WO2006100740A1 - 微生物及び動物由来物の保存方法 - Google Patents

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WO2006100740A1
WO2006100740A1 PCT/JP2005/005024 JP2005005024W WO2006100740A1 WO 2006100740 A1 WO2006100740 A1 WO 2006100740A1 JP 2005005024 W JP2005005024 W JP 2005005024W WO 2006100740 A1 WO2006100740 A1 WO 2006100740A1
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animal
storage
microorganism
preservation
voltage
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PCT/JP2005/005024
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Doubun Hayashi
Tomoki Nishiyama
Mitsuo Shimada
Satoshi Ookoso
Akihiko Mitani
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Mebix, Inc.
Feel Technology Co., Ltd.
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N1/00—Preservation of bodies of humans or animals, or parts thereof
    • A01N1/02—Preservation of living parts
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N1/00—Preservation of bodies of humans or animals, or parts thereof
    • A01N1/02—Preservation of living parts
    • A01N1/0278—Physical preservation processes
    • A01N1/0294—Electromagnetic, i.e. using electromagnetic radiation or electromagnetic fields

Definitions

  • the present invention relates to a novel method for preserving microorganisms and animal-derived substances. More specifically, the present invention relates to a storage method characterized by placing microorganisms and animal-derived substances in an electrostatic field atmosphere.
  • liver transplantation from brain-dead donors has been established as a treatment for end-stage liver disease, and is already being performed in Western countries over 8,000 cases annually.
  • the organ transplantation method was finally implemented in 1997, but as of October 2003, six years have passed, only 23 cases of liver transplantation by donating liver from brain-dead people.
  • partial living donor liver transplantation with the help of the relative or spouse's power was first performed in 1989, more than 2300 cases have been performed so far, and living donor liver transplantation is now becoming a daily practice.
  • Patent Document 2 there is also a proposal of a method for preserving living microorganisms, cells, or tissues using a combination of preservatives of non-reducing disaccharide and filler.
  • Patent Document 2 both storage methods require the addition of stabilizers and complicated processing, and early improvement is desired.
  • Patent Documents 3 to 7 An apparatus for storing food in a supercooled state using an electrostatic field atmosphere has been developed by one of the present inventors (Patent Documents 3 to 7). However, they are all used only in the field of food.
  • Patent Document 1 Japanese Patent Application Laid-Open No. 8-325101
  • Patent Document 2 Special Table 2003-505024
  • Patent Document 3 Japanese Patent Laid-Open No. 10-136882
  • Patent Document 4 Japanese Patent Laid-Open No. 11 332464
  • Patent Document 5 JP 2000-297976 A
  • Patent Document 6 Japanese Patent Laid-Open No. 2001-241824
  • Patent Document 7 International Publication No. W098Z41115
  • An object of the present invention is to provide a novel method for preserving microorganisms and animal-derived materials.
  • the present inventors can preserve microorganisms and animal-derived substances in a more natural form by placing microorganisms or animal-derived substances in an electrostatic field atmosphere. As a result, the present invention has been completed.
  • this invention consists of the following.
  • a method for preserving microorganisms or animal-derived substances which comprises placing microorganisms or animal-derived substances in an electrostatic field atmosphere.
  • the electrostatic field atmosphere is formed by applying an AC or DC voltage of 100 V to 5000 V to the electrode.
  • microorganism or animal-derived substance is any of the following selected:
  • FIG. 1 is a diagram showing the results of measuring CK MB in a preservation solution when the heart is preserved under a voltage application condition. (Example 10)
  • FIG. 2 shows the results of measuring troponin T in a preservation solution when the heart is preserved under voltage application conditions. (Example 10)
  • FIG. 3 is a diagram showing the results of measuring AST, ALT and LDH in a preservation solution when the liver is preserved under a voltage application condition of 100V. (Example 13)
  • FIG. 4 is a graph showing the results of measuring AST, ALT, and LDH in a preservation solution when the liver is preserved under a voltage application condition of 3000V. (Example 13)
  • the electrostatic field atmosphere of the present invention refers to, for example, bringing a closed or open container into an electrostatic field state.
  • the electrode plate can be brought into an electrostatic state by simply placing the electrode plate in an insulated state on the bottom of the container.
  • a normal household or commercial refrigerator can be easily converted into an electrostatic field refrigerator.
  • it is formed of a horizontal plate made of an insulating material (PVC plate), side plates that can be assembled to both sides of the horizontal plate via hinges, and a bottom plate that closes the bottom of the electric field box.
  • PVC plate insulating material
  • the front and top surfaces of the refrigerator are opened and the object can be easily put in and out when the refrigerator door is opened.
  • a high voltage is applied to one of the metal bars, etc., in the connecting line or high voltage generator, and an electrostatic field is formed.
  • a storage apparatus that can be used in the method for storing a microorganism or animal-derived cell of the present invention, specifically, a container provided with an electrode for forming an electrostatic field atmosphere, and an alternating current with the electrode Or the apparatus provided with the power supply for electrostatic field generation which applies a DC voltage, and the cooling device which can hold
  • a conductive curtain may be provided.
  • This curtain is made by attaching a conductive paint to the surface of a flexible cloth, plastic, etc., or making the curtain itself thin. It may be formed by using an aluminum plate or the like.
  • the curtain is connected to the high voltage generator via a rail or the like.
  • the electrostatic field atmosphere of the present invention is formed by applying an AC or DC voltage of 100V to 5000V, preferably 100V to 3000V to the electrodes.
  • the voltage to be applied can be appropriately selected depending on the storage object and its storage state. In particular, the voltage to be applied can be selected depending on the storage solution and the material of the storage container.
  • the current may be either AC or DC.
  • the temperature that can be applied to the preservation method in the electrostatic field atmosphere of the present invention is preferably 20 to 40 ° C. 1-20-5 ° C, more preferably 1 12 1 ° C, and even more preferably 1 5 1 ° C.
  • save can be suitably selected with a preservation
  • the object to be stored can be stored without freezing due to the supercooling phenomenon.
  • the supercooling phenomenon is a phenomenon in which a substance does not freeze even at a temperature below the freezing point, which is the temperature just before the liquid begins to freeze. Even when the temperature is below the freezing point, in the electrostatic field atmosphere of the present invention, the temperature is transferred to the substance, and at the same time, micro-vibration energy is generated, the aqueous solution is not frozen, and the microorganisms and animal-derived substances are not frozen. it is conceivable that.
  • microorganism or animal-derived material is immersed in a preservation solution
  • a preservation solution means that the microorganism or animal-derived material is immersed in a preservation solution in a container such as metal or plastic.
  • Any known preservation solution for cells or the like and a future preservation solution can be used.
  • Representative examples of the preservation solution include, for example, today's transplants (Vol. 11, No. 5, September p. 549-557 (1998), Ringer's solution, Eurocollins solution, UW solution, SLS solution, HL solution, HTK solution, etc., and commercial products such as LATATECH (manufactured by Otsuka Pharmaceutical)
  • microorganism or animal-derived substance is left as it is in an electrostatic field atmosphere
  • the substance itself may be stored and stored in a container such as metal or plastic.
  • microorganisms are left as they are in an electrostatic field atmosphere, they can be put into a dead state due to a supercooling phenomenon, and purified proteins can be stored for a long time without any inactivity.
  • collected blood and its sources can be used for CPD solution (including sodium taenoate, citrate, glucose, NaH PO ⁇ 2 ⁇ )) and MAP solution (man
  • the method of the present invention can be applied to organ's tissue preservation in a transplantation region, blood component preservation in a transfusion region, component preservation in a biological product region, preservation of a plasma fractionation product, and regenerative medicine.
  • Cell's tissue preservation in the area various cultured cell preservation in the basic experimental area, gene therapy area It can be applied in areas such as storage of vectors into which genes and drugs have been introduced, specimen storage in the clinical laboratory area, and storage of purified protein in the pharmaceutical area.
  • Microorganisms and animal-derived materials applied to the preservation method of the present invention mean that they include microorganisms such as bacteria, fungi, and viruses, and substances derived from humans and animals other than humans.
  • microorganisms such as bacteria, fungi, and viruses
  • substances derived from humans and animals other than humans include microorganisms such as bacteria, fungi, and viruses, and substances derived from humans and animals other than humans.
  • the organs and tissues the heart, lung, liver, kidney, spleen, small intestine, heart valve, skin, blood vessel, cornea, eyeball, dura mater, bone, trachea, ear ossicle, etc.
  • proteins in the biological product area are components in the biological product area, such as purified proteins derived from blood and urine components such as blood coagulation factors, anticoagulation factors, thrombin, urokinase, Urinastatin, bracenta and their genetically engineered proteins, other gelatins, heparin, chondroitin, hyaluronic acid, etc. Cells in the field of regenerative medicine.
  • tissue In tissues, hematopoietic stem cells, ES cells (embryonic stem cells), bone marrow, various Factors such as biochemical samples, endocrine samples, virus samples, bacterial samples, fungal samples, immune serum samples, cellular immune samples, genes, chromosome samples, chromosome samples, hematology samples, Microbial specimens, pathological specimens, etc., in the gene therapy area, microorganisms containing vectors and genes are introduced, and in various cultured cells in the basic experimental area, vascular endothelial cells
  • Blood stem cells various cells for regenerative medicine, and the like.
  • the adult rat was anesthetized, the limbs were fixed with an 18G needle, and the abdomen was opened on the chest of the rat.
  • the aorta was clamped just below the diaphragm, the inferior vena cava and hepatic vein were clamped together, the distal part was opened, and a paper wiper was inserted.
  • the aorta was identified on the dorsal side of the left renal vein of the rat, and the kidney was slowly perfused with 5 mL of latatech (Otsuka Pharmaceutical).
  • the right and left kidneys of the rat were removed and placed in a dish containing Latatech (manufactured by Otsuka Pharmaceutical). 4 mL of the preservation solution was injected into the kidney piece using an injection needle and preserved under each preservation condition.
  • Kidney preservation 1st The sample was stored for 28 hours under the condition that no voltage was applied at 4 ° C and 500V and 1000V were applied at 5 ° C.
  • Second time The sample was stored for 28.5 hours and 67 hours, respectively, when no voltage was applied at 0 ° C and at a voltage of 100V at 3 ° C.
  • Lactate dehydrogenase (1-lactate dehydrogenase, hereinafter referred to as “LDH”) leaked into the solution when stored under the above storage conditions was measured.
  • kidney tissue sections were stained and observed with an optical microscope. The results are shown in Tables 1 and 2. Although individual differences were observed, LDH leaked into the storage solution was lower when voltage was applied than when voltage was not applied, and in both cases, good results were obtained.
  • the tissue pieces after the second 28.5 hours of storage showed degeneration findings when no voltage was applied, but no obvious degeneration was observed when voltage was applied.
  • the rat was anesthetized, the limbs were fixed with an 18G needle, and the chest strength of the rat was also applied to the abdomen and the abdomen was opened.
  • UW fluid from the portal vein (Today's transplant: Vol.11, No.5, September p.549-557 (1998)) 4mL was gently injected, the liver was perfused and removed, placed in a dish containing UW fluid, The organ was preserved. 10 mL of the preservation solution was injected into the extracted liver piece using an injection needle and refrigerated under each preservation condition. • Liver preservation
  • the liver was stored for 4 hours when no voltage was applied at 4 ° C and under the conditions of applying 500V and 1000V voltages at 5 ° C.
  • Glutamate-oxaloacetic transaminase (hereinafter “GOT”), gnoretamic acid-pyruvic acid transaminase (“GPT”),
  • Glutamate-oxaloacetic transaminase (hereinafter “GOT”), gnoretamic acid-pyruvic acid transaminase (“GPT”),
  • the results of LDH measurement are shown in Table 3. As a result, the best results were obtained when stored under conditions where a voltage of 500 V was applied.
  • the adult rat was anesthetized, the limbs were fixed with an 18G needle, and the thorax of the rat was opened against the abdomen.
  • the heart is quickly removed together with the large blood vessels, and dish (6cm) containing Ratatech (manufactured by Otsuka Pharmaceutical)
  • the heart chamber of the preserved heart was replaced with Ratatech (manufactured by Otsuka Pharmaceutical) by the autonomous heartbeat. 4 mL of the preservation solution was injected into the heart piece using an injection needle and refrigerated under each preservation condition.
  • Table 4 shows the measurement results of “CK”), GOT, and LDH.
  • Blood samples were collected by preoperative blood storage type self-transfusion for self-transfusion.
  • the collected blood was separated into red blood cells and plasma by usual centrifugation, and the red blood cell solution stored in the MAP solution was stored in a PP blood collection bag.
  • Rats were anesthetized with ether, the limbs were fixed with an 18G needle, and the laparotomy was performed from the abdomen to the neck.
  • the upper edge of the liver was cut off from the diaphragm and the diaphragm was perforated to open the thoracotomy.
  • Diaphragm leading edge After laparotomy, the ribs on both sides were cut along the sternum. Clamp the descending aorta
  • Table 7 shows the measurement results of creatine phosphokinase (CPK :), GOT, and LDH that leaked into the myocardial protective solution when stored under each condition. As a control, it was also measured after 1 hour of storage. After storage for 24 hours, the leakage of CPK, GOT, and LDH tended to be kept lower when voltage was applied than when no stamping was applied.
  • CPK creatine phosphokinase
  • Table 8 shows the measurement results of GOT, GPT, LDH, ⁇ GPT, and alkaline phosphatase (hereinafter referred to as “ALP”) leaked into the preservation solution when stored under each condition. As a control, it was also measured after 1 hour of storage. As a result, GOT, GPT, LDH and ALP tended to increase after storage for 24 hours compared to the control. There was a tendency for leakage of GOT, GPT and LDH to be kept lower when stored under voltage application conditions than when no voltage was applied.
  • Rats were anesthetized with ether, and their limbs were fixed with an 18G needle.
  • the upper edge of the liver was separated from the diaphragm force and the diaphragm was perforated for thoracotomy.
  • Clap the descending aorta after opening the diaphragm's leading edge to the left and right, inject 5 mL of organ preservation solution Lactec G (manufactured by Otsuka Pharmaceutical), and inject 3 mL of myocardial protective fluid myotector (Nisshin Oil Co., Ltd.) in the proximal part of the descending aorta
  • the heart was removed, placed in a dish containing myocector, and preserved.
  • the heart was preserved by injecting 4 mL of the preservative solution into the heart with an 18G needle, shaking lightly and applying no voltage at a force of 0 ° C, or under conditions of applying 100V or 500V.
  • Results Table 9 shows the measurement results of CPK leaked into the storage solution when stored under each condition. As a control, measurement was also performed at 30 minutes from the start of storage. As a result, after 4 hours, the CPK value almost increased compared to the control. After 24 hours of storage, when no voltage was applied, a tendency that the CPK value increased was kept low when stored under applied conditions.
  • Example 7 Unclamp the rat lower aorta after the heart was removed in Example 7, and slowly inject 4 mL of organ preservation solution beer span (manufactured by Fujisawa Pharmaceutical) as far as possible to remove the portal vein. And placed in a dish with beer span added to preserve the organs.
  • organ preservation solution beer span manufactured by Fujisawa Pharmaceutical
  • Results Table 8 shows the measurement results of GOT, GPT, LDH, ⁇ GPT, and ALP leaked into the preservation solution when stored under each condition. As a control, measurements were also taken 30 minutes after storage. As a result, GOT, GPT, LDH, and ALP showed a tendency to increase at 24 hours after liver preservation, and the leakage of each substance was better when stored under applied voltage than when not applied. Tended to be kept low.
  • the left and right kidneys were sequentially removed from the rat from which the liver had been removed in Example 9, placed in a dish to which Ratatech (manufactured by Otsuka Pharmaceutical) was added, and the organ was preserved.
  • Table 11 shows the measurement results of GOT and LDH leaked into the storage solution when stored under each condition. As a control, measurements were also taken 30 minutes after storage. As a result, after storage for 23 hours and 69 hours, the leakage of each substance was more likely to be stored under the condition where voltage was applied than when no force was applied, where GOT and LDH measured values tended to increase. There was a tendency to keep low.
  • Rats were anesthetized with ether, and their limbs were fixed with an 18G needle.
  • the upper edge of the liver was cut off from the diaphragm and the diaphragm was perforated to open the thoracotomy.
  • After laparotomy of the leading edge of the diaphragm clamp the descending aorta, inject 5 mL of organ preservation solution Ratatech G (manufactured by Otsuka Pharmaceutical), and inject 3 mL of myocardial protective fluid myotector (manufactured by Nisshin Oil) into the proximal part of the descending aorta
  • the heart was removed, placed in a dish containing myocector, and preserved.
  • the heart was preserved by injecting 4 mL of preservation solution into the heart with an 18G needle and shaking it lightly and applying no voltage at 0 ° C or under the conditions of applying 100 V or 500 V voltages.
  • Immunosuppression-measured by UV method Specifically, the following method is used.
  • the activity of the CK-1 B subunit is measured using an antibody that specifically inhibits only the CK-1 M subunit in the storage solution. By doubling that value, CK- MB activity can be determined.
  • ELIA immunochemiluminescence immunoassay
  • a pyotinylated antibody complex is generated.
  • magnetic microparticles (MP) coated with streptavidin (SA) are encapsulated and allowed to react with avidin.
  • the mixed solution is sucked into the measurement cell, and magnetic microparticles are attracted to the electrode by the magnetic force of the electrode.
  • TPA tribromine
  • Fig. 1 shows the measurement results of CKMB leaked into the preservation solution when stored under each condition
  • Fig. 2 shows the measurement results of cardiac troponin.
  • measurement was also performed at 30 minutes from the start of storage. As a result, these measured values are kept lower when the voltage is stored under applied conditions than when no printing force is applied after 24 hours of storage, and the applied voltage is better at 500V than at 100V. showed that.
  • Blood samples were collected by preoperative blood storage type self-transfusion for self-transfusion.
  • the collected blood was separated into red blood cells and plasma by usual centrifugation, and the red blood cell solution stored in the MAP solution was stored in a p p blood collection bag.
  • the MAP erythrocyte solution was dispensed in 2 mL aliquots into plastic test tube tubes and stored at 4 ° C. for each of the non-electric field group and the electric field group to which a voltage of 500 V was applied.
  • Total Hp Sodium (Na), potassium (K), free hemoglobin (free Hb) when stored under each condition ), Total haptoglobin (total Hp) was measured, and the results are shown in Table 12-15. As storage time passed, Na showed a decreasing trend and K and free Hp showed an increasing trend. For Na, K, and total Hp, the force-free Hb, which showed almost no difference between the non-electric field group and the electric field group, was more effective in suppressing the increase in the electric field group than in the non-electric field group.
  • Blood samples were collected by preoperative blood storage type self-transfusion for self-transfusion.
  • the collected blood was separated into red blood cells and plasma by usual centrifugation, and the red blood cell solution stored in the MAP solution was stored in a p p blood collection bag.
  • Na, K, free Hb, and total Hp were measured when stored under each condition, and the results are shown in Table 16-19.
  • Na decreased in the non-electric field group as the storage time progressed.
  • the force field group in which the K and free Hb increased, the decrease in Na was suppressed, and the increase in K and free Hb was observed. Inhibition was observed.
  • a voltage of 100 V, 500 V, 1000 V, 200 OV, 3000 V was applied to the organ preservation solution (UW solution) at a temperature of C, and the conditions were set so that the UW solution did not freeze. As a result, it was confirmed that when voltage was applied, it did not freeze at 4 ° C.
  • Rat livers were removed, AST, ALT, and LDH were measured in a group that had been stored in UW solution for 24 hours with a voltage of 100 V applied at 4 ° C.
  • the control group was a condition in which no voltage was applied at 4 ° C.
  • Rat livers were removed, and AST, ALT, and LDH were measured in a group that had been stored in UW solution for 24 hours at a voltage of 3000 V at 4 ° C.
  • the control group was a condition in which no voltage was applied at 4 ° C.
  • microorganisms or animal-derived materials such as organs and organs can be stored without freezing even at 0 ° C. or lower. Even in the case of o ° c or higher, blood and the like could be stored in good condition.
  • the preservation method under the electrostatic field atmosphere of the present invention it becomes possible to preserve microorganisms or animal-derived materials in a state close to nature for a longer period of time than before, particularly in transplantation areas and blood transfusions. It can be used in the field, regenerative medicine area, basic experiment area, gene therapy area, clinical examination area, pharmaceutical's reagent area, etc.

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Abstract

　微生物又は動物由来物の保存方法を提供する。 　微生物又は動物由来物を、静電場雰囲気内に置いて保存することによる。静電場雰囲気は、１００Ｖ～５０００Ｖの交流又は直流電圧を電極に印加して形成される。静電場雰囲気での保存温度は、−２０°C～４０°Cであり、静電場雰囲気でなければ微生物やヒトを含む動物由来物が、凍結しうる−１２～１°Cでも凍結させることなく保存することができる。器官、臓器・組織、細胞、血液、血漿、血清、血液製剤、精製蛋白質、組換蛋白質、培養細胞、培養組織等の保存に有用であり、特に、移植領域、輸血領域、再生医療領域、基礎実験領域、遺伝子治療領域、臨床検査領域、製薬・試薬領域等に利用することができる。

Description

明 細 書
微生物及び動物由来物の保存方法
技術分野
[0001] 本発明は、微生物及び動物由来物の新規な保存方法に関する。さらに、詳しくは、 微生物及び動物由来物を静電場雰囲気内におくことを特徴とする保存方法に関す る。
背景技術
[0002] 脳死ドナーからの肝移植は末期肝疾患に対する治療法として確立され、欧米では すでに年間 8, 000例以上行なわれている。わが国でもようやく 1997年に臓器移植 法が施行されたが、 6年を経過した 2003年 10月現在、脳死者からの肝提供による肝 移植はわずか 23例に過ぎない。一方、我が国では身内または配偶者力も肝提供をう ける生体部分肝移植が 1989年に初めて施行されて以来、現在までに 2300例以上 が実施され、生体肝移植はいまや日常の診療となりつつある。
[0003] ドナー手術と同時進行可能で、最短の冷保存が可能な生体肝移植と異なり、脳死 肝移植の場合、長時間の冷保存 (0— 4°C)が不可避である。 1980年代後半に University of Wisconsin (UW)液が開発され、冷保存時間の限界が従来の 7— 8時間 より 24時問に大幅に延長し、肝移植は緊急手術より準緊急'待機手術へと変貌を遂 げた。し力し現在でも 5— 10%の症例に移植後グラフト機能不全がみられ、実際には 16時間を超える保存ではグラフト機能不全が起こる確率が非常に高くなる。また心臓 '肺移植では保存の限界は 、まだに 6— 7時間であり緊急手術の域を出て ヽな 、の が現状である。そこで保存時間のさらなる延長が可能であれば、その各種臓器移植 に及ぼす世界的な影響はは力りしれないほど大きいと考えられる。
[0004] 臓器保存の温度に注目すれば従来の冷保存温度である 4°Cでは代謝は 1Z10に なり、 4°Cでは 1Z17になることが知られ、氷点下非凍結保存の有用性が示唆され ていた。従来、非凍結剤を用いた実験が行われてきたが、氷点下非凍結保存は可能 であるものの、非凍結剤によるグラフト障害がさけられな力つた。
[0005] 移植技術の発達により、移植対象の動物の組織等の保存方法の改良は種々検討 されている。組織を凍結させない条件での保存は、組織がより自然に近い状態にある ため好ましい保存方法である。たとえば、グルコースを含む第一液で血管内の血液を 排除かつ置換し、ジメチルスルフォキシドまたはグリセリンとマンニットを含む第二液 で第一液を置換した後、凍結させずに 0°Cな!ヽし 20°Cで保存する方法が開示されて いる（特許文献 1)。あるいは非還元二糖と充填剤との保存剤の組み合わせによる生 存微生物、細胞、または組織の保存方法の提案もある (特許文献 2)。しかし、いずれ の保存方法も、安定剤の添加や複雑な処理が必要であり、早期の改良が望まれてい る。
[0006] 食品等を静電場雰囲気を利用して過冷却状態において保存するための装置は、 本件発明者の一によつて開発されている（特許文献 3— 7)。しかし、それらはいずれ も食品の分野でのみ利用されて 、たにすぎな 、。
[0007] 特許文献 1 :特開平 8— 325101号公報
特許文献 2：特表 2003— 505024号公報
特許文献 3 :特開平 10- 136882号公報
特許文献 4：特開平 11 332464号公報
特許文献 5：特開 2000-297976号公報
特許文献 6：特開 2001— 241824号公報
特許文献 7：国際公開 W098Z41115号公報
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0008] 微生物及び動物由来物の新規な保存方法の提供が、本発明の課題である。
課題を解決するための手段
[0009] 上記課題を解決するために鋭意検討した結果、本発明者らは、微生物又は動物由 来物を静電場雰囲気におくことで微生物及び動物由来物をより自然な形で保存しう ることを見出し、本発明を完成した。
つまり本発明は以下からなる。
1.微生物又は動物由来物を、静電場雰囲気内におくことを特徴とする微生物又は 動物由来物の保存方法。 2.静電場雰囲気が、 100V— 5000Vの交流又は直流電圧を電極に印加して形成さ れる前項 1に記載の保存方法。
3.微生物又は動物由来物を、 20°C— 40°Cで静電場雰囲気内におくことを特徴と する前項 1又は 2に記載の保存方法。
4.微生物又は動物由来物が、保存液中に浸漬状態である前項 1一 3の何れか一に 記載の保存方法。
5.微生物又は動物由来物が、静電場雰囲気中にそのまま存置される前項 1一 3の 何れか一に記載の保存方法。
6.微生物又は動物由来物が以下力 選択される何れかである前項 1一 5の何れか 一に記載の保存方法；
臓器，組織、気管、血液成分、生物由来製剤、培養細胞，培養組織、遺伝子、核酸、 ウィルス、細菌、真菌、精製蛋白質、遺伝子組換蛋白質、臨床検査用検体。
発明の効果
[0010] 本発明の静電場雰囲気に器官や臓器等を保存することにより、組織等を損傷する ことなく長期保存することが可能となる。すなわち、本発明の方法では微生物又は動 物由来物を長期間の間自然に近い状態で、微生物または動物由来物が有する活性 を不活ィ匕若しくは不活性化させることなぐ又は死滅化させることなく保存することが できる。
図面の簡単な説明
[0011] [図 1]心臓を電圧印加条件下で保存したときの保存液中の CK MBを測定した結果 を示す図である。（実施例 10)
[図 2]心臓を電圧印加条件下で保存したときの保存液中のトロポニン Tを測定した結 果を示す図である。（実施例 10)
[図 3]肝臓を 100Vの電圧印加条件下で保存したときの保存液中の AST、 ALT及び LDHを測定した結果を示す図である。（実施例 13)
[図 4]肝臓を 3000Vの電圧印加条件下で保存したときの保存液中の AST、 ALT及 び LDHを測定した結果を示す図である。（実施例 13)
発明を実施するための最良の形態 [0012] 臓器保存においては、氷点下非凍結保存により代謝が押さえられること、抗酸化作 用により再灌流時の酸化ストレスを押さえ虚血再灌流障害を軽減する可能性がある。 臓器を静電場雰囲気に置き微振動のエネルギーを与えることで、通常では凍結して しまう温度、例えば一 5°C程度であっても、器官や臓器等が凍結するのを防ぎ、損傷 することなく長期保存することが可能となる。
[0013] 本発明の静電場雰囲気とは、例えば閉鎖系又は開放系の容器内を静電場状態に することをいう。電場雰囲気とするために、種々の手段が公知であるが、例えば容器 内の底部に単に電極板を絶縁状態で載置することにより静電場状態にすることがで きる。また、通常の家庭用又は業務用の冷蔵庫を簡便に静電場冷蔵庫に変換するこ とができる。例えば絶縁材料 (塩ビ板)からなる横板と、この横板の両側にヒンジを介 して組立て自在とされた側板と、電場箱の底部を閉塞する底板から形成される。そし て、その前面と上面は開放されて冷蔵庫の扉を開いたときに対象物の出入が容易に 行ない得る。接続線、高電圧発生装置で、高電圧がいずれかの金属棒等に印加さ れ、静電場が形成される。
[0014] 本発明の微生物又は動物由来細胞の保存方法に使用することができる保存装置と して、具体的には、静電場雰囲気を形成させるための電極を備えた容器と、該電極 に交流または直流電圧を印加する静電場発生用電源と、上記容器に、例えば動物 の臓器を冷蔵温度に保持できる冷却装置とを備えた装置を例示することができる。
[0015] 更に、冷蔵室内の空気を帯電させるためには、導電性カーテンを設けてもよぐこの カーテンは柔軟な布、プラスチック等の表面に導電性塗料を付着せしめたり、カーテ ン自体を薄いアルミ板等にすることにより形成してもよい。そして、カーテンは、レール 等を介して高電圧発生装置に接続される。
[0016] 本発明の静電場雰囲気は、 100V— 5000V、好ましくは 100V— 3000Vの交流又 は直流電圧を電極に印加して形成される。印加する電圧は、保存対象物やその保存 状態により適宜選択することができる。特に、保存液中で保存する場合や保存容器 の材質により、印加する電圧を選択することができる。電流は交流、直流のいずれで あってもよい。
[0017] 本発明の静電場雰囲気におく保存方法に適用されうる温度は、一 20— 40°C、好ま しくは一 20— 5°C、より好ましくは一 12 1°C、さらに好ましくは一 5 1°Cである
。保存する温度は、保存対象物やその保存状態により適宜選択することができる。特 に例えば 0°C以下であっても、過冷却現象により、保存対象物を凍結させることなく保 存することができる。ここに過冷却現象とは、液体が凍り始める寸前の温度である氷 結点を下回る温度であっても物質が凍らな 、現象を 、う。氷結点を下回る温度の場 合でも、本発明の静電場雰囲気下では、物質へ温度を伝えると同時に微振動エネル ギ一が起こり、水溶液は凍結せず、微生物及び動物由来物の凍結もおこらないと考 えられる。
[0018] 微生物又は動物由来物が保存液中に浸漬状態であるとは、微生物及び動物由来 物が金属やプラスチック等の容器内の保存液中に浸って 、る状態を 、 、、一般的に 公知のあらゆる細胞等の保存液や今後開発される保存液を利用することができる。 保存液の代表的なものとして、例えば今日の移植 (Vol. 11, No. 5, September p. 549-557 (1998》に例示されるリンゲル液、ユーロコリンズ溶液、 UW溶液、 SLS溶液 、 H-L溶液、 HTK溶液等や、市販品、例えばラタテック (大塚製薬製)が挙げられる
[0019] 微生物又は動物由来物が、静電場雰囲気中にそのまま存置されるとは、微生物又 は動物由来物が、水溶液中におかれることなくそのまま静電場雰囲気中におかれる ことを 、 、、物質そのものが金属やプラスチック等の容器内に収納されて保存されて いても良い。例えば、微生物を静電場雰囲気中にそのまま存置すると、過冷却現象 により仮死状態とすることができ、精製蛋白質であれば、そのまま安定に不活ィ匕の心 配なく長期保存することが可能である。また、採血した血液やその由来物を、 CPD液 (タエン酸ナトリウム、クェン酸、グルコース、 NaH PO ·2Η Οを含む）や MAP液（マン
2 4 2
-ト一一ル、アデニン、リン酸を含む)等を含むプラスチック (PP)製等の採血用バッグ に入れて、静電場雰囲気中にそのまま存置すると、例えば 0°C以上でも安定に保存 することができる。
[0020] カゝくして、本発明の方法は、移植領域での臓器'組織保存、輸血領域での血液成 分保存、生物由来製剤領域での成分保存、血漿分画製剤の保存、再生医療領域で の細胞'組織保存、基礎実験領域での各種培養細胞保存、遺伝子治療領域での遺 伝子および薬剤を導入したベクターの保存、臨床検査領域での検体保存、製薬'試 薬領域での精製蛋白質保存等の領域で適用することができる。
[0021] 本発明の保存方法に適用される微生物及び動物由来物は、細菌、真菌類、ウィル ス等の微生物、ヒト及びヒト以外の動物由来の物質を含むことを意味し、例えば移植 領域での臓器，組織では、心臓、肺、肝臓、腎臓、脾臓、小腸、心臓弁、皮膚、血管、 角膜、眼球、硬膜、骨、気管、耳小骨等が、輸血領域での血液成分では、血小板、 白血球、赤血球、さい帯血、血漿各成分、各種因子等が、生物由来製剤領域での成 分では、血液や尿成分由来の精製蛋白質、例えば血液凝固因子、抗凝固因子、トロ ンビン、ゥロキナーゼ、ゥリナスタチン、ブラセンタやこれらの遺伝子組換蛋白質、そ の他ゼラチン、へパリン、コンドロイチン、ヒアルロン酸等力 再生医療領域での細胞' 組織では、造血幹細胞、 ES細胞 (胚性幹細胞）、骨髄、各種因子等が、臨床検査領 域での検体では、生化学検体、内分泌検体、ウィルス検体、細菌検体、真菌検体、 免疫血清検体、細胞性免疫検体、遺伝子、染色体検体、染色体検体、血液学検体 、微生物検体、病理学検体等が、遺伝子治療領域では遺伝子および薬剤を導入し たベクターを含む微生物が、基礎実験領域での各種培養細胞では、血管内皮細胞
、血液幹細胞、再生医療用各種細胞等を挙げることができる。
実施例
[0022] 以下に実施例で本発明を説明するが、これらは本発明の典型的代表例を示すもの であって、本発明はこれらに限定されるものではない。
[0023] (実施例 1)腎臓
• 腎臓の摘出及び保存
ラット成獣を麻酔し、四肢を 18G針で固定し、ラットの胸力 腹にかけて開腹した。 横隔膜直下で大動脈をクランプし、下大静脈'肝静脈を併せクランプし、その遠位部 を開窓し、紙ワイパーを挿入した。該ラットの左腎静脈の背側に大動脈を同定し、ラタ テック (大塚製薬製) 5mLで腎臓をゆっくり灌流した。
該ラットの左右の腎臓を摘出し、ラタテック（大塚製薬製)を含むデッシュに置いた。 腎臓片に注射針を用いて 4mLの保存液を注入し、各保存条件で保存した。
• 腎臓の保存 1回目： 4°Cで電圧を印加しない場合及び 5°Cで 500V， 1000Vの各電圧を印加 した条件下で、 28時間保存した。
2回目：0°C電圧を印加しない場合及び 3°Cで 100Vの電圧を印加した条件下で、 各々 28. 5時間及び 67時間保存した。
• 結果
上記保存条件下で保存したときの液中に漏出した乳酸脱水素酵素（1-lactate dehydrogenase,以下「LDH」）を測定した。さらに、 2回目には腎臓組織切片を染色 し、光学顕微鏡にて観察した。その結果を表 1及び表 2に示した。個体差は認められ たものの、電圧をかけない場合よりも電圧をかけた場合のほうが保存溶液に漏出した LDHの値は低値であり、いずれの場合も良好な結果を示した。また、 2回目の 28. 5 時間保存後の組織片は、電圧をかけない場合では変性所見が観察されたが、電圧 をかけた場合には明らかな変性は観察されなかった。
[表 1]
^βΐ Ξ百
Figure imgf000008_0002
[表 2]
Figure imgf000008_0001
(実施例 2)肝臓
• 肝臓の摘出
ラット成獣を麻酔し、四肢を 18G針で固定し、ラットの胸力も腹に力けて開腹した。 門脈から UW液（今日の移植: Vol.11, No.5, September p.549- 557(1998)) 4mLをゆ つくり注入し、肝臓を灌流 '摘出し、 UW液を含むデッシュに置き、臓器保存した。摘 出した肝臓片に注射針を用いて 10mLの保存液を注入し、各保存条件で冷蔵した。 • 肝臓の保存
4°Cで電圧を印加しな 、場合及び 5°Cで 500V, 1000Vの各電圧を印加した条 件下で、肝臓を 4時間保存した。
• 結果
各条件下で保存したときの保存液内に漏出したグルタミン酸 ォキサ口酢酸トランス アミナーゼ（glutamic- oxaloacetic transaminase,以下「GOT」），グノレタミン酸—ピルビ ン酸トランスアミナーゼ（glutamic- pyruvic transaminase 以下「GPT」）， LDHの測定 結果を表 3に示した。その結果、 500Vの電圧を印加した条件下で保存した場合に 最も良好な結果が得られた。
[表 3]
Figure imgf000009_0001
(実施例 3)心臓
• 心臓の摘出及び保存
ラット成獣を麻酔し、四肢を 18G針で固定し、ラットの胸力も腹に力けて開胸した。 心臓を大血管と共に速やかに摘出し、ラタテック（大塚製薬製)を含むデッシュ（6cm
)に置き、臓器保存した。
自律心拍により、保存した心臓の心腔内はラタテック (大塚製薬製）に置換された。 心臓片に注射針を用いて 4mLの保存液を注入し、各保存条件で冷蔵した。
• 心臓の保存 4°Cで電圧を印加しな!、場合及び 5°Cで 500V, 1000Vの各電圧を印加した条 件下で、心臓を 4時間保存したときの保存液内の GOT, GPT, LDHを測定した。ま た、組織切片を染色し、光学顕微鏡にて観察した。
• 結果
各条件下で保存したときの保存液内に漏出したクレアチンキナーゼ (creatine kinase,
以下「CK」）， GOT,及び LDHの測定結果を表 4に示した。その結果、電圧を印加 しない場合よりも印加したときのほうが、保存溶液に漏出した CK, GOT,及び LDH の値は低値であり、良好な結果を示した。心筋組織は、各条件において細胞質及び 核ともに明らかな変化は認められず、良好であった。
[表 4]
心臓
Figure imgf000010_0001
(実施例 4)赤血球
• 赤血球の取得
自己輸血のために術前貯血式自己輸血する方法により採血した。採血した血液を 通常行う遠心分離により赤血球と血漿に分離し、 MAP液で保存した赤血球溶液を P P採血用バックに保存した。
• 赤血球の保存
該 MAP赤血球溶液を、 2mLずつプラスチック製試験管チューブに分注し、 4°Cで 、電圧を印加しな！ヽ非電場群及び 3000Vの電圧を印加した電場群の条件で保存し た。
• 結果
該 MAP赤血球溶液を各条件下で保存したときの保存状態を観察し、その結果を 表 5及び表 6に示した。保存後 7日目でも電圧印加しない場合よりも印加した場合の ほうが pHの変化及びカリウム (K)の漏出度の変化が少なぐ保存条件として良好で あることが確認された (表 5)。さらに、保存後 15日であっても、電圧印加しない場合よ りも印加した場合のほうがカリウム (K)の漏出度が少なぐナトリウム (Na)量の変化も 少なぐ保存条件として良好であることが確認された (表 6)。
[表 5]
Figure imgf000011_0001
[表 6]
Figure imgf000011_0002
(実施例 5)心臓片
• 心臓の摘出及び保存
ラット雄成獣をエーテル麻酔し、四肢を 18G針で固定し、腹から頸にかけて左右に 開腹した。肝臓の上縁を横隔膜から切離し横隔膜を穿孔して開胸した。横隔膜前縁 を左右に開腹した後、胸骨に沿って両側の肋骨を切断した。下行大動脈をクランプし
、臓器心筋保護液ラタテック G (大塚製薬製)を 5mL注入し、下行大動脈近位部に心 筋保護液ミオテクター (日清製油製)を 3mL注入し、心臓を摘出し、ミオテクターを含 むデッシュに置き、臓器保存した。
• 心臓の保存
18G針で 4mLの心筋保護液を心臓に注入し、軽く揺らしてから 2°Cで電圧を印加 しな 、場合及び 100V, 500Vの各電圧を印加した条件下で保存した。
• 結果
各条件下で保存したときの心筋保護液内に漏出したクレアチンホスホキナーゼ（ creation phospho kinase,以下「CPK：」）， GOT, LDHの測定結果を表 7に示した。 対照として保存 1時間後についても測定した。 24時間保存後、印カロしない場合に比 ベて電圧を印加したほうが CPK、 GOT及び LDHの漏出が低く抑えられる傾向が認 められた。
[表 7]
Figure imgf000012_0001
(実施例 6)肝臓
• 肝臓の摘出及び保存
実施例 5で心臓が摘出された後のラットの下大動脈のクランプをはずし、門脈のな るべく遠位力も臓器保存液ビアスパン (藤沢薬品工業製) 4mLをゆっくり注入し、肝 臓を摘
出し、ビアスパンを加えたデッシュに置き、臓器保存した。
• 肝臓の保存
18G針で 10mLの保存液を肝臓に注入し、軽く揺らしてから 2°Cで電圧を印加しな V、場合及び 100V， 500Vの各電圧を印加した条件下で保存した。
• 結果
各条件下で保存したときの保存液内に漏出した GOT, GPT, LDH, γ GPT,ァ ルカリホスファターゼ（alkaline phosphatase,以下「ALP」）の測定結果を表 8に示した 。対照として保存 1時間後についても測定した。その結果、 24時間保存後では対照 に比べて GOT, GPT, LDH及び ALPは増加の傾向が認められた。印加しない場 合に比べて、電圧印加の条件下で保存したほうが、 GOT, GPT及び LDHの漏出が 低く抑えられる傾向が認められた。
[表 8]
Figure imgf000013_0001
(実施例 7)心臓片
• 心臓の摘出及び保存
ラット雄成獣をエーテル麻酔し、四肢を 18G針で固定し、腹力も頸にかけて皮切を おいて左右に開腹した。肝臓の上縁を横隔膜力も切離し横隔膜を穿孔して開胸した 。横隔膜前縁を左右に開腹した後、下行大動脈をクランプし、臓器保存液ラクテック G (大塚製薬製)を 5mL注入し、下行大動脈近位部に心筋保護液ミオテクター（日清 製油製)を 3mL注入し、心臓を摘出し、ミオテクターを含むデッシュに置き、臓器保存 した。
• 心臓の保存
18G針で 4mLの保存液を心臓に注入し、軽く揺らして力 0°Cで電圧を印加しな ヽ 場合及び 100V、 500Vの各電圧を印加した条件下で、心臓を保存した。
• 結果 各条件下で保存したときの保存液内に漏出した CPKの測定結果を表 9に示した。 対照として保存開始 30分についても測定した。その結果、 4時間後では、対照に比 ベて CPK値はほとんど増加しな力つた。 24時間保存後では、印加しない場合は CP K値が増加していた力 電圧を印加条件下で保存すると低く抑えられる傾向が認めら れた。
[表 9]
Figure imgf000014_0001
(実施例 8)肝臓
• 肝臓の摘出及び保存
実施例 7で心臓が摘出された後のラットの下大動脈のクランプをはずし、門脈のな るべく遠位力も臓器保存液ビアスパン (藤沢薬品工業製)4 mLをゆっくり注入し、肝 臓を摘出し、ビアスパンを加えたデッシュに置き、臓器保存した。
• 肝臓の保存
18G針で 10mLの保存液を肝臓に注入し、軽く揺らしてカゝら 0°Cで電圧を印加しな V、場合及び 100V， 500Vの各電圧を印加した条件下で保存した。
• 結果 各条件下で保存したときの保存液内に漏出した GOT, GPT, LDH, γ GPT, AL Pの測定結果を表 8に示した。対照として、保存 30分後についても測定した。その結 果、肝臓保存後 24時間では GOT, GPT, LDH及び ALPは増加の傾向が認められ た力 S、印加しない場合に比べて、電圧を印加した条件で保存したほうが、各物質の漏 出が低く抑えられる傾向が認められた。
[表 10]
Figure imgf000015_0001
(実施例 10)腎臓
• 肝臓の摘出及び保存
実施例 9で肝臓が摘出された後のラットから左右の腎臓を順次摘出し、ラタテック（ 大塚製薬製)を加えたデッシュに置き、臓器保存した。
• 腎臓の保存
18G針で 4mLの保存液を腎臓に注入し、軽く揺らして力 0°Cで電圧を印加しな ヽ 場合及び 100V, 500Vの各電圧を印加した条件下で保存した。
• 結果
各条件下で保存したときの保存液内に漏出した GOT及び LDHの測定結果を表 1 1に示した。対照として、保存 30分後についても測定した。その結果、 23時間及び 6 9時間保存後では GOT及び LDHの測定値が増加の傾向が認められた力 印加しな い場合に比べて、電圧を印加した条件で保存したほうが、各物質の漏出が低く抑え られる傾向が認められた。
[表 11] 保存時 保存 iS度
CO) V e m! GOT LDH
1.66 4 <4 <24
1.50 4 <4 <14
1.65 4 <4 <24
1.51 4 <4 <24
対照 0.5 ：白
王 <πα 0
1.81 4 ぐ 4 <2
1.55 4 26 27
1.46 4 10 38
1.63 4 <4 69
0 1.66 4 14 402
A- J 23 0
500 1.65 4 6 1 1 1
0 1.50 4 8 165
A-2 0
500 1.51 4 <4 50
0 1.42 4 69 1333
B-1 6S 0
100 1.49 4 52 557
0 1.42 4 73 1355
B-2 69 0
100 1.35 4 31 504
[0032] (実施例 10)心臓
1)心臓の摘出及び保存
ラット雄成獣をエーテル麻酔し、四肢を 18G針で固定し、腹力 頸にかけて皮切を おいて左右に開腹した。肝臓の上縁を横隔膜から切離し横隔膜を穿孔して開胸した 。横隔膜前縁を左右に開腹した後、下行大動脈をクランプし、臓器保存液ラタテック G (大塚製薬製)を 5mL注入し、下行大動脈近位部に心筋保護液ミオテクター（日清 製油製)を 3mL注入し、心臓を摘出し、ミオテクターを含むデッシュに置き、臓器保存 した。
[0033] 2)心臓の保存
18G針で 4mLの保存液を心臓に注入し、軽く揺らして力も 0°Cで電圧を印加しな ヽ 場合及び 100V、 500Vの各電圧を印加した条件下で、心臓を保存した。
[0034] 3) CK— MBの測定
免疫阻止 - UV法により測定する。具体的には、次の方法による。上記の保存条件 にて心臓を保存したときの保存液中の CK一 Mサブユニットのみを特異的に阻害する 抗体を用い CK一 Bサブユニットの活性を測定する。その値を 2倍することにより、 CK- MBの活性を求めることができる。
[0035] 4)トロポニン Tの測定
免疫化学発光免疫測定法 (ECLIA)により測定する。本法は電気化学発光反応を 用いたステップサンドイッチ法である。検体内のトロポニン Tとピオチンィ匕抗トロポニン T抗体をよび Ru(bpy) 2+標識抗トロポニン T抗体を反応させ、標識抗体 トロポニン T
3
ピオチン化抗体複合物を生成させる。次にストレプトアビジン (SA)をコーティングし た磁性マイクロパーティクル (MP)をカ卩えてアビジン ピオチン反応をさせる。反応終 了後、混合溶液を測定セル内に吸引し、電極の磁力により磁性マイクロパーティクル を電極に引き付ける。電気供与物質である、トリブロアミン (TPA)にて BZF分離を行 い、電極による酸ィ匕反応と TPAラジカルの還元作用により生じる Ru2+錯体からの発 光量を測定し、トロポニン T量を測定する。
[0036] 5)結果
各条件下で保存したときの保存液内に漏出した CK MBの測定結果を図 1に、心 筋トロポニンの測定結果を図 2に示した。対照として保存開始 30分についても測定し た。その結果、 24時間保存後では印力!]しない場合に比べて電圧を印加条件下で保 存したほうが、これらの測定値が低く抑えられ、印加電圧が 100Vよりも 500Vの方が 良好な結果を示した。
[0037] (実施例 11)赤血球
1)赤血球の取得
自己輸血のために術前貯血式自己輸血する方法により採血した。採血した血液を 通常行う遠心分離により赤血球と血漿に分離し、 MAP液で保存した赤血球溶液を p p採血用バックに保存した。
2)赤血球の保存
該 MAP赤血球溶液を、 2mLずつプラスチック製試験管チューブに分注し、電圧を 印加しな!ヽ非電場群及び 500Vの電圧を印加した電場群につ ヽて各々 4°Cで保存し た。
3)結果
各条件で保存したときのナトリウム (Na)、カリウム (K)、遊離ヘモグロビン (遊離 Hb )、総ハプトグロビン (総 Hp)を測定し、その結果を表 12— 15に示した。保存時間経 過に伴い、 Naは減少傾向を認め、 K及び遊離 Hpは増加傾向を認めた。 Na、 K及び 総 Hpにつ 、ては非電場群と電場群ではほとんど差を認めな力 た力 遊離 Hbは非 電場群に比べて電場群のほうが増加抑制効果が認められた。
12]
Mag CmEq/L)
Figure imgf000018_0001
[表 13]
Κ韹 (mEq/L)
Figure imgf000018_0002
14]
お Ht>
件 _____ ή後 5曰後 10Β後 15曰後 20日後 25曰後 30日後
2 1 1 42 ( 3 51 23 62
（4 、0 V)
2 9 29 1 4 28 27 44
2 ― 18 1 6 33 24 37
¾«群 (4°C. 500V)
2 8 - 5 7 26 表 15] 一. "~ - ~~ (SWlW!l
¾後 5日後 10曰後 15曰後 20日後 25日後 30曰後
44 35 40 38 32 38 35
* 場群 (4¾. O V)
41 38 40 40 36 43 35
44 41 45 44 38 40 36 跳群 （4 , 500V)
41 43 43 42 44 48 41 (実施例 12)赤血球
1)赤血球の取得
自己輸血のために術前貯血式自己輸血する方法により採血した。採血した血液を 通常行う遠心分離により赤血球と血漿に分離し、 MAP液で保存した赤血球溶液を p p採血用バックに保存した。
2)赤血球の保存
該 MAP赤血球溶液を、 2mLずつプラスチック製試験管チューブに分注し、電圧を 印加しな!ヽ非電場群及び 3000Vの電圧を印加した電場群につ ヽて各々 4°Cで保存 した。
3)結果
各条件で保存したときの Na、 K、遊離 Hb、総 Hpを測定し、その結果を表 16— 19 に示した。保存時間経過に伴い非電場群では Naは減少傾向を認め、 K及び遊離 H bは増加傾向を認めた力 電場群では Naの減少は抑制され、 K及び遊離 Hbの増加 傾向につ ヽても抑制が認められた。
[表 16]
Nag CmEq/L)
保存 5 ft後 5曰後 10曰後 150後 20日後 25曰後 30曰後
117 104 10t 95 101 92 86 場群 （4¾ 0 V)
122 111 107 102 98 92 92
¾«群 （4¾、 3000V) 117 ΪΖ4 Ϊ26 124 U8 119 1Ϊ7
122 117 M\ 120 114 110 111 表 17]
g (mEq/L)
Figure imgf000019_0001
遊! ttHb
Figure imgf000020_0001
[表 19]
Figure imgf000020_0002
(実施例 13)肝臓
A)温度条件の検討
-4°C, -5°C,— 6。Cの温度で臓器保存液（UW液）に 100V, 500V, 1000V, 200 OV, 3000Vの電圧印加を行い、 UW液が氷結しない条件を設定した。その結果、電 圧を印加したときは 4°Cで凍結しないことが確認された。
B)電圧印加条件（4°C0V, - 4°C、 100V)
ラットの肝臓を摘出し、 4°Cにて電圧を 100Vを印加して UW液中で 24時間保存し た群の AST, ALT,及び LDHを測定した。 4°Cで電圧を印加しない条件を対照群と した。
その結果を図 3に示した。対照群に比べ、 4°Cにて電圧を 100Vを印加したときの 方が AST, ALT,及び LDHのすべてについて低値を示し、良好であった。
C)電圧印力 Π条件（4oC0V， 4。C、 3000V)
ラットの肝臓を摘出し、 4°Cにて電圧を 3000Vを印加して UW液中で 24時間保存し た群の AST, ALT,及び LDHを測定した。 4°Cで電圧を印加しない条件を対照群と した。
その結果を図 4に示した。対照群及び電圧を印加群の間に AST, ALT,及び LD Hの有効な差異は認められなかった。 産業上の利用可能性
以上説明したように、本発明の静電場雰囲気下におくと、 0°C以下であっても微生 物又は動物由来物、例えば、器官や臓器等を凍結させることなく保存することができ 、 o°c以上の場合であっても血液等について良好な状態で保存することができた。つ まり、本発明の静電場雰囲気下による保存方法を適用することで、従来よりも長期間 の間、微生物又は動物由来物を自然に近い状態で保存することが可能となり、特に 移植領域、輸血領域、再生医療領域、基礎実験領域、遺伝子治療領域、臨床検査 領域、製薬'試薬領域等に利用することができる。

Claims

請求の範囲
[1] 微生物又は動物由来物を、静電場雰囲気内におくことを特徴とする微生物又は動物 由来物の保存方法。
[2] 静電場雰囲気が、 100V— 5000Vの交流又は直流電圧を電極に印加して形成され る請求項 1に記載の保存方法。
[3] 微生物又は動物由来物を、 - 20°C— 40°Cで静電場雰囲気内におくことを特徴とす る請求項 1又は 2に記載の保存方法。
[4] 微生物又は動物由来物が、保存液中に浸漬状態である請求項 1一 3の何れか一に 記載の保存方法。
[5] 微生物又は動物由来物が、静電場雰囲気中にそのまま存置される請求項 1一 3の何 れかーに記載の保存方法。
[6] 微生物又は動物由来物が以下力 選択される何れかである請求項 1一 5の何れか一 に記載の保存方法;臓器，組織、気管、血液成分、生物由来製剤、培養細胞，培養 組織、遺伝子、核酸、ウィルス、細菌、真菌、精製蛋白質、遺伝子組換蛋白質、臨床 検査用検体。
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