WO2007088234A1 - Plantas resistentes al estrés hídrico y salino y procedimiento para la obtención de las mismas - Google Patents

Abstract

La presente invención proporciona una planta resistente al estrés hídrico y salino y un procedimiento para la obtención de la misma. El abordaje utilizado se basa en un reforzamiento de la respuesta a la fitohormona ABA mediante la inactivación combinada de las proteínas fosfatasa tipo 2C: ABI1 y HAB1 o de sus proteínas ortólogas. Esta inactivación se realiza mediante la pérdida de función (silenciamiento/mutagénesis insercional) de los genes que codifican dichas proteínas, generando un doble mutante hab1-1abi1-2 o hab1-1abi1-3. La presente invención tiene aplicación en plantas de interés agronómico.

Description

Titulo

PLANTAS RESISTENTES AL ESTRÉS HÍDRICO Y SALINO Y

PROCEDIMIENTO PARA LA OBTENCIÓN DE LAS MISMAS

Sector de la técnica

La presente invención se encuadra dentro del campo técnico de la biotecnología vegetal, y en concreto se refiere a un procedimiento para obtener plantas modificadas genéticamente, tolerantes a salinidad y sequía.

Estado de la técnica

La sequía y la salinidad representan estreses ambientales que afectan de forma crucial al crecimiento de las plantas y limitan enormemente su potencial agrícola {Bohnert and Jensen, 1996; Flowers, 2004; Yamaguchi and Blumwald, 2005). La explotación y el riego intensivo de los cultivos han originado importantes cambios en la composición química de los suelos agrícolas. Por ejemplo, se estima que la acumulación de NaCl afecta a casi un quinto de la tierra de regadío y millones de hectáreas cultivadas deben ser abandonadas cada año {Flowers, 2004). La agricultura del siglo XXI encara el problema de mantener altos rendimientos en la producción de las cosechas, lo cual es a menudo dificultado por la incidencia de pestes, enfermedades y condiciones climáticas adversas. Mientras el progreso es significativo en el control de diversas enfermedades causadas por patógenos vegetales, todavía es un desafío importante el control del estrés abiótico, fundamentalmente sequía, estrés por temperatura y salinidad (Zhang et ai, 2004). La sequía y la salinidad ocasionan un déficit hídrico que conlleva un estrés osmótico. Adicionalmente, la toxicidad del sodio y del cloruro inhibe procesos metabólicos sensibles a estos iones y produce deficiencias en la toma de nutrientes esenciales, principalmente potasio (Zhu, 2002).

Diferentes mecanismos de halotolerancia y osmotolerancia están implicados en contrarrestar los efectos negativos descritos anteriormente. Por ejemplo, los mecanismos de osmotolerancia comprenden varias rutas metabólicas que bacterias, hongos, algas y plantas han desarrollado durante la lucha evolutiva por la supervivencia (Serrano and Gaxiola, 1994; Zhu, 2002). De este modo, una serie de rutas interconectadas permiten alcanzar el ajuste osmótico, facilitan la retención y adquisición de agua, mantienen la homeostasis iónica, palian el estrés oxidativo originado y en general protegen las funciones celulares (Ingram andBartels 1996; Zhu, 2002).

El ácido abscísico (ABA) es una fitohormona que desempeña un papel crucial en el desarrollo de la semilla y en la regulación de la respuesta vegetal al estrés ambiental, particularmente sequía y salinidad (Finkelstein et ai, 2002; Nambara and Marion-Poll 2005). Durante el desarrollo de la semilla, el ABA regula la síntesis de proteínas y lípidos de reserva, promueve la tolerancia a la desecación y la dormición de la semilla. Esta hormona también ejerce un papel protector para la semilla, evitando su germinación precoz e inhibiendo la misma en condiciones de estrés osmótico (Gonzalez-Guzman et al., 2002). En tejido vegetativo y ante situaciones de bajo potencial hídrico, la planta produce un incremento de hasta 40 veces en los niveles de ABA, lo que conduce a una variedad de respuestas adaptativas. En particular, el cierre de estomas y la remodelación de la expresión génica en respuesta a ABA son cruciales para tolerar la situación de estrés (Finkelstein et al., 2002). El ABA desencadena una cascada señalizadora en las células oclusivas de los estomas que resulta en su cierre ante situaciones de estrés hídrico (Schroeder et al, 2001). Adicionalmente, en respuesta a la hormona se genera un profundo cambio de la expresión génica, el cual afecta a más de 1000 genes del transcriptoma vegetal (Takahashi et ai, 2004). Diferentes evidencias sugieren que la percepción de la hormona puede producirse tanto extra como intracelularmente (Finkelstein et al., 2002). No obstante, todavía no ha sido identificado un receptor primario de la hormona, pero sí se ha elucidado el papel de una amplia variedad de segundos mensajeros que contribuyen a la señalización de la misma. Entre ellos encontramos cADP-ribosa, especies reactivas de oxígeno (ROS), óxido nítrico, fosfoinositoles, ácido fosfatídico, esfingosina-1 -fosfato y Ca²⁺ (Finkelstein et al., 2002). La señalización posterior implica una compleja red de reguladores positivos y negativos, en particular quinasas y fosfatasas, y finalmente una plétora de factores de transcripción {Finkelstein et al., 2002). Mutaciones en proteínas de unión a ARN (HYLl, ABHl o SADl) también afectan la señalización de la hormona {Finkelstein et al., 2002). Los eventos de fosforilación y defosforilación desempeñan un papel crucial en la señalización del ABA, e implican diversas quinasas y fosfatasas {Finkelstein et al., 2002). Por ejemplo, las quinasas AAPK, OSTl o PKABAl, han sido implicadas en diversos aspectos de la señalización hormonal {Finkelstein et al., 2002). Además de estas quinasas (independientes de calcio), otras quinasas calcio-dependientes están implicadas en la ruta de transducción de señal. Por ejemplo, las quinasas CDPKl y CDPKIa que presentan un dominio tipo calmodulina, o la familia de proteínquinasas de tipo SnRK3 (PKS3, PKSl 8, CIPK3) que actúan en concierto con los sensores de calcio CBL y SCaBP (Finkelstein et al, 2002).

Como contrapartida, diferentes proteínfosfatasas (PP) de serina y treonina juegan también un importante papel en la señalización del ABA, en particular PP de tipo 2A (PP2A) y 2C (PP2C). Recientemente se ha demostrado que la disrupción de una subunidad reguladora (RCNl) de la PP2A confiere insensibilidad a ABA en Arabidopsis. También tiene este efecto el uso de un inhibidor químico, ácido okadaico, de esta fosfatasa. Estos datos indican que RCNl es un regulador positivo de la señal de ABA (Kwak et al, 2002). En el caso de la familia de PP2C, la evidencia genética implica al menos a cuatro miembros de esta familia, ABIl, ABI2, PP2CA y HABÍ, como reguladores negativos de la ruta de señalización (Gosti et al, 1999; Leonhardt et al, 2004; Merlot et al, 2001; Saez et al, 2004; Tahtiharju and Palva 2001). Mientras ABIl, ABI2 y HABÍ son reguladores tanto en semillas como en tejido vegetativo, {Leonhardt et al, 2004; Leung et al, 1994;, Leung et al, 1997; Meyer et al, 1994; Rodríguez et al, 1998; Saez et al, 2004), PP2CA no parece estar implicada en la respuesta a estrés hídrico en tejido vegetativo (Tahtiharju and Palva 2001). El ABA promueve un aumento de la expresión de HABÍ y ABIl, y estas proteínas, mediante su actividad defosforilante, provocan una atenuación de la señal. Se crea de este modo un circuito de retroalimentación negativa, ya que la atenuación de la señal hormonal conduce a una disminución de la expresión de ABIl y HABÍ, restaurándose así la capacidad para responder de nuevo a la hormona. Tanto la ruta de biosíntesis de ABA, la regulación de la actividad y expresión de los enzimas biosintéticos implicados, así como la ruta de transducción de señal han sido blancos potenciales en la investigación para la generación de variedades modificadas genéticamente con mayor tolerancia a salinidad y sequía (Finkelstein et al, 2002; Nambara and Marion-Poll 2005). En particular, la transducción de la señal de ABA puede ser modulada mediante reforzamiento de reguladores positivos de la misma o atenuación de reguladores negativos. Durante la última década han sido identificados diversos reguladores negativos de la ruta, fundamentalmente mediante técnicas de genética y biología molecular. Como se ha mencionado previamente, las proteínas fosfatasa de tipo 2C ABIl y HABÍ representan un elemento clave en la regulación negativa de la respuesta a ABA. Puesto que estas proteínas son reguladores negativos globales de la señal de ABA, la eliminación de las mismas puede potencialmente conducir a un reforzamiento de la señal hormonal, incrementando la tolerancia de la planta a situaciones de estrés por sequía y salinidad.

Se han utilizado diversas estrategias de ingeniería genética para mejorar la tolerancia de las plantas a estrés hídrico y salino. Entre ellas cabe citar la transferencia de genes individuales requeridos para la síntesis de osmoprotectores o enzimas detoxificantes (Ingram and Bartels 1996; Bohnert and Jensen, 1996). En estos abordajes se transfiere un único gen que codifica una única proteína de respuesta a estrés, por lo que la tolerancia conferida mediante estrategias individuales es limitada.

La expresión de genes inducibles por estrés hídrico y salino implica rutas independientes y dependientes de ABA. En la ruta independiente de ABA se ha descrito una mejora de la tolerancia a sequía y salinidad mediante la transferencia del factor de transcripción DREBlA (Kasuga et al, 1999). Este factor regula la inducción de genes de respuesta a estrés de forma independiente de ABA (aunque estos genes también presentan en su promotor regiones dependientes de ABA), y su sobreexpresión de forma inducible mejora la tolerancia a estrés. No obstante, una expresión elevada de este factor de transcripción puede conducir a retraso en el crecimiento en condiciones de ausencia de estrés.

Existe la necesidad de encontrar un procedimiento para la obtención de plantas modificadas genéticamente que sean tolerantes a la salinidad y sequía, cuya modificación genética no confiera una tolerancia limitada ni interfiera negativamente con el crecimiento de la planta en condiciones de ausencia de estrés. Este ha sido el objeto de la presente invención y su novedad radica en que proporciona un procedimiento para obtener plantas modificadas genéticamente resistentes al estrés hídrico y salino mediante la inactivación combinada de proteínas fosfatasa tipo 2C, de esta manera se refuerza la ruta de transducción del ABA dando lugar a plantas que presentan una respuesta rápida a la sequía y salinidad, solucionando los problemas anteriormente expuestos. Descripción de la invención

La presente invención se refiere a una técnica de mejora de la resistencia de plantas a salinidad y sequía mediante la inactivación combinada de dos proteínas pertenecientes a la familia de las proteínas fosfatasa de tipo 2C. Un aspecto particular de la invención se refiere a una planta resistente al estrés hídrico y salino que comprende la inactivación combinada de las proteínas ABIl y HABÍ, o de sus proteínas ortólogas.

En la presente invención cuando hablamos de proteínas o genes ortólogos nos referimos a proteínas o genes que se han originado a partir de un mismo ancestro y que comparten la misma función pero que se encuentran en diferentes organismos.

En una realización particular de la invención, la inactivación combinada de las proteínas ABIl y HABÍ se realiza mediante la inactivación de los genes que codifican dichas proteínas o sus proteínas ortólogas, particularmente la inactivación de dichos genes se realiza mediante el silenciamiento génico. En una realización más particular de la invención, la inactivación combinada de las proteínas ABIl y HABÍ se realiza mediante la inactivación de los genes que codifican las proteínas ABIl y HABÍ identificadas como SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2 respectivamente, particularmente la inactivación de los genes que codifican dichas proteínas se realiza mediante silenciamiento génico. En una realización particular de la presente invención, la inactivación de los genes que codifican las proteínas ABIl y HABÍ o sus proteínas ortólogas, se lleva a cabo mediante silenciamiento génico, a través de la generación de un doble mutante. En una realización más particular, el doble mutante es el mutante habí -lábil -2. En otra realización particular el doble mutante es el mutante habí -lábil -3. Otro aspecto particular de la invención se refiere a un procedimiento de obtención de plantas resistentes al estrés hídrico y salino que comprenden la inactivación combinada de las proteínas ABIl y HABÍ o de sus proteínas ortólogas.

En una realización particular, en el procedimiento de obtención de las plantas resistentes al estrés hídrico y salino, la inactivación de las proteínas se realiza mediante la inactivación de los genes que codifican las proteínas ABIl y HABÍ o sus proteínas ortólogas, particularmente la inactivación de dichos genes se realiza mediante el silenciamiento génico. En una realización particular, en el procedimiento de obtención de las plantas resistentes al estrés hídrico y salino, la inactivación de las proteínas se realiza mediante la inactivación de los genes que codifican las proteínas ABIl y HABÍ identificadas como SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2 respectivamente, particularmente la inactivación de los genes que codifican dichas proteínas se realiza mediante silenciamiento génico.

En una realización particular, en el procedimiento de obtención de las plantas resistentes al estrés hídrico y salino, la inactivación de los genes que codifican las proteínas ABIl y HABÍ o sus proteínas ortólogas, se lleva a cabo mediante el silenciamiento génico a partir de la generación de un doble mutante. En una realización más particular, el doble mutante es el mutante habí -lábil -2. En otra realización particular el doble mutante es el mutante habí -lábil -3.

Otro aspecto particular de la invención se refiere a una planta modificada genéticamente o componentes de las mismas que comprende la inactivación combinada de las proteínas ABIl y HABÍ y ha sido obtenida según el procedimiento descrito anteriormente.

La inactivación de proteínas en la presente invención se realiza mediante la inactivación de los genes que codifican dichas proteínas mediante el silenciamiento génico a partir de la generación de un doble mutante con ADN-T, no obstante la inactivación de los genes se puede realizar mediante otras técnicas de ingeniería genética conocidas para un experto en la materia como la construcción de ARN interferente (ARNi) (Helliwell and Waterhouse 2005)

Descripción de las figuras

Figura 1. Esquema de los imitantes habl-1, abil-2 y abil-3. Análisis del ARNm de ABIl y HABÍ en plantas silvestres, habl-1, abil-2, abil-3 y el mutante doble habl- labil-2. (a, b) Esquema del gen HABÍ y ABIl, respectivamente. Localización de las inserciones de ADN-T en los mutantes habl-1, abil-2 y abil-3. La numeración comienza en el ATG iniciador. Se indica mediante flechas el borde izquierdo del ADN- T (LB) y los oligonucleótidos utilizados para localizar la inserción. (c) Análisis Northern de plantas silvestres, habl-1, abil-2, abil-3 y el mutante doble habí -lábil -2. Cada carril contiene aproximadamente 10 μg de ARN total preparado de plantas tratadas con 1 μM ABA durante 3 h. El filtro fue analizado con una sonda preparada a partir del cADN completo de ABIl o HABÍ . Figura 2. Hipersensibilidad a la inhibición de germinación mediada por el ABA en habl-1, abil-2, abil-3 y el mutante doble habl-labil-2 respecto a semillas silvestres. (a-c) Porcentaje de semillas que germinaban y desarrollaban cotiledones verdes a las concentraciones indicadas del ABA, NaCl y manitol. Aproximadamente 200 semillas de cada genotipo fueron sembradas en cada placa y su germinación fue analizada tras 10 días. Los valores son las medias ±SD de tres experimentos independientes.

Figura 3. Hipersensibilidad a la inhibición del crecimiento mediada por el ABA en habl-1, abil-2, abil-3 y el mutante doble habl-labil-2 respecto a plantas silvestres, (a) Crecimiento de los diferentes mutantes y plántulas silvestres en medio suplementado o carente de ABA. Las fotografías fueron tomadas tras 12 días de transferir plántulas de 5 días desde medio MS a placas carentes (-) o suplementadas con 10 μM ABA. (b) Porcentaje de peso fresco de los diferentes mutantes con respecto a plantas silvestres en medio suplementado o carente de ABA. Los valores son las medias ±SE de tres experimentos independientes (n=30 en cada experimento).

Figura 4. Hipersensibilidad en el cierre de estomas inducido por el ABA en habl-1, abil-2, y el mutante doble habl-labil-2 respecto a plantas silvestres. Tolerancia a sequía del doble mutante habl-labil-2 respecto a plantas silvestres. (a) Medidas de la apertura de estomas en plantas silvestres y los diferentes mutantes. El ratio de apertura de los estomas (anchura/longitud) se obtuvo a partir de medidas realizadas tras 2 h 30 min tras la adición de 10 o 100 nM ABA. Los valores son las medias ±SD de tres experimentos independientes (n=30 en cada experimento). (b) Tolerancia al estrés hídrico del doble mutante habl-labil-2 respecto a plantas silvestres. Las fotografías fueron tomadas tras 10 días de cesar el riego de las plantas. Para la fotografía de la parte inferior se eliminó el tallo para apreciar mejor el fenotipo en las hojas de roseta.

Figura 5. Tolerancia al NaCl del doble mutante habl-labil-2 respecto a plantas silvestres. La fotografía fue tomada tras 12 días de transferir plántulas de 5 días desde medio MS a medio suplementado con 100 mM NaCl. Figura 6: Muestra el alineamiento de la proteína ABIl de Arabidopsis thaliana con sus proteínas ortólogas de la planta de la patata (Solanum tuberosum) (A), la planta del tomate (Lycopersicon esculentum) (B) y dos proteínas fosfatasa tipo 2C de la planta del arroz (Oryza sativa) (C).

Figura 7: Muestra el alineamiento de la proteína HABÍ de Arabidopsis thaliana con sus proteínas ortólogas de la planta de la patata (Solanum tuberosum) (A), la planta del tomate (Lycopersicon esculentum) (B) y dos proteínas fosfatasa tipo 2C de la planta del arroz (Oryza sativa)(C).

Descripción detallada de la invención

La presente invención se refiere a una técnica de mejora de la tolerancia de plantas a salinidad y sequía mediante la inactivación combinada de las proteínas fosfatasa de tipo 2C, ABIl y HABÍ. La técnica ha sido desarrollada en la planta modelo Arabidopsis thaliana y puede ser aplicada a plantas de interés agronómico mediante distintas técnicas de ingeniería genética conocidas por un experto en la materia. Ello es posible porque los genes que codifican las proteínas ABIl y HABÍ están conservados en plantas de interés agronómico y existe tecnología adecuada para su inactivación en las mismas (Helliwell and Waterhouse 2005). Por ejemplo, en la figura 6 y en la figura 7 se muestra el alineamiento de las proteínas ABIl y HABÍ de Arabidopsis thaliana con sus proteínas ortólogas de la planta de la patata (Solanum tuberosum), la planta del tomate (Lycopersicon esculentum) y la planta del arroz (Oryza sativa).

En primer lugar se procedió a la inactivación combinada de los genes que codifican las proteínas ABIl y HABÍ utilizando como modelo Arabidopsis thaliana. A continuación se realizó una caracterización fenotípica del mutante doble generado (habí -lábil -2), tanto en condiciones de ausencia como de presencia de estrés salino y sequía. En condiciones de ausencia de estrés abiótico, el doble mutante generado no presentó penalización en el desarrollo vegetativo ni en la producción de semillas respecto a las plantas control. En cambio, en condiciones de sequía y estrés salino, el doble mutante presentó una notable ventaja (estadísticamente significativa) en cuanto a su crecimiento vegetativo y reproductivo.

Las plantas de Arabidopsis thaliana se crecieron en condiciones habituales de invernadero. Para cultivo in vitro, las semillas fueron esterilizadas en superficie mediante tratamiento con etanol 70% y Tritón X-100 0.05 % durante 20 min, seguido de lavados con agua destilada estéril. Las semillas se estratificaron durante 3 días en oscuridad y a 4°C. Después se sembraron en placas de medio Murashige-Skoog (MS) (Murashige and Skoog 1962), compuesto por sales básales MS, ácido 2-[N- morpholino]etanosulfónico 0.1%, sacarosa 1 %, agar 1% y pH ajustado a 5.7 con KOH antes de autoclavar. Las placas se sellaron y fueron incubadas en una cámara de crecimiento controlado a 22°C, y fotoperíodo de 16 h luz y 8 h oscuridad a 80-100 μE m^"2 sec^"1.

Para medir la sensibilidad a ABA en los ensayos de germinación y crecimiento temprano, se sembraron las semillas en placas de medio MS suplementado con las concentraciones indicadas de ABA. Para medir la sensibilidad a la inhibición de la germinación causada por estrés osmótico, el medio se suplemento con las concentraciones indicadas de NaCl o manitol. A los 7 días, se evaluó el porcentaje de semillas que germinaban y desarrollaban cotiledones verdes expandidos. El efecto del ABA y el NaCl sobre el crecimiento se determinó pesando las plantas tras 12 días del paso de las plántulas desde medio MS a medio MS suplementado con ABA 10 μM o NaCl 100 mM, respectivamente. Se obtuvieron datos de tres experimentos independientes, cada uno hecho con 30-40 plantas.

Los ensayos de cierre de estomas inducido por ABA se realizaron en hojas de plantas de 5-6 semanas, de las cuales se obtuvo la capa epidérmica. Esta se incubó durante 2 h 30 min en una solución tampón que contenía KCl 10 mM, ácido diiminoacético 7.5 mM y MES/Tris 10 mM, pH 6.2, a 20⁰C. Posteriormente, la capa epidérmica se incubó durante 2 h 30 min en la misma solución suplementada o no con ABA (concentraciones de 10 y 100 nM). Los datos se expresan como la media de cuatro experimentos ±SD donde se determinó el ratio anchura/longitud para 30-40 estomas en cada experimento.

Para la realización de los ensayos de estrés hídrico, las plantas se crecieron en condiciones normales de riego durante 21 días. Posteriormente se suspendió la irrigación y se minimizó la evaporación del suelo cubriendo el mismo con plástico. Se realizaron tres experimentos, incluyendo 10 plantas en cada uno de tipo silvestre y mutante.

Para realizar análisis de ARN, plántulas de 7 días fueron transferidas a medio suplementado o no con ABA 1 μM, el material se recogió tras tres horas de tratamiento y se congeló en nitrógeno líquido. El ARN total se extrajo mediante un Qiagen RNeasy Plant Mini Kit, se separó en geles de agarosa-formaldehído y se transfirió a una membrana de nylon, la cual fue hibridada con una sonda de ADNc marcada con ³²P. La sonda de ADNc contenía la secuencia codificante del gen ABIl identificada como SEQ ID NO: 3 o la secuencia codificante del gen HABÍ identificada como SEQ ID NO: 4.

Los siguientes ejemplos ilustran la invención y no deben ser considerados en sentido limitativo de la misma:

EJEMPLON⁰I

Obtención y caracterización de los mutantes sencillos de ADN-T habl-1, abil-2 y abil-3

El genoma de la planta modelo Arabidopsis ha sido secuenciado mediante una colaboración internacional denominada AGI (iniciativa para el genoma de Arabidopsis, Nature, 408:796-815). La disponibilidad de la secuencia completa de este genoma (el primer genoma vegetal en ser secuenciado) ha permitido poner en marcha diversos proyectos encaminados a elucidar la función de los más de 25000 genes identificados en esta planta modelo. En particular, se ha generado una plataforma de mutantes de inserción de ADN-T (colección Alonso/Crosby/Ecker, Alonso et al, 2003) que tiene como objetivo generar una colección indexada de mutaciones en el genoma de Arabidopsis.

Esta colección, denominada SALK, se realizó mediante la generación de inserciones de ADN-T (vehiculado por Agrobacterium tumefaciens) a partir del vector pROK2 (Alonso et al., 2003). Para ello se utilizó el método de inmersión floral (Clough andBent, 1998), utilizando la cepa de Agrobacterium tumefaciens C58 que contenía el vector binario pROK2 (Alonso et al, 2003). Las bacterias se crecieron hasta fase estacionaria en medio de cultivo LB (10 g de triptona, 5 g de extracto de levadura y 5 g de NaCl por litro) suplementado con 25 mg/ml de kanamicina. Las células fueron recogidas mediante centrifugación y se resuspendieron en medio de infiltración (sacarosa 5% y Silwet L-77 0.05%). Plantas de Arabidopsis de cuatro semanas fueron invertidas y sumergidas en esta suspensión, tras lo cual se cubrieron con plástico para mantener la humedad. Tras 12-24 horas se retiró la cubierta de plástico y se devolvieron las plantas al invernadero. Tras 3-5 semanas se recogieron las semillas de las plantas así tratadas y se almacenaron durante 3-4 semanas antes de proceder a la selección de los transformantes que contenían ADN-T transferido por Agrobacterium. Para ello se esterilizaron las semillas en superficie como se describe en la sección anterior y se sembraron en placas de medio MS suplementado con 25 mg/ml de kanamicina. Los transformantes fueron identificados como plántulas resistentes a kanamicina que producían hojas verdes y raíces en el medio de selección. Aproximadamente 150000 plantas transformadas fueron así seleccionadas, a partir de las cuales se extrajo ADN genómico y se procedió a la identificación de mutantes mediante la secuenciación de los sitios de inserción del ADN-T. La línea SALK 21004 contenía una inserción de ADN- T en el gen HABÍ (Saez et al., 2004). Para identificar el mutante homocigoto habl-1 se procedió al genotipado de la línea SALK 21004 utilizando los siguientes oligonucleótidos del gen HABÍ : Forward habl-1, identificado como SEQ ID NO: 5 Reverse habl-1, identificado como SEQ ID NO: 6 Igualmente, dos líneas que contenían una inserción única de ADN-T en ABIl fueron identificadas, SALK 72009 y SALK 76039. Para identificar los correspondientes mutantes homocigotos, abil-2 y abil-3 respectivamente, se procedió al genotipado de estas líneas utilizando los siguientes oligonucleótidos del gen ABIl : Línea SALK 72009, forward abil-2 identificado como SEQ ID NO: 7 reverse abil-2, identificado como SEQ ID NO: 8.

Línea SALK 76039, forward abil-3, identificado como SEQ ID NO: 9 y reverse abil- 3, identificado como SEQ ID NO: 10. Como oligonucleótido correspondiente al borde izquierdo del ADN-T del vector pROK2, se utilizó LBnewpROK2, identificado como SEQ ID NO: 11. La secuenciación de la región flanqueante del ADN-T en abil-2 reveló que la inserción estaba localizada 2 nucleótidos antes del ATG iniciador (Figura la). En el caso de abil-3, el inserto de ADN-T estaba localizado 546 nucleótidos después del ATG iniciador (Figura la). Ambas inserciones afectan la expresión de ABIl y el análisis tipo Northern mostró ausencia del transcrito ABIl en ambos mutantes (Figura Ib). EJEMPLO N°2. Hipersensibilidad al ABA de las semillas de habl-1, abil-2y abil-3

La progenie de individuos homocigotos habl-1, abil-2 y abil-3 fue utilizada para realizar diferentes ensayos de sensibilidad a ABA. En primer lugar se examinó la sensibilidad de los imitantes a ABA en ensayos de inhibición de la germinación (Figura 2a). En ausencia de ABA exógeno, las semillas de habl-1, abil-2 y abil-3 mostraron un ratio de germinación similar a semillas control. En cambio, en presencia de ABA, los mutantes fueron hipersensibles a la inhibición de la germinación promovida por la hormona. Semillas Fl hemicigotas para la inserción de ADN-T mostraron una germinación similar a semillas silvestres en medio suplementado con 0.5 μM ABA. La siguiente generación de semillas F2 mostró un fenotipo de hipersensibilidad a ABA en aproximadamente una proporción de 1:3 (121 hipersensible: 313 silvestre, χ²=0.42, P>0.5 para abil-2; 112 hipersensible: 319 silvestre, χ²=1.4, P>0.1 para abil-3). Finalmente, aquellas plántulas F2 hipersensibles al ABA mostraron cosegregación con la presencia de una inserción homocigota de ADN-T en ABIl (n=40). En conjunto estos datos indicaron que las mutaciones abil-2 y abil-3 fueron recesivas y se segregaron como un locus único ligado a la inserción de ADN-T en ABIl.

El ABA desempeña un papel protector en las semillas, impidiendo su germinación y desarrollo temprano en condiciones de estrés osmótico (Gonzalez- Guzman et al., 2002). De hecho, mutantes hipersensibles al ABA son más sensibles a la inhibición de la germinación promovida por el estrés osmótico que semillas silvestres (Saez et al., 2004). Los mutantes habl-1, abil-2 y abil-3 mostraron un fenotipo de hipersensibilidad al ABA en germinación (Figura 2a). A continuación se realizaron análisis tipo dosis-respuesta de germinación y crecimiento temprano en medio suplementado con NaCl (figura 2b) o manitol (figura 2c) para los mutantes. Los resultados indicaron que los mutantes fueron más sensibles que el silvestre a la inhibición de la germinación en situaciones de estrés osmótico, ejerciendo un papel preventivo y evitando la germinación ante las situaciones desfavorables que se producen en condiciones de bajo potencial hídrico (sequía, salinidad). EJEMPLO N° 3 Generación y análisis de un muíante doble habl-labil-2

Para la generación del doble mutante, se cruzó el alelo habl-1 con abil-2, mediante la transferencia de polen de plantas abil-2 al estigma de flores emasculadas de plantas habl-1. El genotipo de las plantas F2 resultantes de este cruce fue analizado mediante PCR. Para identificar individuos homocigotos en la inserción del ADN-T, se obtuvo ADN genómico y se procedió a su genotipado mediante PCR utilizando los siguientes oligonucleótidos:

Gen ABIl: forward abil-2, identificado como SEQ ID NO: 7 y reverse abil-2, identificado como SEQ ID NO: 8

Gen HAB 1 : forward hab 1 - 1 , identificado como SEQ ID NO : 5 y reverse hab 1 - 1 , identificado como SEQ ID NO: 6

Como oligonucleótido correspondiente al borde izquierdo del ADN-T del vector pROK2, se utilizó LBnewpROK2, identificado como SEQ ID NO: 11 Se identificaron plantas F2 que fueran simultáneamente homocigotas para los alelos habl-1 y abil-2, y el genotipo de las mismas se confirmó mediante análisis Southern. El genotipado mediante PCR aquí descrito se realizó mediante dos reacciones de PCR. En primer lugar se identificaron individuos donde no se producía amplificación al utilizar los oligonucleótidos forward y reverse indicados. Estos individuos eran candidatos que presumiblemente contenían la inserción de ADN-T en homocigosis, la cual impedía obtener el producto esperado mediante la reacción de PCR. En segundo lugar, se confirmó la presencia del ADN-T mediante una reacción de PCR que utilizaba los siguientes pares de oligonucleótidos: Alelo habl-1, SEQ ID NO: 11 y SEQ ID NO: 6; alelo abil-2, SEQ ID NO: 11 y SEQ ID NO: 8.

El análisis de la población F2 resultante permitió identificar un mutante doble habl-labil-2, y su respuesta al ABA fue analizada en bioensayos de germinación, crecimiento y cierre estomático. El análisis de germinación en medio suplementado con 0.3 μM ABA mostró una mayor respuesta a ABA en el mutante doble que en los imitantes parentales (Figura 2a). En concordancia con este resultado, el mutante doble fue particularmente sensible a la inhibición de la germinación en situaciones de estrés osmótico causado por NaCl o manitol (Figuras 2b y 2c). El ABA tiene un efecto inhibitorio sobre el crecimiento vegetal cuando el medio es suplementado con concentraciones micromolares de la hormona. Como se demuestra en la figura 3b, tanto abil-2 como abil-3 mostraron mayor sensibilidad que plantas silvestres al efecto inhibidor del crecimiento causado por 10 μM ABA, lo cual también ocurrió con el mutante habl-1. El doble mutante habl-labil-2 mostró una inhibición dramática del crecimiento en estas condiciones y este fenotipo fue mucho más acusado que el observado en los mutantes parentales (Figura 3 a).

EJEMPLO NU. Tolerancia a sequía y salinidad del mutante doble habl-labil-2

A continuación se realizaron ensayos de cierre de estomas en respuesta a ABA. Esta respuesta se ensayó tanto en los mutantes sencillos abil-2 y habl-1 como en el mutante doble (Figura 4a). Las medidas de apertura de estomas indicaron que abil-2, habl-1 y el mutante doble fueron hipersensibles al ABA en un rango de 10-100 nM ABA. Es más, la respuesta del mutante doble a 10 nM ABA fue sinérgica respecto a la respuesta de los mutantes parentales (Figura 4a).

Posteriormente se realizaron ensayos de tolerancia al estrés hídrico para los diversos mutantes y plantas silvestres. Con este fin, se sometieron plantas de 21 días a estrés hídrico mediante retirada del riego en condiciones que minimizan la evaporación desde el suelo. La figura 4b muestra que tras 10 días en ausencia de riego, las plantas silvestres se marchitaron, perdieron turgencia y muchas hojas de roseta amarillearon. En cambio, las plantas habl-labil-2 no mostraron síntomas de marchitamiento y mantuvieron hojas de roseta túrgidas y verdes, mientras los mutantes sencillos habl-1, abil-2 y abil-3 sólo mostraron una tolerancia limitada. Tanto el estrés hídrico como el salino impiden/dificultan la toma de agua y generan acumulación de ABA, y esto último es un factor clave para promover las respuestas adaptativas en la planta. Por lo tanto, una mayor sensibilidad a la hormona podría causar una mayor tolerancia no sólo en situaciones de sequía sino también ante estrés salino. Se comprobó la tolerancia a sal de los mutantes aquí descritos en cultivo in vitro en medio suplementado con 100 mM NaCl. La figura 5 muestra que el mutante doble fue más resistente a la inhibición del crecimiento causada por el NaCl que las plantas silvestres o los mutantes parentales. Referencias bibliográficas

1. Alonso JM, Stepanova AN, Leisse TJ, Kim CJ, Chen H, Shinn P, Stevenson DK, Zimmerman J, Barajas P, Cheuk R, Gadrinab C, Heller C, Jeske A, Koesema E, Meyers CC, Parker H, Prednis L, Ansari Y, Choy N, Deen H, Geralt M, Hazari N, Hom E, Karnes M, Mulholland C, Ndubaku R, Schmidt I, Guzman P, Aguilar-Henonin L, Schmid M, Weigel D, Cárter DE, Marchand T, Risseeuw E, Brogden D, Zeko A, Crosby WL, Berry CC, Ecker JR (2003) Genome-wide insertional mutagenesis of Arabidopsis thaliana. Science 301: 653-657.

2. Bohnert HJ, Jensen RG (1996) Strategies for engineering water-stress tolerance in plants. Tibtech 14: 89-97.

3. Clough, SJ. and Bent, A.F. (1998). Floral dip: a simplified method for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana. Plant J. 16, 735-743.

4. Finkelstein RR, Gampala SS, Rock CD (2002) Abscisic acid signaling in seeds and seedlings. Plant CeIl 14 Suppl: S15-S45. 5. Flowers TJ (2004) Improving crop salt tolerance. J Exp Bot 55: 307-319.

6. Gonzalez-Guzman M, Apostolova N, Belles JM, Barrero JM, Piqueras P, Ponce MR, Micol JL, Serrano R, Rodríguez PL (2002) The short-chain alcohol dehydrogenase ABA2 catalyzes the conversión of xanthoxin to abscisic aldehyde. Plant CeIl 14: 1833- 1846. 7. Gosti F, Beaudoin N, Serizet C, Webb AA, Vartanian N, Giraudat J ( 1999) ABIl protein phosphatase 2C is a negative regulator of abscisic acid signaling. Plant CeIl 11 : 1897-1910.

8. Helliwell CA, Waterhouse PM (2005) Constructs and methods for hairpin RNA- mediated gene silencing in plants. Methods Enzymol 392: 24-35. 9. Ingram J, Bartels D (1996). The molecular basis of dehydration tolerance in plants. Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol 47: 377-403.

10. Kasuga M, Liu Q, Miura S, Yamaguchi-Shinozaki K, Shinozaki K (1999) Improving plant drought, salt, and freezing tolerance by gene transfer of a single stress- inducible transcription factor. Nat Biotechnol 17: 287-291. 11. Kwak JM, Moon JH, Murata Y, Kuchitsu K, Leonhardt N, DeLong A, Schroeder JI (2002) Disruption of a guard cell-expressed protein phosphatase 2A regulatory subunit, RCNl, confers abscisic acid insensitivity in Arabidopsis. Plant CeIl 14: 2849-2861. 12. Leonhardt N, Kwak JM, Robert N, Waner D, Leonhardt G, Schroeder JI (2004) Microarray expression analyses of Arabidopsis guard cells and isolation of a recessive abscisic acid hypersensitive protein phosphatase 2C mutant. Plant CeIl 16: 596-615.

13. Leung J, Bouvier-Durand M, Morris PC, Guerrier D, Chefdor F, Giraudat J (1994) Arabidopsis ABA response gene ABIl: features of a calcium-modulated protein phosphatase. Science 264: 1448-1452.

14. Leung J, Merlot S, Giraudat J (1997) The Arabidopsis ABSCISIC ACID- INSENSITIVE2 (AB 12) and ABIl genes encode homologous protein phosphatases 2C involved in abscisic acid signal transduction. Plant CeIl 9: 759-771. 15. Merlot S, Gosti F, Guerrier D, Vavasseur A, Giraudat J (2001) The ABIl and ABI2 protein phosphatases 2C act in a negative feedback regulatory loop of the abscisic acid signalling pathway. Plant J 25: 295-303.

16. Meyer K, Leube MP, Grill E (1994) A protein phosphatase 2C involved in ABA signal transduction in Arabidopsis thaliana. Science 264: 1452-1455. 17. Murashige T, Skoog F (1962) A revised médium for rapid growth and bioassays with tobáceo tissue culture. Physiol Plant 15: 473-497.

18. Nambara E, Marion-Poll A (2005) ABSCISIC ACID BIOSYNTHESIS AND CATABOLISM. Annu Rev Plant Biol 56: 165-185.

19. Rodríguez PL, Benning G, Grill E (1998) ABI2, a second protein phosphatase 2C involved in abscisic acid signal transduction in Arabidopsis. FEBS Lett 421 : 185-190.

20. Saez A, Apostolova N, Gonzalez-Guzman M, Gonzalez-Garcia MP, Nicolás C, Lorenzo O, Rodríguez PL (2004) Gain-of-function and loss-of-function phenotypes of the protein phosphatase 2C HABÍ reveal its role as a negative regulator of abscisic acid signalling. Plant J 37: 354-369. 21. Schroeder JI, Alien GJ, Hugouvieux V, Kwak JM, Waner D (2001) Guard cell signal transduction. Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol 52: 627-658.

22. Serrano, R., Gaxiola, R. (1994). Microbial models and salt stress tolerance in plants. Crit. Rev. Plant Sci. 13:121-138.

23. Tahtiharju S, Palva T (2001) Antisense inhibition of protein phosphatase 2C accelerates cold acclimation in Arabidopsis thaliana. Plant J 26: 461-470.

24. Takahashi S, Seki M, Ishida J, Satou M, Sakurai T, Narusaka M, Kamiya A, Nakajima M, Enju A, Akiyama K, Yamaguchi-Shinozaki K, Shinozaki K (2004) Monitoring the expression profiles of genes induced by hyperosmotic, high salinity, and oxidative stress and abscisic acid treatment in Arabidopsis cell culture using a full- length cDNA microarray. Plant Mol Biol 56: 29-55.

25. Yamaguchi T, Blumwald E (2005) Developing salt-tolerant crop plants: challenges and opportunities. Trends Plant Sci 10: 615-620

26. Zhu JK (2002). SaIt and drought stress signal transduction in plants. Annu Rev Plant Biol 53: 247-273.

27. Zhang JZ, Creelman RA, Zhu JK (2004). From laboratory to field. Using information from Arabidopsis to engineer salt, cold, and drought tolerance in crops. Plant Physiol 135: 615-621.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Planta resistente al estrés hídrico y salino que comprende la inactivación combinada de las proteínas ABIl y HABÍ o de sus proteínas ortólogas.

2. Planta resistente al estrés hídrico y salino según la reivindicación 1, donde la inactivación de dichas proteínas se realiza mediante el silenciamiento de los genes que codifican las proteínas ABIl y HABÍ o sus ortólogas.

3. Planta resistente al estrés hídrico y salino según cualquiera de las reivindicaciones 1 y 2, donde la inactivación de dichas proteínas se realiza mediante el silenciamiento de los genes que codifican las proteínas ABI 1 y HABÍ identificadas como SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2 respectivamente

4. Planta resistente al estrés hídrico y salino según la reivindicación 2, donde el silenciamiento de los genes que codifican las proteínas ABIl y HABÍ o sus ortólogos se realiza mediante la generación de un doble mutante.

5. Planta resistente al estrés hídrico y salino según la reivindicación 4, donde el doble mutante es habí -lábil -2.

6. Planta resistente al estrés hídrico y salino según la reivindicación 4, donde el doble mutante es habí -lábil -3.

7. Procedimiento de obtención de una planta resistente al estrés hídrico y salino que comprende la inactivación combinada de las proteínas ABIl y HABÍ o de sus proteínas ortólogas.

8. Procedimiento de obtención de una planta resistente al estrés hídrico y salino según la reivindicación 8, donde la inactivación de las proteínas ABIl y HABÍ, se realiza mediante el silenciamiento de los genes que codifican las proteínas ABIl y HABÍ o de sus genes ortólogos.

9. Procedimiento de obtención de una planta resistente al estrés hídrico y salino según cualquiera de las reivindicaciones 8 y 9, donde la inactivación de dichas proteínas se realiza mediante el silenciamiento de los genes que codifican las proteínas ABI 1 y HABÍ, identificadas como SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2 respectivamente.

10. Procedimiento de obtención de una planta resistente al estrés hídrico y salino según la reivindicación 9, donde el silenciamiento de los genes que codifican las proteínas ABIl y HABÍ o sus ortólogos se realiza mediante la generación de un doble mutante.

11. Procedimiento de obtención de una planta resistente al estrés hídrico y salino según la reivindicación 11, donde el doble mutante es habí -lábil -2.

12. Procedimiento de obtención de una planta resistente al estrés hídrico y salino según la reivindicación 11, donde el doble mutante es habí -lábil -3.

13. Planta modificada genéticamente o componentes de las mismas que comprenden la inactivación combinada de las proteínas ABIl y HABÍ obtenida mediante el procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 8-13.