en el cloroplasto y revelaron la
importancia de este orgánulo en aspectos criticos de
mediación/control de la respuesta defensiva de las plantas (Shah, J.
(2003). The salicylic acid loop in plant defense. Curr Opin Plant
Biol 6, 365-371.). De hecho, las mutaciones en
varios genes que codifican para proteínas localizadas en el
cloroplasto dan como resultado una señalización defectuosa de SA
(Kachroo, P., Shanklin, J., Shah, J., Whittle, E.J., and Klessig,
D.F. (2001). A fatty acid desaturase modulates the activation of
defense signaling pathways in plants. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A
98, 9448-9453.; De Leon, I.P., Sanz, A., Hamberg,
M., and Castresana, C. (2002). Involvement of the Arabidopsis
alpha-DOX1 fatty acid dioxygenase in protection
against oxidative stress and cell death. Plant J. 29,
61-62.; Slaymaker, D.H., Navarre, D.A., Clark, D.,
del Pozo, O., Martin, G.B., and Klessig, D.F. (2002). The tobacco
salicylic acid-binding protein 3 (SABP3) is the
chloroplast carbonic anhydrase, which exhibits antioxidant activity
and plays a role in the hypersensitive defense response. Proc Natl
Acad Sci U S A 99, 11640-11645.; Ishikawa, A.,
Okamoto, H., Iwasaki, Y., and Asahi, T. (2001). A deficiency of
coproporphyrinogen III oxidase causes lesion formation in
Arabidopsis. Plant J. 27, 89-99.; Mach, J.M.,
Castillo, A.R., Hoogstraten, R., and Greenberg, J.T. (2001). The
Arabidopsis- accelerated cell death gene ACD2 encodes red
chlorophyll catabolite reductase and suppresses the spread of
disease symptoms. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A 98, 771- 776.).
Además, se ha implicado una señal derivada del cloroplasto en el
control del SA y la respuesta defensiva activada por patógenos que
depende de la presencia de luz o un cloroplasto funcional
fotosintético (Genoud, T., Buchala, A. J., Chua,
N-H. and Métraux, J-P. (2002).
Phytochrome signalling modulates the SA-perceptive
pathway in Arabidopsis. Plant J. 31, 87-95.).
Además, los mutantes eds1 y pad4 (phytoalexin
deficient4 [deficiente en fitoalexina 4]) bloquean la
biosíntesis de SA desencadenada por la infección con patógenos
virulentos (Feys, B.J., Moisan, L.J., Newman, M.A., and Parker,
J.E. (2001). Direct interaction between the Arabidopsis disease
resistance signaling proteins, EDS1 and PAD4. EMBO J. 20,
5400-5411.; Jirage, D., Tootle, T.L., Reuber, T.L.,
Frost, L.N., Feys, B.J., Parker, J.E., Ausubel, F.M., and
Glazebrook, J. (1999). Arabidopsis thaliana PAD4 encodes a
lipase-like gene that is important for salicylic
acid signaling. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96,
13583-13588.) y también la que se observa que se
produce en diferentes mutantes con resistencia a la enfermedad
(Jirage, D., Zhou, N., Cooper, B., Clarke, J.D., Dong, X., and
Glazebrook, J. (2001). Constitutive salicylic
acid-dependent signaling in cpr1 and cpr6 mutants
requires PAD4. Plant J. 26, 395-407.; Clarke, J.D.,
Aarts, N., Feys, B.J., Dong, X., and Parker, J.E. (2001).
Constitutive disease resistance requires EDS1 in the Arabidopsis
mutants cpr1 and cpr6 and is partially
EDS1-dependent in cpr5. Plant J. 26,
409-420.). Se requieren EDS1 y PAD4 para la
resistencia conferida por un subconjunto de genes R (es
decir, TIR-NB-LRR). Ambas proteínas
tienen homología con las lipasas y ambas actúan después del extremo
5' de SID2 y EDS5 en la regulación de la síntesis de SA
(Glazebrook, J., Rogers, E.E., and Ausubel, F.M. (1997). Use of
Arabidopsis for genetic dissection of plant defense responses.
Annu. Rev. Genet. 31, 547-569.; Jirage et
al., 1999; Feys et al., 2001; Nawrath, C., Heck, S.,
Parinthawong, N., and Métraux, J-P. (2002). EDS5, an
Essential Component of Salicylic Acid-Dependent
Signaling for Disease Resistance in Arabidopsis, Is a Member of the
MATE Transporter Family. Plant Cell 14, 275- 286.). La proteína de
repetición de anquirina NPR1 (que no expresa PR-1)
se identificó inicialmente en Arabidopsis a través de una
selección genética de mutantes comprometidos en la SAR (Cao, H.,
Glazebrook, J., Clarke, J.D., Volko, S., and Dong, X. (1997). The
Arabidopsis NPR1 gene that controls systemic acquired resistance
encodes a novel protein containing ankyrin repeats. Cell 88,
57-63.). NPR-1 es un regulador
esencial de SAR (Dong, X. (2004) NPR1, all things considered.
Current Opinion in Plant Biology, 7, 547-552.) y de
la ruta de defensa independiente de SAR, ISR (respuesta sistémica
inducida; Pieterse, C.M., and Van Loon, L.C. (2004). NPR1: the
spider in the web of induced resistance signaling pathways. Curr.
Opin. Plant Biol. 7, 456-464.). Con el tratamiento
con SA y el desequilibrio redox del cognato, NPR1 se transloca al
núcleo donde actúa como modulador de la expresión del gen PR
a través de una interacción selectiva con miembros de la subclase
TGA de la familia de cierre ("zipper") de leucinas básicas de
factores de transcripción (Dong, 2004). Además de npr1, se
han identificado otros mutantes comprometidos en la SAR. Una lista
no exhaustiva incluye dir1 (defective in induced
resistance1 [deficiente en resistencia inducida 1]; Maldonado,
A.M., Doerner, P., Dixon, R.A., Lamb, C.J., and Cameron, R.K.
(2002). A putative lipid transfer protein involved in systemic
resistance signalling in Arabidopsis. Nature 419,
399-403.), que lleva una mutación en un gen que
codifica para una proteína con similitud de secuencia con las
proteínas de transferencia de lípidos y apunta en dirección a una
señal basada en lípidos móviles que media la SAR. Asimismo, el
mutante dth9 (detachment9 [desprendimiento 9]) difiere
de npr1 en que la expresión de PR está inalterada. El
hecho de que el tratamiento con SA no restablezca la resistencia en
las plantas dth9 susceptibles a la enfermedad, coloca a DTH9
por detrás de 3' de SA en una ruta paralela de NPR1. Además de
esto, se han llevado a cabo varias selecciones genéticas para
buscar supresores de un npr1 que permite la identificación
de componentes novedosos de la ruta de señalización de SAR, tales
como SNI1, SNC1, SON1 o SSI2 entre otros (Kachroo et al.,
2001; Li, X., Clarke, J.D., Zhang, Y., and Dong, X. (2001).
Activation of an EDS 1-mediated
R-gene pathway in the snc1 mutant leads to
constitutive, NPR1 independent pathogen resistance. Mol. Plant
Microbe Interact. 14, 1131-1139; Li, X., Zhang, Y.,
Clarke, J.D., Li, Y., and Dong, X. (1999). Identification and
cloning of a negative regulator of systemic acquired resistance,
SNI1, through a screen for suppressors of npr1-1.
Cell 98, 329-339.; Kim, H.S., and Delaney, T.P.
(2002). Arabidopsis SON1 is an F-box protein that
regulates a novel induced defense response independent of both
salicylic acid and systemic acquired resistance. Plant Cell 14,
1469-1482.; Shah, J., Kachroo, P., and Klessig,
D.F. (1999). The Arabidopsis ssi1 mutation restores
pathogenesis-related gene expression in npr1 plants
and renders defensin gene expression salicylic acid dependent.
Plant Cell 11, 191-206.; Nandi, A., Welti, R., and
Shah, J. (2004). The Arabidopsis thaliana dihydroxyacetone
phosphate reductase gene suppressor of fatty acid desaturase
deficiency is required for glycerolipid metabolism and for the
activation of systemic acquired resistance. Plant Cell 16,
465-477.; Zhang, Y., Goritschnig, S., Dong, X., and
Li, X. (2003). A gain-of-function
mutation in a plant disease resistance gene leads to constitutive
activation of downstream signal transduction pathways in suppressor
of npr1-1, constitutive 1. Plant Cell 15,
2636-2646.). Curiosamente, los mutantes snc1
(suppressor of npr1-1, constitutive] [supresor
de npr1-1, constitutivo 1]), sni1
(suppressor of npr1 inducible] [supresor de npr1 inducible
1]) y ssi2 (suppressor of SA insensitivity2 [supresor
de insensibilidad de SA 2]) muestran expresión de PR
constitutiva y aumento de la resistencia frente a patógenos
biotróficos. Por el contrario, el mutante son1
(suppressor of nim1-1 [supresor de
nim1-1]) aporta SAR sin inducción del gen
PR y define un nuevo fenómeno que se ha denominado
resistencia independiente de SAR o ISR
(Hammond-Kosack, K.E., and Parker, J.E. (2003).
Deciphering plant-pathogen communication: fresh
perspectives for molecular resistance breeding. Curr. Opin.
Biotechnol. 14, 177-193.).
Un objeto de la presente invención lo constituye
el aislamiento y la caracterización de un mutante del gen
CSB3 (SEC. ID.NO. 2) de Arabidopsis thaliana,
denominado csb3-1 (derivado de
constitutive subtilisin3 [subtilisina constitutiva 3]) (SEC.
ID. NO.1) con incremento de la resistencia a patógenos biotróficos
y desregulada en la expresión de un promotor génico caracterizado
previamente que controla la expresión de una proteasa subtilisina
inducible por patógeno (P69C). CSB3 se aisló mediante
clonación basada en el mapeo y se demostró que codifica para una
1-hidroxi-2-metil-2-butenil-4-difosfato
sintasa, una enzima que controla una de las etapas terminales de la
biosíntesis de difosfato de isopentenilo (IPP) a través de la ruta
de 4-fosfato de
2-C-metil-D-eritritol
(MEP) que se produce en el cloroplasto de las plantas superiores. A
través del análisis de epistasis con otros mutantes caracterizados
relacionados con la defensa, junto con el aislamiento y la
caracterización de supresores extragénicos del mutante csb3 y
la complementación farmacológica del fenotipo de incremento de
resistencia de plantas csb3, se propone que CSB3 controla
los aspectos críticos de la ruta de resistencia a la enfermedad
mediada por SA frente a patógenos biotróficos.
Otro objeto de la presente invención consiste en
la utilización del alelo mutante csb3-1 en
especies vegetales de interés agronómico, para la obtención de
variedades resistentes a enfermedades producidas por patógenos
biotróficos, inhibiendo el gen CSB3 o la actividad de la proteína
por él codificada con el fin de incrementar la síntesis y
acumulación de ácido salicílico y por ende de la resistencia a
patógenos biotróficos.
El gen P69C codifica para una proteasa
similar a la subtilisina, originalmente identificada en las plantas
de tomate (Jorda, L., and Vera, P. (2000). Local and systemic
induction of two defenserelated subtilisin-like
protease promoters in transgenic Arabidopsis plants. Luciferin
induction of PR gene expression. Plant Physiol. 124,
1049-1058.). Las plantas transgénicas de
Arabidopsis que contienen una región de 2,5 kb del promotor
5' de P69C fusionada al gen indicador de
(R)-glucuronidasa (GUS) revela una rápida
activación transcripcional de este gen mediante SA y durante el
transcurso de interacciones compatibles e incompatibles con
Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 (Pst
DC3000) (Jordá et al., 2000). Se observa expresión inducida
en las hojas locales inoculadas (es decir, tras inoculación con
Pst DC3000 que lleva avrRpm1 (Pst DC3000
avrRpm1)), así como en hojas distales no inoculadas de la
misma planta. Curiosamente, la expresión inducida en las hojas
inoculadas tiene lugar a una distancia de la zona donde se ejecuta
la RH. La expresión del transgén P69C-GUS se
produce en puntos distribuidos a todo lo largo de la lámina de la
hoja de tanto las hojas locales como las distales, tal como se
visualiza mediante la deposición del azul añil derivado de la
X-gluc utilizada como sustrato. Este patrón de
expresión es distinto al observado para otros genes regulados por
SA, tales como PR-1, cuya expresión inducida
es sumamente delimitada y concéntrica a los tejidos que rodean la
lesión de RH (Bowling, S.A., Guo, A., Cao, H., Gordon, S., Klessig,
D.F., and Dong, X. (1994). A mutation in Arabidopsis that leads to
constitutive expression of systemic acquired resistance. Plant Cell
6, 1845-1857.).
Con el fin de identificar las señales y los
mecanismos implicados en la ruta que conduce a la distinta
activación del promotor de P69C y de estudiar el impacto que
esta ruta puede tener sobre la resistencia a la enfermedad, la
investigación se dirigió a la búsqueda de mutantes utilizando
plantas transgénicas de Arabidopsis que albergan el
constructo génico P69C-GUS. La idea fue que
mediante la selección de los mutantes que muestran expresión del
gen indicador en plantas sanas no inoculadas, se podrían
identificar las mutaciones que afectan a la respuesta defensiva.
Para ello, se sometió a mutagénesis una de las líneas transgénicas
homocigóticas que contienen una única inserción de
P69C-GUS con metanosulfato de etilo (EMS) y
se seleccionaron aproximadamente 12800 semillas M2 para individuos
con actividad GUS elevada de manera constitutiva. Estos mutantes se
denominaron csb (constitutive subtilisin [subtilisina
constitutiva]). Se seleccionó un mutante con gran expresión de
GUS, denominado csb3, el cual se describe
detalladamente en la presente invención.
Las plantas csb3 pueden distinguirse de
las plantas salvajes, debido a su característico fenotipo atrofiado
y hojas rizadas (figura 1A). Se llevó a cabo tinción histoquímica
para determinar la actividad GUS, para investigar el patrón de
expresión constitutiva de gen indicador en las plantas csb3.
Tal como se muestra en las figuras 1B-C, no se
detectó actividad GUS en los plantones salvajes originales. Por el
contrario, los plantones csb3 mostraron tinción de GUS en los
cotiledones y una expresión más pronunciada de actividad GUS en
hojas en roseta de plantas con crecimiento completo.
Como la aplicación local de SA induce la
expresión de P69C-GUS en plantas salvajes de
Arabidopsis (Jordá et al., 2000), se estableció la
hipótesis de que la acumulación de SA podría estar aumentada en las
plantas csb3. En un primer lugar se estableció la expresión
de varios genes inducibles por SA (PR-1,
PR-2 y GST6) en plantas csb3.
Los análisis tipo Northern mostrados en la figura 1D revelaron que
la expresión de los genes seleccionados estaba en todos los casos
incrementada en plantas csb3 intactas, pero no en plantas
salvajes, apuntando por tanto en dirección a una activación
constitutiva de la señalización dependiente de SA en el mutante
csb3. Por el contrario, la expresión del gen marcador de
jasmonato/etileno, PDF1.2, no estaba alterado en las plantas
csb3 (figura 1D).
El hecho de que la expresión génica regulada por
SA está activada en plantas csb3 intactas sugirió una
alteración de la acumulación de SA en las plantas csb3. Por
tanto, se examinaron los niveles de SA libre y de
glucósido-salicilato conjugado (SAG) en tejidos de
hoja de plantas csb3 y salvajes (figura 1E). En las hojas no
inoculadas de plantas csb3, se observó un aumento de ocho
veces en el contenido en SAG cuando se comparaba con las plantas
salvajes. No se encontraron diferencias significativas en las
concentraciones de SA libre. Sin embargo, en el tejido de hoja
infectada, a los 3 días después de la inoculación (d.p.i) con
Pst DC3000, las cantidades de SA libre aumentaron once veces
en las plantas csb3 mientras que sólo aumentaron tres veces
en las plantas salvajes. Se observaron aumentos proporcionales
similares en la cantidad de SAG entre plantas csb3 y
salvajes tras la inoculación (figura 1E). Este hallazgo sugiere que
la mutación csb3 no sólo confiere un incremento de la
acumulación de SA en condiciones de reposo, sino también hace que
las plantas tiendan más a aumentar la síntesis y la acumulación de
esta molécula tras la infección.
Para analizar el patrón de herencia de la
mutación csb3, se sometieron a retrocruzamiento plantas
csb3/csb3 con plantas salvajes CSB3/CSB3 que contienen
el transgén P69C-GUS y se analizó la
progenie resultante F1 y F2 para determinar la tinción de GUS. Como
la expresión constitutiva de GUS estaba ausente en todas las
plantas F1 analizadas, se concluyó que la expresión constitutiva de
GUS mediada por csb3 se heredaba como un carácter recesivo.
En las plantas F2, la expresión estaba presente en 67 de 240
plantas (3:1, que no expresan: que expresan de manera constitutiva;
\cdot_{2}= 0,4, 0,1>P>0,5), lo que apoya la conclusión de
que csb3 es una mutación recesiva y lo que indica que un
único locus es responsable del fenotipo csb3.
Con el fin de determinar si existe una relación
entre la ruta de señales que median la activación de
P69C-GUS y que median la resistencia a la
enfermedad, se analizó la respuesta de plantas csb3 y
salvajes frente a diferentes patógenos que generan enfermedad en
Arabidopsis. La respuesta de plantas csb3 frente al
oomiceto biotrófico obligatorio Hyaloperonospora parasitica
comparado con la respuesta de plantas salvajes se muestra en la
figura 2A-B. Se inocularon 25 plantas csb3,
así como 25 plantas salvajes con el aislado de H. parasitica
NOCO (10^{5} conidiosporas/ml), que es virulento sobre
Arabidopsis Col-0. Se sometió a ensayo el
crecimiento del patógeno mediante la observación directa de hifas
teñidas en hojas infectadas (figura 2A) y mediante el recuento de
los conidios producidos sobre hojas infectadas (figura 2B). Ambas
mediciones revelaron una diferencia significativa en el crecimiento
de patógenos entre plantas salvajes y csb3. Mientras las
plantas salvajes tuvieron una fuerte colonización por los oomicetos
y permitieron su ciclo de vida completo (formación de oosporas
sexuales y conidios asexuales en los conidióforos), las plantas
csb3 inhibieron drásticamente el crecimiento de este
patógeno. Esto indica que la resistencia frente a este patógeno
biotrófico se incrementó drásticamente o se bloqueó la
susceptibilidad como consecuencia de la mutación en el locus
CSB3.
También se expusieron las plantas salvajes y
csb3 al patógeno bacteriano virulento Pseudomonas
syringae pv. tomato DC3000 (Pst DC3000), otro
patógeno biotrófico de Arabidopsis. Tras la inoculación, la
velocidad de crecimiento del patógeno se controló en las hojas
infectadas. Las curvas de crecimiento resultantes se muestran en la
figura 2C. El número de unidades formadoras de colonias de
Pst DC3000 detectadas en plantas csb3 fue de 30 a 60
veces inferior al número detectado en las plantas salvajes tras 3 ó
5 días de crecimiento. Por tanto, las plantas csb3 muestran
también incremento de la resistencia frente a este patógeno
bacteriano.
La susceptibilidad de las plantas csb3
frente a patógenos se analizó adicionalmente utilizando
Plectospharella cucumerina, un patógeno necrotrófico de
Arabidopsis. La infección de plantas salvajes por P.
cucumerina conduce a una fuerte degradación del tejido de la
hoja, manifestada como lesiones extensas que aumentan de diámetro a
medida que la infección progresa a lo largo de la hoja inoculada. No
se observaron diferencias en la extensión de la lesión entre las
plantas csb3 y salvajes (figura 2D). Para determinar si la
mutación csb3 podía provocar cambios en la susceptibilidad
frente a otro patógeno necrotrófico, se inocularon plantas
csb3 y salvajes con Botrytis cinerea. La enfermedad
se puntuó entre 5 y 10 días después de la inoculación mediante el
seguimiento de la extensión de la necrosis y la muerte que aparece
en las hojas inoculadas. Tanto las plantas salvajes como las
plantas csb3 eran sumamente susceptibles a Botrytis,
y todas las plantas mostraban necrosis acompañada por proliferación
extensa de micelios fúngicos (figuras 2E y 2F). Por tanto, la
mutación csb3 parecía no afectar a la susceptibilidad de la
planta frente a patógenos necrotróficos. Basándose en el fenotipo
del mutante recesivo csb3, podría establecerse la hipótesis
de que CSB3 podría regular negativamente determinados aspectos de
la respuesta defensiva frente a patógenos biotróficos.
Para proporcionar perspectivas adicionales de la
señalización activada por csb3, se generó una serie de
dobles mutantes entre csb3 y diferentes mutantes con
afectación en la ruta relacionada con SA. Se investigó la respuesta
de resistencia frente a Pst DC3000 para todos estos mutantes
(figura 3).
La mutación pad4 compromete la
acumulación de SA desencadenada por la infección por P.
syringae virulento (Feys et al., 2001; Jirage et
al., 1999) y por tanto, suprime la acumulación de SA alcanzada
en otros mutantes resistentes a patógenos biotróficos (Jirage et
al., 2001). Tal como se muestra en las figuras 3A y 3B, tanto el
incremento de la resistencia frente a Pst DC3000, así como
la expresión constitutiva del gen PR-1
inducible por SA conferida por la mutación csb3 están
suprimidas en las plantas dobles mutantes csb3 pad4. Estos
datos muestran que se requiere completamente PAD4 para la
señalización en plantas csb3.
Los mutantes sid2 y eds5 de
Arabidopsis presentan alteración en la síntesis y
acumulación de SA que se produce en el cloroplasto a través de las
rutas del corismato e isocorismato y ambas plantas mutantes
muestran aumento de la susceptibilidad frente a los patógenos
(Nawrath y Métraux, 1999; Wildermuth et al., 2001). En las
plantas csb3 sid2, así como plantas csb3 eds5, la
resistencia frente a Pst DC3000 conferida por csb3 en
el aislamiento está notablemente reducida (figura 3A). Por tanto,
la expresión constitutiva del gen marcador
PR-1 observada en plantas csb3 estaba
bloqueada en csb3 sid2 y en un grado menor también en plantas
csb3 eds5 (figura 3B). Por tanto, el incremento de la
resistencia de las plantas csb3 depende de la síntesis de SA
que tiene lugar en el cloroplasto mediante la acción de SID2 y
EDS5.
Para ampliar adicionalmente nuestra comprensión
del papel de SA para el incremento de la resistencia de las plantas
csb3, el transgén NahG se sometió a introgresión en
plantas csb3. NahG codifica para una salicilato
hidroxilasa que bloquea la acumulación de SA en el citosol mediante
degradación de SA a catecol (Delaney, T. P., Uknes, S., Vernooij,
B., Friedrich, L., Weymann, K., Negrotto, D., Gaffney, T.,
Gut-Rella, M., Kessmann, H., Ward, E., and Ryals, J.
(1994). A central role of salicylic acid in plant disease
resistance. Science 266, 1247-1250). En las plantas
csb3 NahG, se suprime de nuevo la resistencia aumentada
conferida por la mutación csb3 y se impone la
hipersusceptibilidad de NahG frente a Pst DC3000
(figura 3A). De manera similar, desaparece la expresión constitutiva
del gen PR-1 cuando el transgén NahG
está presente (figura 3B).
El mutante npr1 se identificó por el
aumento de su susceptibilidad frente a patógenos biotróficos y su
incapacidad para organizar una respuesta SAR o expresar
PR-1 en la respuesta frente al tratamiento
con SA (Cao et al., 1997). Se ha mostrado que NPR1 desempeña
un papel clave en la mediación de muchas respuestas defensivas
(Dong, 2004). Curiosamente, las plantas csb3 npr1 siguieron
siendo tan susceptibles a Pst DC3000 como las plantas
npr1 (figura 3A) y la expresión del gen
PR-1 también estaba inhibida (figura 3B).
Esto indica que la resistencia mediada por SA de csb3
requiere una proteína funcional NPR1. Otro mutante comprometido con
la SAR es dth9. Sin embargo, a diferencia de las plantas
npr1, las plantas dth9 siguen conservando la
capacidad para expresar los genes PR en respuesta a SA o al
ataque patogénico (Mayda, E., Mauch-Mani, B., and
Vera, P. (2000). Arabidopsis dth9 mutation identifies a gene
involved in regulating disease susceptibility without affecting
salicylic acid-dependent responses. Plant Cell 12,
2119-2128.). De nuevo, las plantas dobles mutantes
csb3 dth9 mostraron el incremento de la susceptibilidad
frente a Pst DC3000 atribuible a la mutación dth9
(figura 3A), pero a diferencia de npr1, la expresión del gen
marcador PR-1 atribuible a la mutación
csb3 se mantiene intacta (figura 3B), indicando así que la
resistencia de csb3 también depende de DTH9.
La expresión constitutiva de actividad GUS,
dirigida por el promotor de P69C tal como se observa en
plantas csb3, también está suprimida en todos los dobles
mutantes generados, excepto csb3 dth9, y se ejemplifica en la
figura 3C para las plantas csb3 NahG. Otro mutante
interesante analizado por epistasis fue cpr1. Las plantas
cpr1 son más resistentes a Pst DC3000, tienen niveles
elevados de SA, muestran expresión constitutiva del gen
PR-1 y también muestran una tendencia de
crecimiento anómala (Bowling et al., 1994). Por tanto,
cpr1 comparte con csb3 varios aspectos de resistencia
a la enfermedad y tamaño de crecimiento. Curiosamente, cuando la
mutación cpr1 se sometió a introgresión en el resto
("background") csb3, las plantas dobles mutantes csb3
cpr1 resultantes mostraban efectos aditivos que dieron como
resultado un fenotipo extremadamente enano. Las plantas dobles
mutantes homocigóticas nunca alcanzaron la fase reproductiva y, por
tanto, tenían que propagarse en estado heterocigótico. Por tanto, el
fenotipo del mutante csb3 cpr1 podria sugerir que la
mutación csb3 y la mutación cpr1 contribuyen a su
característico aumento de la acumulación de SA y respectivo
fenotipo de incremento de la resistencia a través de rutas
independientes después del extremo 3' de acumulación de SA.
Todas estas observaciones refuerzan la
consideración de que la síntesis y la percepción de SA son
fundamentales para la resistencia asociada a csb3.
Para elucidar adicionalmente el papel funcional
de csb3 en la respuesta defensiva de la planta, se llevó a
cabo una búsqueda de supresores de csb3 mediante la selección
de mutantes que carecen de fenotipo de incremento de la resistencia
conferido por la mutación csb3. La identificación de
supresores del fenotipo csb3 con una reversión
correspondiente en la respuesta de resistencia indicaría que el
papel de CSB3 en la participación a la resistencia mediada por SA
está bajo estricto control genético. Por tanto, las semillas
csb3 homocigóticas volvieron a someterse a mutagénesis con
EMS y aproximadamente 10000 semillas M2 se hicieron crecer y se
seleccionaron para identificar individuos que ya no mostraban el
incremento de la resistencia frente a Pst DC3000 atribuible a
la mutación csb3. Esta selección permitió el aislamiento de
cuatro mutantes scs (supresores de csb3)
(concretamente scs2, scs4, scs9 y scs11;
figura 4). Los cuatro dobles mutantes scs csb3 identificados
han perdido el fenotipo enano morfológico distinguible de
csb3 y son similares a las plantas salvajes en cuanto a la
arquitectura y la tendencia de crecimiento de la planta (figura 4A).
Por tanto, la expresión constitutiva del gen
P69C-GUS (figura 4A) y la del gen
PR-1, ambas atribuibles a la mutación
csb3, estaban suprimidas en los dobles mutantes scs
csb3. Además, el registro comparativo de la velocidad de
crecimiento de Pst DC3000 en hojas infectadas de plantas
salvajes, csb3 y scs csb3 reveló que los mutantes
scs csb3 han perdido el incremento de la resistencia frente
a Pst DC3000 que era característico del mutante csb3
original (figuras 4B-C). En este caso, la
resistencia frente a Pst DC3000 alcanzada en plantas scs2
csb3 y scs11 csb3 es similar a la observada en plantas
salvajes, apoyando un título de crecimiento bacteriano de más de 8
a 40 veces el observado en plantas csb3 (figura 4B). La
pérdida del incremento de la resistencia conferido por la mutación
csb3 es incluso más llamativa en las plantas scs4
csb3 y scs9 csb3. Las plantas scs4 csb3 y scs9
csb3 se vuelven mucho más susceptibles a Pst DC3000 que
las plantas salvajes y permiten un aumento de más de 100 veces en
el crecimiento bacteriano cuando se compara con las plantas
csb3 (figura 4C). La hipersusceptibilidad de las plantas
scs9 csb3 a Pst DC3000 fue incluso superior a la
observada en plantas npr1 y comparable a la registrada para
las plantas dth9 cuando se realizó un experimento lado a
lado; sin embargo, ninguna de las mutaciones scs son
alélicas con respecto a npr1, dth9 o cualquiera de los
mutantes mencionados previamente. Además, los análisis genéticos
indican que las cuatro mutaciones scs no son alélicas entre
ellas, son extragénicas a csb3, y el fenotipo conferido por
cada una de las mutaciones scs se mantiene incluso en
ausencia de la mutación csb3.
En resumen, estos resultados refuerzan la
hipótesis de que CSB3 es un componente importante de la ruta de
resistencia a la enfermedad mediada por SA en Arabidopsis y
su papel en la ruta está controlado adicionalmente por los productos
génicos de SCS.
Para definir la posición de CSB3 en el
mapa cromosómico, el mutante csb3, que está en un resto
Col-0, se cruzó con plantas Landsberg erecta
(Ler) salvajes. Las plantas mutantes csb3
homocigóticas se identificaron entre la progenie F2 por su fenotipo
morfológico característico. Se examinó la población de mapeo de F2
seleccionada para determinar la segregación de marcadores
moleculares basados en PCR. Para el mapeo inicial, se probaron 38
plantas F2 con marcadores de polimorfismo de longitud de secuencia
única (SSLPS) de cada uno de los cinco cromosomas (Bell, C.J., and
Ecker, J.R. (1994). Assignment of 30 microsatellite loci to the
linkage map of Arabidopsis. Genomics 19, 137-144.).
El marcador CIW10 en el cromosoma 5 mostró cosegregación con el
fenotipo csb3. El análisis adicional de esta región mostró
que la mutación se localizaba entre los marcadores nga129 y
MBK-5, que están separados por 15 cM. Para limitar
la región en la que estaba localizado CSB3, se utilizó la
base de datos de inserciones/deleciones grandes de Cereon Genomics
para diseñar marcadores SSLP. Después de seleccionar 748 plantas F2,
se limitó CSB3 a dos clones BAC (MUF9 y MUP24) que
comprenden una región de 66 kb que contenía 21 marcos de lectura
abiertos (ORF) (figura 5A). La región completa de cada uno de estos
genes se amplificó a partir de plantas csb3 y se determinaron
las secuencias de los productos de PCR. La secuencia
correspondiente al gen At5g60600 se identificó como la única
en mostrar una única mutación puntual. Este gen contiene 20 exones
y la mutación csb3 (a partir de ahora
csb3-1) representaba una transición de G a A
en la cadena codificante del exón 19 que conduce a un cambio de
aminoácidos de Gly a Asp. En las figuras 5A-C, se
facilita una visión general de la estrategia de mapeo y la
estructura génica.
CSB3 es un gen de única copia que
codifica para la
1-hidroxi-2-metil-2-butenil-4-difosfato
[HMBPP] sintasa (HDS) localizada en el cloroplasto que cataliza la
formación de HMBPP a partir de 2,4-ciclodifosfato de
2-C-metil-D-eritritol
(MEcPP) mediante un mecanismo todavía desconocido (Hecht, S.,
Eisenreich, W., Adam, P., Amslinger, S., Kis, K., Bacher, A.,
Arigoni, D., and Rohdich, F. (2001). Studies on the nonmevalonate
pathway to terpens: the role of the GcpE (IspG) protein. Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 98, 14837-14842.; Kollas, A.-K.,
Duin, E. C., Eberl, M., Altincicek, B., Hintz, M., Reichenberg, A.,
Henschker, D., Henne, A., Steinbrecher, J., Ostrovsky, D. N., et
al. (2002). Functional characterization of GcpE, an essential
enzyme of the nonmevalonate pathway of isoprenoid biosynthesis. FEBS
Lett. 532, 432-436.). La enzima HDS controla una de
las etapas terminales de la biosíntesis de difosfato de
isopentenilo (IPP) y difosfato de dimetilalilo (DMAPP) a través de
la ruta de 4-fosfato de
2-C-metil-D-eritritol
(MEP) independiente de mevalonato que se produce en el cloroplasto
de las plantas superiores (figura 6). La ruta de MEP localizada en
el plástido, junto con la ruta dependiente de mevalonato citosólico
(MVA), se encargan de la síntesis de difosfato de isopentenilo (IPP)
y su isómero difosfato de dimetilalilo (DMAPP), los precursores
inmediatos para la biosíntesis de isoprenoides (figura 6) (Rohmer,
M. (1999). The discovery of a mevalonate-independent
pathway for isoprenoid biosynthesis in bacteria, algae and higher
plants. Nat. Prod. Rep. 16, 565-574.). La enzima
HDS está conservada en microorganismos en los que se conoce como
GCPE (Kollas et al., 2002), a pesar de la diferencia con la
enzima HDS de planta madura que contiene un dominio proteico interno
grande que está ausente en el homólogo bacteriano (figura 5D). Este
dominio adicional puede conferir distintas funciones reguladoras o
catalíticas a la enzima de la planta (Querol J, Campos N, Imperial
S, Boronat A, Rodríguez-Concepción M (2002).
Functional analysis of the Arabidopsis thaliana GCPE protein
involved in plastid isoprenoid biosynthesis. FEBS Lett. 514:
343-346.). Las enzimas vegetales y microbianas
muestran una región de aminoácidos sumamente conservada cercana al
extremo C- terminal en la que se localiza un conjunto de residuos
Cys convencionales que participan en el ensamblaje de una
agrupación ("cluster") [4Fe-4S] (aminoácidos
640 a 684, figura 5D). La identificación de diferentes mutaciones
en Escherichia coli localizadas en el interior o cerca del
motivo 4Fe-4S señalan a esta región como crítica
para la función enzimática (Sauret-Güeto S,
Ramos-Valdivia A, Ibanez E, Boronat A, Rodríguez
Concepcion M. (2003) Identification of lethal mutations in
Escherichia coli genes encoding enzymes of the
methylerythritolphosphate pathway. Biochem Biophys Res Commun. 307,
408-415.). Como la mutación
csb3-1 identificada está cerca de este
motivo (figura 5D), puede argumentarse que la mutación introduce
una alteración estructural que puede desestabilizar el plegamiento
y, a su vez, la función correcta del cluster
Fe-S.
Se identificó una inserción de
ADN-T de Arabidopsis (SALK 017595) en el gen
CSB3, en la presente invención denominada como
csb3-2 (figura 5C). Esta mutación altera
CSB3 a nivel del 16º exón. Curiosamente, las plantas
heterocigóticas para esta inserción de ADN-T
segregaron plantones albinos que eran mortales. Además, en una
búsqueda de mutantes con afectación del desarrollo del cloroplasto,
muy recientemente (Gutiérrez-Nava, M.L., Gillmor,
C.S., Jiménez, L.F., Guevara-García, A., and León,
P. (2004). CHLOROPLAST BIOGENESIS genes act cell and noncell
autonomously in early chloroplast development. Plant Physiol. 135,
471-482.) identificaron que el mutante clb4
(chloroplast biogenesis [biogénesis de cloroplasto]) llevaba
una mutación inducida por EMS en el mismo locus en el que el cambio
de transición da como resultado la aparición de un codón de
terminación prematuro en el exón 9 (figura 5C). Para dar
uniformidad, este último alelo se denominó para la presente
invención csb3-3/clb4. De manera similar a
csb3-2, los plantones albinos con mutación
csb3-3/clb4 también eran mortales
(Gutiérrez-Nava et al., 2004). Es
interesante observar aquí que otros mutantes de
ADN-T que alteran los ORF de otros genes de la ruta
de MEP (Budziszewski, G.J., et al. (2001). Arabidopsis genes
essential for seedling viability: Isolation of insertional mutants
and molecular cloning. Genetics 159, 1765-1778.)
producen el mismo fenotipo albino mortal de plantones. Esto sugiere
que la ruta de MEP es esencial para la planta y que el alelo
csb3-1 identificado en la presente invención
es una pérdida parcial de función y no un mutante nulo.
Para confirmar que At5g60600 se
corresponde con el gen CSB3, se utilizó la transformación
mediada por Agrobacterium tumefaciens para introducir en las
plantas csb3-1 un ADNc que se corresponde con
At5g60600, bajo el control del promotor 35S de CaMV
(constructo 35S-CSB3). Se generaron varias
líneas transgénicas con el constructo 35SCSB3 y se
estudiaron algunas de ellas detalladamente. Todas las líneas
transgénicas generadas habían perdido el fenotipo morfológico
característico atribuible a la mutación
csb3-1 y habían recuperado un aspecto
externo natural (véase la figura 7A). Además, los transformantes
perdieron la expresión constitutiva del gen P69CGUS (figura
7A), así como la expresión constitutiva de los genes relacionados
con SA, es decir, PR-1 y GST6, que era
característica de las plantas csb3-1 no
transformadas (figura 7C). Además, la expresión de At5g606000 bajo
el control del promotor 35S en las plantas transgénicas
csb3-1 suprime el incremento de la
resistencia frente a Pst DC3000. En estas plantas
transgénicas, la resistencia frente a Pst DC3000 vuelve a
niveles similares a los alcanzados en plantas salvajes (figura 7B).
La complementación completa de todos los aspectos diferentes del
fenotipo csb3 confirma que At5g60600 es equivalente a
CSB3.
La expresión de CSB3 en respuesta a la
infección por P. syringae se analizó en hojas de plantas
salvajes a diferentes intervalos de tiempo tras la inoculación y en
un contexto que genera una interacción compatible (es decir, tras
la inoculación con Pst DC3000) o una incompatible (es decir,
tras inocular con Pst DC3000 (avrRpm1)). Se estudió
la presencia de ARNm de CSB3 mediante RT-PCR.
Estos análisis revelaron que la infección por Pst DC3000 que
llevaba el gen de la avirulencia, gen avrRpm1, y por tanto,
que incitaba una respuesta RH en el tejido inoculado, le seguía una
disminución marcada en el nivel de acumulación de los ARNm de
CSB3 (figura 7D). Esta reducción ya se observaba a las 24 h
después de la inoculación y se mantenía posteriormente incluso
después de 48 horas después de la inoculación.
De manera concomitante e inversamente
correlacionada con esta reducción, el gen marcador inducible por
SA, PR-1, estaba regulado por incremento. Se
registraron resultados similares, aunque con un efecto menos
intenso, en una interacción compatible tal que la que sigue a la
inoculación con Pst DC3000 que carece de avrRpm1
(figura 7D). Además, la expresión de CSB3 en plantas
csb3-1 también reveló una reducción de los
niveles en el estado estacionario de su ARNm comparado con las
plantas salvajes (figura 7D). Por tanto, la regulación por
disminución de la expresión de CSB3 tras la infección
bacteriana o en el resto mutante, se correlaciona de manera inversa
con la expresión inducida de PR-1.
Un aumento en la acumulación del sustrato
(MEcPP) de la enzima CSB3/HDS o de cualquiera de los productos
intermedios metabólicos que preceden la acumulación de MEcPP en la
ruta de MEP (figura 6) podría ser responsable del incremento de la
resistencia de las plantas csb3-1. De manera
alternativa, una disminución de la síntesis del producto (HMBPP) de
la misma enzima podría comprometer la síntesis y la acumulación de
los productos finales (es decir, IPP y DMAPP) (figura 6), que, a su
vez, pueden comprometer la posterior biosíntesis de los diferentes
isoprenoides que deben derivarse de la ruta de MEP. Esta última
posibilidad también puede ser responsable del incremento de la
resistencia de las plantas csb3-1. Para
estudiar cualquiera de estas dos posibilidades, se estudió el
impacto de un inhibidor de la ruta de MEP sobre el incremento de la
resistencia a la enfermedad de las plantas
csb3-1 frente a Pst DC3000. Para este
enfoque, se utilizó fosmidomicina [ácido
3-(N-formil-N-hidroxiamino)-propilfosfónico],
un inhibidor competitivo de DXR, la enzima que controla la segunda
etapa implicada en la ruta de MEP (figura 6) y que reduce los
niveles de los productos finales de esta ruta (es decir, IPP y
DMAPP) (Schwender, J., Müller, C., Zeidler, J., and Lichtenthaler,
H.K. (1999). Cloning and heterologous expression of a cDNA encoding
1-deoxy-D-xylulose-5
phosphate reductoisomerase of Arabidopsis thaliana. FEBS
Lett. 455, 140-144.; Laule, O., Fürholz, A., Chang,
H., Zhu, T., Wang, X., Heifetz, P.B., Gruissem, W., and Lange, M.
(2003). Crosstalk between cytosolic and plastidial pathways of
isoprenoid biosynthesis in Arabidopsis thaliana. Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 100, 6866-6871.). Para desligar esta
respuesta de la derivada de una detención del desarrollo del
cloroplasto, los tratamientos con fosmidomicina se llevaron a cabo
a dosis mucho menores y durante periodos de tiempo más
restringidos, que aquellos utilizados experimentalmente por otros
(Laule et al., 2003). Los plantones salvajes y
csb3-1 se rociaron una vez con una disolución
25 \muM o 50 \muM de fosmidomicina a las 48 horas y a las 24
horas antes de su inoculación con Pst DC3000, y se registró
el crecimiento bacteriano en las plantas inoculadas a 0, 3 y 5
d.p.i. Las plantas tratadas también se sometieron a ensayo para
determinar el efecto sobre la expresión normal del gen
P69C-GUS. Tal como se muestra en la figura
8A, un tratamiento de fosmidomicina 25 \muM sobre las plantas
csb3-1 fue suficiente para reducir
notablemente el incremento de la resistencia frente a Pst
DC3000. Esta inhibición fue incluso más evidente tras un tratamiento
con fosmidomicina 50 \muM que suprimió completamente el
incremento de la resistencia atribuida a la mutación
csb3-1 (figura 8A). Con esta última
concentración de inhibidor, la respuesta de resistencia observada
del mutante era comparable con la alcanzada en las plantas salvajes
no tratadas. Los tratamientos de las plantas
csb3-1 con fosmidomicina 5 \muM también
provocaron una reducción del incremento de la resistencia de las
plantas csb3-1 que sólo se observó a los 5
días después de la inoculación con Pst DC3000, por tanto
indicativo de un efecto relacionado con la dosis para la acción
inhibidora de la fosmidomicina sobre la resistencia observada. La
fosmidomicina, a una concentración de 50 \muM también mostró un
efecto inhibidor sobre la resistencia normal de las plantas
salvajes frente a Pst DC3000, haciendo que las plantas se
volvieran más susceptibles a este patógeno virulento (figura 8A). No
se probaron dosis mayores de este inhibidor, ya que pueden tener un
efecto colateral de desarrollo/homeostasis del cloroplasto que
puede conducir a efectos secundarios no deseados.
Este efecto inhibidor de la fosmidomicina sobre
el incremento de la resistencia de las plantas
csb3-1 frente al crecimiento bacteriano
también estuvo acompañado de la regulación por disminución de la
expresión constitutiva del transgén P69C-GUS
(figura 8B) y de la de los genes marcadores
PR-1 y GST6 (figura 8C).
Por tanto, puede concluirse que el incremento de
la resistencia de las plantas csb3-1 parece
no estar relacionado con una reducción de IPP y su isómero DMAPP,
sino más bien con el resultado de una acumulación en exceso del
sustrato directo de HDS/CSB3, concretamente MEcPP, o de cualquiera
de sus precursores inmediatos. Además, el mismo compuesto parece
ejercer un efecto sobre el control de al menos la magnitud de la
resistencia de las plantas salvajes frente a la infección por
Pst DC3000.
Por tanto, en la presente invención se ha
identificado un mutante novedoso del gen CSB3 de
Arabidopsis thaliana, denominado
csb3-1, que muestra altos niveles de
resistencia frente a los patógenos biotróficos P. syringae y
H. parasitica mientras que conserva la susceptibilidad
normal frente a los patógenos necrotróficos P. cucumerina y
B. cinerea, lo cual es útil para la obtención de plantas
resistentes a enfermedades producidas por patógenos biotróficos.
Los análisis fenotípicos y genéticos indican que
csb3-1 es una mutación recesiva parcial de
pérdida de función que da como resultado la activación de las
defensas de las plantas. De manera coherente con el incremento
observado de la resistencia hacia patógenos biotróficos, las
plantas csb3-1 muestran incremento de la
acumulación de SA en condiciones de reposo y una capacidad
adicional para aumentar la biosíntesis sobre los niveles salvajes
tras la exposición a Pst DC3000. Esta observación ofrece una
explicación de por qué las plantas csb3-1
también muestran activación constitutiva de varios genes marcadores
relacionados con la defensa (por ejemplo, PR1, PR2 y
GST6) que finalmente se controlan mediante la ruta de
señalización mediada por SA (Durrant y Dong, 2004). Fue
particularmente instructivo en la comprensión del papel de CSB3 en
esta ruta de defensa, la observación de que SA se requiere
absolutamente para la resistencia conferida por
csb3-1, tal como se deduce de la supresión de
este fenotipo en varios dobles mutantes que se generaron. Los
niveles de transcrito génico PR-1 en estado
estacionario, la expresión de P69C-GUS y el
incremento de la resistencia frente a Pst DC3000 se
suprimieron de manera llamativa en los dobles mutantes csb3
pad4, csb3 sid2, csb3 eds5 y csb3 NahG
si se compara con los observados en las plantas homocigóticas
csb3-1. Todas estas observaciones indican que
el hecho de mantener intacta la síntesis y acumulación de SA es
fundamental para el incremento de la resistencia a la enfermedad en
las plantas csb3-1. Por tanto, estos estudios
indican que el control mediado por csb3-1 de
la respuesta defensiva dependiente de SA parece actuar en alguna
fase en los primeros acontecimientos de la interacción
planta-patógeno. Además, el incremento de la
resistencia de csb3-1 también requiere
componentes que funcionan como transductores de la señal de defensa
derivada de SA (tal como NPR1), tal como se demuestra por las
plantas dobles mutantes csb3 nrp1 que se comportan como
npr1 con respecto a la falta de la expresión del gen
PR y la hipersusceptibilidad a la infección por Pst
DC3000.
Además, la reversión del fenotipo de
resistencia, desde resistente hasta hipersusceptible, sin una
supresión del nivel de transcrito génico PR-1
en estado estacionario en el doble mutante csb3 dth9, revela
una necesidad también de una ruta intacta dependiente de
DTH9, después del extremo 3' de acumulación de SA para la
resistencia asociada a csb3-1. Por tanto, se
requiere que ambas rutas NPR1 y DTH9 estén intactas para regular la
resistencia a la enfermedad en las plantas
csb3-1. Curiosamente, el fenotipo de
resistencia a la enfermedad de las plantas
csb3-1 está acompañado de la aparición de
una tendencia de crecimiento anómala manifestada en forma de
enanismo, que está acompañada de la presencia de hojas rizadas en
roseta. Esta alteración del desarrollo es también una
característica de otros diversos mutantes de Arabidopsis entre los
que destacan los mutantes cpr (constitutive expressor of
PR genes [que expresa de manera constitutiva los genes PR])
(Durrant y Dong, 2004). Al igual que csb3-1,
los mutantes cpr son más resistentes al crecimiento de
patógenos biotróficos, muestran expresión constitutiva del gen
PR-1 y son completamente dependientes de la
acumulación de SA (Bowling et al., 1994). Sin embargo, a
diferencia de csb3-1, los mutantes cpr
muestran independencia de NPR1 para el incremento de la resistencia
y para expresar las defensas (Clarke, J.D., Volko, S.M., Ledford,
H., Ausubel, F.M., and Dong, X. (2000). Roles of salicylic acid,
jasmonic acid, and ethylene in cpr-induced
resistance in Arabidopsis. Plant Cell 12,
2175-2190.). Además, la generación de plantas dobles
mutantes csb3 cpr1 reveló que ambas mutaciones son aditivas,
dando como resultado plantas que muestran un fenotipo
extremadamente aberrante que nunca alcanza la fase reproductiva. Por
tanto, las mutaciones csb3-1 y cpr1 pueden
contribuir a su característico aumento de la acumulación de SA y
sus respectivos fenotipos de incremento de la resistencia a través
de rutas independientes.
Utilizando una estrategia de donación
posicional, se identificó el gen CSB3. CSB3
complementó la mutación csb3-1, tal como se
muestra, mediante la reducción de la expresión de los genes
PR, así como la reversión del incremento de la resistencia
en plantas transgénicas csb3-1 que expresan
CSB3 (figura 7A-C). Por tanto, se volvió a
confirmar la epistasis de CSB3 a la acumulación de SA y la
expresión de PR e incremento de la resistencia frente a
Pst DC3000. Además, el análisis de la expresión génica en
plantas salvajes reveló que CSB3 se expresa de manera
moderada en condiciones de reposo y la expresión está regulada por
disminución tras la infección por Pst DC3000. Esta regulación
por disminución es más pronunciada durante una interacción
incompatible, tal como la provocada durante la infección por
Pst DC3000 (avrRpm1). Esta regulación por disminución
se correlaciona de manera inversa, tanto en el tiempo como en la
intensidad, con la inducción observada de los genes regulados por
SA (por ejemplo, PR-1) durante la misma
interacción planta-patógeno (figura 7D). Estas
observaciones sugieren que la regulación por disminución del
transcrito CSB3 podría estar implicada funcionalmente en la
acumulación de SA y la activación de las defensas de las plantas
tras la inducción del patógeno y puede coincidir con CSB3 que actúa
como regulador negativo de la ruta dependiente de SA que conduce a
la resistencia frente a patógenos biotróficos en plantas
salvajes.
En el esfuerzo por identificar supresores del
mutante csb3-1, en la presente invención
denominados mutantes scs, se sometieron a mutagénesis
semillas csb3-1 con EMS y se seleccionaron
plantas M2 para buscar plantas que habían perdido el característico
fenotipo enano y la resistencia de csb3-1
frente a Pst DC3000. Se identificaron cuatro mutantes
scs en los que el incremento de la resistencia frente a este
patógeno estaba revertido hasta un nivel comparable al alcanzado en
plantas salvajes (es decir, en plantas scs2 y scs11;
figura 4) o incluso inhibido adicionalmente para hacer estas
plantas hipersusceptibles al mismo patógeno (es decir, en plantas
scs9 y scs11; figura 4). Los mutantes scs
identificados se corresponden con mutaciones recesivas no alélicas
que son extragénicas con respecto al locus csb3 y conferían
el mismo fenotipo incluso en ausencia de la mutación
csb3-1. Estas observaciones proporcionan
pruebas adicionales de que CSB3 es un regulador importante de la
respuesta de resistencia a la enfermedad mediada por SA en
Arabidopsis. Asimismo, estos resultados sugieren que el
papel de CSB3 en la respuesta de resistencia a la enfermedad está
bajo estricto control, tal como se determina mediante la
identificación de los reguladores SCS. La caracterización y donación
adicionales del supresor scs ayudarán a comprender en
detalle cómo funciona esta regulación durante la respuesta de
resistencia a la enfermedad.
El gen CSB3 codifica para la
1-hidroxi-2-metil-2-butenil-4-difosfato
[HMBPP] sintasa que cataliza la formación de HMBPP a partir de
2,4-ciclodifosfato de
2-C-metil-D-eritritol
[MEcPP] (Kollas et al., 2002). Esta actividad enzimática
controla una de las etapas terminales de la biosíntesis de
difosfato de isopentenilo [IPP] y su isómero difosfato de
dimetilalilo [DMAPP] a través de la ruta del
4-fosfato de
2-C-metil-D-eritritol
(MEP) independiente del mevalonato que se produce en el cloroplasto
de las plantas superiores (figura 6). La ruta de MEP localizada en
el plástido, junto con la ruta dependiente de mevalonato citosólico
(MVA), se encargan de la síntesis de precursores de isoprenoides, a
partir de los cuales se origina una plétora de diferentes
compuestos, metabolitos y hormonas vegetales (Rohmer, 1999). No se
pronostica que el mutante csb3-1 sea un
mutante nulo, ya que otros alelos nulos en el gen CSB3 (es
decir, csb3-2, y clb4/csb3-3)
son mortales. Por tanto, la pérdida parcial de función atribuida a
la sustitución de Gly por Asp identificada en la proteína mutante
csb3-1 puede explicarse si se tiene en cuenta que la
introducción de un residuo de aminoácidoácido en lugar de uno
neutro en el interior o cerca del motivo 4Fe-4S,
que está sumamente conservado en este tipo de enzimas, puede
alterar una conformación correcta en este dominio que, a su vez,
puede desestabilizar en cierto grado el correcto plegamiento de la
enzima. Esto coincide con la observación previa de otras mutaciones
que tienen lugar en la misma región del homólogo GCPE de E.
coli (Sauret-Güeto et al., 2003).
Como la pérdida de función asociada con la
mutación csb3-1 da como resultado la
activación de la ruta del SA que conduce al incremento de la
resistencia observado, se deduce que el desmantelamiento de un
compuesto aguas debajo de HDS/CSB3 (debido a la reducción de la
actividad enzimática de la enzima csb3-1) o,
alternativamente, el exceso de acumulación de un compuesto previo a
la acción de la enzima HDS/CSB3 (tal como MEcPP o cualquiera de sus
precursores metabólicos antes del extremo 5') debe tener una
función en la respuesta defensiva controlada por SA. Se probó esta
conjetura examinando el efecto de un inhibidor de la ruta de MEP
(es decir, fosmidomicina) sobre el incremento de la resistencia de
plantas csb3-1, así como sobre la
resistencia normal alcanzada en plantas salvajes. La fosmidomicina
bloquea la actividad de DXR, la enzima que controla la segunda etapa
implicada de la ruta de MEP (figura 6) y por tanto, inhibe la ruta
en un paso previo a la acción de HDS/CSB3 (Schwender et al.,
1999; Laule et al., 2003). Se observó que el efecto
inhibidor de la fosmidomicina puede complementar completamente el
fenotipo de incremento de la resistencia asociado a
csb3-1, así como la expresión de los genes
relacionados con la defensa (figura 8). Por tanto, sugiere que la
activación de la ruta de SA en el mutante
csb3-1 no se debe a una reducción de un
compuesto que surge posterior a la acción de CSB3/HDS que puede
comprometer las posteriores etapas enzimáticas que conducen a la
biosíntesis de isoprenoides, sino más bien es el resultado de una
acumulación en exceso del sustrato directo de HDS/CSB3,
concretamente MEcPP, o indirectamente cualquiera de sus precursores
inmediatos. Además, la fosmidomicina también afecta a la respuesta
de resistencia a la enfermedad de las plantas salvajes frente a
Pst DC3000, y los tratamientos de plantas con 50 \muM de
este inhibidor dan como resultado tasas superiores de crecimiento
bacteriano (figura 8A). Este hallazgo refuerza adicionalmente la
consideración de que el mismo compuesto que se acumula en exceso en
las plantas csb3-1 y regula positivamente el
incremento de la resistencia del mutante también es importante para
una resistencia normal a la enfermedad en plantas
salvajes.
salvajes.
En resumen, estos resultados apuntan en
dirección a la participación de una señal/factor cloroplástico,
derivado de una de las etapas intermedias iniciales de la ruta de
MEP, en el control de la ruta de SA activada por patógenos que
conduce a la resistencia a la enfermedad frente a patógenos
biotróficos. Esto apoya la importancia del cloroplasto en la
mediación de los aspectos críticos de la respuesta defensiva de la
planta. Los desafíos para el futuro son determinar qué
molécula(s) exacta(s) es (son) responsable(s)
del control observado de la ruta de SA y cómo está controlada su
acción mediante el producto de los genes SCS identificados en
la presente invención.
(A) Comparación del aspecto externo de las
plantas csb3 (derecha) y plantas salvajes (wt) (izquierda).
Las plantas se fotografiaron cuando tenían 3,5 semanas de edad.
(B) Tinción histoquímica de la actividad GUS
dirigida por el promotor de P69C en un plantón transgénico
salvaje de 14 días de edad (izquierda) y plantones csb3
(derecha).
(C) Hoja en roseta completamente expandida
procedente de una planta transgénica salvaje (izquierda) y plantas
csb3 (derecha) teñidas para determinar la actividad GUS.
(D) Expresión de los genes marcadores
PR-1, PR-2, GST6 y
PDF1.2 en plantas salvajes y csb3.
(E) Niveles de SA libre y SA total en plantas
salvajes y csb3. Las plantas salvajes (wt) y csb3 se
inocularon con Pst DC3000 o con MgSO_{4} 10 mM (prueba) y
la cantidad de SA libre y glucósido de SA (SAG) determinados 24
horas tras la inoculación. Cada barra representa la media de tres
muestras de replicado con la desviación estándar. Se sometieron a
ensayo el SA libre y el glucósido de SA (SAG) en las mismas
muestras.
(A) Respuesta de resistencia de plantas mutantes
csb3 y salvajes es de Arabidopsis frente a
Hyaloperonospora parasitica virulenta. Siete días después de
la inoculación por rociado de plantas de 2 semanas de edad con
10^{5} conidiosporas por mililitro de agua, se tiñeron las hojas
con azul de tripano-lactofenol y se observaron con
un microscopio para revelar el característico crecimiento extenso de
hifas. El crecimiento de este patógeno presentaba una inhibición
llamativa en las plantas csb3.
(B) Para cuantificar la resistencia frente a
H. parasitica, se hizo un recuento de la producción de
conidios 7 días después de la inoculación con ayuda de un
hemocitómetro. Las plantas que llevaban la mutación csb3 eran
sumamente resistentes a este patógeno.
(C) Crecimiento de Pseudomonas syringae
pv. tomato DC3000 en plantas salvajes y csb3. Se
inocularon plantas de dos semanas de edad mediante inmersión en una
suspensión bacteriana, y se determinó el título de bacterias, medido
como unidades formadoras de colonias (ufc) por peso fresco, a los
0, 3, y 5 días después de la infección para plantas salvajes y
csb3. Se tomaron ocho muestras para cada genotipo en cada
punto de tiempo. Los puntos de datos representan la media \pm la
desviación estándar de los logaritmos. El experimento se repitió
tres veces con resultados similares. Las plantas que llevaban la
mutación csb3 eran sumamente resistentes a este
patógeno.
(D) Respuesta de resistencia de plantas salvajes
y csb3 frente a Plectosphaerella cucumerina. Se
inocularon las plantas aplicando gotas de 6 \mul de suspensión de
esporas (5 x 10^{6} esporas/ml) de P. cucumerina a hojas
completamente expandidas. Se evaluaron los síntomas de enfermedad 4
días después de la inoculación determinando los diámetros medios de
lesión en 3 hojas de 8 plantas cada vez. Los puntos de datos
representan el tamaño medio de lesión \pm DE de las medidas. Las
plantas que llevaban la mutación csb3 eran tan resistentes a
este patógeno como las plantas salvajes.
(E) Hojas de plantas salvajes y csb3 a
los 4 días después de la inoculación con una gota de 6 \mul de
esporas de Botrytis cinerea (2,5 x 10^{4} conidias/ml).
(F) Se midió el tamaño de lesión generado por
Botrytis cinerea a los 4 días después de la inoculación. Los
puntos de datos representan el tamaño medio de lesión \pm DE de
las medidas procedentes de un mínimo de 30 lesiones. Este
experimento se repitió tres veces con resultados similares. wt,
salvaje. Las plantas que llevaban la mutación csb3 eran tan
resistentes a este patógeno como las plantas salvajes.
(A) Crecimiento de Pst DC3000 en los
dobles mutantes csb3 pad4, csb3 sid2, csb3
eds5, csb3 nahG, csb3 dth9, csb3 npr1
comparado con el crecimiento en mutantes sencillos y plantas
salvajes. Se registró el crecimiento bacteriano en muestras de
hojas que se recogieron inmediatamente después de la infección, a
los 3 días después de la inoculación (d.p.i) y a los 5 d.p.i. Se
tomaron ocho muestras para cada genotipo en cada punto de tiempo.
El experimento se repitió dos veces con resultados similares.
(B) Análisis de RT-PCR de la
expresión génica de PR-1 y GST6 en
mutantes relacionados con SA, así como en dobles mutantes
csb3 y plantas salvajes. El gel inferior muestra una
RT-PCR para el gen de mantenimiento
("housekeeping") eIF4\alpha utilizado en la presente
invención como un control de carga.
(C) Hoja en roseta completamente expandida
procedente de una planta original salvaje (centro), plantas
csb3 (izquierda) y plantas csb3 nahG (derecha) teñidas
para determinar la actividad GUS dirigida por el promotor del gen
P69C.
(A) Cuadro superior: fenotipos morfológicos de
los mutantes scs que actúan como supresores del fenotipo
csb3. Se hicieron crecer todas las plantas en paralelo en el
suelo y se fotografiaron cuando tenían 4 semanas de edad. Cuadro
inferior: supresión de la expresión del gen indicador
P69C-GUS inducida por csb3 en hojas
procedentes de mutantes supresores scs.
(B-C) Incremento de la
susceptibilidad a la enfermedad frente a Pst DC3000 de los
diferentes mutantes scs. Se registró el crecimiento
bacteriano a los 0, 3 y 5 días después de la inoculación (d.p.i).
El experimento se repitió dos veces con resultados similares.
(A) Región de 0,8 Mb en el cromosoma 5 con BAC
superpuestos, flanqueados por los marcadores de SSLP, Nga129 y
MBK-5, utilizados para la detección de
recombinaciones en 1496 cromosomas.
(B) Localización de CSB3 en la región
secuenciada correspondiente al clon de BAC, MUF9. CSB3
estaba situado entre dos marcadores de SSLP que comprenden una
región de 66 kb.
(C) Estructura de exón/intrón de CSB3.
Las regiones codificantes están indicadas con líneas gruesas. Las
posiciones de las mutaciones csb3-1,
csb3-2 y clb4/csb3-3
se muestran en la parte superior de cada uno de los exones
respectivos. El inserto presenta el intercambio de nucleótidos
encontrado en el mutante csb3-1 y su
influencia sobre la secuencia proteica. El alelo mutante está
indicado debajo de la secuencia salvaje. Las letras mayúsculas
marcan las secuencias nucleotídicas en la mitad del exón 19. La
transición de "G" a "A" debida al mutágeno está indicada
en negrita. Las secuencias de aminoácidos deducidas están indicadas
como un código de letras individuales debajo de cada triplete de
nucleótidos y las letras en negrita marcan los cambios de
aminoácidos (G a D) en las secuencias proteicas.
(D) Secuencia de aminoácidos deducida de la
enzima
hidroximetilbutenil-4-difosfato
sintasa (HDS, también denominada GcpE en los microorganismos)
asociada a plástido codificada por CSB3. La secuencia señal
pronosticada para el transporte de plástido (programa ChloroP) se
muestra subrayada en el extremo N-terminal. En
cursiva, se muestran las regiones homólogas entre homólogos HDS de
planta y el homólogo GcpE procedente de microorganismos. El dominio
proteico comprendido entre estos dos dominios conservados es
específico de la planta, ya que no está presente en la enzima GcpE
procedente de microorganismos. En el extremo C- terminal, se
muestran con un asterisco los residuos de cisteína conservados que
están sumamente conservados en todas las enzimas HDS y GcpE.
Subrayados están los residuos conservados que comprenden el
distintivo ("signature") donde se halla el cluster
[4Fe-4S] (Sauret-Güeto et
al., 2003). El residuo de glicina convertido en residuo
aspártico en el mutante csb3-1 se muestra en
negrita en la posición 695 y está cerca de la secuencia conservada
que participa en la coordinación de [4Fe-4S].
Las abreviaturas de las enzimas que catalizan
cada etapa de la ruta se muestran en el lado izquierdo de la figura
en negrita tal como sigue:
1-desoxi-D-xilulosa-5-fosfato
sintasa (DXS);
2C-metil-D-eritritol-4-fosfato
sintasa (DXR);
4-difosfocitidil-2C-metil-D-eritritol-4-fosfato
sintasa (CMS);
4-difosfocitidil-2C-metil-D-eritritol
cinasa (CMK);
2C-metil-D-eritritol-2,4-difosfato
sintasa (MCS);
2C-metil-D-eritritol-2,4-ciclodifosfato
reductasa (HDS);
1-hidroxi-2-metil-butenilo
reductasa-4-difosfato (HDR);
isopentenil-difosfato isomerasa (IDI). Los nombres
de algunos de los mutantes encontrados están indicados en el lado
derecho del diagrama. La posición de la mutación csb3 se
muestra. También se indica la posición en la que se sabe que la
fosmidomicina inhibe la ruta.
(A-C) Caracterización fenotípica
y molecular de plantas csb3-1 transformadas
de manera estable con un constructo génico
35S-CSB3. (A) Aspecto morfológico de plantas
csb3-1 no transformadas comparado con dos
líneas transgénicas. Obsérvese la reversión hacia un fenotipo
salvaje en las líneas transgénicas. La tinción histoquímica de la
actividad GUS dirigida por el promotor de P69C en hojas en
roseta completamente expandidas obtenidas de plantas
csb3-1 no transformadas y de las dos líneas
transgénicas se muestra en el mismo cuadro.
(B) Respuesta de resistencia frente a Pst
DC3000 de dos líneas transgénicas csb3 independientes (línea
1.1 y línea 5.6) transformadas de manera estable con un constructo
génico 35S-CSB3 y comparación de la respuesta
de resistencia observada en el tipo salvaje (wt) y el mutante
csb3-1. Obsérvese que las líneas transgénicas
han perdido el incremento de la resistencia asociada con la
mutación csb3-1. Se registró el crecimiento
bacteriano a los 0, 3 y 5 días después de la inoculación (d.p.i). El
experimento se repitió dos veces con resultados similares.
(C) Análisis de RT-PCR de la
expresión génica de PR-1 y GST6 en
plantas csb3-1 así como en plantas salvajes
y en las líneas transgénicas (líneas 1.1 y 5.6) que expresan el
constructo génico 35S-CSB3. Obsérvese que las
plantas transgénicas ya no expresan de manera constitutiva los
genes marcadores relacionados con SA. El gel inferior muestra una
RT-PCR para el gen de mantenimiento eIF4\alpha
utilizado en la presente invención como control de carga.
(D) Análisis de RT-PCR de la
expresión génica de CSB3 y PR-1 en
plantas salvajes tras la infección por Pst DC3000 que llevan
o no el gen de avirulencia avrRpm1. Los números indican las
horas tras la inoculación. El nivel de expresión de estos dos genes
también se analizó en plantas csb3-1 sanas y
se muestra a la izquierda para comparar. El gel inferior muestra
una RT-PCR para el gen de mantenimiento
eIF4\alpha, utilizado en la presente invención como control de
carga. El experimento se repitió dos veces con resultados
similares.
(A) Se rociaron plantones salvajes (wt) y
csb3-1 de Arabidopsis una vez a las 48
horas y a las 24 horas antes de su exposición a Pst DC3000 con una
solución tampón complementada con fosmidomicina 25 \muM o 50
\muM (+ fosm). Los controles se trataron de manera similar con
solución tampón sola. Las plantas se expusieron a Pst DC3000
y se registró el crecimiento del patógeno a los 0, 3 y 5 días
después de la inoculación (d.p.i).
(B) Efecto del tratamiento con fosmidomicina (25
\muM, tratados tal como se indica en (A) sobre la expresión
constitutiva de P69C-GUS en plantones
csb3-1 (derecha) comparado con plantones
csb3-1 tratados con tampón (izquierda).
(C) Efecto del tratamiento con fosmidomicina (25
\muM, tratados tal como se indica en (A) sobre la expresión
constitutiva de genes marcadores regulados por SA en plantones
csb3-1 de Arabidopsis comparado con
plantones csb3-1 tratados con tampón.
Se hicieron crecer plantas de Arabidopsis
thaliana en el suelo o en placas que contienen medio de
Murashige y Skoog (MS) tal como se describió anteriormente (Mayda
et al., 2000). El mutante csb3-1 se
aisló en una selección para determinar los que expresan de manera
constitutiva el gen indicador P69C-GUS en
plantas transgénicas Columbia (Col-0) sometidas a
mutagénesis con metanosulfonato de etilo (EMS), tal como se
describió anteriormente para otros mutantes (Mayda et al.,
2000). La línea mutante csb3-1 utilizada en
estos experimentos se había sometido a retrocruzamiento al menos
cuatro veces con la linea original salvaje. Se hicieron crecer las
plantas en una cámara de crecimiento (19-23ºC,
iluminación fluorescente de 100 \muEm-_{2}
seg-_{1}) en un ciclo de 10 horas de luz y 14
horas de oscuridad. A menos que se indique lo contrario, se
utilizaron hojas expandidas completamente de plantas de 4 semanas
de edad para todos los experimentos. La tinción para determinar la
presencia de actividad GUS se llevó a cabo tal como se describió
anteriormente (Mayda et al., 2000).
Se hizo crecer Pseudomonas syringae pv.
tomato DC3000 y se preparó para su inoculación tal como se
describió anteriormente (Mayda et al., 2000). Las plantas se
inocularon mediante el método de inmersión según Tornero, P. and
Dangl, J. L. (2001). A high-throughput method for
quantifying growth of phytopathogenic bacteria in Arabidopsis
thaliana. Plant J. 28: (4): 475-481. La densidad
de las poblaciones bacterianas se determinó mediante cultivo en
placa de diluciones en serie sobre medio B de King complementado
con rifampicina (50 \mug/ml) a 28ºC y haciendo un recuento de las
unidades formadoras de colonias en diferentes tiempos, tal como se
describió anteriormente (Mayda et al., 2000). Los datos se
notifican como medias y desviaciones estándar del logaritmo (ufc/g
de peso fresco) de seis a ocho replicados. Se realizaron ensayos de
resistencia frente a Hyaloperonospora parasitica en plantas
de tres semanas de edad rociadas con una suspensión de 10^{5}
conidiosporas ml-1 de agua del grifo, tal como se
describió anteriormente (Mayda et al., 2000). Al séptimo
día, se valoró la densidad de las esporas en las plántulas (siete
macetas por tratamiento, cada maceta tratada por separado)
utilizando un hemocitómetro. Alternativamente, se tiñeron muestras
de hojas con azul de tripano-lactofenol en días
diferentes después de la inoculación y se examinaron bajo el
microscopio, tal como se describió anteriormente (Mayda et
al., 2000).
Para la resistencia frente a
Plectosphaerella y Botrytis, se trasplantaron
plantones de tres semanas de edad a macetas individuales y se
cultivaron a temperaturas de 22ºC de día/18ºC de noche con 12 h de
luz cada 24 h. Cuando las plantas tenían una edad de 6 semanas, se
inocularon aplicando gotas de 6 \mul de suspensión de esporas de
Plectosphaere- lla cucumerina (5 x 10^{6} esporas
ml-_{1}) o de Botrytis cinerea (2,5 x
10^{4} conidias ml-_{1}) a 3 hojas
completamente expandidas por planta. Se aisló P. cucumerina
de Arabidopsis con infección salvaje (registro Landsberg
erecta), y se hizo crecer sobre 19,5 g/L de agar dextrosa de
patata (Difco, Detroit, MI) a temperatura ambiente durante 2
semanas antes de recoger las esporas y suspenderlas en MgSO_{4}
10 mM. B. cinerea (cepa BMM1, aislada de Pelargonium
zonale) se hizo crecer sobre 19,5 g/1 de agar dextrosa de
patata (Difco) a 20ºC durante 10 días. Las conidias se recogieron y
se suspendieron en PDS estéril (12 g 1-_{1};
Difco). Las plantas se mantuvieron al 100% de HR y se evaluaron los
síntomas de enfermedad de 4 a 10 días después de la inoculación
determinando el diámetro medio de lesión en 3 hojas de 5 plantas
cada vez.
Se realizaron cruces cortando brotes no abiertos
y utilizando los pistilos como recipientes para polen. Se
realizaron retrocruzamientos con la línea transgénica original
utilizando plantas P69C-GUS como el donante
de polen. También se realizaron cruces recíprocos. Las plantas F1 y
F2 se hicieron crecer en placas MS y se analizaron para determinar
la actividad GUS. Se analizó la segregación del fenotipo en la
generación F2 para determinar la adecuación del ajuste con la
prueba de chi-cuadrado.
Se cruzó una planta csb3 (en el resto de
Columbia) con Landsberg erecta, y se seleccionaron para el
mapeo mutantes homocigóticos csb3 entre la progenie F2
segregante. Se identificaron plantones recombinantes utilizando los
marcadores de polimorfismo de longitud de secuencia única (SSLP)
según el protocolo descrito por Bell y Ecker (1994) y con nuevos
marcadores tal como se informó en el sitio web de la base de datos
de Arabidopsis (www.arabidopsis.org).
Los alelos de mutantes utilizados en todo este
estudio fueron npr1-1 (Cao et al.
1997), pad4-1, sid2-1
(Wildermuth et al., 2001), eds5 (Nawrath et
al., 2002) y dth9 (Mayda et al., 2000). Se ha
descrito la planta transgénica (en el ecotipo Columbia) que expresa
el gen bacteriano NahG. Los dobles mutantes csb3 npr1,
csb3 pad4, csb3 sid2, csb3 eds5, csb3
dth9 y csb3 NahG se generaron utilizando csb3 como
receptor del polen. La característica homocigótica de los loci se
confirmó utilizando un marcador molecular para cada uno de los
alelos en las poblaciones segregantes. Para el mutante doble que
contiene dth9, la hipersusceptibilidad a Pst DC3000
fue el criterio utilizado para valorar la característica
homocigótica. Todos los dobles mutantes se confirmaron en la
generación F3.
Se utilizó la secuencia genómica como la base
para la Clonación del ADNc de CSB3. Se aisló el ARN poli(A+)
de plantas salvajes y se transcribió de manera inversa utilizando
cebadores oligo(dT), tal como se ha descrito (Mayda, E.,
Tornero, P., Conejero, V., and Vera, P. (1999). A tomato homeobox
gene (HD-Zip) is involved in limiting the spread of
programmed cell death. Plant J. 20, 591-600.). Este
ADNc se amplificó mediante PCR utilizando cebadores específicos de
genes diseñados para incluir la región antes del extremo 5' del
codón de iniciación y parte de la región 3' que sigue al codón de
terminación del gen CSB3. Las secuencias de los cebadores
directos e inversos de CSB3 utilizados fueron:
(5'-CTTCCTCTGGATCCTTCTCTTCTC-3') y
(5'-GGACACTAGTTCAAAATGATGATG-3'),
respectivamente. El ADNc se clonó en el vector binario pBI121
(Clontech) bajo el control del promotor constitutivo 35S de CaMV.
Desde allí se transfirió el constructo a pCAMBIA1300 dando como
resultado pCAMBIA35SCSB3 que, a su vez, se transfirió a
Agrobacterium y se utilizó para transformar las plantas
csb3-1 mediante el método de inmersión
floral (Bechtold, N., Ellis, J. And Pelletier, G. (1993). In planta
Agrobacterium mediated gene transfer by infiltration of adult
Arabidopsis thaliana plants. C. R. Acad. Sci. Paris Life Sci.
316, 1194-1199.).
Se determinó el contenido libre y conjugado de
SA en las hojas, en extractos metanólicos mediante análisis con
HPLC tal como se describió anteriormente (Mayda et al.,
1999).
Para analizar el nivel de expresión génica
mediante PCR mediada por transcriptasa inversa, se prepararon
muestras de ARN total procedente de tejidos de hoja utilizando el
kit Totally RNA de Ambion (Austin, TX). La transcripción inversa se
llevó a cabo utilizando el kit de RT para PCR de Clontech (Palo
Alto, CA). Los conjuntos de cebadores oligonucleotídicos (50 pmol
cada uno) utilizados para amplificar CSB3 fueron: CSB3PCR1
(5'GGAGGCCTTCTTGTGGA
TGG-3')/CSB3PCR2 (5'GCTGACCCAACGACCATGTTC-3'). Los cebadores utilizados para amplificar GST6 fueron GST6PCR1 (5'-ATGGCAGGAATCAAAGTTTCGGTC-3')/GST6PCR2 (5'-GAGATTCACTTAAAGAACCT
TCTG-3'). Los cebadores utilizados para amplificar PRI fueron PR1PCR1 (5'-ATGAATTTTACTGGCTATTC-3')/
PR1PCR2 (5'-AACCCACATGTTCACGGCGGA-3').
TGG-3')/CSB3PCR2 (5'GCTGACCCAACGACCATGTTC-3'). Los cebadores utilizados para amplificar GST6 fueron GST6PCR1 (5'-ATGGCAGGAATCAAAGTTTCGGTC-3')/GST6PCR2 (5'-GAGATTCACTTAAAGAACCT
TCTG-3'). Los cebadores utilizados para amplificar PRI fueron PR1PCR1 (5'-ATGAATTTTACTGGCTATTC-3')/
PR1PCR2 (5'-AACCCACATGTTCACGGCGGA-3').
<110> Universidad Politécnica de
valencia
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\vskip0.400000\baselineskip
<120> Aislamiento y caracterización del
mutante csb3 de A. thaliana y su uso como regulador de la
resistencia en plantas a enfermedades producidas por patógenos
biotróficos
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130>
P-INCI-N-05-0089
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\vskip0.400000\baselineskip
<160> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn version 3.3
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<210> 1
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<211> 740
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<212> PRT
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<213> Arabidopsis thaliana
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<400> 1
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<210> 2
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<212> PRT
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<213> Arabidopsis thaliana
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<400> 2
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Claims (5)
1. Un alelo mutante del gen CSB3 de
Arabidopsis thaliana, denominado
csb3-1, caracterizado por conferir a
las plantas resistencia frente a enfermedades producidas por
patógenos biotróficos.
2. Mutante csb3-1 según
la reivindicación 1, caracterizado por su secuencia SEC. ID.
NO. 1, en la que presenta una sustitución de un residuo de Glicina
por uno de Ácido Aspártico en la posición 695.
3. Mutante csb3-1 según
reivindicaciones anteriores, caracterizado por conferir
expresión constitutiva de los genes PR-1,
PR-2 y GST6, completamente dependiente
de la acumulación de ácido salicílico.
4. Utilización del alelo mutante
csb3-1 en especies vegetales de interés
agronómico, para la obtención de plantas resistentes a enfermedades
producidas por patógenos biotróficos.
5. Plantas mutantes
csb3-1 caracterizadas porque el
aumento de resistencia que presentan frente a patógenos
biotróficos, viene determinado por la perdida de función del gen
CSB3 y por tanto de la enzima
1-hidroxi-2-metil-2-butenil-4-difosfato
sintasa por él codificada y que debe resultar en una
sobre-acumulación de su sustrato inmediato, es
decir el 2,4-ciclodifosfato de
2-C-metil-D-eritritol
o de alguno de los intermediarios metabólicos que le preceden según
la ruta MEP.
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