WO2006085516A1 - タンパク質導入用担体、前記担体を用いたタンパク質導入剤、タンパク質導入方法、およびタンパク質導入細胞ならびにその製造方法 - Google Patents

タンパク質導入用担体、前記担体を用いたタンパク質導入剤、タンパク質導入方法、およびタンパク質導入細胞ならびにその製造方法 Download PDF

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protein
introduction
carrier
clay mineral
agent
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Kiyohito Yagi
Masaya Kawase
Masashi Yamada
Hiroto Suzuki
Kohsuke Kino
Yoshio Ohyama
Kazumitsu Ohtsubo
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Osaka University
Meiji Dairies Corporation
Osaka Industrial Promotion Organization
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    • B82Y5/00—Nanobiotechnology or nanomedicine, e.g. protein engineering or drug delivery

Definitions

  • Protein introduction carrier protein introduction agent using the carrier, protein introduction method, protein introduction cell, and production method thereof
  • the present invention relates to a protein introduction carrier for introducing a protein into a cell and a protein introduction agent using the carrier. Furthermore, the present invention relates to a protein introduction method using the introduction agent, a cell into which the protein has been introduced, and a production method thereof.
  • Non-patent literature l Zelphati, 0. et al. J. Biol. Chem. 276, 35103-35110 (2001) Intracellul ar delivery of proteins with a new lipid—mediated delivery system.
  • the present invention aims to provide a new carrier for protein introduction, a protein introduction agent, a protein introduction method, a protein introduction cell, and a production method thereof that are excellent in safety.
  • the protein introduction carrier of the present invention is a carrier for introducing a protein into cells, and is characterized by containing a clay mineral.
  • the protein introduction agent of the present invention is an introduction agent comprising the protein introduction carrier of the present invention and a protein supported thereon.
  • the protein introduction method of the present invention is a method of bringing the protein introduction agent of the present invention into contact with a cell and introducing the protein into the cell.
  • the cell of the present invention into which is introduced is produced.
  • the clay mineral usually refers to a silicate mineral contained in clay.
  • an optical material or a catalyst Conventionally, for example, as a component of cosmetics, as a base material of a foaming agent in the pharmaceutical field, an optical material or a catalyst. Is also widely used.
  • the present inventors have discovered for the first time that clay minerals can be used as a carrier for introducing proteins into cells as in the present invention.
  • the protein introduction carrier of the present invention for example, the protein can be supported only by mixing the carrier and the protein to be introduced in a solution (the carrier and the protein are separated from each other).
  • the protein can be introduced into the cell by bringing the carrier carrying the protein into contact with the target cell. For this reason, the operation of introducing the tank becomes very simple.
  • the fact that clay minerals have been widely used in cosmetics and pharmaceuticals as described above has been sufficiently proven to be safe for living bodies, particularly for humans. Therefore, the protein-introducing carrier of the present invention containing such a clay mineral that is extremely excellent in safety is widely applicable and extremely useful in the clinical medicine field and the like.
  • the mechanism by which the protein-introducing carrier of the present invention introduces a protein into a cell is not clear. It is considered that the protein introduction carrier is taken up into the cell while carrying the protein and releases the protein in the cell.
  • the protein introduction agent of the present invention can be supported on the carrier by mixing the protein-introducing carrier of the present invention and the target protein, for example, and thus can be prepared very easily. is there. And, according to the protein introduction method of the present invention using this protein introduction agent, the protein can be introduced into the cells simply by bringing the introduction agent into contact with the cells. Excellent safety.
  • the protein-introduced cell of the present invention can be produced by the introduction method of the present invention, which is extremely safe for cells, for example, a conventional carrier such as polyethyleneimine is used. The bad effects etc. which can be avoided can also be avoided. Therefore, it can be applied with high safety to a treatment method in which cells introduced with foreign proteins are brought into contact with tissue cells in the affected area.
  • the “protein” is not limited to a so-called protein, and includes peptides and the like as described later.
  • FIG. 1 is a graph showing j8-galatatosidase activity in protein-introduced cells in an example of the present invention.
  • FIG. 2 is a graph showing j8-galatatosidase activity in protein-introduced cells in another example of the present invention.
  • FIG. 3 is a graph showing the adsorptivity of a protein to a protein-introducing carrier in still another example of the present invention, where FIG. (A) shows the amount of protein in the supernatant fraction, and FIG. The adsorption rate of the protein in the protein introduction carrier is shown respectively.
  • FIG. 4 is a graph showing the amount of OVA-specific IgG in mouse serum when OVA is introduced by a protein-introducing carrier in still another example of the present invention.
  • FIG. 5 is an electrophoresis photograph of a Western blot showing the presence or absence of intracellular OVA when mitodocain is introduced by a protein introduction carrier in still another example of the present invention.
  • FIG. 6 In still another example of the present invention, when a pleiotomach fin is introduced by a protein introduction carrier, an electric wave of a Western plot showing the presence or absence of intracellular PTN. It is an electrophoresis photograph.
  • FIG. 7 is a Western blot electrophoresis photograph showing the presence or absence of intracellular OVA when insulin is introduced by a protein introduction carrier in still another example of the present invention.
  • the clay mineral is not particularly limited, and the mechanism is unknown, but according to the clay mineral, protein can be supported.
  • the clay mineral include layered clay minerals. Such a layered clay mineral usually has a structure in which ions and water are sandwiched between the layers.
  • the interlayer material of the layered clay mineral is preferably, for example, an exchangeable cation.
  • the interlayer material is an exchangeable cation
  • this cation is usually bonded to a hydroxyl group (one OH) on the inner surface of the layer.
  • the clay mineral having the exchangeable cation as an interlayer substance is also referred to as “exchangeable cation type” clay mineral.
  • Examples of the exchangeable cation include sodium ion, ammonium ion, quaternary ammonium ion, and the like.
  • sodium ions are preferred because many natural clay minerals are present, and quaternary ammonium ions, which are large three-dimensional structures, are also preferred.
  • Examples of the quaternary ammonium ion include tetramethylammonium chloride, salt benzyltrimethylammonium ion, and the like.
  • amino acids such as a amino acid and j8-amino acid, amine compounds such as domino, cations such as amide compounds such as acrylamide
  • Surfactants such as alkyl trimethyl ammonium, tetramethyl phosphor, alkyl pyridinium, ruthenium tetra ammonium, tris It can be a cation of a cationic metal complex such as phenanthrolin rhodium.
  • a cationic metal complex for example, an ammonia complex such as ruthenium can be used. Further, methyl viologen or the like may be used.
  • the layered clay mineral in the present invention is not particularly limited, and examples thereof include force orite, bilophyllite-talc, smectite, vermiculite, mica, brittle mica, chlorite, and sepiolite-
  • a total of eight groups of crystalline clay minerals can be used.
  • the kaolinite group has “1: 1 type” for the catenate layer type, and the other seven types are “2: 1 type”.
  • clay minerals belonging to the kaolinite group without layer charge include, for example, kaolinite, datekite, rhosite, leucite, nacrite, chrysotile, lizardite, as well as clay minerals belonging to the bilophyllite talc group without layer charge.
  • examples include neurophyllite and talc.
  • Examples of the smectite group having a layer charge include montmorillonite, piderite, nontrolite, sabonite, hectorite, and stevensite.
  • examples of the vermiculite group include di-vermiculite and tri-vermiculite.
  • the mica group includes, for example, muscovite, noragolite, illite, phlogopite, biotite, and levidrite
  • the brittle mica group includes, for example, margarite and clintnite
  • the chlorite group includes donpasite, sudowite. Stones, tatsukite, clinochlore and chamosite are examples.
  • sepiolite and norgorskite groups having no layer charge include sepiolite and norgorskite.
  • a crystalline clay mineral having a layer charge is more preferable, and a smectite group, a vermiculite group, and a mica group are more preferable.
  • montmorillonite, vermiculite and illite are preferred, and montmorillonite is particularly preferred.
  • amorphous clay minerals such as imogolite, alofen, and hisingerite can also be used.
  • the clay mineral is not limited to natural ones, and synthetic products can also be used.
  • clay mineral natural clay strength may be collected, but various commercially available products can be used.
  • montmorillonite for example, bentonite mainly composed of montmorillonite is preferable.
  • Many bentonites are commercially available that comply with the Japanese Pharmacopoeia “Bentonite” and have been proven to be harmless to living organisms. It is extremely useful as a raw material for carriers.
  • Examples of such commercially available bentonite include the brand name bentonite and the trade name Kunipia F (both manufactured by Kunimine Industries Co., Ltd.).
  • Kunipia F both manufactured by Kunimine Industries Co., Ltd.
  • saponite examples include a trade name Smecton SA (manufactured by Kunimine Kogyo Co., Ltd.).
  • Various clay minerals can also be obtained from the Japan Clay Society.
  • the protein-introducing carrier of the present invention may contain, for example, a single, a mixture of a plurality of clay minerals, or components other than the clay mineral, and the degree of purification of the clay mineral is not limited.
  • the clay mineral may be, for example, a purified clay mineral from which various impurities contained or adhered are removed.
  • the impurities include soil organic substances (such as various amino acids and lignins), iron, potassium, calcium, and magnesium.
  • the purity power by ordinary X-ray diffraction or elemental analysis is, for example, 85% or more, preferably 95% or more, particularly preferably 98% or more.
  • the purity by this X-ray diffraction can be determined by comparing the diffraction pattern with a standard sample as is generally done.
  • the method for removing the impurities as described above is not particularly limited.
  • the following methods can be applied.
  • the organic substance removal treatment can be performed, for example, by adding and dispersing a peroxy hydrogen peroxide solution to a clay mineral and then heat-treating the dispersion.
  • concentration of aqueous hydrogen peroxide is, for example, 3 to 15% by weight, preferably 3 to 10% by weight, and more preferably 5 to 7% by weight.
  • the addition ratio of peroxy hydrogenated water is, for example, 10 to 30 ml, preferably 15 to 30 ml, more preferably 15 to 20 ml with respect to the clay mineral lg.
  • the conditions of heat processing are the temperature of 25-50 degreeC, for example, Preferably it is 25-40 degreeC, More preferably, it is 30-40 degreeC.
  • the heating time is not particularly limited, for example, it is preferable to carry out until foaming (oxygen) due to heating disappears. After the foaming is completed, further heating treatment is performed in order to remove residual hydrogen peroxide. It is more preferable.
  • the conditions are not limited to these.
  • a clay mineral having a purity of 85 to 100% can usually be obtained.
  • the content of organic matter in the clay mineral used is, for example, 5% or less, preferably 2%, more preferably 1% or less.
  • the organically treated clay mineral is used as a protein introduction carrier, for example, the dispersion-strength clay mineral is recovered by filtration, centrifugation, or the like, and then used in a solvent such as water, buffer, or physiological saline. What was washed may be used.
  • the interlayer material of the clay mineral subjected to the organic treatment in this manner is the same as the clay mineral before the treatment used as a raw material. For example, in addition to sodium ions, potassium ions, calcium ions, magnesium ions, etc.
  • Various exchangeable cations are possible to be used as sodium ions, potassium ions, calcium ions, magnesium ions, etc.
  • the clay mineral is subjected to a deironing treatment described below instead of or in addition to the organic matter removal treatment in order to remove, for example, iron adhering to or contained in the clay mineral. Also good.
  • This iron removal treatment can be performed, for example, by the following method.
  • the clay mineral dispersion treated with the hydrogen peroxide solution is heated, and, for example, an aqueous sodium citrate solution and an aqueous sodium hydrogen carbonate solution are added thereto and sufficiently stirred.
  • an aqueous solution of sodium hydrosulfite sodium mouth sodium sulfite
  • this mixed solution is allowed to stand.
  • the clay mineral after the iron removal treatment is used as a protein introduction carrier, it may be washed with various solvents as in the case of the organic matter treatment.
  • the addition ratio of each substance to the clay mineral lg is, for example, in the range of sodium citrate 50 to 70 mmol, sodium bicarbonate 15 to 30 mmol, hydrosulfite 20 to 35 mmol, preferably sodium citrate.
  • the range is 55 to 65 mmol, sodium bicarbonate 22 to 28 mmol, hydrosulfite 26 to 29 mmol.
  • the clay mineral after the organic substance treatment or the iron removal treatment may be further subjected to induction treatment to various exchangeable cation types by ion exchange reaction. Even when an exchangeable cation such as sodium is included between layers before the treatment, this induction treatment may be performed. As a specific example, an example of the induction process to the exchangeable sodium type is shown below.
  • the clay mineral When the clay mineral is induced to an exchangeable sodium type, for example, the clay mineral that has been subjected to the organic substance removal treatment or the deironation treatment is added to a saturated aqueous sodium salt solution such as a saturated aqueous sodium chloride solution. 'Disperse and collect the clay mineral by filtration or centrifugation.
  • the addition of the sodium salt (for example, salt sodium salt) and the recovery of clay minerals are: Although it may be performed once, it is preferably performed twice or more, more preferably 3 to 5 times in order to sufficiently induce the sodium type.
  • the addition ratio of the saturated aqueous sodium chloride salt solution to the clay mineral is, for example, in the range of 30 to 80 mL, preferably in the range of 40 to 60 mL, and more preferably in the range of 50 to 60 mL with respect to the clay mineral lg.
  • the suspension of the clay mineral in the saturated aqueous sodium chloride solution is not particularly limited, but for example, it is preferably 10 seconds or more, more preferably 30 to 60 minutes.
  • the solvent used for the induction into the exchangeable sodium type is not limited to the aqueous sodium chloride solution, and in addition, for example, an aqueous solution containing a sodium salt such as sodium bromide or sodium iodide is used. it can.
  • the sodium salt concentration in these solutions is not particularly limited, but is preferably a saturated solution as described above.
  • the induction treatment may be performed with an aqueous solution of a sodium salt such as sodium chloride sodium, sodium bromide, sodium iodide, or sodium azide, or an aqueous solution containing two or more of the sodium salts.
  • a sodium salt such as sodium chloride sodium, sodium bromide, sodium iodide, or sodium azide
  • the solution may be treated in the same manner as the above-described method for derivatization into the sodium form with a solution containing an hum-moum salt such as hum.
  • a solution containing a quaternary ammonium salt such as salt tetramethyl ammonium or benzyltrimethyl ammonium chloride can be used.
  • wear. Mineral function can also be modified by, for example, pillaring using a cationic surfactant as described above, or substitution with an amine compound, amid compound, or cationic metal complex as described above. It is.
  • the clay mineral that has been subjected to the exchange cation type in this way may be used as a protein-introducing carrier after dialysis, for example.
  • the various clay minerals shown above can be used as a protein-introducing carrier as they are, for example, in a state of being dispersed in a solution, but the dried product obtained by freeze-drying or the like is used as a protein. It may be a carrier for introduction. If it is the dried product, the dispersion described later This is because it is easy to prepare a desired concentration when preparing a protein introduction agent in the form of.
  • the protein introduction carrier of the present invention it is not limited to a protein but can be derived by introducing a peptide.
  • the protein introduction agent (also referred to as a protein complex) of the present invention includes the protein introduction carrier of the present invention containing a clay mineral and the protein supported thereon.
  • the “protein” in the present invention includes not only a protein generally composed of only amino acids but also the above-mentioned peptides, glycoproteins, mucins, and pharmaceutically acceptable salts thereof. Included (in the present invention, referred to as "protein").
  • the pharmaceutically acceptable salt include inorganic acid addition salts such as hydrochloride, sulfate, and phosphate, organic acids such as acetate, propionate, kenate, tartrate, and malate.
  • Other salts include sodium salts, potassium salts, calcium salts, and the like.
  • the (weight ratio A: B) is, for example, in the range of 1: 0.1 to 5, preferably in the range of 1: 0.5 to 4, more preferably in the range of 1: 0.5 to 3, particularly preferably. Is in the range of 1: 1-2.
  • the protein to be carried on the protein introduction carrier is not particularly limited, and various proteins can be used, and a single protein or a mixture of a plurality of proteins may be used.
  • the characteristics of the protein are not limited at all, and for example, a peptide having a small molecular weight or a protein having a large molecular weight can be sufficiently introduced into a cell.
  • Specific examples of the molecular weight are not limited at all, but are, for example, about 300 Da to 500 kDa (as well as larger proteins and small peptides), preferably in the range of 1 kDa to 500 kDa, more preferably 5 kDa to 500 kDa. It can be fully introduced into cells.
  • the type of clay mineral to be combined is not limited at all, but may be selected according to the type of protein, for example.
  • the type of protein can be appropriately determined according to, for example, the function given to the cell.
  • proteins that serve as therapeutic agents, preventive agents, and suppressors of diseases.
  • a protein used for desensitization treatment for example, for the purpose of treating hay fever, a pollen allergen or the like is carried, and for the purpose of treating food allergy, a target protein such as ovalbumin (ovalbumin) (allergic
  • ovalbumin ovalbumin
  • a causative protein or a fragment thereof is supported and introduced into cells.
  • it is sufficient to carry a deficient enzyme.
  • lactose intolerance ⁇ -galactosidase or the like is It can be illustrated to be introduced in In addition, for diabetes, it can be exemplified that insulin is loaded and introduced into cells.
  • the form of the protein introduction agent is not particularly limited as long as it contains the protein introduction carrier and the protein carried on the protein introduction carrier.
  • a dispersion liquid in which the protein introduction agent is dispersed may be used. It may be a freeze-dried product. Further, the dispersion may be in a frozen form. In that case, it may be thawed at the time of use.
  • pharmaceutical additives such as excipients, binders, disintegrants, stabilizers, preservatives, buffers, or food additives such as sweeteners, fragrances, preservatives, stabilizers, etc. Etc. can also be added.
  • the protein concentration in the protein dispersion is not particularly limited, but is, for example, in the range of 0.1 to: LOOO ⁇ g / mL, preferably 25 to 400 ⁇ g / mL, particularly preferably 50. ⁇ 200 / ⁇ 8 ⁇ .
  • the dispersion medium of this dispersion is not particularly limited, and examples thereof include distilled water, physiological saline, PBS (phosphate buffered saline) and the like. Further, as described later, when used for protein introduction into cultured cells, a liquid medium or the like may be used in addition to these.
  • the dispersion medium is preferably sterilized in order to prevent contamination.
  • the pH of the protein dispersion is not particularly limited, and may be, for example, near neutral, and is preferably in the range of 5.5 to 7.5.
  • the concentration of the clay mineral in the clay mineral dispersion is not particularly limited.
  • ⁇ is in the range of 0.1 to L000 ⁇ g / mL, and preferably ⁇ to 25 to 400 ⁇ gm. [Ma 50-200 / ⁇ 8 ⁇ ⁇ .
  • the pH of the clay mineral dispersion is the same as that of the protein dispersion, Not limited.
  • a protein introduction agent can be prepared by mixing the protein dispersion and the clay mineral dispersion.
  • a complex in which protein is supported on the clay mineral can be formed.
  • the ratio (weight ratio A: B) between the protein (A) and the clay mineral (B) is, for example, as described above. It is the same.
  • the mixed solution (protein introduction agent) obtained by mixing the protein dispersion and the clay mineral dispersion is usually intended for cells and living bodies, its pH is not particularly limited.
  • pH is medium. It may be set near the sex (for example, pH of about 6.5 to 7.5).
  • the case where an exchangeable cation is included between clay mineral layers is not limited in the same manner.
  • the pH may be adjusted to near neutral.
  • the protein can be introduced without being affected by pH even after the protein is retained and after being placed under acidic conditions. . For this reason, for example, it can be said that it is suitable for oral administration as described later, in which the introduction of protein itself is not affected even when it passes through the stomach under strongly acidic conditions.
  • the protein dispersion and the clay mineral dispersion can be mixed and used immediately as a protein introduction agent, it is preferable to incubate after mixing in order to sufficiently carry the protein in the clay mineral.
  • the temperature conditions for the incubation are not particularly limited, and can usually be treated at room temperature, and the time is not particularly limited.
  • Such a protein introduction agent in the form of a dispersion may be used as it is, or may be frozen until use as described above.
  • methods such as freeze-drying and spray-drying can be applied, and it may be dispersed in the above-mentioned dispersion medium at the time of use.
  • the clay mineral in the present invention is known to be taken internally as a natural remedy, for example, and may be contained in an internal preparation.
  • the protein introduction agent of the present invention is extremely useful as, for example, a pharmaceutical, a functional food, and a food additive.
  • the present invention introduces a protein by bringing the protein introduction agent into contact with a cell.
  • Specific examples of the protein introduction method in vitro and in vivo are shown in the following Embodiments 3 and 4, respectively. According to this method, cells into which a foreign protein has been introduced can be produced. In addition, this invention is not restrict
  • the protein introduction agent may be added to a cultured cell into which the target protein is introduced and incubated.
  • the cultured cells are preincubated for a certain period of time in a liquid medium according to the type, and then the protein introduction agent is added and further incubated.
  • the protein introduction agent is added and further incubated.
  • the protein can be smoothly introduced into the cultured cells by the introduction agent, and incubation is performed for a certain period of time after the addition. Can introduce proteins more efficiently.
  • the type of the liquid medium can be appropriately determined depending on the cells as described above, and is not particularly limited.
  • the addition ratio of the protein introduction agent to the cultured cells is not particularly limited!
  • the addition ratio of the clay mineral to 6 cells IX 10 6 is in the range of 0.01 to: LOO / zg.
  • the protein introduction agent more preferably, the addition rate of the clay mineral is 0.1 to 50 g, particularly preferably 0.2 to 25 / zg.
  • the protein introduction agent such that the ratio of the protein to the cell 1 X 10 6 is in the range of 0.01 to: LOO / zg, more preferably the addition ratio of the protein is 0.1. ⁇ 50 8 , particularly preferably ⁇ . 0.2 to 25 / zg.
  • the cultured cells into which the target protein is introduced are not limited. Applicable.
  • human cells are non-human animal cells (mammalian cells), these In addition, it can be applied to cells of all species such as microorganisms, fish, reptiles, amphibians, birds and insects.
  • the cell culture is not particularly limited as described above, and can be performed according to known culture conditions using a known liquid medium according to the cell type.
  • the culture time in which cells are cultured (pre-incubated) in advance is preferably, for example, 18-30 hours, more preferably 18 to 24 hours, particularly preferably 22 to 24 hours.
  • the incubation time after the addition of the protein introduction agent is not particularly limited as long as, for example, the protein is introduced into the cell, but is, for example, about 3 hours, and the upper limit is not particularly limited.
  • the culture temperature is usually 37 ° C, and it is preferable to culture in the presence of 5% carbon dioxide.
  • Cells into which the protein obtained by the above method has been introduced can be used for the following treatments. For example, when a certain disease has developed due to a gene deficiency, a protein encoded by the deficient gene is introduced into cultured cells by the introduction method of the present invention. Then, the obtained protein-introduced cell is administered to the affected area of the disease. In this way, the transferred protein in the administered cells can alleviate or cure the symptoms of the disease.
  • the administration method include injection into the affected area, and surgical treatment in which the protein-introduced cell is carried on a carrier and implanted in the affected area, subcutaneously or abdominally.
  • the protein introducing agent is administered to a living body, and the protein is introduced into cells of an organ or tissue by the introducing agent.
  • the protein-introducing agent can be introduced into the target cells in the living body, for example, by oral administration or simply administered to the target organ or tissue by surgical treatment or injection. .
  • the protein introduction agent of the present invention when used, the target protein can be selectively and reliably introduced into small intestinal cells. in this way It is considered that the protein can be selectively introduced into the small intestine for the following reasons.
  • the protein is supported on the clay mineral, for example, by mixing the clay mineral and protein.
  • the carrier for introduction of proteins thus carried supports the protein tightly by increasing the charge when the pH is acidic, while the charge is charged under neutral or alkaline conditions. By reducing the size, protein is released and released. Since the clay mineral has such a mechanism, when the protein introduction agent is orally administered, it passes through the stomach under acidic conditions and reaches the small intestine without releasing the protein. In addition, because it is a clay mineral, it is not digested in the stomach. And since the moon cake has a neutral pH and a smaller charge than the stomach, protein is released from the clay mineral of the protein introduction agent.
  • the protein introduction carrier (protein introduction agent) of the present invention is orally administered, the protein will not be digested in the stomach, and it will enter various cells and be selected into the small intestine like intravenous injection. There is no problem that makes it difficult to administer. That is, according to the present invention, selective administration to the small intestine can be easily performed by simple oral administration.
  • allergy treatment desensitization treatment
  • intestinal immunity By such selective protein introduction agent contact with the small intestine, allergy treatment (desensitization treatment) utilizing intestinal immunity can also be realized by simple oral administration.
  • a protein-introducing agent is prepared by supporting a protein that causes various allergies on a protein-introducing carrier, and this is regularly orally administered to allergic patients. Then, since the protein introduction agent is carried to the small intestine and selectively releases the target protein in the small intestinal cells, immune tolerance occurs in intestinal immunity, and allergic symptoms are reduced.
  • Such a method can be said to be an excellent therapy with less burden on patients who do not need frequent administration by injection, for example, as compared with conventional desensitization treatment.
  • Intestinal cells usually peel off in about two weeks, so that cells into which proteins are introduced do not remain in the body for a long period of time. Therefore, if the present invention is applied, it can be said that it is possible to provide a preventive method and a therapeutic method that are further excellent in safety.
  • the protein introduction method in vivo can be applied to, for example, a human living body, and can also be applied to a living body of a mammal other than human.
  • the dose of the protein introduction agent can be appropriately determined according to the purpose, type of living body, etc. For example, cells and clay minerals or The ratio with the protein may be the same ratio as the in vitro introduction described above.
  • protein can be selectively introduced into the small intestine, it can be said to be a useful method for clinical treatment.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is a pharmaceutical composition containing a protein as a therapeutic agent, preventive agent or inhibitor of a disease, and further comprises the protein introduction carrier of the present invention (that is, the present invention) A protein composition comprising a protein transducing agent).
  • the active ingredient that serves as a therapeutic agent, preventive agent, or suppressor for a disease is a protein
  • administration of the pharmaceutical composition of the present invention containing the protein-introducing carrier allows easy and safe human safety.
  • the prevention and treatment of mammals other than can be performed.
  • the type of protein is not limited at all, and can be selected according to the disease. For example, in the case of desensitization treatment, protein such as pollen or albumin, etc., and in the case of diabetes, insulin or the like can be selected.
  • the method for administering the pharmaceutical composition is not particularly limited, and oral administration and parenteral administration such as injection can be selected depending on the disease.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be administered by being implanted into a living body by a surgical treatment such as a protein-introduced cell as described above.
  • ⁇ -galatatosidase was introduced into small intestinal epithelial cells in vitro using clay minerals.
  • DMEM Dullbecco'sModified E agle's Medium: serum-free
  • Rat small intestinal epithelial cells IEC-6 (ATCC-CRL1592) distributed by ATCC were used as cells.
  • 2.5 ml of the following liquid medium was placed in a 12 well plate (Falcon), and 1 ⁇ 10 5 small intestinal epithelial cells were seeded on each well and cultured at 37 ° C. for 24 hours.
  • the carbon dioxide concentration was adjusted to 5% with a carbon dioxide incubator.
  • DMEM Dulbecco's modified Eagle medium: Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.
  • FBS fetal bovine serum: manufactured by Dainippon Pharmaceutical
  • the cultured cells were washed twice with the PBS (-), and the DEME (serum-free) lml was added to each well. Further, the protein introduction agent 1001 was added to each well so that j8-galactosidase was: L g (905 mU) Z well. After incubating at 37 ° C. for 3 hours, serum (FBS) 111 ⁇ 1 was added to adjust the FBS concentration in the medium to 10% by weight and incubated at 37 ° C. for 24 hours.
  • FBS serum
  • Z buffer 90 ⁇ 1 of the following composition recovered cell extract 10 ⁇ 1 and 4 mg / ml ONPG ( 0- Nitrophenyl / 3-D-galatatopyranoside) solution 20 ⁇ 1 after 1 hour at 3 7 ° C and ⁇ Ka ⁇ , 100 i ul of reaction stopping solution (LMNA CO) and ⁇ Ka ⁇ , The absorbance of this reaction solution at a wavelength of 415 nm was measured. Then, ⁇ -galatatosidase activity (mU) in each cell was calculated from the obtained absorbance and a calibration curve prepared in advance. These results are shown in Fig. 1. Note that “j8-galonly” in the figure indicates that only galactosidase was introduced in Comparative Example 1 (same in FIG. 2).
  • ⁇ -galatatosidase was introduced into small intestinal epithelial cells in vivo using clay minerals.
  • the same trade name Smecton SA and the trade name bentonite as in Example 1 were used.
  • the carrier dispersion (lmgZml) 50 ⁇ 1 and the protein dispersion (1 ⁇ 8 ⁇ 1) 50 / ⁇ 1 prepared in the same manner as in Example 1 were each diluted with 1001 of mili-Q water. Then, both dilutions were mixed and incubated at 25 ° C for 1 hour to prepare a protein introduction agent.
  • the protein introduction agent was forcibly orally administered to a 6-week-old ddY mouse (OS: Japan SLC) using an oral sonde so that the concentration of 13-galatatosidase was 50 ⁇ g (45.25 U) / mouse.
  • the mice were fasted from the day before the administration of the protein introduction agent.
  • mili-Q water 300 1 was administered instead of the protein introduction agent, and Comparative Example 2 Instead of the protein introduction agent, a diluted solution obtained by diluting the protein dispersion (lmgZml) 50 1 with mili-Q water 250 1 was orally administered.
  • mice were anesthetized with ether and dislocated the cervical spine. Then, the mouse small intestine was taken out, cut out by 4 cm from the stomach side, and a total of 3 sections were each immersed in 200 ⁇ 1 of PBS ( ⁇ ) containing 5 mM E GTA.
  • the small intestine was homogenized (Fiscotron homogenizer: manufactured by Sakai-ON), and the supernatant collected by centrifugation (14,500 rpm, 5 minutes, 4 ° C.) was used as a cell extract. For these cell extracts, j8-galatatosidase activity was measured in the same manner as in Example 1.
  • Fig. 2 shows the results of cell extracts from a section of a section close to the large intestine.
  • Example 2 and Comparative Example 2 can be judged to be activity values by the protein into which the difference from the control is introduced. Then, as shown in FIG. 2, compared with Comparative Example 2, Examples 2-1 (Kunipia) and 2-2 (Bentonite) showed extremely high activity. In other words, it can be said that j8-galactosidase can be introduced into small intestinal cells extremely efficiently even in vivo by using these protein introduction carriers.
  • j8-galactosidase is introduced in vivo in this way and shows activity in vivo
  • an introduction agent carrying j8-galactosidase is, for example, for lactose intolerance. It can be said that it can be used as a medicine or a functional food.
  • OVA ovalbumin
  • bentonite trade name Bengel Fw; manufactured by Houjiyun Co., Ltd.
  • FIG. 3 (A) is a graph showing the protein concentration in the supernatant
  • Fig. 3 (B) shows the ratio of the amount of protein decrease from OVA alone, that is, the ratio to the bentonite, where OVA alone is 100%. Indicates adsorption rate (%) It is a graph.
  • a protein transduction agent was prepared using a protein containing ovalbumin (OVA), a major allergen of egg allergy, and a clay mineral, and the introduction of OVA into mouse blood in vivo was confirmed.
  • OVA ovalbumin
  • Example 3 OVA and bentonite (trade name Bengel Fw) were suspended in the PBS () of Example 1 to prepare an OVA dispersion (lOOmgZml) and a carrier dispersion (lOOmgZml). These dispersions were mixed in the following ratio in an Ebendful tube and incubated at room temperature for 1 hour to obtain a protein introduction agent.
  • PBS (—) 300 / zl of Example 1 was administered instead of the protein introduction agent, and in Comparative Example 4, a solution of OVA alone shown in Table 2 instead of the protein introduction agent 300 ⁇ 1 Were orally administered.
  • the OVA-specific Ig G antibody contained in the serum sample was allowed to act on the OVA-coated well plate, and the HRP-labeled antibody was used as the secondary antibody to detect the OVA-specific IgG antibody contained in the sample.
  • the following Coating Buffer was added to the well plate to 100 ⁇ l Zwell, sealed, and incubated at 4 ° C for 1 hour. The next day, the well plate was washed three times with the following Wash buffer, and the following blocking buffer was added to 300 ⁇ l Zwell. After incubation for 1 hour, the well plate was washed 3 times with the wash buffer. The serum sample was diluted 500-fold with the following sample diluent, and this diluted sample was added to the well plate so as to be 100 1 / well and incubated for 2 hours. After incubation, the well plate was washed 5 times with the wash buffer.
  • Coating buffer Dissolved in lOOmM carbonate buffer (pH 9.6) so that the OVA concentration is 10 ⁇ g / ml.
  • Wash buffer Mix 50 mM Tris, O. 14 M NaCl, and O. 05% Tween20 (trade name) (pH 8.0).
  • Blocking buffer Blocking one (trade name) and 50 mM Tris—HC1 are mixed so that the volume ratio is 1: 3.
  • Sample diluent Blocking one (trade name) and the above Wash solution are mixed so that the volume ratio is 1:19.
  • TMB solution TMB solution (trade name) and Peroxidase solution (trade name) are mixed immediately before use so that the volume ratio is 1: 1.
  • the protein-introduced carrier of the present invention is useful as a carrier for protein delivery, for example, in oral desensitization treatment for food allergies and the like.
  • MK mitodocaine
  • MK for example, a recombinant in which Escherichia coli is used as a host is prepared, and a preparation obtained by refining the expressed MK can be used in the experiment.
  • human MKcDNA is routinely obtained by PCR using the Wilms tumor-derived culture cell line G-401 according to the method of Take et al. (J. Biochem.ll6, ppl063- 1068 (1994)).
  • the human MKcDN A is transduced into E. coli to prepare a recombinant.
  • a preparation can be prepared by purifying human MK protein from inclusion bodies of recombinant E. coli grown in culture according to the method of Take et al. It can also be prepared by purchasing a commercial product from Peptide Research Institute (Osaka), R & D Systems (MN, USA), or the like.
  • the carrier dispersion 15 ⁇ 1 and the protein dispersion 151 were added to and mixed with DMEM (Dullbecco's Modified Eagle's Medium: serum-free) 270 ⁇ 1.
  • DMEM Dullbecco's Modified Eagle's Medium: serum-free
  • the mixture was allowed to stand at room temperature for 1 hour, and the DMEMlml was further added and mixed to obtain a protein introduction agent.
  • Rat small intestinal epithelial cells IEC-6 (ECACC-88071 401) distributed by ATCC were used as cells. First, place 5 ml of the following liquid medium in a 12-well plate (Corning) and inoculate 5 x 10 4 rat rat small intestinal epithelial cells IEC-6 on each well for 4 days at 37 ° C. did. All cells were cultured under conditions of 5% carbon dioxide. [0098] (Composition of liquid medium)
  • FBS fetal bovine serum: made by Hyclone
  • the cultured cells were washed twice with the PBS (-) solution, and 1.3 ml of the protein introduction agent was added to each well. Each well was then incubated at 37 ° C for 2 hours to introduce these proteins (MK) into cultured cells.
  • each sample was subjected to sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) according to the method of Laemmli et al. PAG mini “Daiichi” 15Z25 (Daiichi Chemical Co., Ltd.) was used as the gel for electrophoresis, and the electrophoresis conditions were about 90 minutes at a constant current of 20 mA.
  • Each well includes marker protein solution, mitocaine + smetato A total of 7 samples were sampled: N, SA, Mitodocaine + Kunipia F, Mitodocaine + Bengel FW, Mitsodocaine + Bengenore Bright 25, Comparative Example 5 (Middocaine only), and Control.
  • the amount of sample per lane was 2 X 10 5 cells.
  • chemically synthesized middocaine human (Peptide Institute, Inc.) was prepared and run at 200 to 500 ng per lane (not shown in FIG. 5).
  • molecular weight marker the trade name Kaleidoscope Prestained Standards (BIO—RAD) was used.
  • the membrane was reacted with donkey anti-goat IgG peroxidase-labeled antibody (SantaCruz Biotechnology, In; CA, U.S.A.) for 1 hour at room temperature. After completion of the reaction, the membrane was washed 4 times (each for 10 minutes) with a PBS solution containing 0.05% Tween 20, and then once (10 minutes) with a PBS solution.
  • donkey anti-goat IgG peroxidase-labeled antibody SantaCruz Biotechnology, In; CA, U.S.A.
  • lanes 1 and 8 are the results of using the marker protein solution
  • lanes 2 to 5 are the results of using the protein transducing agent
  • lane 2 is the midocaine + smecton SA
  • lane 3 is the mitodo force in + Kunipia F
  • lane 4 Mitodocaine + Bengenore FW
  • Lane 5 is the result of Mitodocaine + Bengelbright 25
  • Lane 6 is the result of Comparative Example 5 (Mitsudocaine only)
  • Lane 7 is the result of control (one).
  • Example 6 A protein having a molecular weight of about 18 kD was introduced into small intestinal epithelial cells IEC-6 (ECAC C 88071401) in vitro using various carriers for protein introduction.
  • PTN can also be produced as a recombinant, and a recombinant PTN protein can be prepared and used as a standard.
  • Peptide Laboratories Osaka
  • R & DSystems MN, USA
  • Etc. may be used.
  • the carrier dispersion 15 ⁇ 1 and the protein dispersion 151 were added to DMEM (Dullbecco's Modified Eagle's Medium: serum-free) 270 ⁇ 1 and mixed. The mixture was allowed to stand at room temperature for 1 hour, and the DMEMlml was further added and mixed to obtain a protein introduction agent.
  • DMEM Dullbecco's Modified Eagle's Medium: serum-free
  • Rat small intestinal epithelial cells IEC-6 (ECACC-88071 401) distributed by ATCC were used as cells. First, in a 12 well plate (manufactured by Corning Co., Ltd.), store 5 ml of the same liquid medium as in Example 5 and seed each well with 5 x 10 4 rat small intestinal epithelial cells IEC-6. The cells were cultured at 37 ° C for 4 days. All cells were cultured under conditions of 5% carbon dioxide.
  • lanes 1 and 8 are the results of using the marker protein solution
  • lanes 2 to 5 are the protein introduction agents
  • lane 2 is the pleotite fin + smecton SA
  • lane 3 is the pleat mouth.
  • Lane 4 is Pleoto Mouth Fin + Wenger FW
  • Lane 5 is Pleoto Mouth Fin + Wenger Bright 25
  • Lane 6 is Comparative Example 6 (pre-trophin only)
  • Lane 7 is control (one) Is the result of As shown in the figure, even when any of the above four types of protein introduction carriers was used, a band was confirmed that was darker than the one introduced alone (Comparative Example 6).
  • Polypeptides having a molecular weight of about 5 kD were introduced into small intestinal epithelial cells IEC-6 (ECAC C 88071401) in vitro using various carriers for protein introduction.
  • the same carrier dispersion (2 mgZml) was prepared using the same clay mineral of the trade name Sumetaton SA containing saponite as the carrier for protein introduction as in Example 6.
  • Sumetaton SA containing saponite
  • insulin SIGMA-A LDRICH; MO, U.S.A.
  • INS insulin
  • This INS was dispersed in 1 mgZml with 5 mmol Zl hydrochloric acid aqueous solution to prepare a polypeptide dispersion.
  • the carrier dispersion 15 ⁇ 1 and the polypeptide dispersion 151 were added to DMEM (Dullbecco's Modified Eagle's Medium: serum-free) 270 ⁇ 1 and mixed.
  • DMEM Dullbecco's Modified Eagle's Medium: serum-free
  • the blend The mixture was allowed to stand at room temperature for 1 hour, and the above DMEMlml was further added and mixed to obtain a polypeptide introducing agent.
  • Rat small intestinal epithelial cells IEC-6 (ECACC-88071 401) distributed by ATCC were used as cells. First, in a 12 well plate (manufactured by Corning Co., Ltd.), store 5 ml of the same liquid medium as in Example 5 and seed each well with 5 x 10 4 rat small intestinal epithelial cells IEC-6. The cells were cultured at 37 ° C for 4 days. All cells were cultured under conditions of 5% carbon dioxide.
  • the cultured cells were washed twice with the PBS (-) solution, and 1.3 ml of the above-mentioned polypeptide introduction agent was added to each tool. Each well was then incubated at 37 ° C for 2 hours to introduce INS into the cultured cells.
  • SDS-PAGE sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis
  • Isocratic Gel Invitrogen; CA, USA
  • the sample amount per lane was 2 ⁇ 10 5 ce lis protein.
  • insulin SIGMA-ALDRICH; MO, USA
  • As the molecular weight marker the trade name Kaleidoscope Prestained Standards (BIO-RAD) was used.
  • lane 1 is the marker protein solution
  • lane 2 is the result of using the polypeptide transfection agent (insulin + smecton SA)
  • lane 3 is the control (one)
  • lane 4 is the standard solution (positive control insulin). )
  • Result As shown in the figure, as a result of using smecton SA containing saponate, a dark band indicating the introduction of insulin was confirmed.
  • the protein introduction carrier of the present invention when used, a target protein can be introduced into cells with high safety. Therefore, the protein introduction method of the present invention using the protein introduction carrier is very useful in the field of clinical medicine.

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Abstract

　優れた安全性でタンパク質を細胞に導入できるタンパク質導入方法を提供する。 　粘土鉱物からなるタンパク質導入用担体に目的タンパク質を担持させ、これを細胞に添加することによって前記細胞内に前記目的タンパク質を導入することができる。前記粘土鉱物は、層状粘土鉱物であることが好ましく、モンモリロナイト、バーミキュライト、イライト等が使用できる。

Description

明 細 書
タンパク質導入用担体、前記担体を用いたタンパク質導入剤、タンパク質 導入方法、およびタンパク質導入細胞ならびにその製造方法
技術分野
[0001] 本発明は、細胞内にタンパク質を導入するためのタンパク質導入用担体、前記担 体を用いたタンパク質導入剤に関する。さらに、前記導入剤を用いたタンパク質の導 入方法、タンパク質を導入した細胞ならびにその製造方法に関する。
背景技術
[0002] 近年、ガンや遺伝子疾患等、種々の疾患の治療法として、例えば、欠損遺伝子や 変異遺伝子に対する正常型遺伝子を細胞内に導入することにより遺伝子レベルで治 療を行う、いわゆる遺伝子治療が実用化されている。し力しながら、遺伝子治療の場 合、遺伝子が細胞に導入されても、確実にタンパク質が発現し且つその機能を奏す る力否かが問題となる。
[0003] このため、遺伝子治療とは別に、必要なタンパク質そのものを目的細胞に導入する 方法が検討されている。その一手段として、 目的タンパク質を担持して細胞に導入す る担体の研究がなされている力 生体内への導入を想定しているため、安全性が高 いことが必要不可欠である。
[0004] し力しながら、タンパク質を細胞に導入できる担体は極めて少なぐさらに、ポリェチ レンイミン等の公知の担体は、生体に対して毒性を示すため安全性に問題があり、実 際に生体に使用できるものは存在しないに等しい状況である（例えば、非特許文献 1 参照)。
非特許文献 l : Zelphati, 0. et al. J. Biol. Chem. 276, 35103-35110 (2001)Intracellul ar delivery of proteins with a new lipid— mediated delivery system.
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0005] そこで、本発明は、安全性に優れる新たなタンパク質導入用担体、タンパク質導入 剤、タンパク質導入方法、タンパク質導入細胞ならびにその製造方法の提供を目的 とする。
課題を解決するための手段
[0006] 前記目的を達成するために、本発明のタンパク質導入用担体は、細胞にタンパク 質を導入するための担体であって、粘土鉱物を含むことを特徴とする。また、本発明 のタンパク質導入剤は、前記本発明のタンパク質導入用担体とこれに担持されたタン パク質とを含む導入剤である。
[0007] さらに、本発明のタンパク質導入方法は、前記本発明のタンパク質導入剤を細胞に 接触させて、前記細胞に前記タンパク質を導入する方法であり、また、この方法によ つて、外来のタンパク質が導入された本発明の細胞が製造される。
発明の効果
[0008] 本発明者らは、臨床医療等の分野において、細胞に対する安全性が高い新規のタ ンパク質導入用担体を開発すべく鋭意研究を行った。その結果、前記粘土鉱物をタ ンパク質導入用担体として用いれば、容易に細胞内にタンパク質を導入できることを 見出した。前記「粘土鉱物」とは、通常、粘土に含まれるケィ酸塩鉱物を言い、従来 から、例えば、化粧品の成分として、医薬分野における発布剤の基材ゃ制酸剤として 、また光学材料や触媒としても広く利用されている。しカゝしながら、本発明のように、 粘土鉱物を、タンパク質を細胞に導入するための担体として使用できることは、本発 明者らが初めて見出したことである。
[0009] 本発明のタンパク質導入用担体によれば、例えば、前記担体と導入させるタンパク 質とを溶液内で混合するだけで、前記タンパク質を担持することができ (前記担体とタ ンパク質との複合体を形成することができ）、さらに、このタンパク質を担持した前記担 体を、目的細胞に接触させれば、細胞内にタンパク質を導入できる。このため、タン ノ ク質導入の操作も極めて簡便になる。また、粘土鉱物は、前述のように従来から広 く化粧品や医薬品に使用されているという事実からも、生体に対する、特にヒトに対す る安全性は十分に立証されているところである。したがって、このような安全性に極め て優れる粘土鉱物を含む本発明のタンパク質導入用担体は、前記臨床医療の分野 等において、広く適用でき、且つ、極めて有用である。なお、本発明のタンパク質導 入担体が細胞にタンパク質を導入するメカニズムは明らかではないが、おそらく前記 タンパク質導入用担体が、タンパク質を担持した状態で細胞内に取り込まれ、細胞内 でタンパク質を遊離すると考えられる。
[0010] また、本発明のタンパク質導入剤は、前述のように、例えば、本発明のタンパク質導 入担体と目的タンパク質との混合によって、前記タンパク質を前記担体に担持できる ため、調製が極めて容易である。そして、このタンパク質導入剤を用いた本発明のタ ンパク質導入方法によれば、前記導入剤を細胞に接触させるだけで細胞内にタンパ ク質を導入できるため、その操作も極めて簡便であり、安全性にも優れる。
[0011] また、本発明のタンパク質導入細胞は、細胞に対する安全性が非常に高い本発明 の導入方法によって作製できるため、例えば、従来のようなポリエチレンィミン等の担 体を使用した場合に見られる弊害等も回避できる。このため、外来のタンパク質を導 入した細胞を患部の組織細胞に接触させる治療方法等にも、高 ヽ安全性で適用で きる。なお、本発明において「タンパク質」とは、いわゆるタンパク質には限定されず、 後述するようにペプチド等も含まれる。
図面の簡単な説明
[0012] [図 1]本発明の一実施例において、タンパク質導入細胞における j8 -ガラタトシダーゼ 活性を示すグラフである。
[図 2]本発明の他の実施例において、タンパク質導入細胞における j8 -ガラタトシダー ゼ活性を示すグラフである。
[図 3]本発明のさらにその他の実施例において、タンパク質導入担体に対するタンパ ク質の吸着性を示すグラフであり、同図 (A)は上清画分におけるタンパク質量、同図 (B)はタンパク質導入担体におけるタンパク質の吸着率をそれぞれ示す。
[図 4]本発明のさらにその他の実施例において、 OVAをタンパク質導入担体により導 入した場合における、マウス血清中の OVA特異的 IgG量を示すグラフである。
[図 5]本発明のさらにその他の実施例において、ミツドカインをタンパク質導入担体に より導入した場合における、細胞内 OVAの有無を示すウェスタンブロットの電気泳動 写真である。
[図 6]本発明のさらにその他の実施例において、プレイオト口フィンをタンパク質導入 担体により導入した場合における、細胞内 PTNの有無を示すウェスタンプロットの電 気泳動写真である。
[図 7]本発明のさらにその他の実施例において、インスリンをタンパク質導入担体によ り導入した場合における、細胞内 OVAの有無を示すウェスタンブロットの電気泳動写 真である。
発明を実施するための最良の形態
[0013] (実施形態 1)
タンパク 入 ffl相. ：
本発明のタンパク質導入用担体において、前記粘土鉱物は、特に制限されず、ま た、メカニズムは不明であるが、前記粘土鉱物によれば、タンパク質を担持することが できる。前記粘土鉱物としては、例えば、層状粘土鉱物があげられる。このような層状 構造の粘土鉱物は、通常、その層間にイオンや水が挟み込まれた構造をとっている
[0014] 前記層状粘土鉱物の層間物質は、例えば、交換性陽イオンであることが好ましい。
層間物質が交換性陽イオンの場合、通常、この陽イオンは層の内側面の水酸基（一 OH)と結合している。なお、前記交換性陽イオンを層間物質として有する粘土鉱物 を、以下、「交換性陽イオン型」の粘土鉱物ともいう。
[0015] このような粘土鉱物であれば、例えば、酸性条件下でタンパク質を放出することなく 、中性またはアルカリ性条件下でタンパク質を放出（遊離)することもできる。このため 、条件に応じて選択的にタンパク質を放出させる際に有用である。
[0016] 前記交換性陽イオンとしては、例えば、ナトリウムイオン、アンモ-ゥムイオン、第 4 級アンモ-ゥムイオン等があげられる。これらの中でも、天然型の粘土鉱物の多くが 有していることからナトリウムイオンが好ましぐまた、大きな立体構造である第 4級アン モ -ゥムイオンも好ましい。前記第 4級アンモ-ゥムイオンとしては、例えば、塩化テト ラメチルアンモ -ゥムイオン、塩ィ匕べンジルトリメチルアンモ -ゥムイオン等がある。
[0017] また、これら以外にも、例えば、 a アミノ酸や j8—アミノ酸等の各種アミノ酸、ドー ノ ミン等のアミン化合物、アクリルアミド等のアミドィ匕合物等の陽イオンでもよいし、ァ ルキルアンモ-ゥム、アルキルトリメチルアンモ-ゥム、テトラメチルホスホ-ゥム、アル キルピリジ-ゥム等のカチオン性界面活性剤や、ルテニウムテトラアンモ-ゥム、トリス フエナンスロリンロジウム等のカチオン性金属錯体の陽イオンでもよ \、。前記カチオン 性金属錯体としては、例えば、ルテニウム等のアンモニア錯体等が使用できる。また 、メチルビオロゲン等でもよい。
[0018] 本発明における前記層状粘土鉱物としては、特に制限されず、例えば、力オリナイ ト、バイロフイライト—タルク、スメクタイト、バーミキユライト、雲母、脆雲母、緑泥石およ びセピオライト—ノ^ゴスカイトの合計 8群の結晶質型粘土鉱物が使用できる。結晶 質型の中でも、カオリナイト群はケィ酸塩層の型が「1 : 1型」であり、その他 7つのダル ープは、「2 : 1型」である。層電荷のない前記カオリナイト群に属する粘土鉱物として は、例えば、カオリナイト、デイツカイト、ノ、ロイサイト、ナクライト、クリソタイル、リザルダ イト、同じく層電荷のないバイロフイライト タルク群に属する粘土鉱物としては、例え ば、ノイロフィライト、タルクがあげられる。また、層電荷を有するスメクタイト群としては 、例えば、モンモリロナイト、パイデライト、ノントロライト、サボナイト、ヘクトライト、スチ ブンサイトが、バーミキユライト群としては、例えば、 di-バーミキユライト、 tri-バーミキュ ライトが、雲母群としては、例えば、白雲母、ノ ラゴライト、イライト、フロゴバイト、黒雲 母、レビドライトが、脆雲母群としては、例えば、マーガライト、クリントナイトが、緑泥石 群としては、ドンパサイト、スドウ石、タツカイト、クリノクロア、シャモサイトが、それぞれ あげられる。また、層電荷のないセピオライト一ノ リゴスカイト群としては、セピヲライト 、 ノ リゴルスカイトがあげられる。これらの中でも、層電荷を有する結晶質粘土鉱物が 好ましぐより好ましくは、スメクタイト群、バーミキユライト群、雲母群である。具体的に は、モンモリロナイト、バーミキユライト、イライトが好ましぐ特にモンモリロナイトが好ま しい。
[0019] また、前記層状粘土鉱物の他にも、例えば、ィモゴライト、ァロフェン、ヒシンゲライト 等の非結晶質型粘土鉱物も使用できる。また、前記粘土鉱物としては、天然のものに は限られず、合成物も使用できる。
[0020] 前記粘土鉱物は、天然の粘土力も採取してもよいが、種々の市販品が使用できる。
モンモリロナイトとしては、例えば、モンモリロナイトを主成分とするベントナイトが好ま しい。ベントナイトは、 日本薬局方「ベントナイト」に準拠した市販品が多数販売されて おり、生体に対して無害であることは証明済みであるため、本発明のタンパク質導入 用担体の原料として極めて有用である。このようなベントナイトの市販品としては、例 えば、商品名ベントナイト、商品名クニピア F (共にクニミネ工業社製)等があげられる 。サボナイトとしては、例えば、商品名スメクトン SA (クニミネ工業社製)等がある。また 、 日本粘土学会からも、各種粘土鉱物を入手することもできる。なお、本発明のタン パク質導入用担体は、例えば、単独、複数の粘土鉱物の混合物、もしくは前記粘土 鉱物以外の成分を含んでいてもよぐまた、前記粘土鉱物の精製度も限定されない。
[0021] 前記粘土鉱物は、例えば、含有もしくは付着している各種不純物が除去された精 製粘土鉱物であってもよい。前記不純物とは、例えば、土壌中の有機物 (各種ァミノ 酸やリグニン等）や、鉄、カリウム、カルシウム、マグネシウム等がある。
[0022] 精製粘土鉱物の場合は、通常の X線回折または元素分析による純度力 例えば、 8 5%以上であり、好ましくは 95%以上、特に好ましくは 98%以上である。この X線回 折による純度は、一般に行われるように、標準サンプルとの回折パターンを比較した 、回折線の強度比力 決定することができる。
[0023] 前述のような不純物を除去する方法としては、特に制限されないが、例えば、前記 有機物を除去する場合には、以下の方法等が適用できる。
[0024] 有機物の除去処理は、例えば、粘土鉱物に過酸ィ匕水素水を添加して分散させ、こ の分散液を加熱処理することによって行うことができる。過酸化水素水の濃度は、例 えば、 3〜15重量％であり、好ましくは 3〜10重量％であり、より好ましくは 5〜7重量 %である。過酸ィ匕水素水の添加割合は、粘土鉱物 lgに対して、例えば、 10〜30ml であり、好ましくは 15〜30mlであり、より好ましくは 15〜20mlである。また、加熱処 理の条件は、例えば、温度 25〜50°Cであり、好ましくは 25〜40°Cであり、より好まし くは 30〜40°Cである。加温時間は、特に制限されないが、例えば、加温による発泡（ 酸素）がなくなるまで行うことが好ましぐ発泡終了後、残留した過酸化水素を除去す るために、さらに加温処理を行うことがより好ましい。なお、これらの条件には限定され ない。
[0025] このような有機物処理によって、通常、純度が 85〜 100%の粘土鉱物を得ることが できる。また、使用する粘土鉱物における有機物の含有量は、例えば、 5%以下であ り、好ましくは 2%であることが好ましぐより好ましくは 1%以下である。 [0026] 前記有機処理後の粘土鉱物をタンパク質導入用担体とする場合は、例えば、ろ過 や遠心分離等によって前記分散液力 粘土鉱物を回収し、水、緩衝液、生理食塩水 等の溶媒で洗浄したものを使用すればよい。なお、このように有機物処理を行った粘 土鉱物の層間物質は、原料として用いた処理前の粘土鉱物と同様であり、例えば、 ナトリウムイオンの他にも、カリウムイオン、カルシウムイオン、マグネシウムイオン等の 各種交換性陽イオンがあげられる。
[0027] また、前記粘土鉱物は、例えば、粘土鉱物に付着または含まれる鉄を除去するた めに、前記有機物の除去処理に代えて、またはそれに加えて、以下に示す脱鉄処理 を施してもよい。この脱鉄処理は、例えば、以下に示す方法によって行うことができる
[0028] 前記過酸化水素水で処理した前記粘土鉱物の分散液を加熱し、例えば、ここにク ェン酸ナトリウム水溶液および炭酸水素ナトリウム水溶液を添加して十分に攪拌する 。この混合液に、さらにハイドロサルファイトナトリウム (ノヽイド口亜硫酸ナトリウム）水溶 液を加えて攪拌し、この混合液を静置する。この脱鉄処理後の粘土鉱物をタンパク 質導入用担体とする場合には、前記有機物処理の場合と同様に各種溶媒で洗浄し たものを使用すればよい。
[0029] 前記方法において、粘土鉱物 lgに対する各物質の添加割合は、例えば、クェン酸 ナトリウム 50〜70mmol、炭酸水素ナトリウム 15〜30mmol、ハイドロサルファイト 20 〜35mmolの範囲であり、好ましくはクェン酸ナトリウム 55〜65mmol、炭酸水素ナト リウム 22〜28mmol、ハイドロサルファイト 26〜29mmolの範囲である。
[0030] また、有機物処理後または脱鉄処理後の粘土鉱物は、さらに、イオン交換反応によ る各種交換性陽イオン型への誘導処理を施してもょ ヽ。処理前から層間にナトリウム 等の交換性陽イオンを含む場合においても、この誘導処理を施してもよい。具体例と して、以下に、交換性ナトリウム型への誘導処理の一例を示す。
[0031] 粘土鉱物を交換性ナトリウム型への誘導処理する場合には、例えば、前記有機物 除去処理または脱鉄処理を行った粘土鉱物を、塩化ナトリウム飽和水溶液等のナトリ ゥム塩飽和水溶液に添加'分散し、ろ過や遠心分離によって前記粘土鉱物を回収す ればよい。前記ナトリウム塩 (例えば、塩ィ匕ナトリウム）の添加と粘土鉱物の回収とは、 1回でもよいが、十分にナトリウム型への誘導を行うために 2回以上行うことが好ましく 、より好ましくは 3〜5回である。また粘土鉱物に対する塩ィ匕ナトリウム飽和水溶液の 添加割合は、粘土鉱物 lgに対して、例えば、 30〜80mLの範囲であり、好ましくは 4 0〜60mL、より好ましくは 50〜60mLの範囲である。塩化ナトリウム飽和水溶液に対 する粘土鉱物の懸濁は、特に制限されないが、例えば、 10秒以上であることが好まし ぐより好ましくは 30〜60分である。
[0032] 交換性ナトリウム型への誘導に使用する溶媒としては、前記塩化ナトリウム水溶液 には限定されず、この他にも、例えば、臭化ナトリウム、ヨウ化ナトリウム等のナトリウム 塩を含む水溶液が使用できる。また、これらの溶液におけるナトリウム塩濃度は、特に 制限されな 、が、前述のように飽和溶液であることが好ま 、。
[0033] また、より一層完全にナトリウム型への誘導を行う場合は、前記塩化ナトリウム飽和 溶液による誘導処理に代えて、若しくはこれに加えて、例えば、クェン酸ナトリウム、 炭酸水素ナトリウム、酢酸ナトリウム、塩ィ匕ナトリウム、臭化ナトリウム、ヨウ化ナトリウム 、アジィ匕ナトリウム等のナトリウム塩の水溶液や、前記ナトリウム塩を二種以上含む水 溶液等によって誘導処理を行えばよ 、。
[0034] 一方、交換性アンモ-ゥム型への誘導処理を行う場合には、例えば、アンモニア、 塩化アンモ-ゥム、臭化アンモ-ゥム、ヨウ化アンモ-ゥム、酢酸アンモ-ゥム等のァ ンモ-ゥム塩を含む溶液で、前述のナトリウム型への誘導方法と同様に処理を行え ばよい。また、第 4級アンモ-ゥム型の場合は、例えば、塩ィ匕テトラメチルアンモ-ゥ ム、塩化べンジルトリメチルアンモ -ゥム等の 4級アンモ-ゥム塩を含む溶液が使用で きる。また、例えば、前述のようなカチオン性界面活性剤を用いたピラー化や、前述 のようなアミンィ匕合物、アミドィ匕合物、カチオン性金属錯体等による置換によっても、 鉱物機能の修飾が可能である。
[0035] このように交換性陽イオン型への誘導処理を行った粘土鉱物は、例えば、透析を行 つた後にタンパク質導入用担体として使用すればよい。
[0036] また、以上に示した各種粘土鉱物は、例えば、溶液に分散させた状態でそのままタ ンパク質導入用担体として使用することもできるが、凍結乾燥等により乾燥させた乾 燥物をタンパク質導入用担体としてもよい。前記乾燥物であれば、後述する分散液 の形態であるタンパク質導入剤を調製する際に、所望の濃度に調製し易いからであ る。なお、本発明のタンパク質導入担体によれば、タンパク質に限られず、ペプチドを 導人することちでさる。
[0037] (実施形態 2)
タンパク皙導入剤
本発明のタンパク質導入剤 (タンパク質複合体ともいう）は、前述のように、粘土鉱 物を含む本発明のタンパク質導入用担体と、これに担持されたタンパク質とを含む。 なお、本発明における「タンパク質」とは、アミノ酸のみ力も構成される一般に言うタン パク質のみならず、前述のペプチドや、糖タンパク質、ムチン等、また、これらの薬学 的に許容された塩等も含まれる (本発明においては、「タンパク質」と言う)。前記薬学 的に許容される塩としては、例えば、塩酸塩、硫酸塩、リン酸塩等の無機酸付加塩、 酢酸塩、プロピオン酸塩、クェン酸塩、酒石酸塩、リンゴ酸塩等の有機酸塩、この他 にも、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩等の塩もあげられる。
[0038] 前記タンパク質導入剤において、前記タンパク質 (A)と粘土鉱物 (B)との混合割合
(重量比 A: B)は、例えば、 1 : 0. 1〜5の範囲であり、好ましくは 1 : 0. 5〜4の範囲、 より好ましくは 1 : 0. 5〜3の範囲、特に好ましくは 1 : 1〜2の範囲である。
[0039] 前記タンパク質導入用担体に担持させるタンパク質は、特に制限されず、種々のタ ンパク質が使用でき、単独、もしくは複数のタンパク質の混合物でもよい。タンパク質 の特性も何ら制限されず、例えば、分子量の小さいペプチドであっても、分子量の大 きいタンパク質であっても十分に細胞に導入することができる。分子量の具体例とし ては、何ら制限されないが、例えば、 300Da〜500kDa程度であり（それより大きいタ ンパク質および小さいペプチドももちろんのこと）、好ましくは、 lkDa〜500kDaの範 囲、より好ましくは 5kDa〜500kDaである。十分に細胞に導入することができる。また 、組合せる粘土鉱物の種類も何ら制限されないが、例えば、タンパク質の種類に応じ て選択してもよい。
[0040] タンパク質の種類は、例えば、細胞に付与した 、機能等に応じて適宜決定でき、例 えば、医薬の分野においては、疾患の治療剤、予防剤、抑制剤となるタンパク質があ げられる。具体例の 1つとして、減感作治療に使用するタンパク質があげられる。例え ば、花粉症の治療を目的とする場合には、すぎ等の花粉のアレルゲン等を担持させ 、食物アレルギーの治療を目的とする場合には、卵白アルブミン (オボアルブミン)等 の対象タンパク質 (アレルギーの原因タンパク質やその断片）等を担持させ、細胞に 導入することが例示できる。また、酵素欠乏による疾患の治療を目的とする場合には 、欠損している酵素を担持させればよぐ例えば、乳糖不耐症の治療には、 β -ガラク トシダーゼ等を担持させて、細胞に導入することが例示できる。また、糖尿病に対して は、インスリンを担持させて、細胞に導入することが例示できる。
[0041] このタンパク質導入剤の形態としては、前記タンパク質導入用担体とこれに担持さ れたタンパク質とを含んでいれば特に制限されず、例えば、これが分散された分散液 であってもよいし、凍結乾燥品であってもよい。また、前記分散液を凍結させた形態 でもよぐその場合は使用時に解凍すればよい。また、必要に応じて、例えば、賦形 剤、結合剤、崩壊剤、安定剤、保存剤、緩衝剤等の医薬品添加物、または、甘味料、 香料、保存料、安定剤等の食品添加物等を加えることも可能である。
[0042] 次に、本発明のタンパク質導入剤の調製方法の一例を示す。まず、目的のタンパク 質を含むタンパク質分散液と、前記粘土鉱物 (タンパク質導入用担体)を含む粘土鉱 物分散液とを調製する。
[0043] 前記タンパク質分散液におけるタンパク質の濃度は、特に制限されないが、例えば 、 0. 1〜： LOOO μ g/mLの範囲であり、好ましく ίま 25〜400 μ g/mL、特に好ましく は 50〜200 /ζ 8ΖπΛである。この分散液の分散媒は、特に制限されず、例えば、蒸 留水、生理食塩水、 PBS (phosphatebuffered saline)等があげられる。また、後述する ように培養細胞へのタンパク質導入に使用する場合には、これらの他に、液体培地 等を用いてもよい。なお、前記分散媒は、コンタミネーシヨンを防止するために滅菌処 理されていることが好ましい。前記タンパク質分散液の pHは、特に制限されず、例え ば、中性付近があげられ、 5. 5〜7. 5の範囲が好ましい。
[0044] 前記粘土鉱物分散液における粘土鉱物の濃度は、特に制限されな!ヽが、例えば、 0. 1〜： L000 μ g/mLの範囲であり、好ましく ίま 25〜400 μ g m 特に好ましく【ま 50〜200 /ζ 8Ζπ^である。この分散液の分散媒としては、前述と同様のものが使用 できる。前記粘土鉱物分散液の pHも、前記タンパク質分散液と同様であり、特に制 限されない。
[0045] そして、前記タンパク質分散液と粘土鉱物分散液とを混合することによって、タンパ ク質導入剤を調製できる。このように液中でタンパク質と粘土鉱物とを混合することに よって、前記粘土鉱物にタンパク質が担持された複合体を形成できる。なお、前記タ ンパク質分散液と粘土鉱物分散液とを混合した前記タンパク質導入剤において、タ ンパク質 (A)と粘土鉱物 (B)との割合 (重量比 A : B)は、例えば、前述と同様である。
[0046] 前記タンパク質分散液と粘土鉱物分散液とを混合した混合液 (タンパク質導入剤） は、通常、細胞や生体を対象とするため、その pHは特に制限されないが、例えば、 p Hは中性付近 (例えば、 pH約 6. 5〜7. 5)に設定すればよい。また、前述のように、 粘土鉱物の層間に交換性陽イオンを含む場合も、同様に制限されず、例えば、中性 付近の pHに調整すればよい。なお、このようなタンパク質導入剤によれば、例えば、 タンパク質を保持させた状態で、酸性条件下におかれた後であっても、 pHの影響を 受けることなくタンパク質の導入を行うことができる。このため、例えば、強酸性条件で ある胃を通過してもタンパク質の導入自体は影響を受けることがなぐ後述のような経 口投与に適しているといえる。
[0047] 前記タンパク質分散液と粘土鉱物分散液とを混合した後、直ぐにタンパク質導入剤 として使用することもできるが、粘土鉱物にタンパク質を十分に担持させるため、混合 後、インキュベートすることが好ましい。インキュベートの温度条件は、特に制限され ず、通常、室温で処理でき、また、その時間も特に制限されない。
[0048] このような分散液形態のタンパク質導入剤は、そのまま使用してもよいし、前述のよ うに使用時まで凍結させてもよい。また、乾燥状態にする場合には、例えば、凍結乾 燥、スプレードライ等の方法が適用でき、使用時に前述のような分散媒に分散させれ ばよい。
[0049] 本発明における前記粘土鉱物は、例えば、自然療法として内服することが知られて おり、また、内服製剤に含有されている場合がある。このように生体に対する安全性 は十分に確認されていることから、本発明のタンパク質導入剤は、例えば、医薬品、 機能性食品、食品添加物として極めて有用である。
[0050] つぎに、前記タンパク質導入剤を細胞に接触させてタンパク質を導入する、本発明 のタンパク質導入方法について、 in vitroおよび in vivoにおける具体例を、以下の実 施形態 3および 4にそれぞれ示す。この方法によれば、外来のタンパク質を導入した 細胞を製造することができる。なお、本発明は、これらの形態には制限されない。
[0051] (実施形態 3)
in vitroでのタンパク質導入方法
本実施形態において、 in vitroで、培養細胞に前記タンパク質導入剤を接触させ、 前記細胞に目的タンパク質を導入する導入方法の一例を説明する。この方法では、 例えば、 目的タンパク質を導入する培養細胞に、前記タンパク質導入剤を添加してィ ンキュペートすればよい。
[0052] 培養細胞は、予め、その種類に応じた液体培地で一定時間プレインキュペートした 後に、前記タンパク質導入剤を添加して、さらにインキュベートすることが好ましい。こ のように、前記導入剤の添加前に予めプレインキュペートすることによって、例えば、 培養細胞への前記導入剤によるタンパク質導入をスムーズに行うことができ、また、 添加後に一定時間インキュベートを行うことによって、より効率良くタンパク質を導入 できる。
[0053] 前記液体培地の種類は、前述のように細胞に応じて適宜決定でき、特に制限され ないが、例えば、細胞の成育環境を安定ィ匕できることから、血清を含むことが好まし い。
[0054] 培養細胞に対する前記タンパク質導入剤の添加割合は特に制限されな!ヽが、例え ば、細胞 I X 106個に対する粘土鉱物の添加割合が 0. 01〜： LOO /z gの範囲となるよ うに、前記タンパク質導入剤を添加することが好ましぐより好ましくは粘土鉱物の添 加割合が 0. 1〜50 g、特に好ましくは 0. 2〜25 /z gである。また、細胞 1 X 106に 対するタンパク質の割合が 0. 01〜： LOO /z gの範囲となるように、前記タンパク質導入 剤を添加することが好ましぐより好ましくはタンパク質の添加割合 0. 1〜50 8、特 に好ましく ίま 0. 2〜25 /z gである。
[0055] 目的タンパク質を導入する培養細胞としては、制限されないが、例えば、小腸、鼻 粘膜、皮膚組織、皮下組織、骨組織、軟骨組織および歯周等の種々の細胞に本発 明の方法を適用できる。また、ヒト細胞ゃヒト以外の動物細胞（哺乳類細胞）、これらの 他にも、例えば、微生物、魚類、爬虫類、両生類、鳥類、昆虫等、全ての生物種の細 胞にも適用できる。前記細胞培養に関しても、前述のように特に制限されず、細胞の 種類に応じた公知の液体培地を用いて、公知の培養条件に従って行うことができる。
[0056] 以下に培養条件の具体例を示すが、前述のように培養細胞の種類に応じて適宜決 定できるため、これらには限定されない。例えば、培養細胞に前記タンパク質導入剤 を添加する前、予め、細胞を培養 (プレインキュペート）してもよぐその培養時間は、 例えば、 18〜30時間であることが好ましぐより好ましくは 18〜24時間、特に好ましく は 22〜24時間である。一方、前記タンパク質導入剤添加後のインキュベート時間は 、例えば、前記タンパク質が細胞内に導入されればよぐ特に制限されないが、例え ば、 3時間程度であり、上限も特に制限されず、 48時間程度である。培養温度は、通 常、 37°Cであり、 5%二酸化炭素の存在下で培養することが好ましい。
[0057] 以上の方法によって得られたタンパク質を導入した細胞は、以下のような治療への 使用が可能である。例えば、遺伝子欠損によりある疾患が発症している場合、欠損遺 伝子がコードするタンパク質を本発明の導入方法によって培養細胞に導入する。そ して、得られたタンパク質導入細胞をその疾患の患部に投与する。そうすれば、投与 した細胞における導入タンパク質によって、疾患の症状の緩和や治癒を図ることがで きる。なお、前記投与方法としては、例えば、患部への注射、担体に前記タンパク質 導入細胞を担持させて患部や皮下もしくは腹腔に埋め込む外科的処置等がある。
[0058] (実施形態 4)
つぎに、 in vivoでのタンパク質導入、すなわち、細胞が生体細胞であって、生体に 前記タンパク質導入剤を投与して、前記導入剤により器官または組織の細胞にタン パク質を導入する一例を説明する。この方法では、前記タンパク質導入剤を、例えば 、経口投与によって、または目的の器官や組織に外科的処置や注射等により投与す るだけで、生体内の目的細胞に目的タンパク質を導入することができる。
[0059] 生体の中でも、例えば、小腸細胞にタンパク質を導入する場合には、前記タンパク 質導入剤を経口投与することが好ましい。経口投与は簡便であり、また投与量も治療 の結果に応じて調整し易いことからも好ましい。し力も、本発明のタンパク質導入剤を 使用した場合、 目的タンパク質を選択的に確実に小腸細胞へ導入できる。このように 小腸に選択的にタンパク質を導入できるのは、以下の理由によると考えられる。
[0060] 前述のように、前記粘土鉱物とタンパク質を混合させること等によって、前記タンパ ク質は前記粘土鉱物に担持される。このようにタンパク質を担持した導入用担体は、 通常、 pHが酸性条件であると、電荷が大きくなることにより、前記タンパク質をしつか りと担持し、一方、中性またはアルカリ性条件下では、電荷が小さくなることにより、タ ンパク質を遊離し放出する。前記粘土鉱物はこのようなメカニズムを持っため、前記 タンパク質導入剤を経口投与すると、タンパク質を放出することなく酸性条件の胃を 通過し、小腸へと達するのである。また、粘土鉱物であるため胃で消化されることもな い。そして、小月昜は中'性付近の pHであって、胃に比べて電荷が小さくなるため、前記 タンパク質導入剤の粘土鉱物からタンパク質が放出されるのである。このように、本発 明のタンパク質導入用担体 (タンパク質導入剤)を経口投与すれば、タンパク質が胃 で消化されることがなぐまた、静脈注射のように様々な細胞に入り込んで小腸への 選択的投与が困難となる問題もない。つまり、本発明によれば、簡便な経口投与によ つて、小腸への選択的投与を容易に行うことが可能となる。
[0061] このような小腸への選択的なタンパク質導入剤の接触により、腸管免疫を利用した アレルギー治療 (減感作治療)を、簡便な経口投与で実現することもできる。例えば、 各種アレルギーの原因となるタンパク質をタンパク質導入用担体に担持させて、タン パク質導入剤を調製し、これを定期的にアレルギー患者に経口投与する。すると、前 記タンパク質導入剤は小腸に運ばれ、小腸細胞内で選択的に目的タンパク質を放 出するため、腸管免疫において免疫寛容の現象がおき、アレルギー症状が減退され るのである。このような方法は、従来の減感作治療に比べて、例えば、注射による頻 回投与の必要性がなぐ患者への負担が少ない優れた療法といえる。また、腸内細 胞は、通常、二週間程度で剥がれ落ちるため、タンパク質導入された細胞が長期間 にわたつて体内に残ることもない。したがって、本発明を適用すれば、より一層安全 性に優れた予防方法，治療方法を提供できるといえる。
[0062] in vivoでの前記タンパク質導入方法は、例えば、ヒトの生体にも適用でき、また、ヒ ト以外の哺乳類の生体にも適用できる。また、前記タンパク質導入剤の投与量は、そ の目的や生体の種類等に応じて適宜決定できるが、例えば、細胞と粘土鉱物または タンパク質との割合は、前述の invitroでの導入と同じ割合でもよい。
[0063] 以上のように in vivoでのタンパク質導入方法によれば、安全性に優れたタンパク質 の導入が可能になり、さらに経口投与を行えば、外科的処置や注射を行うことなしに
、例えば、選択的に小腸へのタンパク質導入が可能になるため、臨床治療に有用な 方法といえる。
[0064] (実施形態 5)
医. および 唐、のチ β方 ならびに'冶
本発明の医薬組成物は、疾患の治療剤、予防剤または抑制剤としてタンパク質を 含む医薬組成物であって、さらに、本発明のタンパク質導入用担体を含むことを特徴 とする (すなわち、本発明のタンパク質導入剤を含む医薬組成物である)。疾患の治 療剤、予防剤、抑制剤となる有効成分がタンパク質である場合、前記タンパク質導入 用担体を含む本発明の医薬組成物を投与することによって、優れた安全性で簡便に 、ヒトゃヒトを除く哺乳動物等の予防'治療を行うことができる。タンパク質の種類は何 ら制限されず、疾患に応じて選択でき、例えば、減感作治療の場合は、花粉やアル ブミン等のタンパク質等、糖尿病の場合には、インスリン等が選択できる。また、医薬 組成物の投与の方法も、特に制限されず、経口投与、注射等の非経口投与を疾患 に応じて選択できる。また、本発明の医薬組成物は、前述のようなタンパク質導入細 胞でもよぐ外科的処置で生体内に埋め込むことにより投与してもよい。
実施例 1
[0065] 粘土鉱物を用いて、 in vitroでの小腸上皮細胞への β -ガラタトシダーゼの導入を行 つた ο
[0066] 1.タンパク質導入用担体とタンパク質の複合化
タンパク質導入用担体として、モンモリロナイトを含む商品名クニピアおよび商品名 ベントナイト、サボナイトを含む商品名スメクトン SA (全てクニミネ工業株式会社製)の 3種類の粘土鉱物を使用し、これらを PBS (—） (Ca2+,Mg2+- freeリン酸緩衝生理食 塩水: pH7. 2)で lmgZmlとなるように分散して、担体分散液をそれぞれ調製した。 一方、大腸菌由来 β -ガラタトシダーゼ（CALBIOCHEM社製）を mili— Q水で lmgZ mlに懸濁し、タンパク質分散液を調製した。そして、 DMEM (Dullbecco'sModified E agle's Medium： serum - free) 100 μ 1に、前記担体分散液 5 μ 1およびタンパク質分 散液 1 μ 1を添加して混合した。前記混合液を 25°Cで 1時間インキュベートして、タン パク質導入剤とした。
[0067] 2. in vitroでのタンパク質導入
細胞として、 ATCCより分譲されたラット小腸上皮細胞 IEC— 6 (ATCC— CRL159 2)を使用した。まず、 12 well plate (ファルコン社製）に下記液体培地 2. 5mlをカロえ、 各ゥエルに小腸上皮細胞を 1 X 105個播種して 37°Cで 24時間培養した。なお、培養 時には、炭酸ガス濃度を炭酸ガスインキュベーターで 5%となるように調整した。
[0068] (液体培地組成）
DMEM (Dulbecco's modified Eagle medium:日水製薬社製）
10重量％ FBS (fetal bovine serum :大日本製薬社製）
[0069] 前記 24時間の培養後、培養細胞を前記 PBS (—）で 2回洗浄し、前記 DEME(seru m- free)lmlを各ゥエルに添カ卩した。さらに、 j8 -ガラクトシダーゼが: L g(905mU)Z wellとなるように、前記タンパク質導入剤 100 1を各ゥエルに添加した。そして、 37 °Cで 3時間インキュベートした後、血清 (FBS) 111 μ 1を添カ卩して培地中の FBS濃度 を 10重量％とし、 37°Cで 24時間インキュベートした。
[0070] また、コントロールとして、前記タンパク質導入剤を添加して!/、な 、細胞を、比較例 1として、 |8 _ガラクトシダーゼを単独で導入した細胞を、それぞれ同様に培養した。 なお、比較例 1においては、前記タンパク質導入剤に代えて、前記タンパク質分散液 ( lmg/ml)を DMEM100 μ 1で希釈したものを添カ卩した。
[0071] 前記インキュベート後、全細胞の回収を行った。まず、培養細胞を前記 PBS (—）で 2回洗浄してから、前記 PBS (―) 100 μ 1を添カ卩し、 Cell Scraperにより細胞を回収し た。そして、前記細胞を— 80°Cで凍結させた後、 37°Cで融解し、遠心分離（14, 50 Orpm、 5分間）に供することによって細胞抽出液を回収した。
[0072] 3.タンパク質導入の確認
96 well plateに、下記組成の Z buffer 90 μ 1、回収した細胞抽出液 10 μ 1および 4 mg/ml ONPG (0-二トロフエ-ル /3 -D-ガラタトピラノシド）溶液 20 μ 1を添カ卩して 3 7°Cで 1時間インキュベートした後、 100 iu lの反応停止液（lMNa CO )を添カ卩して、 この反応液の波長 415nmにおける吸光度を測定した。そして、得られた吸光度と予 め準備した検量線とから、各細胞における β -ガラタトシダーゼ活性 (mU)を算出した 。これらの結果を図 1に示す。なお、同図の「j8 - galonly」とは、比較例 1において - ガラクトシダーゼのみを導入したことを示す（図 2において同様)。
[0073] (Z buffer)
Na HPO
2 4
NaH PO
2 4
KC1
MgSO
4
2-メルカプトエタノ
mili-Q
[0074] 図示のように、比較例 1に比べて実施例 1—1 (クニピア）、 1— 2 (スメクトン SA)、 1 — 3 (ベントナイト）は、極めて高い活性を示した。つまり、これらのタンパク質導入担 体を用いることによって、極めて効率良く j8 -ガラクトシダーゼを細胞内に導入できた といえる。
実施例 2
[0075] 粘土鉱物を用いて、 in vivoでの小腸上皮細胞への β -ガラタトシダーゼの導入を行 つた。なお、タンパク質導入用担体としては、実施例 1と同じ商品名スメクトン SAおよ び商品名ベントナイトを使用した。
[0076] 1.タンパク質導入用担体とタンパク質の複合化
実施例 1と同様にして調製した担体分散液（lmgZml) 50 μ 1および前記タンパク 質分散液（1πι8Ζπι1) 50 /ζ 1を、それぞれ mili— Q水 100 1で希釈した。そして、両 希釈液を混合して、 25°Cで 1時間インキュベートし、タンパク質導入剤を調製した。
[0077] 2. In vivoでのタンパク皙導人
6週齢の ddYマウス（ォス：日本 SLC)に 13 -ガラタトシダーゼ 50 μ g(45.25U)/マ ウスとなるように、経口ゾンデを用いて前記タンパク質導入剤を強制的に経口投与し た。なお、前記マウスは、タンパク質導入剤の投与前日から絶食させた。コントロール は、前記タンパク質導入剤に代えて mili— Q水 300 1を投与し、比較例 2は、前記タ ンパク質導入剤に代えて、タンパク質分散液（lmgZml) 50 1を mili— Q水 250 1 で希釈した希釈液を経口投与した。
[0078] 3.タンパク質導入の確認
経口投与の 3時間後、エーテル麻酔してマウスの頸椎を脱臼させた。そして、マウス 小腸を取り出し、胃側より 4cmずつ切り出して、合計 3個の切片をそれぞれ 5mM E GTA含有 PBS (―) 200 μ 1に浸漬した。前記小腸をホモジナイズ (フィスコトロンホモ ジナイザ: ΝΙΉ- ON社製）し、遠心分離（14,500rpm、 5分、 4°C)により回収した上澄 みを細胞抽出液とした。これらの細胞抽出液について、前記実施例 1と同様にして j8 -ガラタトシダーゼ活性を測定した。大腸に近 、部分の切片からの細胞抽出液にっ 、 て、その結果を図 2に示す。
[0079] 図 2において、コントロールについて活性が見られる力 これは細胞が本来有する β -ガラタトシダーゼ活性である。したがって、実施例 2および比較例 2は、それぞれコ ントロールとの差が導入されたタンパク質による活性値と判断できる。すると、図 2に 示すように、比較例 2比べて、実施例 2— 1 (クニピア）、 2— 2 (ベントナイト）は、極め て高い活性を示した。つまり、これらのタンパク質導入担体を用いることによって、 invi voにおいても、極めて効率良く j8 -ガラクトシダーゼを小腸細胞に導入できたといえる 。また、このように in vivoにおいて j8 -ガラクトシダーゼが導入され、且つ、生体内で活 性を示していることから、このような j8 -ガラクトシダーゼを担持する導入剤は、例えば 、乳糖不耐症用の医薬品もしくは機能性食品として使用できるといえる。
実施例 3
[0080] 粘土鉱物へのオボアルブミン（OVA)の吸着を確認した。まず、 OVAとベントナイト (商品名 Bengel Fw;ホージユン社製)を、実施例 1の前記 PBS ( - )にそれぞれ懸濁 し、 OVA分散液（lmgZml)および担体分散液（lmgZml)を調製した。これらの分 散液を下記割合で混合して室温で 1時間インキュベートした後、遠心分離 (4°C、 13, 000rpm、 30分）を行った。そして、上清画分の吸光度（260nm、 280nm)を測定し 、タンパク濃度を定量した (n= 3)。この結果を図 3に示す。図 3 (A)は、前記上清に おけるタンパク質濃度を示すグラフであり、同図（B)は、 OVA単独を 100%とし、 OV A単独からのタンパク質減少量の割合、すなわち、ベントナイトへの吸着率（％)を示 すグラフである。
[0081] [表 1]
Figure imgf000021_0001
[0082] 図示のように、ベントナイトと OVAを混合することによって、ベントナイトへの OVAの 吸着が確認された。また、ベントナイト量を増加させることによって OVAの吸着率が 向上した。
実施例 4
[0083] 卵アレルギーの主要アレルゲンであるオボアルブミン (OVA)を含むタンパク質と粘 土鉱物とを用いてタンパク質導入剤を調製し、 in vivoでのマウス血液への OVAの導 入を確認した。
[0084] 1. タンパク皙導入剤の調製
前記実施例 3と同様にして、 OVAとベントナイト (商品名 Bengel Fw)を、実施例 1の 前記 PBS ( )にそれぞれ懸濁し、 OVA分散液（ lOOmgZml)および担体分散液（ lOOmgZml)を調製した。エツベンドフルチューブ内で、これらの分散液を下記割合 で混合して室温で 1時間インキュベートし、タンパク質導入剤とした。
[0085] [表 2]
タンパク質導入剤 PBS (-） 100mg/mへ'ントナイト l OOmg/ml OVA
( 1 ) 1 ) ( 1 )
コントロール 300 0 0 比較例 4 250 0 50
OVA単独
¾施例 4 150 100 50 へ'ントナイト- OVA複合体 [0086] 2. In vivoでのタンパク質導入
6週齢の ddYマウス (メス：日本 SLC)に、経口ゾンデを用いて前記タンパク質導入 剤 300 μ 1を経口投与した (経口投与 0日、 η= 3)。経口投与は、さらに、 1回目の投 与力ら 7日後、 14日後にも行った。なお、前記マウスは、タンパク質導入剤の投与前 日から絶食させた。コントロールは、前記タンパク質導入剤に代えて実施例 1の PBS ( — ) 300 /z lを投与し、比較例 4は、前記タンパク質導入剤に代えて、前記表 2に示す OVA単独の溶液 300 μ 1をそれぞれ経口投与した。
[0087] 3.タンパク質導入の確認
(血清サンプルの調製）
1回目の経口投与から 14日後および 21日後に、マウスの眼底より、パスツールピぺ ットを用いて採血を行った。採取後すぐに、血液を遠心分離 (4°C、 6, 000rpm、 5分 )し、血清を回収した。血清サンプルは、後述のアツセィまで— 20°Cで保存した。
[0088] (ELISA法）
OVAをコーティングしたゥエルプレートに、血清サンプルに含まれる OVA特異的 Ig G抗体を作用させ、 HRP標識抗体を 2次抗体として用いることにより、前記サンプル に含まれる OVA特異的 IgG抗体を検出した。
[0089] アツセィ前日に、ゥエルプレートに、下記 Coating Bufferを 100 μ lZwellとなるように 添加し、封をしてから 4°Cで 1晚インキュベートした。翌日、下記 Washbufferで前記ゥ エルプレートを 3回洗浄し、下記 blocking bufferを 300 μ lZwellとなるように添カ卩した 。 1時間インキュベートした後、前記ゥエルプレートを前記 washbufferで 3回洗浄した。 血清サンプルを下記 Sample diluentで 500倍〖こ希釈し、この希釈サンプルを前記ゥ エルプレートに 100 1/wellとなるように加え、 2時間インキュベートした。インキュべ ート後、前記ゥエルプレートを前記 washbufferで 5回洗浄した。さらに、下記 HRP detec tion ant¾odyと前記 sample diluentを 1： 100, 000の割合で混合し、これを 100 μ m Zwellとなるように前記ゥエルプレートに添カ卩して、 1時間インキュベートした。前記ゥ エルプレートを前記 washbufferで 5回洗い、下記 TMB Solutionを 100 lZwellとなる ように添加し、 30分インキュベートした後、 2M硫酸を 100 lZwellとなるように加え て、吸光度を測定した (450nm, ref595nm)0この結果を、図 4に示す。 [0090] (試薬の調製方法）
Coating buffer: OVAが 10 μ g/mlの濃度となるように、 lOOmM炭酸緩衝液（pH9 . 6)に溶解。
Wash buffer: 50mM Tris、 O. 14M NaClおよび O. 05% Tween20 (商品名）を混合 (pH8. 0)。
Blocking buffer : Blocking one (商品名）と 50mM Tris— HC1とが体積比 1： 3となるよ うに混合。
Sample diluent： Blocking one (商品名）と前記 Wash solutionとが体積比 1： 19となるよ うに混合。
TMB solution : TMB solution (商品名）と Peroxidase solution (商品名）とが体積比 1： 1 となるように、使用直前に混合。
[0091] 図 4に示すように、 OVAを単独で投与したモデル (比較例 4)では、 PBSのみを投 与したモデル (コントロール）とほぼ同程度の結果であった。これは、胃内の酸性条件 やタンパク分解酵素により、抗原タンパクである OVAが変性もしくは消化されたため と推測される。これに対して、タンパク質導入剤 (ベントナイト— OVA複合体)を投与 したモデル（実施例 4)においては、前記コントロールおよび比較例 4の結果と比較し て、血清中において有意な OVA特異的 IgG量の増加が確認された。この結果から、 実施例 4のタンパク質導入剤により、腸管内に OVAが導入されたことがわかる。つま り、実施例 4のタンパク質導入剤において、 OVAはベントナイトとの複合体を形成し ているため、 OVAは、前述のような胃内の障害カゝら保護された状態で腸管に導入さ れ、その結果、腸管からの免疫応答を引き起こし、血清における OVA特異的 IgGの 増加が確認されたと考えられる。以上の結果から、本発明のタンパク質導入担体は、 例えば、食物アレルギー等に対する経口減感作治療において、タンパク質デリバリー 用担体として有用であることがわかる。
[0092] 実施例 5〜実施例 7において、タンパク質導入用担体を用いて、 5kDa〜500kDa ( 例えば、 6〜465kDa)のペプチドおよびタンパク質の導入を確認した。
実施例 5
[0093] 各種タンパク質導入用担体を用いて、 in vitroでの小腸上皮細胞 IEC— 6 (ECAC C 88071401)株への分子量約 13kDのタンパク質の導入を行った。
[0094] 1.タンパク質導入用担体とタンパク質の複合化
タンパク質導入用担体として、モンモリロナイトを含む商品名クニピア F (クニミネェ 業株式会社製)、商品名ベンゲル FW (株式会社ホージユン製)および商品名ベンゲ ルブライト 25 (株式会社ホージユン製）、サボナイトを含む商品名スメクトン SA (クニミ ネ工業株式会社製)の 4種類の粘土鉱物を使用し，これらを PBS (—）溶液 (Ca2+,Mg 2+- freeリン酸緩衝生理食塩水: PH7. 2)で 2mgZmlとなるように分散して、担体分 散液をそれぞれ調製した。一方、担体と複合化させる分子量約 13kDのタンパク質の 一例として、（株)ペプチド研究所より購入したミツドカイン (以下、「MK」ともいう）を用 いた。この MKタンパク質を mili—Q水で lmgZmlとなるように分散し、タンパク質分 散液を調製した。
[0095] なお、 MKは、例えば、大腸菌を宿主とした組換え体を作製し、発現した MKを精 製した標品を実験に用いることも可能である。具体的には、基本的に、武らの方法 (J. Biochem.ll6,ppl063- 1068(1994))に従う力 ウィルムス腫瘍由来の培養株細胞 G— 401を用いて、 PCR法によりヒト MKcDNAを常法によって調製し、このヒト MKcDN Aを大腸菌へ形質導入し、組換え体を作製する。そして、培養により増殖した組み換 え大腸菌の封入体より、前記武らの方法に従って、ヒト MKタンパク質を精製すること で標品を準備することができる。また、（株)ペプチド研究所 (大阪)、 R&D Systems ( MN, USA)等より市販品を購入することによって準備することも可能である。
[0096」 そして、 DMEM (Dullbecco's Modified Eagle's Medium： serum― free) 270 μ 1に、 前記担体分散液 15 μ 1およびタンパク質分散液 15 1を添加して混合した。前記混 合液を室温で 1時間静置した後、さらに前記 DMEMlmlを添加混合し、タンパク質 導入剤とした。
[0097] 2. in vitroでのタンパク質導入
細胞として、 ATCCより分譲されたラット小腸上皮細胞 IEC— 6 (ECACC— 88071 401)を使用した。まず、 12 well plate (コ一-ング社製）に下記液体培地 1. 5mlをカロ え、各ゥエルにラット小腸上皮細胞 IEC— 6を 5 X 104個播種して 37°Cで 4日間培養し た。なお，すべての細胞は、 5%炭酸ガス濃度の条件下で培養した。 [0098] (液体培地の組成）
DMEM (インビトロジェン社製）
5% FBS (fetal bovine serum:ハイクローン社製）
0. 1 units/ml インスリン (インビトロジェン社製）
100 units/ml ペニシリン Gナトリウム（インビトロジェン社製）
100 μ g/ml ストレプトマイシン (インビトロジェン社製）
0. 05 μ g/ml アンホテリシン B (大日本住友製薬社製）
[0099] 前記 4日間の培養後、培養細胞を前記 PBS (—)溶液で 2回洗浄し、前記タンパク質 導入剤 1. 3mlを各ゥエルに添加した。その後、各ゥエルを 37°Cで 2時間インキュベー トして、これらのタンパク質 (MK)を培養細胞に導入した。
[0100] また、コントロールとして、前記タンパク質導入剤を添加して!/、な 、細胞を、比較例 5として、 MKを単独で導入した細胞を、それぞれ同様に培養した。なお、比較例 5に おいては、前記タンパク質導入剤に代えて、前記担体分散液 15 /z lを前記 DMEM1 270 μ 1と mili— Q水 15 μ 1で希釈したものを添カ卩した。
[0101] 前記前記インキュベート後、全細胞の回収を行った。まず、培養細胞を前記 PBS( ―)溶液で 2回洗浄した。洗浄後、下記サンプル処理液 100 1を添カ卩し、 CellScraper により細胞を回収し、 80°Cで凍結させた。
[0102] (サンプル処理液組成）
9容量 (体積比） トリス SDSサンプル処理液 (第一化学薬品社製） 1容量 (体積比） 2-メルカプトエタノール (ナカライテスタ社製）
10容量 (体積比） mili— Q水
[0103] 3.タンパク質導入の確認
ラット小腸上皮細胞内へのタンパク質導入の確認は、前記「2.」において回収、凍 結した各サンプルをウェスタンブロット解析により行った。
[0104] まず、各サンプルについて、ドデシル硫酸ナトリウム ポリアクリルアミドゲル電気泳 動（SDS— PAGE)を Laemmliらの方法に従って行った。泳動用ゲルとして商品名 P AGミニ「第一」 15Z25 (第一化学薬品 (株)）を用い、泳動条件は、 20mA定電流に て、約 90分間とした。各ゥエルには、マーカータンパク質溶液、ミツドカイン +スメタト ン SA、ミツドカイン +クニピア F、ミツドカイン +ベンゲル FW、ミツドカイン +ベンゲノレ ブライト 25、比較例 5 (ミツドカインのみ）、コントロールの計 7種類のサンプルをァプラ ィした。 1レーンあたりのサンプル量は、 2 X 105cellsのタンパク量とした。陽性対照とし ては、化学合成ミツドカイン (ヒト）（(株)ペプチド研究所)を 1レーンあたり 200〜500n gとなるに調製して泳動した（図 5において図示せず)。分子量マーカーは、商品名 Ka leidoscopePrestained Standards(BIO— RAD) 使用した。
[0105] SDS— PAGE終了後、常法に従い、ウェスタンブロット解析を行った。ブロッテイン グ用メンブレンには、商品名 Immobilon (MILLIPORE;MA,U.S.A.)を使用し、 150mA で 2時間転写した。転写終了後、非特異的反応を抑えるため、前記メンブレンをプロ ッキング溶液（4%スキムミルクおよび 0. 05%Tween20を含む PBS溶液）に、ゆつく りとシェイクしながら一晚浸漬した。一晩ブロッキング操作を行った前記メンブレンを 抗ヒト MK抗体 (R&DSystems (MN.USA) )と室温で 2時間反応させた。反応終了後、 前記メンブレンを 0. 05% Tween20を含む PBS溶液で 4回（各 10分間）洗浄した。 続いて、前記メンブレンをロバ抗ャギ IgGペルォキシダーゼ標識抗体（SantaCruz Bio technology,In ； CA,U.S.A.)と室温で 1時間反応させた。反応終了後、前記メンブレ ンを、 0. 05% Tween20を含む PBS溶液で 4回（各 10分間）洗浄し、その後、 PBS 溶液にて 1回（10分間）洗浄した。
[0106] 十分に洗浄したメンブレンを、発色キット（商品名ィムノスティン HRP-1000 ;コ -カミ ノルタエムジー (株)）を用いて反応させた。発色反応を開始後、数分で MKの分子量 の位置にバンドが確認された。その結果の代表的な確認例を図 5の写真に示す。同 図において、レーン 1および 8は、マーカータンパク質溶液、レーン 2〜5はタンパク質 導入剤を使用した結果であり、レーン 2はミツドカイン +スメクトン SA、レーン 3はミツド 力イン +クニピア F、レーン 4はミツドカイン +ベンゲノレ FW、レーン 5はミツドカイン + ベンゲルブライト 25の結果、レーン 6は、比較例 5 (ミツドカインのみ）、レーン 7はコン トロール（一）の結果である。同図に示すように、前記 4種類のいずれのタンパク質導 入担体を使用した場合でも、単独で導入したもの (比較例 5)よりも濃いバンドが確認 された。
実施例 6 [0107] 各種タンパク質導入用担体を用いて、 in vitroでの小腸上皮細胞 IEC— 6 (ECAC C 88071401)株への分子量約 18kDのタンパク質の導入を行った。
[0108] 1.タンパク質導入用担体とタンパク質の複合化
タンパク質導入用担体として、前記実施例 6と同様に、モンモリロナイトを含む商品 名クニピア F、商品名ベンゲル FWおよび商品名ベンゲルブライト 25、サボナイトを含 む商品名スメクトン SAの 4種類の粘土鉱物を使用し、同様の担体分散液（2mgZml )を調製した。一方、担体と複合化させる分子量約 18kDのタンパク質の一例として、 ( 株)ペプチド研究所より購入したプレイオト口フィン (以下、「PTN」とも 、う）を用いた。 この PTNタンパク質を mili— Q水で lmgZmlとなるように分散し、タンパク質分散液 を調製した。なお、 PTNも MKと同様に、組換え体を作製し、組換え PTNタンパク質 を調製し、これを標品としてもよぐまた、（株)ペプチド研究所 (大阪)、 R&DSystem s (MN, USA)等の市販品を使用してもよい。
[0109」 そして、 DMEM (Dullbecco's Modified Eagle's Medium： serum― free) 270 μ 1に、 前記担体分散液 15 μ 1およびタンパク質分散液 15 1を添加して混合した。前記混 合液を室温で 1時間静置した後、さらに前記 DMEMlmlを添加混合し、タンパク質 導入剤とした。
[0110] 2. in vitroでのタンパク皙導人
細胞として、 ATCCより分譲されたラット小腸上皮細胞 IEC— 6 (ECACC— 88071 401)を使用した。まず、 12 well plate (コ一-ング社製）に、実施例 5と同様の液体培 地 1. 5mlをカ卩え、各ゥエルにラット小腸上皮細胞 IEC— 6を 5 X 104個播種して 37°C で 4日間培養した。なお，すべての細胞は、 5%炭酸ガス濃度の条件下で培養した。
[0111] 前記 4日間の培養後、培養細胞を前記 PBS (—)溶液で 2回洗浄し、前記タンパク質 導入剤 1. 3mlを各ゥエルに添加した。その後、各ゥエルを 37°Cで 2時間インキュベー トして、これらのタンパク質 (MK)を培養細胞に導入した。
[0112] また、コントロールとして、前記タンパク質導入剤を添加していない細胞を、比較例 6として、 PTNを単独で導入した細胞を、それぞれ同様に培養した。なお、比較例 6 においては、前記タンパク質導入剤に代えて、前記担体分散液 15 1を前記 DME M1270 μ 1と mili— Q水 15 μ 1で希釈したものを添カ卩した。 [0113] 前記前記インキュベート後、全細胞の回収を行った。まず、培養細胞を前記 PBS( ―)溶液で 2回洗浄した。洗浄後、実施例 5と同様のサンプル処理液 100 1を添加し 、 CellScraperにより細胞を回収し、 80°Cで凍結させた。
[0114] 3.タンパク質導入の確認
ラット小腸上皮細胞内へのタンパク質導入の確認は、特に示さな 、限り前記実施例 5と同様にウェスタンプロット解析することにより行った。なお、陽性対照としては、化 学合成プレイオト口フィン (ヒト） ( (株)ペプチド研究所 (大阪)）を 1レーンあたり 200〜 500ngとなるように調製して泳動した（図 6において図示せず)。また、メンブレンとの 反応に使用する抗体は、抗ヒト PTN抗体 (R&DSystems (MN,USA) )とした。その結果 を、図 6に示す。
[0115] 同図において、レーン 1および 8は、マーカータンパク質溶液、レーン 2〜5はタンパ ク質導入剤を使用した結果であり、レーン 2はプレイオト口フィン +スメクトン SA、レー ン 3はプレイオト口フィン +クニピア F、レーン 4はプレイオト口フィン +ベンゲル FW、レ ーン 5はプレイオト口フィン +ベンゲルブライト 25の結果、レーン 6は、比較例 6 (プレ ィォトロフィンのみ）、レーン 7はコントロール（一）の結果である。同図に示すように、 前記 4種類のいずれのタンパク質導入担体を使用した場合でも、単独で導入したも の（比較例 6)よりも濃 、バンドが確認された。
実施例 7
[0116] 各種タンパク質導入用担体を用いて、 in vitroでの小腸上皮細胞 IEC— 6 (ECAC C 88071401)株への分子量約 5kDのポリペプチドの導入を行った。
[0117] 1.タンパク質導入用担体とタンパク質の複合化
タンパク質導入用担体として、前記実施例 6と同様の、サボナイトを含む商品名スメ タトン SAの粘土鉱物を使用し、同様の担体分散液 (2mgZml)を調製した。一方、 担体と複合化させる分子量約 5kDのポリペプチドの一例として、インスリン（SIGMA-A LDRICH ;MO,U.S.A.) (以下、「INS」ともいう）を用いた。この INSを 5mmolZl塩酸 水溶液で lmgZmlに分散し、ポリペプチド分散液を調製した。
[0118] そして、 DMEM (Dullbecco's Modified Eagle's Medium： serum - free) 270 μ 1に、 前記担体分散液 15 μ 1およびポリペプチド分散液 15 1を添加して混合した。前記混 合液を室温で 1時間静置した後、さらに前記 DMEMlmlを添加混合し、ポリべプチ ド導入剤とした。
[0119] 2. in vitroでのポリペプチド導入
細胞として、 ATCCより分譲されたラット小腸上皮細胞 IEC— 6 (ECACC— 88071 401)を使用した。まず、 12 well plate (コ一-ング社製）に、実施例 5と同様の液体培 地 1. 5mlをカ卩え、各ゥエルにラット小腸上皮細胞 IEC— 6を 5 X 104個播種して 37°C で 4日間培養した。なお，すべての細胞は、 5%炭酸ガス濃度の条件下で培養した。
[0120] 前記 4日間の培養後、培養細胞を前記 PBS (—)溶液で 2回洗浄し、前記ポリべプチ ド導入剤 1. 3mlを各ゥヱルに添加した。その後、各ゥエルを 37°Cで 2時間インキュべ ートして、 INSを培養細胞に導入した。
[0121] また、コントロールとして、前記タンパク質導入剤を添加していない細胞を同様に培 し 7こ。
[0122] 前記前記インキュベート後、全細胞の回収を行った。まず、培養細胞を前記 PBS( ―)溶液で 2回洗浄した。洗浄後、前記実施例 5と同様のサンプル処理液 100 1を添 加し、 CellScraperにより細胞を回収し、— 80°Cで凍結させた。
[0123] 3.タンパク皙導入の確認
ラット小腸上皮細胞内へのポリペプチドの確認は、前記「2.」において回収、凍結し た各サンプルの電気泳動により行った。
[0124] まず、各サンプルについて、ドデシル硫酸ナトリウム—ポリアクリルアミドゲル電気泳 動（SDS— PAGE)を Laemmliらの方法に従って行った。泳動用ゲルとして 18%Isocr atic Gel (Invitrogen;CA,U.S.A.)を用い、泳動条件は、 50mA定電流にて、約 50分 間とした。各ゥエルには、マーカータンパク質溶液、インスリン +スメクトン SA、コント口 一ルの計 3種類のサンプルをアプライした。 1レーンあたりのサンプル量は、 2 X 105ce lisのタンパク量とした。陽性対照としては、インスリン（SIGMA-ALDRICH ;MO,U.S.A. )を 1レーンあたり 500〜1000ngとなるに調製して泳動した。分子量マーカーは、商 品名 KaleidoscopePrestained Standards(BIO- RAD)を使用した。
[0125] SDS— PAGE終了後、ゲルをクーマシーブリリアントブルー染色し、各レーンにお けるインスリンバンドの濃さを確認した。その結果の代表的な確認例を図 7の写真に 示す。同図において、レーン 1は、マーカータンパク質溶液、レーン 2はポリペプチド 導入剤を使用した結果 (インスリン +スメクトン SA)、レーン 3はコントロール（一）、レ ーン 4は、標準溶液（陽性対照インスリン)の結果である。同図に示すように、サボナイ トを含むスメクトン S Aを使用した結果、インスリンの導入を示す濃いバンドが確認され た。
産業上の利用可能性
このように、本発明のタンパク質導入用担体を用いれば、高い安全性で細胞に目 的タンパク質を導入することができる。このため、前記タンパク質導入用担体を用いた 本発明のタンパク質導入方法は、臨床医療の分野において非常に有用である。

Claims

請求の範囲
[I] 細胞内にタンパク質を導入するための担体であって、
粘土鉱物を含むことを特徴とする、タンパク質導入用担体。
[2] 前記粘土鉱物が層状粘土鉱物である、請求の範囲 1記載のタンパク質導入用担体
[3] 前記粘土鉱物が、カオリナイト群、バイロフイライト タルク群、スメクタイト群、バーミ キュライト群、雲母群、脆雲母群、緑泥石群およびセピオライトーパリゴスカイト群から なる群力も選択された少なくとも一つの結晶質型粘土鉱物である、請求の範囲 1記載 のタンパク質導入用担体。
[4] 前記粘土鉱物が、モンモリロナイト、バーミキユライトおよびイライトからなる群力 選 択された少なくとも一つの粘土鉱物である、請求の範囲 3記載のタンパク質導入用担 体。
[5] 前記粘土鉱物が、有機物が除去された粘土鉱物である、請求の範囲 1記載のタン パク質導入用担体。
[6] 前記粘土鉱物が、脱鉄処理された粘土鉱物である、請求の範囲 1記載のタンパク 質導入用担体。
[7] 前記粘土鉱物の純度が、 85%以上である、請求の範囲 1記載のタンパク質導入用 担体。
[8] 前記粘土鉱物が、層間に交換性陽イオンを有する、請求の範囲 2記載のタンパク 質導入用担体。
[9] 前記交換性陽イオンが、ナトリウムイオン、アンモ-ゥムイオンおよび第 4級アンモ- ゥムイオン力もなる群力も選択された少なくとも一つの陽イオンである、請求の範囲 8 記載のタンパク質導入用担体。
[10] 前記交換性陽イオンが、アミノ酸、アミンィ匕合物、アミドィ匕合物、カチオン性界面活 性剤およびカチオン性金属錯体力ゝらなる群カゝら選択された少なくとも一つの物質の 陽イオンである、請求の範囲 8記載のタンパク質導入用担体。
[II] 前記粘土鉱物が前記タンパク質を担持し、酸性条件下では前記タンパク質を保持 し、中性またはアルカリ性条件下で前記タンパク質を遊離する、請求の範囲 1記載の タンパク質導入用担体。
[12] 生体細胞へタンパク質を導入するための担体である、請求の範囲 1記載のタンパク 質導入担体。
[13] 小腸細胞へタンパク質を導入するための担体である、請求の範囲 1記載のタンパク 質導入担体。
[14] 経口投与用の担体である、請求の範囲 1記載のタンパク質導入用担体。
[15] 経口減感作治療において、タンパク質を経口投与するための担体である、請求の 範囲 1記載のタンパク質導入用担体。
[16] 培養細胞へタンパク質を導入するための担体である、請求の範囲 1記載のタンパク 質導入用担体。
[17] 担体とタンパク質とを含むタンパク質導入剤であって、
前記担体が請求の範囲 1記載のタンパク質導入用担体であり、前記タンパク質が前 記タンパク質導入用担体に担持されていることを特徴とする、タンパク質導入剤。
[18] 前記タンパク質 (A)と前記タンパク質導入用担体に含まれる粘土鉱物 (B)との混合 割合 (重量比 A: B)が、 1 : 0. 1〜5の範囲である、請求の範囲 17記載のタンパク質 導入剤。
[19] タンパク質導入剤の形態が分散液の形態である、請求の範囲 17記載のタンパク質 導入剤。
[20] 前記分散液の pHが、 5. 5〜7. 5の範囲である、請求の範囲 19記載のタンパク質 導入剤。
[21] 疾患の治療剤、予防剤または抑制剤としてタンパク質を含む医薬組成物であって、 さらに、請求の範囲 1記載のタンパク質導入用担体を含むことを特徴とする、医薬 組成物。
[22] 経口投与用の医薬組成物である、請求の範囲 21記載の医薬組成物。
[23] 減感作治療の医薬組成物である、請求の範囲 21記載の医薬組成物。
[24] 担体とタンパク質とを含むタンパク質導入剤を細胞に接触させて、前記細胞に前記 タンパク質を導入するタンパク質の導入方法であって、
前記タンパク質導入剤力 請求の範囲 17記載のタンパク質導入剤であることを特 徴とする、タンパク質導入方法。
[25] 前記細胞と前記タンパク質導入剤に含まれる粘土鉱物との割合が、細胞 1 X 106個 に対して粘土鉱物 0. 01〜： LOO /z gの範囲である、請求の範囲 24記載のタンパク質 導入方法。
[26] 前記細胞と前記タンパク質導入剤に含まれるタンパク質との割合力 細胞 1 X 106 個に対してタンパク質 0. 01〜： LOO /z gの範囲である、請求の範囲 24記載のタンパク 質導入方法。
[27] 前記細胞が培養細胞である、請求の範囲 24記載のタンパク質導入方法。
[28] 前記培養細胞と前記タンパク質導入剤との接触に先立って、前記培養細胞をイン キュペートする工程を含む、請求の範囲 27記載のタンパク質導入方法。
[29] 前記タンパク質導入剤を前記培養細胞に 3〜48時間接触させる、請求の範囲 27 記載のタンパク質導入方法。
[30] 前記細胞が生体細胞であり、生体内に前記タンパク質導入剤を投与して、生体の 器官細胞または組織細胞にタンパク質を導入する、請求の範囲 24記載のタンパク質 導入方法。
[31] 前記生体内への前記タンパク質導入剤の投与方法が経口投与である、請求の範 囲 30記載のタンパク質導入方法。
[32] 前記タンパク質を導入する器官が小腸である、請求の範囲 30記載のタンパク質導 入方法。
[33] 細胞に外来のタンパク質を導入してタンパク質導入細胞を製造する方法であって、 前記タンパク質の導入方法力 請求の範囲 24記載のタンパク質導入方法であること を特徴とする、タンパク質導入細胞の製造方法。
[34] 外来のタンパク質を導入したタンパク質導入細胞であって、請求の範囲 33記載の 方法により製造されることを特徴とする、タンパク質導入細胞。
[35] 疾患の治療剤、予防剤または抑制剤としてタンパク質を含む医薬組成物を患者に 投与する前記疾患の予防または治療方法であって、
前記医薬組成物が、請求の範囲 21記載の医薬組成物であることを特徴とする予防 または治療方法。
[36] 前記投与方法が、経口投与である、請求の範囲 35記載の予防または治療方法。
[37] 前記疾患が、糖尿病であり、前記タンパク質力インスリンである、請求の範囲 35記 載の予防または治療方法。
[38] 予防または治療方法が、減感作治療方法である、請求の範囲 35記載の予防また は治療方法。
[39] 前記疾患がアレルギーであり、前記タンパク質がアレルギーの原因タンパク質であ る、請求の範囲 38記載の予防または治療方法。
[40] 疾患の治療剤、予防剤または抑制剤としてタンパク質を含む医薬組成物の製造の ための請求の範囲 1記載のタンパク質導入用担体の使用。
[41] 前記医薬組成物が経口投与用の医薬組成物である、請求の範囲 40記載のタンパ ク質導入用担体の使用。
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