WO2006092230A2 - Proteinbindende camptothecin-peptid-derivate und diese enthaltende arzneimittel - Google Patents

Proteinbindende camptothecin-peptid-derivate und diese enthaltende arzneimittel Download PDF

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WO2006092230A2
WO2006092230A2 PCT/EP2006/001624 EP2006001624W WO2006092230A2 WO 2006092230 A2 WO2006092230 A2 WO 2006092230A2 EP 2006001624 W EP2006001624 W EP 2006001624W WO 2006092230 A2 WO2006092230 A2 WO 2006092230A2
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WO
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camptothecin
camptothecin derivative
derivative according
leucine
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Felix Kratz
André WARNECKE
Björn Schmid
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Ktb Tumorforschungsgesellschaft Mbh
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    • C07K7/06—Linear peptides containing only normal peptide links having 5 to 11 amino acids
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents

Definitions

  • the invention relates to camptothecin-peptide derivatives which contain a protein-binding group and, with the involvement of cathepsins B and / or D, are enzymatically cleavable in the body with release of the active substance or of a low-molecular-weight active substance derivative.
  • Camptothecin is an alkaloid with antitumor properties (Wall ME, et al., J. Am.Chem.Soc., 1966, 88, 3888-3890), whose derivatives, such as topotecan or (rinotecan) are used to treat various cancers (Kollmannsberger C , Oncology 1999, 56, 1-12, Rothenberg ML Oncologist 2001, 6, 66-80)
  • therapies with these drugs are accompanied by side effects to improve the side effect profile and efficacy of CPT and CPT derivatives, respectively , macromolecular transport of CPT has been demonstrated by coupling the drug to synthetic polymers such as poly (ethylene glycol) (Greenwald RB, et al., Bioorg. Med.
  • the invention has for its object to provide prodrugs of CPT, the release CPT or CPT derivatives in the tumor. This object is achieved by camptothecin-peptide derivatives of the general formula
  • R i H or OH
  • R 2 H, NH 2 , NO 2 or ⁇ /, ⁇ / -dimethylaminomethyl
  • R 4 H, alkyl or aryl
  • R 5 H, alkyl or aryl, of which the latter two may optionally be substituted
  • P1-P4 L- or D-amino acids
  • n 0 to 3
  • m 1 to 3
  • k 0 to 5
  • PM is a protein binding group.
  • An integrated hydrolytically or enzymatically cleavable predetermined breaking point in this case allows a controlled release of the active ingredient or an aminoacyl-drug derivative in vivo, so that camptothecin derivatives of the present invention are prodrugs.
  • the CPT derivatives of the invention are composed of an antitumorally active camptothecin component, a spacer molecule, a peptide chain and a heterobifunctional crosslinker. This structure is explained in more detail below: - -
  • the antitumor active CPT component is an active ingredient of the general formula
  • R 1 H, OH
  • R 2 H, NH 2 , NO 2 or ⁇ /, ⁇ / -dimethylaminomethyl
  • R 3 H, ethyl, which has a free 20-hydroxy group.
  • Preferred active ingredients are camptothecin, topotecan, 10-hydroxycamptothecin, 9-aminocamptothecin and 9-nitrocamptothecin.
  • the spacer molecule is an aminocarboxylic acid of the general formula
  • R 4 H, alkyl or aryl, preferably H
  • Particularly preferred spacers are 4-aminobutanoic acid, 5-aminopentanoic acid, 3-aminopropanoic acid and L- and D-alanine.
  • the peptide chain is composed of a cathepsin B and / or D cleavable sequence and a ⁇ / -terminaien solubility-promoting component and has the general formula
  • P 1 -P 4 L- or D-amino acids
  • X aa an amino acid with a basic side chain.
  • the amino acids Pi and P 3 are preferably selected from the amino acids alanine, glycine, leucine, isoieucine, norleucine, Vaiin and / or phenylalanine.
  • the amino acids P 2 and P 4 are preferably selected from the amino acids leucine, isoieucine, norleucine and / or phenylalanine.
  • the solubilizing group Xaa is preferably selected from the amino acids arginine, lysine and histidine.
  • a particularly preferred group is arginine.
  • the heterobifunctional crosslinker is a carboxylic acid having a protein binding group of the general formula
  • the protein binding group (PM) is preferably selected from a 2-dithiopyridyl group, a haloacetamide group, a haloacetate group, a disulfide group, an acrylic acid ester group, a monoalkylmalonic acid ester group, a monoalkylmaleamic acid amide group, a ⁇ / -hydroxy-succinimidylester group, an isothiocyanate group, an aziridine group or a
  • maleimide A particularly preferred protein binding group is the maleimide group. - -
  • Active ingredient and spacer molecule are linked by an ester bond between the 20-hydroxy group of the drug and a carboxyl group of the spacer molecule.
  • the bond between the spacer molecule and the crosslinker-peptide moiety consists of an amide bond between the amino group of the spacer molecule and the C-terminal carboxyl group of the crosslinker-peptide moiety.
  • the bond between the crosslinker and the peptide chain consists of an amide bond between the N-terminus of the peptide chain and the carboxyl group of the crosslinker.
  • An essential property of the CPT derivatives according to the invention is that the bonds between the active substance and spacer molecule and between the spacer molecule and the crosslinker are hydrolytically and / or enzymatically cleavable with the involvement of cathepsins B and / or D, whereby a controlled release of the active ingredient or an aminoacyl Drug derivative in tumor tissue is made possible.
  • Cathepsins B and D are overexpressed in many human tumors, thus providing an ideal target for target-directed, enzymatic activation of prodrugs (Yan, S., et al., Supra., Chem. 1998, 2, 113-123, Leto, G., et al., Clin Exp. Metastasis 2004, 91-106).
  • the CPT derivatives of the invention show a rapid cleavage in experimental tumor homogenates (see Example 5).
  • the preparation of the CPT derivatives according to the invention is preferably carried out by condensation of camptothecin derivatives of the general formula
  • R 1 H or OH
  • R 2 H, NH 2 , NO 2 or ⁇ /, ⁇ / -dimethylaminomethyl
  • R 3 H or ethyl, with spacers of the general formula - -
  • reagents for activating the carboxyl group of the spacer preferably ⁇ / .W-dicyclohexylcarbodiimide (DCC) 1 W, / V-diisopropylcarbodiimide (DIPC), (benzotriazol-1-yloxy) tris (dimethylamino) phosphonium hexafluorophosphate (BOP), O - (Azabenzotriazol-1-yl) -N, N, N ', N'-tetramethyluronium hexafluorophosphate (HATU) or 2-chloro-1-methylpyridinium iodide with addition of common catalysts or auxiliary bases such.
  • pyridine 4-dimethylaminopyridine (DMAP) or hydroxybenzotriazole (HOBt) and / or scandium (III) trifluoromethanesulfonate used.
  • the reaction is expediently carried out in a polar aprotic organic solvent, preferably in dichloromethane, ⁇ /, ⁇ / -dimethylformamide and tetrahydrofuran.
  • the reactions are conveniently carried out at temperatures between -10 0 C and room temperature, the reaction time is usually between 30 minutes and 48 hours.
  • the workup can be ⁇ . B. by recrystallization from methanol or ethanol, or by column chromatography z. B. on silica gel.
  • the mobile phase used here are preferably chloroform-methanol mixtures which may optionally contain additions of amines or carboxylic acids.
  • the protective group of the amino function is removed.
  • This splitting can z. B. be achieved by treatment with trifluoroacetic acid / dichloromethane mixtures or piperidine.
  • the Boc-protected prodrug precursor is treated with trifluoroacetic acid / dichloromethane 1: 1 for 30 minutes and the product isolated by precipitation with diethyl ether. - -
  • R 2 H, NH 2 , NO 2 or ⁇ /, ⁇ / -Dimethy! Aminomethyl
  • R 3 H or ethyl
  • R 4 H, alkyl or aryl, preferably H
  • reagents for activating the carboxyl group of the crosslinker peptide unit preferably O- (azabenzotriazo! -1-yl) -N, N, N ' , ⁇ T-tetramethyluronium hexafluorophosphate (HATU), (benzotriazol-1-yloxy) tris (dimethylamino) phosphonium hexafluorophosphate (BOP), A / ./V-Diisopropylcarbodiimid (DIPC), N 1 N 1 - dicyclohexylcarbodiimide (DCC) or 2-chloro-1-methylpyyridinium iodide with addition of conventional catalysts or auxiliary bases such , B.
  • DIPC dimethylamino phosphonium hexafluorophosphate
  • DIPC N 1 N 1 - dicyclohexylcarbodiimide
  • DIEA V-ethyldiisopropylamine
  • DMAP 4-dimethylaminopyridine
  • HOBt hydroxybenzotriazole
  • the reaction is conveniently carried out in a polar organic solvent, preferably in /V./V- dimethylformamide.
  • the reactions are conveniently carried out at temperatures between -10 0 C and room temperature, the reaction time is usually between 30 minutes and 48 hours.
  • the workup is z.
  • Preferably used mobile phase are acetonitrile-water mixtures, which may optionally contain additions of amines or carboxylic acids, preferably trifluoroacetic acid.
  • solubilizing arginine groups By using solubilizing arginine groups, the water solubility can be significantly increased compared to CPT. Such compounds typically exhibit greater than 400-fold increased solubility in isotonic saline versus CPT (see Example 2).
  • the protein-binding camptothecin derivatives according to the invention are administered parenterally, preferably intravenously.
  • the CPT derivatives according to the invention are provided as solutions, solids or lyophilisates, if appropriate using customary auxiliaries.
  • auxiliaries are, for example, polysorbates, glucose, lactose, mannitol, dextranes, citric acid, tromethamol, triethanolamine, aminoacetic acid and / or synthetic polymers.
  • the CPT derivatives according to the invention are administered dissolved in an isotonic buffer.
  • the solubility of the CPT derivative may optionally be controlled by pharmaceutical solvents such as 1,2-propanediol, ethanol, isopropanol, glycerol and / or poly (ethylene glycol) having a molecular weight of from 200 to 600 g / mol, preferably poly (ethylene glycol) having a molecular weight of 600 g / mol, and / or solubilizers such.
  • pharmaceutical solvents such as 1,2-propanediol, ethanol, isopropanol, glycerol and / or poly (ethylene glycol) having a molecular weight of from 200 to 600 g / mol, preferably poly (ethylene glycol) having a molecular weight of 600 g / mol, and / or solubilizers such.
  • Tween 80 Cremophor or polyvinylpyrrolidone can be improved.
  • An essential feature of the CPT derivatives according to the invention lies in a rapid covalent binding to serum proteins via the protein-binding group, as a result of which a macromolecular transport form of the active substance is generated.
  • Serum proteins such as transferrin, albumin and LDL are known to have increased uptake into tumor tissue (Kratz F, Beyer U. Drug Delivery 1998, 5, 281-299), so that they can be used in the context of the invention as endogenous carriers for cytostatics.
  • a particularly preferred serum protein is circulating human serum albumin (HSA) which forms the major protein component of human blood at an average concentration of 30 to 50 g / L (Peters T. Adv. Protein Chem.
  • Example 3 The reaction of the new CPT derivatives with serum proteins can also be carried out extracorporeally, e.g. B. with an intended for infusion albumin, blood or serum amount.
  • the CPT-peptide derivatives on which the invention is based have the advantage of being chemically clearly defined.
  • Figure 3 is a chromatogram of the HSA conjugate of EMC-Arg-Arg-Ala-Leu-Ala-Leu-GABA-CPT after cleavage by cathepsin B.
  • Figure 4 is a chromatogram of the HSA conjugate of EMC-Arg-Arg-Ala-Leu-Ala-Leu-GABA-CPT after cleavage into HT29 colorectal tumor homogenate at pH 5.0.
  • Figure 5 is a chromatogram of the HSA conjugate of EMC-Arg-Arg-Ala-Leu-Ala-Leu-GABA-CPT after cleavage into HT29 colorectal tumor homogenate at pH 7.4.
  • Camptothecin 300 mg, 0.861 mmol
  • 4-dimethylaminopyridine 210 mg, 1.72 mmol
  • /V./V. are added to a solution of Boc-3-aminopropanoic acid (489 mg, 2.87 mmol) in 100 mL dichloromethane at 0 ° C -Diisopropylcarbodiimide (420 ⁇ L, 2.87 mmol) under a nitrogen atmosphere and the resulting suspension stirred for sixteen hours at room temperature to give a clear solution.
  • the mixture is then washed twice with 10O mL of 0.1N HCl, the organic phase dried over magnesium sulfate and the solvent removed in vacuo.
  • camptothecin-20-O [(((((((((6-maleinidohexanoylo) arginyl) -arginyl) alanyl) leucycanyl] leucyl) -4-aminobutanoate] (abbreviated EMC-Arg-Arg)
  • camptothecin 300 mg, 0.861 mmol
  • 4-dimethylaminopyridine 210 mg, 1.72 mmol
  • ⁇ / ⁇ / ⁇ P ⁇ -aminobutanoic acid
  • Diisopropylcarbodiimide 420 .mu.l, 0.861 mmol
  • the organic phase dried over magnesium sulfate and the solvent removed in vacuo.
  • the CPT derivatives according to the invention thus show a more than 400-fold increased solubility in isotonic saline solution over CPT.
  • Human plasma was by chromatography on a C-ts-RP-HPLC column (Symmetry ® 300-5 4.6 x 250 mm Waters) by gradient elution (flow: 1.2- 1.8 mL / min; mobile phase A: 30% 200 mM K 2 HPO 4 pH 7, 70% acetonitrile, eluent B: 72.5% 200 mM K 2 HPO 4 pH 7, 28.5% acetonitrile, gradient: 26 min eluent B isocrat, 15 min 0-100% eluent A linear) into its protein components and at 254 nm detected (see Figure 1).
  • EMC-Arg-Arg-Ala-Leu-Ala-Leu-GABA-CPT are dissolved in 200 ⁇ L Tris buffer (pH 7.4) at room temperature (5 mM solution) and 10 ⁇ L of this solution with 490 ⁇ L human plasma for 30 min long incubated at 37 0 C and the sample then applied to the Ci 8 -RP-H PLC column (method see above). Measuring absorbance at 370 nm reveals that the majority of EMC-Arg-Arg-Ala-Leu-Ala-Leu-GABA-CPT is bound to albumin (see Figure 2).
  • the conjugate shows good stability in human plasma.
  • EMC-Arg-Arg-Ala-Leu-Ala-Leu-GABA-CPT are dissolved in 200 ⁇ l of Tris buffer pH 7.4 (for cathepsin B). 10 ⁇ L of this solution are incubated for 30 minutes with 40 ⁇ L of a 20% HSA solution at 37 0 C. Below are 10 ⁇ L
  • Cathepsin B solution (71.7 ⁇ g / ml) was added and each diluted with buffer to a volume of 500 ⁇ L.
  • Colorectal tumor homogenate 1.56 mg of EMC-Arg-Arg-Ala-Leu-Ala-Leu-GABA-CPT are dissolved in 200 ⁇ l Tris buffer pH 7.4 or sodium acetate buffer pH 5.0. 10 ⁇ L of this solution are incubated for 30 minutes with 40 ⁇ L of a 20% HSA solution at 37 ° C. Subsequently, 10 ⁇ L of HT29 colorectal tumor homogenate are added and diluted with buffer to a volume of 500 ⁇ L.
  • the tumor material is crushed by means of a scalpel and 200 mg of the mass are homogenized with 800 ⁇ L buffer (Tris buffer pH 7.4 or sodium acetate buffer pH 5.0) with the addition of 3-4 glass beads in a shaker. The mixture is then centrifuged at 4 0 C and the supernatant to 200 .mu.l aliquots. The determination of the cleavage products is carried out using the HPLC method described in Example 3 (FIGS. 4 and 5).
  • CPT-GABA is visible after 2 hours.
  • pH 7.4 CPT-GABA is also detectable after 2 hours and CPT as a cleavage product after 24 hours.

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Abstract

Die Erfindung betrifft Camptothecin-Peptid-Derivate, die eine proteinbindende Gruppe enthalten und enzymatisch im Körper unter Freisetzung des Wirkstoffs oder eines niedermolekularen Wirkstoff-Derivates spaltbar sind.

Description

Proteinbindende Camptothecin-Peptid-Derivate und diese enthaltende
Arzneimittel
Beschreibung
Die Erfindung betrifft Camptothecin-Peptid-Derivate, die eine proteinbindende Gruppe enthalten und unter Beteiligung der Cathepsine B und/oder D enzymatisch im Körper unter Freisetzung des Wirkstoffs oder eines niedermolekularen Wirkstoff- Derivates spaltbar sind.
Camptothecin (CPT) ist ein Alkaloid mit tumorhemmenden Eigenschaften (Wall M. E., et al. J. Am. Chem. Soc. 1966, 88, 3888-3890), dessen Derivate wie Topotecan oder (rinotecan zur Behandlung verschiedener Krebserkrankungen eingesetzt werden (Kollmannsberger C, et al. Oncology 1999, 56, 1-12, Rothenberg M. L. Oncologist 2001, 6, 66-80). Jedoch sind Therapien mit diesen Arzneistoffen von Nebenwirkungen begleitet. Um das Nebenwirkungsprofil und die Wirksamkeit von CPT bzw. CPT-Derivaten zu verbessern, wurden makromolekulare Transportformen von CPT durch Kopplung des Wirkstoffs an synthetische Polymere wie Poly(ethylenglykol) (Greenwald R. B., et al. Bioorg. Med. Chem. 1998, 6, 551-562, Conover C. D., et al. Anti-Cancer Drug Design 1999, 14, 499-506), HPMA- Copolymere (Fraier D., et al. J. Pharm. Biomed. Anal. 2000, 22, 505-514) oder HPMA-Copolymere in Verbindung mit Peptid-Spacem entwickelt (Caiolfa V. R., et al. J. Controlled Release 2000, 65, 105-119, Zamai M., et al. Mol. Cancer Ther. 2003, 2, 29-40).
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, Prodrugs von CPT zu schaffen, die CPT oder CPT-Derivate im Tumor freisetzen. Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst durch Camptothecin-Peptid-Derivate der allgemeinen Formel
Figure imgf000003_0001
JL
Crosslinker Peptid Spacer Wirkstoff
Figure imgf000003_0002
Crosslinker-Peptid-Einheit
worin Ri = H oder OH, R2 = H, NH2, NO2 oder Λ/,Λ/-Dimethylaminomethyl, R3 - H oder Ethyl, R4 = H, Alkyl oder Aryl, R5 = H, Alkyl oder Aryl, von denen die beiden letztgenannten gegebenenfalls substituiert sein können, P1-P4 = L- oder D- Aminosäuren, Xaa eine löslichkeitsvermittelnde Aminosäure, n = 0 bis 3, m = 1 bis 3, k = 0 bis 5, p = 0 bis 6 bedeuten und PM eine proteinbindende Gruppe ist.
Eine integrierte hydrolytisch oder enzymatisch spaltbare Sollbruchstelle erlaubt hierbei eine kontrollierte Freisetzung des Wirkstoffs oder eines Aminoacyl-Wϊrkstoff- Derivates in vivo, sodass Camptothecin-Derivate der vorliegenden Erfindung Prodrugs darstellen.
Die erfindungsgemäßen CPT-Derivate sind aus einer antitumoral wirksamen Camptothecin-Komponente, einem Spacermolekül, einer Peptidkette und einem heterobifunktioneilen Crosslinker aufgebaut Im Folgenden wird dieser Aufbau näher erläutert: - -
Die antitumoral wirksame CPT-Komponente ist ein Wirkstoff der allgemeinen Formel
Figure imgf000004_0001
worin R1 = H, OH
R2 = H, NH2, NO2 oder Λ/,Λ/-Dimethylaminomethyl R3 = H, Ethyl bedeuten, welcher eine freie 20-Hydroxygruppe aufweist. Bevorzugte Wirkstoffe sind Camptothecin, Topotecan, 10-Hydroxycamptothecin, 9-Aminocamptothecin und 9- Nitrocamptothecin.
Das Spacermolekül ist eine Aminocarbonsäure der allgemeinen Formel
Figure imgf000004_0002
in der R4 = H, Alkyl oder Aryl, bevorzugt H
R5 = H, Alkyl oder Aryl, gegebenenfalls substituiert, bevorzugt H oder Methyl n = 0 bis 3 bedeuten.
Besonders bevorzugte Spacer sind 4-Aminobutansäure, 5-Aminopentansäure, 3- Aminopropansäure sowie L- und D-Alanin.
Die Peptidkette setzt sich aus einer durch die Cathepsine B und/oder D spaltbaren Sequenz sowie einer Λ/-terminaien löslichkeitsvermittelnden Komponente zusammen und hat die allgemeine Formel
H2N-I-Xa3-I-Pi-P2-P3-P4-OH in der
P1-P4 = L- oder D-Aminosäuren Xaa = eine Aminosäure mit basischer Seitenkette bedeuten.
Die Aminosäuren Pi und P3 sind bevorzugt ausgewählt unter den Aminosäuren Alanin, Glycin, Leucin, Isoieucin, Norleucin, Vaiin und/oder Phenylalanin. Die Aminosäuren P2 und P4 sind bevorzugt ausgewählt unter den Aminosäuren Leucin, Isoieucin, Norleucin und/oder Phenylalanin.
Die löslichkeitsvermittelnde Gruppe Xaa ist bevorzugt ausgewählt unter den Aminosäuren Arginin, Lysin und Histidin. Eine besonders bevorzugte Gruppe ist Arginin.
Der heterobifunktionelle Crosslinker ist eine Carbonsäure mit einer proteinbindenden Gruppe der allgemeinen Formel
Figure imgf000005_0001
in der k = 0 bis 5 p = 0 bis 6
PM = proteinbindende Gruppe bedeuten.
Die proteinbindende Gruppe (PM) ist bevorzugt ausgewählt unter einer 2- Dithiopyridylgruppe, einer Halogenacetamidgruppe, einer Halogenacetatgruppe, einer Disulfidgruppe, einer Acrylsäureestergruppe, einer Monoalkylmalein- säureestergruppe, einer Monoalkylmaleaminsäureamidgruppe, einer Λ/-Hydroxy- succinimidylestergruppe, einer lsothiocyanatgruppe, einer Aziridingruppe oder einer
Maleinimidgruppe. Eine besonders bevorzugte proteinbindende Gruppe ist die Maleinimidgruppe. — —
Wirkstoff und Spacermolekül sind durch eine Esterbindung zwischen der 20- Hydroxygruppe des Wirkstoffs und einer Carboxylgruppe des Spacermoleküis verbunden. Die Bindung zwischen Spacermoiekül und der Crosslinker-Peptid-Einheit besteht aus einer Amidbindung zwischen der Aminogruppe des Spacermoleküis und der C-terminalen Carboxylgruppe der Crosslinker-Peptid-Einheit. Die Bindung zwischen Crosslinker und der Peptidkette besteht aus einer Amidbindung zwischen dem N-Terminus der Peptidkette und der Carboxylgruppe des Crosslinkers.
Eine wesentliche Eigenschaft der erfindungsgemäßen CPT-Derivate besteht darin, dass die Bindungen zwischen Wirkstoff und Spacermolekül sowie zwischen Spacermolekül und dem Crosslinker hydrolytisch und/oder enzymatisch unter Beteiligung der Cathepsine B und/oder D spaltbar sind, wodurch eine kontrollierte Freisetzung des Wirkstoffs oder eines Aminoacyl-Wirkstoff-Derivates in Tumorgewebe ermöglicht wird. Die Cathepsine B und D werden in vielen humanen Tumoren überexprimiert, wodurch sie einen idealen Angriffspunkt für eine Targetorientierte, enzymatische Aktivierung von Prodrugs darstellen (Yan, S., et al. ß/o/. Chem. 1998, 2, 113-123, Leto, G., et al. Clin. Exp. Metastasis 2004, 91-106). Des Weiteren zeigen die erfindungsgemäßen CPT-Derivate eine rasche Spaltung in experimentellen Tumorhomogenaten (siehe Beispiel 5).
Die Herstellung der erfindungsgemäßen CPT-Derivate erfolgt bevorzugt durch Kondensation von Camptothecin-Derivaten der allgemeinen Formel
Figure imgf000006_0001
in der
R1 = H oder OH
R2 = H, NH2, NO2 oder Λ/,Λ/-Dimethylaminomethyl
R3 = H oder Ethyl bedeuten, mit Spacern der allgemeinen Formel - -
Figure imgf000007_0001
worin
R = eine dem Fachmann geläufige Schutzgruppe für Amine, bevorzugt Boc oder Fmoc R4 = H, Alkyl oder Aryl, bevorzugt H
R5 = H, Alkyl oder Aryl, gegebenenfalls substituiert, bevorzugt H oder Methyl n = 0 bis 3 bedeuten.
Dabei werden als Reagenzien zur Aktivierung der Carboxylgruppe des Spacers vorzugsweise Λ/.W-Dicyclohexylcarbodiimid (DCC)1 W,/V-Diisopropylcarbodiimid (DIPC), (Benzotriazol-1-yloxy)tris(dimethylamino)phosphonium-Hexafluorophosphat (BOP), O-(Azabenzotriazol-1-yl)-N,N,N',N'-tetramethyluronium-Hexafluorophosphat (HATU) oder 2-Chlor-1-methylpyridiniumiodid unter Zusatz gängiger Katalysatoren bzw. Hilfsbasen wie z. B. Trialkylamine, Pyridin, 4-Dimethylaminopyridin (DMAP) oder Hydroxybenzotriazol (HOBt) und/oder Scandium(lll)trifluormethansulfonat eingesetzt. Die Umsetzung erfolgt zweckmäßig in einem polar-aprotischen organischen Lösungsmittel, vorzugsweise in Dichlormethan, Λ/,Λ/-Dimethylformarnid und Tetrahydrofuran. Die Umsetzungen werden zweckmäßig bei Temperaturen zwischen -10 0C und Raumtemperatur durchgeführt, wobei die Reaktionszeit normalerweise zwischen 30 Minuten und 48 Stunden liegt. Die Aufarbeitung kann ∑. B. durch Umkristallisation aus Methanol oder Ethanol, oder durch Säulenchromatographie z. B. an Kieselgel erfolgen. Hierbei verwendete Laufmittel sind bevorzugt Chloroform-Methanol-Gemische, die gegebenenfalls Zusätze von Aminen oder Carbonsäuren enthalten können.
Anschließend wird die Schutzgruppe der Amino-Funktion entfernt. Diese Abspaltung kann z. B. durch Behandlung mit Trifluoressigsäure/Dichlormethan-Gemischen oder Piperidin erreicht werden. In einer für das Verfahren bevorzugten Ausführungsweise wird die Boc-geschütze Prodrugvorstufe 30 min mit Trifluoressigsäure/Dichlormethan 1 :1 behandelt und das Produkt durch Fällung mit Diethylether isoliert. — —
Danach wird die erhaltene Prodrugvorstufe, der ailgemeinen Formel
Figure imgf000008_0001
worin
Figure imgf000008_0002
R2 = H, NH2, NO2 oder Λ/,Λ/-Dimethy!aminomethyl
R3 = H oder Ethyl
R4 = H, Alkyl oder Aryl, bevorzugt H
R5 = H, Alkyl oder Aryl, gegebenenfalls substituiert, bevorzugt H, Methyl n = 0 bis 3 bedeuten, durch Kondensation umgesetzt mit einer Crosslinker-Peptid-Einheit der allgemeinen Formel
Figure imgf000008_0003
worin m = 1 bis 3 k = 0 bis 5 p = 0 bis 6
PM = proteinbindende Gruppe bedeuten.
Dabei werden als Reagenzien zur Aktivierung der Carboxylgruppe der Crosslinker- Peptid-Einheit vorzugsweise O-(Azabenzotriazo!-1 -y\)-N,N,N', ΛT-tetramethyluronium- Hexafluorophosphat (HATU), (Benzotriazol-1-yloxy)tris(dimethylamino)phosphonium- Hexafluorophosphat (BOP), A/./V-Diisopropylcarbodiimid (DIPC), N1N1- Dicyclohexylcarbodiimid (DCC) oder 2-Chlor-1-methy!pyridiniumiodid unter Zusatz gängiger Katalysatoren bzw. Hilfsbasen wie z. B. /V-Ethyldiisopropylamin (DIEA), Trialkylamine, Pyridin, 4-Dimethylaminopyridin (DMAP) oder Hydroxybenzotriazol (HOBt) eingesetzt. Die Umsetzung erfolgt zweckmäßig in einem polaren organischen Lösungsmittel, vorzugsweise in /V./V-Dimethylformamid. Die Umsetzungen werden zweckmäßig bei Temperaturen zwischen -10 0C und Raumtemperatur durchgeführt, wobei die Reaktionszeit normalerweise zwischen 30 Minuten und 48 Stunden liegt. Die Aufarbeitung erfolgt z. B. durch Säulenchromatographie bevorzugt an C18-RP- Kieselgel. Bevorzugt verwendete Laufmittel sind hierbei Acetonitril-Wasser- Gemische, die gegebenenfalls Zusätze von Aminen oder Carbonsäuren, bevorzugt Trifluoressigsäure, enthalten können.
Nach einer bevorzugten Ausführungsweise wird Camptothecin zuerst mit Boc- geschützter 4-Aminobutansäure (Boc-GABA) und nachfolgender Abspaltung der Schutzgruppe zum Camptothecin-20-O-(4-aminobutanoat)-Trifluoracetat umgesetzt, welches anschließend mit EMC-Arg-Arg-Ala-Leu-Ala-Leu-OH (EMC = 6-Maleinimido- capronsäure) unter Benutzung von HATU als Kopplungsreagenz kondensiert wird (siehe Beispiel 1 ).
Durch die Verwendung löslichkeitsvermittelnder Arginingruppen lässt sich die Wasserlöslichkeit gegenüber CPT signifikant steigern. Solche Verbindungen weisen typischerweise eine gegenüber CPT um mehr als 400-fach gesteigerte Löslichkeit in isotonischer Kochsalzlösung auf (siehe Beispiel 2).
Die erfindungsgemäßen proteinbindenden Camptothecin-Derivate werden parenteral, bevorzugt intravenös appliziert. Dazu werden die erfindungsgemäßen CPT-Derivate als Lösungen, Feststoffe oder Lyophilisate, gegebenenfalls unter Verwendung üblicher Hilfsstoffe bereitgestellt. Solche Hilfsstoffe sind beispielsweise Polysorbate, Glucose, Lactose, Mannitol, Dextrane, Zitronensäure, Tromethamol, Triethanolamin, Aminoessigsäure und/oder synthetische Polymere. Bevorzugt werden die erfindungsgemäßen CPT-Derivate in einem isotonischen Puffer gelöst appliziert. Die Löslichkeit des CPT-Derivates kann gegebenenfalls durch pharmazeutische Lösungsmittel wie etwa 1 ,2-Propandiol, Ethanol, lsopropanol, Glycerol und/oder Poly(ethylenglykol) mit einem Molekulargewicht von 200 bis 600 g/mol, bevorzugt Poly(ethylenglykol) mit einem Molekulargewicht von 600 g/mol, und/oder Löslichkeitsvermittler wie z. B. Tween 80, Cremophor oder Polyvinyl- pyrrolidon verbessert werden.
Ein wesentliches Merkmal der erfindungsgemäßen CPT-Derivate liegt in einer raschen kovalenten Bindung an Serumproteine über die proteinbindende Gruppe, wodurch eine makromolekulare Transportform des Wirkstoffs generiert wird. Von Serumproteinen wie Transferrin, Albumin und LDL ist eine erhöhte Aufnahme in Tumorgewebe bekannt (Kratz F.; Beyer U. Drug Delivery 1998, 5, 281-299), sodass diese im Rahmen der Erfindung als endogene Träger für Zytostatika herangezogen werden können. Ein besonders bevorzugtes Serumprotein ist zirkulierendes Humanserumalbumin (HSA), das mit einer durchschnittlichen Konzentration von 30 bis 50 g/L die Hauptprotein-Komponente des menschlichen Blutes bildet (Peters T. Adv. Protein Chem. 1985, 37, 161-245) und eine freie Cysteingruppe (Cystein-34- Gruppe) an der Oberfläche des Proteins aufweist, welche zur Anbindung von thiolbindenden Gruppen wie Maleinimiden oder Disulfiden geeignet ist (WO 00/76551). Dass das erfindungsgemäße Maleinimid-funktionalisierte CPT-Derivate schnell und selektiv an HSA binden, zeigt Beispiel 3. Die Reaktion der neuen CPT- Derivate mit Serumproteinen kann auch extrakorporal durchgeführt werden, z. B. mit einer zur Infusion vorgesehenen Albumin-, Blut- oder Serummenge.
Gegenüber Camptothecin-Konjugaten mit synthetischen Polymeren als Trägersystemen besitzen die der Erfindung zugrunde liegenden CPT-Peptid-Derivate den Vorteil, chemisch eindeutig definiert zu sein.
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung in Verbindung mit der beigefügten Zeichnung näher.
In der Zeichnung stellen dar:
Abbildung 1 ein Chromatogramm von humanem Blutplasma; bei λ = 370 nm ist lediglich eine geringfügige Absorption zu beobachten.
Abbildung 2 ein Chromatogramm von EMC-Arg-Arg-Ala-Leu-Ala-Leu-GABA-CPT, das zuvor 30 min mit humanem Plasma inkubiert wurde (Detektion bei λ = 280 und 370 nm).
Abbildung 3 ein Chromatogramm des HSA-Konjugats von EMC-Arg-Arg-Ala-Leu-Ala- Leu-GABA-CPT nach Spaltung durch Cathepsin B.
Abbildung 4 ein Chromatogramm des HSA-Konjugats von EMC-Arg-Arg-Ala-Leu-Ala- Leu-GABA-CPT nach Spaltung in HT29-Kolorektaltumor-Homogenat bei pH 5,0.
Abbildung 5 ein Chromatogramm des HSA-Konjugats von EMC-Arg-Arg-Ala-Leu- Ala-Leu-GABA-CPT nach Spaltung in HT29-Kolorektaltumor-Homogenat bei pH 7,4.
Beispiel 1
Herstellung von Camptothecin-20-O-(L-Alaninat)-Trifluoracetat
Figure imgf000011_0001
Zu einer Suspension von Boc-L-Alanin (489 mg, 2.58 mmol), Camptothecin (300 mg, 0.861 mmol), 4-Dimethylaminopyridin (330 mg, 2.58 mmol) sowie Scandium(ül)- trifluormethansulfonat (256 mg, 1.46 mmol) in 30 mL Dichlormethan wird unter Stickstoffatmosphäre bei -80C MW-Diisopropylcarbodiimid (426 μL, 2.76 mmol) - -
gegeben und 30 Minuten gerührt. Anschließend wird die Reaktionsmischung 2 Stunden bei Raumtemperatur gerührt, die Feststoffe abfiltriert und das Filtrat jeweils einmal mit 60 ml_ 0.1 N HCl, 0.1 M NaHCθ3 und destilliertem Wasser gewaschen. Die organische Phase wird über Magnesiumsulfat getrocknet und das Lösungsmittel im Vakuum entfernt. Nach Umkristallisation des Rückstands aus Methanol und Abspaltung der Boc-Schutzgruppe durch 30 minütige Behandlung mit 1 mL Trifluoressigsäure/Dichlormethan (1 :1) erhält man 292 mg Camptothecin-20-O-(L- alaninat)-Trifluoracetat als blassgelben Feststoff.
Beispiel 2
Herstellung von Camptothecin^O-O-φ-AminopropanoatJ-Trifluoracetat
Figure imgf000012_0001
Zu einer Lösung von Boc-3-Aminopropansäure (489 mg, 2.87 mmol) in 100 mL Dichlormethan werden bei O0C Camptothecin (300 mg, 0.861 mmol), 4- Dimethylaminopyridin (210 mg, 1.72 mmol) sowie /V./V-Diisopropylcarbodiimid (420 μL, 2.87 mmol) unter Stickstoffatmosphäre gegeben und die entstandene Suspension sechzehn Stunden bei Raumtemperatur gerührt, wobei eine klare Lösung entsteht. Anschließend wird zweimal mit 10O mL 0.1 N HCl gewaschen, die organische Phase über Magnesiumsulfat getrocknet und das Lösungsmittel im Vakuum entfernt. Nach Umkristallisation des Rückstands aus Methanol und Abspaltung der Boc-Schutzgruppe durch 30 minütige Behandlung mit 1 mL Trifluoressigsäure/Dichlormethan (1:1 ) erhält man 310 mg Camptothecin-20-O-(4- aminobutanoat)-Trifluoracetat als blassgelben Feststoff. Beispiel 3
Herstellung von Camptothecin-20-O-[(((((((6-maleinimidohexanoyI)arginyl)- arginyl)alanyl)leucyI)alanyI)leucyl)-4-aminobutanoat] (abgekürzt EMC-Arg-Arg-
Ala-Leu-Ala-Leu-GABA-CPT)
Figure imgf000013_0001
Zu einer Lösung von Boc-4-aminobutansäure (583 mg, 2.87 mmol) in 100 mL Dichlormethan werden bei 00C Camptothecin (300 mg, 0.861 mmol), 4- Dimethylaminopyridin (210 mg, 1.72 mmol) sowie Λ/.ΛP-Diisopropylcarbodiimid (420 μl_, 0.861 mmol) unter Stickstoffatmosphäre gegeben und die entstandene Suspension sechzehn Stunden bei Raumtemperatur gerührt, wobei eine klare Lösung entsteht. Anschließend wird zweimal mit 10O mL 0.1 N HCl gewaschen, die organische Phase über Magnesiumsulfat getrocknet und das Lösungsmittel im Vakuum entfernt. Nach Umkristallisation des Rückstands aus Methanol und Abspaltung der Boc-Schutzgruppe durch 30 minütige Behandlung mit 1 mL Trifluoressigsäure/Dichlormβthan (1:1) erhält man 310 mg Camptothecin-20-O-(4- aminobutanoat)-Trifluoracetat als blassgelben Feststoff.
Anschließend wird zu einer Lösung von Camptothecin-20-O-(4-aminobutanoat)- Trifluoracetat (43 mg, 0.079 mmol), [((((6-(Maleinimidohexanoyl)arginyl)arginyl)- alanyl)leucyl)alanyl]feucin-Trifluoracetat (100 mg, 0.087 mmol) und N- Ethyldiisopropylamin (54 μL, 0.316 mmol) in 1.5 mL Λ/,Λ/-Dimethylformamid, O- (Azabenzotriazol-1-yl)-N,N,Λ/',/V'-tetramethyluronium-Hexafluorophosphat (33 mg, 0.087 mmol) unter Stickstoffatmosphäre gegeben und 35 Minuten bei Raumtemperatur gerührt. Das Produkt wird mit Diethylether gefällt und der Niederschlag im Vakuum getrocknet. Die Reinigung des Rohprodukts erfolgt durch präparative Ci8-RP-HPLC (Aceton itril/Wasser 40:60, 0.1 % Trifluoressigsäure). Nach Lyophilisation erhält man 96 mg der Zielverbindung als leuchtend gelben Feststoff. ESI-MS (4.0 kV, MeOH): m/z (%) 1307.6 ([M + H]+, 100), 1329.5 ([M + Na]+, 96) HPLC-Reinheit (Λ = 370 nm, C18-RP-Säule, Acetonitril/Wasser 40:60, 0.1 % TFA): >95%
Beispiel 4
Löslichkeit von EMC-Arg-Arg-Ala-Leu-Ala-Leu-GABA-CPT in isotonischer
Kochsalzlösung.
molare Masse Löslichkeit
Verbindung
[g/mol] [μmol/L] [μg/mL]
CFT 348.36 11 (±1 ) 3.8 (±0.3)
EMC-Arg-Arg-
Ala-Leu-Ala-Leu- 1556 >4500 >7000
GABA-CPT
Ergebnis:
Die erfindugsgemäßen CPT-Derivate zeigen somit gegenüber CPT eine um mehr als 400-fach gesteigerte Löslichkeit in isotonischer Kochsalzlösung.
Beispiel 5
Bindung von EMC-Arg-Arg-Ala-Leu-AIa-Leu-GABA-CPT an HSA im
Humanplasma
Humanplasma wurde durch Chromatographie an einer C-ts-RP-HPLC-Säule (Symmetry® 300-5 4.6 x 250 mm von Waters) durch Gradientenelution (Fluss: 1.2- 1.8 mL/min; Eluent A: 30 % 200 mM K2HPO4 pH 7, 70 % Acetonitril; Eluent B: 72.5 % 200 mM K2HPO4 pH 7, 28.5 % Acetonitril; Gradient: 26 min Eluent B isokrat, 15 min 0-100 % Eluent A linear) in seine Proteinbestandteile aufgetrennt und bei 254 nm detektiert (siehe Abbildung 1 ).
Nun werden 1.56 mg EMC-Arg-Arg-Ala-Leu-Ala-Leu-GABA-CPT in 200 μL Tris- Puffer (pH 7.4) bei Raumtemperatur gelöst (5 mM Lösung) und 10 μL dieser Lösung mit 490 μL Humanplasma 30 min lang bei 37 0C inkubiert und die Probe anschließend auf die Ci8-RP-H PLC-Säule aufgetragen (Methode s. oben). Bei Messung der Absorption bei 370 nm zeigt sich, dass der überwiegende Teil von EMC-Arg-Arg-Ala-Leu-AIa-Leu-GABA-CPT an Albumin gebunden vorliegt (siehe Abbildung 2).
Beispiel 6
Stabilität von HSA-Konjugaten von EMC-Arg-Arg-Ala-Leu-Ala-Leu-GABA-CPT- in Humanplasma Die Plasmastabilität der durch Inkubation von EMC-Arg-Arg-Ala-Leu-Ala-Leu-GABA- CPT mit humanem Blutplasma generierten HSA-Konjugate wird mit der in Beispiel 3 beschriebenen HPLC-Methode durch Messung der Abnahme der Peakflächen {λ = 370 nm) bestimmt:
Konjugat mit EWIC-Arg-Arg-Ala-Leu-Ala-Leu-GAB A-CPT: nach 48 h sind noch >95% des HSA-Konjugats vorhanden.
Somit zeigt das Konjugat eine gute Stabilität in Humanplasma.
Beispiel 7
Enzymatische Spaltung von EMC-Arg-Arg-Ala-Leu-Ala-Leu-GABA-CPT durch
Cathepsin B
1.56 mg EMC-Arg-Arg-Ala-Leu-Ala-Leu-GABA-CPT werden in 200 μl_ Tris-Puffer pH 7.4 (für Cathepsin B) gelöst. 10 μL dieser Lösung werden über 30 Minuten mit 40 μL einer 20 %igen HSA-Lösung bei 370C inkubiert. Nachfolgend werden 10 μL
Cathepsin-B-Lösung (71.7 μg/ml) zugegeben und jeweils mit Puffer auf ein Volumen von 500 μL verdünnt.
Die Bestimmung der Spaltprodukte erfolgt mit der in Beispiel 3 beschriebenen HPLC- Methode (Abbildung 3). Ergebnis:
Nach nur zweistündiger Spaltung mit Cathepsin B ist nach einer Retentionszeit von 13 Minuten ein niedermolekulares CPT-Derivat, sowie nach 5 Minuten CPT-GABA erkennbar.
Beispiel 8
Enzymatische Spaltung von EMC-Arg-Arg-Ala-Leu-Ala-Leu-GABA-CPT in HT29-
Kolorektaltumor-Homogenat 1.56 mg EMC-Arg-Arg-Ala-Leu-Ala-Leu-GABA-CPT werden in 200 μL Tris-Puffer pH 7.4 bzw. Natriumacetat-Puffer pH 5.0 gelöst. 10 μL dieser Lösung werden über 30 Minuten mit 40 μL einer 20 %igen HSA-Lösung bei 37°C inkubiert. Nachfolgend werden 10 μL HT29-Kolorektaltumor-Homogenat zugegeben und mit Puffer auf ein Volumen von 500 μL verdünnt. Herstellung des Tumor-Homogenats: Das Tumormaterial wird mittels eines Skalpells stark zerkleinert und 200 mg der Masse werden mit 800 μL Puffer (Tris-Puffer pH 7.4 bzw. Natriumacetat-Puffer pH 5.0) unter Zusatz von 3-4 Glasperlen im Schüttler homogenisiert. Anschließend wird bei 4 0C zentrifugiert und der Überstand auf 200 μL aliquotiert. Die Bestimmung der Spaltprodukte erfolgt mit der in Beispiel 3 beschriebenen HPLC- Methode (Abbildung 4 und 5).
Ergebnis:
Bei pH 5.0 ist nach 2 Stunden CPT-GABA erkennbar. Bei pH 7.4 ist nach 2 Stunden ebenfalls CPT-GABA sowie nach 24 Stunden CPT als Spaltprodukt erkennbar.
Somit ist eine Aktivierung des erfindungsgemäßen CPT-Derivates im experimentellen Tumor-Homogenat in seine Wirkformen nachgewiesen.

Claims

Ansprüche
1. Ein Camptothecin-Derivat der Formel I:
Figure imgf000017_0001
Crosslinker Peptid Spacer Wirkstoff
Crosslinker-Peptid-Einheit worin
R1 = H oder OH
R2 = H, NH2, NO2 oder Λ/,Λ/-Dimethylaminomethyl R3 = H oder Ethy! R4 = H, Alkyl oder Aryi
R5 = H, gegebenenfalls substituiertes Alkyl oder Aryl
Pi, P3 = Alanin, Glycin, Leucin, Isoleucin, Norleucin, Valin und/oder Phenylalanin
P2, P4 = Leucin, Isoleucin, Norleucin und/oder Phenylalanin Xaa = Aminosäure mit basischer Seitenkette n = 0 bis 3 m = 1 bis 3 k = 0 bis 5 p = 0 bis 6 PM eine proteinbindende Gruppe bedeutet.
Camptothecin-Derivat gemäß Anspruch 1 , wobei PM eine Maleinimidgruppe, eine 2-Dithiopyridylgruppe, eine Halogenacetamidgruppe, eine Halogen- - -
acetatgruppe, eine Disulfidgruppe, eine Acrylsäureestergruppe, eine Monoalkylmaleinsäureestergruppe, eine Monoalkylmaleaminsäureamidgrup- pe, eine /V-Hydroxysuccinimidylestergruppe, eine Isothiocyanatgruppe oder eine Aziridingruppe ist, die gegebenenfalls substituiert sein kann.
3. Camptothecin-Derivat nach Anspruch 2, wobei PM eine Maleinimidgruppe ist, die gegebenenfalls substituiert sein kann.
4. Camptothecin-Derivat nach Anspruch 1, worin Ri = OH, R2 = /V1A/- Dimethylaminomethyl und R3 = H ist.
5. Camptothecin-Derivat nach Anspruch 3, worin Ri = H, R2 = H und R3 = H ist.
6. Camptothecin-Derivat nach einem der vorhergehenden Ansprüche, worin R4 = H, R5 = H, Methyl, Hydroxymethyl, Phenylmethyl, 4-Hydroxyphenylmethyl,
Imidazolylmethyl, Indolylmethyl, CH(CHs)2, CH2CH(CHs)2, CH(CH3)CH2CH3, CH(OH)CH3, CH2COOH, CH2CH2COOH, CH2CONH2, CH2CH2CONH2, CH2(CH2)3NH2, CH2CH2SCH3 oder CH2(CH2)2NHC(NH)NH2 ist.
7. Camptothecin-Derivat nach einem der vorhergehenden Ansprüche, worin Pi und P3 gleich oder unterschiedlich sind und Alanin, Glycin, Leucin, lsoleucin, Norleucin, Valin oder Phenylalanin bedeuten.
8. Camptothecin-Derivat nach einem der vorhergehenden Ansprüche, worin P2 und P4 gleich oder unterschiedlich sind und Leucin, lsoleucin, Norleucin oder
Phenylalanin bedeuten.
9. Camptothecin-Derivat nach einem der vorhergehenden Ansprüche, worin Xaa = Arginin, Lysin oder Histidin bedeuten.
10. Camptothecin-Derivat gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, worin n = O bis 3, m = 1 bis 3, k = O bis 5 und p = O bis 6 ist 11. Camptothecin-Derivat nach einem der vorhergehenden Ansprüche, worin Xaa = Arginin und m = 2 bedeuten.
12. Camptothecin-Derivat nach einem der vorhergehenden Ansprüche, worin P-i, P3 = Alanin und P2, P3 = Leucin bedeuten.
13. Verfahren zur Herstellung von Camptothecin-Derivaten nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass ein Camptothecin-Derivat der allgemeinen Formel Il
Figure imgf000019_0001
in der
Ri = H oder OH
R2 = H, NH2, NO2 oder /V,Λ/-Dimethylaminomethyl R3 = H oder Ethyl bedeuten, wobei etwaige nukleophile Gruppen an R1, R2 und R5 gegebenenfalls durch geeignete Schutzgruppen geschützt vorliegen, mit einem Spacer der allgemeinen Formel III
Figure imgf000019_0002
in der
R = Boc-Schutzgruppe oder andere gängige Aminoschutzgruppe R4 = H, Alkyl oder Aryl R5 = H, Alkyl oder Aryl n = 0 bis 3
PM = eine proteinbindende Gruppe bedeuten, in Gegenwart von Carbonsäure-Aktivierungsreagenzien und unter
Zusatz gängiger Katalysatoren bzw. Hilfsbasen umgesetzt werden. 14. Verfahren nach Anspruch 1133,, ddaadduurrcchh gekennzeichnet, dass als Carbonsäure-Aktivierungsreagenzien N,Λf-Diisopropyicarbodiimid, N1AT- Dicyclohexylcarbodiimid, (Benzotriazol-1-yloxy)tris(dimethylamino)phos- phonium-Hexafluorophosphat oder 2-Chlor-1-methylpyridiniumiodid eingesetz werden.
15. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass als Katalysatoren bzw. Hilfsbasen Trialkylamine, Pyridin, 4-Dimethylaminopyridin (DMAP) oder Hydroxybenzotriazol (HOBt) und/oder Scandium(lll)trifluormethansulfonat eingesetzt werden.
16. Verfahren gemäß Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass Camptothecin mit einer Boc-Aminocarbonsäure unter Einsatz von /V,/V- Diisopropylcarbodiimid und Dimethylaminopyridin umgesetzt wird.
17. Verfahren gemäß Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass Camptothecin mit Boc-4-Aminobutansäure unter Einsatz von /V,ΛP-Diisopropylcarbodiimid und Dimethylaminopyridin umgesetzt wird.
18. Verfahren zur Herstellung von Camptothecin-Derivaten nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass ein Campto- thecin-O-acyl-Derivat der allgemeinen Formel IV
Figure imgf000020_0001
in der
R-I = H oder OH
R2 = H, NH2, NO2 oder Λ/./V-Dimethylarninomethyl R3 = H oder Ethyi
R4 = H, Alkyl oder Aryl
R5 = H, gegebenenfalls substituiertes Alkyl oder Aryl n = 0 bis 3 bedeuten, wobei etwaige nukleophile Gruppen an R-i, R2 und R5 gegebenenfalls durch geeignete Schutzgruppen geschützt vorliegen, mit einer
Crosslinker-Peptid-Einheit der allgemeinen Formel V
Figure imgf000021_0001
in der
Pi und P3 gleich oder unterschiedlich sind und Alanin, Glycin, Leucin,
Isoleucin, Norleucin, Valin oder Phenylalanin bedeuten
P2 und P4 gleich oder unterschiedlich sind und Leucin, Isoleucin, Norleucin oder Phenylalanin bedeuten
Xaa = Arginin, Lysin oder Histidin m = 1 bis 3 k = 0 bis 5 p = 0 bis 6
PM eine proteinbindende Gruppe bedeutet, in Gegenwart von Carbonsäure-Aktivierungsreagenzien und unter
Zusatz gängiger Katalysatoren bzw. Hilfsbasen umgesetzt werden.
19. Verfahren nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass als Carbonsäure- Aktivierungsreagenzien A/./V-Diisopropylcarbodiimid, A/.W-Dicyclohexyl- carbodiimid, (Benzotriazol-1 -yloxy)tris(dimethylamino)phosphonium-Hexa- fluorophosphat, 2-Chlor-1-methylpyridiniumiodid oder O-(AzabenzotriazoI-1- yl)-Λ/,Λ/,W,Λ/'-tetramethyluronium-Hexafluorophosphat verwendet werden.
20. Verfahren nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass als Katalysatoren bzw. Hilfsbasen Λ/-Ethyldiisopropylamin (DIEA), Trialkylamine, Pyridin, 4-
Dimethylam/nopyridin (DMAP) oder Hydroxybenzotriazol (HOBt) eingesetzt werden. 21. Verfahren nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass als Carbonsäure- Aktivierungsreagenz O-(Azabenzotriazol-1-yl)-Λ/,Λ/,N',Λ/'-tetramethyluronium- Hexafluorophosphat in Verbindung mit Λ/-Ethyldiisopropylamin (DIEA) verwendet wird.
22. Verfahren gemäß Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass ein Camptothecin-O-acyl-Trifluoracetat mit [((((6-(Maleinimido- hexanoyOarginylJarginyOalanyl^eucyOalanyOleucin-Trifluoracetat unter Einsatz von O-(Azabenzotriazol-1-yl)-N,N,N',N'-tetramethyluronium-
Hexafluorophosphat in Verbindung mit Λ/-Ethyldiisopropylamin (DIEA) umgesetzt wird.
23. Verfahren gemäß Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass Camptothecin- O-4-aminobutanoat-Trifluoracetat mit [((((6-(Maleinimido- hexanoyOarginyOarginyOalanyOleucyOalanyφeucin-Trifluoracetat unter Einsatz von O-(Azabenzotriazol-1-yl)-N)N,N',N'-tetramethyluronium-
Hexafluorophosphat in Verbindung mit A/-Ethyldiisopropylamin (DIEA) umgesetzt wird.
24. Arzneimittel enthaltend ein Camptothecin-Derivat gemäß einem der Ansprüche 1 bis 12, gegebenenfalls zusammen mit üblichen Hilfsstoffen und/oder pharmazeutischen Lösungsmitteln.
25. Verwendung eines Camptothecin-Derivates nach einem der Ansprüche 1 bis 12 zur Behandlung von Krebskrankheiten.
26. Verfahren zur Herstellung eines Arzneimittels für die Behandlung von Krebskrankheiten, dadurch gekennzeichnet, dass man eine Verbindung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 12 in eine therapeutisch annehmbare
Lösung überführt.
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