WO2006128442A1 - Verfahren und vorrichtung zur optischen charakterisierung von gewebe - Google Patents

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Thomas Freudenberg
Karl-Heinz Schönborn
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Definitions

  • the invention relates to a method for the optical characterization of human or animal tissue formed from cells and to an apparatus for carrying out the method.
  • fluorescence-based tumor diagnostics There are already several devices on the market that are based on the linear UV excitation with a xenon lamp. As a rule, autofluorescence intensity in characteristic wavelength ranges (Storz, Richard-Wolf GmbH, Olympus) is evaluated in front of a white light background image.
  • the inherent two- or more-photon absorption also causes a corresponding intensity dependence of the process: in a two-photon process, the yield is typically quadratically dependent on intensity, in a three-photon process of the third power of intensity, etc.
  • the three-dimensional spatial resolution of the method is based on two interlinked effects, which are described on the basis of the typically used laser systems:
  • the limitation results from the properties of the beam source and the optics used. This is described by the radius of the beam waist W 0 , which is approximately calculated for the frequent case of the fundamental mode radiation, which is hereby referred to as an example without limiting the generality of the inventive concept, as follows:
  • ⁇ is the wavelength of the radiation
  • f the focal length of the optics used
  • D the illuminated diameter when radiation enters the optics.
  • the diameter of the excitation region in the image plane of the optics can be adjusted, for example, by selecting the ratio f / D.
  • I 0 is the intensity in the focus of the excitation. This fact is characterized by the so-called Rayleigh length, which indicates at what distance from the focus the intensity has dropped to half.
  • the spot in which non-linear processes take place, is shaped as the waist of a Gaussian beam and comparatively elongated at not too large apertures.
  • a compact form of the excitation volume i. H. one in which the diameter of this volume and the extent perpendicular to the beam axis are approximately of the same order of magnitude.
  • the three-dimensional image is generated by scanning, as is usual with the methods mentioned.
  • inventive new methods and apparatus which are disclosed below, the restriction described in the aforementioned paragraph is repealed
  • a further limitation of previous methodologies limiting the use of non-linear fluorescence methodologies outside of clinical and biological research is the low volume of prior art methods because of the small size of the tissue volume examined. This is on the order of 500 x 500 ⁇ m lateral and 200 to 400 ⁇ m deep. On the one hand, as already described, the limitation is limited by the too high spatial resolution. On the other hand, the data volumes and rates, which are necessary for use in clinical diagnostics and early diagnosis of diseases, in particular tumorous type, in a real-time evaluation, limit the highly desirable clinical use of the methodology.
  • the present invention is based on the problem to provide a method and an apparatus for the optical characterization of tissue, which allows a more reliable differentiation of healthy and diseased tissue than previously possible.
  • the radiation emitted by the radiation source is imparted such an intensity profile transversely to its direction of propagation that the excitation region covers a plurality of lines of the tissue and the excited back radiation is due to cell-spreading tissue properties.
  • the method of the present invention provides the basis for an innovative fluorescent diagnostic, imaging, non-invasive tumor diagnostic method suitable for early detection and screening (in vivo and in vitro).
  • the method provides the characterization of the tissue or metabolic state and thus of pathological, especially tumorous changes with an oriented on the clinical objective statement and spatial resolution that is currently not available to the doctor.
  • Tissue state is determined from the supracellular averaging spectroscopic data and presented to the physician in a morphometric slice of several millimeters, which allows for evaluation of tumors for expansion, location and aggressiveness.
  • the patient benefits from improved early diagnosis and diagnostics. These procedures can be used to avoid or, in the case of localization of early stages, to be significantly reduced by minimally invasive methods.
  • Health insurance saves on treatment costs by two-thirds less costs than previously unavoidable biopsies and a significant reduction in the number and severity of surgical interventions. Unless surgical intervention can be avoided or replaced by minimally invasive methods such as PDT (Photo-Dynamic Therapy), the severity of the procedure and its healing and aesthetic effects are significantly reduced because the distinction between healthy and diseased tissue can be significantly more accurate as before.
  • PDT Photo-Dynamic Therapy
  • the novel method can also be used for other measuring and characterization tasks.
  • all specifics are shown below using the example of the fluorescence diagnosis of tumors without wishing to restrict the generality and breadth of the inventive concept.
  • ENT, gynecology further areas of application in the field of accessible body cavities (ENT, gynecology) and endoscopically accessible internal body (gastro-entereology, urology, bronchoscopy) are part of the field of application of the invention.
  • actinic keratosis a disease induced by additive UV exposure, which may develop into skin cancer, squamous cell carcinoma, and b) HPV virus-induced genital genital warts, "condylomas”, not only in women cervical cancer, but can also induce cancers of the anogenital region in both men and women.
  • method according to the invention advantageously fulfills the medical-diagnostic process requirements for a spatially resolved diagnosis embedded in the morphological framework of the examination area, the dimensions of which, according to the clinical experience, should not fall below 4 mm lateral and 0.5 mm in depth.
  • the impressing of the intensity profile consists of imaging the radiation into the tissue via an objective.
  • the objective has a numerical aperture of approximately 0.3 to 1.5.
  • the impressing of the intensity profile is to divide the radiation emitted by the radiation source into at least two partial beams, wherein the excitation range is determined by the position of the partial beams.
  • the partial beams are each focused into the tissue such that the focal points for the partial beams are at a distance from one another.
  • the basic idea of this development of the invention is that a plurality of partial beams differing in their direction are formed from the excitation beam generated by the beam source. With a focusing optics arises in the focal plane according to the number and arrangement of the partial beams, a bundle of foci. If the distance thereof in the focal plane is set appropriately, then along the propagation direction of the excitation radiation there results a limitation of the multiphoton excitation region which is at least approximately independent of the number of partial beams.
  • the reflection is a fluorescence signal, for example a two- or more-photon fluorescence.
  • the excitation is carried out with short-wave UV or blue light, whereby by extinction by overlying non-metabolically active necrosis tissue, a "false negative" findings can be made, or in tumor spread under the healthy skin, the actual spread and thus the determination of tumor size is misjudged.
  • the subcellular resolution of the conventional methods does not permit determination of the correlation between the fluorescence spectra of endogenous fluophors and the pathological states of corresponding cell areas.
  • Multiphoton microscopy has become an effective tool in cell biology research. The clinical use for Tomorstaging is not their actual field of application.
  • the fluorescence spectroscopic, spatially resolved functional diagnosis is involved in a morphological representation of the study area.
  • the radiation emitted by the radiation source is divided by coherence reflectometry into an excitation beam for excitation of fluorescence in the tissue and a reference beam for additional characterization of the tissue, the excitation beam partly reflecting back from the tissue and the reference beam reflecting the reference beam back from the tissue Radiation is superimposed.
  • the intensity profile impressed on the radiation emitted by the beam source has a characteristic profile with at least two intensity maxima.
  • This "fingerprint" of the beam can be used to equalize the optical path lengths for the reference beam and the reflected beam
  • the optical path length for the reference beam is set in an advantageous manner so that the intensity distribution imprinted on the radiation emitted by the beam source is In this case, the optical path length for the reference beam corresponds to the optical path length traveled by the excitation beam from the beam source to the focus and back to the interference detector.
  • the inhomogeneous refractive index of the material influences the location of the multiphoton excitation and the signal optical coherence reflectometry in different ways: In the path of the excitation light, the refractive power goes to the location the stimulation (focus) in the depth of the material only once. If the backscattered signals are detected by the method of optical coherence reflectometry, the refractive index of the beam path enters twice, as the light has to penetrate the material on the way back and forth. Thus, for the desirable combination of multiphoton excitation and optical coherence reflectometry, the spatial association with one another, in particular along the propagation direction of the excitation radiation, is absent.
  • That the structured excitation beam is focused by means of suitable optics into the target to be excited or to be examined,
  • the basic idea of the invention is that a structure is impressed on the excitation beam which emerges only in the focus - that is, at the location of the multiphoton excitation - or changes with the propagation length such that a detectable change in the vicinity of the focus occurs Structure or more precisely their image emerges.
  • the interference of the backscattered light in a plane optically conjugate to the excitation plane will exactly have an image of this structure.
  • the reference beam path can now be adjusted in its length until the structure to be expected in the interference pattern emerges. This is the indicator for the superposition of the location of the multiphoton excitation with that of the morphological scanning by means of optical coherence reflectometry.
  • the characteristically different fluorescence curves of tumorous and normal tissue allow a tissue diagnosis with significant selectivity and specificity.
  • the tissue is scanned at a supratellar focus size suitable for the procedure so that a local assessment of the tissue metabolism in real-time in useful resolution becomes possible.
  • the size of the scanning focus is decoupled from the size of the "scan volume" to be assigned to a scan point, thereby eliminating unfavorable restrictions according to the present invention in the case of the previously known optical diagnostic methods
  • spectral fingerprint describes the metabolic status, the degree of neovascularization or the structuring status of the considered tissue area largely independent of disturbance variables and enables an automatic preopathological assessment.
  • the beam source is thus used for both multiphoton excitation and optical coherence reflectometry. If necessary, the spectral properties of the source should be designed so that it allows the desired depth resolution (resolution along the radiation propagation).
  • This radiation is split into an excitation beam and a reference beam with a partially transmissive mirror. Both beams can still be provided with modulators that temporally modulate the intensity but not the optical path length.
  • a particularly preferred variant of the method provides that a) the irradiation of the tissue with radiation takes place in the wavelength range of 720-800 nm, whereby a two-photon fluorescence is excited in the tissue; b) detecting the intensity of a first fluorescence signal at a wavelength of 460 + 30 nm and a second fluorescence signal at a wavelength of
  • step c) determining the ratio of the intensities of the first and second fluorescence signals; and d) generating a signal in dependence on the ratio determined in step c).
  • the wavelength range at 460 ⁇ 30 nm is significant for NAD (P) H and the wavelength range at 550 + 30 nm is significant for flavins.
  • the formation of the ratio of the measurement values from (a) and (b) serves to refer the interfering factors and obtain an activity signal for the metabolic activity that differs significantly between normal and pathological tissue volumes of the same kind.
  • a further, preferred variant provides that a) the tissue is irradiated with radiation in the wavelength range between 500-550 nm, and b) a first intensity of two-photon fluorescence at a wavelength of 340 ⁇ 40 nm (significant for tryptophan ) is detected; c) the tissue is irradiated with radiation in the wavelength range between 720-800 nm, and d) a second intensity of two-photon fluorescence at a wavelength of
  • Another, preferred variant of the method provides the steps: Excitation of the two-photon fluorescence in the wavelength range 720-800 nm and measurement of the fluorescence signal at 460 ⁇ 40 nm [significant for NAD (P) H] as a function of the tissue depth z,
  • the method may include:
  • the focused beam is moved through the tissue by means of a suitable (scanning) device.
  • the aim is in particular the detection of tumors in the early stage ("carcinoma in situ") and the demarcation against advanced stages (immigration of micro vessels, breaking the basement membrane, loss of tissue structure) b) Dissolution of the structure is recognized by the locally differing content of elastin and / or collagen c) The breakthrough of the basal membrane is recognized by the absence of the optic disc structure through image analysis to suppress disturbances and compensate for the effects of unknown scaling on the one hand the measuring arrangement and on the other hand of the biological materials in the excitation and measuring beam path is worked with a referencing of the measurement signal, in which the measurement data of at least two significant substances are used, in particular the substance groups NAD (P) H, flavins and tryptophan.
  • NAD substance groups
  • the doctor is shown a morphological image of the examined tissue area on the monitor. This is based on the evaluation of the signals of the structure molecules (elastin and / or collagen) and the direct reflection of the excitation radiation (surface reflection and scattering amplitude).
  • the areas of alternating metabolism are displayed in the monitor image in false color representation.
  • the device consists of an operating unit with mains supply, controls integrated computer and monitor connected and the handpiece with focusing optics and scanner for the excitation radiation and the elements for collecting the measuring radiation (reflected and scattered at the excitation wavelength, SHG radiation at half Excitation wavelength and fluorescence radiation).
  • the excitation radiation is supplied either by means of fiber optics, preferably as photonic fibers, or an articulated arm. In this case, elements of the delivery optics for the fluorescence excitation radiation can also be used to collect the measurement radiation.
  • optical ultrasound in the analogous to imaging medical ultrasound pronounced scanning methodology (optical ultrasound") fixed in relation to the handpiece scanning vertically placed in the tissue and the doctor, as usual in ultrasound moves through the tissue with the additional information mentioned (“fingerprint” with automatic rating) is displayed in real time on the screen.
  • the handpiece In high-resolution operating conditions, where the manual positioning accuracy is insufficient or the unrest caused by the involuntary movement of the hand is too great for the method, the handpiece is firmly seated and the displacement of the scanning plane is carried out by electromotive or micromechanical actuators.
  • a laser in particular a pulsed laser
  • a possible source of excitation which works with pulses in the picosecond range, also allows the generation of broadband light for excitation in several colors by the use of a photonic fiber.
  • Such a light source has hitherto been used neither in fluorescence-based tumor diagnosis nor in multiphoton microscopy.
  • the method differs from the known diagnostic methods in that it assesses and displays the dignity of the tissue condition in a three-dimensional scan image of the skin.
  • the resolution is chosen such that, depending on the tissue depth considered, a number of approximately 20 to 200,000 cells contribute to the local signal.
  • the combination of the fluorescence method with an OCT system provides a 3D-OCT because of the three-dimensional scan, so that simultaneously the same volume of tissue ("scan volume”) is evaluated for its dignity at a useful resolution and, on the other hand, morphologically mapped therefore obtains a complete three-dimensional image of the tissue and its assessed metabolic status.
  • the beam is moved laterally in x and y direction (beam axis is selected in z-direction) at high speed, whereby the fluorescence from a large number of excitation pulses can be compactly used to an object point.
  • a resonant control can be provided here.
  • the mechanical resonance frequency of the mirror arrangement is determined by suitable selection of the torsion spring moment and the moment of inertia so that the desired oscillation frequency is produced. Exactly with this resonant frequency is stimulated excited with an electric or magnetic field. This creates a sinusoidal oscillation of the mirror and a corresponding movement of the focus in one axis.
  • the resonant frequencies of the two mutually perpendicular oscillation axes are designed in different torsional and inertial moments, so that two different resonant frequencies occur in both axes x and y, thereby designing the low-frequency axis. that the oscillation takes place approx. 6 to 15 times slower than in the higher-frequency direction.
  • the scan spot moves with a Lissajous figure over the object field in the x and y direction and scans this field approximately equally.
  • This resonant excitation in one axis or in two axes will be referred to as "asynchronous biaxial harmonic driving.”
  • distractions using the Pockels or Kerr effect are possible.
  • phase modulation of a reflex with the aid of a micromechanical actuator.
  • a field of free-swinging mirrors is generated micromechanically, which are suspended in each case in 3 or 4 tab points.
  • the carrier tapes of these individual and mutually identical phase actuators are made uniform and have a small thickness compared to the width. As a result, they can be deflected perpendicularly to the mirror surface without tilting, so that their position is maintained parallel to the rest position even when deflected.
  • an electrode field is mounted so that in the x-y direction per mirror elements there is an electrode positioned underneath.
  • the mirrors themselves also receive a conductive contact surface on the underside.
  • an up and down movement of the mirror elements without torsion is achieved via electrostatic forces.
  • an effective The altitude of each individual point can be controlled singularly. This allows for a reflection of a phase shift, which can be set location-dependent.
  • the deflection of the mirrors must be only 200 to 750 nm for their optimal effectiveness at a common wavelength in the visible range (400-1500 microns) for a complete phase cancellation. This can be ensured by a suitable design of the carrier straps without problems.
  • the conditions are set in each partial beam such that the desired intensity of the excitation radiation is achieved with the optics selected in the focus and that the partial beams are adjusted such that each of them with the selected focusing optics one formed by the foci of the other partial beams separate focus in the image plane of the optics. Furthermore, the spacing of these at least two foci in the image plane is set in such a way that their superposition along the propagation direction of the excitation radiation, in particular in the vicinity of the focus of each subbeam, does not exceed a selectable fraction of the intensity of the excitation radiation in focus.
  • optical element for division into the desired number of partial beams is performed as an actuator, that the number of partial beams and the
  • Distance of their foci can be selected that with a suitable optical element, the intensity of the partial beams or the total beam can be adjusted such that a suitable value can be set for the intensities in the focus of each partial beam in accordance with the requirements of the two- or multi-photon excitation process,
  • optical element for dividing into the desired number of partial beams or an additional optical element allows a time-variable deflection or arrangement of the partial beams, in the image plane of the objective a corresponding variation over time of the excitation area or parts thereof allows
  • the resulting temporal change of the excitation area is used to compensate for the gaps in the excitation area in the focal region resulting from the arrangement of the partial beams.
  • a device performs a scanning movement by moving the focus of the laser laterally and in depth through the tissue and compensating for the attenuation of the beam in the tissue by means of an intensity control and keeping the intensity in focus constant. For safety reasons, it must be required that, on the one hand, a single pulse does not cause any damage. On the other hand, the superimposed effect of the subsequent pulses and the energy accumulated in tissue during use should not lead to damage.
  • the characteristic quantities here are the volume density of the absorbed pulse energy and the absorbed pulse peak power in the focus volume. Heat conduction processes can be disregarded.
  • the absorbed energy of the individual pulses is to be related to the volume swept by the scanning movement. In the event that the excitation volumes of the individual pulses overlap, this can lead to a higher load than by a single pulse.
  • both the absorption and scattering properties of the tissue must be considered.
  • the cross-section for scattering processes is one to two orders of magnitude higher than that for the absorption of light.
  • an absorption coefficient of 4 cm -1 for the pure absorption and 5 cm -1 is given as the effective cross section for the combination of absorption and scattering.
  • the penetration depth (decrease in intensity to 1 / e) is estimated at 4 mm.
  • the measuring spot is moved laterally through the tissue at a fixed depth, before the next "line” is measured at a new depth, the superimposed effect of the pulses in the depth can not be estimated adiabatically.
  • a diffusion of the heat into a larger volume takes place, so that the superimposed effect of two sagittally adjacent pulses is far exceeded by the joint effect of all pulses considered in the following section.
  • Control b The scanning process is stopped so that the following pulses hit the same place repeatedly.
  • Error handling The most important measure against the two inadmissible operating states a) and b) is provided in the design and system layout a fast monitoring electronics, which constantly checks the normal operation and eye-safe contact of the applicator on the skin and which in turn independent of the Control electronics of the device works. As soon as the monitoring electronics detects an error, it shuts off the laser source. This eliminates the danger. As an additional measure, in the case of a) a hardware limitation in the laser is used, which prevents an energy release beyond certain values.
  • the probability of occurrence of the errors is reduced by electronic measures and the independent monitoring electronics to an acceptable value (exact definition can only be specified when the system is created).
  • a failure of the scanning movement means that a maximum temperature of 50 ° C on the axis of the laser beam is set to a depth of about 4 mm. Consequently, a failure of the scanning movement without shutting off the laser leads to a painful irritation in the patient. This covers with self-experiments, in which these radiation conditions on sensitive skin regions (Ellenbeuge) were perceived as "pinpricks".
  • Fig. 1 shows schematically a device for optical tissue characterization according to a first embodiment of the invention
  • FIG. 3 schematically shows an apparatus for optical tissue characterization according to a second embodiment
  • FIG. 4A, 4B schematically show third and fourth embodiments of a device for optical tissue characterization
  • FIG. 5 shows a fifth embodiment of a device for optical tissue characterization
  • Fig. 6 is a graphic representation of a result of a fluorescence measurement
  • FIG. 7 Graphical representation of the intensity of a stimulated in a tissue
  • FIG. 8 Graphical representation of the intensity of a tissue excited
  • FIG. 9 shows a sixth embodiment of a device for optical tissue characterization
  • FIG. 1 shows a device for the optical characterization of a human or animal tissue 1.
  • the light of a laser 2 typically used for the triggering of multiphoton processes is irradiated with a beam splitter 3 into partial beams 4a. 4b, 4c split.
  • a beam splitter 3 into partial beams 4a. 4b, 4c split.
  • each partial beam can be applied with the maximum permitted intensity. According to the number of selected sub-beams then grows the expected fluorescence signal over that of a sub-beam.
  • the spatial limitation of the excitation region along the propagation direction of the excitation beam and thus the process resolution can be maintained largely unchanged.
  • FIG. 2 shows, for the selected case of the superposition of nine partial beams of the same intensity, the dependence of the normalized intensity profiles in the center of the beam on the axis of the propagation direction of the beam Radiation in multiples of the Rayleigh length of a partial beam.
  • the focal plane z is set to zero.
  • the solid line A shows the course for a partial beam.
  • the dotted line B shows the intensity profile for a beam with the same peak intensity as in A, but - by appropriately selected aperture - with the same total energy as the nine partial beams.
  • This curve has a much slower decay of the intensity along the propagation direction. This means that the excitation region in this axis would be significantly extended.
  • the superimposition yields somewhat higher intensities in the focus itself and the excitation area is significantly increased along the direction of propagation. This can be seen, for example, by taking the point of fading to half the focus intensity as a measure.
  • the intensity has fallen approximately the same distance from the focus to the half as in the case of a beam with the same waist.
  • the choice of the most favorable distance of the foci may depend on their arrangement in the focal plane of the objective, its number and the characteristics of the excitation radiation. Preferably, a distance in the size of 2.5 to 15 times the waist radius of a single beam is selected.
  • FIG. 3 shows a device in which a laser beam source 2 is used both for the multiphon excitation and for optical coherence reflectometry. If necessary, the spectral properties of the source should be designed so that it allows the desired depth resolution (resolution along the radiation propagation).
  • This radiation is divided into an excitation beam AS and a reference beam RS with a partially transmissive mirror 71. Both beams can still be provided with modulators that temporally modulate the intensity but not the optical path length. Such an arrangement is not shown.
  • the excitation beam AS is impressed transversely to the direction of propagation in the structuring unit 3 by a structure which, due to the focusing, emerges in high contrast only in the vicinity of the focal plane of an objective 5 within the target.
  • a holographic element or microlens or micro-prism arrangements can be used for this unit.
  • FIG. 3 as a possible embodiment of such an arrangement, the division into three sub-beams 4a, 4b, 4c is shown, which form closely adjacent foci in the target 1 (tissue). Outside the focal plane, the contrast between the foci decreases as a result of the mixing of the partial beams.
  • the thus structured excitation beam AS can be moved relative to this with a scanner 6 for location-specific excitation of the target 1.
  • the structured excitation beam AS illuminates the interior of the target 1, scattering takes place at structural boundaries.
  • the backscattered portion passes through the lens 5, where it is again collimated, and optionally the scanner 6, which reverses the scanning beam movement.
  • the scanner 6 which reverses the scanning beam movement.
  • this light originating from the depth of the target 1 passes into interference detector 20 (e.g., a CCD camera) for interference with the reference beam RS.
  • interference detector 20 e.g., a CCD camera
  • the optical path length of the reference beam RS can be changed via a movable mirror device 19 (the direction of movement is indicated by the double arrow M). If one observes the interference spatially resolved, then one will observe a particularly high-contrast interference pattern, if the optical path length of the reference beam exactly corresponds to the beam path of the excitation light to the focus and the backscattered back to the place of superposition.
  • the interference pattern will show the image of the structure impressed on the excitation beam. This is the indicator that coherence reflectometry is the focal area of excitation.
  • FIG. 3 shows two or more photon microscopy as a possible application.
  • the multiphoton fluorescence is detected by means of the dichroic beam splitter 72 and the receiver 8 summarily from the focal regions of all three partial beams. Equally possible, however, are arrangements which make it possible to detect the fluorescence signals of only a selected partial region.
  • FIGS. 4A, 4B show the principle of a serial device for optical tissue characterization. After the excitation by focused IR laser pulses ( ⁇ fs to ps) (arrow P), the light emitted by the sample / tissue is detected with a spectrometer 1 1.
  • This spectrometer can be designed to simplify the evaluation and to improve the collection efficiency of the reflected light as a polychromator with relatively low spectral triggering and wide spectral windows. In the latter case, the convergent lens in front of the polychromator 11 may possibly be omitted.
  • the position of the focus 51 is uniquely determined.
  • the depth assignment can be calibrated on a suitably prepared object.
  • the intensity is varied during the depth scan to compensate for the attenuation of the excitation light when focusing into deeper areas of the tissue.
  • the control is based on physical effects, which are triggered independently of tissue as a function of the excitation intensity in the focus and thus compensate for the weakening in different tissue types. In this way, disturbing self-focusing and quantitative UV conversion in the tissue are avoided.
  • the relative movement between the beam and the focus is shown only in two coordinates (x lateral, z in the tissue depth), without limiting the generality.
  • the second lateral axis y can additionally be traveled in one of the ways indicated.
  • FIG. 4B The principle of the arrangement of FIG. 4B corresponds to that of FIG. 4A, with the difference that the sample can be moved with a positioning unit 12 relative to the focusing lens in order to be able to measure different points of the sample. Furthermore, a spectrometer or polychromator (see corresponding remark to FIG. 4A) 11 a is arranged, which enables time-resolved measurements and is connected to an evaluation unit 13.
  • the arrangement of Fig. 4B is particularly suitable for in vitro studies, such. Cell cultures, excised tissue samples or pathological preparations.
  • FIG. 5 shows a further variant of an apparatus for optical tissue examination with combined fluorescence and OCT system.
  • the principle of this system has already been explained with reference to FIG.
  • the apparatus is not one Spectrometer equipped, but is operated with a plurality of discrete sensors 15a, 15b, which use by filtering by means of upstream filters 16a, 16b spectral partial signals of the fluorescence spectrum.
  • the filters 16a, 16b are not simply line, band or edge filters. Instead, at least partially complex graduated filters are used, which are calculated and produced according to an evaluation function.
  • the following device parameters can be used to determine the targeted specific measurement results for the evaluation in a 50 ⁇ m lateral, sagittal, and 2 Hz repetition rate on a 1.5 x 4 mm 2 section :
  • the apparatus according to FIG. 5 works with non-linear fluorescence excitation. This for the following reasons:
  • a sufficient penetration depth is only possible within the "IR window" of about 750 to 900 nm.
  • FIG. 6 shows an evaluation of the non-linearly excited emission measurements on 26 samples, of which 11 represent healthy and 15 diseased tissue.
  • the ordinate plots the position of a characteristic wavelength ( ⁇ Char ) calculated from the spectrum, and the abscissa plots the intensity ratio at two fixed wavelengths V ( ⁇ i / ⁇ 2 ).
  • the broken line G represents a limit curve. It can be seen that basaliomas can be distinguished from normal skin.
  • FGI fluorescence optical tissue indicator
  • FIG. 7 shows a conventional fluorescence spectroscopic examination (UV-induced autofluorescence with one-photon excitation) of different types of tissue (sclera with solid line or epithelial tissue shown with a dashed line). It can be seen from the spectrum that no significant spectroscopic differences exist. This is not surprising since the substances considered in this context differ only very little in their molecular structure. Experience has shown that no specificity can be expected from the broad absorption bands and the statistical averaging.
  • FIG. 8 shows the result of a nonlinear excited spectroscopic examination of the different types of tissue. In contrast to Fig. 7, there are significant differences.
  • the FGI is detected with a spatial resolution averaging over the volume (focussing volume) of 20 to 200,000 cells.
  • the fluorescence-optical tissue indicator is a supracellularly averaged quantity which describes the tissue, and not a parameter for a cell organelle or specific cell compartments. Only this determination allows a temporal evaluation in real time, without fixation of the patient over long periods of time by data reduction to an extent appropriate to the purpose of diagnosis.
  • the intensity values of the fluorescence radiation can be determined and correlated at two or more significant indicator or reference wavelengths.
  • the desired speed of the evaluation can be achieved and gain the opportunity to evaluate in real time both the measurement signals, as well as the good / bad decision to make, and to represent the result in the OCT image.
  • a) the decay behavior, d. H. the temporal component of fluorescence emission, and b) the influence of the fluorescence excitation wavelength are taken into account.
  • the time course can be evaluated by electronic gating.
  • Optional additional procedures in combination with the described new method, allow the acquisition of additional information useful to the physician.
  • this is the possible combination with an OCT procedure, which is not necessary for the specificity of the requested new procedure, but which gives physicians supplementary morphological information that facilitates their further treatment.
  • FIG. 9 shows a further embodiment of a device for optical tissue examination.
  • a laser source (not shown) is connected to a measuring head 31 via a glass fiber 30. Via the glass fiber 30 and the measuring head 31, the laser light can be moved up and away from the tissue to be examined. Thus, similar to an ultrasound examination, a wide area of tissue can be optically "scanned.” The backscattered or tissue-excited light is conducted via the optical fiber 30 into an integrated evaluation unit which generates image information about the tissue from the determined data integrated screen 40 is displayed.
  • an OCT system can be integrated that works synchronously and spatially congruent with the fluorescence system. This can be achieved with relatively little expenditure on equipment, since the optics, the scanner, the laser source and the signal path of the fluorescence system can be used.
  • this OCT provides the morphological structure of those tissue volumes for which the stated information on deviating metabolism is determined by fluorescence optics.
  • this information can be assigned directly to the morphological tissue image. From the geometric assignment to the measuring head, an image is generated that is based on tissue structures. The doctor receives a statement in which tissue-morphologically characterized areas in the tissue are the critical areas with conspicuous metabolism.
  • the hallmark of the apparatus is a medical device suitable for everyday practice or clinical use for efficient, safe and reproducible tumor diagnostics. The principles of action, methods and algorithms used for this purpose are determined by the medical diagnostic objective. This concerns, for example, the issues of single or multi-color excitation and the spectral and temporally resolved detection of fluorescence. From clinical practice, the dimensions of the diagnostic field of observation follow: a depth resolution of 0.5-1.5 mm, sectional representations with several millimeters edge length (eg 4 mm).
  • An essential characteristic for the diagnostic interpretation is the combination of the fluorescence optical data with morphological information, because only As a result, for example, the carcinogenic penetration of the basal membrane is recognizable.
  • the method of the OCT or the extraction of corresponding fluorescence signals is used according to the invention.

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur optischen Charakterisierung von aus Zellen gebildetem menschlichem oder tierischem Gewebe mit den Schritten: - Bereitstellen einer Strahlquelle zum Aussenden gerichteter elektromagnetischer Strahlung; - Bestrahlen des zu charakterisierenden Gewebes mit der Strahlung, wodurch im Gewebe eine für das Gewebe charakteristische Rückstrahlung erzeugt wird, wobei - die in das Gewebe eingedrungene Strahlung innerhalb eines sich quer zu ihrer Ausbreitungsrichtung erstreckenden Anregungsbereiches eine ausreichende Intensität aufweist, um im Gewebe eine charakteristische Rückstrahlung anzuregen. Erfindungsgemäß wird der von der Strahlquelle ausgesandten Strahlung ein derartiges Intensitätsprofil quer zu ihrer Ausbreitungsrichtung aufgeprägt, dass der Anregungsbereich eine Mehrzahl von Zellen des Gewebes überdeckt und die angeregte Rückstrahlung auf zellübergreifende Gewebeeigenschaften zurückgeht. In einem zweiten Aspekt betrifft die Erfindung ein Verfahren, bei dem die von der Strahlquelle ausgesandte Strahlung quer zur Ausbreitungsrichtung periodisch so abgelenkt wird, dass die Strahlung einen Bereich des Gewebes um die Messstelle herum periodisch abtastet, der sich über eine Mehrzahl von Zellen des Gewebes erstreckt. Des Weiteren betrifft die Erfindung Vorrichtungen zur Durchführung der Verfahren.

Description

Verfahren und Vorrichtung zur optischen Charakterisierung von Gewebe
Beschreibung
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur optischen Charakterisierung von aus Zellen gebildetem menschlichem oder tierischem Gewebe sowie eine Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens.
Die Diagnostik epidermaler, kutaner, adnexaler und mukosaler Veränderungen erfolgte bis zum Ende des 20. Jahrhunderts überwiegend klinisch. Seit den 80er Jahren haben sich durch die rasante Entwicklung der Technik, vor allem der Rechentechnik, eine Reihe bildgebender Verfahren in der Dermatologie etablieren können.
Von spezieller Relevanz ist dabei die Fluoreszenz-basierte Tumordiagnostik. Hier sind bereits mehrere Geräte auf dem Markt, die auf der linearen UV-Anregung mit einer Xenonlampe basieren. Ausgewertet wird in der Regel die Autofluoreszenzintensität in charakteristischen Wellenlängenbereichen (Storz, Richard-Wolf GmbH, Olympus) vor einem Weißlicht-Hintergrundbild.
Insbesondere wird von der Arbeitsgruppe H. van den Bergh untersucht, wie durch eine sequenziell mehrfarbige Anregung, Lebensdauerauflösung und spezielle Datenauswertung eine erhebliche Verbesserung der Diagnose erzielt werden kann [H. van den Bergh, Med. Laser Appl. 18 (2003)1 , 20 und darin zitierte]. In allen Fällen liegt die laterale Auflö- sung im Sub-Millimeter-Bereich. Eine Differenzierung in der Tiefe ist aus prinzipiellen Gründen nicht möglich.
Dem Ziel, eine dreidimensionale Fluoreszenz-Darstellung des Gewebes mit akzeptablen Lichtausbeuten zu realisieren, kam man erst mit der Multiphotonen- Fluoreszenzmikroskopie näher (W. Denk, J. H. Strickler, W.W. Webb, "2-Photon laser scanning fluorescence microscopy," Science 248 (1990), 73-76). Bei diesem Verfahren wird die ortsaufgelöste Fluoreszenzdetektion der konfokalen Mikroskopie, die sehr geringe Fluoreszenzsignale und damit niedrige Abtastraten bedingt, durch die Lokalisierung mittels einer Multiphotonenanregung ersetzt. Außerdem können bei diesem Verfahren Wellenlängen im so genannten optischen Fenster des Gewebes (700nm - 1000nm) für die Anregung eingesetzt werden. Der Fokus der Forschungen auf diesem Gebiet liegt seit dem Beginn der Arbeiten auf der räumlich aufgelösten Darstellung der Konzentrationen verschiedener Biomoleküle im zellulären und subzellulären Bereich (Übersicht W. R. Zipfel et al Nature Biotechnology 21 (2003), 1 1 , 1369-1377 und darin zitierte).
In das Feld der Multiphotonen-Mikroskopie (-Tomographie) ordnen sich auch die aktuellen Arbeiten der Gruppe von Prof. Karsten König ein (K. König et al J. Biomed. Opt. 8 (2003) 3, 432-439). Die mit einer Ortsauflösung im Sub-Mikrometerbereich dargestellten intrazellulären Strukturen erlauben Aussagen bezüglich Zellteilung und Stoffwechselverhalten einzelner Zellen und damit eine Therapiekontrolle, nicht jedoch die Untersuchung ausgedehnter Gewebsareale. Die diagnostischen Ansätze auf der Basis der Multiphoto- nenmikroskopie gehen von der Interpretation der intrazellulären Stoffwechselvorgänge und der zellulären Struktur aus.
Für die in relevante ortsaufgelöste Darstellung auf der Basis fokussierter Fluoreszenzanregung kann als Stand der Technik auf die seit langem etablierte konfokale Fluoreszenzmikroskopie verwiesen werden. Sie liefert horizontale Schnittbilder mit einer Auflösung im Bereich der verwendeten Wellenlänge. Die Vorteile der Zweiphotonenanregung bei diesem Verfahren, namentlich durch Anregung im .optischen Fenster', sowie deutlich bessere Ortsauflösung auch in streuendem Gewebe wurden diskutiert und demonstriert [Review: W. R. Zipfel, R. M. Williams, W. W. Webb, nature biotechnology, 21/11 , November 2003]. Beispielhaft seien hier die Arbeiten von Levene et al. [M. J. Levene et al. In vivo multiphoton microscopy of deep brain tissue. J Neurophysiol 91 : 1908-1912, 2004] und Theer et al. [P. Theer et al., Two-Photon imaging to a depth of 1000 mm in living brain tissue... Optics Lett. VOL. 28(12), 2003] erwähnt, in denen Nervenzellen und Blutgefäße von Ratten und Mäusen in vivo in einer Tiefe von 1 mm dargestellt werden konnten. Diese Arbeiten belegen, dass konfokal nichtlinear angeregte Fluoreszenz auch aus großer Tiefe im Gewebe als ortsaufgelöste Information erfasst werden kann. Aller- dings konnten in Bezug auf Tumordiagnostik mit diesen Verfahren bislang nur morphologische und interzelluläre Informationen und keine Aussagen über den Stoffwechselzustand von Gewebebereichen gewonnen werden. Die für die therapeutischen Entscheidungen wichtigen Informationen wie Ausbreitung und Gesamtaktivität eines Tumors konnten bislang nicht geliefert werden.
Mit den Schriften US5034613 und US6166385 und begleitenden Veröffentlichung wurde das Verfahren der Zwei-Photonen-Mikroskopie und später der Mehr-Photonen- Mikroskopie bekannt gemacht. Die Idee dieser Verfahren beruht darauf, dass die dreidi- mensionale Ortsauflösung durch die enge räumliche Begrenzung einer durch Zwei- oder Mehr-Photonen-Prozesse angeregten Fluoreszenz erreicht wird. Die Bildgewinnung selbst basiert auf der rastemden Abtastung des Untersuchungsgebietes mit dem Anregungsstrahlung.
Die Auslösung von Zwei- oder Mehrphotonen-Prozesse ist an die simultane Absorption von zwei oder mehr Photonen im Anregungsgebiet gebunden. Deshalb sind im Allgemeinen dafür hohe Intensitäten, wie sie gepulste Lasersysteme bereitstellen, erforderlich. Typischerweise sind dies, wenn man zur Vermeidung von Gewebeschädigungen im Anregungsgebiet die mittlere Leistung des Lasers begrenzen muss, Piko- oder Femtose- kundenpulse bzw. Folgen von solchen Pulsen.
Die verfahrensimmanente Zwei- oder Mehr-Photonenabsorption bedingt auch eine entsprechende Intensitätsabhängigkeit des Prozesses: Bei einem Zwei-Photonenprozess ist die Ausbeute typischerweise quadratisch von der Intensität abhängig, bei einem Drei- Photonenprozess von der dritten Potenz der Intensität usw.
Die dreidimensionale Ortsauflösung des Verfahrens, für das hier beispielhaft die Zwei- und Mehr-Photonen-Mikroskopie angeführt werden, basiert auf zwei miteinander verknüpften Effekten, die anhand der typischerweise eingesetzten Lasersysteme beschrie- ben werden:
In der Bildebene der Optik, durch die die Anregungsstrahlung in das Targetmaterial fo- kussiert wird, ergibt sich die Begrenzung durch die Eigenschaften der Strahlquelle und der verwendeten Optik. Beschrieben wird dies durch den Radius der Strahltaille W0, der sich für den häufigen Fall der Grundmode-Strahlung, auf die hier als Beispiel ohne Beschränkung der Allgemeinheit des Erfindungsgedankens Bezug genommen wird, wie folgt näherungsweise berechnet:
Figure imgf000005_0001
Dabei ist λ die Wellenlänge der Strahlung, f die Brennweite der verwendeten Optik und D der ausgeleuchtete Durchmesser bei Strahlungseintritt in die Optik. Wie man leicht erkennt, lässt sich der Durchmesser des Anregungsgebietes in der Bildebene der Optik beispielsweise durch Wahl des Verhältnisses f/D einstellen.
Entlang der Ausbreitungsrichtung der Strahlung (z-Richtung) nimmt der Radius w(z) des - hier wieder beispielhaft betrachteten - Grundmode-Bündels zu:
Figure imgf000006_0001
Mit der Zunahme des Radius des Bündels nimmt die Intensität der Anregungsstrahlung und damit die Ausbeute des Prozesses ab.
—
Figure imgf000006_0002
Dabei ist I0 die Intensität im Fokus der Anregung. Charakterisiert wird dieser Tatbestand durch die sogenannte Rayleigh-Länge, die angibt, in welchem Abstand vom Fokus die Intensität auf die Hälfte abgefallen ist.
Entsprechend dem oben angeführten, quadratischen oder stärkeren Zusammenhang zwischen der Ausbeute des Prozesses und der Anregungsintensität wird deutlich, dass das Anregungsgebiet auch entlang der hier z-Achse genannten Ausbreitungsrichtung begrenzt ist.
Die Beschreibung dieser Zusammenhänge machen auch deutlich, dass es in dieser Anordnung nicht möglich ist, die Dimensionen des Anregungsgebietes unabhängig vonein- ander durch die Wahl der Anregungsstrahlung und der Optik festzulegen. Die Ausdehnung des Anregungsgebietes in z-Richtung wächst quadratisch mit dem Radius des Anregungsstrahles im Fokus.
Auf Grund dieser Tatsache gelingt es beispielsweise für die Multiphotonen-Mikroskopie nicht, Übersichtsmessungen mit verringerter Auflösung - also vergrößertem Fokus - und entsprechend erhöhter Ausbeute durchzuführen, ohne dass dadurch überproportional Auflösung in der Ausbreitungsrichtung der Anregungsstrahlung verloren ginge. Dieser Tatbestand ist insbesondere dann nachteilig, wenn zur Vermeidung unerwünschter Prozesse im Targetmaterial die Intensität der Anregungsstrahlung begrenzt ist. Bei der gezielten nichtlinearer Anregung von Prozessen in organischen oder anorganischen Stoffen ist weiterhin Folgendes zu beachten:
Der Spot, in dem nichtlineare Prozesse ablaufen, ist als Taille eines Gaußstrahles ge- formt und bei nicht zu großen Aperturen vergleichsweise langgestreckt. Gewünscht für die Auswertung ist jedoch zumeist eine kompakte Form des Anregungsvolumens, d. h. eine, bei der der Durchmesser dieses Volumens und die Ausdehnung senkrecht zur Strahlsachse in etwa die gleiche Größenordnung haben.
Dabei wird grundsätzlich wie bei den genannten Methoden üblich das dreidimensionale Bild durch Scannen erzeugt. Durch zusätzliche, erfinderisch neue Methoden und apparative Einrichtungen, die im Folgenden offenbart sind, wird die im vorgenannten Absatz beschriebene Restriktion aufgehoben
Eine weitere, den Einsatz der nichtlinearen Fluoreszenzmethodiken außerhalb der klinischen und biologischen Forschung beschränkende Begrenzung der bisherigen Methodiken ist das geringe Volumen der Methoden gemäß dem Stand der Technik ist die geringe Ausdehnung des untersuchten Gewebsvolumens. Dies liegt in der Größenordnung von lateral 500 x 500 μm und in der Tiefe 200 bis 400 μm. Die Begrenzung ist einerseits wie bereits beschrieben durch die zu hohe Ortsauflösung begrenzt. Andererseits begrenzen auch die Datenmengen und -raten, die bei einer Echtzeitauswertung - wie sie für den Einsatz für die klinische Diagnostik und Früherkennung von Erkrankungen, insbesondere tumoröser Art notwendig ist - den höchst wünschenswerten klinischen Einsatz der Methodik.
Der vorliegenden Erfindung liegt das Problem zugrunde, ein Verfahren und eine Vorrichtung zur optischen Charakterisierung von Gewebe anzugeben, das eine zuverlässigere Unterscheidung von gesundem und erkranktem Gewebe als bisher möglich erlaubt.
Die vorgenannte Problem wrd durch das Verfahren mit den Merkmalen des Anspruchs 1 , durch das Verfahren mit den Merkmalen des Anspruchs 33, durch die Vorrichtung gemäß dem Anspruch 46 sowie die Vorrichtung gemäß dem Anspruch 61 gelöst. Besonders bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung sind in den Unteransprüchen angegeben.
Danach wird ein Verfahren zur optischen Charakterisierung von aus Zellen gebildetem menschlichen oder tierischen Gewebe angegeben, das die Schritte aufweist:
- Bereitstellen einer Strahlquelle zum Aussenden gerichteter elektromagnetischer Strahlung; - Bestrahlen des zu charakterisierenden Gewebes mit der Strahlung, wodurch im Gewebe eine für das Gewebe charakteristische Rückstrahlung erzeugt wird, wobei die in das Gewebe eingedrungene Strahlung innerhalb eines sich quer zu ihrer Ausbreitungsrichtung erstreckenden Anregungsbereiches eine ausreichende In- tensität aufweist, um im Gewebe eine charakteristische Rückstrahlung anzuregen, wobei
- der von der Strahlquelle ausgesandten Strahlung ein derartiges Intensitätsprofil quer zu ihrer Ausbreitungsrichtung aufgeprägt wird, dass der Anregungsbereich eine Mehrzahl von Zeilen des Gewebes überdeckt und die angeregte Rückstrah- lung auf zellübergreifende Gewebeeigenschaften zurückgeht.
Das erfindungsgemäße Verfahren legt die Grundlage für ein innovatives Fluoreszenzdiagnostisches, bildgebendes, nicht-invasives Tumordiagnoseverfahren, das zur Früherkennung und zum Screening (in vivo und in vitro) geeignet ist. Das Verfahren liefert die Charakterisierung des Gewebe- bzw. Stoffwechselzustandes und damit von krankhaften, insbesondere tumorösen Veränderungen mit einer an der klinischen Zielstellung orientierten Aussagekraft und Ortsauflösung, die dem Arzt derzeit nicht zur Verfügung steht. Der Gewebezustand wird aus den spektroskopischen Daten in suprazellulärer Mittelung bestimmt und dem Arzt in einem mehrere Millimeter umfassenden morphologischen Schnittbild dargestellt, das eine Bewertung von Tumoren hinsichtlich ihrer Ausdehnung, Position und Aggressivität erlaubt.
Dem Patienten nutzen vor allem die verbesserte Früherkennung und Diagnostik. Durch diese können operative Eingriffe vermieden oder - im Falle der Lokalisierung von Früh- Stadien - durch minimal-invasive Methoden deutlich reduziert werden. Die Krankenversicherung spart Behandlungskosten durch im Vergleich zu den bisher unvermeidlichen Biopsien um zwei Drittel verringerte Kosten sowie durch deutliche Reduktion von Zahl und Schwere der operativen Eingriffe. Soweit chirurgische Eingriffe nicht vermieden oder durch minimal-invasive Methoden, wie PDT (Photo-dynamische Therapie) ersetzt werden können, werden die Schwere des Eingriffs und seine heilungsbezogenen und ästhetischen Auswirkungen deutlich verringert, weil die Abgrenzung zwischen gesundem und krankem Gewebe bedeutend exakter erfolgen kann als bisher.
Die neuartige Methode lässt sich aber auch für andere Mess- und Charaterisierungsauf- gaben z. B. im Bereich der Pathologie, Biochemie, Biotechnologie, für lebende oder nicht vitale organische sowie für anorganische Stoffe in festem oder flüssigem Zustand vorteilhaft einsetzen. Der besseren Verständlichkeit halber sind im Folgenden alle Spezifika am Beispiel der Fluoreszenzdiagnose von Tumoren dargestellt, ohne damit die Allgemeingültigkeit und Breite des Erfindungsgedankens einschränken zu wollen. Neben dem zunächst dargestellten Einsatzgebiet im Bereich der Haut sind weitere Anwendungsbereiche im Bereich der zugänglichen Körperhöhlen (HNO, Gynäkologie) und im endoskopisch zugänglichen Körperinneren (Gastro-Entereologie, Urologie, Bron- choskopie) Teil des Anwendungsgebietes der Erfindung.
In der Behandlung bösartiger Erkrankungen ist eine frühzeitige Erkennung, neben den Krebs-Frühstadien, vor allem der Vorstufen, für die Aussichten auf Heilung von ganz entscheidender Bedeutung. Zudem steigt durch die zunehmende Lebenserwartung die Inzi- denz solcher Krebs-Vorstufen, was durch die Lebensgewohnheiten, wie z.B. intensive Sonnenbestrahlung, Erkrankungen durch sexuell übertragbare Viren und Umweltnoxen noch verstärkt wird. Als Beispiele seien hier genannt:
a) die aktinische Keratose, eine durch additive UV-Exposition ausgelöste Er- krankung, die in einen Hautkrebs, das Plattenepithelkarzinom übergehen kann und b) die durch HPV-Viren ausgelösten genitalen Feigwarzen, „Condylome", die nicht nur bei Frauen für die Auslösung des Gebärmutterhalskrebs verantwortlich sind, sondern auch bei Männern und Frauen Krebse der Anogenital- Region induzieren können.
Während eine manifeste Krebserkrankung häufig eindeutig erkannt werden kann („Blickdiagnose" in ca. 50 % der Erkrankungen), sind deren Vorstufen und ganz frühen Stadien bei der visuellen Diagnose häufig unauffällig. Dies ist ein Grund dafür, weshalb Scree- ning-Untersuchungen nicht den gewünschten Effekt erbringen. Sie können entweder „falsch negativ" sein, also eine vorhandene Krebserkrankung nicht rechtzeitig erkennen und damit die Chancen einer Heilung durch minimal-invasive Behandlungen verpassen. Ebenso ungünstig sind „falsch positive" Diagnosen, welche neben der erheblichen psychischen Belastung der Patienten bis zum Ausschluss einer Krebsdiagnose auch viele aufwendige Untersuchungen nach sich ziehen, die nicht nur die Patienten zusätzlich belasten und gefährden, sondern auch erhebliche Folgekosten verursachen.
Andererseits gewinnen in der Behandlung epithelialer Tumoren minimal-invasive Verfahren wie die Cryotherapie sowie die Photodynamische Therapie und neuerdings auch die medikamentöse Behandlung (Wirkstoff Imiquimod) eine immer stärkere Bedeutung. Da diese Behandlungsverfahren aber ohne Herausschneiden („Exzision") arbeiten, fehlt ihnen die Möglichkeit der histologischen Untersuchung, mit der nicht nur die Diagnose gesichert wird, sondern auch Informationen über die Aggressivität des Tumors („Grading"), und über das Überschreiten der Grenzstrukturen und das Eindringen in das benachbarte Gewebe („Staging") erhalten werden. Voraussetzung für ein Screening sind deshalb neben der eindeutigen Diagnosestellung durch die räumliche Zuordnung der Fluoreszenz auch eine Aussage über die Ausbreitung und den Invasionsgrad.
Daraus ergibt sich, dass erfindungsgemäße Verfahren die medizinisch-diagnostischen Verfahrensanforderungen nach einer ortsaufgelösten Diagnose eingebettet in den morphologischen Rahmen des Untersuchungsgebietes vorteilhaft erfüllt, dessen Dimensionen entsprechend den klinischen Erfahrungen 4 mm lateral und 0,5 mm in der Tiefe nicht unterschreiten sollten.
In einer bevorzugten Weiterbildung des Verfahrens besteht das Aufprägen des Intensitätsprofils darin, die Strahlung über ein Objektiv in das Gewebe abzubilden. Dabei besitzt das Objektiv eine numerische Apertur von näherungsweise 0,3 bis 1 ,5.
In einer weiteren bevorzugten Ausbildung der Erfindung besteht das Aufprägen des Intensitätsprofils darin, die von der Strahlquelle ausgesandte Strahlung in mindestens zwei Teilstrahlen aufzuteilen, wobei der Anregungsbereich durch die Lage der Teilstrahlen festgelegt ist. Vorteilhafterweise werden die Teilstrahlen jeweils so in das Gewebe fokus- siert, dass die Fokuspunkte für die Teilstrahlen beabstandet zueinander sind.
Der Grundgedanke dieser Weiterbildung der Erfindung besteht darin, dass aus dem von der Strahlquelle generierten Anregungsstrahl mehrere, sich in ihrer Richtung unterscheidende Teilstrahlen geformt werden. Mit einer Fokussierungsoptik entsteht in deren Fokusebene entsprechend der Anzahl und Anordnung der Teilstrahlen ein Bündel von Foki. Wird deren Abstand in der Fokalebene geeignet eingestellt, so ergibt sich entlang der Ausbreitungsrichtung der Anregungsstrahlung eine von der Zahl der Teilstrahlen zumindest annähernd unabhängige Begrenzung des Mehrphotonen-Anregungsgebietes.
Besonders vorteilhaft ist, wenn die Rückstrahlung ein Fluoreszenzsignal, z.B. eine Zwei- oder Mehr-Photonen-Fluoreszenz ist. Die bisherigen Verfahren der klinischen Fluoreszenzdiagnostik, sowohl der Auto- als auch der Xenofluoreszenz, erfassen nur ein Summenbild oberflächlicher Gewebsschichten. Die Anregung erfolgt mit kurzwelligem UV- bzw. Blaulicht, wobei durch Auslöschung durch darüber liegendes nicht- stoffwechselaktives Nekrosegewebe ein „falsch negativer" Befund erhoben werden kann, oder bei Tumorausbreitung unter die gesunde Haut die tatsächliche Ausbreitung und damit die Bestimmung der Tumorgröße falsch eingeschätzt wird. Diese Nachteile lassen sich durch enge räumliche Begrenzung einer NIR-Mehrphotonenanregung mit Lasern überwinden. Die in den letzten Jahren entwickelten Verfahren der Multiphotonen-Mikroskopie nutzen diesen Weg der Anregung von Fluophoren im Gewebe. Sie zielen auf hohe Ortsauflösungen (<1 μm) zur Untersuchung zellbiologischer Vorgänge in subzellulärer Dimension ab. Die dafür eingesetzten Methoden der scannenden Mikroskopie limitieren das Abtast- volumen auf Gesichtsfeldabmessungen und Scantiefen in der Größenordnung von einigen hundert Mikrometern. Diese Werte lassen sich - anders als beim erfindungsgemäßen Verfahren - prinzipbedingt nicht auf die für den klinischen Einsatz geforderten oben genannten Dimensionen des Scanvolumens ausdehnen.
Darüber hinaus erlaubt die subzelluläre Auflösung der konventionellen Verfahren - anders als bei der suprazellulären Auflösung des erfindungsgemäßen Verfahrens - nicht die Ermittlung der Korrelation zwischen den Fluoreszenzspektren endogener Fluophore und den pathologischen Zuständen entsprechender Zellbereiche. Die Multiphotonen- Mikroskopie ist zu einem wirkungsvollen Instrument der zellbiologischen Forschung ge- reift. Der klinische Einsatz zum Tomorstaging ist nicht ihr eigentliches Einsatzgebiet.
Das Verfahren dient im Bereich der Tumordiagnostik dem Zweck, die Zahl der tatsächlich erforderlichen operativen Eingriffe drastisch zu verringern. Zuvorderst sind Hauttu- more im Fokus der Behandlung, da diese ohne weiteres von außen zugänglich sind.Weitergehender, z. T. noch bedeutenderer Anwendungen ergeben sich intra- und extrakorporal durch endoskopische und intraoperative Applikatoreinrichtung mit integrierter Scanfunktion.
Bei entsprechender erfindungsgemäß vorgesehener Erweiterung und Miniaturisierung liegen auch in der endoskopische Diagnostik, vor allem für die Gynäkologie und HNO- Heilkunde, weitreichende Zukunfts-Potenziale für die Erfindung. Insbesondere die Differentialdiagnose der Gebärmutterhalserkrankungen und sonstiger durch humane Papillo- maviren induzierten Erkrankungen, aber auch oraler Leukoplakien und der lichenoiden Krebsvorstufen sind sehr ernstzunehmende Anwendungsgebiete der Erfindung.
Für das Tumorstaging und damit die Indikationsstellung zu minimal-invasiven Verfahren ist neben der Tumorgröße die Ausbreitungstiefe und die Stromainvasion von viel entscheidenderer Bedeutung. Die bisherigen Schnittbildverfahren, wie MRT, sind von ihrer räumlichen Auflösung nicht dazu in der Lage. Die hochauflösende Sonographie mit 100 MHz ist mit sehr vielen Störfaktoren behaftet, allein schon dadurch, dass sie als Kontaktverfahren bei unterschiedlichem Schallkopf-Auflagedruck unterschiedliche Dickenmessungen verursacht. Die optische Kohärenz-Tomographie (OCT) könnte aufgrund ihrer hohen Auflösung dafür eine Lösung darstellen. Jedoch haben die bisherigen Erfahrungen mit allen drei Verfahren gezeigt, dass eine Unterscheidung zwischen Schwellung, Entzündung und kanzerogen-pathologischem Befund („Dignität") nicht allein anhand morphologischer Information möglich ist.
Deshalb ist einer Weiterbildung des erfindungsgemäßen Verfahrens die fluors- zenzspektroskopische, ortsaufgelöste Funktionaldiagnose in eine morphologische Darstellung des Untersuchungsgebietes eingebunden. Dazu wird die von der Strahlquelle ausgesandte Strahlung zur zusätzlichen Charakterisierung des Gewebes per Kohärenz- Reflektometrie in einen Anregungsstrahl zur Anregung einer Fluoreszenz in dem Gewebe und einen Referenzstrahl aufgeteilt, wobei der Anregungsstrahl zum Teil vom Gewe- be zurückreflektiert und der Referenzstrahl mit der vom Gewebe zurückreflektierten Strahlung überlagert wird.
Besonders bevorzugt weist das der von der Strahlquelle ausgehenden Strahlung aufgeprägte Intensitätsprofil einen charakteristischen Verlauf mit mindestens zwei Intensitäts- maxima auf. Dieser „Fingerprint" des Strahls kann dazu genutzt werden, die optischen Weglängen für den Referenzstrahl und des reflektierten Strahls abzugleichen. Dazu wird in vorteilhafter Weise die optische Weglänge für den Referenzstrahl so eingestellt, dass sich die auf die von der Strahlquelle ausgesandten Strahlung aufgeprägte Intensitätsverteilung im Interferenzdetektor nachweisen lässt, wobei in diesem Fall die optische Weg- länge für den Referenzstrahl der vom Anregungsstrahl zurückgelegten optischen Weglänge von der Strahlquelle bis zum Fokus und zurück bis zum Interferenzdetektor entspricht.
Will man Mehrphotonen-Anregungsprozesse mit der optischen Kohärenz-Reflektometrie kombinieren, um so zusätzliche Informationen über den Ort der Anregung zu gewinnen, so ergibt sich das Problem der räumlichen Zuordnung der beiden Prozesse bzw. Informationen. Es besteht besonders im Fall von optisch inhomogenen Proben (z.B. Gewebe) darin, dass der inhomogene Brechungsindex des Materials den Ort der Mehrphotonen- Anregung und das Signal optischen Kohärenz-Reflektometrie in unterschiedlicher Weise beeinflusst: In den Weg des Anregungslichtes geht die Brechkraft bis zum Ort der Anregung (Fokus) in die Tiefe des Materials nur einmal ein. Detektiert die rückgestreuten Signale mit der Methode der optischen Kohärenz-Reflektometrie, so geht in deren Strahlengang der Brechungsindex zweimal ein, indem das Licht auf dem Hin- und auf dem Rückweg das Material durchdringen muss. Somit fehlt für die wünschenswerte Kombina- tion von Mehrphotonen-Anregung und optischer Kohärenz-Reflektometrie die räumliche Zuordnung zueinander insbesondere entlang der Ausbreitungsrichtung der Anregungsstrahlung.
Zusammenfassend gibt es für die Kombination von Fluoreszenzspektroskopie und Kohärenzspektroskopie insbesondere die bevorzugte Weiterbildung • Dass die Strahlung eines zur Anregung von Zwei- oder Mehrphotonenprozessen und/oder zur optischen Kohärenz-Reflektometrie geeigneten Lasers in einen An- regungs- und einen Refrenzstrahl aufgeteilt wird,
• Dass dem Anregungsstrahl quer zu seiner Ausbreitungsrichtung eine solche Struktur aufgeprägt wird, dass sich nur in der Fokalebene der nachfolgenden Optik oder in deren unmittelbarer Umgebung quer zur Ausbreitungsrichtung des Anregungslichtes eine Intensitätsstruktur mit mindestens zwei Maxima getrennt durch ein Minimum herausbildet,
• Dass dieser Fokalbereich mit jener Region übereinstimmt, in der vorrangig die gewünschten Zwei- oder Mehrphotonenprozesse stattfinden,
• Dass der strukturierte Anregungsstrahl mittels einer geeigneten Optik in das anzuregende oder bzw. und zu untersuchende Target fokussiert wird,
• Dass die im Target entstehende rückgestreute Strahlung von der Fokussierungs- optik aufgefangen und sich der ursprünglichen Ausbreitungsrichtung der Anre- gungslichtes entgegengesetzt ausbreitet,
• Dass auf diesem Weg ein geeignetes optisches Umlenkelement eingebracht wird, ohne dass diese rückgestreuten Strahlung erneut jenes Element durchläuft, dass dem Anregungsstrahl seine Struktur quer zu seiner Ausbreitungsrichtung aufgeprägt hat, • Dass die rückgestreute Strahlung in einer zur der Fokalebene optisch konjugierten Fläche mit dem Referenzstrahl derart zur Interferenz gebracht wird, dass die zu den beleuchteten Punkten des Targets konjugiert liegenden Punkte vom Referenzstrahl vollständig erfasst werden,
• Dass das dort entstehende Interferenzmuster mit einem ortsauflösenden licht- empfindlichen Detektor erfasst und ausgewertet wird,
• Dass die optische Weglänge des Refrenzstrahles verändert werden kann, und
• dass als Anzeige für die Übereinstimmung des Ortes der Zwei- oder Mehrphotonenanregung mit jenem Ort, von dem die rückgestreuten optischen Signale stammen, das Bild des Interferenzmusters genommen wird, indem sich jene Struktur widerspiegelt, die nur Im Fokalbereich der Anregungsstrahlung hervortritt.
Der Grundgedanke der Erfindung besteht darin, dass dem Anregungsstrahl eine Struktur aufgeprägt wird, die nur im Fokus - also am Ort der Multiphotonen-Anregung - hervortritt, bzw. sich mit der Ausbreitungslänge derart ändert, dass in der Umgebung des Fokus eine detektierbare Veränderung in dieser Struktur oder genauer ihres Abbildes hervortritt. Die Interferenz des rückgestreuten Lichtes in einer zur Anregungsebene optisch konjugierten Ebene wird genau wird ein Abbild dieser Struktur aufweisen. Mit einem ortsauflösenden Nachweiselement für das Interferenzsignal kann nun der Referenzstrahlengang in seiner Länge angepasst werden, bis die zu erwartende Struktur im Interferenzmuster hervortritt. Dies ist der Indikator für die Überlagerung des Ortes der Multiphotonenanre- gung mit dem der morphologischen Abtastung mittels optischer Kohärenz- Reflektometrie.
Zusammenfassend bieteten sich insbesondere die folgenden Vorteile:
Die charakteristisch unterschiedlichen Fluoreszenzkurven von tumorösem und normalem Gewebe erlauben eine Gewebsdiagnose mit signifikanter Selektivität und Spezifität, Das Gewebe wird mit einer für das Verfahren dienlichen Fokusgröße im supra- zellulären Bereich abgescannt, so dass eine lokale Bewertung des Gewebestoffwechsels in Echtzeit in dienlicher Auflösung möglich wird,
Als eine vorteilhafte Gruppe von Ausprägungen wird die Größe des abtastenden Fokus von der Größe des einem Scanpunkt zuzuordnenden „Scanvolumens" entkoppelt. Dadurch werden ungünstige Restriktionen erfindungsgemäß aufgehoben, die bei den bisher bekannten optischen Diagnoseverfahren dem hier angestrebten
Einsatzzweck im Wege standen.
Durch besondere Referenzierungsverfahren wird ein lokaler Dignitätskennwert ermittelt („spektraler Fingerabdruck"), der den Stoffwechselstatus, den Grad der Gefäßneubildung oder den Strukturierungsstatus des betrachteten Gewebsareals weitge- hend unabhängig von Störgrößen beschreibt und eine automatische präpathologische Bewertung ermöglicht,
Die Kombination von räumlich aufgelöster, funktionaler Biostatusbewertung und morphologischer Bildgebung stellt einen qualitativen Sprung in der klinischen Diagnostik der oberen Hautschichten dar, - Im Besonderen wird durch Parameterwahl und das spezielle Auswerteverfahren des Verfahrens eine ausreichende Eindringtiefe bis zur Basalmembran erreicht, so dass eine Unterscheidung zwischen unterschiedlich invasiven Formen kanzerogener Erscheinungen möglich wird.
Die Strahlquelle wird somit sowohl für die Multiphotonen-Anregung als auch für optische Kohärenz-Reflektometrie eingesetzt. Gegebenenfalls sind die spektralen Eigenschaften der Quelle so zu gestalten, dass sie die gewünschte Tiefenauflösung (Auflösung entlang der Strahlungsausbreitung) ermöglicht. Diese Strahlung wird in einen Anregungsstrahl und einen Referenzstrahl mit einem teildurchlässigen Spiegel geteilt. Beide Strahlen können noch mit Modulatoren versehen werden, die die Intensität nicht jedoch die optische Weglänge zeitlich modulieren.
Eine besonders bevorzugte Variante des Verfahrens sieht vor, dass a) das Bestrahlen des Gewebes mit Strahlung im Wellenlängenbereich von 720- 800 nm erfolgt, wodurch im Gewebe eine Zweiphotonen-Fluoreszenz angeregt wird; b) Detektieren der Intensität eines ersten Fluoreszenzsignals bei einer Wellenlänge von 460+30 nm und eines zweiten Fluoreszenzsignals bei einer Wellenlänge von
550±30 nm; c) Bestimmten des Verhältnisses der Intensitäten des ersten und zweiten Fluoreszenzsignals; und d) in Abhängigkeit von dem in Schritt c) bestimmten Verhältnis ein Signal erzeugt wird.
Dabei ist der Wellenlängebereich bei 460±30 nm signifikant für NAD(P)H und der Wellenlängebereich bei 550 +30 nm signifikant für Flavine. Die Bildung des Verhältnisses der Messwerte aus (a) und (b) dient zur Referenzierung der Störfaktoren und Gewinnung eines Aktivitätssignals für die Stoffwechselaktivität, das sich signifikant zwischen normalem und pathologischen Gewebsvolumina gleicher Art unterscheidet.
Eine weitere, bevorzugte Variante sieht vor, dass a) das Gewebe mit Strahlung im Wellenlängenbereich zwischen 500-550 nm be- strahlt wird, und dabei b) eine erste Intensität einer Zweiphotonen-Fluoreszenz bei einer Wellenlänge von 340 ±40 nm (signifikant für Tryptophan) detektiert wird; c) das Gewebe mit Strahlung im Wellenlängenbereich zwischen 720-800 nm bestrahlt wird, und dabei d) eine zweite Intensität einer Zweiphotonen-Fluoreszenz bei einer Wellenlänge von
460 ±40 nm (signifikant für NAD(P)H) detektiert wird; e) das Verhältnis der in Schritt b) bestimmten ersten Intensität und der in Schritt d) bestimmten zweiten Intensität bestimmt wird (zur Referenzierung der Störfaktoren und Gewinnung eines Kennwertes, der sich signifikant zwischen normalem und pathologischen Gewebsvoiumina gleicher Art unterscheidet); und f) Erzeugen eines elektrischen Signals in Abhängigkeit von dem in Schritt c) bestimmten Verhältnis. g) in Abhängigkeit von dem in Schritt f) bestimmten Verhältnis ein elektrisches Signal erzeugt wird.
Eine weitere, bevorzugte Variante des Verfahrens sieht die Schritte vor: • Anregung der Zweiphotonen-Fluoreszenz im Wellenlängenbereich 720-800 nm und Messung des Fluorszenzsignals bei 460 ±40 nm [signifikant für NAD(P)H] als Funktion der Gewebetiefe z erfolgt,
• Speicherung der Messwerte in einem als gesund bekannten Gewebsareal als Funkti- on der Tiefe (= „Normalverlauf' als Funktion von z) und gleichartige Messung in einem Verdachtsareal (= „Verdachtsverlauf" als Funktion von z),
• wobei anschließend die beiden Signalverläufe ins Verhältnis gesetzt werden (= „Indikatorverlauf" als Funktion von z), und eine Schranke von 20-40% Abweichung des Indikators vom Wert Eins im Verdachtsareal als Indikationsgrenze für einen anomalen Stoffwechsel verwendet werden, der sich signifikant zwischen normalem und pathologischen Gewebsvolumina gleicher Art unterscheidet.
Des Weiteren kann das Verfahren umfassen:
• Einstrahlung und Tiefenscan eines fokussierten Kurzpulslaserstrahls im Wellen- längenbereich 720-880 nm oder 980-1080 nm und Messung der remittierten
Strahlung bei exakt der halben Einstrahlungswellenlänge [Indikator für Art und Struktur des Kollagens als Strukturmerkmal] als Funktion der Gewebetiefe z in einem in einem als gesund bekannten Gewebsareal als Funktion der Tiefe (= „Normalverlauf" als Funktion von z) und • gleichartige Messung in einem Verdachtsareal (= „Verdachtsverlauf" als Funktion von z), wobei
• anschließend die beiden Signalverläufe ins Verhältnis gesetzt werden (= „Indikatorverlauf" als Funktion von z), und eine Schranke von 30-50% Abweichung des Indikators vom Wert Eins im Verdachtsareal als Indikationsgrenze für eine anomale Gewebestrukturierung verwendet werden, der sich signifikant zwischen normalem und pathologischen Gewebsvolumina gleicher Art unterscheidet.
Dabei kann der fokussierte Strahl wird mittels einer geeigneten (Abtast-) Einrichtung durch das Gewebe bewegt. Diese Bewegung kann in einer der folgenden Abtastmodi ausgeführt werden a) zweidimensional im Sinne einer horizontalen (= zur Gewebeoberfläche parallelen) Abtastebene, b) zweidimensional im Sinne einer vertikalen (= zur Gewebeoberfläche senk- rechten) Abtastebene („optischer Ultraschall") c) dreidimensional im Sinne eines Abtastvolumens. Ziel ist insbesondere das Auffinden von Tumoren im Frühstadium („Carcinoma in situ") und die Abgrenzung gegen weiterentwickelte Stadien (Einwandern von Micro-Gefäßen, Durchbrechen der Basalmembran, Verlust der Gewebestrukturierung). Dabei werden folgende Erkenntnisse genutzt a) Micro-Zirkulation wird am erhöhten Hemoglobin-Signal erkannt. b) Auflösung der Struktur wird am lokal abweichenden Gehalt an Elastin und/oder Kollagen erkannt. c) Das Durchbrechen der Basalmembran wird durch Fehlen der Papillenstruktur durch Bildauswertung erkannt. Zur Unterdrückung von Störungen und zur Kompensation von Einflüssen unbekannter Skalierung einerseits der Messanordnung und andererseits der biologischen Materialien im Anregungs- und Mess-Strahlengang wird mit einer Referenzierung des Mess-Signals gearbeitet, bei der die Messdaten mindestens zweier signifikanter Stoffe herangezogen werden, hier insbesondere der Stoffgruppen NAD(P)H, Flavine und Tryptophan. Als weitere signifikanzsteigernde Information werden morphologische Daten, wie der lokale Gehalt an Elastin oder Kollagen herangezogen, die sich durch eine eigene Fluoreszenzmerkmale Elastin) oder durch nichtlineare Erzeugung eines Referenzsignals (bevorzugt SHG = Second Harmonie Generation = Frequenzverdoppelung der Anregungsstrahlung, bevorzugt bei Kollagen) nachweisen lassen.
Dem Arzt wird ein morphologisches Bild des untersuchten Gewebeareals am Monitor gezeigt. Dieses beruht auf der Auswertung der Signale der Strukturmoleküle (Elastin und/oder Kollagen) und der direkten Rückstrahlung der Anregungsstrahlung (Oberflächen-Reflex und Streuamplitude).
Ein „Gewebe-spektroskopischer Fingerabdruck" wird durch die genannten Referenzie- rungen ermittelt und vom Rechner automatisch bewertet [zumindest zweiwertig (= „normal" oder „abweichend") oder dreiwertig (= „normal", abweichend" oder „unklar/unbestimmt")]. Die Bereiche abwechselnden Stoffwechsels werden im Monitorbild in Falschfarbendarstellung wiedergegeben.
Geräteaufbau:
Das Gerät besteht aus einem Betriebsgerät mit Netzversorgung, Bedienelementen integriertem Rechner und angeschlossenem Monitor sowie dem Handstück mit Fokussier- Optik und Scanner für die Anregungsstrahlung und den Elementen zum Sammeln der Mess-Strahlung (reflektierte und Streustrahl bei der Anregungswellenlänge, SHG- Strahlung bei der halben Anregungswellenlänge sowie der Fluoreszenzstrahlung). Die Zuführung der Anregungsstrahlung geschieht entweder mittels Faseroptik, bevorzugt als Photonic Fibers, oder einem Gelenkarm. Dabei können Elemente der Zuführungsoptik für die Fluoreszenz-Anregungsstrahlung auch zum Sammeln der Mess-Strahlung verwendet werden.
Als eine besonders vorteilhafte Ausführungsform wird bei dem analog zum bildgebenden medizinischen Ultraschall ausgeprägten Abtastmethodik („Optischer Ultraschall") eine im Bezug zum Handstück fixe Abtastebene vertikal in das Gewebe gelegt und vom Arzt, wie beim Ultraschall üblich durch das Gewebe bewegt. Das Schnittbild des Gewebes mit den genannten Zusatzinformationen („Fingerabdruck" mit automatischer Bewertung) wird in Echtzeit im Bildschirm angezeigt.
Bei Betriebszuständen mit hoher Auflösung, wo die händische Positionierungsgenauigkeit nicht ausreicht oder die Unruhe durch die unwillkürliche Handbewegung für das Ver- fahren zu groß ist, wird das Handstück fest aufgesetzt und die Verschiebung der Abtastebene durch elektromotorische oder mikromechanische Stellelemente ausgeführt.
Als Strahlquelle wird bevorzugt ein Laser, insbesondere ein gepulster Laser eingesetzt. Eine mögliche Anregungsquelle, die mit Pulsen im Pikosekundenbereich arbeitet, erlaubt zudem durch die Verwendung einer photonischen Faser auch die Erzeugung breitbandi- gen Lichtes zur Anregung bei mehreren Farben. Eine derartige Lichtquelle ist bislang weder in der fluoreszenzbasierten Tumordiagnostik noch in der Mehrphotonenmikroskopie eingesetzt worden.
Das Verfahren grenzt sich von den bekannten Diagnoseverfahren dadurch ab, dass es die Dignität des Gewebezustandes in einem dreidimensionalen Scanbild der Haut bewertet und darstellt. Dabei ist die Auflösung so gewählt, dass -je nach betrachteter Gewebs- tiefe- eine Anzahl von ca. 20 bis 200000 Zellen zum lokalen Signal beitragen.
Damit grenzt sich das Verfahren von höher auflösenden Verfahren ab, die Gestalt, Teilungsverhalten und Stoffwechsel einzelner Tumorzellen mikroskopisch betrachten. Diese liefern labortechnisch und für die Forschung interessante Ergebnisse, sind jedoch für eine klinische Anwendung am Patienten nur sehr bedingt geeignet. Das für die genannten Laborverfahren notwendige hohe Auflösungsvermögen im Bereich von 1 μm erfordert ein Epi-Fluoreszenzmikroskop mit hoch-aperturiger optische Abbildung, was ohne Immo- bilisation des Patienten nicht möglich ist. Ferner ist die erreichbare Gewebstiefe deutlich limitiert. Um die hoch-detaillierte Information zu gewinnen und auszuwerten, benötigt man vergleichsweise lange Messzeiten, weshalb ein solches Verfahren für ein klinisches Staging -anders als das erfindungsgemäße Verfahren ungeeignet ist. Das oben beschrieben erfindungsgemäße Verfahren arbeitet vollkommen nicht-invasiv. Die Hautoberfläche wird nicht angetastet, so dass auch bei positivem Befund keine Gefahr besteht, durch das Verfahren das Ausschwemmen von Tochterzellen des Tumors auszulösen.
Die Kombination des Fluoreszenzverfahrens mit einem OCT-System liefert wegen des dreidimensionalen Scanvorgangs ein 3D-OCT, so dass simultan dasselbe Gewebsvolu- men („Scan-Volumen") einerseits in dienlicher Auflösung auf seine Dignität bewertet und andererseits morphologisch abgebildet wird. Der untersuchende Arzt erhält daher eine vollständige dreidimensionales Bild des Gewebes und seines bewerteten Stoffwechselzustandes.
Das Verfahren wurde in Bezug auf Haut als relativ leicht zugänglichen Organ dargestellt. Es weist jedoch deutliches Potential zur Weiterentwicklung für andere medizinische und labortechnische Anwendungsgebiete auf.
In einem weiteren Aspekt der Erfindung wird ein Verfahren zur optischen Charakterisierung von aus Zellen gebildetem Gewebe angegeben, das die Schritte aufweist:
- Bereitstellen einer Strahlquelle zum Aussenden gerichteter Strahlung;
- Bestrahlen des zu charakterisierenden Gewebes mit der Strahlung an einer Messstelle, wodurch im Gewebe eine für das Gewebe charakteristische Rückstreustrahlung angeregt wird, wobei - die von der Strahlquelle ausgesandte Strahlung quer zur Ausbreitungsrichtung periodisch so abgelenkt wird, dass die Strahlung einen Bereich des Gewebes um die Messstelle herum periodisch abtastet, der sich über eine Mehrzahl von Zellen des Gewebes erstreckt.
Häufig ist vorgesehen, die Information zu einem Objektpunkt aus der Integration des Fluoreszenzsignales einer großen Zahl von Anregungspulsen zu entnehmen. Um aus dem langgestreckten Anregungsfokus ein Anregungsvoiumen etwa gleicher lateraler
Ausdehnung zu bekommen, wird der Strahl lateral in x und y-Richtung (Strahlachse ist in z-Richtung gewählt) mit hoher Geschwindigkeit bewegt, wodurch die Fluoreszenz aus einer hohen Zahl von Anregungspulsen zu einem Objektpunkt kompakt genutzt werden kann.
Da die Frequenz der Repetitionsrate des Lasers üblicherweise im Bereich 80 Mhz liegt, kommen als Mittel für das „Wobbling" konventionelle mechanische Scanner nicht in Fra- ge. Vielmehr wird hier auf eine Lösung im Sinne der Mikrosystemtechnik oder Mikrome- chanik zurückgegriffen.
Abweichend zur üblichen Bauform von Mikroscannern, bei denen ein einachsig oder zweiachsig kardanisch aufgehängter Spiegel über ein elektromagnetisches Feld gegen die Rückstellkraft der blattfederartigen Trägerelemente des Spiegels geregelt ausgelenkt wird, kann hier eine resonante Ansteuerung vorgesehen werden. Dafür wird die mechanische Resonanzfrequenz der Spiegelanordnung durch geeignete Wahl der Torsionsfedermomentes und des Trägheitsmomentes so bestimmt, dass die gewünschte Schwin- gungsfrequenz entsteht. Genau mit dieser dieser Resonanzfrequenz wird auch mit einem elektrischen oder magnetischen Feld angeregt angeregt. Dadurch entsteht eine sinusförmige Schwingung des Spiegels und eine entsprechende Bewegung des Fokus in einer Achse. Soll in zwei Achsen „gewobbelt" werden, so werden die Resonanzfrequenzen der beiden senkrecht zueinander stehenden Schwingungsachsen in unterschiedlichen Torsi- ons- und Trägheitsmomenten ausgelegt, so dass zwei unterschiedliche Resonanzfrequenzen in beiden Achsen x und y entstehen. Dabei wird die niederfrequente Achse so ausgelegt, dass die Schwingung ca. 6- bis 15-mal langsamer erfolgt als in der höherfre- quenten Richtung.
Somit bewegt sich der Scanspot mit einer Lissajous-Figur über das Objektfeld in x- und y-Richtung und tastet dieses Feld in etwa gleichmäßig ab. Diese resonante Anregung in eine Achse oder in zwei Achsen wird im weiteren Text „asynchrone zweiachsige harmonische Ansteuerung genannt". Alternativ sind Ablenkungen unter Nutzung des Pockels- oder Kerr-Effekt möglich.
Eine weitere Variante ist die aktive Phasenmodulation eines Reflexes mit Hilfe eines mikromechanischen Aktuators. Dazu wird mikromechanisch ein Feld von freischwingenden Spiegeln erzeugt, die jeweils in 3 oder 4 Laschenpunkten aufgehängt sind. Die Trägerbänder dieser einzelnen und untereinander gleichen Phasen-Aktuatoren sind gleichmä- ßig ausgeführt und weisen eine im Vergleich zur Breite geringe Dicke auf. Dadurch lassen sie sich senkrecht zur Spiegelfläche leicht auslenken, ohne zu verkippen, so dass ihre Lage parallel zur Ruhestellung auch bei Auslenkung erhalten bleibt.
In der Substratschicht unter den Spiegelflächen wird ein Elektrodenfeld so angebracht, dass in x-y-Richtung je Spiegelelemente eine darunter positionierte Elektroden vorliegt. Die Spiegel selbst erhalten unterseitig ebenfalls eine leitfähige Kontaktfläche.
Durch Ansteuerung der einzelnen Elektroden wird über elektrostatische Kräfte eine Auf- und Abbewegung der Spiegelelemente ohne Torsion erreicht. Dadurch kann eine effekti- ve Höhenlage jedes einzelnen Punktes singulär angesteuert werden. Dies ermöglicht bei einer Reflexion eine Phasenschiebung, die ortsabhängig eingestellt werden kann. Die Auslenkung der Spiegel muss zu ihrer optimalen Wirksamkeit bei einer üblichen Wellenlänge im sichtbaren Bereich ( 400-1500 μm) für eine komplette Phasenauslöschung nur 200 bis 750 nm betragen. Dies ist durch eine geeignete Auslegung der Trägerlaschen ohne Probleme zu gewährleisten.
Wesentlich bei der Erzeugung von Teilstrahlen ist, dass in jedem Teilstrahl die Bedingungen derart eingestellt werden, dass mit der gewählten Optik im Fokus die gewünsch- te Intensität der Anregungsstrahlung erreicht wird und dass die Teilstrahlen derart eingestellt werden, dass jeder von ihnen mit der gewählten Fokussierungsoptik einen von den Foki der anderen Teilstrahlen getrennten Fokus in der Bildebene der Optik ausbildet. Des Weiteren wird der Abstand dieser mindestens zwei Foki in der Bildebene derart eingestellt wird, dass deren Überlagerung entlang der Ausbreitungsrichtung der Anregungs- Strahlung insbesondere in der Nähe des Fokus jedes Teilstrahles einen wählbaren Bruchteil der Intensität der Anregungsstrahlung im Fokus nicht überschreitet.
Zusammenfassend ist bevorzugt vorgesehen, dass
• das optische Element zur Aufteilung in die gewünschte Anzahl von Teilstrahlen derart als Stellelement ausgeführt wird, dass die Anzahl der Teilstrahlen und der
Abstand ihre Foki gewählt werden kann dass mit einem geeigneten optischen E- lement die Teilstrahlen oder der Gesamtstrahl in ihrer Intensität derart modifiziert werden können, dass für die Intensitäten im Fokus jedes Teilstrahles entsprechend den Erfordernissen des Zwei- oder Mehrphotonenanregungsprozesses ein geeigneter Wert eingestellt werden kann,
• dass das optische Element zur Aufteilung in die gewünschte Anzahl von Teilstrahlen oder ein zusätzliches optisches Element eine mit der Zeit veränderbare Ablenkung oder Anordnung der Teilstrahlen ermöglicht, die in der Bildebene des Objektives eine entsprechende mit der Zeit veränderte Variation des Anregungsge- bietes oder Teilen davon ermöglicht,
• dass durch eine solche Anordnung die entstehende zeitliche Veränderung des Anregungsgebietes dazu genutzt wird, die durch die Anordnung der Teilstrahlen entstehenden Lücken des Anregungsgebietes in der Fokalregion auszugleichen.
• dass die Formgebung des Anregungsvolumens durch „Microwobbling" erzielt wird • dass die gewünschten Bewegungen durch mechanische oder elektromagnetische Effekte, wie Pockels- oder Kerreffekt erzielt wird
• dass mikromechanische Elemente zur schnellen Mikrobewegung des Fokus (oder zur Phasensteuerung verwendet werden. Für einen sicheren Betrieb einer Vorrichtung zur optischen Gewebeuntersuchung gibt es folgende grundsätzliche Forderungen:
A. Im regulären Betrieb dürfen keinerlei Schädigungen für den Patienten auftreten B. Im „Ein-Fehler-Fall" dürfen ebenfalls keine Schädigungen für den Patienten eintreten
C. Für den ungünstigsten anzunehmenden Fall aus der Kombination mehrerer Fehlfunktionen werden die Folgewirkungen diskutiert. Eine Schädigung des Patienten mit Krankheitswert muss ausgeschlossen sein.
Die drei Forderungen werden in den folgenden Abschnitten als Risikoanalyse gemäß ISO 14191 separat bewertet. Ein anschließendes Fazit fasst die Sicherheitsbewertung zusammen.
Beschreibung des regulären Betriebes (Fall A): Kategorien:
Im Regelbetrieb führt eine erfindungsgemäße Vorrichtung eine Scanbewegung aus, indem der Fokus des Lasers lateral und in der Tiefe durch das Gewebe bewegt und durch eine Intensitätsregelung die Abschwächung des Strahles im Gewebe ausgeglichen und die Intensität im Fokus konstant gehalten wird. Aus Sicherheitsgründen muss gefordert werden, dass einerseits ein Einzelpuls keine Schädigung verursacht. Andererseits darf die überlagerte Wirkung der Folgepulse sowie die während der Anwendung im Gewebe akkumulierte Energie nicht zu Schädigungen führen.
Beim Einzelpuls müssen adiabatische thermische Effekte, der Einfluss der Photochemie sowie intra- und intermolekulare Übergangszeiten aufgrund der schnellen energetischen Anregungsvorgänge betrachtet werden. Da die höchste Anregungsintensität im Fokus der Laserstrahlung liegt, sind die kennzeichnenden Größen hier die Volumendichte der absorbierten Pulsenergie und der absorbierten Pulsspitzenleistung im Fokusvolumen. Wärmeleitungsvorgänge können ausser Betracht bleiben.
Für die Bewertung der überlagerten Wirkung der Folgepulse ist die absorbierte Energie der Einzelpulse auf das durch die Scanbewegung überstrichene Volumen zu beziehen. Für den Fall, dass sich die Anregungsvolumina der Einzelpulse überlappen, kann es hierbei zu einer höheren Belastung als durch einen einzelnen Puls kommen.
Während in den beiden obigen Fällen die Absorption der Strahlung im Fokusvolumen betrachtet wird, muss zur Beurteilung der Wirkung der im Gewebe akkumulierten Ener- gie die starke Streuung des Gewebes berücksichtigt werden. Sie führt dazu, dass selbst im Wellenlängenbereich des optischen Fensters bei vergleichsweise geringer Absorption die Strahlung ein begrenztes Gewebevolumen nicht verlässt und letztlich in diesem Volumen absorbiert wird. Kennzeichnend ist hier die mittlere Leistung sowie Wärmetrans- portvorgänge im Gewebe, d.h. die Wärmeleitung und Wärmeabtransport durch Blutzirkulation sind zu berücksichtigen.
Nichtthermische Wirkungen:
Aufgrund der geringen Photonenenergie (~104 cm-1) und Leistungsdichte (~1011 W/cm2) können Schädigungen durch Bindungsbruch ausgeschlossen werden. Schädigungen durch Temperaturgradienten bei Erwärmung im ps-Zeitbereich sind nicht bekannt, daher konzentriert sich die Abschätzung der Gewebeschädigung im Folgenden auf die rein thermische Belastung. Abschätzung und Bewertung der thermischen Belastung des Gewebes:
Bei der Bewertung der schädlichen Nebenwirkungen müssen sowohl die Absorptions- als auch die Streueigenschaften des Gewebes berücksichtigt werden. In dem vorgesehenen Wellenlängenbereich der Strahlung ist der Wirkungsquerschnitt für Streuprozesse um ein bis zwei Größenordnungen höher, als der für die Absorption des Lichtes. Für 1064 nm wird ein Absorptionskoeffizient von 4 cm-1 für die reine Absorption und 5 cm-1 als effektiver Wirkungsquerschnitt für die Kombination aus Absorption und Streuung angegeben. Die Eindringtiefe (Abfall der Intensität auf 1/e) wird mit 4 mm beziffert. Temperaturänderungen ergeben sich aufgrund der kurzen Pulsdauer (~1 ps) zunächst adiabatisch aus der absorbierten Energie geteilt durch die Wärmekapazität des Gewebes. Als konservative Abschätzung soll hier der kleinste Wert für die Wärmekapazität (1930 J kg-1 K-1 für Fettgewebe) angenommen werden. Die Temperaturunterschiede gleichen sich dann für längere Zeiten durch die Wärmeleitfähigkeit des Gewebes wieder aus. Auch hier wird für die Abschätzung der kleinste Wert (λ = 0.3 W m-1K-1 in Fett) angenommen.
Für die Abschätzung der adiabatischen Wirkung eines Einzelpulses reicht es, den Ort der maximal auftretenden Intensität zu betrachten. Dieser liegt im Fokus, wo sich die gesamte dort während eines Laserpulses absorbierte Energie adiabatisch, d.h. ohne Wärmeaustausch mit der Umgebung, akkumuliert. Aufgrund der Intensitätsregelung ist diese Intensität für alle Scanpositionen, d.h. für alle Tiefen im Gewebe, identisch. Ein Energieübertrag geschieht nur durch lineare und nichtlineare Absorption; Streuung braucht in der Rechnung nicht berücksichtigt zu werden. Unter der Annahme einer Absorption von 50% pro mm und der o.g. Wärmekapazität ergibt sich aus den vorgesehe- nen Geräteparametern eine Erwärmung des Fokusvolumens um 2.6 °C durch einen einzelnen Laserpuls.
Für die Bewertung der überlagerten Wirkung der Folgepulse während des lateralen Scanvorganges ist z.B. die absorbierte Energie aller Pulse zu berücksichtigen, die während 100 μm Scanstrecke auf das Gewebe auftreffen. Diese ist auf das entsprechende Scanvolumen (Breite: Taillendurchmesser, Tiefe: doppelte Rayleighlänge 100 μm) zu beziehen. Als konservative Abschätzung soll auch diese Betrachtung adiabatisch durchgeführt werden, obwohl es in dem Zeitraum zwischen zwei Pulsen zu einer geringfügigen Verteilung der eingetragenen Wärme in Gewebe kommt. Die Berechnung mit o.g. Werten ergibt eine Erwärmung des Gewebes um 4.7 °C im Fokalbereich des Lasers bei einmaligem lateralen Überstreichen mit dem Messfleck. Da der Scanvorgang .zeilenweise' erfolgt, d.h. der Messfleck erst in einer festen Tiefe lateral durch das Gewebe bewegt wird, bevor in einer neuen Tiefe die nächste .Zeile' gemessen wird, ist die überlagerte Wirkung der Pulse in der Tiefe nicht adiabatisch abzuschätzen. In dem Zeitraum zwischen zwei ,Zeilen' findet eine Diffusion der Wärme in ein größeres Volumen statt, so- dass die überlagerte Wirkung zweier saggital benachbarter Pulse durch die im folgenden Abschnitt betrachtete gemeinsame Wirkung aller Pulse bei weitem übertroffen wird.
Für die Bewertung dieser langfristig (d.h. über mehr als 105 Pulse) im Gewebe akkumulierten Energie ist diese auf das Volumen zu beziehen, das die Strahlung aufgrund der starken Streuung nicht verlässt. Als konservative Abschätzung wird die höchste Laserleistung, d.h. für die Messung in größter Tiefe, angenommen. Geht man von einem zylindrischen Streuvolumen mit 2 mm Durchmesser und 4 mm Tiefe aus, dessen Zentrum lateral schnell auf einer Linie von 4 mm bewegt wird, ergibt sich eine Erwärmung um 1 °C pro Sekunde in diesem Volumen. Unter stationären Bedingungen, d.h. wenn der Applikator auf der Haut lange nicht bewegt wird, begrenzt der Wärmetransport des Gewebes unter ungünstigsten Bedingungen (Fettgewebe, s.o.) die Temperatur auf 43 °C in der Strahlebene (10 μm Dicke). (Annahme: Diffusive Wärmeleitung, in 5 mm Entfernung wird die Körpertemperatur durch Blutzirkulation auf 37 °C gehalten).
Um die sicherheitstechnische Bedeutung einer Temperaturerhöhung im Gewebe zu bewerten, kann auf Literaturergebnisse zurückgegriffen werden (siehe zum Beispiel G. Müller, H. P. Berlien „Angewandte Lasermedizin", ECOMED-Verlag, Loseblattsammlung, 1993 ff., Kapitel 3.3 „Thermische Wirkungen"). Demnach ist eine schädigende thermische Wirkung sowohl von der Temperatur, als auch von deren Einwirkdauer abhängig. Bei den hier betrachteten Zeitskalen sind die Grenztemperaturen für unter 1 bis maximal 10 Sekunden anzusetzen. Schäden treten bei diesen Einwirkdauern gemäß den Literaturdaten erst bei über 57°C ein, also 20K über der Körpertemperatur! Beschreibung des Ein-Fehler-Falles (Fall B):
Folgende Fehlerquellen sind aus Sicherheitsgründen zu betrachten: a) Die Pulsenergie erhöht sich auf den Maximalwert des Lasers durch Fehler der
Regelung b) Der Scanvorgang unterbleibt, sodass die Folgepulse dieselbe Stelle wiederholt treffen.
Fehlerbehandlung: Als wichtigste Maßnahme gegen die beiden unzulässigen Betriebszu- stände a) und b) ist in der Konstruktion und Systemlayout eine schnelle Überwachungselektronik vorgesehen, die den Regelbetrieb sowie den augensicheren Kontakt des Ap- plikators auf der Haut ständig überprüft und die ihrerseits unabhängig von der Steuerelektronik des Gerätes arbeitet. Sobald die Überwachungselektronik einen Fehler erkennt, schaltet sie die Laserquelle ab. Dadurch ist die Gefahr beseitigt. Als zusätzliche Maßnahme wird für den Fall a) eine Hardwarelimitierung in den Laser eingesetzt, die eine Energieabgabe über bestimmte Werte hinaus verhindert.
Bewertung des Restrisikos (Fall C):
Eintrittswahrscheinlichkeit der FehlerDie Eintrittswahrscheinlichkeit der genannten Fehler (Pulsenergie erhöht sich, Scanvorgang unterbleibt) wird durch elektronische Maßnahmen und die unabhängige Überwachungselektronik auf einen akzeptablen Wert ab- gesenkt (genaue Definition kann erst bei Erstellung der Anlage angegeben werden).
Folgewirkung des Mehr-Fehler-Falles:
Sollte trotzdem ein Fehler in der Überwachung auftreten, so sind die Auswirkungen wie folgt zu beurteilen: a) Ausfall der Leistungsregelung: Die Wirkung der Einzelpulse sowie die überlagerte Wirkung der Folgepulse wurde für den Regelbetrieb adiabatisch berechnet. Daher skaliert die Wirkung (unter Vernachlässigung der nichtlinearen Absorption) linear mit der Laserleistung. Damit bleibt die kurzzeitige adiabatische Erwärmung unterhalb 10 °C. Für die Bewertung der im Gewebe akkumulierten Energie wurde bereits für die Abschätzung im Regelfall mit der maximalen Laserleistung gerechnet. Folglich führt ein Ausfall der Leistungsregelung nicht zu einer Schädigung des Patienten.
b) Ausfall der Scanbewegung: Die Einzelpulse werden alle in dem selben Gewebevolumen fokussiert, was zu einer schnellen Temperaturerhöhung führt, bis das Fokusvolu- men durch die Wärmediffusion ins umliegende Gewebe eine konstante Temperatur von 62 °C erreicht. Für die im Gewebe akkumulierte Leistung bedeutet ein Ausfall der Scanbewegung, dass sich eine maximale Temperatur von 50 °C auf der Achse des Laserstrahles bis in eine Tiefe von ca. 4 mm einstellt. Folglich führt ein Ausfall der Scanbewegung ohne Abschaltung des Lasers zu einem Schmerzreiz bei dem Patienten. Dies deckt sich mit Selbstversuchen, in denen diese Strahlungsbedingungen an empfindlichen Hautregionen (Ellenbeuge) als „Nadelstiche" wahrgenommen wurden.
Es ist anzumerken, dass ein Ausfall der Scanbewegung die Bilderzeugung verhindert und der behandelnde Arzt daher die Störung erkennt. Bereits ein Abheben des Applikators von der Haut wird zur sofortigen Abschaltung des Lasers führen.
Die Erfindung wird im Folgenden anhand von Ausführungsbeispielen unter Bezugnahme auf die Figuren näher erläutert. Es zeigen:
Fig. 1 schematisch eine Vorrichtung zur optischen Gewebecharakterisierung gemäß einer ersten Ausführungsform der Erfindung;
Fig. 2 beispielhaft den Verlauf der Intensität für verschiedene Intensitätsprofile;
Fig. 3 schematisch eine Vorrichtung zur optischen Gewebecharakterisierung gemäß einer zweiten Ausführungsform;
Fig. 4A, 4B schematisch eine dritte und vierte Ausführungsformen einer Vorrichtung zur optischen Gewebecharakterisierung;
Fig. 5 eine fünfte Ausführungsformen einer Vorrichtung zur optischen Gewebecharakterisierung;
Fig. 6 Graphische Darstellung eines Ergebnis einer Fluoreszenzmessung;
Fig. 7 Graphische Darstellung der Intensität einer in einem Gewebe angeregten
Ein-Photonen-Fluoreszenz;
Fig. 8 Graphische Darstellung der Intensität einer in einem Gewebe angeregten
Zwei-Photonen-Fluoreszenz;
Fig. 9 eine sechste Ausführungsformen einer Vorrichtung zur optischen Gewebecharakterisierung ;
Die Fig. 1 zeigt eine Vorrichtung zur optischen Charakterisierung eines menschlichen oder tierischen Gewebes 1. Das Licht eines für die Auslösung von Mehrphotonenprozessen typischerweise eingesetzten Lasers 2 wird mit einem Strahlteiler 3 in Teilstrahlen 4a, 4b, 4c aufgeteilt. Es sind drei Teilstrahlen dargestellt. Es versteht sich jedoch, dass die Erfindung nicht auf drei Teilstrahlen beschränkt ist, sondern eine beliebige Anzahl von Teilstrahlen verwendet werden kann.
Deren unterschiedliche Richtungen der Teilstrahlen 4a, 4b, 4c werden durch ein Objektiv 5 in eine entsprechende Anordnung von Foki 51a, 51 b, 51c umgesetzt. Auf dem optischen Weg zwischen der Strahlaufteilung und dem Objektiv 5 können einerseits Elemente zur Beeinflussung z.B. der Intensität der Teilstrahlen eingebracht werden (Hier nicht dargestellt) oder - wie in der Fig. 1 beispielhaft dargestellt - ein Scanner 6, der zur abras- temden Anregung des Targets 1 (Gewebe) benutzt wird.
In den Foki 51a, 51b, 51c der Teilstrahlen 4a, 4b, 4c findet auf Grund der hohen Intensitäten eine Mehrphotonen-Absorption statt, in deren Folge diese Bereiche ein entsprechendes Fluoreszenzsignal aussenden, das zur Charakterisierung des bzw. der Anre- gungsbereiche(s) herangezogen werden kann. Dieses Fluoreszenzlicht wird zu einem Teil von dem Objektiv 5 erfasst, durch einen dichroidischen Spiegel 7 von dem Anregungslicht spektral und räumlich getrennt und mit einem Fluoreszenzdetektor 8 nachgewiesen.
Die Fig. 1 macht deutlich, dass durch die summarische Erfassung dieses Fluoreszenzsignales der gesamte Bereich („integraler Anregungsbereich") charakterisiert wird, der von dem Bündel der Anregungsfoki im Target überdeckt wird. Sollte es aus nachweistechnischen Gründen erforderlich sein, auch die Lücken in diesem Anregungsmuster zu erfassen, so kann dies beispielsweise durch minimale Scanbewegungen und die Mitte- lung über mehrere Laserpulse erfolgen.
Eine solche Anordnung ist insbesondere dann von Vorteil, wenn zum Beispiel um Schäden zu vermeiden, die Intensität der Anregungsstrahlung nach oben hin begrenzt ist. In der vorgeschlagenen Anordnung kann jeder Teilstrahl mit der maximal zugelassenen Intensität beaufschlagt werden. Entsprechend der Zahl der gewählten Teilstrahlen wächst dann das zu erwartenden Fluoreszenzsignal gegenüber dem von einem Teilstrahl. Dabei kann man jedoch - wie einführend beschrieben - die räumliche Begrenzung des Anregungsgebietes entlang der Ausbreitungsrichtung des Anregungsstrahles und damit die Verfahrensauflösung weitgehend unverändert beibehalten.
Die erfindungsgemäß wichtige Fragestellung der geeigneten Anordnung der Foki im Target wird anhand der Fig. 2 erläutert. Die Fig. 2 zeigt für den ausgewählten Fall der Überlagerung von neun Teilstrahlen gleicher Intensität die Abhängigkeit des normierten Intensitätsverläufe im Zentrum des Bündels über der Achse der Ausbreitungsrichtung der Strahlung in Vielfachen der Rayleigh-Länge eines Teilstrahles. Für die Fokalebene ist z zu Null gesetzt.
Dabei zeigt die durchgezogene Linie A den Verlauf für einen Teilstrahl. Zum Vergleich zeigt die gepunktete Linie B den Intensitätsverlauf für einen Strahl mit gleicher Spitzenintensität wie in A, jedoch - durch entsprechend gewählte Apertur - mit der gleichen Gesamtenergie wie die neun Teilstrahlen. Diese Kurve weist ein deutlich langsameres Abklingen der Intensität längs der Ausbreitungsrichtung auf. Dies bedeutet, dass das Anregungsgebiet in dieser Achse deutlich verlängert wäre.
Die anderen drei Kurven stellen den Intensitätsverlauf für unterschiedliche laterale Abstände der Foki der Teilstrahlen dar (C: Abstand = 1 ,5-faches des Taillenradius; D: Abstand = Dreifaches des Taillenradius; E: Abstand = Fünffaches des Taillenradius).
Wählt man den Abstand zu klein (z.B. 1 ,5-fache des Taillenradius), so ergibt die Überlagerung etwas höhere Intensitäten im Fokus selbst und das Anregungsgebiet ist entlang der Ausbreitungsrichtung deutlich vergrößert. Man erkennt dies, wenn man beispielsweise den Punkt des Abklingens auf die halbe Fokusintensität als Maßstab nimmt.
Stellt man jedoch beispielsweise den drei- oder fünffachen Taillenradius in dieser Beispielanordnung ein, so ist die Intensität annähernd im gleichen Abstand vom Fokus auf die Hälfte abgefallen wie im Fall eines Strahles mit gleicher Taille.
Das Beispiel macht deutlich, dass es durch erfindungsgemäß vorteilhafte Wahl des Ab- Standes der Foki gelingt, die Ausdehnung des Anregungsgebietes entlang der Ausbreitungsrichtung nahezu unabhängig von der Zahl der Teilstrahlen und damit von der Größe des Anregungsgebietes zu gestalten.
Die Wahl des günstigsten Abstandes der Foki kann von ihrer Anordnung in der Fokus- ebene des Objektiv, ihrer Zahl und den Eigenschaften der Anregungsstrahlung abhängen. Bevorzugt wird ein Abstand in der Größe des 2,5 - 15-fachen des Taillenradius eines Einzelstrahls gewählt.
Die Fig. 3 zeigt eine Vorrichtung, in der eine Laser-Strahlquelle 2 sowohl für die Multipho- tonen-Anregung als auch für optische Kohärenz-Reflektometrie eingesetzt wird. Gegebenenfalls sind die spektralen Eigenschaften der Quelle so zu gestalten, dass sie die gewünschte Tiefenauflösung (Auflösung entlang der Strahlungsausbreitung) ermöglicht. Diese Strahlung wird in einen Anregungsstrahl AS und einen Referenzstrahl RS mit einem teildurchlässigen Spiegel 71 geteilt. Beide Strahlen können noch mit Modulatoren versehen werden, die die Intensität nicht jedoch die optische Weglänge zeitlich modulieren. Eine solche Anordnung ist nicht abgebildet.
Dem Anregungsstrahl AS wird quer zur Ausbreitungsrichtung in der Strukturierungsein- heit 3 eine Struktur aufgeprägt, die infolge der Fokussierung nur in der Nähe der Fokalebene eines Objektivs 5 innerhalb des Targets kontrastreich hervortritt. Für diese Einheit können beispielsweise ein holographisches Element oder Mikrolinsen- oder Mikropris- men-Anordnungen eingesetzt werden. In der Fig. 3 ist als mögliche Ausführung einer solchen Anordnung die Aufteilung in drei Teilstrahlen 4a, 4b, 4c dargestellt, die in dem Target 1 (Gewebe) eng benachbarte Foki ausbilden. Außerhalb der Fokalebene verringert sich der Kontrast zwischen den Foki infolge der Durchmischung der Teilstrahlen. Der so strukturierte Anregungsstrahl AS kann mit einem Scanner 6 zur ortsdefinierten Anregung des Targets 1 relativ zu diesem bewegt werden.
Dort wo der strukturierte Anregungsstrahl AS das Innere des Targets 1 beleuchtet, findet an Strukturgrenzen Streuung statt. Der rückgestreute Anteil durchläuft das Objektiv 5, in dem er wieder kollimiert wird, und gegebenenfalls den Scanner 6, der die abtastende Strahlbewegung rückgängig macht. Über einen Strahlteiler 7 und gegebenenfalls eine Feldlinse 10 gelangt dieses aus der Tiefe des Targets 1 stammende Licht zur Interferenz mit dem Referenzstrahl RS in einem Interferenzdetektor 20 (z.B. eine CCD-Kamera).
Die optische Weglänge des Referenzstrahles RS kann über eine bewegliche Spiegelvor- richtung 19 (Die Bewegungsrichtung ist durch den Doppelpfeil M angegeben) verändert werden. Beobachtet man die Interferenz ortsaufgelöst, so wird man dann ein besonders kontrastreiches Interferenzmuster beobachten, wenn die optische Weglänge des Referenzstrahles genau dem Strahlweg des Anregungslichtes bis zum Fokus und des rückgestreuten zurück bis zum Ort der Überlagerung entspricht. In den Interferenzmuster wird sich das Abbild der dem Anregungsstrahl aufgeprägten Struktur zeigen. Dies ist der Indikator dafür, dass die Kohärenz-Reflektometrie den Fokalbereich der Anregung darstellt.
Als Beispiel ist in der Fig. 3 die Zwei- oder Mehrphotonen-Mikroskopie als möglicher An- wendungsfall dargestellt. In dem hier gezeigten Beispiel wird die Mehrphotonen- Fluoreszenz mittels des dichroitischen Strahlteilers 72 und des Empfängers 8 summarisch aus den Fokalbereichen aller drei Teilstrahlen erfasst. Genauso möglich sind jedoch auch Anordnungen, die es erlauben, die Fluoreszenzsignale nur einer ausgewählten Teilregion zu detektieren. Die Fig. 4A, 4B zeigen das Prinzip eines Seriengerätes zur optische Gewebecharakterisierung. Nach der Anregung durch fokussierte IR-Laserpulse (~ fs bis ps) (Pfeil P) wird das von der Probe / dem Gewebe ausgehende Licht mit einem Spektrometer 1 1 detek- tiert. Dieses Spektrometer kann zur Vereinfachung der Auswertung und zur Verbesserung der Kollektionseffizienz des rückgestrahlten Lichtes als Polychromator mit relativ geringer spektraler Auslösung und weiten Spektralfenstern ausgeführt sein. Im letzteren Fall kann auch die Sammellinse vor dem Polychromator 11 ggf. entfallen.
Da nur Licht ausgewertet wird, dessen Photonen eine höhere Energie haben, als die des eingestrahlten Lichtes, ist sichergestellt, dass das Signal aus nichtlinearen Prozessen stammt, die nur im Bereich des Fokus stattfinden können. Aus der Position einer Linse 5 und dem Brechungsindex des Gewebes ist die Lage des Fokus 51 eindeutig bestimmt. Die Tiefenzuordnung kann an einem geeignet präparierten Objekt kalibriert werden.
Die Intensität wird während des Tiefenscans variiert, um die Abschwächung des Anregungslichtes bei der Fokussierung in tiefere Bereiche des Gewebes auszugleichen. Die Regelung basiert auf physikalischen Effekten, die gewebeunabhängig als Funktion der Anregungsintensität im Fokus ausgelöst werden und gleichen somit auch die Abschwä- chung in unterschiedlichen Gewebetypen aus. Auf diese Weise werden störende Selbst- fokussierung sowie quantitative UV-Konvertierung im Gewebe vermieden.
In Fig. 4A und 4B ist ohne Beschränkung der Allgemeinheit die Relativbewegung zwischen Strahl und Fokus jeweils nur in zwei Koordinaten (x lateral, z in die Gewebetiefe) dargestellt. Die zweite Lateralachse y kann erfindungsgemäß in einer der angegebenen Weisen zusätzlich abgefahren werden.
Das Prinzip der Anordnung der Fig. 4B entspricht dem der Fig. 4A, mit dem Unterschied, dass die Probe mit einer Positioniereinheit 12 gegenüber dem fokussierenden Objektiv bewegt werden kann, um verschiedene Punkte der Probe ausmessen zu können. Des Weiteren ist ein Spektrometer oder Polychromator (siehe entsprechende Bemerkung zu Fig. 4A) 11a angeordnet, das zeitaufgelöste Messungen ermöglicht und mit einer Auswerteeinheit 13 verbunden ist. Die Anordnung nach Fig. 4B ist besonders geeignet für in- vitro-Untersuchungen, wie z. B. Zellkulturen, von exzidierten Gewebeproben oder patho- logischen Präparaten.
Die Fig. 5 zeigt eine weitere Variante einer Apparatur zur optischen Gewebeuntersuchung mit kombinierten Fluoreszenz- und OCT-System. Das Prinzip dieses Systems ist bereits in Bezug auf die Fig. 3 erläutert worden. Die Apparatur ist nicht mit einem Spektrometer ausgestattet, sondern wird mit mehreren diskreten Sensoren 15a, 15b betrieben, die durch Filterung mittels vorgeschalteter Filter 16a, 16b spektrale Teilsignale des Fluoreszenzspektrums nutzen.
Bei den Filtern 16a, 16b handelt es sich nicht ausschließlich um einfach Linien-, Bandoder Kantenfilter. Vielmehr werden mindestens teilweise komplexe Verlaufsfilter eingesetzt werden, die gemäß einer Bewertungsfunktion berechnet und hergestellt sind.
Beispielhaft seien im Folgenden einige typische Betriebswerte einer derartigen Apparatur tabellarisch dargestellt. In Übertragung der Ergebnisse aus den Vorversuchen lässt sich mit folgenden Geräteparametern eine Bestimmung der angestrebten spezifischen Messergebnisse für die Auswertung in einer Schrittweite von 50 μm lateral wie saggital und einer Bildwiederholrate von 2 Hz auf einem Schnitt von 1.5 x 4 mm2 erreichen:
Figure imgf000031_0001
Die Apparatur gemäß der Fig. 5 arbeitet mit nicht-linearer Fluoreszenzanregung. Dies aus folgenden Gründen:
A. Eine ausreichende Eindringtiefe ist nur innerhalb des „IR-Fensters" von ca. 750 bis 900 nm möglich.
B. Durch die nichtlineare Wirkung geschieht die Fluoreszenzanregung praktisch ausschließlich im Focus der Anregung, daher sehr lokalisiert, so dass eine hohe laterale und Tiefenauflösung erreicht wird. C. Die durch nicht-lineare Anregung gewonnenen Fluoreszenzspektren unterscheiden sich nach den bisherigen eigenen Messungen grundsätzlich von solchen, die mittels linearer Anregung , d. h. mit der halben Anregungs-Wellenlänge, gewonnen werden.
Die Ursache liegt darin, dass für den Fluoreszenzvorgang, sowohl die Anregungskinetik, als auch die Abstrahlungskinetik sowie intra-molekulare Energieübertragungsvorgänge wesentlich sind. Diese Erkenntnis ist aus einschlägigen wissenschaftlichen Untersuchungen grundsätzlich bekannt. Die damit verbundene wesentlich verbesserte Spezifität von nichtlinearen laserspektroskopischen Methoden wird inzwischen in einigen technischen und biologisch-medizinischen Applikationen fruchtbringend angewendet.
Im Rahmen von Voruntersuchungen zu dem genannten Punkt C werden Proben herangezogen und in vitro untersucht, die histopathologisch definiert waren (Basaliom/ Haut). Der neue Ansatz - nichtlineare Spektroskopie in suprazellulärer Mittelwertmessung - hat in den Untersuchungen eine sehr gute Unterscheidbarkeit zwischen Basaliom und nor- malern Gewebe ermöglicht. Es konnten in den so erzeugten Emissionsspektren Spektralbereiche identifiziert werden, die praktisch eine Ja/Nein-Entscheidung bezüglich normalem oder anomalem Zellstoffwechsel erlauben. In einer Vorstudie wurden mit diesem Verfahren inzwischen insgesamt 26 Messreihen durchgeführt und ausgewertet. Das Ergebnis ist in der Fig. 6 dargestellt.
Die Fig. 6 zeigt eine Auswertung der nichtlinear angeregten Emissionsmessungen an 26 Proben, von denen 11 gesundes und 15 krankes Gewebe darstellen. In der Ordinate ist die Lage einer aus dem Spektrum berechneten charakteristischen Wellenlänge (λChar) und in der Abszisse das Intensitätsverhältnis an zwei festgelegten Wellenlängen V(λi/λ2) aufgetragen. Die unterbrochene Linie G stellt eine Grenzkurve dar. Es ist erkennbar, dass Basaliome von normaler Haut unterschieden werden können.
Es zeigt sich, dass durch geeignete mathematische Reduzierung der Messergebnisse eine selbstreferenzierte, d.h. von der Gesamtintensität unabhängige, skalare Kenngröße ermittelt werden kann, die im Folgenden als Fluoreszenzoptischer Gewebs Indikator (FGI) bezeichnet werden soll. Der FGI zu einem bestimmten geometrischen Messpunkt im Gewebe kann aus den Intensitätswerten bei einigen charakteristischen Wellenlängen ermittelt werden. Die Auswertung dieser Messungen zeigt, dass es in nahezu eindeutiger Weise möglich ist, krankes von gesundem Gewebe mit dieser nichtlinearen Methode zu unterscheiden. Das genaue Verfahren ist Gegenstand der Patentanmeldung.
Hintergrund für diese neue Methode ist die Tatsache, dass im kranken Gewebe eine Reihe von molekularen Indikatoren vorliegen. Diese können jedoch auf Grund ihrer spektroskopischen Eigenschaften mit linearen Methoden nicht unterschieden werden, wie die Fig. 7 zeigt.
Die Fig. 7 zeigt eine konventionelle fluoreszenzspektroskopische Untersuchung (UV- induzierte Autofluoreszenz mit Einphotonen-Anregung)) von unterschiedlichen Gewebetypen (Lederhaut mit durchgezogener Linie bzw. Epithelgewebe mit gestrichelter Linie dargestellt). Aus dem Spektrum ist erkennbar, dass keine signifikanten spektroskopischen Unterschiede existieren. Dieses ist nicht verwunderlich, da die in diesem Zusammenhang betrachteten Substanzen sich in ihrem molekularen Aufbau nur sehr wenig unterscheiden. Erfahrungsgemäß ist durch die breiten Absorptionsbanden und die statistische Mittelung dann auch keine Spezifität zu erwarten.
Eine nichtlineare Methode schafft hier Abhilfe, indem die unter nichtlinearen Bedingungen deutlich verstärkten Unterschiede zwischen den verschiedenen molekularen Syste- men spektroskopisch auswertbar werden. Wie groß diese Unterschiede sind, ist in der Fig. 8 dargestellt. Die Fig. 8 zeigt das Ergebnis einer nichtlinear angeregten spektroskopische Untersuchung der unterschiedlichen Gewebetypen. Im Gegensatz zu Abb. 7 existieren signifikante Unterschiede.
Diese wenigen Beispiele sollen belegen, dass die nichtlinearen spektroskopischen Methoden einen grundsätzlich neuen Zugang zur Analytik gerade im biologischmedizinischen Bereich eröffnen. Diese speziellen Beispiele zeigen ohne Einschränkung der Allgemeinheit die Prinzipien der neuartigen Methodik und belegen ihre Realisierbarkeit. Der erfindungsgemäß breitere Ansatz ist in den dargestellte Ansprüchen und Erläu- terungen dargestellt.
Ein wesentlicher Teil des Ansatzes des erfindungsgemäßen Verfahrens ist, dass der FGI mit einer räumlichen Auflösung detektiert wird, die über das Volumen (Fokussierungsvo- lumen) von 20 bis 200.000 Zellen mittelt. Es handelt sich beim fluoreszenzoptischen Ge- websindikator also um eine suprazellulär gemittelte Größe, die das Gewebe beschreibt, und nicht um eine Kenngröße für eine Zellorganelle oder bestimmte Zellkompartimente. Erst diese Festlegung ermöglicht durch Datenreduktion auf einen dem Diagnosezweck angemessenen Umfang eine zeitliche Auswertung in Echtzeit, ohne Fixierung des Patienten über lange Zeiträume.
Die Auftragung des FGI für die bis jetzt durchgeführten Gewebsmessungen gibt eine klare Abgrenzung zwischen gesundem und krankem Gewebe (siehe Abb. A). Zusammenfassend lässt sich feststellen, dass Selektivität durch die Auswertung der Fluoreszenzdaten erzielt wird. Die zeitlich und örtlich deckungsgleiche Kombination dieser Fluoreszenzdaten mit einem OCT erlaubt die Orientierung des Arztes im Gewebe und liefert die Zuordnung der fluoreszenzoptischen Messungen zur Morphologie des untersuchten Hautareals.
Die bisherigen Untersuchungen zeigen, dass mit dem Fluoreszenzgewebeindikator FGI in Verbindung mit charakteristischen Fluoreszenzmaxima bereits bei reiner Intensitätsauswertung und Verhältnisbildung bei zwei Wellenlängen (selbstreferenziert) ein klarer Indikator für pathologische Zustände des Gewebes gefunden werden konnte.
Mit der beispielhaftdargelegten Definition des FGI wurde also bereits jetzt ein klar abzugrenzender Indikatorwert gefunden, der durch Schwellwerte eine automatische Unterscheidung zwischen gesund und krank ermöglicht. Die dargestellten erfindungsgemäßen Verfahrensgrundlagen erlauben es, die Selektivität und Spezifität weiter zu erhöhen und an vielfältige Fragestellungen spezifisch anzupassen.
So werden erfindungsgemäß zur Erreichung eines optimalen und möglichst aussagekräftigen Diagnoseziels, mit minimalen falsch-negativen und falsch-positiven Aussagen und zur Erhöhung der Diagnoseaussage, wie dargelegt, andere Wellenlängen herangezogen und/oder ein Korrelationsfaktor aus mehr als zwei Wellenlängen berechnet.
Es können aus dem Bildpunkt bzw. Fokuspunkt die Intensitätswerte der Fluoreszenzstrahlung bei zwei oder mehr signifikanten Indikator- bzw. Referenz-Wellenlängen bestimmt und ins Verhältnis gesetzt werden. Damit lässt sich die gewünschte Geschwindigkeit der Auswertung erzielen und die Möglichkeit gewinnen, in Echtzeit sowohl die Mess- Signale auszuwerten, als auch die Gut-/ Schlechtentscheidung zu treffen, sowie das Ergebnis im OCT-BiId darzustellen.
Dabei kann zusätzlich a) das Abklingverhalten, d. h. die zeitliche Komponente der Fluoreszenzab- Strahlung, sowie b) der Einfluss der Fluoreszenz-Anregungswellenlänge berücksichtigt werden. Zu a: Mittels geeigneter schneller Sensoren mit festgelegter Detektionswellenlän-. ge (beispielsweise PMT = Photo Multiplier Tubes) kann der zeitliche Verlauf durch elektronisches Gating ausgewertet werden. Zu b: Durch eine Variation der Anregungswellenlänge wird die Detektions-
Sicherheit und -Schärfe erfindungsgemäß erhöht.
Optionale zusätzliche Verfahren erlauben in ihrer Kombination mit der beschriebenen neuen Methode die Gewinnung zusätzlicher, für den Mediziner nützlicher, Informationen. Zum einen handelt es sich dabei um die mögliche Kombination mit einem OCT- Verfahren, welches für die Spezifität des beantragten neuen Verfahrens nicht erforderlich ist, dem Mediziner jedoch morphologische Zusatzinformationen gibt, die ihm die weitere Behandlung erleichtern.
In Fig. 9 ist eine weitere Ausführungsform einer Vorrichtung zur optischen Gewebeuntersuchung gezeigt. Eine Laserquelle (nicht dargestellt) ist über eine Glasfaser 30 mit einem Messkopf 31 verbunden. Über die Glasfaser 30 und der Messkopf 31 kann das Laserlicht an das zu untersuchende Gewebe heran- und hinweggeführt werden. Somit kann ähnlich einer Ultraschalluntersuchung ein weites Gewebeareal optisch „abgetastet" werden. Das rückgestreute bzw. im Gewebe angeregte Licht wird über die Glasfaser 30 in eine integrierte Auswerteeinheit geleitet, die aus den bestimmten Daten eine Bildinformation über das Gewebe generiert. Diese Bildinformation wird an einem integrierten Bildschirm 40 angezeigt.
Zusätzlich zu einem Fluoreszenzsystem kann ein OCT-System integriert sein, das synchron und örtlich deckungsgleich mit dem Fluoreszenzsystem arbeitet. Dies lässt sich mit relativ geringem apparativem Aufwand realisieren, da die Optik, der Scanner, die Laserquelle und der Signalweg des Fluoreszenzsystems genutzt werden können.
Dieses OCT liefert als wichtige Zusatzinformation die morphologische Struktur derjenigen Gewebevolumina, für die die genannten Informationen zu abweichendem Stoffwechsel fluoreszenzoptisch bestimmt werden. Damit kann diese Information unmittelbar dem morphologischen Gewebebild zugeordnet werden. Aus der geometrischen Zuordnung zum Messkopf wird so ein Bild erzeugt, das auf Ge- websstrukturen bezogen ist. Der Arzt erhält eine Aussage in welchen gewebsmorpholo- gisch charakterisierten Bereichen im Gewebe die kritischen Areale mit auffälligem Stoffwechsel liegen. Kennzeichen der Apparatur ist ein für den Praxis- bzw. Klinikalltag taugliches Medizinge- rät zur effizienten, sicheren und reproduzierbaren Tumordiagnostik. Die Wirkprinzipien, Methoden und Algorithmen, die dazu verwendet werden, sind durch die medizinischdiagnostische Zielsetzung determiniert. Dies betrifft beispielsweise die Fragestellungen von Ein- oder Mehrfarbenanregung und der spektralen und zeitlich aufgelösten Detektion der Fluoreszenz. Aus der klinischen Praxis folgen die Dimensionen des diagnostischen Beobachtungsfeldes: eine Tiefenauflösung von 0,5 - 1 ,5 mm, Schnittbilddarstellungen mit mehreren Millimetern Kantenlänge (z. B. 4 mm).
Wesentliches Kennzeichen für die diagnostische Interpretation ist dabei die Zusammenführung der fluoreszenzoptischen Daten mit morphologischen Informationen, denn nur dadurch wird beispielsweise die kanzerogene Durchdringung der Basalmembran erkennbar. Für derartige morphologische Informationen wird erfindungsgemäß das Verfahren des OCT oder die Extraktion entsprechender Fluoreszenzsignale eingesetzt.

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zur optischen Charakterisierung von aus Zellen gebildetem menschlichem oder tierischem Gewebe mit den Schritten: - Bereitstellen einer Strahlquelle zum Aussenden gerichteter elektromagnetischer
Strahlung;
- Bestrahlen des zu charakterisierenden Gewebes mit der Strahlung, wodurch im Gewebe eine für das Gewebe charakteristische Rückstrahlung erzeugt wird, wobei
- die in das Gewebe eingedrungene Strahlung innerhalb eines sich quer zu ihrer Ausbreitungsrichtung erstreckenden Anregungsbereiches eine ausreichende Intensität aufweist, um im Gewebe eine charakteristische Rückstrahlung anzuregen,
dadurch gekennzeichnet, dass
der von der Strahlquelle ausgesandten Strahlung ein derartiges Intensitätsprofil quer zu ihrer Ausbreitungsrichtung aufgeprägt wird, dass der Anregungsbereich eine Mehrzahl von Zellen des Gewebes überdeckt und die angeregte Rückstrahlung auf zellübergreifende Gewebeeigenschaften zurückgeht.
2. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass das Aufprägen des Intensitätsprofils darin besteht, die Strahlung über ein Objektiv in das Gewebe abzubilden.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Objektiv eine nu- merische Apertur von näherungsweise 0,3 bis 1 ,5 aufweist.
4. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass das Aufprägen des Intensitätsprofils darin besteht, die von der Strahlquelle ausgesandte Strahlung in mindestens zwei Teilstrahlen aufzuteilen, wobei der Anregungsbereich durch die La- ge der Teilstrahlen festgelegt ist.
5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Teilstrahlen jeweils so in das Gewebe fokussiert werden, dass die Fokuspunkte für die Teilstrahlen beabstandet zueinander sind.
6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass das Intensitätsprofil so gewählt wird, dass sich der Anregungsbereich eines einzelnen Teilstrahls quer zur- Ausbreitungsrichtung der von der Strahlquelle ausgehenden Strahlung über näherungsweise 1 bis 2.500 Zellen des Gewebes erstreckt.
7. Verfahren nach Anspruch 5 oder 6, dadurch gekennzeichnet, dass sich der Sum- menanregungsbereich der erzeugten Teilstrahlen quer zur Ausbreitungsrichtung der von der Strahlquelle ausgehenden Strahlung über näherungsweise 1.000 bis 200.000 Zellen des Gewebes erstreckt.
8. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Rückstrahlung ein Fluoreszenzsignal, eine harmonische Oberwelle der
Strahlung der Strahlquelle und/ oder ein Reflexionssignal ist.
9. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Intensität der Strahlung so gewählt wird, dass eine Zwei- oder Mehrphoto- nenanregung im Gewebe erfolgt.
10. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Rückstreustrahlung die doppelte Frequenz der Strahlung aufweist, mit der das Gewebe bestrahlt wird.
11. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die von der Strahlquelle ausgesandte Strahlung zur zusätzlichen Charakterisierung des Gewebes per Kohärenz-Reflektometrie in einen Anregungsstrahl zur Anregung einer Fluoreszenz in dem Gewebe und einen Referenzstrahl aufgeteilt wird, wobei der Anregungsstrahl zum Teil vom Gewebe zurückreflektiert und der Referenzstrahl mit der vom Gewebe zurückreflektierten Strahlung überlagert wird.
12. Verfahren nach Anspruch 11 , dadurch gekennzeichnet, dass der Referenz- und der Anregungsstrahl in einem ortsauflösenden Interferenzdetektor überlagert wer- den.
13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass der Interferenzdetektor ein ein- oder zweidimensionaler Bildgeber mit mindestens 4 Pixeln, insbesondere ein CCD-Chip, eine CCD-Kamera, eine CCD-Zeile oder eine Zeilenkamera, ist.
14. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass das der von der Strahlquelle ausgehenden Strahlung aufgeprägte Intensitätsprofil einen charakteristischen Verlauf mit mindestens zwei Intensitätsmaxima aufweist.
15. Verfahren nach Anspruch 11 , 12 und 14, dadurch gekennzeichnet, dass die optische Weglänge für den Referenzstrahl so eingestellt wird, dass sich die auf die von der Strahlquelle ausgesandten Strahlung aufgeprägte Intensitätsverteilung im Interferenzdetektor nachweisen lässt, wobei in diesem Fall die optische Weglänge für den Referenzstrahl der vom Anregungsstrahl zurückgelegten optischen Weglänge von der Strahlquelle bis zum Fokus und zurück bis zum Interferenzdetektor entspricht.
16. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass a) der Interferenzdetektor die Intensität der an ihm eintreffenden Strahlung ortsaufgelöst in einer Ebene senkrecht zur Strahlung bestimmt; b) jeweils die Intensitäten an benachbarten Orten miteinander vergleicht, um einen ortsabhängigen Kontrastwert zu ermitteln; c) aus den ortsabhängigen Kontrastwerten einen Mittelwert bestimmt, der eine charakteristische, integrale Kontrastgröße für die am Detektor eintreffende Strahlung darstellt; d) das aufgeprägte Intensitätsprofil dadurch nachgewiesen wird, dass die integrale
Kontrastgröße ein Maximum erreicht.
17. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass a) der Interferenzdetektor die Intensität der an ihm eintreffenden Strahlung ortsauf- gelöst in einer Erfassungsebene senkrecht zur Strahlung bestimmt; b) aus den bestimmten Intensitätswerten und dem auf die Strahlung der Strahlquelle aufgeprägten Intensitätsprofil einen Korrelationswert bestimmt wird; c) das aufgeprägte Intensitätsprofil dadurch nachgewiesen wird, dass der Korrelationswert ein Maximum erreicht.
18. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die von der Strahlquelle ausgesandte Strahlung quer zu ihrer Ausbreitungsrichtung so abgelenkt wird, so dass ein Bereich des Gewebes, der sich parallel zur Gewebeoberfläche erstreckt, abgetastet wird.
19. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Fokussierung der von der Strahlquelle ausgesandte Strahlung in eine Fo- kusebene zeitlich abhängig erfolgt, so dass die Fokusebene in Ausbreitungsrichtung der Strahlung verschoben wird, wodurch ein Bereich, der sich senkrecht zur Gewebeoberfläche erstreckt, abgetastet wird.
20. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die im Gewebe angeregte Rückstreustrahlung in einem Detektor nachgewiesen wird, wobei ihre Intensität in Abhängigkeit von der Wellenlänge und/oder der Zeit bestimmt wird.
21. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass
a) das Bestrahlen des Gewebes mit Strahlung im Wellenlängenbereich von 720- 800 nm erfolgt, wodurch im Gewebe eine Zweiphotonen-Fluoreszenz angeregt wird; b) Detektieren der Intensität eines ersten Fluoreszenzsignals bei einer Wellenlänge von 460±30 nm und eines zweiten Fluoreszenzsignals bei einer Wellenlänge von 550±30 nm; c) Bestimmten des Verhältnisses der Intensitäten des ersten und zweiten Fluores- zenzsignals; und d) in Abhängigkeit von dem in Schritt c) bestimmten Verhältnis ein Signal erzeugt wird.
22. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass a) das Gewebe mit Strahlung im Wellenlängenbereich zwischen 500-550 nm bestrahlt wird, und dabei b) eine erste Intensität einer Zweiphotonen-Fluoreszenz bei einer Wellenlänge von 340 ±40 nm detektiert wird; c) das Gewebe mit Strahlung im Wellenlängenbereich zwischen 720-800 nm bestrahlt wird, und dabei d) eine zweite Intensität einer Zweiphotonen-Fluoreszenz bei einer Wellenlänge von 460 ±40 nm detektiert wird; e) das Verhältnis der in Schritt b) bestimmten ersten Intensität und der in Schritt d) bestimmten zweiten Intensität bestimmt wird; und f) in Abhängigkeit von dem in Schritt e) bestimmten Verhältnis ein Signal erzeugt wird.
23. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass a) das Gewebe mit Strahlung im Wellenlängenbereich zwischen 720-800 nm be- strahlt wird, und dabei b) eine Intensität einer Zweiphotonen-Fluoreszenz bei einer Wellenlänge von 460 ±40 nm detektiert wird.
24. Verfahren nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, dass die Strahlung über ein Objektiv in das Gewebe abgebildet wird und das Objektiv entlang der Ausbreitungsrichtung der von der Strahlquelle ausgesandten Strahlung schrittweise verschoben wird, wobei die Schritte a) und b) für mehrere Objektivpositionen erfolgen, so dass der Fokus in Ausbreitungsrichtung der Strahlung durch das Gewebe geführt und ein Fluoreszenzsignal für mehrere Gewebetiefen bestimmt wird.
25. Verfahren nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, dass das Verfahren an einem gesunden Gewebe durchgeführt wird und die so bestimmten Intensitäten des Fluoreszenzsignals als Referenzwerte gespeichert werden.
26. Verfahren nach Anspruch 24 und 25, dadurch gekennzeichnet, dass a) das Verfahren gemäß Anspruch 24 an einem zu charakterisierenden Gewebe durchgeführt wird, b) die bestimmten Intensitäten für jede Tiefe zu den jeweiligen Intensitäten des gespeicherten Referenzsignals ins Verhältnis gesetzt werden; c) in Abhängigkeit von dem in Schritt b) bestimmten Verhältnis ein Signal erzeugt wird.
27. Verfahren nach Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet, dass das Signal erzeugt wird, wenn das in Schritt b) bestimmte Verhältnis näherungsweise 30% von dem Wert 1 abweicht.
28. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass a) das Bestrahlen des Gewebes mit einem Kurzpulslaserstrahl im Wellenlängenbe- reich 720-880 nm oder 980-1080 nm erfolgt; b) Detektieren der Intensität remittierender Strahlung bei der halben Wellenlänge der gemäß Schritt a) zum Bestrahlen des Gewebes verwendeten Strahlung.
29. Verfahren nach Anspruch 28, dadurch gekennzeichnet, dass die Strahlung über ein Objektiv in das Gewebe abgebildet wird und das Objektiv entlang der Ausbreitungsrichtung der von der Strahlquelle ausgesandten Strahlung schrittweise verschoben wird, wobei die Schritte a) und b) für mehrere Objektivpositionen erfolgen, so dass der Fokus in Ausbreitungsrichtung der Strahlung durch das Gewebe geführt und ein Fluoreszenzsignal für mehrere Gewebetiefen bestimmt wird.
30. Verfahren nach Anspruch 29, dadurch gekennzeichnet, dass das Verfahren an einem gesunden Gewebe durchgeführt wird und die so bestimmten Intensitäten des
Fluoreszenzsignals als Referenzwerte gespeichert werden.
31. Verfahren nach Anspruch 29 und 30, dadurch gekennzeichnet, dass a) das Verfahren gemäß Anspruch 28 an einem zu charakterisierenden Gewebe durchgeführt wird; b) die bestimmten Intensitäten für jede Tiefe zu den jeweiligen Intensitäten des gespeicherten Referenzsignals ins Verhältnis gesetzt werden; c) in Abhängigkeit von dem in Schritt b) bestimmten Verhältnis ein Signal erzeugt wird.
32. Verfahren nach Anspruch 31 , dadurch gekennzeichnet, dass das Signal erzeugt wird, wenn das in Schritt b) bestimmte Verhältnis näherungsweise 40% von dem Wert 1 abweicht.
33. Verfahren zur optischen Charakterisierung von aus Zellen gebildetem Gewebe mit den Schritten:
- Bereitstellen einer Strahlquelle zum Aussenden gerichteter Strahlung;
- Bestrahlen des zu charakterisierenden Gewebes mit der Strahlung an einer Messstelle, wodurch im Gewebe eine für das Gewebe charakteristische Rückstreustrah- lung angeregt wird,
dadurch gekennzeichnet, dass
die von der Strahlquelle ausgesandte Strahlung quer zur Ausbreitungsrichtung peri- odisch so abgelenkt wird, dass die Strahlung einen Bereich des Gewebes um die
Messstelle herum periodisch abtastet, der sich über eine Mehrzahl von Zellen des Gewebes erstreckt.
34. Verfahren nach Anspruch 33, dadurch gekennzeichnet, dass die Strahlung in das Gewebe fokussiert wird, wobei die Intensität der Strahlung so gewählt wird, dass in einem sich entlang der Ausbreitungsrichtung um den Fokus herum erstreckenden
Fokusbereich eine charakteristische Rückstrahlung angeregt wird.
35. Verfahren nach Anspruch 34, dadurch gekennzeichnet, dass der Fokusbereich in dem die charakteristische Rückstrahlung erzeugt wird, entlang der Ausbreitungsrich- tung der Strahlung periodisch bewegt wird, um ein bestimmtes Gewebevolumen um eine Messteile herum abzutasten.
36. Verfahren nach Anspruch 35, dadurch gekennzeichnet, dass das Gewebevolumen eine Ausdehnung quer zur Ausbreitungsrichtung der Strahlung von 2 bis 10 mm auf- weist.
37. Verfahren nach Anspruch 35 oder 36, dadurch gekennzeichnet, dass das Gewebevolumen eine Ausdehnung in Ausbreitungsrichtung der Strahlung von 0,3 bis 4 mm aufweist.
38. Verfahren nach einem der Ansprüche 33 bis 37, dadurch gekennzeichnet, dass die Strahlquelle eine Pulsquelle ist, die gepulste Strahlung aussendet.
39. Verfahren nach Anspruch 38, dadurch gekennzeichnet, dass die Pulsquelle eine Pulswiederholfrequenz im Bereich von 35 bis 150 MHz aufweist.
40. Verfahren nach einem der Ansprüche 33 bis 39, dadurch gekennzeichnet, dass das periodische Abtasten um eine Messstelle herum mit einer Wiederholfrequenz von 0,5 bis 2 MHz erfolgt.
41. Verfahren nach einem der Ansprüche 33 bis 40, dadurch gekennzeichnet, dass die von der Strahlquelle ausgehende Strahlung zusätzlich zur periodischen Ablenkung quer zur Ausbreitungsrichtung abgelenkt wird, um das Gewebe an mehreren Messstellen abzutasten.
42. Verfahren nach einem der Ansprüche 33 bis 41 , dadurch gekennzeichnet, dass die von der Strahlquelle ausgesandte Strahlung in mindestens zwei Teilstrahlen aufgeteilt wird.
43. Verfahren nach Anspruch 42, dadurch gekennzeichnet, dass die Teilstrahlen in das Gewebe fokussiert werden.
44. Verfahren nach Anspruch 42 oder 43, dadurch gekennzeichnet, dass die einzelnen Teilstrahlen separat oder gemeinsam abgelenkt werden.
45. Verfahren nach einem der Ansprüche 33 bis 44, dadurch gekennzeichnet, dass die Teilstrahlen so fokussiert werden, dass die Foki benachbarter Teilstrahlen einen Ab- stand zueinander aufweisen, und die Teilstrahlen um jeweils einen Betrag abgelenkt werden, der diesem Abstand entspricht, so dass Lücken zwischen den Teilstrahlen ausgeglichen werden.
46. Vorrichtung zur Durchführung eines Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 33 mit: einer Strahlquelle zum Aussenden gerichteter Strahlung zum Bestrahlen des zu charakterisierenden Gewebes, die im Gewebe eine für das Gewebe charakteristische Rückstreustrahlung anregen kann, wobei in das Gewebe eingedrungene Strahlung innerhalb eines sich quer zu ihrer Ausbreitungsrichtung erstreckenden Anregungsbereiches eine ausreichende Intensität aufweist, um im Gewebe eine charakteristische Rückstreustrahlung anzuregen,
gekennzeichnet durch
Strahlformungsmittel, mit denen der von der Strahlquelle ausgesandten Strahlung ein derartiges Intensitätsprofil aufprägbar ist, dass der Anregungsbereich eine Mehrzahl von Zellen des Gewebes überdecken kann und die beim Bestrahlen des Gewebes angeregte Rückstreustrahlung auf zeilübergreifende Gewebeeigenschaften zu- rückgeht.
47. Vorrichtung nach Anspruch 46, gekennzeichnet durch Abbildungsmittel zum Fokussieren der von der Strahlquelle ausgesandten Strahlung in das Gewebe.
48. Vorrichtung nach Anspruch 47, dadurch gekennzeichnet, dass die Abbildungsmittel von der Strahlquelle aus gesehen vor oder hinter den Strahlformungsmitteln angeordnet sind.
49. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 46 bis 48, dadurch gekennzeichnet, dass die Strahlformungsmittel die von der Strahlquelle ausgesandte Strahlung in mindestens zwei Teilstrahlen aufteilen.
50. Vorrichtung nach Anspruch 47 und 49, dadurch gekennzeichnet, dass die Abbildungsmittel mehrere Objektive umfassen und jeder Teilstrahl mit einem eigenen Objektiv in das Gewebe fokussiert wird.
51. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 46 bis 50, dadurch gekennzeichnet, dass die Abbildungsmittel mindestens ein Objektiv zum Fokussieren der Strahlung sowie eine Verstelleinheit umfassen, mit das mindestens eine Objektiv entlang der Ausbreitungsrichtung der Strahlung bewegt werden kann, um den Fokuspunkt des Objektivs entlang dieser Richtung zu bewegen und ein Abtasten des Gewebes in einer Ebene, die sich senkrecht zur Gewebeoberfläche erstreckt, zu ermöglichen.
52. Vorrichtung nach Anspruch 51 , dadurch gekennzeichnet, dass die Verstelleinheit und die Objektive in ein Gehäuse integriert sind, das auf das zu untersuchende Gewebe aufgelegt werden kann und parallel zur Gewebeoberfläche verschiebbar ist.
53. Vorrichtung nach Anspruch 52, gekennzeichnet durch elektromotorische und/oder mikromechanische Stellelemente, mit denen das Gehäuse parallel zur Gewebeoberfläche verschoben werden kann.
54. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 46 bis 53, gekennzeichnet durch eine Lichtleitfaser, die die von der Strahlquelle erzeugte Strahlung an das zu charakterisierende Gewebe heranführt.
55. Vorrichtung nach Anspruch 54, dadurch gekennzeichnet, dass die Lichtleitfaser die Abbildungsmittel und/oder die Strahlformungsmittel aufweist.
56. Vorrichtung nach Anspruch 55, dadurch gekennzeichnet, dass die Abbildungsmittel und/oder die Strahlformungsmittel einstückig mit der Lichtleitfaser ausgebildet sind.
57. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 46 bis 56, gekennzeichnet durch einen Detektor zum Detektieren der Rückstreustrahlung, der in Abhängigkeit von der detek- tierten Strahlung ein elektrisches Signal erzeugt.
58. Vorrichtung nach Anspruch 57, gekennzeichnet durch eine Auswerteeinheit zum Auswerten des vom Detektor erzeugten elektrischen Signals.
59. Vorrichtung nach Anspruch 58, dadurch gekennzeichnet, dass die Auswerteinheit das vom Detektor erzeugte elektrische Signal in ein Bildinformationssignal umsetzt.
60. Vorrichtung nach Anspruch 59, dadurch gekennzeichnet, dass die Auswerteeinheit einen Bildschirm zur visuellen Darstellung des Bildinformationssignals aufweist.
61. Vorrichtung zur Durchführung eines Verfahrens nach einem der Ansprüche 34 bis 45 mit einer Strahlquelle zum Erzeugen gerichteter Strahlung zum Bestrahlen des zu charakterisierenden Gewebes,
gekennzeichnet durch
Ablenkmittel zum Ablenken der von der Strahlquelle erzeugten Strahlung, mit denen die Strahlung quer zur Ausbreitungsrichtung periodisch ablenkbar ist, so dass die Strahlung einen Bereich des Gewebes periodisch abtasten kann, der sich über eine Mehrzahl von Zellen des Gewebes erstreckt.
62. Vorrichtung nach Anspruch 61 , dadurch gekennzeichnet, dass die Ablenkmittel ein Spiegelelement zum Ablenken der Strahlung umfassen, das durch ein elektrisches oder magnetisches Feld in eine periodische Bewegung versetzbar ist.
63. Vorrichtung nach Anspruch 61 oder 62, dadurch gekennzeichnet, dass das Spiegelelement in einer ersten Richtung quer zur Ausbreitungsrichtung der Strahlung eine erste Resonanzfrequenz aufweist und in einer zur ersten Richtung und zur Ausbreitungsrichtung der Strahlung senkrechten, zweiten Richtung eine zweite Reso- nanzfrequenz aufweist.
64. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Strahlquelle ein gepulster Laser ist.
65. Vorrichtung nach Anspruch 64, dadurch gekennzeichnet, dass der Laser Strahlung mit einer Wellenlänge zwischen 500 und 1000 nm aussendet.
66. Vorrichtung nach Anspruch 64 oder 65, dadurch gekennzeichnet, dass der Laser Pulse mit einer Pulsdaυer zwischen 80 fs und 800 ps erzeugt.
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