WO2006131225A1 - Verfahren und vorrichtung zur quantitativen bestimmung von analyten in flüssigen proben - Google Patents

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WO2006131225A1
WO2006131225A1 PCT/EP2006/005078 EP2006005078W WO2006131225A1 WO 2006131225 A1 WO2006131225 A1 WO 2006131225A1 EP 2006005078 W EP2006005078 W EP 2006005078W WO 2006131225 A1 WO2006131225 A1 WO 2006131225A1
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WO
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carrier
light
sample
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analytes
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PCT/EP2006/005078
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French (fr)
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Jens Tschmelak
Günther PROLL
Nina KÄPPEL
Günter GAUGLITZ
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Universität Tübingen
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    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B82—NANOTECHNOLOGY
    • B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
    • B82Y5/00—Nanobiotechnology or nanomedicine, e.g. protein engineering or drug delivery
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54366—Apparatus specially adapted for solid-phase testing
    • G01N33/54373—Apparatus specially adapted for solid-phase testing involving physiochemical end-point determination, e.g. wave-guides, FETS, gratings
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B82—NANOTECHNOLOGY
    • B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
    • B82Y10/00—Nanotechnology for information processing, storage or transmission, e.g. quantum computing or single electron logic

Definitions

  • the present invention relates to a method and a device for the highly sensitive parallel detection of analytes in liquid media.
  • the object of the present invention is therefore to provide a cost-effective method and a device for fast, highly sensitive and parallel detection of a plurality of different analytes.
  • first layers are applied to a carrier surface.
  • the carrier material used is a light-conducting medium.
  • this glass or plastic is suitable.
  • the carrier has two parallel surfaces in a particularly preferred embodiment.
  • a polymer layer is applied first according to the method as described in DE19816604 A1.
  • a layer is applied which has substances with molecular structures which correspond to or are similar to the analyte to be investigated.
  • the molecular structures of the applied substances have suitable properties for sufficiently specific detection by the recognition structures of the ligands added later in the binding test of the sample.
  • the applied substances may correspond to the analyte or a derivative of the analyte to be examined, which have suitable functional groups in order to be covalently or noncovalently bound to the polymer layer. If only one analyte is to be detected, the corresponding molecular structures are applied in a planar manner. In the case of several analytes to be examined, the application of different molecular structures takes place in a spatially resolved manner, e.g. in the form of spots.
  • the samples to be examined are prepared for the binding inhibition test.
  • the samples are diluted, if necessary, with a suitable liquid.
  • the analytes are transferred to a liquid medium using suitable methods (extraction, solution, grinding, or the like).
  • defined volumes of the liquid samples are pre-incubated with the appropriate ligands.
  • ligands substances are understood here and below which have suitable recognition structures for sufficiently specific detection and binding of analytes to be examined from the sample.
  • antibodies, aptamers, antigens, coated Beads etc. are used.
  • the ligands bear suitable markers for later detection, which can be excited by an evanescent field. These may be, for example, fluorescent dyes, quantum dots or the like.
  • the preincubation of the sample is terminated either after reaching equilibrium or after expiration of a predefined time.
  • the pretreated sample is brought into contact with the coated support.
  • a flow method is used.
  • the sample is passed through a flow cell in or on which the coated carrier is located, so that the sample comes into contact with the coated surface.
  • the ligands in the sample can bind via the free binding sites to the corresponding molecular structures of the substances applied to the support surface.
  • the incubation can be stopped by rinsing the carrier.
  • the laser light is used, which is generated for example by light-emitting diodes (LED), laser diodes or laser.
  • LED light-emitting diodes
  • laser diodes laser diodes
  • an evanescent field arises at the phase boundary, which excites the markers located on the surface of the support.
  • the marker used and the light used must be coordinated so that an excitation can take place.
  • the marker emits its characteristic light, which is detected by a detector.
  • photodiodes or CCD elements can be used as the detector.
  • appropriate filters can be placed between the carrier and the detector.
  • additional coupling and decoupling elements for example in the form of mirrors, lenses or light guides, can be arranged between the light source and the carrier and / or between the carrier and the detector.
  • the light intensities measured by the detector can now be evaluated and used as a basis for the quantitative determination of the analytes to be examined.
  • an evaluation device in particular a computer can be used, so that the evaluation is automated.
  • further method steps such as sample preparation and the measurement process can be carried out according to the invention of machines. In a particularly preferred embodiment, the entire process is fully automatic.
  • analytes such as hormones, antibiotics, pesticides, pharmaceuticals, drugs and other molecules or molecular complexes
  • Different types of fluids can be analyzed, such as drinking water, fruit juices, milk, serum, blood plasma, urine and others.
  • ligands with suitable recognition structures for the respective analytes, substances for the carrier surface with suitable molecular structures, and suitable sample preparation are selected.
  • the flexibility of the method allows its application in different areas: from food monitoring to water analysis to clinical diagnostics.
  • the method according to the invention allows several diverse analytes to be detected simultaneously in different liquid media more quickly, more sensitively and more cost-effectively.
  • FIG. 1 The principle of the binding inhibition test used in the method according to the invention using the example of an immunoassay; the antibodies 1 serve as ligands for the analyte 2; A: In the first step, pre-incubation is performed, in which antibody 1 is added to the sample containing the analyte 2; B: In the second step, the sample is pumped over the carrier 4; the antibodies 1 can now bind with their free binding sites to the modified surface 3; after completion of the incubation, the detection takes place.
  • the light is coupled from the light source 1 in the glass substrate 2 and forwarded by total reflection within the carrier 2; on the carrier surface, which is coated with corresponding substances 3 for the specific detection of the analyte, an evanescent field is formed near the surface; the sample can be brought into contact with the carrier surface via a flow cell 4; after the incubation of the prepared sample, the detection of the emitted light is carried out by a detector 5; this transmits the recorded measurement data to an evaluation unit 6.
  • Fig. 3 Calibration curve for progesterone in UHT milk; Progesterone concentrations between 0.009 and 900 ng ml '1 were measured (six steps); the antibody was used at a concentration of 30 ng ml -1 in each sample and a detection limit of 46 pg ml -1 could be achieved.
  • Fig. 4 Calibration curve for progesterone in fresh milk; progesterone concentrations were measured between 0.009 to 900 ng ml -1 (six steps) and the antibody was used at a concentration of 30 ng ml -1 in each sample; a detection limit of 56 pg ml-1 could be achieved.
  • Fig. 5 Calibration curve for progesterone in raw milk; progesterone concentrations were measured between 0.009 to 900 ng ml -1 (six steps) and the antibody was used at a concentration of 30 ng ml -1 in each sample; a detection limit of 52 pg ml -1 was achieved.
  • Fig. 6 Calibration curve for testosterone in bovine serum; testosterone concentrations between 0.009 and 900 ng ml -1 were measured (six steps) and the antibody was used at a concentration of 30 ng ml -1 in each sample; a detection limit of 309 pg ml -1 was achieved.
  • the hormone progesterone in three different types of milk is quantified. Detection limits between 46 and 56 pg ml "1 were achieved.
  • Consumption chemicals were purchased from Sigma-Aldrich and Merck KGaA.
  • the hormone was purchased as VETRANAL ® standard for Riedl-de Haen Laboratory Chemicals GmbH & Co. KG.
  • the monoclonal IgGI antibody, anti-progesterone, was purchased from Achs Antibodies GmbH.
  • the fluorescence marker CyDye Cy5.5 used was purchased from Amersham Biosciences Europe GmbH.
  • the aminodextran Amdex TM 40,000 dalton molecular weight was purchased from the Helix Research Company.
  • the progesterone derivative for immobilization on the support surface was synthesized.
  • the basic unit consists of a 1 ml reciprocating syringe with T-valve for the Tecan Cavro-Module XL3000; a sample loop consisting of a teflon tube with about 2 ml total volume of Ismatec; a 6-way valve with a flow cell tube (0.7 ml total volume) from Ismatec; a Plexiglas flow cell with milled flow channel and Swagelok ports for inlet and outlet of proliquid; a Bok7 glass size 60x14x1.5mm bulkhead glass from Desag, with the 45 ° bevel and polish made by PE Applied Biosystems; a modulated laser diode with a wavelength of 635 nm and 15 mW power from Cohenent; six polymer fibers with a numerical aperture of 0.46; six edge filters 680 AELP with a diameter of 25 mm, a thickness of 4.5 mm and a maximum transmission of 90% from Omega Optical; six photodiodes with integrated preamplifier
  • the autosampler HTS PAL by CTC Analytics was used for sample preparation. It consists mainly of a moving 1 ml syringe, a washing station, a six-port Inject / Load valve (Valco) Sample holder for 98 1 ml samples and one sample holder for five 10 ml samples.
  • the software program Cycle Composer controls the autosampler via a separate PC. The communication between the two PCs takes place via a relay card.
  • the autosampler automatically mixes the samples and injects them into the own sample loop via the Valco valve (Teflon tube with 960 ⁇ l, Ismatek).
  • the carrier is completely coated, whereas in the multi-analyte measurements a spatially resolved modification of the carriers using a microdosing system is required.
  • the glass surface is first cleaned and activated.
  • the glass slides are placed in a fresh piranha solution for 30 minutes and then rinsed well with deionized water.
  • the carrier is covered with 50 .mu.l of GOPTS, a second placed on it (sandwich technique) and both stored in a dry chamber.
  • the carriers are rapidly rinsed with dry acetone and dried in a stream of nitrogen.
  • the activated carriers are covered with 50 ⁇ l of aminodextran-water solution and folded together (sandwich technique). Overnight they are stored in a steam atmosphere. Then they are rinsed with deionized water and dried. Now follows the reaction with the derivative. For this purpose, about 5 mg of the derivative is dissolved in a little dry DMF and mixed with 1, 1-fold molar amount of DCC in DMF. This solution is placed on the carrier and stored again with the sandwich technique in a DMF saturated chamber for at least 5 h. Thereafter, the carriers are rinsed first with DMF and then with deionized water.
  • the GOPTS-activated carrier is dripped with a conjugate of derivative and aminodextran using the Microdrop dosing system.
  • the spot diameter is 3 mm and the distance of the spots 6.5 mm.
  • the conjugate is prepared from the active ester of the derivative and antimodextran (40 kD).
  • the active ester of the derivative and antimodextran 40 kD.
  • the aminodextran is dissolved in a mixture of carbonate buffer pH 9.5 and DMF (1: 1). 0.125 molar equivalents of active ester are added to the AMD solution.
  • the solution is shaken overnight. Subsequently, the conjugate is precipitated with methanol, washed and freeze-dried. The conjugate is dissolved in deionized and filtered water (2 mg ml -1 ), which is used to drip the carrier by microdosing.
  • the optical design of the device consists of a laser diode, which has a distance of approx. 2-5 cm from the carrier. Over the beveled edge of the glass carrier, the laser light is coupled into this. Through total reflection, the beam is transmitted within the carrier. The reflection points are at a distance of about 6.5 mm. At these sites, an evanescent field is formed near the surface in the flow cell, in which fluorescent dyes can be excited. On the back of the carrier polymer fibers conduct the fluorescence via edge filters to the photodiodes. The lock-in technique used modulates the laser light, and only the incoming, correspondingly modulated radiation is detected.
  • the sample is mixed by the HTS PAL Autosampler and injected into the sample loop of the Valcoventils.
  • the syringe pump then slowly pumps the sample over the flow cell.
  • the antibody will be added to the sample immediately before the measurement. This has several advantages: First, the time interval between mixing and measurement is always the same, second, the antibody is spared, since it is only relatively short time in possibly aggressive matrices, and third, the antibody can be stored refrigerated in the storage vessel, without the complete sample tray needs to be cooled.
  • the hormone testosterone is quantified in bovine serum.
  • the hormone testosterone was purchased as VETRANAL ® Standard from Riedl-de Haen Laboratory Chemicals GmbH & Co. KG.
  • the monoclonal IgGI antibody, anti-testosterone, was purchased from Achs Antibodies GmbH.
  • the fluorescent marker CyDye TM Cy5.5 was purchased from Amersham Biosciences Europe GmbH.
  • the 40,000 dalton molecular weight aminodextran Amdex TM was purchased from HeNx Research Company.
  • the testosterone derivative (testosterone 3- (O-carboxymethyl) oxime) for immobilization on the support surface was purchased from Sigma-Aldrich.
  • Example 1 The basic device and the optical design of the device correspond to the system used in Example 1.
  • the HTS PAL autosampler from CTC Analytics was used according to the procedure described in Example 1.
  • the complete coating method described in Example 1 was used for a single analyte measurement. Sample preparation and measurement procedure, as well as the calculation of the analytical parameters were carried out according to Example 1.

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren und eine Vorrichtung zur hochsensitiven parallelen Detektion und quantitativen Bestimmung von Analyten in flüssigen Proben. Bei diesem Verfahren wird die totale interne Reflektionsfluoreszenz (TIRF) an einem speziell beschichteten Träger in Kombination mit einem Bindungshemmtest eingesetzt. Mit dem Verfahren können Flüssigkeiten unterschiedlicher Natur schnell analysiert werden, wie beispielsweise Trinkwasser, Fruchtsäfte, Milch, Serum, Blutplasma, Urin etc. Das Verfahren ermöglicht die Untersuchung von Proben auf mehrere unterschiedliche Analyten gleichzeitig, zu denen beispielsweise Hormone, Antibiotika, Pestizide, Pharmake, Drogen und andere Moleküle oder Molekülkomplexe gehören können.

Description

Beschreibung
Verfahren und Vorrichtung zur quantitativen Bestimmung von Analvten in flüssigen Proben
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren und eine Vorrichtung zur hochsensitiven parallelen Detektion von Analyten in flüssigen Medien.
Bisher wurden Analysen flüssiger Proben vorwiegend mittels kostenintensiver chromatographischer Verfahren mit aufwendiger Probenvorbereitung durchge- führt (R. J. Kavlock et al. (1996) Environ Health Perspect 104: 715-740; M. Petrovic et al. (2002) J Chromatogr A 974: 23-51 ; R. Heinrich-Ramm et al. (2004) Anal Bioanal Chem 380: 59-67; G. S. Pope, J. K. Swinburne (1980) J Dairy Res 47: 427-449; T. Mottram et al. (2002) Comp Clin Path 11 : 50-58).
Die Nachteile der bekannten Verfahren liegen vor allem in einer kostenintensi- ven Probenvorbereitung, die auf die Notwendigkeit einer Aufkonzentrierung und einer eventuellen Derivatisierung der Analyte zurückzuführen ist. Zusätzlich entstehen Probleme bei verschiedenen Anwendungen, da die herkömmlichen Verfahren stark von der Matrix abhängig sind und deswegen werden für die Messung unterschiedlicher Substanzklassen unterschiedliche Ansätze benötigt.
Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es daher, ein kostengünstiges Verfahren und eine Vorrichtung zur schnellen, hochsensitiven und parallelen Detektion von mehreren unterschiedlichen Analyten bereit zu stellen.
Diese Aufgabe wird durch das Verfahren mit den Merkmalen des Anspruches 1 gelöst. Bevorzugte Ausführungsformen dieses Verfahrens sind in den abhängi- gen Ansprüchen 2 bis 26 dargestellt. Die erfindungsgemäße Vorrichtung ist in Anspruch 27 beschrieben. Bevorzugte Verwendungen umfasst Anspruch 28. Der Wortlaut sämtlicher Ansprüche wird hiermit durch Bezugnahme zum Inhalt dieser Beschreibung gemacht. Erfindungsgemäß wird die totale interne Reflektionsfluoreszenz (TIRF) an einem speziell beschichteten Träger in Kombination mit einem Bindungshemmtest eingesetzt.
Hierzu werden zuerst auf einer Trägeroberfläche Schichten aufgetragen. Als Trägermaterial wird ein Licht leitendes Medium verwendet. Insbesondere ist hierfür Glas oder Kunststoff geeignet. Der Träger weist in einer besonders bevorzugten Ausführung zwei parallele Oberflächen auf.
Vorzugsweise wird als erstes eine Polymerschicht nach dem Verfahren wie in DE19816604 A1 beschrieben aufgetragen. Als nächstes wird erfindungsgemäß eine Schicht aufgetragen, die Substanzen mit Molekülstrukturen aufweist, welche den zu untersuchenden Analyten entsprechen oder ihnen ähnlich sind. Die Molekülstrukturen der aufgetragenen Substanzen weisen dabei geeignete Eigenschaften zur ausreichend spezifischen Detektion durch die Erkennungsstrukturen der später im Bindungstest der Probe zugegebenen Liganden auf. Die aufgetragenen Substanzen können dabei dem zu untersuchenden Analyten oder einem Derivat des Analyten entsprechen, wobei diese geeignete funktionelle Gruppen aufweisen, um an die Polymerschicht kovalent oder nicht- kovalent gebunden zu werden. Wenn nur ein Analyt detektiert werden soll, werden die entsprechenden Molekülstrukturen flächig aufgebracht. Bei mehreren zu untersuchenden Analyten erfolgt die Auftragung unterschiedlicher Molekülstrukturen ortsaufgelöst, z.B. in Form von Spots.
Zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens werden die zu untersuchenden Proben für den Bindungshemmtest vorbereitet. Dazu werden die Proben, falls notwendig, mit einer geeigneten Flüssigkeit verdünnt. Zur Untersu- chung von festen Proben werden die Analyte mit geeigneten Methoden (Extraktion, Lösung, Zerkleinern o. a.) in ein flüssiges Medium überführt. Anschließend werden definierte Volumina der flüssigen Proben mit den entsprechenden Liganden vorinkubiert. Als Liganden werden hier und im Folgenden Substanzen verstanden, die passende Erkennungsstrukturen für die ausreichend spezifi- sehe Erkennung und Bindung von zu untersuchenden Analyten aus der Probe aufweisen. Hierzu können z.B. Antikörper, Aptamere, Antigene, beschichtete Beads etc. verwendet werden. Die Liganden tragen erfindungsgemäß für die spätere Detektion geeignete Marker, die durch ein evaneszentes Feld angeregt werden können. Das können z.B. Fluoreszenzfarbstoffe, Quantendots o. a. sein. Die Vorinkubation der Probe wird entweder nach dem Erreichen des Gleichgewichts oder nach Ablauf einer vorher definierten Zeit beendet.
Sobald die Vorinkubation beendet ist, wird die vorbehandelte Probe in Kontakt mit dem beschichteten Träger gebracht. Besonders bevorzugt wird hierzu ein Durchflussverfahren verwendet. Dazu wird die Probe durch eine Durchflusszelle geleitet, in oder an der sich der beschichtete Träger befindet, so dass die Probe mit der beschichteten Oberfläche in Kontakt kommt. In einem Bindungshemmtest können die Liganden in der Probe über die freien Bindungsstellen an die entsprechenden Molekülstrukturen der auf der Trägeroberfläche aufgetragenen Substanzen binden. Nach Ablauf einer bestimmten Zeit kann die Inkubation durch Spülen des Trägers beendet werden.
Nach dem Ende der Inkubation wird durch den Träger mittels einer Totalreflektion Licht von einer geeigneten Lichtquelle geleitet. Besonders bevorzugt wird hierzu das Laserlicht verwendet, das z.B. von Leuchtdioden (LED), Laserdioden oder Laser erzeugt wird. Bei der Totalreflektion entsteht an der Phasengrenze ein evaneszentes Feld, durch das die sich an der Trägeroberfläche befindlichen Marker angeregt werden. Hierbei müssen der verwendete Marker und das verwendete Licht so aufeinander abgestimmt sein, dass eine Anregung erfolgen kann. Bei dieser Anregung emittiert der Marker das für ihn charakteristische Licht, das von einem Detektor erfasst wird. Als Detektor können insbesondere Photodioden oder CCD-Elemente verwendet werden. Um die Verfälschung der Messergebnisse durch die Messung von Fremdlicht zu verhindern, können zwischen dem Träger und dem Detektor entsprechende Filter platziert werden. Zur Leitung, Lenkung oder Strahlformung des auf den Träger einfallenden und am Detektor ankommenden Lichtes können zwischen der Lichtquelle und dem Träger und / oder zwischen dem Träger und dem Detektor zusätzlich Einkoppel- und Auskoppelelemente z.B. in Form von Spiegeln, Linsen oder Lichtleitern angeordnet sein. Die vom Detektor gemessenen Lichtintensitäten können nun ausgewertet und als Grundlage für die quantitative Bestimmung der zu untersuchenden Analyten dienen. Hierfür kann eine Auswerteeinrichtung, insbesondere ein Computer verwendet werden, so dass die Auswertung automatisiert erfolgt. Auch weitere Verfahrensschritte, wie die Probenvorbereitung und der Messvorgang können erfindungsgemäß von Automaten durchgeführt werden. In einer besonders bevorzugten Ausführung erfolgt das ganze Verfahren vollautomatisch.
Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren können unterschiedliche Analyten wie beispielsweise Hormone, Antibiotika, Pestizide, Pharmaka, Drogen und andere Moleküle oder Molekülkomplexe quantifiziert werden. Dabei können Flüssigkeiten unterschiedlicher Natur analysiert werden, wie beispielsweise Trinkwasser, Fruchtsäfte, Milch, Serum, Blutplasma, Urin und andere. Für jede konkrete Anwendung werden Liganden mit zu den jeweiligen Analyten passenden Erkennungsstrukturen, Substanzen für die Trägeroberfläche mit geeigneten Molekül- Strukturen sowie eine passende Probenvorbereitung gewählt. Die Flexibilität des Verfahrens ermöglicht seine Anwendung in unterschiedlichen Bereichen: von der Lebensmittelüberwachung über die Wasseranalytik bis hin zur klinischen Diagnostik.
Im Vergleich zu bekannten Verfahren können mit dem erfindungsgemäßen Ver- fahren mehrere diverse Analyten gleichzeitig in unterschiedlichen flüssigen Medien schneller, sensitiver und kostengünstiger detektiert werden.
Weitere Vorteile, Merkmale und Anwendungsmöglichkeiten der Erfindung werden nachstehend anhand der Ausführungsbeispiele mit Bezug auf die Zeichnungen beschrieben. In den Zeichnungen zeigen:
Abb. 1 : Das Prinzip des im erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Bindungshemmtests am Beispiel eines Immunoassays; dabei dienen die Antikörper 1 als Liganden für den Analyten 2; A: Im ersten Schritt erfolgt die Vorinkubation, bei der zur Probe, die den Analyten 2 enthält, der Antikörper 1 hinzugefügt wird; B: Im zweiten Schritt wird die Probe über den Träger 4 gepumpt; die Antikörper 1 können nun mit ihren freien Bindungsstellen an die modifizierte Oberfläche 3 binden; nach Beendigung der Inkubation erfolgt die Detektion. Abb. 2: Schematischer Aufbau einer möglichen Vorrichtung zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens: das Licht wird von der Lichtquelle 1 in den Glasträger 2 eingekoppelt und durch Totalreflexion innerhalb des Trägers 2 weitergeleitet; an der Trägeroberfläche, die mit entsprechenden Substanzen 3 zur spezifischen Detektion des Analyten beschichtet ist, entsteht oberflächennah ein evaneszentes Feld; die Probe kann über eine Durchflusszelle 4 mit der Trägeroberfläche in Kontakt gebracht werden; nach der Inkubation der vorbereiteten Probe erfolgt die Detektion des emittierten Lichts durch einen Detektor 5; dieser gibt die aufgezeichneten Messdaten an eine Auswerteeinheit 6 weiter.
Abb. 3: Kalibrierkurve für Progesteron in H-Milch; es wurden Progesteronkonzentrationen zwischen 0,009 bis 900 ng ml'1 gemessen (sechs Stufen); der Antikörper wurde mit einer Konzentration von 30 ng ml"1 in jeder Probe eingesetzt; es konnte eine Nachweisgrenze von 46 pg ml"1 erzielt werden.
Abb. 4: Kalibrierkurve für Progesteron in Frischmilch; es wurden Progesteronkonzentrationen zwischen 0,009 bis 900 ng ml"1 gemessen (sechs Stufen); der Antikörper wurde mit einer Konzentration von 30 ng ml"1 in jeder Probe eingesetzt; es konnte eine Nachweisgrenze von 56 pg ml-1 erzielt werden.
Abb. 5: Kalibrierkurve für Progesteron in Rohmilch; es wurden Progesteronkonzentrationen zwischen 0,009 bis 900 ng ml"1 gemessen (sechs Stufen); der Antikörper wurde mit einer Konzentration von 30 ng ml"1 in jeder Probe einge- setzt; es konnte eine Nachweisgrenze von 52 pg ml"1 erzielt werden.
Abb. 6: Kalibrierkurve für Testosteron in Rinderserum; es wurden Testosteron- konzentrationen zwischen 0,009 bis 900 ng ml"1 gemessen (sechs Stufen); der Antikörper wurde mit einer Konzentration von 30 ng ml"1 in jeder Probe einge- setzt; es konnte eine Nachweisgrenze von 309 pg ml"1 erzielt werden. Ausführungsbeispiele
Beispiel 1 : Detektion von Proqesteron in Milch
In diesem Ausführungsbeispiel wird das Hormon Progesteron in drei unterschiedlichen Milcharten (H-Milch, Frischmilch und Rohmilch) quantifiziert. Hier- bei wurden Nachweisgrenzen zwischen 46 und 56 pg ml"1 erzielt.
Verbrauchschemikalien wurden von Sigma-Aldrich und Merck KGaA bezogen. Das Hormon wurde als VETRANAL® Standard bei Riedl-de Haen Laborchemikalien GmbH & Co. KG gekauft. Der monoklonale IgGI Antikörper, Anti- Progesteron, wurde bei Achs Antibodies GmbH erworben. Der eingesetzte Flu- oreszenzmarker CyDye Cy5.5 wurde über Amersham Biosciences Europe GmbH bezogen. Das Aminodextran Amdex™ mit 40.000 Dalton Molekulargewicht wurde bei der Helix Research Company gekauft. Das Progesteronderivat zur Immobilisierung an der Trägeroberfläche wurde synthetisiert.
Das Grundgerät besteht aus einer 1 ml Hubkolbenspritze mit T-Ventil für das Cavro-Modul XL3000 von Tecan; einer Probenschleife, bestehend aus einem Teflonschlauch mit ca. 2 ml Gesamtvolumen von Ismatec; einem 6-Wege-Ventil mit einem Flusszellenschlauch (0,7 ml Gesamtvolumen) von Ismatec; einer Flusszelle aus Plexiglas mit gefrästem Flusskanal und Swagelok-Anschlüssen für Ein- und Auslass von Proliquid; einem bulkoptischen Träger aus BK7 Glas mit der Größe 60 x 14 x 1 ,5 mm von Desag, wobei die 45°-Anschrägung und Polierung von PE Applied Biosystems, vorgenommen wurde; einer modulierten Laserdiode mit einer Wellenlänge von 635 nm und 15 mW Leistung von Cohe- rent; sechs Polymerfasern mit einer Numerischen Apertur von 0,46; sechs Kantenfilter 680 AELP mit einem Durchmesser von 25 mm, einer Dicke von 4,5 mm und einer maximalen Transmission von 90% von Omega Optical; sechs Photodioden mit integriertem Vorverstärker OSI 5-100M/1 K und 50 M/2 K von Eurodis und eine Elektronik mit Lock-In-Verstärker.
Zur Probenvorbereitung wurde der Autosampier HTS PAL von CTC Analytics verwendet. Er besteht hauptsächlich aus einer beweglichen 1 ml Spritze, einer Waschstation, einem Inject/Load-Ventil (Valco) mit sechs Anschlüssen, einem Probenhalter für 98 1-ml-Proben und einem Probenhalter für fünf 10-ml-Proben. Das Softwareprogramm Cycle Composer steuert den Autosampier über einen separaten PC. Die Kommunikation der beiden PCs erfolgt über eine Relais- Karte. Der Autosampier mischt die Proben selbstständig und injiziert sie über das Valco-Ventil in die eigene Probenschleife (Teflonschlauch mit 960 μl, Isma- tec).
Zur Beschichtung des Glasträgers werden zwei verschiedene Verfahren verwendet, eines für die Einzelanalyt-Messungen und ein anderes für die Multi- Analyt-Messungen. Bei den Einzelanalyt-Messungen wird der Träger vollstän- dig beschichtet, wogegen bei den Multi-Analyt-Messungen eine ortsaufgelöste Modifizierung der Träger unter Verwendung eines Mikrodosiersystems benötigt wird. In beiden Fällen wird zunächst die Glasoberfläche gereinigt und aktiviert. Dazu werden die Glasplättchen 30 min in eine frische Piranha-Lösung gelegt und anschließend mit deionisiertem Wasser gut abgespült. Nach dem Trocknen im Stickstoffstrom wird der Träger mit 50 μl GOPTS belegt, ein zweiter darauf gelegt (Sandwichtechnik) und beide in einer trockenen Kammer gelagert. Nach 60 min werden die Träger zügig mit trockenem Aceton abgespült und im Stickstoffstrom getrocknet. Für die vollständige Beschichtung werden die aktivierten Träger mit 50 μl Aminodextran-Wasser-Lösung bedeckt und zusammenge- klappt (Sandwichtechnik). Über Nacht werden sie in einer Wasserdampfatmosphäre gelagert. Anschließend werden sie mit deionisiertem Wasser abgespült und getrocknet. Nun folgt die Umsetzung mit dem Derivat. Dazu wird ca. 5 mg des Derivats in wenig trockenem DMF gelöst und mit der 1 ,1 -fachen Molmenge DCC in DMF gemischt. Diese Lösung wird auf den Träger gegeben und wieder mit der Sandwichtechnik in einer mit DMF gesättigten Kammer mindestens 5 h gelagert. Danach werden die Träger erst mit DMF und dann mit deionisiertem Wasser abgespült.
Zur ortsaufgelösten Modifizierung wird der mit GOPTS aktivierte Träger mit einem Konjugat aus Derivat und Aminodextran mit Hilfe des Microdrop- Dosiersystem betropft. Der Spotdurchmesser beträgt 3 mm und der Abstand der Spots 6,5 mm. Das Konjugat wird aus dem Aktivester des Derivats und A- minodextran (40 kD) hergestellt. Dazu wird ca. 5 mg des Derivats in wasserfrei- em DMF gelöst und die 1 ,1-fache Molmenge an NHS und die 1 ,5-fache Molmenge DCC (jeweils in DMF gelöst) zugegeben. Zur Bildung des Konjugats wird das Aminodextran in einer Mischung aus Carbonatpuffer pH 9,5 und DMF (1 :1) gelöst. 0,125 Moläquivalente Aktivester werden zur AMD-Lösung zuge- fügt. Die Lösung wird über Nacht geschüttelt. Anschließend wird das Konjugat mit Methanol gefällt, gewaschen und gefriergetrocknet. Das Konjugat wird in deionisiertem und gefiltertem Wasser gelöst (2 mg ml"1). Mit dieser Lösung wird der Träger per Mikrodosiersystem betropft.
Der optische Aufbau des Gerätes besteht aus einer Laserdiode, die einen Ab- stand von ca. 2-5 cm vom Träger hat. Über die angeschrägte Kante des Glasträgers wird das Laserlicht in diesen eingekoppelt. Durch Totalreflexion wird der Strahl innerhalb des Trägers weitergeleitet. Die Reflexionspunkte befinden sich im Abstand von ungefähr 6,5 mm. An diesen Stellen entsteht oberflächennah in der Flusszelle ein evaneszentes Feld, in dem Fluoreszenzfarbstoffe angeregt werden können. Auf der Rückseite des Trägers leiten Polymerfasern die Fluoreszenz über Kantenfilter zu den Photodioden. Durch die eingesetzte Lock-In- Technik wird das Laserlicht moduliert, und nur die ankommende, entsprechend modulierte Strahlung wird detektiert.
Durch den HTS PAL Autosampier wird die Probe gemischt und in die Proben- schleife des Valcoventils injiziert. Danach pumpt die Spritzenpumpe die Probe langsam über die Durchflusszelle. Der Antikörper wird direkt vor der Messung zur Probe gegeben werden. Dies hat mehrere Vorteile: Erstens ist das Zeitintervall zwischen Mischen und Messung immer gleich, zweitens wird der Antikörper geschont, da er sich nur relativ kurze Zeit in eventuell aggressiven Matri- zes befindet, und drittens kann der Antikörper im Vorratsgefäß gekühlt gelagert werden, ohne dass der komplette Probenteller gekühlt werden muss.
Für die Berechnung von analytischen Qualitätsmerkmalen bei Kalibrierungen werden sämtliche Analytkonzentrationen mindestens dreifach gemessen und damit die Kalibrierung robuster dargestellt. Der Blindwert wird neunmal be- stimmt. Aus den erhaltenen Daten der Replika werden der Mittelwert, die Standardabweichung und aus denen der Blindwert-Messungen die Erkennungs- grenze bestimmt. Die Bestimmungsgrenze errechnet sich aus der zehnfachen Blindwertstandardabweichung. Die Wiederfindungsrate für Testproben ergibt sich aus dem Mittelwert der Replika-Messungen und dem wahren Wert.
Die Kalibration in verdünnter Milch (1 :10) resultierte in einem sechsstufigen Versuchsplan mit einer Progesteronkonzentration von 0,009 bis 900 ng ml'1 in Nachweisgrenzen zwischen 46 und 56 pg ml_"1 abhängig von dem verwendeten Milchtyp (H-Milch, Frischmilch und Rohmilch). Die erhaltenen Kalibrierkurven sind in Abbildung 3 (H-Milch), 4 (Frischmilch) und 5 (Rohmilch) dargestellt.
Basierend auf den Kalibrierkurven wurden Realproben vermessen. Hierbei wur- den die folgenden Analytkonzentrationen gefunden, wobei zu berücksichtigen ist, dass die Kalibration mit Frischmilch erfolgte, die bereits einen Progesterongehalt von etwa 1 ,0 ng ml'1 enthielt.
Figure imgf000011_0001
Beispiel 2: Detektion von Testosteron in Rinderserum
In diesem Ausführungsbeispiel wird das Hormon Testosteron in Rinderserum quantifiziert.
Verbrauchschemikalien wurden von Sigma-Aldrich und Merck KGaA bezogen. Das Hormon Testosteron wurde als VETRANAL® Standard bei Riedl-de Haen Laborchemikalien GmbH & Co. KG gekauft. Der monoklonale IgGI Antikörper, Anti-Testosteron, wurde bei Achs Antibodies GmbH erworben. Der eingesetzte Fluoreszenzmarker CyDye™ Cy5.5 wurde über Amersham Biosciences Europe GmbH bezogen. Das Aminodextran Amdex™ mit 40.000 Dalton Molekularge- wicht wurde bei der HeNx Research Company gekauft. Das Testosteronderivat (Testosteron 3-(O-carboxymethyl)oxim) zur Immobilisierung an der Trägeroberfläche wurde über Sigma-Aldrich bezogen.
Das Grundgerät und der optische Aufbau des Gerätes entsprechen dem im Beispiel 1 verwendeten System. Zur Probenvorbereitung wurde der Auto- sampler HTS PAL von CTC Analytics entsprechend der in Beispiel 1 beschriebenen Vorgehensweise verwendet. Für die Vorbereitung des Glasträgers wurde das in Beispiel 1 beschriebene Verfahren zur vollständigen Beschichtung für eine Einzelanalyt-Messung verwendet. Probenvorbereitung und Messablauf, sowie die Berechnung der analytischen Kenngrößen wurden entsprechend des Beispiel 1 durchgeführt.
Die Kalibration in Rinderserum resultierte in einem sechsstufigen Versuchsplan, wobei die Testosteronkonzentration von 0,009 bis 900 ng ml"1 gewählt wurden. Hierbei wurde eine Nachweisgrenze von 309 pg ml'1 erzielt. Die erhaltene Kalibrierkurve ist in Abbildung 6 dargestellt.

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zur quantitativen Bestimmung von in einer flüssigen Probe enthaltenden Analyten mit folgenden Schritten:
a. Inkubation der Probe mit geeigneten mit Markern versehenen Liganden, wobei die Marker als Folge einer Anregung durch ein geeignetes evaneszentes Feld Licht emittieren können, und die Liganden die zu quantifizierenden Analyten in der Probe ausreichend spezifisch erkennen und binden können;
b. Inkubation der im vorgehenden Schritt behandelten Probe mit einem mit geeigneten Substanzen beschichteten Licht leitenden Träger, wobei diese Substanzen die Liganden in der behandelten Probe ausreichend spezifisch erkennen und binden können;
c. Leitung des von mindestens einer Lichtquelle eingestrahlten Lich- tes durch den Träger mittels einer Totalreflektion, wodurch an den
Grenzphasen des Trägers ein evaneszentes Feld entsteht;
d. Detektion des als Folge einer Anregung durch ein evaneszentes Feld von den Markern emittierten Lichtes durch mindestens einen Detektor;
e. Quantitative Bestimmung von Analyten in der Probe basierend auf den an mindestens einem Detektor gemessenen Lichtintensitäten.
2. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass die flüssige Probe ein Lebensmittel umfasst.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei der flüssigen Probe um Trinkwasser, Fruchtsaft, Milch, ein Milcherzeugnis, Bier, Wein, Softdrink o.a. handelt.
4. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass die flüssige Probe eine physiologische Flüssigkeit umfasst.
5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei der flüssigen Probe um Serum, Blutplasma, Urin, Speichel, Sper- ma o.a. handelt.
6. Verfahren nach einem der vorgehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die flüssige Probe durch die Überführung der A- nalyte aus einer festen Probe in ein geeignetes flüssiges Medium erzeugt ist oder wird.
7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass die feste Probe ein Lebensmittel umfasst.
8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei der festen Probe um Babynahrung, Fisch, Fleisch, Ei, Obst, Gemüse, Getreide, Milcherzeugnis o.a. oder ein mindestens eins davon enthaltendes Produkt handelt.
9. Verfahren nach einem der vorgehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die zu quantifizierenden Analyte Hormone, Antibiotika, Pestizide, Pharmaka, Drogen o.a. sind.
10. Verfahren nach einem der vorgehenden Ansprüche, dadurch ge- kennzeichnet, dass die Liganden Antikörper, Proteine, DNA, RNA,
Aptamere, Beads, Antigene o.a. sind.
11. Verfahren nach einem der vorgehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Marker Fluoreszenzfarbstoffe oder / und Quantendots sind.
12. Verfahren nach einem der vorgehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die auf dem Träger aufgeschichteten Substanzen den zu quantifizierenden Analyten oder Derivaten der Analyte entsprechen.
13. Verfahren nach einem der vorgehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die auf dem Träger aufgeschichteten Substanzen vor dem Auftragen auf den Träger mit geeigneten funktionellen Gruppen modifiziert sind oder werden.
14. Verfahren nach einem der vorgehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Substanzen auf dem Träger flächig oder ortsaufgelöst aufgetragen sind.
15. Verfahren nach einem der vorgehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Träger zumindest zum Teil, vorzugsweise vollständig aus Glas oder Kunststoff besteht.
16. Verfahren nach einem der vorgehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Träger zwei parallele Oberflächen aufweist.
17. Verfahren nach einem der vorgehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass vor der Beschichtung mit den Substanzen min- destens eine Polymerschicht auf den Träger aufgetragen ist oder wird.
18. Verfahren nach einem der vorgehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Inkubation der Probe mit den auf dem Träger befindlichen Substanzen in einer Durchflusszelle erfolgt.
19. Verfahren nach einem der vorgehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Inkubation der Probe mit den auf dem Träger befindlichen Substanzen nach Ablauf einer bestimmten Zeit durch Spülen des Trägers mit einer geeigneten Flüssigkeit beendet wird.
20. Verfahren nach einem der vorgehenden Ansprüche, dadurch ge- kennzeichnet, dass als Licht ein Laserlicht verwendet wird.
21. Verfahren nach einem der vorgehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass als Lichtquelle eine Leuchtdiode (LED), Laserdiode oder Laser verwendet wird.
22. Verfahren nach einem der vorgehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass als Detektor eine Photodiode oder ein CCD- Element verwendet wird.
23. Verfahren nach einem der vorgehenden Ansprüche, dadurch ge- kennzeichnet, dass zwischen dem Träger und dem Detektor mindestens ein Filter angeordnet ist.
24. Verfahren nach einem der vorgehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass zwischen der Lichtquelle und dem Träger und/oder zwischen dem Träger und dem Detektor Einkoppel- und/ oder Auskoppelelemente, die der Lichtleitung, Lichtlenkung und/oder
Strahlformung dienen, angeordnet sind.
25. Verfahren nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei den Einkoppel- und/oder Auskoppelelementen um Spiegel, Linsen oder Lichtleiter handelt.
26. Verfahren nach einem der vorgehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Probenvorbereitung, die Lichtleitung, die De- tektion und / oder die Auswertung vollautomatisch erfolgen.
27. Vorrichtung zur quantitativen Bestimmung von in einer flüssigen Probe enthaltenden Analyten nach dem Verfahren nach einem der vor- gehenden Ansprüche mit:
a. mindestens einer Lichtquelle, die das zur Anregung von verwendeten Markern geeignete Licht ausstrahlt, und die derart zum Träger angeordnet ist, dass an seinen Grenzphasen eine Totalreflektion des Lichtes erfolgt;
b. mindestens einer Durchflusszelle, in der der Träger mit seiner mit
Substanzen beschichteten Oberfläche positionierbar ist;
c. mindestens einem Detektor zur Messung des durch die angeregten Marker emittierten Lichtes; d. ggf. einem Filter, der zwischen dem Träger und dem mindestens einem Detektor angeordnet ist;
e. ggf. der Lichtleitung, Lichtlenkung und / oder Strahlformung dienenden Einkoppel- und / oder Auskoppelelementen;
f. ggf. einer Auswerteeinrichtung, die insbesondere einen Computer aufweist.
28. Verwendung des Verfahren und der Vorrichtung entsprechend einem der vorgehenden Ansprüche in Lebensmittelindustrie, Wasseranalytik, der forensischen oder klinischen Analytik oder Diagnostik.
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