WO2006085451A1 - 遺伝子導入造血細胞から血液細胞を再構築させる方法 - Google Patents

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cells
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gfp
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Kumi Yoshida
Shinji Okano
Yoshikazu Yonemitsu
Katsuo Sueishi
Makoto Inoue
Mamoru Hasegawa
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Dnavec Corporation
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    • C12N2760/18011—Paramyxoviridae
    • C12N2760/18811—Sendai virus
    • C12N2760/18851—Methods of production or purification of viral material
    • C12N2760/18852—Methods of production or purification of viral material relating to complementing cells and packaging systems for producing virus or viral particles

Definitions

  • the present invention relates to a composition for transplanting hematopoietic cells, including transgenic hematopoietic cells.
  • the present invention also relates to a method for reconstructing blood cells from transgenic hematopoietic cells.
  • the method of the present invention can be applied to non-damaged cell gene therapy in hematopoietic cell transplantation.
  • AAV adeno-associated virus vectors
  • lentiviral vectors that incorporate genes into the chromosome
  • congenital immunodeficiency diseases because there are cases where bone marrow transplants do not prove effective, these patients are left with only gene therapy, so a new and safe vector system based on a different concept from previous chromosomally integrated vectors. It is desirable to build It is.
  • Non-Patent Document l Cavazz Edition-Calvo M. et al., Science 2000; 288: 669-672
  • Non-Patent Document 2 Kaiser J., Science 2003; 299: 495
  • Non-Patent Document 3 Hacein- Bey- Abina S. et al., Science 2003; 302: 415-419
  • Non-Patent Document 4 Fischer A. et al., N Eng Journal Med 2004; 350: 2526-2527
  • the present invention provides a method for producing a hematopoietic cell transplant composition containing transgenic hematopoietic cells using a non-chromosomally integrated viral vector.
  • the present invention also provides a method for reconstructing blood cells from hematopoietic cells transfected with a non-chromosomal viral vector.
  • the present inventors have proposed a method using a non-chromosomal non-integrated virus in order to enable safe gene transfer without damaging the chromosome of the hematopoietic cell for hematopoietic cell transplantation! Developed.
  • bone marrow cells were prepared by removing erythrocytes and sputum cells from the femur of mice, and transfected bone marrow cells were prepared by infecting minus-strand RNA viruses incorporating foreign genes.
  • the present invention discloses for the first time blood cell reconstruction by gene-introduced hematopoietic cells using a non-chromosomal cytoplasmic vector, and recombines the cell chromosome by using a minus-strand RNA viral vector.
  • the present invention relates to a gene-introduced hematopoietic cell composition suitable for hematopoietic cell transplantation, a method for producing the same, and a method for reconstructing hematopoietic cell-powered blood cells into which a gene has been introduced using a minus-strand RNA virus vector.
  • the present invention relates to the inventions described in the claims. It should be noted that one or more combinations of inventions described in the claims that refer to the same claim are already intended to be expressed in the claims. That is, the present invention
  • a method for producing a hematopoietic cell transplantation composition which comprises introducing a minus-strand RNA virus vector into a hematopoietic cell and preparing a composition comprising the hematopoietic cell and a pharmaceutically acceptable medium.
  • Minus-strand RNA virus vector strength The method according to [1], wherein one or more genes encoding envelope-constituting proteins are mutated or deleted,
  • step (b) injecting the hematopoietic cells of step (a) into an animal
  • C57BL6 strain GFP transgenic mouse Changes in GFP positive rate in peripheral blood cells when transplanted to allogeneic recipients of bone marrow collected from (GFP-TG) or C57BL6 mouse bone marrow transfected with SeV / dF-GFP or tsSeV / dF-GFP
  • FIG. The vertical axis is a logarithmic display.
  • FIG. 2 Flow cytometry shows GFP-positive rate in various organs (total of 6 animals, 5 weeks after transplantation) when C57BL6 mouse bone marrow transfected with tsSeV / dF-GFP is transplanted to allogeneic recipients
  • FIG. Of the individuals analyzed in Fig. 1, peripheral blood at 4 weeks with good survival rate was selected and analyzed. A representative profile is shown. The numbers in parentheses indicate the mean value standard error% (n 6).
  • FIG. 3 GFP-positive rate in each blood cell fraction in the spleen 'bone marrow when C57BL6 mouse bone marrow transfected with tsSeV / dF-GFP by flow cytometry was transplanted into allogeneic recipients (post-transplantation) 5 shows a total of 6 animals).
  • FIG. 4 is a graph showing changes in survival rate over time (total of 53 animals) when C57BL6 mouse bone marrow transfected with tsSeV / dF-GFP is transplanted into allogeneic recipients.
  • b Untreated C57BL 6 mice, mice transfected with tsSeV / dF-GFP! /, white blood cell count (WBC) in peripheral blood when bone marrow of GFP transgenic mouse is transplanted into allogeneic recipients, It is a figure which shows red blood cell count (RBC) and platelet count (PLT) (4 weeks after transplantation). A marked pancytopenia is observed only in tsSeV / dF-GFP.
  • RBC red blood cell count
  • PHT platelet count
  • FIG. 5 is a diagram showing SeV-specific CTL activity (4 weeks after transplantation) when C57BL6 mouse bone marrow transfected with tsSeV / dF-GFP is transplanted into allogeneic recipients.
  • the numbers in parentheses indicate the percentage of GFP positive cells in the peripheral blood at the same time in each individual. For each individual, 3 culture wells are seeded with target cells, each data is the average of 3 wells, and error bars indicate standard errors.
  • b This is a bar graph comparing the data shown in a. above into two groups (dead group, surviving group) and comparing the GFP positive rate (left) and anti-SeV antibody titer (right), respectively. Error bars indicate standard error.
  • the rate of GFP positive cells rapidly decreased, and all cases survived for a long time.
  • the vertical axis is a logarithmic display.
  • FIG. 8 is a graph showing changes in the GFP positive rate in peripheral blood cells when the C57BL6 mouse bone marrow transfected with tsSeV / dF-GFP or TriSeV-GFP is transplanted into allogeneic recipients. Note that the vertical axis is logarithmic.
  • FIG. 10 is a diagram showing the results of blood cell fraction analysis.
  • a marked pancytopenia is observed only in tsSeV / dF-GFP.
  • FIG. 13 is a diagram showing a continuation of FIG.
  • FIG. 14 is a diagram showing a procedure for constructing a SeV18 + BssHII / PLmut ⁇ M ⁇ F ⁇ HN—Notl cDNA (pSeV18 + BssHII / PLmut ⁇ F ⁇ HN-Notl).
  • FIG. 15 is a diagram showing a continuation of FIG.
  • FIG. 16 is a diagram showing a continuation of FIG.
  • FIG. 17 is a diagram showing a construction procedure of SeV18 + NotI / PLmut ⁇ M ⁇ F ⁇ HN—GFP cDNA (pSeV18 + NotI / PLmut ⁇ M ⁇ F ⁇ HN-GFP).
  • FIG. 18 is a diagram showing a continuation of FIG.
  • FIG. 19 shows the construction of Cre / loxP-inducible M, F and HN gene expression plasmids that express Blasticidin S resistance gene as a selection marker.
  • FIG. 20 is a diagram showing a continuation of FIG.
  • the present invention provides a hematopoietic cell transplant composition containing a hematopoietic cell into which a minus-strand RNA viral vector is introduced and a pharmaceutically acceptable medium, and a method for producing the same.
  • a minus-strand RNA virus is a virus that contains a minus-strand RNA (an antisense strand that is complementary to the strand that senses the viral protein) as a genome. Negative strand RNA is also called negative strand RNA.
  • the minus-strand RNA virus vector refers to a minus-strand RNA virus as a carrier (vector) for introducing a gene or nucleic acid into a cell.
  • the minus-strand RNA virus vector may or may not have foreign genes.
  • a recombinant virus refers to a virus produced via a recombinant polynucleotide, or an amplification product of the virus.
  • a recombinant polynucleotide refers to a polynucleotide in which both ends or one end are not joined in the same manner as in the natural state.
  • the recombinant polynucleotide is a polynucleotide in which the binding of the polynucleotide strand is artificially altered (cut and / or bound).
  • a recombinant polynucleotide can be produced by a known genetic recombination method by combining polynucleotide synthesis, nuclease treatment, ligase treatment, and the like.
  • Recombinant virus was constructed by genetic manipulation It can be produced by expressing a polynucleotide encoding the viral genome and reconstructing the virus. For example, a method of reconstructing a virus from cDNA encoding the viral genome is known (Y. Nagai, A. Kato. Microbiol. Immunol. 1999: 43; 6 13-624).
  • a gene refers to genetic material and refers to a nucleic acid encoding a transcription unit.
  • the gene can be RNA or DNA! /.
  • a nucleic acid encoding a protein is called a gene of the protein.
  • a gene may not encode a protein.
  • a gene may encode a functional RNA such as a ribozyme or an antisense RNA.
  • a gene can be a naturally derived or artificially designed sequence.
  • “DNA” includes single-stranded DNA and double-stranded DNA.
  • encoding a protein means that an ORF encoding the amino acid sequence of the protein is included in the sense or antisense so that the polynucleotide can express the protein under appropriate conditions.
  • the minus-strand RNA virus suitably used in the present invention includes, for example, the Paramyxoviridae virus Sendai virus, Nu ⁇ 7 Susnore 3 Quinoles (introduced Newcastle disease virus) 7 Mumps virus, hemp Winores (measles virus) ⁇ RS Winores, respiratory syncytial virus) rinderpest 1 / Inores, rinderpest virus) ⁇ Distemper virus ⁇ Sanoreno ⁇ Rheinoleenza Viruses (SV5), human parainfluenza virus types 1,2,3, Rhabdoviridae's vesicular stomatitis virus ⁇ rabies virus rabies virus, etc.
  • the Paramyxoviridae virus Sendai virus Nu ⁇ 7 Susnore 3 Quinoles (introduced Newcastle disease virus) 7 Mumps virus, hemp Winores (measles virus) ⁇ RS Winores, respiratory syncytial virus) rinderpest 1 / In
  • PDPR measles virus
  • RPV rinderpest virus
  • Hendra virus Hendra
  • Nipah virus Nip ah virus
  • HPIV-2 human parainfluen
  • Sendai virus SeV
  • human parainfluenza virus— 1 HPIV— 1
  • HPIV-3 huma n parainfluenza virus-3
  • phocine distemper virus PDV
  • canine distemper virus CDV
  • dolphin molbillivirus DMV
  • measles virus MV
  • rinderpest examples include viruses selected from the group consisting of viruses (RPV), Hendra virus (Hendra) ⁇ Nipah virus (N ipah), and respiratory syncytial virus (RSV).
  • the minus-strand RNA virus used in the present invention is particularly preferably a single-strand minus-strand RNA virus (also referred to as a non-segmented minus-strand RNA virus).
  • a “single-stranded negative strand RNA virus” refers to a virus having a single-stranded negative strand [ie, negative strand] RNA in the genome. Examples of such viruses include noramyxovirores (Paramyxoviridae; Paramyxovirus, Morbillivirus, Rubulavirus, and Pneumovir us ⁇ , etc.
  • Bunyaviridae (Bunyaviridae; Bunyavirus, Hantavirus, Nairovirus, and Phlebovirus 3 ⁇ 4r3 ⁇ 4? _? ⁇ Lena ), viruses belonging to the family (Arenaviridae) are included.
  • the minus-strand RNA virus used in the present invention is more preferably a virus belonging to the subfamily of Nora myxovirus (including the genera Respirovirus, Rubravirus, and Morbillivirus) or a derivative thereof, More preferably, it is a virus belonging to the genus Respirovirus (also referred to as Paramyxovirus) or a derivative thereof.
  • Derivatives include viruses in which viral genes have been modified and viruses that have been chemically modified so as not to impair the ability of the gene to be introduced by the virus.
  • respirovirus viruses to which the present invention can be applied examples include human parinfluenza virus type 1 (HPIV-1), human parainfluenza virus type 3 (HPIV-3), and ushipara influenza virus type 3 (BPIV-3). , Sendai virus (also called mouse parinfluenza virus type 1), and simian parainfluenza virus type 10 (S PIV-10).
  • the paramyxovirus is most preferably a sender virus. These viruses may be derived from natural strains, wild strains, mutant strains, laboratory passage strains, and artificially constructed strains.
  • Negative-strand RNA viral vector antisense gene carried in viral genomic RNA Code to Viral genomic RNA forms a ribonucleoprotein (RNP) together with the viral protein of the minus-strand RNA virus, and this protein expresses a gene in the genome, and this RNA is replicated to form a daughter RNP.
  • Genomic RNA may be a virus gene that has mutations and / or deletions, or has been modified by the incorporation of a foreign gene.
  • the genome of a minus-strand RNA virus consists of a viral gene arranged as an antisense sequence between the 3 'leader region and the 5' trailer region.
  • each gene's ORF there is a transcription termination sequence (E sequence)-an intervening sequence (I sequence)-a transcription initiation sequence (S sequence), which separates the RNA encoding each gene's ORF. Transcribed as cistron.
  • the genomic RNA contained in the virus of the present invention encodes a minus-strand RNA viral protein that constitutes the RNA and RNP. On the other hand, since the genomic RNA of the minus-strand RNA virus is minus-strand, these proteins are encoded as antisense.
  • Genomic RNA and the minus-strand RNA virus protein that constitutes RNP form a complex with the minus-strand RNA viral genomic RNA, and the replication of the genomic RNA and the expression of the gene encoded by the genome and the autonomous RNA itself It refers to a group of viral proteins that are required for typical replication. These proteins form the core excluding the viral envelope, and are typically N (nucleocapsid), P (phospho), and L (large) proteins. 1S Corresponding protein is obvious to those skilled in the art (Anjeanette Robert et al., Virol ogy. 1998: 247; 1-6) 0 For example, N is represented as NP Sometimes.
  • the RNA may encode an M (matrix) protein necessary for the formation of virus particles.
  • RNA may encode an envelope protein necessary for virus particle infection.
  • Negative-strand RNA virus envelope proteins include F (fusion) protein, which is a protein that causes cell membrane fusion, and HN (hemadalun-neuraminidase) protein (or H (hemadalchun)), which is necessary for cell adhesion.
  • F fusion
  • HN hemadalun-neuraminidase
  • viral envelope proteins other than F protein and Z or HN protein or H may be encoded.
  • the minus-strand RNA virus used in the present invention preferably has a mutation and / or deletion of a gene encoding an envelope-constituting protein.
  • each gene in each virus belonging to the Paramyxovirus subfamily is generally expressed as follows.
  • the NP gene is also denoted as “N”.
  • HN is expressed as H (hemadalchun) when it has no neuraminidase activity.
  • accession number of the nucleotide sequence database of each gene of Sendai virus is M29343, M30202, M30203, M30204, M51331, M55565, M69046, X17218 for the NP gene, M30202, M30203, for the P gene.
  • genes encoded by other viruses include the CDV, AF014953; DMV, X75961; HPIV-1, D01070; HPIV-2, M55320; HPIV-3, D10025; Mapuera, X85128.
  • the ORFs encoding these viral proteins and the ORFs of foreign genes are placed antisense in the genomic RNA via the EIS sequence described above.
  • the closest 3 'ORF in genomic RNA requires only the S sequence between the 3' leader region and the ORF, and not the E and I sequences.
  • the ORF closest to the 5 'in genomic RNA requires only the E sequence between the 5' trailer region and the ORF, and does not require the I and S sequences.
  • Two ORFs can also be transcribed as the same cistron using, for example, a sequence such as IRES.
  • RNA genome consists of 6 ORFs that encode the N, P, M, F, HN (H), and L proteins antisense to the 3 'leader region. Are arranged in order, followed by a 5 'trailer region at the other end.
  • the genomic RNA is not limited to the arrangement of the viral gene, but preferably, like the wild-type virus, the 3 ′ leader region is followed by N, P, M, F, HN ( Or H), and ORFs encoding L protein are arranged in order, followed by a 5 ′ trailer region.
  • vectors carrying the N, P, and L genes autonomously express genes from the RNA genome in the cell, and the genomic RNA is replicated. Furthermore, infectious virus particles are formed and released extracellularly by the action of genes encoding envelope spike proteins such as the F and HN (or H) genes and the M gene. Therefore, such a vector becomes a viral vector having transmission ability.
  • F and HN (or H) genes and the M gene Therefore, such a vector becomes a viral vector having transmission ability.
  • the minus-strand RNA viral vector used in the present invention preferably has a mutation and / or deletion in the gene of one or more envelope constituent proteins. It has been found that the use of such a mutant negative-strand RNA virus significantly increases the efficiency of blood cell lipolysis.
  • the variation in the protein constituting the envelope is a variation in which the infectious virus producing ability of the virus substituted with the mutated gene is significantly reduced as compared with the virus having the wild type gene.
  • the term “deficiency” means that the function of the wild-type gene is substantially lost, which includes modification so as not to express a functional protein, and deletion of a gene.
  • Envelope constituent proteins are viral proteins that are components of the viral envelope, and include spike proteins that are exposed on the envelope surface and function to adhere to or infect cells, and lining proteins that function to form envelopes. It is.
  • the genes of the envelope protein include F, HN, and M. Depending on the virus species, genes such as H, Ml, and G are included.
  • Viruses in which one or more of these envelope protein genes are mutated and / or deleted significantly increase the engraftment rate of transgenic hematopoietic cells compared to wild-type viruses, resulting in leukocytes, erythrocytes and platelets. It has been found that blood cells containing can be generated for a long time. Viruses in which the envelope component protein gene is mutated and / or deleted are highly safe because the ability to form infectious virus particles in infected cells is reduced. In addition, the cytotoxicity is significantly reduced. Examples of genes to be mutated and / or deleted in the genome include, for example, F gene, HN or H) gene, M gene, or any combination thereof.
  • At least the F gene is mutated or deleted, more preferably deleted. More preferably, the F gene and the HN (or H) gene are mutated or deleted, more preferably deleted. More preferably, the F gene, HN gene or H) gene and M gene are mutated or deleted, more preferably deleted.
  • At least the F gene is deleted, and at least the HN (or H) gene is mutated.
  • a deletion vector Once such a viral vector has entered the cell, F protein is not expressed, and HN (or H) protein is expressed at a very low level or not.
  • the present inventors have confirmed that when a large number of HN proteins are expressed in vector-infected cells, they may cause adsorption and aggregation between cells, and in fact, this phenomenon can occur in vitro. Therefore, it is possible to obtain better results in hematopoietic cell transplantation by using a vector having a temperature-sensitive mutation in the HN gene or H) gene, more preferably a vector lacking the HN (or H) gene.
  • a vector that lacks all of the envelope protein genes it was found that the colonization rate after transplantation was significantly increased and pancytopenia was significantly suppressed even when compared to temperature-sensitive mutant vectors. (Example 6). Therefore, a vector that lacks all envelope-constituting protein genes such as F, HN (or H), and M genes is the most preferred vector in the present invention, and is used for gene transfer into hematopoietic cells. This makes it possible for the recipient to reconstruct blood cells stably for a long period of time.
  • the present invention relates to a method for increasing the engraftment rate and / or the engraftment period in negative-strand RNA virus vector-introduced hematopoietic cell transplantation, which comprises introducing this vector into hematopoietic cells.
  • the present invention also relates to the use of this vector in the manufacture of a transplantation therapeutic composition comprising transgenic hematopoietic cells.
  • a temperature-sensitive mutation is a mutation whose activity is significantly reduced at a normal temperature (eg, 37 ° C) of a virus host compared to a low temperature (eg, 32 ° C).
  • a normal temperature eg, 37 ° C
  • a low temperature eg, 32 ° C
  • Such a protein having a temperature-sensitive mutation is useful because a virus can be produced under permissive conditions (low temperature) without complementation with a wild-type protein or the like.
  • a vector that lacks the F gene and has a temperature-sensitive mutation in the HN and M genes a vector that lacks the F and HN gene and has a temperature-sensitive mutation in the M gene, and a temperature-sensitive mutation in the HN gene that lacks the F and M genes
  • Such vectors are particularly preferably used in the present invention.
  • the present invention is characterized in that these vectors are introduced into hematopoietic cells.
  • the present invention relates to a method for increasing the engraftment rate and / or engraftment period in hematopoietic cell transplantation with an eggplant RNA virus vector.
  • the present invention also relates to the use of these vectors in the manufacture of a transplantation therapeutic composition comprising transgenic hematopoietic cells.
  • the temperature-sensitive mutation of the M gene is not particularly limited, but at least one selected from the group consisting of G69, T116, and A183 in the Sendai virus M protein, preferably Any two amino acid sites that are arbitrarily selected, more preferably all three amino acid sites, or other negative-strand RNA viruses can be suitably used by mutating those sites homologous to those of ⁇ protein.
  • G69 is the 69th amino acid Gly of protein T
  • T116 is the 116th amino acid Thr of M protein
  • A183 is the 183rd amino acid Ala of M protein.
  • M gene The gene encoding M protein (M gene) is widely conserved in minus-strand RNA viruses and is known to have a function of interacting with both the nucleoside psid and envelope of the virus ( Garoff, H. et al., Microbiol. Mol. Biol. Rev. 1998: 62; 11 7-190) o Also expected to be amphiphilic a-helix in SeV M protein 104-119 (104-KACTDLRITVRRTVRA-119Z SEQ ID NO: 1) has been identified as an important region for particle formation (Genevieve Mottet et al., J. Gen. Virol. 1999: 80; 2977-2986), but this region is common among minus-strand RNA viruses. Saved.
  • the amino acid sequence of the M protein is similar to that of the minus-strand RNA virus, especially in the Paramyxovirus subfamily!
  • the known M protein is a basic protein with a total length of about 330 to 380 amino acids. Similar across all regions, but particularly high in the C-terminal half (Gould, A. R. Virus Res. 1996: 43; 17-31, Harcourt, BH et al, Virology. 2000: 271 ; 334-349). Therefore, for example, amino acids homologous to G69, T116, and A183 of SeV M protein can be easily identified.
  • the amino acid at the homologous site of the other minus-strand RNA virus ⁇ protein corresponding to G69, T116, and A183 of the SeV M protein can be obtained by those skilled in the art using, for example, a homology search program for amino acid sequences such as BLAST. It can be identified by aligning it with the amino acid of SeV M protein using an alignment program such as CLUSTAL W.
  • the homologous part of each M protein corresponding to G69 of SeV M protein in terms of rank, human parainfluenza virus-1 (HPIV-1) (in parentheses are abbreviations) G69, hum an parainfluenza virus-3 (HPIV-3) is G3, phocine distemper virus (PDV) ⁇ o and G70 for canine distemper virus (CDV), i G71 for dolphin molbillivirus (DMV), G70 for peste—des—petits— ruminants virus (PDPR), measles virus (MV), and rinder pest virus (RPV) G81 for Hendra virus (Hendra) and Nipah virus (Nipah), G70 for human parainfluenza virus-2 (HPIV-2), human parainfluenza virus-4a (HPIV-4a) and human parainfluenza virus-4b ( HPIV-4b) includes E47, and mumps virus (Mumps) includes E72 (letters and numbers indicate amino acids and their positions).
  • PDV
  • homologous sites of each M protein corresponding to SeV M protein T116 include ⁇ 116 for human parainfluenza virus-1 (HPIV-1), T120, phocine for numan parainfluenza virus-3 (HPIV-3) T104 for distemper virus (PDV) and canine distemper virus (CDV), T105 for dolphin molbillivirus (DMV), peste—des—petits— ruminants virus (PDPR), measles virus (MV) and rinderpest virus (RPV)
  • T104, Hend ra virus (Hendra) and Nipah virus (Nipah) T120, human parainfluenza viru s-2 (HPIV-2) and simian parainfluenza virus 5 (5 ⁇ 5) T 121 for human parainfl uenza virus— 4a (HPIV— 4a) and human parainfluenza virus— 4b (HPIV— 4b), Tl 19 for mumps virus (Mumps), S for Newcastle disease virus
  • each M protein has one of the above three sites, preferably a combination of any two sites. More preferably,
  • the amino acid mutation may be a substitution with another desired amino acid !, but is preferably a substitution with an amino acid having a different side chain chemical property.
  • amino acids are basic amino acids (eg lysine, arginine, histidine), acidic amino acids (eg aspartic acid, dartamic acid), uncharged polar amino acids (eg glycine, asparagine, glutamine, serine, threonine, tyrosine, cysteine).
  • Non-polar amino acids eg alanine, parin, leucine, isoleucine, proline, ferrolanine, methionine, tryptophan
  • ⁇ -branched amino acids eg threonine, palin, isoleucine
  • aromatic amino acids eg tyrosine, ferulanine
  • Tryptophan, histidine e.g tyrosine, ferulanine
  • a certain amino acid may be replaced with an amino acid other than the amino acid of the group to which the amino acid belongs.
  • basic amino acids are substituted with acidic or neutral amino acids
  • polar amino acids are substituted with nonpolar amino acids
  • amino acids having a molecular weight larger than the average molecular weight of 20 natural amino acids If there is, the substitution to an amino acid smaller than the average molecular weight, and conversely, the substitution to an amino acid larger than the average molecular weight is possible, but it is not limited thereto.
  • G69E is a mutation in which the 69th amino acid Gly of the M protein is replaced with Glu
  • T116A is a mutation in which the 116th amino acid Thr of the M protein is replaced with Ala
  • A183S is a mutation in the M protein.
  • the homologous sites of Sendai virus M protein G69, T116, and A183 or other virus M proteins can be replaced with Glu (E), Ala (A), and Ser (S), respectively. It is preferable to have these mutations in combination, and it is more preferable that all of the above three mutations are retained. Mutation can be introduced into the M gene according to a known mutation introduction method. For example, as described in the Examples, it is possible to introduce using an oligonucleotide having a target mutation.
  • measles virus an epitope against a monoclonal antibody of M protein is used.
  • the M gene sequence of P253-505 (Morikawa, Y. et al., Kitasato Arch. Exp. Med. 1991: 64; 15-30), a temperature-sensitive strain with a variable loop, may be used.
  • the 104th Thr of the measles virus M protein corresponding to the 116th Thr of the SeV M protein, or the 119th Thr of the Mumps virus M protein may be substituted with another amino acid (for example, Ala).
  • the vector used in the present invention is deficient in the M gene.
  • M gene deficiency refers to the fact that the function of the wild-type M gene is substantially lost, and includes cases of having an M gene having a loss-of-function mutation and a case of lacking the M gene.
  • a loss-of-function mutation of the M gene can be produced, for example, by deleting the protein coding sequence of the M gene or inserting another sequence. For example, a stop codon can be designed in the middle of the M protein coding sequence (WO00 / 09700).
  • the vector of the present invention is completely deleted of the coding sequence of the M protein.
  • the vector lacking the M protein ORF loses the ability to form virus particles under any conditions.
  • the temperature-sensitive mutation of the HN gene is not particularly limited.
  • at least one selected from the group consisting of A262, G264, and K461 of the Sendai virus HN protein preferably Those containing mutations at two, more preferably all three amino acid sites selected arbitrarily, or at sites homologous to those of other minus-strand RNA virus M proteins can be preferably used.
  • A262 refers to the 262th amino acid Ala of the HN protein
  • G264 refers to the 264th amino acid Gly of the HN protein
  • K461 refers to the 461st amino acid Lys of the HN protein.
  • the amino acid mutation may be a substitution with another desired amino acid, but is preferably a substitution with an amino acid having a different side chain chemistry like the mutation of the M protein described above.
  • substitution with a different group of amino acids may be mentioned.
  • a mutation selected from the group consisting of A262T, G264R, and K461G in Sendai virus HN protein, or a mutation containing a mutation homologous thereto can be preferably used.
  • A262T is a mutation in which the 262nd amino acid A1a of the HN protein is replaced with Thr
  • G264R is a mutation in which the 264th amino acid Gly of the HN protein is replaced with Arg
  • K461G is a mutation of the HN protein.
  • This is a mutation in which the amino acid Lys at position 461 is replaced with Gly. That is, Sendai virus HN proteins A262, G264, and K461
  • the homologous sites of other viral HN proteins can be replaced with Thr (T), Arg (R), and Gly (G), respectively. It is preferred to have these mutations in combination, especially to keep all three of these mutations U.
  • the Urabe AM9 strain (Wright, KE et al., Virus Res. 2000: 67; 49-57, which shows temperature-sensitive properties and is used as a vaccine) ), It is preferable for the present invention to introduce mutations into amino acids 464 and 468 of the HN protein. Amino acid mutations at homologous positions can be applied to other minus-strand RNA viruses.
  • the HN gene is deleted.
  • HN gene deficiency means that the function of the wild-type HN gene is substantially lost, and includes cases where the HN gene has a loss-of-function mutation and a case where the HN gene is deleted.
  • a function-deficient mutation of the HN gene can be produced, for example, by deleting the protein coding sequence of the HN gene or inserting another sequence. For example, a stop codon can be designed in the middle of the HN protein coding sequence.
  • the vector of the present invention has a complete deletion of the HN protein code sequence.
  • the minus-strand RNA virus may have a mutation in the P gene or L gene.
  • mutations include the 86th Glu (E86) mutation in the SeV P protein, the substitution of the 511st Leu (L511) in the SeV P protein with another amino acid, or other minus
  • substitution of the homologous site of the strand RNA virus P protein may be a substitution with another desired amino acid, but is preferably a substitution with an amino acid having a different side chain chemical property as described above.
  • substitution with a different group of amino acids may be mentioned. Specific examples include substitution of E86 with Lys (E86K) and substitution of L511 with Phe (L51 IF).
  • L protein substitution of 1197th Asn (Nil 97) and / or 1795th Lys (K1795) with other amino acids, or substitution of homologous sites of other negative-strand RNA virus L proteins. .
  • L protein genes having both of these two mutations of L protein are particularly preferred.
  • the amino acid mutation may be a substitution with another desired amino acid, but is preferably a substitution with an amino acid having a different side chain chemical property as described above. For example, as described above, different groups of amino Substitution with an acid, etc. are mentioned. Specifically, substitution of N1197 with Ser (N1197S),
  • Examples include substitution of K1795 with Glu (K1795E). Having both P gene and L gene mutations can significantly enhance the effects of persistent infectivity, suppression of secondary particle release, or suppression of cytotoxicity. In addition, envelope protein gene mutations and
  • the minus-strand RNA viral vector may be one lacking an accessory gene.
  • knocking out the V gene, one of the SeV accessory genes significantly reduces the pathogenicity of SeV against a host such as a mouse that does not impair gene expression and replication in cultured cells (Kato, A. et al. J. Virol. 1997: 71; 72
  • Attenuated vectors are particularly useful as viral vectors for gene transfer with lower toxicity.
  • Minus-strand RNA viruses are transcribed and replicated only in the cytoplasm of the host cell, and no integration occurs in the chromosome because there is no DNA phase (Lamb, RA and Kolakofsky, D., Paramyxoviridae: The viruses and tneir replication.In: Fields BN, K nipe DM, Howley PM, (eds) .Fields of virology. Lippincott-Raven Publishers: Phila delphia, 1996: 2; 1177-1204) 0 And there are no safety issues such as immortality. This feature of the minus-strand RNA virus is thought to greatly contribute to the safety of vectorization.
  • heterologous gene expression for example, even when Sendai virus (SeV) is continuously passaged, almost no base mutation is observed, and the inserted heterologous gene with high genomic stability is stable over a long period of time. (Yu, D. et al "Genes Cells. 1997: 2: 457-466), and transgene size or packaging flexibility due to the absence of a force psid structure protein.
  • the SeV vector can introduce foreign genes up to at least 5 kb, and can also express two or more genes simultaneously by adding a transcription unit.
  • Sendai virus is pathogenic to rodents and is not pathogenic to powerful humans known to cause pneumonia. This is also the nasal injection of wild-type Sendai virus. Is supported by previous reports that it does not cause serious adverse effects in non-human primates (Hurwitz, JL et al., Vaccine. 1997: 15; 533-540, Bitzer, M. et al. al, J. Gene Med. 2003: 5; 543-553, Slobod, KS et al, Vaccine. 2004: 22; 31 82-3186) o It is also extremely difficult to obtain various cells' organs using existing vectors. High gene transfer and expression efficiency (Yonemitsu Y.
  • the minus-strand RNA viral vector can encode a desired foreign gene in genomic RNA.
  • a recombinant viral vector containing a foreign gene can be obtained by inserting the foreign gene into the genome of the above viral vector.
  • the insertion position of the foreign gene can be selected, for example, from a desired site in the protein non-coding region of the viral genome, for example, between the 3 'leader region of genomic RNA and the viral protein ORF closest to the 3' end. It can be inserted between the viral protein ORF and / or between the viral protein ORF closest to the 5 'end and the 5' trailer region.
  • a nucleic acid encoding a foreign gene can be inserted into the deleted region.
  • An EIS sequence is constructed between the inserted foreign gene and the viral ORF. To do. Two or more foreign genes can be inserted in tandem via the EIS sequence.
  • the foreign gene introduced by the minus-strand RNA virus is not particularly limited, Examples of natural proteins include cyto force-in, other humoral factors, growth factors, receptors, intracellular signal molecules, enzymes, peptides, and the like.
  • the protein can be a secreted protein, a membrane protein, a cytoplasmic protein, a nucleoprotein, and the like.
  • Artificial proteins include, for example, fusion proteins such as chimeric toxins, dominant negative proteins (including receptor soluble molecules or membrane-bound dominant negative receptors), deletion-type cell adhesion molecules and cell surfaces. Examples include molecules. Further, it may be a protein to which a secretion signal, a membrane localization signal, a nuclear translocation signal or the like is added.
  • Antisense RNA molecules or RNA-cleaved ribozymes can be expressed as transgenes to suppress the function of specific genes. If a viral vector is prepared using a gene for treating a disease as a foreign gene, this vector can be administered to perform gene therapy. As an application of the viral vector of the present invention to gene therapy, a gene expression by direct administration or gene expression by indirect (ex vivo) administration can be used in a foreign gene or a patient's body that can be expected to have a therapeutic effect. It is also possible to express rod-like cell force for endogenous genes that are in short supply. The method of the present invention can also be used as a gene therapy vector in regenerative medicine. Examples of loaded genes are given below.
  • CD45 Cause of SCID 1 gene, located on chromosome lq31-32. A phosphatase that regulates Src kinase with common lymphocyte CD antigen. This deficiency results in T and ⁇ deficient SCID (Hermis ton. Et al "Annu. Rev. Immunol. 2003: 21; 107-137; Buckley RH. , Annu. Rev. Immu nol. 2004: 22; 625-655)
  • IL-7 receptor alpha SCID cause 1 gene, located on chromosome 5pl3. A receptor subunit of IL-7 that is important for differentiation and homeostasis of lymphocytes, especially T cells. This deficiency results in T-deficient SCID (Peschon JJ., J. Exp. Med. 1994: 180; 1955 -1960; Buckley RH., Annu. Rev. Immunol. 2004: 22; 625-655)
  • RAG1 / 2 SCID cause 1 gene, located at chromosome 11 ⁇ 13.
  • lymphocytes Due to the accumulation of purine metabolites, lymphocytes become apoptotic due to the accumulation of purine metabolites, resulting in T and ⁇ -deficient SCID (Noguchi M., Cell, 1999: 73; 147-157; Puck JM.'Hum. Mol. Gemet., 1993: 1099-1104; Buckley RH "Annu. Rev. Immunol. 2004: 22; 625-655)
  • ⁇ c common gamma chain
  • SCID 1 gene located on chromosome Xql3.1. It is a subunit common to IL-2, IL-4, IL7, IL-7, IL-15, and IL-21 receptors, and is a T, ⁇ , ⁇ deficient SCID (so-called X-linked SCID) (Buckley RH. Et al "J. Pediatr. 1997: 130; 378-387; Buckley RH. Et al., N, Engl. J. Med. 1999: 340; 508-516, Buckley RH., Annu. Rev. Immunol. 2004: 22; 625-655)
  • Glycosil phosphatidylinositol linked protein is a protein that suppresses complement activity. Both deficiencies cause hemolysis due to erythrocyte self-complement activity and cause severe nocturnal hemoglobinuria (Johnson RJ. Et al ., J. Clinic. Pathol., 2002: 55; 145-152) copper transporting P—type ATPase (ATP7B, Wilson disease protein): a causative gene of Winoreson disease. This protein is located on chromosome 13 and is important for copper metabolism in the bile duct. This deficiency causes the deposition of copper in the liver, cornea, and brain (Ferenci P., Clin liver Dis. 1998: 2; 31- 4 9)
  • GFP Fluorescent chromophore
  • ludferase ludferase
  • FGF-2 (WO2002 / 042481)
  • Btk deficient in companion agammaglobulinemia
  • CD40 / CD40 ligand deficient in high IgM syndrome
  • WASP Wikott-Aid deficiency in rich syndrome
  • Expression levels of a foreign gene carried in a vector can be regulated by the type of transcription initiation sequence added upstream of the gene (the 3'-side of the minus strand (negative strand)) (WO01 / 18223) o
  • genomic It can be controlled by the insertion position of the foreign gene above, and the level of expression increases as it is inserted closer to 3 'of the negative strand. The expression level is lowered.
  • the insertion position of a foreign gene can be adjusted as appropriate in order to obtain a desired expression level of the gene and so that the combination with the genes encoding the preceding and subsequent viral proteins is optimal.
  • the foreign gene be linked to a highly efficient transcription initiation sequence and inserted near the 3 ′ end of the minus-strand genome. Specifically, it is inserted between the 3 'leader region and the viral protein ORF closest to 3'. Alternatively, it may be inserted between the viral protein gene closest to 3 'and the ORF of the second viral protein gene, or between the second and third viral protein genes from 3'.
  • the viral protein gene closest to 3 'in the genome is the N gene
  • the second gene is the P gene
  • the third gene is the M gene.
  • the transgene for example, by setting the insertion position of the foreign gene as 5 'as possible in the minus-strand genome, or by making the transcription start sequence less efficient, It is also possible to obtain an appropriate effect by keeping the expression level of the vector force low.
  • the E sequence of the Sendai virus vector is preferably, for example, 3′-AUUCUUUU-5 ′ (SEQ ID NO: 9) (5′-TAAGAAAAA-3 ′ (SEQ ID NO: 10) for DNA encoding a plus strand).
  • 3′-GAA-5 ′ (5′-CTT-3 for plus-strand DNA) may be used as the I sequence, for example, any 3 bases.
  • RNA virus vector (a) in the presence of a virus protein necessary for reconstitution of RNP containing genomic RNA of a minus-strand RNA virus in a mammalian or avian cell. Transcribed cDNA encoding genomic RNA of minus-strand RNA virus And (b) a step of recovering the produced negative-strand RNA virus.
  • the viral proteins required for reconstitution of RNP above are typically N, P, and L proteins. Transcription can generate a negative-strand genome (ie, the same antisense strand as the viral genome) or a positive-strand (antigenome, complementary strand of genomic RNA). it can.
  • RNA ends In order to increase the reconstitution efficiency of the vector, a positive strand is preferably generated. It is preferable that the RNA ends accurately reflect the ends of the 3 ′ leader sequence and the 5 ′ trailer sequence as in the case of the natural viral genome. This can be achieved, for example, by adding a self-cleaving ribozyme to the 5 ′ end of the transcript and accurately cutting the end of the minus-strand RNA virus genome with the ribozyme. Alternatively, in order to precisely control the 5 ′ end of the transcript, the RNA polymerase recognition sequence of batteriophage is used as a transcription initiation site, and the RNA polymerase is expressed in the cell.
  • the 3' end of the transcript can be encoded with a self-cleaving ribozyme so that the 3 'end can be accurately cut out by this ribozyme (Hasan , MK et al., J. Gen. Virol. 1997: 78; 2813-2820, Kato, A. et al., EMBO J. 1997 ,: 16; 578-587 and Yu, D. et al "Genes Cells. 1997: 2; 457-466)
  • a self-cleaving ribozyme derived from the antigenic strand of hepatitis delta virus can be used.
  • a plasmid vector is transferred to express viral proteins or viral genomic RNA in virus-producing cells, for example, the calcium phosphate method (Graham, FL van Der Eb, J., Virology. 1973: 52; 456; Wigler, M. and Silverstein, S., Cell. 197 7: 11; 223; Chen, C. and Okayama, H. Mol. Cell. Biol, 1987: 7; 2745), using various transfer reagents Conventional methods, electroporation, or the like can be used.
  • DEAE-dextran Sigma # D-9885 MW 5 X 10 5
  • DOTMA Roche
  • Superfect QIAGEN # 301305
  • DOPE DOPE
  • DOSPER Ro che # 1811169
  • TransIT-LTl Mirus, Product No. MIR 2300
  • the clog mouthkin can be covered (Calos, MP, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1983: 80 ; 3015).
  • the production temperature of the recombinant virus is allowed (for example, 35 ° C or lower, more preferably 34 ° C or lower, more preferably 33 ° C or lower, most preferably 32 ° C or lower). ° C or less).
  • efficient particle formation can be achieved by producing virus at a low temperature.
  • producing a recombinant virus that lacks the envelope protein protein gene introduce the deleted gene and / or a gene encoding an envelope protein of another virus into the cell. Infectious virus particles can be formed by expression (Hirata, T. et al., J. Virol.
  • vesicular stomatitis virus vesicular stomatitis virus
  • VSV-G Envelope proteins derived from viruses that infect human cells, such as the G protein of VSV (VSV-G) and the retroviral unphotopick envelope protein. wear.
  • the VSV-G protein may be derived from any VSV strain.
  • VSV-G protein derived from Indiana serotype strain J. Virology, 1981: 39; 519-528
  • the minus-strand RNA viral vector may be produced by arbitrarily combining envelope proteins derived from other viruses.
  • an amphoteric mouth pick envelope protein for example, an envelope protein derived from mouse leukemia virus (MuLV) 4070A strain can be used.
  • An envelope protein derived from MuMLV 10A1 can also be used (for example, pCL-10Al (Imgenex) (Naviaux, RK et al., J. Virol. 1996: 70; 5701-5705).
  • family proteins include herpes simplex virus gB, gD, gH, and gp85 proteins, EB virus gp350 and gp220 proteins, etc.
  • Hepadnaviridae proteins include hepatitis B virus S These proteins may be used as fusion proteins in which the extracellular domain is bound to the intracellular domain of F protein or HN protein, and thus the viruses used in the present invention.
  • Vectors include pseudo-type virus vectors containing envelope proteins derived from viruses other than the one from which the genome is derived, such as the VSV-G protein. If these envelope proteins are designed so that they are not encoded in the genome, the virus vector force will not be expressed after the virus particles have infected the cells.
  • proteins such as adhesion factors, ligands and receptors that can adhere to specific cells on the envelope surface, antibodies or fragments thereof, or these proteins in the extracellular region
  • a virus containing a chimeric protein having a polypeptide derived from an envelope protein in the intracellular region can also be produced. This can control the specificity of the viral vector infection.
  • These may be encoded in the viral genome or supplied by expression from a gene other than the viral genome (for example, another expression vector or a gene on the host chromosome) at the time of virus reconstitution. Good.
  • Helper cells that express envelope-constituting proteins can be prepared, for example, by transfecting a gene encoding a deleted envelope-constituting protein or another envelope protein (WO00 / 70055 and WO00 / 70070; Has an, MK et al "J. General Virology. 1997: 78; 2813-2820).
  • a vector having a recombinase target sequence such as Cre / loxP-inducible expression plasmid pCALNdlw (Arai, T. et al., J. Virology, 1998: 72; 1115- 1121) is used as an envelope. It is preferable to incorporate a protein gene.
  • the cells for example, monkey kidney-derived cell line LLC-MK cells (ATCC CCL-7) can be used. LLC-MK cells are 10%
  • the above plasmid pCALNdLw / F designed so that the envelope protein gene product can be induced and expressed by Cre DNA recombinase can be obtained by a known method using the calcium phosphate method (mammalian transfection kit (Stratagene)). Gene transfer into LLC-MK cells according to Tocol. Closing cells by limiting dilution
  • the titer of the recovered virus can be determined by, for example, CIU (Cell Infecting Unit) measurement or hemagglutination activity (HA) measurement (WO00 / 70070; Kato, A. et al., 1996: ⁇ ; 569—579; Yonemitsu, Y. & Kaneda, Y., Hemaggulutinatin g virus of Japan—phospho— mediated gene delivery to vascular cells. Ed. by Baker A H. Molecular Biology of Vascular Diseases. Method in Molecular Medicine: Humana Press. 1999: 295-306; Kiyotani, K. et al., Virology. 1990: 177; 65-74).
  • CIU Cell Infecting Unit
  • HA hemagglutination activity
  • the titer can be quantified by directly counting infected cells using the marker as an index (eg, as GFP-CIU).
  • the titer measured in this way can be handled in the same way as CIU (WO00 / 70070).
  • the host cells used for reconstitution are not particularly limited.
  • monkey kidney-derived LLC-MK cells and CV-1 cells eg ATCC CCL-70
  • CV-1 cells eg ATCC CCL-70
  • -Cultured cells such as kidney-derived BHK cells (eg ATCC CCL-10), human-derived cells, etc. Can be used.
  • infectious virus particles having the protein in the envelope can also be obtained.
  • a method for producing a viral vector using chicken eggs has already been developed (Nakanishi et al., (1993), “Advanced Technology Protocol III for Neuroscience Research, Molecular Neuronal Physiology”, Koseisha, Osaka, ⁇ .153- 172).
  • fertilized eggs are placed in an incubator and cultured at 37-38 ° C for 9-12 days to grow embryos. Inoculate the virus vector into the allantoic cavity and incubate the eggs for several days (eg, 3 days) to propagate the viral vector. Conditions such as the culture period may vary depending on the recombinant Sendai virus used. Thereafter, the urine fluid containing the virus is collected. Separation and purification of Sendai virus vector from urine can be performed according to conventional methods (Yasuhito Tashiro, “Virus Experiment Protocol”, supervised by Nagai and Ishihama, Medical View, pp.68-73, (1995) ).
  • the recovered viral vector can be purified to be substantially pure.
  • the purification method can be performed by a known purification / separation method including filtration (filtration), centrifugation, adsorption, column purification, or any combination thereof.
  • “Substantially pure” means that the virus component occupies a major proportion in the solution containing the virus vector.
  • a substantially pure viral vector composition has a 10% (by weight) protein content as a viral vector component of the total protein contained in the solution (except for proteins added as carriers and stabilizers). / Weight) or more, preferably 20% or more, more preferably 50% or more, preferably 70% or more, more preferably 80% or more, and further preferably 90% or more.
  • a paramyxovirus vector as a specific purification method, a method using cellulose sulfate ester or crosslinked polysaccharide sulfate ester (Japanese Patent Publication No. 62-30752, Japanese Patent Publication No. 62-33879, and Japanese Patent Publication No. No. 62-30753), and a method of adsorbing to a sulfated-fucose-containing polysaccharide and / or a degradation product thereof (WO97 / 32010) and the like.
  • a hematopoietic cell transplantation composition can be produced by infecting hematopoietic cells with the above-described minus-strand RNA viral vector.
  • the present invention relates to construction using a minus-strand RNA viral vector.
  • the present invention relates to a method for producing a blood cell transplant composition, and the use of a negative-strand RNA virus vector in the production of a hematopoietic cell transplant composition.
  • Hematopoietic cells refer to cells that can differentiate into blood cells of at least one of white blood cells, red blood cells, and platelets.
  • Hematopoietic cells include bone marrow cells, hematopoietic progenitor cells, hematopoietic stem cells (hematopoietic stem cells; HSC), and the like.
  • the hematopoietic cells used in the present invention are preferably cells that have the ability to be divided into at least three lineages of leukocytes, erythrocytes, and platelets.
  • a hematopoietic progenitor cell is a cell that can be divided into at least one of the blood cell lineages.
  • Hematopoietic stem cells are self-replicating and multipotent cells that have the ability to differentiate into at least the three systems of leukocytes, erythrocytes, and platelets. Hematopoietic cells may be those that can differentiate into somatic cells (nervous system, liver, heart, etc.) (Weissman IL. Et al., Science, 2000: 287; 1442-1446; Lagasse E. et. al, Immunity, 2001: 14; 425-436; Anderson DJ. et al. Nat Med, 2001: 7; 393-395).
  • Each blood cell can be identified from its morphology and staining specificity.
  • staining methods Giemsa staining, Wright staining, May-Giemsa staining, May-Dariyunwald-Giemsa staining, peroxidase staining, elastase staining, PAS staining, etc. can be used (New Biochemistry Experiment Course 8, Blood (above) 1987, see pages 8-15).
  • Hematopoietic stem cells are present not only in bone marrow but also in peripheral blood and umbilical cord blood.
  • hematopoietic cell transplantation refers to transplantation of a cell composition containing hematopoietic cells, such as bone marrow transplantation (BMT), peripheral blood stem cell transplantation (PBSCT), and cord blood stem cell transplantation (CBSCT). included. That is, the present invention can be applied not only to bone marrow cell transplantation but also to peripheral blood hematopoietic stem cell transplantation and umbilical cord blood transplantation.
  • BMT bone marrow transplantation
  • PBSCT peripheral blood stem cell transplantation
  • CBSCT cord blood stem cell transplantation
  • HSC identification can be performed by calculating the progenitor cells of granulocytes and monocytes by the colony assay method, or by measuring CD34 (antigen) positive cells that are considered to be characteristic of HSC with a flow cytometer.
  • hematopoietic cells include C-kit +, Thyl.l 10 ", lin-, Sea-l + (Osawa M, Hanada K, Hamada H, Nakauchi H. Science. 1996; 273: 242-245.), CD34 +, Thy +, Lin-, c-kit ' 0 "(Bhatia M, Wang JC, Kapp U, Bonnet D, Dick JE. Proc Natl Acad Sci US A.
  • the lin "(lineage n egative) phenotype can be identified and selected as appropriate using commercially available kits etc. Italy [For example, GPA, CD3, CD2, CD56, CD24, CD19, CD14, CD16, and CD99b All are negative.
  • Methods for isolating human hematopoietic stem cells can also be referred to the following documents (Leary AG, Blood 69: 953, 1987; Sutherland HJ, Blood 74: 1563, 1989; Andrews RG, J Exp Med 169: 1721.
  • mouse bone marrow cells were collected from the femur and tibia by flushing, and after removing red blood cells with Lysing buffer (0.38% NH CI in Tris-HC1, pH7.65), anti-Thyl. 2
  • collected bone marrow cells can be treated with anti-B220 (B cell) antibody, anti-CD3 (T cell) antibody, anti-Gr-1 (granulocyte) antibody, anti-Mac-1 (macrophage) antibody, anti-DX-5 (NK cell). Obtained by removing the lineage with an antibody such as an antibody (Sato T, Laver JH, Ogawa M. Blood. 1999; 94: 2548-2554.) O
  • HLA human lymphocyte antigen
  • G-CSF 400 g / m (or 10 ⁇ g / kg) per day is divided into 1 or 2 times, 5 days or until the end of collection. It is obtained by injecting hematopoietic stem cells using a blood cell separator from peripheral blood (vein) 1 to 3 times during the period from the 4th day to the 6th day.
  • a blood cell separator from peripheral blood (vein) 1 to 3 times during the period from the 4th day to the 6th day.
  • PBSC peripheral blood stem cells
  • G-CSF and other hematopoietic factors may be used in combination.
  • GM-CSF, IL-3, or SCF can be used in combination (Huhn RD et al., Exp Hematol 24: 839—847, 1996; Begley CG et al., Blood 90: 3378 -3389, 1997 Lane TA et al "Blood 85: 275-282, 1995).
  • aspirin was administered to alleviate systemic symptoms such as low back pain, bone pain and fever, and prevent increased platelet aggregation. can do.
  • the peripheral blood stem cells obtained above can be obtained.
  • Concentration method of CD34 positive cells with CD34 antibody magnetic beads Isolex system (Baxter, etc.), CliniMACS (AmCell), Concentration method through avidin column (CEPRATE, Cellpro), CD34 antibody fixed to flask It can be obtained by separating and collecting CD34-positive cells using a method such as adsorbing the cells to be reacted to the flask and washing the rest (CELLECTOR, AIS). Kodera, Saito supervision, Japan medical Website, Kyoto Azuma, (1 ", 1997) p 26 0- 277, see).
  • erythrocyte sedimentation agent blood cells are added to the collected umbilical cord blood and divided into each blood fraction by weight, except for the plasma fraction and erythrocyte fraction, which are unnecessary at the time of transplantation.
  • CD34-positive cells were isolated through the Isolex system (Baxter), CliniMACS (AmCell), concentration method through an avidin column (CEPRATE, Cellpro), CD34 antibody was immobilized on the flask, and the reacting cells were adsorbed to the flask.
  • Umbilical cord blood CD34-positive hematopoietic stem cells can be obtained by purifying the rest (CELLEC TOR, AIS), etc. (Morishita et al., “Hematopoietic Stem Cell Transplant Manual” 2nd edition, edited by Kodera, Saito, Japan See, Medical Museum, Tokyo, (1999), p661-680;).
  • the isolated hematopoietic cells can be cultured with SCF, IL-3, GM-CSF, G-CSF, and Epo, for example, by the methyl sesulose method (Sonoda Y. et al., Blood 84: 4099-4106, 1 994; Kimura T. et al., Blood 90: 4767-4778, 1997). Hematopoietic cells are added at about 1 ⁇ 10 2 to 1 ⁇ 10 4 / ml and cultured at 37 ° C., 5% CO, 5% O, for example. However, culture conditions are appropriate
  • mononuclear cells can be separated by Fi coll specific gravity centrifugation.
  • mononuclear cells can be separated by Ficoll treatment or blood separation equipment to remove and concentrate granulocytes and erythrocytes.
  • Ficoll treatment or blood separation equipment to remove and concentrate granulocytes and erythrocytes.
  • the collected cells When cryopreserving the collected cells, it is suspended in RPMI1640 medium containing 10% autoserum and 10% DMSO, frozen, frozen with a programmed freezer, and stored in liquid nitrogen.
  • the cell concentration can be 2 x 10 7 to 6 x 10 soml.
  • the final concentration of 6% Hyd rodyethyl Starch (HES), 5% DMSO, 4% albumin should be added to the cell suspension (concentration below 1 X 10 8 / ml).
  • Equal amounts of ice-cold stock solutions can be mixed and stored frozen in a deep freezer at -80 ° C (Knudsen LM et al., J. Hematother. 5: 399-406, 1996).
  • the number of CD34 positive cells required for safe autotransplantation is approximately 2 ⁇ 10 6 / kg (Schots R et al., Bone Marrow Transplant. 17: 509—515, 199b; Zimmerman TM et al., Bone Mar row Transplant. 15: 439-444, 1995).
  • the number of CD34 positive cells can be measured with a normal 2-color flowcytometer. Specifically, after removing red blood cells from bone marrow cells and peripheral blood pheresis cells by hemolysis, they are developed with forward scatter and anti-CD45 antibody, and gates are determined to remove red blood cells and platelets.
  • this gate is expanded with side scatter and anti-CD34 antibody, and nonspecific reaction parts such as neutrophils are excluded, and the ratio of the number of cells in the fraction to the total number of cells is calculated.
  • the total number of CD34 positive cells can be calculated from this value and the number of blood cells previously measured with a blood cell counter.
  • the number of viable stem cells contained in the cryopreserved cells can be determined by counting CFU-GM by the colony formation method.
  • the standard of CFU-GM required for transplantation is generally 1 ⁇ 10 5 to 2 ⁇ 10 5 / kg.
  • the minus-strand RNA viral vector can be introduced into the hematopoietic cell by contacting the hematopoietic cell prepared as described above with the minus-strand RNA viral vector.
  • Minus-strand RNA virus vectors and hematopoietic cells can be contacted in vivo (in vivo) or in vitro (in vitro or ex vivo).
  • culture medium, physiological saline, blood, plasma, serum, body fluid For example, it may be carried out in a desired physiological aqueous solution.
  • MOI multiplicity of infection; infection per cell
  • the number of viruses is preferably between 1 and 500, more preferably between 2 and 300, more preferably between 3 and 200, even more preferably between 5 and 100, and even more preferably. ⁇ 70.
  • Contact between the vector and the hematopoietic cell is sufficient even for a short time, for example, 1 minute or longer, preferably 3 minutes or longer, 5 minutes or longer, 10 minutes or longer, or 20 minutes or longer, for example 1 to 60. Minutes, and more specifically about 5 to 30 minutes. Of course, the contact may be continued for a longer time, for example, for several days or longer.
  • the hematopoietic cells into which the vector has been introduced can be combined with a desired pharmacologically acceptable carrier or vehicle to form a hematopoietic cell transplant composition.
  • a desired pharmacologically acceptable carrier or vehicle is not limited as long as it is a solution capable of suspending living cells. Examples include phosphate buffered saline (PBS), sodium chloride sodium solution, Ringer's solution, and culture solution.
  • the hematopoietic cell transplantation composition may contain a hematopoietic cell by introducing a vector!
  • the engraftment efficiency of hematopoietic cells can be increased by mixing hematopoietic cells into which the vector has been introduced and hematopoietic cells into which the vector has not been introduced.
  • the mixing ratio is not limited thereto, but for example, vector-introduced hematopoietic cells: non-introduced hematopoietic cells may be appropriately adjusted between 1:10 and 10: 1.
  • the present invention also relates to a method for reconstructing blood cells from hematopoietic cells into which a minus-strand RNA viral vector has been introduced.
  • This method includes the steps of (a) contacting a minus-strand RNA viral vector with hematopoietic cells, and (b) injecting the hematopoietic cells of step (a) into an animal.
  • the minus-strand RNA viral vector is a cytoplasmic vector and does not integrate into the hematopoietic cell chromosome, so there is no risk of chromosomal damage like retroviruses.
  • the minus-strand RNA virus replicates in the cytoplasm of the hematopoietic cell, and even if the hematopoietic cell divides, the vector is distributed to the daughter cell, and the transgene expression continues even in the reconstructed blood cell. Prove that you can.
  • Blood cells refer to cellular components in blood, and specifically include white blood cells, red blood cells, and platelets. Producing blood cells means producing any of these blood cells, preferably all of white blood cells, red blood cells, and platelets.
  • Leukocytes include granulocytes, monocytes, and lymphocytes. In the present invention, leukocytes mean any of those cells.
  • a minus-strand RNA viral vector is introduced.
  • Hematopoietic cells can be divided into three lines. In other words, leukocytes, erythrocytes, and platelets are generated from hematopoietic cells into which negative-strand RNA virus vectors have been introduced by hematopoietic cell transplantation.
  • Transplantation of hematopoietic cells can be appropriately performed according to a well-known transplantation protocol.
  • animals to be subjected to hematopoietic cell transplantation include desired mammals, such as mice, rats, dogs, pigs, cats, rabbits, rabbits, hidges, goats, monkeys, etc.
  • Human mammals and humans are included.
  • the number of cells administered per mouse is 5.0 x 10 6 force 2.0 x 10 7 , preferably about 1.0xl0 7 , preferably about 2.0xl0 7 from the tail vein, penile vein, or fundus vein. It can be administered intravenously (Tomita Y, Mayumi H, Eto M, Nomoto K.
  • 2 ⁇ 10 8 / kg to 3 ⁇ 10 8 / kg, preferably about 3 ⁇ 10 8 / kg are intravenously administered per individual.
  • 2 x 10 6 / kg or more for autologous hematopoietic stem cell transplantation per individual 5 x 10 6 / kg or more for allogeneic transplantation, preferably about 5 x 10 6 for autologous hematopoietic stem cell transplantation / kg, about 10 x 10 6 / kg intravenously for allogeneic transplantation.
  • the required number of transplants per individual is 2 x 10 sokg or more, preferably about 4 x 10 sokg intravenously.
  • an antihistamine such as hydroxy zine 25 mg or chlorphenirmine 5 mg
  • gij renal corticosteroid hydrocortiso ne OOmg
  • TBI total body irradiation
  • melphalan or cyclophosphamide
  • TBI can also cause various disorders, and pretreatment with only anticancer drugs, such as busulfan and CPA BUCY, can be selected to avoid these disorders (Inoue, T. et al., Strahlenther Onkol 169: 250-255, 1993; Blais e, D. et al., Blood. 1992: 79; 2578-2582; Blume, KG. Et al., Blood. 1993: 81; 2187-2193; Hartman, A. et al " 1998: 22; 439-443) It is also possible to reduce the pretreatment dose by performing Donor Lymphocyte Infosion (DLI) simultaneously with bone marrow transplantation.
  • DLI Donor Lymphocyte Infosion
  • irradiation methods such as a long SAD (Source axis distance) (or SSD (Source skin distance) method, a sweep beam method, a beam moving method, and a therapeutic bed moving method can be applied.
  • the long SAD (SSD) method is easy to use because it does not require special equipment, and is often used.
  • Normal irradiation can be expected in the case of single irradiation, for example, 10 Gy (6 cGy / min) per dose for humans, and 12 Gy (6 cGy / min) for 6 times / 6 days for fractional irradiation. Examples include 1.8 Gy / times 2 to 3 times / day (total dose of about 15 Gy) or 2 to 3 Gy / times 1 to 2 times / day (total dose of about 12 Gy). Good.
  • immunosuppression includes not only bone marrow destructive treatment such as TBI but also bone marrow nondestructive treatment with an immunosuppressive agent or the like.
  • an immunosuppressant used for the pretreatment anticancer agents such as fludarabine and cladribine and antithymocyte globulin are used.
  • a mixed chimera with non-myeloablative pretreatment can be applied, but in tumors such as leukemia, a large amount of lymphocytes are injected to completely chimerize.
  • diseases for which hematopoietic cell transplantation is considered effective without bone marrow destruction include renal cancer, malignant melanoma, low-grade lymphoma, and aplastic anemia. Bone marrow destruction is preferred for tumors with a high risk of recurrence.
  • irradiation is performed as a pretreatment for mini-transplantation, for example, a small dose TBI of about 1 to 2 Gy / l is applied.
  • reduced conditioning therapy which is an intermediate pretreatment between conventional pretreatment and mini transplantation, has also been developed. These pretreatments can also be used in the present invention.
  • GVHD is an important factor in determining the survival prognosis after allogeneic transplantation
  • immunosuppressive therapy is used to prevent the onset.
  • Acute GVHD usually develops within 2 to 6 weeks after allogeneic transplantation.
  • infectious diseases such as cytomegalovirus and microangiopathy due to immunosuppressants may occur.
  • force biopsies such as the skin, stomach, duodenum, large intestine, and rectum are useful. Treat patients with moderate or higher symptoms with corticosteroids. If you do not respond to steroids, Use immunosuppressants such as thymocyte globulin and tacrolimus.
  • cyclosporine and methotrexate are often used as prophylactic agents, and among unrelated individuals tacrolimus and methotrexate are often used as prophylactic agents.
  • Chronic GVHD typically occurs at a rate in long-term survivors who have received allogeneic transplants, typically around 100 days after transplantation.
  • the clinical findings are similar to autoimmune diseases such as scleroderma, lichen planus, Sjogren syndrome, and primary biliary cirrhosis, and can be diagnosed by lip and skin biopsy, liver biopsy, and so on.
  • Treatment mainly consists of cyclosporine and corticosteroids, and phototherapy such as PUVA (Psoralens with Ultraviolet A) can be performed for skin lesions.
  • Hematopoietic cell transplantation in the present invention includes, for example, aplastic anemia, leukemia (acute leukemia such as acute myeloid leukemia and acute lymphocytic leukemia, and chronic myelogenous leukemia), myelodysplastic syndrome, lymphoma (Hodgkin's disease, non-disease) (Including Hodgkin's lymphoma), hematologic diseases such as osteomyeloma, malignant tumors that are effective for chemotherapy (including breast cancer and germ cell tumor), and congenital diseases.
  • Applicable diseases can also be applied to diseases caused by single gene deficiency or abnormal expression system (promoter deficiency or abnormal control), or diseases caused by two or more gene deficiencies or abnormal expression system.
  • somatic cells such as nervous system cells and hepatocytes that can be differentiated from bone marrow stem cells as well as abnormalities in blood cells.
  • diseases caused by abnormalities in somatic cells such as nervous system cells and hepatocytes that can be differentiated from bone marrow stem cells as well as abnormalities in blood cells.
  • single gene deficiencies include X-linked SCID, ADA deficiency, hemophilia, ammunoglobulinemia, hyper-IgMemia, chronic granulomatosis, etc. Nocturnal hemoglobinuria and the like, and therapeutic effects can be expected by performing cell transplantation after introducing each causative gene into hematopoietic stem cells.
  • Examples of diseases and genes for which gene therapy in hematopoietic cell transplantation is considered to be effective include, for example, Hurler disease, Scheie disease, and Hurler-Scheie disease (—L—lduronidase 7 ⁇ lduronate sulfatase), SanfilippoM (N — Sulfatase, N-acetyl--D-glucosaminidase, a-D-flucosaminidase-N-acetyltransferase), Morquio disease (galac tosamine- ⁇ -sulfate sulfatase or ⁇ -galactosidase), Maroteaux-Lamy syndrome (N-acetylgalactosamine— 4— sulphatase), 3 ⁇ 4ly3 ⁇ 4 ( ⁇ -glucuronidase), Gaucherji ⁇ , ⁇ -gluco cerebrosidase), Farber disease (acid ceramidase), Niemann—Pick ⁇ (acid
  • Ucosidase Ucosidase
  • Guibaud-Vainsel syndrome carbonic anhydrase II
  • Thallassemias ct- ⁇ -globin
  • G6PD deficiency glue ose-6-phosphate dehydrogenase
  • PK deficiency pyruvate kinase L type
  • Erythropoietic porphyia uroporphyrinogen III synthase
  • purine nucleoside phosphorylase PNP
  • X-linked severe combined immunodeficiency is the causative gene for purine nucleoside phosphophorylase deficiency Is IL-2 Receptor Y chain ( ⁇ C)
  • Tsu the X chromosome-linked chronic granulomatous disease, such as Te is one of the subunits constituting the NADPH Okishidaze gp91 can be exemplified.
  • a malignant tumor and hematologic malignancies solid In the case of stem cell transplantation, it is possible to enhance the antitumor effect by introducing a chimeric toxin gene that targets a tumor-specific molecule, etc.
  • mice 7-week-old female C57BL / 6J mice and Balb / c mice (KBT Oriental), GFP transgenic mice C57BL / 6—TgN (act—EGFP) OsbC14—Y01—FM131 (Okabe M, Ikawa M, Kominami K, Nakanishi T, Nishimune Y. FEBS Lett. 1997; 407: 313-319) were used as donors, and C57BL / 6 and Balb / c nu / nu were used as recipients.
  • Plasmid pSeV 18 + / dF-GFP which is a vector template for SeV 18 + / dF-GFP (hereinafter referred to as SeV / dF-GFP) lacking the F gene and carrying the GFP gene, is the full-length cDNA of Sendai virus Z strain. It was created by inserting the GFP cDNA, the donor nucleic acid, into the Notl cleavage site artificially constructed into the spacer sequence inserted between the leader sequence and the NP gene, and then deleting the F gene region.
  • tsSeV / dF-GFP For SeV 18+ / dFM ts HN ts PLmut-GFP (hereinafter tsSeV / dF-GFP), M gene (G69E, T116A, A183S), HN gene (A262T, G264R, K461G), and P, A mutation was inserted into the L gene (P gene: L511F, L gene: N1197S, K1795E) (Inoue M, et al. J Virol 2003; 77: 3238-3246; Inoue M, et al. Mol. Ther. 2003; 7 (5): S37) G
  • the F gene product is required for vector reconstitution, it can be increased by feeding into trans using LLC-MK cells that continuously express the F protein.
  • Bone marrow cells collected from the femur of donor mice were flushed with a syringe with a 23 gauge needle in 10% FBS + RPMI1640 (Gibco BRL). Thereafter, erythrocytes are removed with Lysing buffer (0.38% NH CI in Tris-HCl, pH7.65), and anti-red blood cells are completely removed to completely remove mature T cells.
  • Bone marrow cells were reacted with Thyl.2 antibody (mouse ascites IgM monoclonal antibody, Meiji Dairies Co., Ltd., Health Science Institute, Tokyo) and Usagi complement (CL3051, CEDARLANE, Ontario CANADA).
  • Thyl.2 antibody mouse ascites IgM monoclonal antibody, Meiji Dairies Co., Ltd., Health Science Institute, Tokyo
  • Usagi complement CEDARLANE, Ontario CANADA
  • MOI multiplicity of infections
  • Recipient mice C57BL / 6 were injected with 2 x 10 so 200 ⁇ l, and nu / nu-BALB / C was injected with 4 x 10 so 200 ⁇ l each via a 30-gauge syringe. These recipient mice were irradiated with gamma rays 4-6 hours before transplantation, with C57 BL / 6 giving a lethal dose of 10 Gry and nu / nu-BALB / C giving a sublethal dose of 7 Gry.
  • FK506 tacrolimus, Fujisawa Pharmaceutical Co., Ltd., Osaka
  • No-spleen mice were laparotomized 2 days before transplantation and the spleen was removed.
  • Peripheral blood at 1, 4, 8, and 12 weeks after bone marrow transplantation was collected from the tail vein, and GFP positive cells were analyzed by FACS.
  • erythrocytes were removed from the peripheral blood with a lysing buffer, washed twice with HANK S solution, and then adjusted to about Ixl0 5 to lxl0 6 / ml.
  • PI propidium iodide staining was performed to exclude dead cells.
  • Target cells (EL4: American Type Culture Collections) was adjusted to 1 x 10 6/200 ⁇ 1 , was added S eV peptide M. After adding O.lmCi Na 51 CrO to the cells and shaking well,
  • % specinc release ((.experimental cpm-spontaneous cpm no Amaximum cpm-spont aneous cpm)) X 100
  • the SeV peptide is an NP protein amino acid sequence NH-FAPGNYPAL-COOH (the target sequence of CTL that has already been reported and has been clearly demonstrated to be presented to class I antigens.
  • SEQ ID NO: 11 was synthesized and used.
  • the tsSeV / dF-GFP NP protein does not have the same site.
  • Fig. 1 we examined the distribution of GFP-expressing cells in the hematopoietic system using 6 mice with relatively high engraftment efficiency (Fig. 2).
  • the GFP positive rate at 5 weeks in these 6 peripheral bloods was 55.9 ⁇ 5.9%, which was relatively high in the spleen and thymus, but 17.1 ⁇ 8.8% in the lower limb femur bone marrow.
  • NK cells CD3— / DX5 +
  • NKT cells CD3 + / DX5 +
  • whole T-cells CD3 + / DX5—
  • helper T—cells CD3 + / CD4 +
  • cytotoxic T—cells CD3 + / CD8
  • dendritic cells DCs
  • DCs CDllb / CDllc
  • monocytes / macrophages M ⁇
  • M ⁇ CD llb + / CDllc ⁇
  • B-cells B220 + / IgM + were used.
  • NK, DC, ⁇ , and ⁇ showed relatively high positive rates. Although the positive rate for sputum and sputum is relatively low, the sputum cell fraction of the transplanted cells is almost completely removed, so that GFP-positive sputum / spider cells detected in the recipient's spleen 'bone marrow It was considered that hematopoietic stem cells were derived rather than the isolated ⁇ / ⁇ cells.
  • mice When bone marrow cells treated with tsSeV / dF-GFP were transplanted in a similar manner to a total of 53 C57BL6 mice, about 40% of mice died 5 to 7 weeks after transplantation (Fig. 4a). For these mice, peripheral blood was collected at 1 and 4 weeks after transplantation to confirm GFP-positive cells. However, in the blood collection at 4 weeks of dead mice, all cases had a relatively good GFP-positive rate ( In addition to more than 10%) blood dilution was observed. Therefore, we examined the number of blood cells in mice with a good survival rate 4 weeks after transplantation.
  • Fig. 5a shows the slight increase in CTL activity 3 ⁇ 4 Daily of FK506, which mainly suppresses cellular immunity, in order to investigate whether it is significantly involved in the decrease in the number of GFP-positive cells derived from ssV / dF-GFP Administration (5 mg / kg / day from 2 weeks after transplantation) and cell engraftment dynamics in nude mice were examined.
  • Fig. 5b the increase in cell engraftment was not observed in both cases, indicating that CTL was effective in eliminating transgenic cells in recipient mice transplanted with tsSeV / dF-GFP transgenic bone marrow. Engagement was considered relatively low.
  • GFP-positive T cells are derived from donor-derived GFP-positive T cells that should have been removed at least partially in the recipient bone marrow or spleen blood cells of tsSeV / dF-GFP transgenic bone marrow cells.
  • Cells are donor cells that have been gener- ated by tsSeV / dF-GFP It may be derived from the hematopoietic stem cells in the middle.
  • the recipients of tsSeV / dF-GFP transgenic bone marrow cells include a group that dies with relatively high repopulation and a group that is rapidly eliminated after 4 weeks. It was hypothesized that the gene transfer efficiency was low in the latter.
  • Bone marrow cells collected from the femur of donor mouse C57BL / 6 are in 10% immobilized FBS (bio-west, Inc., UT) + RPMI 1640 culture solution (Sigma, Mo) (hereinafter RPMI1640 complete culture solution) Flushed with a syringe with a 23 gauge needle. After that, red blood cells are lysed with Lysing buffer (0.38% NH
  • MOI multiplicity of infections
  • Peripheral blood was collected from the tail vein weekly after bone marrow transplantation, and GFP-positive cells were analyzed using a FACS iron.
  • erythrocytes were removed from peripheral blood with lysing buffer, washed twice with HANKS solution, and adjusted to about 1 ⁇ 10 5 to 6 cells / ml.
  • PI sodium iodide
  • FACS Caliber Becton Dickinson
  • Use CellQuest software (Becton Dickinson) for 7 prices.
  • peripheral blood was collected from the tail vein of mice using a blood collection tube, allowed to stand at room temperature for 30 minutes, and then centrifuged at 10,000 rpm for 5 minutes. The supernatant was stocked and stored at -80 ° C.
  • the serum was thawed at room temperature, and the anti-SeV antibody titer in the serum was determined using a MONILISA TM HVJ Enzyme-linked Immunosorbent Assay kit (Wakamoto Pharmaceutical Co., Ltd., Tokyo).
  • peripheral blood is collected from the tail vein of the mouse with a blood collection tube, diluted with peripheral blood 201 1 with dilution solution 501, and fully automated hemocytometer in Zida blood mode.
  • Celltac a MEK-6158, Nihon Kohden, Tokyo.
  • TriSeV-BMT showed an average GFP positivity of 5% or more at the 8th week after transplantation, the mortality rate decreased, and it survived for a long time (Figs. 8 and 9). Expression continued thereafter, and at 12 w, the GFP positive rate decreased to 0.1% or less.
  • the anti-SeV antibody titer there was no clear tendency as in the case of tsSeV / dF-BMT (FIG. 11).
  • M / F / HN 3 gene deletion type SeV genomic cDNA (1) M / F / HN3 gene deletion type SeV vector (SeV18 + NotI / PLmut ⁇ M ⁇ F ⁇ ) which has restriction enzyme Notl recognition site in front of NP gene and M / F / HN gene deletion site with Pad site A cDNA (pSeV18 + NotI / PLmut ⁇ F ⁇ HN-Pad) encoding the viral genome of HN-Pad was constructed by the following procedure. 9 types of mutations derived from 6 types of temperature-sensitive mutations (M: G69E, T116 A, A183S, HN: A262T, G264R,! 461 and persistent infection 36 ⁇ ) (?
  • the F gene-deficient SeV vector (SeV18 + NotI / MtsHNtsPLmut ⁇ F-GFP: WO03 / 025570) carrying the GFP gene and the cDNA (pSeV18 + NotI / MtsHNtsPLmut ⁇ F-GFP)
  • a plasmid (Litmu s-) containing a fragment containing M, HN and GFP genes digested with Sail and Nhel (8294 bp) subcloned into the Sall / Nhel site of Litmus38 (New Engl and Biolabs, Beverly, MA) MtsHNtsPmut ⁇ F- GFP: WO03 / 025570) as a template, primer (delMF HN-PacF: o -gaggtcgcgcgttaattaagctttcacctcaaacaagcacagatcat
  • the fragment (5008bp) recovered after digestion is ligated, M / F / HN3 gene deletion type SeV vector having Notl site in front of NP gene and M / F / HN gene deletion site with Pad site CDNA (pSeV18 + NotI / PLmut ⁇ F ⁇ HN-Pad) was constructed (FIG.
  • a gene of interest such as a therapeutic gene is loaded on a Sendai virus vector
  • a GOI gene fragment with a Sendai virus stop signal, intervening sequence, and start signal downstream of the gene is used in the Notl site. It is convenient to insert them (WO00 / 70070, WO03 / 025570, etc.).
  • the expression level of the loaded gene depends on the insertion position in the vector. Differently, the polar expression (Tokusumi T. et al.) Is known in that the expression level is higher on the 3 'side of the (-)-strand RNA genome and the expression level decreases toward the 5' side (Tokusumi T. et al. Therefore, high GOI expression can be expected by introducing the GOI gene into the Notl site of SeV18 + NotI / PLmut AMAFA HN-Pad. It is also possible to additionally load a second gene using the Pad site.
  • M / F / HN3 gene deletion type SeV vector (SeV18 + BssHII / PLmut ⁇ M ⁇ F ⁇ HN with BssHII site in front of NP gene and Notl site at M / F / HN gene deletion site -Notl)
  • cDNA (pSeV18 + BssHII / PLmut ⁇ F ⁇ HN-Notl) was constructed by the following procedure. First, a Notl site was introduced into the M / F / HN gene deletion site.
  • Litmus- Pmut AMAF ⁇ ⁇ - Pad as a template, primer (pF (dMdFdHN- Notl): 5'- gaaaaacccaggg tgaaagggcggccgcccataggtcatggatgg— 3 '( ⁇ ⁇ U number: 15), and pR (dMdFdHN— Notl): 5 tat ccatgg -3, (Self column number: 16)) was used to introduce mutations to construct Litmus-Pmut AMAFA HN-Notl (Fig. 14). Mutagenesis was performed using the QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene, La Jolla, Calif.) According to the method described in the kit.
  • the Notl site in front of the NP gene was converted to the BssHII site.
  • pSeV / A SallNhelfrg-MCS as a template, primer (pl8 + BssHII- FW: 5-ctgccaaagttcacgcgcgcgtagatcttcacgatgg- ( ⁇ 3 ⁇ 4 ⁇ No .: 1 and pl8 + BssHII- RV: Se ⁇ : 18)) was used for mutagenesis to construct pSeV18 + BssHII / A SalINheIfrg- MCS (Fig. 15). , CA) was used according to the method described in the kit.
  • this vector can be used in cases where cytotoxicity occurs or the recovery rate of the vector is poor or the production volume is poor. It is also possible to load the second gene using the BssHII site.
  • M / F / HN3 gene deletion type SeV vector (SeV18 + NotI / PLmut ⁇ M ⁇ F ⁇ HN-GFP: SeV) which has green fluorescence protein (GFP) gene at M / F / HN gene deletion site / PLmut ⁇ M ⁇ F ⁇ HN—GFP (also referred to as GFP)
  • GFP green fluorescence protein
  • an F gene-deficient SeV vector cDNA containing the GFP gene (pSeV18 + / ⁇ F-GFP: WO03 / 025570) as the Ten pre-1 ⁇ ⁇ door, Fufima 1 ⁇ (pGFP_Sg N:! 5 Mr.
  • this vector can easily insert other GOI genes using the Notl site in front of the NP gene, and after identifying the transfected cells by GFP fluorescence, the effect of the GOI gene (treatment The effect (function analysis etc.) can be examined.
  • the Cre / loxP-inducible expression plasmid that expresses the M, F, and HN genes was constructed by amplifying the M, F, and HN genes by PCR and inducing the gene product by Cre DNA recombinase. Amplification product at the unique site Swal site (or the same site after converting the site to EcoRI recognition sequence) of the generated plasmid pCALNdlw (Arai, T. et al., J. Virology 72, 1998, pi 115-1121) Built by inserting.
  • PCA LNdLw / F (WO00 / 70070) used for F gene transfer has a neomycin resistance gene
  • pCALNdLw / hygroM (WO03 / 025570) used for M gene transfer has a hygromycin metagene! /
  • Cre / loxP-inducible M, F and HN gene expression plasmids expressing Blasticidin Sffif sex gene (Invitrogen, Groningen, Netherlands) as a selection marker were newly constructed (FIGS. 19 and 20).
  • the neomycin resistance gene of the pCALNdLw plasmid was first replaced with the blasticidin S resistance gene.
  • pCALN dLw was digested with Spel and EcoT22I, separated by agarose electrophoresis, and then a band corresponding to a fragment containing neomycin resistance gene (265 lbp) and a fragment containing ampicillin resistance gene (3674 bp) were cut out and QIAquick Collected with Gel Extraction Kit.
  • the collected fragment (265 lbp) containing the neomycin metagene was further digested with Xho I, and after electrophoresis, a fragment (1761 bp) not containing the neomycin resistance gene was excised and collected using the QIAquick Gel Extraction Kit.
  • the fragment (3674 bp) containing the ampicillin resistance gene was purified by QIAquick PC R purification Kit after dephosphorylation.
  • the blasticidin Sffif sex gene is based on pTEFl / Bst (Invitrogen, Groningen, Netherlands) as a template.
  • PCR was carried out using the ima and collected by QIAquick PCR Purification Kit and then digested with Xhol and EcoT22I. These three fragments were ligated to produce pCALNdLw / bst.
  • digest pCALNdLw-bst with Xhol isolate and purify the fragment (1033bp) containing the drug resistance gene, and recombine with the Xho I fragment containing the drug resistance genes of pCALNdLw / hygroM, pCALNdLw / F and pCALNdLw / zeoHN.
  • PCALNdLw / bstM, pCAL NdLw / bstF, and pCALNdLw / bstHN were constructed, respectively.
  • helper cells that express SeV-M, F, and HN proteins.
  • F gene To create helper cells that express SeV-M, F, and HN proteins, first introduce the F gene to create F protein expression helper cells, then introduce the M gene to create M and F protein expression helper cells. Then, M and F genes were introduced again together with the HN gene, and helper cells expressing M, F and HN proteins were produced.
  • Helper cells expressing F protein were created following the method of Li et al. (Li, H.-O. et al, J. Virology 74, 6564-6569 (2000), WO00 / 70070).
  • LipofectA MINE PLUS reagent Invitrogen, Groningen, Netherlands was used as described in the protocol. That is, the following method was taken. LLC-MK cells at 5xl0 5 cells / dish 60m
  • the liquid mixture was added. After incubation for 3 hours in a 37 ° C, 5% CO incubator,
  • D-MEM D-MEM containing 20% FBS was added and cultured for 24 hours. After incubation, the cells are detached with trypsin, diluted to a density of approximately 5 cells / wel 1 or 25 cells / well in a 96-well plate, and D containing 10% FBS containing 500 g / mL G418 (Gibco-BRL, Rockville, MD). -Cultured in MEM for about 2 weeks. The clone that spread from a single cell was expanded to a 6-well plate. About the obtained clone, F protein expression level was analyzed semi-quantitatively by Western-blotting.
  • Recombinant adenovirus (AxCANCre) expressing Cre DNA recombinase diluted in MEM containing 5% FBS was seeded on a 12-well plate in a confluent state.
  • the method of Saito et al. (Saito, I. et al., Nucl. A cid. Res. 23, 3816—3821 (1995), Arai, T. et al., J. Virol. 72, 1115—1121 (1998)). After culturing at 32 ° C. for 2 days, the culture supernatant was removed, washed once with PBS, and the cells were detached with a cell scraper to recover the cells.
  • Helper cells expressing M and F proteins were created by introducing the M gene according to the method of [5] above based on LLC / F / # 33. That is, the following method was taken. LLC / F / # 33 cells were seeded in 60 mm dishes at 5xl0 5 cells / dish and cultured in D-MEM containing 10% FBS for 24 hours. Dilute 1 ⁇ g of pCALNdLw / hygroM in D-MEM without FBS and antibiotics (total amount: 242 ⁇ L). After stirring, add 8 ⁇ L of LipofectAMINE PLUS reagent, stir again, and let stand at room temperature for 15 minutes .
  • Recombinant adenovirus (AxCANCre) expressing Cre DNA recombinase diluted in MEM containing FBS was prepared by the method of Saito et al. (Saito, I. et al., Nucl. Acid. Res. 23, 3816-3821 (1995), Arai , T. et al "J. Virol. 72, 1115-1121 (1998)). After incubation at 32 ° C for 2 days, the culture supernatant was removed and washed once with PBS. After removing the cells with a scraper, the cells were collected, and 1/5 volume was applied per lane, SDS-PAGE was performed, and then anti-M antibody (N-39F: Inoue, M.
  • Helper cells expressing M, F and HN proteins were created by introducing the HN gene according to the above method [5] based on LLC / F / M / # 72-17. At this time, the M and F genes were simultaneously introduced again. That is, the following method was taken. LLC / F / M / # 72-17 cells were seeded in a 60 mm petri dish at 5xl0 5 cells / dish and cultured in D-MEM containing 10% FBS for 24 hours.
  • Recombinant adenovirus (AxCANCre) expressing Cre DNA recombinase diluted in MEM containing 5% FBS was sown in a 12-well plate and almost confluent.
  • the method of Saito et al. (Saito, I. et al., Nucl Acid. Res. 23, 38 16-3821 (1995), Arai, T. et al "J. Virol. 72, 1115-1121 (1998)) at MOI 5.
  • plasmids pSeV18 + NotI / PLmut ⁇ M ⁇ F ⁇ HN-GFP, pGEM / NP, pGEM / P, pGEM / L and pGEM / F-HN Kato, A et al "Genes Cells 1, 569-579 (1996)) with Opti-MEM (Gibco-BRL, Rockville, MD) at 12 g, 4 g, 2 g, 4 g and 4 ⁇ g / dish ratios, respectively.
  • the medium was changed with MEM containing 40 ⁇ g / mL AraC and 7.5 ⁇ g / mL Trypsi n, and further cultured at 37 ° C. for 2 days (P0). These cells were harvested and the pellet was suspended in Opti-MEM per 2 mL Zdish. After freeze-thawing three times, a lysate was prepared, and the cells of [7] above were evaluated using this lysate.
  • the titer of SeV18 + NotI / PLmut ⁇ M ⁇ F ⁇ HN-GFP (SeV / PLmut ⁇ F ⁇ HN—GFP) prepared using this helper cell (TriRE # 7) is lxlO 8 GFP—CIU / mL or more (the definition of GFP—CIU is described in WO00Z70070), and we have successfully prepared sufficient titers that can be used for in vitro and in vivo experiments. Further, it can be further concentrated by a general method such as centrifugation.
  • hematopoietic cell transplantation using transgenic hematopoietic cells using a non-chromosomal cytoplasmic vector has become possible. Since the method of the present invention does not involve integration into the host chromosome, the gene can be introduced without risk of inactivation of the tumor suppressor gene or activation of the oncogene, and is safe. It is possible to construct a vector system. Because there are cases where hematopoietic cell transplantation is not effective for congenital immunodeficiency diseases, these treatments are the only options that remain with gene therapy. Expected to apply the method of the present invention to new gene therapy for these intractable diseases. Is done.

Abstract

［課題］　本発明は、染色体非組込型ウイルスベクターを用いて、遺伝子導入造血細胞を含む造血細胞移植組成物を製造する方法を提供する。また本発明は、染色体非組込型ウイルスベクターを用いて遺伝子導入した造血細胞から、血液細胞を再構築させる方法を提供する。 ［解決手段］　マイナス鎖RNAウイルスベクターを造血細胞に導入し、この細胞を造血細胞移植することにより、導入遺伝子を発現する血液細胞を再構築することができる。遺伝子導入造血細胞は、移植された体内において白血球、赤血球、血小板に分化することができた。本発明は、造血細胞移植における遺伝子治療における、宿主染色体損傷の危険がない安全な遺伝子導入システムを提供する。

Description

遺伝子導入造血細胞から血液細胞を再構築させる方法
技術分野
[0001] 本発明は、遺伝子導入造血細胞を含む造血細胞移植のための組成物に関する。
また本発明は、遺伝子導入造血細胞から血液細胞を再構築させる方法に関する。本 発明の方法は、造血細胞移植における細胞染色体非損傷型の遺伝子治療に適用さ れ得る。
背景技術
[0002] X連鎖重症複合免疫不全症 (X-linked SCID)など、単一遺伝子異常による難治性 疾患に対する新たな治療法として遺伝子治療が期待されて 、る。 2000年にはフラン スにおいて、 CD34陽性造血幹細胞に対し原因遺伝子である共通ガンマ鎖（common γ -chain)遺伝子をレトロウイルスベクターにて導入し、 11例中 9例で有効であったこ とが報告された（Cavazzana- Calvo M. et al.， Science 2000;288:669-672) 0しかしそ の後、 2例の患児に T細胞性白血病が発生し、同様なベクターや治療系に対する警 鐘が成された（Kaiser J., Science 2003;299:495； Hacein— Bey— Abina S. et al, Scienc e 2003;302:415-419) oその後の解析によりこの 2例には T細胞の発生に必要、かつ 胸腺で発現が消失すべき遺伝子である LM02の恒常的活性ィ匕を認めることが報告さ れている（Hacein- Bey- Abina S. et al., Science 2003;302:415-419; Fischer A. et al" N Eng Journal Med 2004;350:2526-2527) 0現在、この LM02の恒常的活性化はこの 臨床研究プロトコールに特異的なものではないかと考えられている力 レトロウイルス ベクターのプロウィルスゲノムの宿主染色体内への取り込み自体力 癌抑制遺伝子 の不活ィ匕や癌遺伝子の活性ィ匕の原因となり得る可能性は否定できず、根本的な問 題点と考えられて 、る。この潜在的危険性は同様に染色体へ遺伝子を組み込むァ デノ随伴ウィルスベクター (AAV)、レンチウィルスベクターでも想定されている。先天 性免疫不全性疾患には骨髄移植が有効性を示さない症例が存在するため、これら の患児には遺伝子治療のみが残されたオプションとなる。従ってこれまでの染色体組 込型ベクターと異なる概念に基づく新しいかつ安全なベクターシステムの構築が望ま れている。
非特許文献 l : Cavazz編- Calvo M. et al., Science 2000;288:669-672
非特許文献 2 : Kaiser J., Science 2003;299:495
非特許文献 3 : Hacein- Bey- Abina S. et al., Science 2003;302:415-419
非特許文献 4 : Fischer A. et al., N Eng Journal Med 2004;350:2526-2527
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0003] 本発明は、染色体非組込型ウィルスベクターを用いて、遺伝子導入造血細胞を含 む造血細胞移植組成物を製造する方法を提供する。また本発明は、染色体非組込 型ウィルスベクターを用いて遺伝子導入した造血細胞から、血液細胞を再構築させ る方法を提供する。
課題を解決するための手段
[0004] 本発明者らは、造血細胞移植にお!、て、造血細胞の染色体を損傷させることのな Vヽ安全な遺伝子導入を可能にするため、染色体非組込型ウィルスを用いる方法の開 発を行った。このために、染色体非組込型ウィルスの 1つであるマイナス鎖 RNAウイ ルスを用いて造血細胞に遺伝子を導入し、この造血細胞からの血球系の再構築を試 みた。まず、マウス大腿骨より赤血球 ·Τ細胞を除去した骨髄細胞を調製し、外来遺 伝子を組み込んだマイナス鎖 RNAウィルスを感染させ遺伝子導入骨髄細胞を作製し た。そして、放射線照射により骨髄破壊 (myeloablation)を施行したマウスに、この遺 伝子導入骨髄細胞を注入する実験を行った。その後の生体内における移入骨髄細 胞の生着動態と免疫学的反応を検討したところ、マイナス鎖 RNAウィルスベクターが 導入された骨髄細胞はレシピエント内で生着し、 T細胞を含む血球系細胞の repopula tionが確認された。本発明は、染色体非傷害型細胞質型ベクターを用いた遺伝子導 入造血細胞による血球系再構築を初めて開示するものであり、マイナス鎖 RNAウィル スベクターを用いることにより、細胞の染色体を組み換えることなく遺伝子導入した移 植造血細胞から血球系統の repopulationが可能であることを実証するものである。特 にエンベロープ構成蛋白質をコードする遺伝子に変異または欠損を有するマイナス 鎖 RNAウィルスベクターを用いれば、長期間安定して血球系細胞の再構築が行われ ることが判明した。本発明により、染色体損傷を懸念することなぐ安全に造血細胞移 植における遺伝子治療を実施することが可能となる。
すなわち本発明は、造血細胞移植に適した遺伝子導入造血細胞組成物およびそ の製造方法、およびマイナス鎖 RNAウィルスベクターを用いて遺伝子導入した造血 細胞力 血液細胞を再構築させる方法等に関し、より具体的には、請求項の各項に 記載の発明に関する。なお同一の請求項を引用する請求項に記載の発明の 1つま たは複数の組み合わせ力 なる発明は、それらの請求項に記載の発現に既に意図 されている。すなわち本発明は、
〔1〕造血細胞移植組成物の製造方法であって、マイナス鎖 RNAウィルスベクターを 造血細胞に導入し、該造血細胞および薬学的に許容される媒体を含む組成物を調 製することを含む方法、
〔2〕マイナス鎖 RNAウィルスベクター力 エンベロープ構成蛋白質をコードする 1つま たは複数の遺伝子が変異または欠損している、〔1〕に記載の方法、
〔3〕エンベロープ構成蛋白質をコードするすべての遺伝子が変異または欠損してい る、〔2〕に記載の方法、
〔4〕エンベロープ構成蛋白質をコードする少なくとも 1つの遺伝子が欠損している、〔 2〕または〔3〕に記載の方法、
〔5〕該少なくとも 1つの遺伝子が F遺伝子である、〔4〕に記載の方法、
〔6〕エンベロープ構成蛋白質をコードするすべての遺伝子が欠損している、〔4〕に記 載の方法、
〔7〕マイナス鎖 RNAウィルスがパラミクソウィルス科ウィルスである、〔1〕から〔6〕の!ヽ ずれかに記載の方法、
〔8〕パラミクソウィルス科ウィルスがセンダイウィルスである、〔7〕に記載の方法、 〔9〕〔1〕から〔8〕のいずれかに記載の方法により得られる造血細胞移植組成物、 〔10〕遺伝子導入された血液細胞を造血細胞力 生成させる方法であって、
(a)マイナス鎖 RNAウィルスベクターを造血細胞に接触させる工程、および
(b)工程 (a)の造血細胞を動物に注入する工程、を含む方法、
〔11〕工程 (b)の注入前に該動物を免疫抑制する工程をさらに含む、〔10〕に記載の 方法、
〔 12〕マイナス鎖 RNAウィルスベクターにお!/、て、エンベロープ構成蛋白質をコードす る 1つまたは複数の遺伝子が変異または欠損している、〔10〕または〔11〕に記載の方 法、
〔13〕エンベロープ構成蛋白質をコードするすべての遺伝子が変異または欠損して いる、〔12〕に記載の方法、
〔14〕エンベロープ構成蛋白質をコードする少なくとも 1つの遺伝子が欠損している、 〔12〕または〔13〕に記載の方法、
〔15〕該少なくとも 1つの遺伝子が F遺伝子である、〔14〕に記載の方法、
〔16〕エンベロープ構成蛋白質をコードするすべての遺伝子が欠損している、〔14〕 に記載の方法、
〔17〕マイナス鎖 RNAウィルスがパラミクソウィルス科ウィルスである、〔10〕から〔16〕 のいずれかに記載の方法、
〔18〕パラミクソウィルス科ウィルスがセンダイウィルスである、〔17〕に記載の方法、に 関する。
発明の効果
[0006] 本発明にお ヽて、染色体非組み込み型の細胞質型ベクターにより遺伝子導入され た造血細胞力 生体内で repopulationが可能であることが初めて実証された。レシピ ェントにおいて、外来遺伝子を発現するドナー由来の T細胞が検出されたことから、 マイナス鎖 RNAウィルスベクターが導入された造血幹細胞から repopulationが起こつ たことが支持される。マイナス鎖 RNAウィルスは、細胞質で転写'複製し、細胞核の染 色体遺伝子に相互作用しない。本発明は、例えば先天性免疫不全症などの造血系 疾患に対する宿主染色体非傷害遺伝子治療を可能とする。
図面の簡単な説明
[0007] [図 l]a.フローサイトメトリーによる T細胞除去ドナー（C57BL6マウス）骨髄細胞への Se V/dF- GFP及び tsSeV/dF- GFPによる遺伝子導入効率解析。代表的プロファイルを 示す図である。 SeV/dF-GFPの遺伝子導入効率は80.7±2.9% (n=3)、tsSeV/dF-GFP の場合は 88.8 ± 1.9% (n=18)であった。 b. C57BL6系統 GFPトランスジエニックマウス（ GFP-TG)より採取した骨髄、あるいは SeV/dF-GFPもしくは tsSeV/dF-GFPで遺伝子 導入した C57BL6マウス骨髄を同種レシピエントへ移植した場合の、末梢血血球細胞 における GFP陽性率の経時的変化を示す図である。縦軸は対数表示である。
[図 2]フローサイトメトリーによる、 tsSeV/dF- GFPで遺伝子導入した C57BL6マウス骨 髄を同種レシピエントへ移植した場合の、各種臓器における GFP陽性率 (移植後 5週 、計 6頭)を示す図である。図 1で解析した個体のうち、 4週目の末梢血にて生着率の よいものを選択して解析した。代表的プロファイルを示す。括弧内の数字は、平均値 士標準誤差％(n=6)を示す。
[図 3]フローサイトメトリーによる、 tsSeV/dF- GFPで遺伝子導入した C57BL6マウス骨 髄を同種レシピエントへ移植した場合の、脾臓'骨髄における各血球細胞分画にお ける GFP陽性率 (移植後 5週、計 6頭)を示す図である。
[図 4]a. tsSeV/dF-GFPで遺伝子導入した C57BL6マウス骨髄を同種レシピエントへ 移植した場合の、生存率の経時的変化 (計 53頭)を示す図である。 b.非処理 C57BL 6マウス、 tsSeV/dF- GFPで遺伝子導入したマウスある!/、は GFPトランスジエニックマウ スの骨髄を同種レシピエントへ移植した場合の、末梢血における白血球数 (WBC)、 赤血球数（RBC)、血小板数（PLT) (移植後 4週）を示す図である。 tsSeV/dF-GFPの みに著明な汎血球減少を認める。
[図 5]a. tsSeV/dF-GFPで遺伝子導入した C57BL6マウス骨髄を同種レシピエントへ 移植した場合の、 SeV特異的 CTL活性 (移植後 4週）を示す図である。括弧内の数字 は、各個体における同時期の末梢血中 GFP陽性細胞率を示す。各個体につき、 3つ 培養ゥエルに標的細胞を播種、各データは 3ゥエルの平均値、エラーバーは標準誤 差を示す。 b. tsSeV/dF- GFPで遺伝子導入した C57BL6マウス骨髄を同種レシピエン トへ移植した場合 (n=10)、また同様のマウスに移植後 2週目より FK506 (5 mg/kg/day )を腹腔内連日投与 (n=7)、そして tsSeV/dF- GFPで遺伝子導入した balb/cマウス骨 髄を同種ヌードマウスへ移植した場合の末梢血 GFP陽性細胞の経時的変化を示す 図である。いずれの操作においても、 GFP陽性率の低下を阻止できな力つた。
[図 6]a. tsSeV/dF-GFPで遺伝子導入した C57BL6マウス骨髄を同種レシピエントへ 移植した場合 (総個体数 n=34)の、 5週以内死亡群 (n=ll、白三角）及び長期生存群 (n=23、黒四角）における末梢血 GFP陽性細胞率 (縦軸）と血清中抗 SeV抗体価 (横 軸)の相関 (移植後 4週）を示す図である。死亡個体群では、末梢血 GFP陽性率が高 ぐさらに抗 SeV抗体価が低いことに注意。 b.上記 a.に示したデータを 2群 (死亡群、 生存群）に分けてそれぞれ GFP陽性率 (左）、抗 SeV抗体価 (右)を比較したバーグラ フである。エラーバーは標準誤差を示す。
[図 7]tsSeV/dF-GFPで遺伝子導入した C57BL6マウス骨髄を、単独で同種レシピエン トへ移植した場合 (ts-BMT, n=3)及び同骨髄を同量の無処置骨髄と混合して移植し た場合 (ts-Mix-BMT, n=5)における、末梢血 GFP陽性細胞率の経時的変化を示す 図である。 ts-BMT群では、比較的 GFP陽性率は保たれたものの、全例が 8週以内に 死亡した。一方、混合細胞移植群では、速やかに GFP陽性細胞率が減少し、全例が 長期生存した。縦軸は対数表示である。
[図 8]tsSeV/dF- GFPもしくは、 TriSeV- GFPで遺伝子導入した C57BL6マウス骨髄を 同種レシピエントへ移植した場合の、末梢血血球細胞における GFP陽性率の経時的 変化を示す図である。縦軸は対数表示であることに注意。
[図 9]tsSeV/dF- GFPもしくは、 TriSeV- GFPで遺伝子導入した C57BL6マウス骨髄を 同種レシピエントへ移植した場合の、生存率の経時的変化 (それぞれ n=53, n=13)を 示す図である。
[図 10]血液細胞分画分析の結果を示す図である。非処理 C57BL6マウス、 tsSeV/dF- GFPもしくは、 TriSeV- GFPで遺伝子導入したあるいは GFPトランスジエニックマウス骨 髄を同種レシピエントへ移植した場合での末梢血における白血球数、赤血球数、血 小板数（移植後 4週、 TriSeV-BMTは 4,8週）。 tsSeV/dF-GFPのみに著明な汎血球減 少を認める。
[図 ll]tsSeV/dF- GFPもしくは、 TriSeV- GFPで遺伝子導入した C57BL6マウス骨髄を 同種レシピエントへ移植した場合（総個体数、各 n=34、 n=16)の、 tsSeV/dF-GFPで 5 週以内死亡群 (n=ll、白三角）、長期生存群 (n=23、黒丸)及び TriSeV-BMT群 (n=16 、 X )における、末梢血 GFP陽性細胞率 (縦軸）と血清中抗 SeV抗体価 (横軸）の相関 (移植後 4週）を示す図である。
[図 12]SeV18+NotI/PLmut Δ M Δ F Δ HN- Padの cDNA (pSeV18+NotI/PLmut Δ Μ Δ F Δ HN-Pacl)の構築手順を示す図である。
[図 13]図 12の続きを示す図である。
[図 14]SeV18+BssHII/PLmut Δ M Δ F Δ HN— Notlの cDNA (pSeV18+BssHII/PLmut Δ Μ Δ F Δ HN-Notl)の構築手順を示す図である。
[図 15]図 14の続きを示す図である。
[図 16]図 15の続きを示す図である。
[図 17]SeV18+NotI/PLmut Δ M Δ F Δ HN— GFPの cDNA (pSeV18+NotI/PLmut Δ M Δ F Δ HN- GFP)の構築手順を示す図である。
[図 18]図 17の続きを示す図である。
[図 19]選択マーカ一として Blasticidin S耐性遺伝子を発現する Cre/loxP誘導型 M, F および HN遺伝子発現プラスミドの構築を示す図である。
[図 20]図 19の続きを示す図である。
発明を実施するための最良の形態
[0008] 本発明は、マイナス鎖 RNAウィルスベクターが導入された造血細胞および薬学的に 許容される媒体を含む造血細胞移植組成物およびその製造方法を提供する。本発 明にお 、てマイナス鎖 RNAウィルスとは、マイナス鎖（ウィルス蛋白質をセンスにコー ドする鎖と相補的なアンチセンス鎖）の RNAをゲノムとして含むウィルスのことである。 マイナス鎖 RNAはネガティブ鎖 RNAとも呼ばれる。
[0009] また、マイナス鎖 RNAウィルスベクターとは、遺伝子または核酸を細胞に導入するた め担体（ベクター）としてのマイナス鎖 RNAウィルスを言う。マイナス鎖 RNAウィルスべ クタ一は外来遺伝子を持って ヽても持たなくてもよ 、。
[0010] 組み換えウィルスとは、組み換えポリヌクレオチドを介して生成したウィルス、または そのウィルスの増幅産物を言う。組み換えポリヌクレオチドとは、両端または片端が自 然の状態と同じようには結合していないポリヌクレオチドを言う。具体的には、組み換 えポリヌクレオチドは、人為的にポリヌクレオチド鎖の結合が改変 (切断および/または 結合)されたポリヌクレオチドである。組み換えポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチド合 成、ヌクレアーゼ処理、リガーゼ処理等を組み合わせて、公知の遺伝子組み換え方 法により生成させることができる。組み換えウィルスは、遺伝子操作により構築された ウィルスゲノムをコードするポリヌクレオチドを発現させ、ウィルスを再構築することに よって生成することができる。例えば、ウィルスゲノムをコードする cDNAから、ウィルス 再構成する方法が知られている（Y. Nagai, A. Kato. Microbiol. Immunol. 1999: 43; 6 13-624 )。
[0011] 本発明において遺伝子とは遺伝物質を指し、転写単位をコードする核酸を言う。遺 伝子は RNAであっても DNAであってもよ!/、。本発明にお!/、て蛋白質をコードする核酸 は、該蛋白質の遺伝子と呼ぶ。また一般に、遺伝子は蛋白質をコードしていなくても よぐ例えば遺伝子はリボザィムまたはアンチセンス RNAなどの機能的 RNAをコード するものであってもよい。一般に、遺伝子は天然由来または人為的に設計された配 列であり得る。また、本発明において「DNA」とは、一本鎖 DNAおよび二本鎖 DNAを 含む。また蛋白質をコードするとは、ポリヌクレオチドが該蛋白質を適当な条件下で 発現できるように、該蛋白質のアミノ酸配列をコードする ORFをセンスまたはアンチセ ンスに含むことを言う。
[0012] 本発明において得に好適に用いられるマイナス鎖 RNAウィルスとしては、例えばパ ラミクソゥイノレス科 (Paramyxoviridae)ウィルスのセンダイウィルス (Sendai virus),ニュ ~~ 7ッスノレ 3クイノレス (Newcastle disease virus入お 7こふく力ぜゥ ノレス (mumps virus) 、麻 ウイノレス (measles virus) ^ RSウイノレス、 respiratory syncytial virus) ^牛疫1/イノレス、 rinderpest virus) ^ジステンノ ーウイノレス (distemper virus) ^サノレノ《ラインフノレエンザゥ ィルス（SV5)、ヒトパラインフルエンザウイルス 1,2,3型、ラブドウィルス科 (Rhabdovirida e)の水抱'性口内炎ウイノレス (vesicular stomatitis virus) ^狂犬柄ウイノレス (rabies virus) 等が挙げられ、具体的には、 Sendai virus (SeV)、 human parainfluenza virus- 1 (HPIV -1)、 human parainfluenza virus- 3 (HPIV- 3)、 phocine distemper virus (PDV)、 canine distemper virus (CDV)、 dolphin molbillivirus (DMV)、 peste—des—petits— ruminants vir us (PDPR)、 measles virus (MV)、 rinderpest virus (RPV)、 Hendra virus (Hendra)、 Nip ah virus (Nipah)、 human parainfluenza virus- 2 (HPIV- 2)、 simian parainfluenza virus 5 (SV5)、 human parainfluenza virus- 4a (HPIV- 4a)、 human parainfluenza virus- 4b (H PIV— 4b)、 mumps virus (Mumps) ^および Newcastle disease virus (NDV)などが含まれ る oよりタナ しくは、 Sendai virus (SeV)、 human parainfluenza virus— 1 (HPIV— 1)、 huma n parainfluenza virus- 3 (HPIV- 3)、 phocine distemper virus (PDV)、 canine distemper virus (CDV)、 dolphin molbillivirus (DMV)、 peste—des—petits— ruminants virus (PDPR) 、 measles virus (MV)、 rinderpest virus (RPV)、 Hendra virus (Hendra) ^ Nipah virus (N ipah)、 respiratory syncytial virus (RSV)からなる群より選択されるウィルス等が挙げら れる。
[0013] 本発明において用いられるマイナス鎖 RNAウィルスとしては、特に一本鎖マイナス 鎖 RNAウィルス（非分節型（non- segmented)マイナス鎖 RNAウィルスとも言う）が好ま しい。「一本鎖ネガティブ鎖 RNAウィルス」とは、一本鎖ネガティブ鎖 [すなわちマイナ ス鎖] RNAをゲノムに有するウィルスを言う。このようなウィルスとしては、ノ ラミクソウイ ノレス (Paramyxoviridae; Paramyxovirus, Morbillivirus, Rubulavirus,およ Ό、 Pneumovir us厲等 フブ rウイノレス (Rhabdoviridae; Vesiculovirus, Lyssavirus,および βρ hemerovirus属等を含む）、フィロウイノレス（Filoviridae)、ブ-ャウイノレス (Bunyaviridae ； Bunyavirus, Hantavirus, Nairovirus,および Phlebovirus ¾r¾ ?_? ^ レナ,ノィノレ ス（Arenaviridae)などの科に属するウィルスが含まれる。
[0014] 本発明において用いられるマイナス鎖 RNAウィルスは、より好ましくは、ノ ラミクソゥ ィルス亜科（レスピロウィルス属、ルブラウィルス属、およびモルビリウィルス属を含む )に属するウィルスまたはその誘導体であり、より好ましくはレスピロウィルス属（genus Respirovirus) (パラミクソウィルス属（Paramyxovirus)とも言う）に属するウィルスまたは その誘導体である。誘導体には、ウィルスによる遺伝子導入能を損なわないように、 ウィルス遺伝子が改変されたウィルス、およびィ匕学修飾されたウィルス等が含まれる 。本発明を適用可能なレスピロウィルス属ウィルスとしては、例えばヒトパラインフルェ ンザウィルス 1型（HPIV- 1)、ヒトパラインフルエンザウイルス 3型（HPIV- 3)、ゥシパラ インフルエンザウイルス 3型（BPIV- 3)、センダイウィルス (Sendai virus;マウスパライン フルェンザウィルス 1型とも呼ばれる)、およびサルパラインフルエンザウイルス 10型（S PIV-10)などが含まれる。本発明においてパラミクソウィルスは、最も好ましくはセンダ ィウィルスである。これらのウィルスは、天然株、野生株、変異株、ラボ継代株、およ び人為的に構築された株などに由来してもよい。
[0015] マイナス鎖 RNAウィルスベクターはウィルスゲノム RNAに搭載遺伝子をアンチセンス にコードしている。ウィルスゲノム RNAとは、マイナス鎖 RNAウィルスのウィルス蛋白質 と共にリボヌクレオプロテイン (RNP)を形成し、該蛋白質によりゲノム中の遺伝子が発 現し、この RNAが複製されて娘 RNPが形成される機能を持つ RNAである。ゲノム RNA は、ウィルス遺伝子に変異および/または欠損があるものや、外来遺伝子が組み込ま れるなどして改変されたものであってもょ 、。一般にマイナス鎖 RNAウィルスのゲノム は、 3'リーダー領域と 5'トレイラ一領域の間に、ウィルス遺伝子がアンチセンス配列と して並んだ構成をしている。各遺伝子の ORFの間には、転写終結配列 (E配列） -介 在配列 (I配列） -転写開始配列 (S配列）が存在し、これにより各遺伝子の ORFをコー ドする RNAが別々のシストロンとして転写される。本発明のウィルスに含まれるゲノム R NAは、該 RNAと RNPを構成するマイナス鎖 RNAウィルス蛋白質をコードしている。伹 し、マイナス鎖 RNAウィルスのゲノム RNAはマイナス鎖であるから、これらの蛋白質は アンチセンスとしてコードされて 、る。ゲノム RNAと RNPを構成するマイナス鎖 RNAウイ ルス蛋白質とは、マイナス鎖 RNAウィルスのゲノム RNAと複合体を形成し、ゲノム RNA の複製およびゲノムにコードされて 、る遺伝子の発現および RNA自身の自律的な複 製に必要とされるウィルス蛋白質群を言う。これらの蛋白質は、ウィルスのェンベロー プを除くコアを形成する蛋白質であり、典型的には、 N (ヌクレオキヤプシド）、 P (ホス ホ）、および L (ラージ)蛋白質である。ウィルス種によっては、表記は異なることもある 1S 対応する蛋白質は当業者にとっては自明である（Anjeanette Robert et al.， Virol ogy. 1998: 247; 1-6 )0例えば Nは NPと表記されることもある。また該 RNAは、ウィルス 粒子の形成に必要な M (マトリックス）蛋白質をコードしていてもよい。さらに該 RNAは 、ウィルス粒子の感染に必要なエンベロープ蛋白質をコードしていてもよい。マイナス 鎖 RNAウィルスのエンベロープ蛋白質としては、細胞膜融合を起こす蛋白質である F (フュージョン）蛋白質および細胞への接着に必要な HN (へマダルチュン-ノイラミニ ダーゼ)蛋白質 (または H (へマダルチュン)）が挙げられる。また、 F蛋白質および Z または HNほたは H)蛋白質以外のウィルスエンベロープ蛋白質をコードさせてもよ い。但し、後述のように、本発明において用いるマイナス鎖 RNAウィルスは、ェンベロ ープ構成蛋白質をコードする遺伝子が変異および/または欠損していることが好まし い。 [0016] 例えばパラミクソウィルス亜科に属する各ウィルスにおける各遺伝子は、一般に次 のように表記される。一般に、 NP遺伝子は" N"とも表記される。また、 HNはノイラミニダ ーゼ活性を有さない場合には H (へマダルチュン）と表記される。
レスピロウィルス属 NP P/C/V M F HN - L
ルブラウィルス属 NP P/V M F HN (SH) L
モービリウィルス属 NP P/C/V M F H - L
[0017] 例えばセンダイウィルスの各遺伝子の塩基配列のデータベースのァクセッション番 号は、 NP遺伝子については M29343、 M30202, M30203, M30204, M51331, M55565 , M69046, X17218, P遺伝子については M30202, M30203, M30204, M55565, M690 46, X00583, X17007, X17008, M遺伝子については D11446, K02742, M30202, M3 0203, M30204, M69046, U31956, X00584, X53056、 F遺伝子については D00152, D11446, D17334, D17335, M30202, M30203, M30204, M69046, X00152, X02131、 HN遺伝子については D26475, M12397, M30202, M30203, M30204, M69046, X005 86, X02808, X56131、 L遺伝子については D00053, M30202, M30203, M30204, M6 9040, X00587, X58886を参照のこと。またその他のウィルスがコードするウィルス遺 伝子を例示すれば、 N遺伝子については、 CDV, AF014953; DMV, X75961; HPIV- 1 , D01070; HPIV- 2, M55320; HPIV- 3, D10025; Mapuera, X85128; Mumps, D86172; MV, K01711; NDV, AF064091; PDPR, X74443; PDV, X75717; RPV, X68311; SeV, X00087; SV5, M81442;および Tupaia, AF079780, P遺伝子については、 CDV, X5 1869; DMV, Z47758; HPIV- 1, M74081; HPIV- 3, X04721; HPIV- 4a, M55975; HPIV -4b, M55976; Mumps, D86173; MV, M89920; NDV, M20302; PDV, X75960; RPV, X68311; SeV, M30202; SV5, AF052755;および Tupaia, AF079780, C遺伝子につ いては CDV, AF014953; DMV, Z47758; HPIV- 1. M74081; HPIV- 3, D00047; MV, AB016162; RPV, X68311; SeV, AB005796;および Tupaia, AF079780, M遺伝子に ついては CDV, M12669; DMV Z30087; HPIV- 1, S38067; HPIV- 2, M62734; HPIV- 3, D00130; HPIV- 4a, D10241; HPIV- 4b, D10242; Mumps, D86171; MV, AB012948 ； NDV, AF089819; PDPR, Z47977; PDV, X75717; RPV, M34018; SeV, U31956;お よび SV5, M32248, F遺伝子については CDV, M21849; DMV, AJ224704; HPN- 1. M22347; HPIV— 2, M60182; HPIV— 3. X05303, HPIV— 4a, D49821; HPIV— 4b, D49822 ； Mumps, D86169; MV, AB003178; NDV, AF048763; PDPR, Z37017; PDV, AJ2247 06; RPV, M21514; SeV, D17334;および SV5, AB021962, HN (Hまたは G)遺伝子に ついては CDV, AF112189; DMV, AJ224705; HPIV- 1, U709498; HPIV- 2. D000865 ； HPIV— 3, AB012132; HPIV— 4A, M34033; HPIV-4B, AB006954; Mumps, X99040; MV, K01711; NDV, AF204872; PDPR, Z81358; PDV, Z36979; RPV, AF132934; Se V, U06433;および SV-5, S76876が例示できる。但し、各ウィルスは複数の株が知ら れており、株の違いにより上記に例示した以外の配列力もなる遺伝子も存在する。 これらのウィルス蛋白質をコードする ORFおよび外来遺伝子の ORFは、ゲノム RNA にお 、て上記の E-I-S配列を介してアンチセンスに配置される。ゲノム RNAにお!/、て 最も 3'に近い ORFは、 3'リーダー領域と該 ORFとの間に S配列のみが必要であり、 Eお よび I配列は必要ない。またゲノム RNAにおいて最も 5'に近い ORFは、 5'トレイラー領 域と該 ORFとの間に E配列のみが必要であり、 Iおよび S配列は必要ない。また 2つの ORFは、例えば IRES等の配列を用いて同一シストロンとして転写させることも可能で ある。このような場合は、これら 2つの ORFの間には E-ト S配列は必要ない。例えば、 野生型のパラミクソウィルスの場合、典型的な RNAゲノムは、 3'リーダー領域に続き、 N、 P、 M、 F、 HN (H)、および L蛋白質をアンチセンスにコードする 6つの ORFが順に 並んでおり、それに続いて 5'トレイラ一領域を他端に有する。本発明においてゲノム R NAは、ウィルス遺伝子の配置はこれに限定されるものではないが、好ましくは、野生 型ウィルスと同様に、 3'リーダー領域に続き、 N、 P、 M、 F、 HN (または H)、および L蛋 白質をコードする ORFが順に並び、それに続いて 5'トレイラ一領域が配置されること が好ましい。ある種のウィルスにおいては、ウィルス遺伝子が異なっている力 そのよ うな場合でも各ウィルス遺伝子を野生型と同様の配置とすることが好ましい。一般に N、 P、および L遺伝子を保持しているベクターは、細胞内で自律的に RNAゲノムから 遺伝子が発現し、ゲノム RNAが複製される。さらに Fおよび HN (または H)遺伝子等の エンベロープのスパイク蛋白質をコードする遺伝子、および M遺伝子の働きにより、 感染性のウィルス粒子が形成され、細胞外に放出される。従って、このようなベクター は伝播能を有するウィルスベクターとなる。ベクターに外来遺伝子を搭載させる場合 は、後述するように、このゲノム中の蛋白質非コード領域に挿入すればよい。
[0019] 本発明において用いるマイナス鎖 RNAウィルスベクターは、 1つまたは複数のェン ベロープ構成蛋白質の遺伝子に変異および/または欠損を有するものが好ましい。こ のような変異型マイナス鎖 RNAウィルスを用いることにより、血液細胞のリポピユレ一 シヨンの効率が有意に上昇することが判明した。ここでエンベロープ構成蛋白質の変 異とは、野生型遺伝子を持つウィルスに比べ、変異遺伝子に置換されたウィルスの 感染性ウィルス産生能が有意に低下するような変異である。また欠損とは、野生型遺 伝子の機能が実質的に失われることであり、機能的蛋白質を発現しないように改変さ れること、および遺伝子が欠失していることを含む。野生型遺伝子の機能が実質的に 失われるとは、当該遺伝子の欠損により、 37°Cにおけるウィルス産生が野生型の 1/1 0以下、好ましくは 1/20以下、より好ましくは 1/50以下に減少することである。ェンベロ ープ構成蛋白質とは、ウィルスのエンベロープの成分となるウィルス蛋白質を言い、 エンベロープ表面に露出し細胞への接着または感染に機能するスパイク蛋白質およ びエンベロープの形成等に機能する裏打ち蛋白質が含まれる。典型的には、ェンべ ロープ構成蛋白質の遺伝子としては F、 HN、および Mが挙げられ、ウィルス種によつ ては H、 Ml、および G等の遺伝子が含まれる。これらのエンベロープ構成蛋白質の 遺伝子の 1つまたは複数を変異および/または欠失させたウィルスは、野生型ウィル スに比べ遺伝子導入造血細胞の生着率を顕著に増カロさせ、白血球、赤血球および 血小板を含む血液細胞を長期間生成させることが可能になることが判明した。またェ ンべロープ構成蛋白質遺伝子を変異および/または欠失させたウィルスは、感染細 胞における感染性ウィルス粒子の形成能が低下するため安全性が高 、。また細胞傷 害性が有意に低下する。ゲノムにおいて変異および/または欠損させる遺伝子として は、例えば F遺伝子、 HNほたは H)遺伝子、 M遺伝子、またはその任意の組み合わ せが挙げられる。特に好ましくは、少なくとも F遺伝子が変異または欠損、より好ましく は欠損している。さらに好ましくは、 F遺伝子および HN (または H)遺伝子が変異また は欠損、より好ましくは欠損している。さらに好ましくは、 F遺伝子、 HNほたは H)遺 伝子および M遺伝子が変異または欠損、より好ましくは欠損している。
[0020] 特に、少なくとも F遺伝子が欠失し、さらに少なくとも HN (または H)遺伝子が変異ま たは欠失するベクターを用いることが好ましい。このようなウィルスベクターは、一度 細胞内に入り込んだ後は、 F蛋白質は発現せず、 HN (または H)蛋白質も極低レベル 発現または無発現となる。ベクター感染細胞において HN蛋白質が多数表出すると、 細胞同士の吸着や aggregationを来たす可能性があり、事実このような現象が in vitro で起こり得ることを本発明者らは確認した。従って、 HNほたは H)遺伝子に温度感受 性変異を有するベクター、さらに好ましくは HN (または H)遺伝子を欠損するベクター を用いることにより、造血細胞移植においてより良好な結果を得ることが可能となる。 さらに、 M遺伝子を変異または欠損させることにより、より良好な生着動態を得ることが できる。特にエンベロープ構成蛋白質遺伝子をすベて欠損するベクターを使用した 場合、温度感受性変異型のベクターと比較しても移植後の定着率が著しく上昇し、 汎血球減少が有意に抑制されることが判明した (実施例 6)。従って、 F、 HN (または H )、および M遺伝子等のエンベロープ構成蛋白質遺伝子をすベて欠損するベクター は、本発明において最も好適なベクターであり、これを用いて造血細胞に遺伝子導 入を行うことにより、レシピエントにお 、て長期間安定に血液細胞を再構築させること が可能となる。本発明は、このベクターを造血細胞に導入することを特徴とする、マイ ナス鎖 RNAウィルスベクター導入造血細胞移植における生着率および/または生着 期間を上昇させる方法に関する。また本発明は、遺伝子導入造血細胞を含む移植 治療組成物の製造における、このベクターの使用にも関する。
エンベロープ構成蛋白質において多数の温度感受性変異が知られている。これら の温度感受性変異蛋白質遺伝子を有するウィルスを本発明にお ヽて好適に用いる ことができる。温度感受性変異とは、低温（例えば 32°C)に比べ、ウィルス宿主の通 常の温度 (例えば 37°C)において有意に活性が低下する変異のことである。このよう な、温度感受性変異を持つ蛋白質は、野生型蛋白質などで相補しなくても許容条件 (低温）下でウィルスを作製することができるので有用である。例えば、 F遺伝子を欠 損し HNおよび M遺伝子に温度感受性変異を有するベクター、 Fおよび HN遺伝子を 欠損し M遺伝子に温度感受性変異を有するベクター、 Fおよび M遺伝子を欠損し HN 遺伝子に温度感受性変異を有するベクターなどは、本発明において特に好適に用 いられる。本発明は、これらのベクターを造血細胞に導入することを特徴とする、マイ ナス鎖 RNAウィルスベクター導入造血細胞移植における生着率および/または生着 期間を上昇させる方法に関する。また本発明は、遺伝子導入造血細胞を含む移植 治療組成物の製造における、これらのベクターの使用にも関する。
[0022] 例えば、 M遺伝子の温度感受性変異としては、特に限定されるものではな 、が、セ ンダイウィルスの M蛋白質における G69、 T116、および A183からなる群より選択される 少なくとも 1つ、好ましくは任意に選択される 2つ、さらに好ましくは 3つすベてのァミノ 酸部位、あるいは他のマイナス鎖 RNAウィルス Μ蛋白質のそれらと相同な部位が変異 して 、るものを好適に用いることができる。ここで G69とは Μ蛋白質の 69番目のァミノ 酸 Gly、 T116とは M蛋白質の 116番目のアミノ酸 Thr、 A183とは M蛋白質の 183番目の アミノ酸 Alaを指す。
[0023] M蛋白質をコードする遺伝子 (M遺伝子）は、マイナス鎖 RNAウィルスで広く保存さ れており、ウィルスのヌクレオ力プシドとエンベロープの両者に相互作用する機能を 有することが知られている（Garoff, H. et al.， Microbiol. Mol. Biol. Rev. 1998: 62; 11 7-190) oまた、 SeV M蛋白質において amphiphilic a - helixと予想されている 104-119 (104-KACTDLRITVRRTVRA-119Z配列番号： 1)は粒子形成に重要な領域として 同定されている（Genevieve Mottet et al.， J. Gen. Virol. 1999: 80; 2977- 2986)が、 当該領域はマイナス鎖 RNAウィルス間で良く保存されている。 M蛋白質のアミノ酸配 列はマイナス鎖 RNAウィルスで類似しており、特にパラミクソウィルス亜科にお!、ては 既知の M蛋白質は共通して全長約 330〜380アミノ酸力 なる塩基性蛋白質であり、 全領域にわたって類似性があるが、特に C端側半分での類似性が高い（Gould, A. R . Virus Res. 1996: 43; 17-31、 Harcourt, B.H. et al, Virology. 2000: 271; 334-349) 。従って、例えば SeV M蛋白質の G69、 T116、及び A183と相同なアミノ酸は容易に 同定することが可能である。
[0024] SeV M蛋白質の G69、 T116、及び A183と対応する他のマイナス鎖 RNAウィルス Μ蛋 白質の相同な部位のアミノ酸は、当業者であれば、例えば BLASTなどのアミノ酸配列 のホモロジ一検索プログラム（ァライメント作成機能を持つもの）または CLUSTAL Wな どのァライメント作成プログラムを用いて SeV M蛋白質のアミノ酸と整列化することによ り同定することができる。例えば SeV M蛋白質の G69に相当する各 M蛋白質の相同部 位としては、 human parainfluenza virus- 1 (HPIV- 1) (括弧は略称）であれば G69、 hum an parainfluenza virus- 3 (HPIV- 3)であれは G 3、 phocine distemper virus (PDV)^o よび canine distemper virus (CDV)であれば G70、 dolphin molbillivirus (DMV)であれ i G71、 peste—des—petits— ruminants virus (PDPR)、 measles virus (MV)、および rinder pest virus (RPV)であれば G70、 Hendra virus (Hendra)および Nipah virus (Nipah)であ れば G81、 human parainfluenza virus— 2 (HPIV— 2)であれば G70、 human parainfluenza virus- 4a (HPIV- 4a)および human parainfluenza virus- 4b (HPIV- 4b)であれば E47、 m umps virus (Mumps)であれば E72が挙げられる（文字と番号はアミノ酸とその位置を表 す)。また、 SeV M蛋白質の T116に相当する各 M蛋白質の相同部位としては、 human parainfluenza virus- 1 (HPIV- 1)であれは Γ116、 numan parainfluenza virus- 3 (HPIV- 3 )でれば T120、 phocine distemper virus (PDV)および canine distemper virus (CDV)で あれば T104、 dolphin molbillivirus (DMV)であれは T105、 peste—des—petits— ruminants virus (PDPR)、 measles virus (MV)および rinderpest virus (RPV)であれば T104、 Hend ra virus (Hendra)および Nipah virus (Nipah)であれば T120、 human parainfluenza viru s- 2 (HPIV- 2)および simian parainfluenza virus 5 (5\ 5)で&>れば丁117、 human parainfl uenza virus— 4a (HPIV— 4a)および human parainfluenza virus— 4b (HPIV— 4b)であれば T 121、 mumps virus (Mumps)であれば Tl 19、 Newcastle disease virus (NDV)であれば S 120が挙げられる。 SeV M蛋白質の A183に相当する各 M蛋白質の相同部位としては 、 human parainfluenza virus- 1 (HPIV- 1)で &)れば A183、 human parainfluenza virus- 3
(HPIV- 3)であれな F187、 phocine distemper virus (PDV)および canine distemper viru s (CDV)であれば Y171、 dolphin molbillivirus (DMV)であれば Y 172、 peste-des-petits -ruminants virus (PDPR)、 measles virus (MV)および rinderpest virus (RPV)であれは Y171、 Hendra virus (HendraJおよび Nipah virus (Nipah)で teれば Y187、 human parain fluenza virus— 2 (HPIV— 2)であれは Yl 84、 simian parainfluenza virus 5 (SV5)であれば F184、 human parainfluenza virus- 4a (HPIV- 4a)および human parainfluenza virus- 4b (HPIV- 4b)であれは F188、 mumps virus (Mumps)であれば F186、 Newcastle disease vi rus (NDV)であれば Y187が挙げられる。ここに挙げたウィルスにおいて、それぞれの M蛋白質に上記の 3つの部位のいずれか、好ましくは任意の 2部位の組み合わせ、さ らに好ましくは 3つの部位全てのアミノ酸が他のアミノ酸に置換された変異 M蛋白質を コードするゲノムを有するウィルスは、本発明において好適に用いられる。
[0025] アミノ酸変異は、所望の他のアミノ酸への置換であってよ!、が、好ましくは、側鎖の 化学的性質の異なるアミノ酸への置換である。例えばアミノ酸は、塩基性アミノ酸 (例 えばリジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性アミノ酸（例えばァスパラギン酸、ダルタミ ン酸）、非荷電極性アミノ酸（例えばグリシン、ァスパラギン、グルタミン、セリン、スレ ォニン、チロシン、システィン）、非極性アミノ酸（例えばァラニン、パリン、ロイシン、ィ ソロイシン、プロリン、フエ-ルァラニン、メチォニン、トリプトファン）、 β分岐アミノ酸（ 例えばスレオニン、パリン、イソロイシン）、および芳香族アミノ酸（例えばチロシン、フ ェ-ルァラニン、トリプトファン、ヒスチジン）などのグループに分類することができるが 、あるアミノ酸について、そのアミノ酸が属するグループのアミノ酸以外のアミノ酸に置 換することなどが挙げられる。具体的には、塩基性アミノ酸であれは、酸性または中 性アミノ酸への置換、極性アミノ酸であれは非極性アミノ酸への置換、 20種の天然の アミノ酸の平均分子量より大き 、分子量を持つアミノ酸であれば、その平均分子量よ り小さいアミノ酸への置換、逆にその平均分子量より小さいアミノ酸であれば、それよ り大きいアミノ酸への置換などが挙げられるが、それに限定されない。
[0026] 具体的に例示すれば、センダイウィルス Μ蛋白質における G69E、 T116A、および A 183Sからなる群より選択される変異あるいはそれらと相同な位置に変異を含む他のパ ラミクソウィルスの M蛋白質を用いることができる。ここで G69Eとは、 M蛋白質の 69番 目のアミノ酸 Glyが Gluに置換された変異、 T116Aとは、 M蛋白質の 116番目のアミノ酸 Thrが Alaに置換された変異、 A183Sとは、 M蛋白質の 183番目のアミノ酸 Alaが Serに 置換された変異を言う。すなわち、センダイウィルス M蛋白質の G69、 T116、および A 183あるいは他のウィルス M蛋白質の相同部位を、それぞれ Glu (E)、 Ala (A)、および Ser (S)へ置換することができる。これらの変異は組み合わせて有していることが好ま しぐ特に上記 3変異の全てを保持していることがより好ましい。 M遺伝子への変異の 導入は、公知の変異導入方法に従って実施することができる。例えば実施例に記載 のように目的の変異を入れたオリゴヌクレオチドを用いて導入することが可能である。
[0027] また、例えば麻疹ウィルスにおいては、 M蛋白のモノクローナル抗体に対するェピト ープが変化している温度感受性株の P253- 505 (Morikawa, Y. et al.， Kitasato Arch. Exp. Med. 1991: 64; 15-30)の M遺伝子配列を用いてもよい。また、 SeV M蛋白質の 116番目の Thrに対応する麻疹ウィルス M蛋白質の 104番目の Thr、またはムンプスゥ ィルスの M蛋白質の 119番目の Thrを他のアミノ酸（例えば Ala)に置換してもよい。
[0028] 本発明において用いられるベクターは、さらに好ましい態様においては M遺伝子を 欠損している。 M遺伝子の欠損とは、野生型 M遺伝子の機能が実質的に失われてい ることを言 ヽ、機能欠失型の変異を有する M遺伝子を持つ場合および M遺伝子を欠 失する場合を含む。 M遺伝子の機能欠失型変異は、例えば M遺伝子の蛋白質コード 配列を欠失させたり、他の配列を挿入することにより作製することができる。例えば、 M蛋白質コード配列の途中に停止コドンを設計することができる（WO00/09700)。本 発明のベクターは、最も好ましくは M蛋白質のコード配列を完全に欠失している。 M 蛋白質の ORFを欠失したベクターは、温度感受性変異 M蛋白質をコードするべクタ 一とは違 、、任意の条件にぉ 、てウィルス粒子を形成する能力を失って 、る。
[0029] HN遺伝子の温度感受性変異としては、特に限定されるものではないが、例えばセ ンダイウィルスの HN蛋白質の A262、 G264、および K461力 なる群より選択される少 なくとも 1つ、好ましくは任意に選択される 2つ、さらに好ましくは 3つすベてのアミノ酸 部位、あるいは他のマイナス鎖 RNAウィルス M蛋白質のそれらと相同な部位に変異を 含むものを好適に用いることができる。ここで A262とは HN蛋白質の 262番目のァミノ 酸 Ala、 G264とは HN蛋白質の 264番目のアミノ酸 Gly、 K461とは HN蛋白質の 461番目 のアミノ酸 Lysを指す。アミノ酸変異は、所望の他のアミノ酸への置換であってよいが、 好ましくは、上記の M蛋白質の変異と同様、側鎖の化学的性質の異なるアミノ酸への 置換である。例えば、上記したように異なるグループのアミノ酸に置換することなどが 挙げられる。具体的には、例えばセンダイウィルス HN蛋白質における A262T、 G264 R、および K461G力 なる群より選択される変異あるいはそれらと相同な変異を含むも のを好適に用いることができる。ここで A262Tとは、 HN蛋白質の 262番目のアミノ酸 A1 aが Thrに置換された変異、 G264Rとは、 HN蛋白質の 264番目のアミノ酸 Glyが Argに 置換された変異、 K461Gとは、 HN蛋白質の 461番目のアミノ酸 Lysが Glyに置換された 変異を言う。すなわち、センダイウィルス HN蛋白質の A262、 G264、および K461ある いは他のウィルス HN蛋白質の相同部位を、それぞれ Thr (T)、 Arg (R)、および Gly (G )へ置換することができる。これらの変異は組み合わせて有していることが好ましぐ 特にこれらの 3つの変異の全てを保持して 、ることがより好ま U 、。
[0030] また、例えば、ムンブスウィルスにお ヽては、温度感受性の性質を示しワクチンとし て使用されている Urabe AM9株（Wright, K. E. et al.， Virus Res. 2000: 67; 49- 57)を 参考に、 HN蛋白の 464及び 468番目のアミノ酸に変異導入することは本発明にお!/ヽ て好ましい。これと相同な位置のアミノ酸の変異は、他のマイナス鎖 RNAウィルスにも 適用することができる。
[0031] さらに好ましい態様では、 HN遺伝子を欠損させる。 HN遺伝子の欠損とは、野生型 HN遺伝子の機能が実質的に失われていることを言い、機能欠失型の変異を有する HN遺伝子を持つ場合および HN遺伝子を欠失する場合を含む。 HN遺伝子の機能欠 失型変異は、例えば HN遺伝子の蛋白質コード配列を欠失させたり、他の配列を挿 入することにより作製することができる。例えば、 HN蛋白質コード配列の途中に停止 コドンを設計することができる。本発明のベクターは、最も好ましくは HN蛋白質のコー ド配列を完全に欠失して 、る。
[0032] またマイナス鎖 RNAウィルスは、 P遺伝子または L遺伝子に変異を有して ヽてもよ ヽ 。このような変異としては、具体的には、 SeV P蛋白質の 86番目の Glu (E86)の変異、 S eV P蛋白質の 511番目の Leu (L511)の他のアミノ酸への置換、または他のマイナス鎖 RNAウィルス P蛋白質の相同部位の置換が挙げられる。アミノ酸変異は、所望の他の アミノ酸への置換であってよいが、好ましくは、上記と同様、側鎖の化学的性質の異 なるアミノ酸への置換である。例えば、上記したように異なるグループのアミノ酸に置 換することなどが挙げられる。具体的には、 E86の Lysへの置換（E86K)、 L511の Phe への置換 (L51 IF)などが例示できる。また L蛋白質においては、 1197番目の Asn (Nil 97)および/または 1795番目の Lys (K1795)の他のアミノ酸への置換、または他のマイ ナス鎖 RNAウィルス L蛋白質の相同部位の置換が挙げられる。 L蛋白質のこれら 2つ の変異の両方を有する L蛋白質遺伝子は特に好ましい。アミノ酸変異は、やはり所望 の他のアミノ酸への置換であってよいが、好ましくは、上記と同様、側鎖の化学的性 質の異なるアミノ酸への置換である。例えば、上記したように異なるグループのァミノ 酸に置換することなどが挙げられる。具体的には、 N1197の Serへの置換 (N1197S)、
K1795の Gluへの置換 (K1795E)などが例示できる。 P遺伝子と L遺伝子の変異は、両 方持っていることで、持続感染性、 2次粒子放出の抑制、または細胞傷害性の抑制の 効果を顕著に高めることができる。さらに、エンベロープ蛋白質遺伝子の変異および
/または欠損を組み合わせることで、これらの効果を劇的に上昇させることができる。
[0033] またマイナス鎖 RNAウィルスベクターは、アクセサリー遺伝子が欠損したものであつ てよい。例えば SeVのアクセサリー遺伝子の 1つである V遺伝子をノックアウトすること により、培養細胞における遺伝子発現および複製は障害されることなぐマウス等の 宿主に対する SeVの病原性が顕著に減少する（Kato, A. et al. J. Virol. 1997: 71; 72
66-7272, Kato, A. et al. EMBO J. 1997: 16; 578-587, Curran, J. et al., WO01/042
72, EP1067179) oこのような弱毒化ベクターは、より毒性の低い遺伝子導入用ウィル スベクターとして特に有用である。
[0034] マイナス鎖 RNAウィルスは宿主細胞の細胞質でのみ転写.複製を行い、 DNAフエ一 ズを持たないため染色体への組み込み（integration)は起こらない（Lamb, R.A. and Kolakofsky, D., Paramyxoviridae： The viruses and tneir replication. In: Fields BN, K nipe DM, Howley PM, (eds). Fields of virology. Lippincott - Raven Publishers: Phila delphia, 1996: 2; 1177-1204) 0このため染色体異常による癌化および不死化などの 安全面における問題が生じない。マイナス鎖 RNAウィルスのこの特徴は、ベクター化 した時の安全性に大きく寄与するものと考えられる。異種遺伝子発現の結果では、例 えばセンダイウィルス (SeV)を連続多代継代しても殆ど塩基の変異が認められず、ゲ ノムの安定性が高ぐ挿入異種遺伝子を長期間に渡って安定に発現する事が示され ている（Yu, D. et al" Genes Cells. 1997: 2: 457-466)。また、力プシド構造蛋白質を 持たな ヽことによる導入遺伝子のサイズまたはパッケージングの柔軟性 (flexibility)な ど性質上のメリットがある。 SeVベクターは、外来遺伝子を少なくとも 5kbまで導入可能 であり、転写ユニットを付加することによって 2種類以上の遺伝子を同時に発現する 事も可能である。
[0035] 特にセンダイウィルスは、齧歯類にとっては病原性で肺炎を生じることが知られてい る力 人に対しては病原性がない。これはまた、野生型センダイウィルスの経鼻的投 与によって非ヒト霊長類において重篤な有害作用を示さないというこれまでの報告に よっても支持されている（Hurwitz, J.L. et al.， Vaccine. 1997: 15; 533-540, Bitzer, M . et al, J. Gene Med. 2003: 5; 543-553, Slobod, K.S. et al, Vaccine. 2004： 22; 31 82-3186) oまた、種々の細胞'臓器へ、既存のベクターでは得られない極めて高い 遺伝子導入 ·発現効率を示す（Yonemitsu Y. et al., Nature Biotechnol 2000;18:970- 973; Masaki I. et al., FASEB J 2001;15:1294-1296; Yamashita A. et al., J Immunol 2002;168:450-457; Masaki I. et al., Circ Res 2002;90:966-973; Onimaru M. et al" Circ Res 2002;91:723-730; Shoji F. et al" Gene Ther 2003;10:213-218; Okano S. e t al., Gene Ther 2003;10: 1381- 1391)。ヒト造血幹細胞への in vitro導入においても、 3系統への分化能を維持したまま高効率遺伝子導入が可能である (Jin CH. et al, G ene Ther. 2003 ;10:272-277) 0センダイウィルスのこれらの特徴は、センダイウィルス ベクターが人への造血細胞移植における遺伝子治療ベクターとしての利用を支持す るものである。
[0036] マイナス鎖 RNAウィルスベクターは、ゲノム RNA中に所望の外来遺伝子をコードし 得る。外来遺伝子を含む組換えウィルスベクターは、上記のウィルスベクターのゲノ ムに外来遺伝子を挿入することによって得られる。外来遺伝子の挿入位置は、例え ばウィルスゲノムの蛋白質非コード領域の所望の部位を選択することができ、例えば ゲノム RNAの 3'リーダー領域と 3'端に最も近いウィルス蛋白質 ORFとの間、各ウィルス 蛋白質 ORFの間、および/または 5'端に最も近いウィルス蛋白質 ORFと 5'トレイラー領 域の間に挿入することができる。また、 M、 Fまたは HN遺伝子などのエンベロープ構 成蛋白質遺伝子を欠失するゲノムでは、その欠失領域に外来遺伝子をコードする核 酸を挿入することができる。ノ ミクソウィルスに外来遺伝子を導入する場合は、ゲノ ムへの挿入断片のポリヌクレオチドの鎖長が 6の倍数となるように挿入することが望ま しい（Kolakofski, D. et al., J. Virol. 1998: 72; 891—899; Calain, P. and Roux, L. J. V irol. 1993: 67; 4822-4830) 0挿入した外来遺伝子とウィルス ORFとの間には、 E-I-S 配列が構成されるようにする。 E-I-S配列を介して 2またはそれ以上の外来遺伝子をタ ンデムに並べて挿入することができる。
[0037] マイナス鎖 RNAウィルスにより導入する外来遺伝子としては、特に制限はないが、 天然の蛋白質としては、例えばサイト力イン、その他の液性因子、増殖因子、受容体 、細胞内シグナル分子、酵素、ペプチドなどが挙げられる。蛋白質は分泌蛋白質、膜 蛋白質、細胞質蛋白質、核蛋白質などであり得る。人工的な蛋白質としては、例えば 、キメラ毒素などの融合蛋白質、ドミナントネガティブ蛋白質 (受容体の可溶性分子ま たは膜結合型ドミナントネガティブ受容体を含む）、欠失型の細胞接着分子および細 胞表面分子などが挙げられる。また、分泌シグナル、膜局在化シグナル、または核移 行シグナル等を付加した蛋白質であってもよい。導入遺伝子としてアンチセンス RNA 分子または RNA切断型リボザィムなどを発現させて、特定の遺伝子の機能を抑制す ることもできる。外来遺伝子として疾患の治療用遺伝子を用いてウィルスベクターを 調製すれば、このベクターを投与して遺伝子治療を行うことが可能となる。本発明の ウィルスベクターの遺伝子治療への応用としては、直接投与による遺伝子発現、間 接 (ex vivo)投与による遺伝子発現のいずれの方法によっても、治療効果を期待でき る外来遺伝子もしくは患者の体内で供給が不足している内在遺伝子等を榭状細胞 力も発現させることが可能である。また本発明の方法は、再生医療における遺伝子治 療ベクターとしても利用できる。 以下に搭載遺伝子を例示する。
CD45 : SCIDの原因 1遺伝子、染色体 lq31-32に位置。共通リンパ球 CD抗原で Src ki naseを調節するフォスファターゼでこの欠損により T、 ΝΚ欠損型の SCIDとなる (Hermis ton. et al" Annu. Rev. Immunol. 2003: 21; 107-137; Buckley RH., Annu. Rev. Immu nol. 2004: 22; 625-655)
IL-7 receptor alpha: SCIDの原因 1遺伝子、染色体 5pl3に位置。リンパ球特に T細 胞の分化、ホメォスターシスに重要な IL-7のレセプターのサブユニット、この欠損によ り T欠損型の SCIDとなる (Peschon JJ., J. Exp. Med. 1994: 180; 1955-1960; Buckley RH., Annu. Rev. Immunol. 2004: 22; 625-655)
RAG1/2 : SCIDの原因 1遺伝子、染色体 11ρ13に位置。 T細胞レセプター及び抗体の 生成において重要なリコンビナーゼで、この欠損により T、 Β欠損型の SCIDとなる (sch warz. et al" Science. 1996: 274; 97-99; Buckley RH., Annu. Rev. Immunol. 2004: 2 2; 625-655) Adenosine Deaminase (ADA)： SCIDの原因 1遺伝子、染色体 20ql3.11に位置。プリン 代謝の再利用経路における酵素で、この遺伝子欠損によりプリン代謝産物の蓄積に よりリンパ球がアポトーシスとなり T、 ΝΚ欠損型の SCIDとなる（Noguchi M., Cell, 1999: 73; 147-157; Puck JM.'Hum. Mol. Gemet., 1993: 1099-1104; Buckley RH" Annu. Rev. Immunol. 2004: 22; 625-655)
common gamma chain ( γ c) : SCIDの原因 1遺伝子、染色体 Xql3.1に位置。 IL- 2, IL -4, IL7, IL- 7, IL- 15, IL- 21のレセプターに共通するサブユニットで、 T、 Β、 ΝΚ欠損 型の SCID (いわゆる X- linked SCID)となる (Buckley RH. et al" J. Pediatr. 1997: 130 ； 378-387; Buckley RH. et al., N, Engl. J. Med. 1999: 340; 508-516, Buckley RH., Annu. Rev. Immunol. 2004: 22; 625-655)
DAF及び CD59 : Glycosil phosphatidylinositol linked proteinで補体活性を抑制する 蛋白で両者の欠損は、赤血球の自己の補体活性による溶血を惹起し、重症の夜間 血色素尿症を発症する (Johnson RJ. et al., J. Clinic. Pathol. , 2002: 55; 145-152) copper transporting P— type ATPase (ATP7B, Wilson disease protein)：ウイノレソン病 の原因遺伝子。染色体 13に位置し、胆管での銅代謝に重要な蛋白で、この欠損によ り肝臓、角膜、脳に銅が沈着して発症する（Ferenci P., Clin liver Dis. 1998: 2; 31-4 9)
GFP (ォワンクラゲ蛍光発色体）、 ludferase :これらは遺伝子導入細胞のマーカーとし て生体内での動態の解析や遺伝子導入効率の判定に利用できる。
FGF-2: (WO2002/042481)
その他、 Btk (伴性無ガンマグロブリン血症で欠損）、 CD40/CD40 ligand (高 IgM症候 群で欠損）、 (Cooper MD. et al., Hematology, 2003: 313- 330)、 WASP (Wiskott- Aid rich症候群で欠損； Snapper SB. et al., Annu. Rev. immunol. 1999: 17; 905- 929)、な どが挙げられる力 これらの限定されない。
ベクターに搭載する外来遺伝子の発現レベルは、その遺伝子の上流 (マイナス鎖（ ネガティブ鎖)の 3'側）に付加する転写開始配列の種類により調節することができる（ WO01/18223) oまた、ゲノム上の外来遺伝子の挿入位置によって制御することがで き、マイナス鎖の 3'の近くに挿入するほど発現レベルが高ぐ 5'の近くに挿入するほど 発現レベルが低くなる。このように、外来遺伝子の挿入位置は、該遺伝子の所望の発 現量を得るために、また前後のウィルス蛋白質をコードする遺伝子との組み合わせが 最適となる様に適宜調節することができる。一般に、外来遺伝子の高い発現が得られ ることが有利と考えられるため、外来遺伝子は、効率の高い転写開始配列に連結し、 マイナス鎖ゲノムの 3'端近くに挿入することが好ましい。具体的には、 3'リーダー領域 と 3'に最も近いウィルス蛋白質 ORFとの間に挿入される。あるいは、 3'に一番近いウイ ルス蛋白質遺伝子と 2番目のウィルス蛋白質遺伝子の ORFの間、または 3'から 2番目 と 3番目のウィルス蛋白質遺伝子の間に挿入してもよい。野生型パラミクソウィルスに おいては、ゲノムの 3'に最も近いウィルス蛋白質遺伝子は N遺伝子であり、 2番目の 遺伝子は P遺伝子、 3番目の遺伝子は M遺伝子である。逆に、導入遺伝子の高発現 が望ましくな 、場合は、例えば外来遺伝子の挿入位置をマイナス鎖ゲノムのなるべく 5'側に設定したり、転写開始配列を効率の低いものにするなどして、ウィルスベクター 力 の発現レベルを低く抑えることで適切な効果が得られるようにすることも可能であ る。
[0040] 外来遺伝子をコードする核酸をゲノムに挿入するときに付加する S配列としては、例 えばマイナス鎖 RNAウィルスの所望の S配列を用いることができる力 センダイウィル スであれば、 3'- UCCCWVUUWC- 5' (W= Aまたは U; V= A, C,または G) (配列番号 : 2)の配列を好適に用いることができる。特に 3'-UCCCAGUUUC-5' (配列番号： 3) 、 3'- UCCCACUUAC- 5' (配列番号： 4)、および 3'- UCCCACUUUC- 5' (配列番号： 5)が好ましい。これらの配列は、プラス鎖をコードする DNA配列で表すとそれぞれ 5' -AGGGTCAAAG-3' (配列番号： 6)、 5 -AGGGTGAATG-3' (配列番号： 7)、および 5 -AGGGTGAAAG-3' (配列番号： 8)である。センダイウィルスベクターの E配列とし ては、例えば 3'-AUUCUUUUU-5' (配列番号： 9) (プラス鎖をコードする DNAでは 5' - TAAGAAAAA-3' (配列番号： 10) )が好ましい。 I配列は、例えば任意の 3塩基であ つてよぐ具体的には 3'- GAA- 5' (プラス鎖 DNAでは 5'- CTT- 3，）を用いればよい。
[0041] マイナス鎖 RNAウィルスベクターを製造するには、（a)哺乳動物または鳥類細胞等 にお 、て、マイナス鎖 RNAウィルスのゲノム RNAを含む RNPの再構成に必要なウィル ス蛋白質の存在下、マイナス鎖 RNAウィルスのゲノム RNAをコードする cDNAを転写さ せる工程、（b)生成したマイナス鎖 RNAウィルスを回収する工程、により製造すること ができる。上記の RNPの再構成に必要なウィルス蛋白質とは、典型的には N、 P、お よび L蛋白質を言う。転写によりマイナス鎖ゲノム (すなわちウィルスゲノムと同じアン チセンス鎖）を生成させてもよぐあるいはプラス鎖（アンチゲノム。ゲノム RNAの相補 鎖。）を生成させても、ウィルス RNPを再構成することができる。ベクターの再構成効 率を高めるには、好ましくはプラス鎖を生成させる。 RNA末端は、天然のウィルスゲノ ムと同様に 3'リーダー配列と 5'トレイラ一配列の末端をなるベく正確に反映させること が好ましい。このためには、例えば転写産物の 5'端に自己切断型のリボザィムを付カロ しておき、リボザィムによりマイナス鎖 RNAウィルスゲノムの末端を正確に切り出させる ことにより実現させることができる。あるいは、転写産物の 5'端を正確に制御するため に、転写開始部位としてバタテリオファージの RNAポリメラーゼ認識配列を利用し、該 RNAポリメラーゼを細胞内で発現させる。転写産物の 3'端を制御するには、例えば転 写産物の 3'端に自己切断型リボザィムをコードさせておき、このリボザィムにより正確 に 3'端が切り出されるようにすることができる（Hasan, M. K. et al., J. Gen. Virol. 1997 ： 78; 2813-2820、 Kato, A. et al., EMBO J. 1997,: 16; 578-587及び Yu, D. et al" Genes Cells. 1997: 2; 457-466)。リボザィムとしては、デルタ肝炎ウィルスのアンチゲ ノム鎖（antigenomic strand)由来の自己開裂リボザィムが使用できる。
より具体的な組み換えウィルスの再構成は、例えば以下の文献を参照することがで きる（W097/16539; W097/16538; WOOO/70055; WOOO/70070; WOOl/18223; WO 03/025570; Durbin, A. P. et al. Virology, 1997: 235; 323-332; Whelan, S. P. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1995: 92; 8388—8392; Schnell. M. J. et al., EMBO J. 19 94: 13; 4195-4203; Radecke, F. et al., EMBO J. 1995: 14; 5773-5784; Lawson, N. D. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 4477—4481; Garcin, D. et al. EMBO J. , 1 995: 14; 6087-6094; Kato, A. et al., Genes Cells. 1996: 1; 569—579; Baron, M. D. and Barrett, T.， J. Virol. 1997: 71; 1265—1271; Bridgen, A. and Elliott, R. M., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1996: 93; 15400—15404; Hasan, M. K. et al., J. Gen. Virol, 1997: 78; 2813-2820、 Kato, A. et al., EMBO J. 1997: 16; 578-587、 Yu, D. et al" G enes Cells, 1997: 2; 457—466、 Tokusumi, T. et al. Virus Res. 2002: 86; 33—38、 Li, H.-O. et al, J. Virol. 2000: 74; 6564—6569)。これらの方法により、ノ《ラインフルェン ザ、水疱性口内炎ウィルス、狂犬病ウィルス、麻疹ウィルス、リンダ一ペストウィルス、 センダイウィルスなどを含むマイナス鎖 RNAウィルスを DNA力 再構成させることがで きる。
[0043] ウィルス生産細胞でウィルス蛋白質やウィルスゲノム RNAを発現させるためにプラス ミドベクターをトランスフエタトする場合、例えばリン酸カルシウム法（Graham, F. L. an d Van Der Eb, J., Virology. 1973: 52; 456; Wigler, M. and Silverstein, S., Cell. 197 7: 11; 223; Chen, C. and Okayama, H. Mol. Cell. Biol, 1987: 7; 2745)、種々のトラ ンスフエクシヨン試薬を用いた方法、あるいは電気穿孔法等を用いることができる。トラ ンスフエクシヨン試薬については、 DEAE-デキストラン（Sigma #D- 9885 M.W. 5 X 105 )、 DOTMA (Roche)、 Superfect (QIAGEN #301305)、 DOTAP、 DOPE, DOSPER (Ro che #1811169)、 TransIT-LTl (Mirus, Product No. MIR 2300)などを用いることがで きる。トランスフエクシヨン試薬と DNAとの複合体がエンドソーム中で分解されてしまう のを防ぐため、クロ口キンをカ卩えることができる（Calos, M. P., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1983: 80; 3015)。
[0044] 温度感受性変異を有する蛋白質を用いる場合は、組み換えウィルスの産生を許容 温度 (例えば 35°C以下、より好ましくは 34°C以下、さらに好ましくは 33°C以下、最も好 ましくは 32°Cまたはそれ以下)で行う。また、野生型蛋白質を用いる場合でも、ウィル ス産生を低温で行うことで効率的な粒子形成を行わせることが可能である。ェンベロ ープ構成蛋白質遺伝子を欠損する組み換えウィルスを製造する場合は、ウィルス産 生細胞にぉ 、て、これら欠損させた遺伝子および/または他のウィルスのェンベロー プ蛋白質をコードする遺伝子などを細胞に導入して発現させることにより、感染性の ウィルス粒子を形成させることができる（Hirata, T. et al., J. Virol. Methods, 2002: 10 4; 125-133; Inoue, M. et al., J. Virol. 2003： 77; 6419—6429; Inoue M. et al., J Gen e Med. 2004;6:1069- 1081)。
[0045] 例えば、ウィルス産生にぉ 、て、水疱性口内炎ウィルス (vesicular stomatitis virus;
VSV)の G蛋白質 (VSV- G)やレトロウイルスのアンフォト口ピックエンベロープ蛋白質 などのヒト細胞に感染するウィルスに由来するエンベロープ蛋白質を用いることがで きる。 VSV- G蛋白質は、任意の VSV株に由来するものであってよい。例えば Indiana 血清型株（J. Virology, 1981: 39; 519-528)由来の VSV- G蛋白を用いることができる 1S これに限定されない。このようにマイナス鎖 RNAウィルスベクターは、他のウィルス 由来のエンベロープ蛋白質を任意に組み合わせて製造されたものであってよい。ァ ンフォト口ピックエンベロープ蛋白質としては、例えばマウス白血病ウィルス（MuLV) 4 070A株由来のエンベロープ蛋白質を用い得る。また、 MuMLV 10A1由来のェンベロ ープ蛋白質を用いることもできる（例えば pCL- 10Al(Imgenex) (Naviaux, R. K. et al., J. Virol. 1996: 70; 5701-5705)。また、ヘルぺスウィルス科の蛋白質としては、例えば 単純へルぺスウィルスの gB、 gD、 gH、 gp85蛋白質、 EBウィルスの gp350、 gp220蛋白 質などが挙げられる。へパドナウィルス科の蛋白質としては、 B型肝炎ウィルスの S蛋 白質などが挙げられる。これらの蛋白質は、細胞外ドメインを F蛋白質または HN蛋白 質の細胞内ドメインと結合させた融合蛋白質として用いてもょ 、。このように本発明に おいて用いられるウィルスベクターには、 VSV-G蛋白質などのように、ゲノムが由来 するウィルス以外のウィルスに由来するエンベロープ蛋白質を含むシユードタイプゥ ィルスべクタ一が含まれる。ウィルスのゲノム RNAにはこれらのエンベロープ蛋白質を ゲノムにコードされないように設計すれば、ウィルス粒子が細胞に感染した後は、ウイ ルスベクター力もこの蛋白質が発現されることはない。
[0046] また、エンベロープ表面に特定の細胞に接着しうるような接着因子、リガンド、受容 体等の蛋白質、抗体またはその断片、あるいはこれらの蛋白質を細胞外領域に有し 、マイナス鎖 RNAウィルスのエンベロープ蛋白質由来のポリペプチドを細胞内領域に 有するキメラ蛋白質などを含むウィルスを製造することもできる。これにより、ウィルス ベクターの感染の特異性を制御し得る。これらはウィルスゲノムにコードされて ヽても よいし、ウィルスの再構成時に、ウィルスゲノム以外の遺伝子 (例えば別の発現べクタ 一または宿主染色体上などにある遺伝子)からの発現により供給されてもよい。
[0047] エンベロープ構成蛋白質を発現するヘルパー細胞は、例えば欠損させたェンベロ ープ構成蛋白質あるいは別のエンベロープ蛋白質をコードする遺伝子をトランスフエ クシヨンすることにより作製することができる（WO00/70055および WO00/70070 ;Has an, M. K. et al" J. General Virology. 1997: 78; 2813- 2820参照）。誘導発現を可能 にするために、例えば Cre/loxP誘導型発現プラスミド pCALNdlw (Arai, T. et al., J. Vi rology, 1998: 72; 1115- 1121)等の組み換え酵素標的配列を持つベクターにェンべ ロープ蛋白質遺伝子を組み込むことが好ましい。細胞は、例えばサル腎臓由来細胞 株 LLC- MK細胞（ATCC CCL- 7)を用いることができる。 LLC- MK細胞は、 10%の
2 2 熱処理した非動化ゥシ胎児血清 (FBS)、ペニシリン Gナトリウム 50単位/ ml、およびスト レプトマイシン 50 micro- g/mlを添カ卩した MEMで 37°C、 5% COで培養する。 SeV- F
2
遺伝子産物は細胞傷害性を有するため、 Cre DNAリコンビナーゼによりエンベロープ 蛋白質遺伝子産物を誘導発現されるように設計された上記プラスミド pCALNdLw/F を、リン酸カルシウム法（mammalian transfection kit (Stratagene))により、周知のプロ トコールに従って LLC-MK細胞に遺伝子導入を行う。限界希釈により細胞をクロー-
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ングした後、細胞を拡大培養し、導入遺伝子の高発現細胞株の選別を行う。このた めには、例えばアデノウイルス AxCANCreを斉藤らの方法（Saito et al., Nucl. Acids R es. 1995: 23; 3816-3821; Arai, T.et al" J. Virol. 1998: 72; 1115-1121)により例えば moi=3〜5で感染させ、ウェスタンブロッテイングまたはウィルス生産により、細胞を選 択する。
[0048] 回収されたウィルスの力価は、例えば CIU (Cell Infecting Unit)測定または赤血球 凝集活性 (HA)の測定することにより決定することができる (WO00/70070; Kato, A. et al., uenes し ells. 1996: 丄； 569—579; Yonemitsu, Y. & Kaneda, Y., Hemaggulutinatin g virus of Japan— liposome— mediated gene delivery to vascular cells. Ed. by Baker A H. Molecular Biology of Vascular Diseases. Method in Molecular Medicine: Humana Press. 1999: 295-306; Kiyotani, K. et al., Virology. 1990: 177; 65-74)。また、 GFP ( 緑色蛍光蛋白質)などのマーカー遺伝子を搭載したベクターについては、マーカー を指標に直接的に感染細胞をカウントすることにより力価を定量することができる（例 えば GFP-CIUとして)。このようにして測定した力価は、 CIUと同等に扱うことができる（ WO00/70070)。
[0049] ウィルスが再構成する限り、再構成に用いる宿主細胞は特に制限されな 、。例えば 、サル腎由来の LLC- MK細胞および CV- 1細胞（例えば ATCC CCL- 70)、ノヽムスタ
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ー腎由来の BHK細胞（例えば ATCC CCL-10)などの培養細胞、ヒト由来細胞等を 使うことができる。これらの細胞に適当なエンベロープ蛋白質を発現させることで、そ の蛋白質をエンベロープに有する感染性ウィルス粒子を得ることもできる。また、大量 にウィルスベクターを得るために、上記の宿主カゝら得られたウィルスベクターを発育 鶏卵に感染させ、ベクターを増幅することができる。鶏卵を使ったウィルスベクターの 製造方法は既に開発されている（中西ら編, (1993),「神経科学研究の先端技術プロト コール III,分子神経細胞生理学」，厚生社，大阪， ρρ.153-172)。具体的には、例え ば、受精卵を培養器に入れ 9〜12日間 37〜38°Cで培養し、胚を成長させる。ウィル スベクターを尿膜腔へ接種し、数日間（例えば 3日間）卵を培養してウィルスベクター を増殖させる。培養期間等の条件は、使用する組み換えセンダイウィルスにより変わ り得る。その後、ウィルスを含んだ尿液を回収する。尿液からのセンダイウィルスべク ターの分離 ·精製は常法に従って行うことができる（田代眞人,「ウィルス実験プロトコ 一ル」，永井、石浜監修，メジカルビユー社， pp.68-73,(1995))。
[0050] 回収したウィルスベクターは実質的に純粋になるよう精製することができる。精製方 法はフィルトレーシヨン (濾過）、遠心分離、吸着、およびカラム精製等を含む公知の 精製 ·分離方法またはその任意の組み合わせにより行うことができる。「実質的に純 粋」とは、ウィルスベクターを含む溶液中で該ウィルスの成分が主要な割合を占める ことを言う。例えば実質的に純粋なウィルスベクター組成物は、溶液中に含まれる全 蛋白質 (但しキャリアーや安定剤として加えた蛋白質は除く）のうち、ウィルスベクター の成分として含まれる蛋白質の割合が 10% (重量/重量）以上、好ましくは 20%以上、よ り好ましくは 50%以上、好ましくは 70%以上、より好ましくは 80%以上、さらに好ましく は 90%以上を占めることにより確認することができる。例えばパラミクソウィルスベクタ 一であれば、具体的な精製方法としては、セルロース硫酸エステルまたは架橋ポリサ ッカライド硫酸エステルを用いる方法 (特公昭 62-30752号公報、特公昭 62-33879号 公報、および特公昭 62-30753号公報）、およびフコース硫酸含有多糖および/または その分解物に吸着させる方法 (WO97/32010)等を例示することができる力 これらに 制限されない。
[0051] 上記のマイナス鎖 RNAウィルスベクターを造血細胞に感染させ、造血細胞移植組 成物を製造することができる。本発明は、マイナス鎖 RNAウィルスベクターを用いた造 血細胞移植組成物の製造方法、および造血細胞移植組成物の製造におけるマイナ ス鎖 RNAウィルスベクターの使用に関する。
[0052] 造血細胞とは、白血球、赤血球、または血小板の少なくともいずれかの血液細胞に 分化し得る細胞を言う。造血細胞には、骨髄細胞、造血前駆細胞、造血幹細胞 (hem atopoietic stem cell ; HSC)などが含まれる。本発明において用いる造血細胞は、好ま しくは白血球、赤血球、および血小板の少なくとも 3系統に分ィ匕する能力を持つ細胞 である。造血前駆細胞とは、血液細胞の少なくともいずれかの系統に分ィ匕できる細胞 であり、血液細胞の各系統へ分化が進み、多分化能を消失した細胞 (リンパ球系、顆 粒球系、赤血球系、血小板系へ分化する細胞)も含まれる。造血幹細胞とは、自己 複製能と多分化能を有する細胞で、少なくとも白血球、赤血球、および血小板の 3系 統に分化する能力を持つ細胞である。造血細胞は、体性細胞 (神経系、肝臓、心臓 など）へ分化することのできるものであってもよい（Weissman IL. et al.， Science, 2000: 287; 1442-1446; Lagasse E. et al, Immunity, 2001: 14; 425-436; Anderson DJ. et al. Nat Med, 2001: 7; 393-395)。
[0053] 各血液細胞は、その形態や染色の特異性から同定することが可能である。染色法 としては、ギムザ染色、ライト染色、メイ—ギムザ染色、メイ—ダリユンワルド—ギムザ染 色、ペルォキシダーゼ染色、エラスターゼ染色、 PAS染色等を用いることができる（新 生化学実験講座 8,血液 (上)， 1987, 8-15ページ参照)。
[0054] 造血幹細胞は、骨髄のみならず末梢血および臍帯血中にも存在する。本発明にお いて造血細胞移植とは、造血細胞を含む細胞組成物を移植することを言い、骨髄移 植 (BMT)、末梢血幹細胞移植 (PBSCT)、および臍帯血幹細胞移植 (CBSCT)など が含まれる。すなわち本発明は、骨髄細胞移植のみならず、末梢血造血幹細胞移植 および臍帯血移植においても適用することができる。 HSCの同定は、顆粒球、単球の 前駆細胞をコロニーアツセィ法で算定したり、 HSCに特徴的と考えられる CD34 (抗原 )陽性細胞をフローサイトメーターで測定することにより実施することができる。具体的 には、造血細胞としては、マウスであれば C- kit+、 Thyl.l10", lin―、 Sea- l+ (Osawa M, H anada K, Hamada H, Nakauchi H. Science. 1996; 273: 242-245.)、ヒトでは CD34+、 T hy+、 Lin―、 c-kit'0" (Bhatia M, Wang JC, Kapp U, Bonnet D, Dick JE. Proc Natl Acad Sci U S A. 1997; 94:5320-5325)の表現型を有する細胞が挙げられる。 lin" (lineage n egative)の表現型は、適宜市販のキット等を用いて同定および選択することができる 伊 [Jえば GPA、 CD3、 CD2、 CD56、 CD24、 CD19、 CD14、 CD16、および CD99b が全て negativeのものである。
[0055] ヒト造血幹細胞の分離方法は、以下の文献も参照することができる（Leary AG, Bloo d 69: 953, 1987; Sutherland HJ, Blood 74: 1563, 1989; Andrews RG, J Exp Med 169 ： 1721. 1989; Terstappen LWMM, Blood 77: 1218, 1991; Lansdorp PM, J Exp Med 175: 1501, 1992; Briddell RA, Blood 79: 3159, 1992; Gunji Y, Blood 80: 429, 1992; Craig W, J Exp Med 177: 1331, 1993; Gunji Y, Blood 82: 3283, 1993; Traycoff CN, Exp Hematol 22: 215, 1994; Huang S, Blood 83: 1515, 1994; DiGinsto D, Blood 84: 421, 1994; Murray L, Blood 85: 368, 1995; Hao Qし, Blood 86: 3745, 1995; Laver J H, Exp Hematol 23: 1515, 1995; Berardi AC, Science 267: 104, 1995; Kawashima I, Blood 87: 4136, 1996; Leemhuis T, Exp Hematol 24: 1215, 1996; Civin CI, Blood 8 8: 4102, 1996; Larochelle A, Nature Med 2: 1329, 1996; Tajima S, J Exp Med 184: 1357, 1996; Sakabe H, Stem Cells 15: 73, 1997; Sakabe H, Leukemia 12: 728, 1998 ；原田実根他編，新しい造血幹細胞移植，南江堂， 1998, 9-23ページ)。
[0056] 例えばマウスの骨髄細胞は、大腿骨、及び頸骨より骨髄細胞をフラッシュにて採取 し、 Lysing buffer (0.38% NH CI in Tris- HC1, pH7.65)にて赤血球除去後、抗 Thyl.2
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抗体およびゥサギ補体を用いた抗体補体反応による成熟 τ細胞の除去後に得られる
(Tomita Y, Mayumi H, Eto M, Nomoto K. J Immunol. 1990; 144: 463-473.)。または 、採取骨髄細胞を抗 B220 (B細胞)抗体、抗 CD3 (T細胞)抗体、抗 Gr-1 (顆粒球)抗 体、抗 Mac- 1 (マクロファージ）抗体、抗 DX-5 (NK細胞）抗体等の抗体でビーズあるい は遠心法にて lineageを除去して得られる（Sato T, Laver JH, Ogawa M. Blood. 1999; 94: 2548-2554.) o
[0057] ヒト造血細胞を骨髄より採取する場合は、全身麻酔下、腹臥位で、腸骨の左右それ ぞれ 3〜5ケ所から、 1回に数 ml程度の骨髄液を採取する（末梢血混入を避けるため )。採取量は同種移植の場合では細胞数は 3 (2〜5) X 108/kg (患者体重あたり）、自 家移植の場合で 1〜3 X 10Vkgを目標として骨髄採取する。骨組織などの混入がある ためメッシュを通した後，ノ ッグにつめる。移植の際には粗いフィルターを用いて輸注 する。同種移植の場合は、ヒト白血球抗原（human lymphocyte antigen； HLA)適合ド ナーを選択することが好ましい。但し、 GVHD予防法の確立、新しい免疫抑制剤の開 発、および CD34陽性細胞の純ィ匕技術などにより、 HLA不一致のドナーでも移植は可 能になってきている。ドナーとしては、 HLA- A、 - B、および- DRの 3組 6抗原のうち、 4 種類以上、より好ましくは 5種類以上、より好ましくは全てがレシピエントと一致すること が好ましい。 ABOmajor不適合移植の場合、遠心分離により赤血球を除去したものを 用いる。 ABOminor不適合の場合、遠心分離にて血漿を除去したものを用いる。（森 下ら編、『造血幹細胞移植マニュアル』第 2版、小寺、斎藤監修、日本医学館、東京、 (1"9年） P260-277、参照）。
[0058] 末梢血より末梢血幹細胞を採取する場合は、 G-CSF 1 日 400 g/m (又は 10 μ g/k g)を 1回、または 2回に分割し、 5 日間または採取終了時まで連日皮下注射し、投与 開始 4日目カゝら 6日目までの期間に 1から 3回、末梢血 (静脈)から血球分離装置を用 V、て造血幹細胞を採取することによって得られる（日本造血細胞移植学会のウェブ ページにおける造血幹細胞移植に関するガイドラインの説明資料 (2003年 4月 21日 改訂第 3版)を参照)。末梢血幹細胞 (PBSC)の動員については、 Harada M et al, J. Hematother 5: 63—71 , 1996、 Waller CF et al. , Bone Marrow Transplant 18: 279—28 3, 1996、 Anderlini P et al. , Blood 90: 903-908, 1997、原田実根他編，新しい造血幹 細胞移植，南江堂， 1998, 67-72ページ、名古屋 BMTグループ編，造血細胞移植マ -ュアル改訂三版， 2004, 237- 240ページも参照のこと。動員に用いる G- CSFとして は、野生型蛋白質の他、 N末端を改変した誘導体 (nartograstinなど）、糖鎖が付加さ れた修飾蛋白質 (lenograstinなど）を用いることができる。また G- CSFと他の造血因子 を併用してもよい。例えば、 GM-CSF、 IL-3、または SCFなどを併用することができる（ Huhn RD et al., Exp Hematol 24: 839—847, 1996; Begley CG et al., Blood 90: 3378 -3389, 1997; Lane TA et al" Blood 85: 275-282, 1995)。 G- CSF投与中は、腰痛、 骨痛および発熱などの全身症状の軽減や、血小板凝集能亢進の防止のため、 aspiri nを投与することができる。
[0059] ヒト末梢血造血幹細胞 (CD34+細胞）を得るには、上記で得られた末梢血幹細胞か ら CD34陽性細胞を CD34抗体磁気ビーズでの濃縮法 Isolex system (Baxter社など）、 CliniMACS (AmCell社）、アビジンカラムを通しての濃縮法（CEPRATE、 Cellpro社）、 CD34抗体をフラスコに固定ィ匕し、反応する細胞をフラスコに吸着させ、残りを洗い流 す (CELLECTOR、 AIS社)等の方法で CD34陽性細胞を分離採取することで得られる (森下ら編、『造血幹細胞移植マニュアル』第 2版、小寺、斎藤監修、日本医学館、東 京、（1"9年） p260-277、参照）。
[0060] ヒト臍帯血細胞移植では、採取した臍帯血に、赤血球沈降剤血球を加え、重量によ つて各血液画分に分け、移植時には不要となる血漿画分、赤血球画分を除き、必要 な造血幹細胞を得る。更に CD34陽性細胞を Isolex system (Baxter社）、 CliniMACS ( AmCell社）、アビジンカラムを通しての濃縮法（CEPRATE、 Cellpro社）、 CD34抗体を フラスコに固定ィ匕し、反応する細胞をフラスコに吸着させ、残りを洗い流す (CELLEC TOR, AIS社)等の方法によって純化することで臍帯血 CD34陽性造血幹細胞を得る ことができる (森下ら編、『造血幹細胞移植マニュアル』第 2版、小寺、斎藤監修、日 本医学館、東京、（1999年）、 p661-680、参照；)。
[0061] 単離した造血細胞は、例えばメチルセスロース法により、 SCF、 IL-3、 GM- CSF、 G- CSF、 Epoを添カ卩した培養することができる（Sonoda Y. et al., Blood 84: 4099-4106, 1 994; Kimura T. et al., Blood 90: 4767-4778, 1997)。造血細胞は 1 X 102から 1 X lO4/ ml程度で添加し、例えば 37°C、 5% CO、 5% O 下で培養する。但し、培養条件は適
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宜調整してよい。
[0062] 自家移植にぉ 、ては、簡便性の点力 末梢血幹細胞移植が選択されることが多!ヽ 力 自家骨髄移植も適用される。その場合、通常は、化学療法の影響のない造血回 復期に、骨髄の正常造血を確認後、全身麻酔下に腸骨および胸骨から採取する。 目標細胞数は、骨髄有核細胞 3 X 108から 5 X 108/kg程度である。連続式血液成分分 離装置で得られた細胞浮遊液は、顆粒球や赤血球の混入が非常に少ないため、単 核球分離操作を省略することができる。顆粒球や赤血球が多く含まれる場合には、 Fi coll比重遠心法により単核球を分離することができる。骨髄液の場合は、顆粒球や赤 血球の除去と濃縮のため、 Ficoll処理または血液分離装置による単核球分離を行うこ とがでさる。 [0063] 混入した血小板をそのまま輸注すると塞栓などの原因となる場合があるため、採取 後に除去することが好ましい。例えばダブルバックに集めて弱遠心 (200g、 15分)する 力 遠心管に分注して 1600rpm、 10分遠心して血小板を除去し、 RPMI1640培地に交 換することができる。採取した細胞を凍結保存する場合は、 10%自己血清、 10%DM SOを含む RPMI1640培地に浮遊させて凍結させ、 programmed freezerで凍結、液体 窒素中で保存する。細胞濃度は 2 X 107から 6 X 10ソ mlとすることができる。比較的短 期間の細胞保存のためには、細胞浮遊液（1 X 108/ml以下の濃度）に終濃度 6% Hyd rodyethyl Starch (HES)、 5% DMSO、 4% albuminとなるように、氷冷した等量の保存液 を混合し、 - 80°Cの deep freezerで凍結保存することができる（Knudsen LM et al., J. Hematother. 5: 399—406, 1996)。
[0064] 安全な自家移植に必要な CD34陽性細胞数は、およそ 2 X 106/kgである（Schots R e t al., Bone Marrow Transplant. 17: 509—515, 199b; Zimmerman TM et al., Bone Mar row Transplant. 15: 439-444, 1995)。 CD34陽性細胞数は、通常の 2 color flowcytom etryで計測することができる。具体的には、骨髄細胞や末梢血ァフェレ一シス細胞を 溶血処理により赤血球を除去した後、 forward scatterと抗 CD45抗体で展開し、 gateを 決めて赤血球および血小板を除く。次に、この gateを side scatterと抗 CD34抗体で展 開し、好中球などの非特異反応部分を除 、た分画中の細胞数の全細胞数に対する 割合で算定する。この値と、予め血球計測機で測定した血球数から、全 CD34陽性細 胞数が算出できる。
凍結保存した細胞に含まれる viableな幹細胞の数は、コロニー形成法により CFU-G Mを数える方法で知ることができる。移植に必要な CFU-GMの基準は、一般的には 1 X 105〜2 X 105/kgである。
[0065] 上記のように調整した造血細胞をマイナス鎖 RNAウィルスベクターと接触させること により、該マイナス鎖 RNAウィルスベクターを造血細胞に導入することができる。マイ ナス鎖 RNAウィルスベクターと造血細胞との接触は、体内（in vivo)または体外（in vit roまたは ex vivo)で行うことができ、例えば培養液、生理食塩水、血液、血漿、血清、 体液など所望の生理的水溶液中で実施すればよい。
[0066] ベクターと造血細胞との接触においては、 MOI (多重感染度；細胞 1つあたりの感染 ウィルス数）は 1〜500の間にすることが好ましぐより好ましくは 2〜300、さらに好ましく は 3〜200、さらに好ましくは 5〜100、さらに好ましくは？〜 70である。ベクターと造血細 胞との接触は短い時間でも十分であり、例えば 1分以上、好ましくは 3分以上、 5分以 上、 10分以上、または 20分以上接触させればよぐ例えば 1〜60分程度、より特定す れば 5分〜 30分程度であってよい。もちろん、それ以上の時間接触させてもよぐ例え ば数日間またはそれ以上接触させてもよい。
[0067] ベクターを導入した造血細胞は、薬理学的に許容される所望の担体または媒体と 組み合わせて造血細胞移植組成物とすることができる。「薬学的に許容される担体ま たは媒体」とは、生細胞を懸濁できる溶液であれば制限はない。例えばリン酸緩衝生 理食塩水（PBS)、塩ィ匕ナトリウム溶液、リンゲル溶液、培養液等が挙げられる
[0068] また造血細胞移植組成物は、ベクターを導入して 、な 、造血細胞が含まれて!/、て もよい。ベクターを導入した造血細胞と、ベクターを導入していない造血細胞を混合 することにより、造血細胞の生着効率は上昇し得る。混合比率は、それに限定されな V、が、例えばベクター導入造血細胞：非導入造血細胞を 1： 10〜10： 1の間で適宜調 整してよい。
[0069] また本発明は、マイナス鎖 RNAウィルスベクターが導入された造血細胞から血液細 胞を再構築させる方法に関する。この方法は、（a)マイナス鎖 RNAウィルスベクターを 造血細胞に接触させる工程、および (b)工程 (a)の造血細胞を動物に注入する工程 、を含む。マイナス鎖 RNAウィルスベクターは細胞質ベクターであり、造血細胞の染 色体にインテグレートすることはないため、レトロウイルスのような染色体損傷のリスク がない。し力も、本発明において、マイナス鎖 RNAウィルスは造血細胞の細胞質中で 複製し、造血細胞が分裂しても娘細胞にベクターが分配され、再構築された血液細 胞中でも導入遺伝子の発現が持続できることが証明された。
[0070] 血液細胞とは、血液中の細胞成分を言 、、具体的には白血球、赤血球、および血 小板が含まれる。血液細胞を生成させるとは、これらの血液細胞のいずれか、好まし くは白血球、赤血球、および血小板の全てを生成させることである。また白血球は、 顆粒球、単球、リンパ球が含まれ、本発明において白血球とは、それらのいずれかの 細胞を意味する。本発明の方法により、マイナス鎖 RNAウィルスベクターが導入され た造血細胞は 3系統への分ィ匕が可能である。すなわち造血細胞移植により、マイナ ス鎖 RNAウィルスベクターが導入された造血細胞から白血球、赤血球、および血小 板が生成する。
[0071] 造血細胞の移植は、適宜周知の移植プロトコルに従って実施することができる。造 血細胞移植の対象となる動物に特に制限はないが、例えば所望の哺乳動物が挙げ られ、例えばマウス、ラット、ィヌ、ブタ、ネコ、ゥシ、ゥサギ、ヒッジ、ャギ、サルなどの 非ヒト哺乳動物およびヒトが含まれる。例えばマウスにおいては、投与細胞数は 1匹あ たり、 5.0 X 106力 2.0 X 107、好ましくは約 1.0xl07、好ましくは約 2.0xl07を尾静脈、 陰茎静脈、または眼底静脈より one shot静脈注射にて投与することができる（Tomita Y, Mayumi H, Eto M, Nomoto K. J Immunol. 1990; 144: 463-473.)。ヒトの骨髄細胞 移植では、個体あたり、 2 X 108/kgから 3 X 108/kg、好ましくは約 3 X 108/kgを経静脈 的に点滴投与する。ヒトの末梢血造血幹細胞移植では、個体あたり自家造血幹細胞 移植では 2 X 106/kg以上、同種移植では 5 X 106/kg以上、好ましくは、自家造血幹細 胞移植では約 5 X 106/kg、同種移植では約 10 X 106/kgを経静脈的に点滴投与する。 ヒトの臍帯血造血幹細胞移植では、個体あたり、移植必要数は 2 X 10ソ kg以上、好ま しくは約 4 X 10ソ kgを経静脈的に点滴投与する。（森下ら編、『造血幹細胞移植マ- ュアル』第 2版、小寺、斎藤監修、日本医学館、東京、（1999年) p260-277、p661-680 、参照）。
[0072] 輸液への血小板の混入による血栓や塞栓を防止するため、抗ヒスタミン剤（hydroxy zine 25mgまたは chlorphenirmine 5mgなど)または gij腎皮質ステロイド (hydrocortiso ne lOOmg)などの前投与を行うことができる。移植に凍結細胞を用いる場合、移植細 胞溶液中の赤血球の溶血が問題となる場合には、ハプトグロビン製剤 4,000単位の 点滴などで尿細管障害を予防することができる。末梢血幹細胞移植の場合は、 2日 間に分けて輸注することも好まし 、。
[0073] ドナー造血細胞の生着を促進するため、造血細胞の注入前に、レシピエントを免疫 抑制しておくことが好ましい。例えば白血病における骨髄移植では、白血病細胞の 死滅と宿主の免疫担当細胞の不活化のため、造血細胞の移植前に全身照射 (total body irradiation; TBI)を行うことができる。このような処置は、一般に、前処理（Prepar ative regimen)またはコンディショニング（Conditioning)とも呼ばれる。 TBIは急性'慢 性のいずれの白血病でも対象となる。このとき、メルファラン、シクロホスフアミド（CPA )などの抗癌剤と併用することができる。しかし TBIはさまざまな障害の原因にもなるた め、これらを避けるためにブスルファンと CPAの BUCY法など抗癌剤だけの前処置を 選択することもできる（Inoue, T. et al., Strahlenther Onkol 169: 250-255, 1993; Blais e, D. et al., Blood. 1992: 79; 2578-2582; Blume, KG. et al., Blood. 1993: 81; 2187- 2193; Hartman, A. et al" Bone Marrow Transplant. 1998: 22; 439-443)。また、骨髄 移植と同時に Donor Lymphocyte Infosion (DLI)を行うことで、前処置の線量を軽減す ることが可能である。
[0074] 放射線照射を行う場合は、長 SAD (Source axis distance) (または SSD (Source skin distance)法、スイープビーム法、ビーム移動法、治療寝台移動法等の照射方法を適 用することができる。このうち、長 SAD (SSD)法は、特殊な装置を必要としない点で簡 便であり、良く用いられている。照射は、 1回照射または分割照射であってよいが、分 割照射の方が正常細胞の回復が期待できる。 1回照射は、例えばヒトであれば一回 あたり 10Gy (6cGy/min)、分割照射であれば、 12Gy(6cGy/min)を 6回 /6日、 1.8Gy/ 回を 2〜3回/日（総線量 15Gy程度）、または 2〜3Gy/回で 1〜2回/日（総線量 12Gy程 度)などが例示できるが、線量は適宜調整されてよい。
[0075] また、前処置を行わなくても、ドナー造血細胞を多数注入すれば、造血細胞が骨髄 に生着することが動物実験により証明されている。これは、ドナー造血細胞の生着に は必ずしも骨髄破壊的前処置は必要がないことを示している。これを基に、宿主の免 疫抑制のみを実施する骨髄非破壊的前処置を用いる造血幹細胞移植、 Vヽゎゆるミ 二移植（Mini-transplant:ミニトランスプラント）が開発されており、これに本発明を適 用することも可能である。ミニ移植は骨髄破壊的前処置を伴う移植とは異なり合併症 も軽いため、高齢者や臓器障害のある患者にまで適応が拡大される。本発明におい て免疫抑制には、 TBIなどの骨髄破壊的処置のみならず、免疫抑制剤などによる骨 髄非破壊的処置が含まれる。前処置に用いる免疫抑制剤としては、フルダラビン、ク ラドリビンなどの抗癌剤ゃ抗胸腺グロブリンが用いられる。このような前処置後に造血 幹細胞移植を行うことで、患者とドナーの造血細胞が混在する骨髄の混合キメラ、も しくはすべてドナーの造血細胞に入れ替わった骨髄となる完全キメラを作り出すこと が可能である。再生不良性貧血のような非悪性疾患では、骨髄非破壊的前処置によ る混合キメラを適用できるが、白血病などの腫瘍では大量のリンパ球を注入して完全 キメラ化する。骨髄破壊を伴わな 、造血細胞移植が有効と考えられる疾患としては、 例えば腎癌、悪性黒色腫、低悪性度リンパ腫、再生不良性貧血などがある。再発リス クの高 、腫瘍に対しては骨髄破壊の方が好ま 、。ミニ移植の前処置で照射を行う 場合は、例えば l〜2Gy/l回程度の小線量 TBIが適用される。また、従来の前処置と ミニ移植との中間的な前処置である、 reduced conditioning療法も開発されている。こ れらの前処理を本発明にお 、て用いることもできる。
[0076] 移植において抗癌剤の大量投与や全身照射を行った場合は、全身の造血が抑え られ、感染に対する抵抗力が著しく低下する。従って、移植期間中は無菌室で過ごし 、外界力もの感染を予防することが好ましい。但し、 HSCのソースとして末梢血を用い る同種末梢血幹糸田包移 ¾ (allogeneic peripheral blood stem cell transplantation； alio -PBSCT)を行うことで早期の造血能回復が得られるため、完全無菌室管理を行わな くとも移植は可能になっている。移植が成功すれば、約 20日程度で白血球数は増加 する。一般に、末梢血幹細胞移植のほうが骨髄移植より回復が早い。血球の増加が 少な 、場合は、さらに造血幹細胞移植を実施することができる。
[0077] 自家移植の場合は、移植した造血幹細胞の数が十分あれば生着に問題はな！/、が 、同種移植の場合、ドナーとレシピエントが遺伝学的に同一でない限り、移植片が持 つ抗原に対しレシピエントの T細胞が反応し生着不全を起こす。そのため、移植前の 前治療には、ドナーの HSCが生着するための免疫抑制効果が必要となる。また逆に HSCが生着してドナー由来の造血能が回復すると、ドナー由来の T細胞がレシピエン トの細胞を攻撃し移植片対宿主病 (GVHD)が発症する。 GVHDは同種移植後の生 命予後を決定する重要な因子となるため、発症予防のために免疫抑制療法が行わ れる。急性 GVHDは通常同種移植後 2〜6週間以内に発症する。また、サイトメガロウ ィルスなどの感染症や免疫抑制剤による microangiopathyも併発することもある。診断 には、皮膚や胃、十二指腸、大腸、直腸など力 の生検が有用である。中等症以上 の場合は、副腎皮質ステロイドによる治療を行う。ステロイドに反応しない場合は、抗 胸腺細胞グロブリンやタクロリムスなどの免疫抑制剤を用いる。血縁者間の移植では 、シクロスポリンとメトトレキサート、非血縁者間ではタクロリムスとメトトレキサートが予 防薬として用いられることが多い。慢性 GVHDは、典型的には移植後 100日前後に、 同種移植を受けた長期生存者中に一定の割合で発症する。臨床所見としては、強 皮症、扁平苔癬、 Sjogren症候群、原発性胆汁性肝硬変などの自己免疫疾患によく 似ており、口唇や皮膚の生検、肝生検などによって診断が可能である。治療としては シクロスポリンと副腎皮質ステロイドが主体で、皮膚病変に対しては PUVA (Psoralens with Ultraviolet A)などの光線療法を実施することもできる。
本発明における造血細胞移植は、例えば再生不良性貧血、白血病 (急性骨髄性 白血病および急性リンパ性白血病などの急性白血病、並びに慢性骨髄性白血病な ど）、骨髄異形成症候群、リンパ腫 (ホジキン病、非ホジキンリンパ腫などを含む）、骨 髄腫などの血液疾患、化学療法が有効な悪性腫瘍 (乳がん、胚細胞腫などを含む） 、先天性疾患などの治療として実施することができる。適応疾患については、単一遺 伝子欠損あるいは発現系異常 (プロモーターの欠損、あるいは制御異常によるものな ど）、または 2つ以上の遺伝子欠損あるいは発現系異常による疾患においても適応可 能である。また、血球系の異常のみならず、骨髄幹細胞より分化可能とされる神経系 細胞、肝細胞などの体細胞の遺伝子異常を要因とする疾患にっ ヽても適応となる。 また、遺伝子異常疾患のみならず、分泌蛋白などの供給細胞として用いた場合に治 療効果が期待できる疾患にも応用可能である。例えば、単一遺伝子欠損症としては 、 X-linked SCID、 ADA欠損症、血友病、無免疫グロブリン血症、高 IgM血症、慢性肉 芽腫症など、複数遺伝子欠損症に関しては、発作性夜間血色素尿症などが挙げら れ、それぞれの原因遺伝子を造血幹細胞に遺伝子導入後、細胞移植を行うことで治 療効果が期待できる。造血細胞移植における遺伝子治療が有効と考えられる疾患お よびその遺伝子を例示すれば、例えば Hurler病、 Scheie病、および Hurler-Scheie病（ — L— lduronidaseま 7こ ίま lduronate sulfatase)、 SanfilippoM (N— sulfatase、 N-acetyl- - D- glucosaminidase、 a - D- flucosaminidase- N- acetyltransferase)、 Morquio病 (galac tosamine- β -sulfate sulfataseまたは β -galactosidase)、 Maroteaux- Lamy症候群 (N- acetylgalactosamine— 4— sulphatase)、 ¾ly¾ ( β -glucuronidase)、 Gaucherji丙、 β— gluco cerebrosidase)、 Farber病 (acid ceramidase)、 Niemann— Pick丙 (acid sphingomyekinas e)、 Krabbe病 (galactocerebroside β -galactosidase)、 Metachromatic leucodystrophy (arylsufatase A)、 Fabry丙、 -galactosidase A)、 SCID (adenosine deaminase)、 X- li nked SCID (gamma- c receptor)、 X連鎖無ガンマグロブリン血症（X- linked agammagl obulinemia ; XL v (Bruton s tyrosine kinaseノ、 JAK— 3欠損症 (JaK— 3)、 Aspartyglycoa minuria (aspartyglycosaminidase)、 Fucosidoses ( - L- !Ucosidase)、 Guibaud- Vainsel 症恢 (carbonic anhydrase II)、 Thallassemias ( ct - β - globin)、 G6PD欠損症 (glue ose- 6- phosphate dehydrogenase)、 PK欠損症 (pyruvate kinase L型)、 Erythropoietic porphyia (uroporphyrinogen III synthase)など力举げられる。また、プリンヌクレ才シド フォスフオリラーゼ欠損症については原因遺伝子である purine nucleoside phosphoryl ase (PNP)、 X連鎖重症複合免疫不全症については IL-2レセプター Ύ鎖（Ύ C)、 X染 色体連鎖性慢性肉芽腫症にっ 、ては NADPHォキシダーゼを構成するサブユニット の 1つである gp91 などが例示できる。また、固形悪性腫瘍や血液悪性腫瘍の造血 幹細胞移植の際に、腫瘍特異的な分子を標的とするキメラ毒素の遺伝子導入などに よって、抗腫瘍効果の増強などを惹起することが可能と考えられる。また、癌の化学 療法の副作用の軽減のために、多剤耐性遺伝子 MDR-1を導入することも考えられ る。さらに、後天性免疫不全症候群 (AIDS)の治療のために抗 HIV遺伝子 (例えば RR E decoy, envアンチセンス）の遺伝子治療が可能である。
実施例
[0079] 以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に制 限されるものではない。なお、本明細書中に引用された文献は、すべて本明細書の 一部として組み込まれる。
[0080] 使用動物
7週齢雌性 C57BL/6Jマウス及び同 Balb/cマウス（KBTオリエンタル）、 GFPトランスジ エニックマウス C57BL/6—TgN(act—EGFP)OsbC14—Y01—FM131 (Okabe M, Ikawa M, Kominami K, Nakanishi T, Nishimune Y. FEBS Lett. 1997; 407:313— 319)をドナーと して用い、同 C57BL/6、 Balb/c nu/nuをレシピエントとして使用した。
[0081] ベクター（SeV18+/dF- GFPゝ SeV18+/dFMtsHNtsPLmut- GFP)の構築 F遺伝子を欠損し GFP遺伝子を搭載する SeV18+/dF- GFP (以下 SeV/dF- GFP)のべ クタ一テンプレートとなるプラスミド pSeV18+/dF- GFPは、センダイウィルス Z株の全長 c DNAを挿入、リーダー配列と NP遺伝子間に挿入されたスぺーサー配列に人為的に 構築した Notl切断部位に供与核酸である GFP cDNAを挿入し、さらに F遺伝子領域 を削除することにより作成した。 SeV18+/dFMtsHNtsPLmut- GFP (以下 tsSeV/dF- GFP) については、同様のプラスミドにさらに M遺伝子（G69E, T116A, A183S)、 HN遺伝子 (A262T, G264R, K461G)、および P, L遺伝子（P遺伝子： L511F, L遺伝子： N1197S, K1795E)に対し変異を挿入した（Inoue M, et al. J Virol 2003;77:3238-3246; Inoue M, et al. Mol. Ther. 2003; 7(5):S37) G
双方のベクター構築にはマイナス鎖 RNAウィルスを cDNAより作製させるためのリバ ースジエネテイクス法を用いた（Inoue M, et. al. J Virol 2003; 77:3238-3246)。具体 的には pSeV/dF- GFPあるいは pSeV18+/dFMtsHNtsPLmut- GFPと、 N、 P、 Lおよび F蛋 白質を発現するプラスミドを同時にサル腎臓由来 LLC-MK 細胞にトランスフエクショ
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ンすることにより作成した。 F遺伝子産物はベクターの再構成に必要であるため、 F蛋 白質を継続的に発現している LLC-MK細胞を使ってトランスに供給することにより増
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幅させた。
造血細胞への遺伝子導入とマウスへの移植
以下の実験は、全て無菌操作にて施行した。
ドナーマウスの大腿骨より採取した骨髄細胞は、 10%FBS + RPMI1640 (Gibco BRL )中に 23ゲージ針付き注射器でフラッシュした。その後、赤血球を Lysing buffer (0.38% NH CI in Tris-HCl, pH7.65)にて除去、さらに成熟 T細胞を完全に取り除くために抗
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Thyl.2抗体 (マウス腹水 IgMモノクローナル抗体、明治乳業株式会社ヘルスサイェン ス研究所、東京）とゥサギ補体（CL3051, CEDARLANE, Ontario CANADA)を骨髄 細胞に反応させた。
T細胞除去骨髄細胞を 1 X 10ソ mlに調節後、重複感染度 (multiplicity of infections: MOI) = 10でベクターに感染させ、 37°C恒温槽で約 1時間インキュベートした。その 後一部をプレートに播き 48時間後フローサイトメトリー（FACSCaliber, Becton Dickins on, CA)にて GFP遺伝子の発現を確認した。採取された骨髄細胞は 3回洗浄、遠心 後、 serum freeの RPMI1640で希釈調節した。それぞれレシピエントマウス： C57BL/6 は 2 X 10ソ 200 μ 1、 nu/nu- BALB/Cは 4 x 10ソ 200 μ 1それぞれ尾静脈から 30ゲージ 注射器で注入した。このレシピエントマウスは移植 4〜6時間前に γ線をそれぞれ C57 BL/6は致死量の 10 Gry、 nu/nu-BALB/Cは亜致死量の 7 Gry照射した。なお、細胞 性免疫抑制のための FK506投与群は骨髄移植 2週間後力も FK506 (tacrolimus,藤沢 薬品工業株式会社， 大阪）を 5 mg/kg連日腹腔内投与した。また、 no- spleenマウス は移植 2日前に開腹し脾臓を除去した。
[0083] フローサイトメトリー
骨髄移植から 1, 4, 8, 12週間後の末梢血を尾静脈カゝら採血し、 GFP陽性細胞につ いて FACSにて解析した。まず、末梢血は赤血球を Lysing bufferで除去し、 2回 HANK S液で洗浄の後約 Ixl05〜lxl06/mlに調節した。解析前に、 PI (propidium iodide)染 色を行い、死細胞を除外した。また、それぞれのマウスの脾臓、骨髄、胸腺での GFP 陽性細胞分画の確認のため、 Fcブロックの後、榭状細胞（DC)と単球/マクロファージ (Μ Φ )の判定のために、 anti- CDl lbPE (1:4, Biosciences Pharmingen CA)と anti- CD l lcAPC (1:5, Biosciences Pharmingen CA)、 B細胞（B- cell)判定には anti- B220APC (1:13, Becton Dickinson CA)と anti— IgMPE (1:10, Becton Dickinson CA)、 helper T細 胞（hT- cell)と cytotoxic T細胞（cT- cell)の判定のため anti- CD3APC (1:5, Bioscienc es Pharmingen CA)、 anti- CD8PE (l:10,Becton Dickinson CA)もしくは anti- CD4PE ( 1: 10, Becton Dickinson CA)、そしてナチュラルキラー（NK)細胞、 NKT細胞と、 T細 胞（Τ- cell)の判定のため anti- CD3APCと anti- DX5PE (1:5, Biosciences Pharmingen CA)抗体を用いて 30分 4°C下で染色し, FACS Caliber(Becton Dickinson CA)にて 解析を行った。データは FlowJo (TreeStar Inc., San Carlos, CA)もしくは CellQuest™ software (Becton Dickinson CA)を用 ヽて評価した。
[0084] 血清中抗 SeV抗体価の測定
骨髄移植力 1, 4, 8, 12週間後、マウスの尾静脈力 末梢血を採血管で採取し、常 温で 30分間静置後、 10,000rpmで 5分間遠心分離した。その上清をストックし- 80°Cで 保管した。検査時に室温で解凍し、血清中の抗 SeV抗体価を MONILISA™ HVJ Enzy me— linked Immunosorbent Assay kit (Wakamoto Pharmaceutical Co. Ltd.,東, ¾Uを 用いて測定した。
[0085] 血液検査
骨髄移植力 1, 4, 8, 12週間後、マウスの尾静脈力 末梢血を採血管で採取し、末 梢血 20 μ 1に対して、血球計算用希釈液 50 μ 1で希釈し、ジダ血モードで全自動血球 計数器 (Celltac a MEK-6158, 日本光電，東京）を用いて検査した。
[0086] CTL活性の測定
レシピエントマウスの spleenをスライドガラスにてすりつぶし、 lysing後 10%FCS入り RP Ml 1640 +ペニシリン + DM添カ卩培地にて 5 x 106/ml希釈し、 SeVペプチド 1 mMと混 合した後、 24穴プレートに播種、 5日間培養した。培養 3日目では培地交換とともに IL - 2を培地 lmlにっき 3 l (30U/ml以上）添カ卩し、 IL- 2と 48時間共培養した。
標的細胞（EL4: American Type Culture Collections)は 1 x 106/200 μ 1に調整し、 S eVペプチドを M加えた。さらに、 O.lmCiの Na 51CrOを細胞に加え、よく振った後
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に 10%CO条件下で、 15分ごとに振りながら 1.5時間インキュベーションした。
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5曰間培養した細胞を回収し 3穴ずつ 1 X 106、 5 X 105、 2.5 x 105、 1.25 x 105で U底 9 6穴プレートに播種した。これに標的細胞を 100 1ずついれ、 4時間インキュベーショ ンし、 2回洗い後それぞれを γカウンターにかけ、以下の計算式にて SeV特異的 Na 51
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CrOリリースを算出した。
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%specinc release = ((.experimental cpm - spontaneous cpmノ Amaximum cpm - spont aneous cpm)) X 100
最大遊離量は 1% triton X- 100 (Wako Pure Chemical Industries Ltd., Osaka, Japan )を使用した細胞溶解によって得た。自然遊離量は細胞を 0.2mlの培養液のみで培養 することで得た。自然遊離量は最大遊離量の 15%から 20%の範囲であった。それぞ れの個体は 3検体ずつ作成した。
SeVペプチドとしては、既に報告されている CTLの標的配列となり、クラス I抗原に提 示されることが明ら力となっている NP蛋白のアミノ酸配列 NH - FAPGNYPAL-COOH (
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配列番号： 11)を合成して用いた。なお、 tsSeV/dF-GFPの NP蛋白には、同部位の変 異は存在しない。
[0087] 統計解析 統計分析値はすべて平均値士標準誤差として表現した。データは Mann Whitney U- testを用いて解析し、 Pく 0.05を統計学的有意差とした。
[0088] 〔実施例 1〕マウス造血細胞に対する SeVの遺伝子導入効率と同細胞の生着効率
C57BL6マウス骨髄細胞（T細胞除去後）に対する SeV/dF-GFPならびに tsSeV/dF- GFPによる遺伝子導入効率を検討した（図 la)。 MOI=10にて各々のベクター液を骨 髄細胞培養液へ添加、 1時間後に新鮮培養液にて洗浄後、 48時間後の GFP陽性率 を FACSにて解析した。図 1に典型的解析図を示す。 SeV/dF- GFPによる GFP陽性率 は 80.7 ± 2.9% (n=3)、 tsSeV/dF- GFPによるそれは 88.8士 1.9% (n=18)であり、 、ずれも 80%以上の高 、遺伝子導入効率を示した。
次に SeVにて GFP遺伝子を導入した骨髄細胞の放射線照射同種マウスに対する生 着効率を、末梢血細胞における GFP陽性率を指標として検討した (図 lb)。陽性対照 である GFPトランスジエニックマウス（GFP-TG)をドナーとした場合、生着率は経過中 常に 98%以上であり、この効率は移植後 4週目〜8週目も維持されていた (n=3)。 SeV /dF-GFPにて処置した骨髄細胞を移植した場合、移植早期（1週目）より末梢血にお ける GFP陽性率は陽性対照に比べ低く（0.1-2.3%, n=9)、以後 GFP陽性細胞は消失 した。一方で tsSeV/dF-GFPで処理した骨髄細胞を移植した場合、移植早期には比 較的高い GFP陽性率を示した (45-85%, n=10) oその後 GFP陽性率は次第に漸減し、 移植後 4週目では、個体差はあるものの（2.0-26%)、依然平均で 10%以上の末梢血細 胞が GFP陽性であった。
[0089] 〔実施例 2〕tsSeV/dF-GFPにて遺伝子導入された造血細胞のレシピエントにおける 生体内分布ならびに各細胞分画における GFP陽性率
図 1にお 、て比較的生着効率のょ 、マウス 6頭を用いて、 GFP発現細胞が造血系 のいずれに分布するかを検討した（図 2)。この 6頭の末梢血における 5週目の GFP陽 性率は 55.9±5.9%であり、脾臓、胸腺で比較的高かったが、下肢大腿骨骨髄では 17. 1 ± 8.8%であった。
次に脾臓と骨髄において各細胞分画における GFP陽性細胞率を FACSにて解析し た（図 3)。各細胞分画の同定には、 NK cells=CD3—/DX5+、 NKT cells= CD3+/DX5+、 whole T-cells= CD3+/DX5—、 helper T— cells= CD3+/CD4+、 cytotoxic T— cells= CD3+/ CD8、 dendritic cells (DCs)= CDllb /CDllc、 monocytes/ macrophages (M Φ ) = CD llb+/CDllc―、 B-cells= B220+/IgM+を用いた。脾臓'骨髄共に NK、 DC、 ΜΦ、 Βは比 較的陽性率が高力つた。 ΝΚΤ、 Τについては陽性率は比較的低いものの、移植細胞 の Τ細胞分画はほぼ完全に除去されていることより、レシピエントの脾臓'骨髄で検出 された GFP陽性 ΝΚΤ/Τ細胞は、移入された分ィ匕した ΝΚΤ/Τ細胞ではなぐむしろ造 血幹細胞由来のものと考えられた。
[0090] 〔実施例 3〕tsSeV/dF-GFPにて遺伝子導入された造血細胞の 5週目以降のレシピエ ントにおける生着動態
以上の結果から、 tsSeV/dF-GFPによって遺伝子導入された骨髄細胞は、同種レシ ピエントにお 、て repopulation可能であることが示された。しかし GFP陽性率は次第に 減少することが明らかになった。この GFP陽性細胞数の減少をより詳細に検討するた め、より長期の生着動態について検討した。
計 53頭の C57BL6マウスへ tsSeV/dF-GFPにて処置した骨髄細胞を同様の方法で 移植したところ、約 40%のマウスが移植後 5〜7週で死亡した（図 4a)。これらのマウス について、移植後 1週目及び 4週目で末梢血を採取し GFP陽性細胞を確認したが、 死亡したマウスの 4週目の採血において、全例が比較的良好な GFP陽性率（10%以上 )に加え血液の希釈が観察された。そこで移植後 4週目における生着率のよいマウス での血球数を検討した。
図 4bに示すように、無処置マウス (n=6)、及び GFP-TGマウス骨髄を移植されたレシ ピエントマウス (n=6)と比較して、 tsSeV/dF-GFPにて処置した骨髄細胞を移植された レシピエントマウス（全 6頭中 4週目の末梢血中 GFP陽性細胞 10%以上： n=3)では移 植後 4週目における白血球数 (WBC)、赤血球数 (RBC)、血小板 (PLT)全てが著明 に減少していた。
[0091] 〔実施例 4〕 tsSeV/dF-GFPにて遺伝子導入された移植造血細胞に対するレシピエン トにおける免疫学的反応の検討
tsSeV/dF-GFP遺伝子導入骨髄を移植されたレシピエントマウスにおける汎血球減 少の原因を検討するために、同レシピエントマウスにおける SeVに対する免疫反応に ついて検索を行った。 4-1.細胞性免疫反応
tsSeV/dF-GFP遺伝子導入骨髄を移植されたレシピエントマウスにおける 4週目の 末梢血 GFP陽性細胞率と、同個体におけるセンダイウィルス感染細胞に対する特異 的細胞障害性 T細胞活性 (CTL活性)を検討した。
図 5aに示すごとぐ末梢血 GFP陽性細胞率が高い個体 (64.9%)では有意な CTL活 '性を認めるものの、そのレベルは低値に留まって 、た。
図 5aで得られた CTL活性の軽度の上昇力 ¾sSeV/dF-GFP由来 GFP陽性細胞数の 減少に有意に関与するカゝ否かを検討するため、主に細胞性免疫を抑制する FK506 の連日投与 (移植後 2週目より、 5 mg/kg/day)、及びヌードマウスにおける細胞生着 動態を検討した。図 5bに示すごとぐ双方において細胞生着率の上昇は認められな 力つたことから、 tsSeV/dF-GFP遺伝子導入骨髄を移植されたレシピエントマウスにお ける遺伝子導入細胞の排除への CTLの関与は、比較的低いものと考えられた。
[0092] 4-2.液性免疫反応
次に、 tsSeV/dF- GFP遺伝子導入骨髄を移植されたレシピエントマウス (n=34)にお ける液性免疫反応について、 4週目の末梢血 GFP陽性細胞率と抗 SeV抗体の関係に ついて検討した。
図 6aに示すごとぐ 34頭中 11頭は 5週目にて死亡し、 23頭は長期生存した。これ らから移植後 4週目に採取した末梢血 GFP陽性細胞数と同時期の抗 SeV抗体価を検 討すると、 GFP陽性率が高い個体では抗 SeV抗体価が低ぐまた GFP陽性率が低い 個体では抗 SeV抗体価が高 ヽ傾向を認めた（図 6aおよび 6b)。本発明で使用した抗 S eV抗体検出用 ELISAシステムは SeVの膜タンパクを認識するものであるため、 tsSeV/ dF-GFPが感染した骨髄細胞に発現したわずかな膜タンパクに対し、レシピエントが 抗体を産生したものと考えられた。
[0093] 〔実施例 5〕遺伝子導入ならびに非導入細胞混合造血細胞の移植後動態に関する検 討
tsSeV/dF-GFP遺伝子導入骨髄細胞のレシピエント骨髄中あるいは脾臓の血球細 胞の中で、少なくとも一部に除去したはずであるドナー由来の GFP陽性 T細胞が存在 することから、これら GFP陽性 T細胞は tsSeV/dF-GFPにより遺伝子されたドナー細胞 中の造血幹細胞に由来する可能性があると考えられる。一方で tsSeV/dF-GFP遺伝 子導入骨髄細胞のレシピエントには、比較的高い repopulationのまま死亡する群と、 4 週以降速やかに排除されていく群が存在することから、前者は造血幹細胞の多くへ 遺伝子導入され、後者では遺伝子導入効率が低いのではないか、と仮説を立てた。 これを検討するため、 tsSeV/dF-GFPによる遺伝子導入骨髄細胞と非導入骨髄細 胞を等量混合し、レシピエントマウスへ移植した（図 7)。本実験では遺伝子導入のみ の細胞を移植された群では全てのレシピエントマウスが 8週目までに死亡した力 混 合移植群では 5頭全例において GFP陽性末梢血細胞率力 週以降に速やかに低下 して行った。この結果は上記の仮説に矛盾しな 、結果であると考えられた。
〔実施例 6〕 3遺伝子欠損型 SeVベクターを用いた遺伝子導入骨髄細胞移植 体内での SeV/dFMtsHNts- GFP (tsSeV/dGFP)においても考えられる leakyな HN, M 遺伝子の発現の影響を除外するため、全膜蛋白質遺伝子を欠損させた SeV/dFdMd HN- GFP (TriSeV- GFP)を用いて遺伝子導入した骨髄細胞移植を行った。膜タンパ ク質 F, M, HNの発現をなくすために、 F, M, HNの遺伝子を取り除いた TriSeV-GF Pをベクターとして使用した（下記の参考例参照)。骨髄細胞への遺伝子導入とマウス への移植は、以下の手順にて全て無菌操作にて施行した。
ドナーマウス C57BL/6の大腿骨より採取した骨髄細胞は、 10%非動化した FBS (bio -west, Inc., UT) + RPMI 1640培養液（Sigma, Mo) (以下 RPMI1640完全培溶液）中に 23ゲージ針付き注射器でフラッシュした。その後、赤血球を Lysing buffer (0.38% NH
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CI in Tris-HCl, pH7.65)にて除去、さらに成熟 T細胞を完全に取り除くために抗 Thyl .2抗体（M8023, Sigma, Mo)とゥサギ補体（CL3051, CEDARLANE, Ontario, CANAD A)を骨髄細胞に反応させた。
T細胞除去骨髄細胞を 1 X 107 cells/mlに調節後、重複感染度 (multiplicity of infec tions: MOI) = 10でベクターに感染させ、 37°C恒温槽で約 1時間インキュベートした。 その後一部をプレートに播き 48時間後フローサイトメトリー（FACSCaliber, Becton Die kinson, CA)にて GFP遺伝子の発現を確認した。採取された骨髄細胞は 3回洗浄、遠 心後、 serum freeの RPMI1640で希釈調節した。その後、レシピエントマウス C57BL/6 に 2x10ソ 200 1尾静脈力も 30ゲージ注射器で注入した。このレシピエントマウスは移 植 4〜6時間前に γ線を致死量である 10 Gy照射した。
[0095] フローサイトメトリー
骨髄移植後経週的に末梢血を尾静脈から採血し、 GFP陽性細胞について FACS〖こ て解析した。まず、末梢血は赤血球を Lysing bufferで除去し、 2回 HANKS液で洗浄の 後、約 1 X 105〜6cells/mlに調節した。解析前に、 PI (propidium iodide)染色を行い、死 細胞を除外した後、 FACS Caliber (Becton Dickinson)にて解析を行った。 CellQuest software (Becton Dickinson)を用 ヽて平価し 7こ。
[0096] 血清中抗 SeV抗体価の測定
骨髄移植後経週的にマウスの尾静脈カゝら末梢血を採血管で採取し、常温で 30分 間静置後、 10,000 rpmで 5分間遠心分離した。その上清をストックし- 80°Cで保管した 。検査時に室温で解凍し、血清中の抗 SeV抗体価を MONILISA™ HVJ Enzyme-linke d Immunosorbent Assay kit (Wakamoto Pharmaceuticalし o. Ltd.,東 ¾) 用 ヽて孭 U 定した。
[0097] 血液検査
骨髄移植後経週的に、マウスの尾静脈から末梢血を採血管で採取し、末梢血 20 1に対して、血球計算用希釈液 50 1で希釈し、ジダ血モードで全自動血球計数器 (C elltac a MEK-6158, 日本光電，東京）を用いて検査した。
[0098] 上記の手順で 3遺伝子欠損型 SeVを使用した骨髄細胞移植を行った場合、 tsSeV/ d-GFPを使用した際と比べ、末梢血中の GFP陽性細胞率の減少は緩やかな傾向で あった（図 8)。また、 tsSeV/d-GFPを使用した際は、移植後 5週目で 10%以上の GFP 陽性率を示した個体は汎血球減少を伴 、死亡する個体が観察された（図 6a)。また、 長期生存した個体の多くは移植後 5週目以降の GFP陽性率は 1%以下と低下していた (図 6a)。それに比べ、 TriSeV-BMTでは、移植後 8週目においても平均して 5%以上 の GFP陽性率を示し、その死亡率は減少し、長期生存した（図 8、 9)。その後も発現 は持続し、 12wで GFP陽性率は 0.1%以下にまで低下した。抗 SeV抗体価に関しては、 t sSeV/dF-BMTの際のようなはっきりした傾向は見られなかった（図 11 )。
[0099] 〔参考例〕 3遺伝子欠損型ベクターの構築
[1] M/F/HN 3遺伝子欠失型 SeVゲノム cDNAの構築（1) NP遺伝子の前に制限酵素 Notl認識部位を有し、 M/F/HN遺伝子欠失部位に Pad 部位を有する M/F/HN3遺伝子欠失型 SeVベクター（SeV18+NotI/PLmut Δ M Δ F Δ HN- Pad)のウィルスゲノムをコードする cDNA (pSeV18+NotI/PLmut Δ Μ Δ F Δ HN- P ad)を以下の手順で構築した。温度感受性変異である 6種類の変異 (M : G69E, T116 A, A183S、 HN:A262T, G264R, ! 461 及び持続感染36¥由来の変異（？丄51 、 L ： N1197S, K1795E)の合計 9種類の変異を有し、 GFP遺伝子を搭載した F遺伝子欠失 型 SeVベクター (SeV18+NotI/MtsHNtsPLmut Δ F-GFP: WO03/025570)の cDNA(pS eV18+NotI/MtsHNtsPLmut Δ F-GFP)を以下の手順で構築した。 Sailおよび Nhelで 消化した M, HNおよび GFP遺伝子を含むフラグメント（8294bp)を Litmus38 (New Engl and Biolabs, Beverly, MA)の Sall/Nhelサイトにサブクローユングしたプラスミド（Litmu s-MtsHNtsPmut Δ F- GFP: WO03/025570)をテンプレートにして、プライマー（delMF HN-PacF: o -gaggtcgcgcgttaattaagctttcacctcaaacaagcacagatcatgg-ύ' (酉己列番号： 12 )ゝおよひ delMFHN- PacR: 5 -gcatgtttcccaaggggagagttaattaaccaagcactcacaagggac-3' (配列番号： 13) )を用いてインバース（Inverse) PCRを行い、 Padおよび Dpnlで消化 後、セルフライゲーシヨンし、 M, HNおよび GFP遺伝子を欠失したプラスミド（Litmus-P mut Δ M Δ F Δ HN- Pad)を構築した（図 12)。
L遺伝子にニケ所の変異（N1197S, K1795E)を有し、 Sailおよび Nhelの間にマルチ クロー-ングサイト（5'— GTCGACACCAGGTATTTAAATTAATTAATCGCGAGCTA GC- 3'：配列番号： 14)を挿入したプラスミド（pSeV/ A SalINheIfrg-MCS :WO03/0255 70)を Sailおよび Nhelで消化して回収したフラグメント（8294bp)と、 Litmus-Pmut Δ M Δ F Δ HN-PacI (P遺伝子に L511F変異を含む）を Sailおよび Nhelで消化して回収した フラグメント（5008bp)をライゲーシヨンして、 NP遺伝子の前に Notl部位を有し、 M/F/ HN遺伝子欠失部位に Pad部位を有する M/F/HN3遺伝子欠失型 SeVベクターの cD NA (pSeV18+NotI/PLmut Δ Μ Δ F Δ HN- Pad)を構築した（図 13)。センダイウィルス ベクターに治療用遺伝子などの目的遺伝子 (gene of interest： GOI)を搭載する場合 、遺伝子の下流にセンダイウィルスの終止シグナル-介在配列-開始シグナルを付カロ した GOI遺伝子断片を Notl部位を利用して挿入するのが便利である（WO00/70070、 WO03/025570など)。また、搭載した遺伝子の発現量はベクターへの挿入位置によ つて異なり、（-)鎖 RNAゲノムの 3'側で発現量が高ぐ 5'側に行くほど発現量が低下す るという極性効果（polar effect)が知られている（Tokusumi T. et al.， Virus Res. 86, 3 3-28 (2002)) o従って、 SeV18+NotI/PLmut A M A F A HN- Padの Notl部位に GOI遺 伝子を導入することで、 GOIの高い発現が期待できる。また、 Pad部位を利用して、 2 つ目の遺伝子を追加的に搭載することも可能である。
[0101] [2] M/F/HN 3遺伝子欠失型 SeVゲノム cDNAの構築（2)
NP遺伝子の前に BssHII部位を有し、 M/F/HN遺伝子欠失部位に Notl部位を有す る M/F/HN3遺伝子欠失型 SeVベクター（SeV18+BssHII/PLmut Δ M Δ F Δ HN- Notl) の cDNA (pSeV18+BssHII/PLmut Δ Μ Δ F Δ HN- Notl)を以下の手順で構築した。ま ず、 M/F/HN遺伝子欠失部位への Notl部位の導入を行った。 Litmus- Pmut A M A F Δ ΗΝ- Padをテンプレートとして、プライマー（pF(dMdFdHN- Notl): 5'- gaaaaacccaggg tgaaagggcggccgcccataggtcatggatgg— 3' (酉己歹 U番号： 15)、および pR(dMdFdHN— Notl): 5し ccatccatgacctatgggcggccgccctttcaccctgggtttttc- 3， (酉己列番号： 16) )を用いて変 異導入を行い、 Litmus- Pmut A M A F A HN- Notlを構築した（図 14)。変異導入には QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene, La Jolla, CA)を禾 lj用して Kitに記載の方法に従って行った。一方、 NP遺伝子前の Notl部位を BssHII部位へ変 換した。 pSeV/ A SallNhelfrg-MCSをテンプレートとして、プライマー（pl8+BssHII- FW ： 5 - ctgccaaagttcacgcgcgcgtagatcttcacgatgg- (酉列 ¾·号： 1 、およひ pl8+BssHII- RV: ΰ -ccatcgtgaagatctacgcgcgcgtgaactttggcag-3' (目 S歹幡号： 18) )を用いて変異導 入を行い、 pSeV18+BssHII/ A SalINheIfrg- MCSを構築した（図 15)。変異導入には同 様【こ QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene, La Jolla, CA)を禾 lj用 して Kitに記載の方法に従って行った。
[0102] pSeV18+BssHII/ Δ SallNhelfrg-MCSを Sailおよび Nhelで消化して回収したフラグメン ト（8294bp)と、 Litmus-Pmut Δ M Δ F Δ HN- Notlを Sailおよび Nhelで消化して回収した フラグメント（5008bp)をライゲーシヨンして、 NP遺伝子の前に BssHII部位を有し、 M/F /HN遺伝子欠失部位に Notl部位を有する M/F/HN3遺伝子欠失型 SeVベクターの c DNA (pSeVl 8+BssHII/PLmut Δ Μ Δ F Δ HN- Notl)を構築した（図 16)。搭載遺伝子 の発現量は、（-)鎖 RNAゲノムの 3'側で発現量が高ぐ 5'側に行くほど発現量が低下 する。上述の通り、センダイウィルスの終止シグナル-介在配列-開始シグナルを付カロ した GOI遺伝子断片は Notl部位を利用して挿入するのが便利だ力 NP遺伝子の前 に Notl部位を有する上記ベクターを利用した場合に細胞傷害性が出る、ある 、はべ クタ一の回収率 ·生産量が悪いなどの場合に、本ベクターを利用することができる。ま た、 BssHII部位を利用して、 2つ目の遺伝子を搭載することも可能である。
[0103] [3] GFP遺伝子を有する M/F/HN 3遺伝子欠失型 SeVゲノム cDNAの構築
緑色蛍光蛋白質（green fluorescence protein； GFP)遺伝子を M/F/HN遺伝子欠失 部位に有する M/F/HN3遺伝子欠失型 SeVベクター（SeV18+NotI/PLmut Δ M Δ F Δ HN-GFP： SeV/PLmut Δ M Δ F Δ HN— GFPとも記す）の cDNA (pSeV18+NotI/PLmut Δ Μ Δ F Δ HN-GFP)を以下の手順で構築した。 GFP遺伝子の下流に終止シグナル-介 在配列-開始シグナルを有する GFP遺伝子断片を増幅するために、 GFP遺伝子を有 する F遺伝子欠失型 SeVベクター cDNA (pSeV18+/ Δ F- GFP： WO03/025570)をテン プレ1 ~~トとして、フフィマ1 ~~ (pGFP_Sg!N: 5し ctgcgatcgcgccccaagcagacaccacct- 3' (酉己 歹 IJ番号： 19)、および pGFP— SglC: 5 '-tacgcgatcgctgataatggtcgtgatcat-3 ' (配列番号： 20) )を用いて遺伝子を増幅し、 Sgflで切り出し（888bp)、 Litmus-Pmut Δ Μ Δ F Δ HN -Padの M/F/HN欠失部位の Pad部位に組み込み、 Litmus- Pmut Δ Μ Δ F Δ HN-GFP を構築した（図 17)。 pSeV/ A SallNhelfrg-MCSを Sailおよび Nhelで消化して回収した フラグメント（8294bp)と、 Litmus- Pmut Δ Μ Δ F Δ HN- GFPを Sailおよび Nhelで消化し て回収したフラグメント（5896bp)をライゲーシヨンして、 GFP遺伝子を M/F/HN遺伝子 欠失部位に有する M/F/HN3遺伝子欠失型 SeVベクターのゲノムをコードする cDNA( pSeV18+NotI/PLmut Δ Μ Δ F Δ HN-GFP)を構築した（図 18)。 GFP発現の検出は容 易であり、ベクターの再構成およびベクターを用いた様々なアツセィに有用である。ま た、このベクターは NP遺伝子の前に Notl部位を利用して他の GOI遺伝子を容易に揷 入することができ、 GFPの蛍光により遺伝子導入細胞を特定した上で、 GOI遺伝子の 影響 (治療効果 '機能解析など)を調べることができる。
[0104] [4] SeV-M, F及び HN蛋白を発現するヘルパー細胞の作出（1)： M, Fおよび HN発 現プラスミドの構築
M,Fおよび HN蛋白を発現するヘルパー細胞の作出のために、 Cre/loxP発現誘導 システムを利用した。当該システムは Cre DNAリコンビナーゼにより遺伝子産物を誘 導発現するように設計されたプラスミド pCALNdLw(Arai, T. et al.， J. Virol. 72: 1115- 1121 (1988))を利用したものであり、 F蛋白を発現するヘルパー細胞（Li, H.-O. et al. , J. Virology 74, 6564-6569 (2000), WO00/70070)、 Mおよび F蛋白を発現するへノレ パー糸田胞（Inoue M. et al" J. Gene Med. 6, 1069-1081 (2004), WO03/025570)を作 出する時と同様に、本 3遺伝子欠失ベクターの構築にも同システムを利用した。
[0105] M,Fおよび HN遺伝子を発現する Cre/loxP誘導型発現プラスミドの構築は M,Fおよ び HN遺伝子を PCRで増幅し、 Cre DNAリコンビナーゼにより遺伝子産物を誘導発現 されるように設計されたプラスミド pCALNdlw(Arai, T. et al., J. Virology 72, 1998, pi 115-1121)のユニークサイト Swal部位 (あるいは同部位を EcoRI認識配列に変換した 後の同部位）に増幅産物を挿入することで構築した。 F遺伝子導入時に使用した pCA LNdLw/F (WO00/70070)は neomycin耐性遺伝子を有し、 M遺伝子導入時に使用し た pCALNdLw/hygroM (WO03/025570)は hygromycin而性遺伝子を有して!/、る。
[0106] また新たに、選択マーカーとして Blasticidin Sffif性遺伝子（Invitrogen, Groningen, Netherlands)を発現する Cre/loxP誘導型 M,Fおよび HN遺伝子発現プラスミドの構築 も行った（図 19および 20)。これらのプラスミドの構築のために、まず pCALNdLwプラ スミドの neomycin耐性遺伝子を blasticidin S耐性遺伝子に置き換えた。即ち、 pCALN dLwを Spel及び EcoT22Iで消化し、ァガロース電気泳動で分離後、 neomycin耐性遺 伝子を含む断片（265 lbp)とアンピシリン耐性遺伝子を含む断片 (3674bp)に該当す るバンドを切り出し、 QIAquick Gel Extraction Kitで回収した。回収した neomycin而性 遺伝子を含む断片（265 lbp)をさらに Xho Iで消化し、電気泳動後、 neomycin耐性遺 伝子を含まない断片（1761bp)を切り出し、 QIAquick Gel Extraction Kitで回収した。 アンピシリン耐性遺伝子を含む断片 (3674bp)は、脱リン酸化反応後、 QIAquick PC R purification Kitにより精製した。 blasticidin Sffif性遺伝子は pTEFl/Bst (Invitrogen, Groningen, Netherlands)をテンプレートに bst— 5' (5'— TCTCGAGTCGCTCGGTAC GATGGCCAAGCCTTTGTCTCAAGAAGAATCCA- 3'/配列番号： 21)及び bst- 3'
TAGCCCTCCCACACATAACCAGAGGGCAGC- 3'Z配列番号： 22)の 2種のプラ イマ一を用いて PCRを行い、 QIAquick PCR Purification Kitで回収した後 Xhol及び E coT22Iで消化して調製した。これら 3種の断片をライゲーシヨンし pCALNdLw/bstを作 製した。次に pCALNdLw- bstを Xholで消化し、薬剤耐性遺伝子を含む断片（1033bp) を分離精製し、 pCALNdLw/hygroM, pCALNdLw/F及び pCALNdLw/zeoHNの薬剤 耐性遺伝子を含む Xho I断片と組み換えることでそれぞれ、 pCALNdLw/bstM, pCAL NdLw/bstF, pCALNdLw/bstHNを構築した。
[0107] [5] SeV-M, F及び HN蛋白を発現するヘルパー細胞の作出（2)： Fタンパク質発現 ヘルパー細胞の作出
SeV-M, F及び HN蛋白を発現するヘルパー細胞の作出するため、まず、 F遺伝子 を導入し Fタンパク質発現ヘルパー細胞を作出、次に M遺伝子を導入し Mおよび Fタ ンパク質発現ヘルパー細胞を作出、そして HN遺伝子とともに、再度 Mおよび F遺伝 子を導入し、 M,Fおよび HNタンパク質を発現するヘルパー細胞を作出した。
[0108] F蛋白を発現するヘルパー細胞は Liらの方法に倣って作出した (Li, H.-O. et al, J . Virology 74, 6564-6569 (2000), WO00/70070)。トランスフエクシヨンには LipofectA MINE PLUS reagent (Invitrogen, Groningen, Netherlands)を用いプロトコ一ノレに記載 の方法で行った。即ち以下の方法をとつた。 LLC- MK細胞を 5xl05 cells/dishで 60m
2
mシャーレに播き、 10% FBSを含む D- MEMで 24時間培養した。 pCALNdLw/Fの 1 μ g を FBS及び抗生物質を含まない D- MEMに希釈し（総量で 242 μ L)、撹拌後 LipofectA MINE PLUS reagent 8 Lを添加、再度撹拌し室温で 15分間放置した。放置後、予 め LipofectAMINE reagent 12 μ Lを FBS及び抗生物質を含まない D- MEMに希釈した ものを (総量で 250 L)添加し室温で 15分間放置した。放置後、 FBS及び抗生物質を 含まない D- MEMを 2mL添カ卩し撹拌後、 PBSで 1回洗浄した LLC- MK細胞へこのトラ
2
ンスフエクシヨン混合液を添カ卩した。 37°C, 5% COインキュベーターで 3時間培養後、
2
トランスフエクシヨン混合液を除去することなぐ 20% FBSを含む D- MEMを 2.5mL添カロ し 24時間培養した。培養後、トリプシンで細胞を剥がし、 96wellプレートに約 5cells/wel 1或いは 25cells/wellの割合で希釈し、 500 g/mLの G418 (Gibco- BRL, Rockville, M D)を含む 10% FBS入りの D- MEMで約 2週間培養した。単一の細胞から広がったクロ ーンを 6wellプレートまで拡大培養した。得られたクローンについて、 F蛋白の発現量 を Western-blottingで半定量的に解析した。各クローンを 12wellプレートに播き、ほぼ コンフルェントの状態で、 5% FBSを含む MEMで希釈した Cre DNAリコンビナーゼを発 現する組み換えアデノウイルス（AxCANCre)を Saitoらの方法（Saito, I. et al., Nucl. A cid. Res. 23, 3816—3821 (1995), Arai, T. et al., J. Virol. 72, 1115—1121 (1998))で M 01 5で感染させた。 32°Cで 2日間培養後、培養上清を除去し PBSで 1回洗浄し、セル スクレーパーで細胞を剥がして細胞を回収した。 1 laneあたりこの 1/5量をアプライし て SDS- PAGEを行った後、抗 F抗体（f236 : Segawa, H. et al., J. Biochem. 123, 1064- 1072 (1998))を利用して Western- blottingを行った。 F蛋白の発現量の多いクローン を選択し、最終的にはF遺伝子欠失型SeV(SeV/ Δ F-GFP: Li, H.-0. et al, J. Virol ogy 74, 6564-6569 (2000))の生産量の高いクローンとして、 LLC/F/#33を取得した。
[6] SeV-M, F及び HN蛋白を発現するヘルパー細胞の作出（3) :Mおよび Fタンパク 質発現ヘルパー細胞の作出
Mおよび F蛋白を発現するヘルパー細胞は、 LLC/F/#33をもとに、上記 [5]の方法 に倣って M遺伝子を導入して作出した。即ち以下の方法をとつた。 LLC/F/#33細胞 を 5xl05 cells/dishで 60mmシャーレに播き、 10% FBSを含む D- MEMで 24時間培養し た。 pCALNdLw/hygroMの 1 μ gを FBS及び抗生物質を含まない D- MEMに希釈し（総 量で 242 μ L)、撹拌後 LipofectAMINE PLUS reagent 8 μ Lを添加、再度撹拌し室温 で 15分間放置した。放置後、予め LipofectAMINE reagent 12 μ Lを FBS及び抗生物 質を含まない D- MEMに希釈したものを (総量で 250 μ L)添加し室温で 15分間放置し た。放置後、 FBS及び抗生物質を含まない D-MEMを 2mL添カ卩し撹拌後、 PBSで 1回 洗浄した LLC/F/#33細胞へこのトランスフエクシヨン混合液を添カ卩した。 37°C, 5% CO インキュベーターで 3時間培養後、トランスフエクシヨン混合液を除去することなぐ 20
2
% FBSを含む D- MEMを 2.5mL添カ卩し 24時間培養した。培養後、トリプシンで細胞を剥 がし、 96wellプレートに約 5cells/well或いは 25cells/wellの割合で希釈し、 150 g/mL の hygromycin B (Invitrogen, Groningen, Netherlands)を含む 10% FBS入りの D- MEM で約 2週間培養した。単一の細胞力 広がったクローンを 6wellプレートまで拡大培養 した。得られたクローンについて、 Fおよび M蛋白の発現量を Western-blottingで半定 量的に解析した。各クローンを 12wellプレートに播き、ほぼコンフルェントの状態で、 5 % FBSを含む MEMで希釈した Cre DNAリコンビナーゼを発現する組み換えアデノウィ ルス（AxCANCre)を Saitoらの方法（Saito, I. et al., Nucl. Acid. Res. 23, 3816-3821 ( 1995), Arai, T. et al" J. Virol. 72, 1115-1121 (1998))で MOI 5で感染させた。 32°C で 2日間培養後、培養上清を除去し PBSで 1回洗浄し、セルスクレーパーで細胞を剥 がして細胞を回収した。 1 laneあたりこの 1/5量をアプライして SDS-PAGEを行った後、 抗 M抗体（N- 39F: Inoue, M. et al., J. Virol. 77, 3238-3246 (2003))および抗 F抗体（f 236 : Segawa, H. et al., J. Biochem. 123, 1064-1072 (1998))を利用して Western- bio ttingを行った。 M蛋白および F蛋白の発現量の多いクローンを選択し、最終的には M および F遺伝子欠失型 SeV (SeV/ A M A F- GFP: Inoue, M. et al., J. Gene Med. 6, 10 69-1081 (2004))の生産量の高いクローンとして、 LLC/F/M/#72を取得した。さらに、 再度限外希釈した後、細胞のクローユングおよび生産性評価を行い、 SeV/ A M A F- GFPの生産性の高!、クローンとして、 LLC/F/M/#72-17を選択した。
[7] SeV-M, F及び HN蛋白を発現するヘルパー細胞の作出（4) :M,Fおよび HNタン パク質発現ヘルパー細胞の作出
M,Fおよび HN蛋白を発現するヘルパー細胞は、 LLC/F/M/#72-17をもとに、上記 [ 5]の方法に倣って HN遺伝子を導入して作出した。この時、 Mおよび F遺伝子も再度 同時に導入した。即ち以下の方法をとつた。 LLC/F/M/#72-17細胞を 5xl05 cells/dis hで 60mmシャーレに播き、 10% FBSを含む D- MEMで 24時間培養した。 pCALNdLw/b stM, pCALNdLw/bstFおよび pCALNdLw/bstHNのそれぞれ 1 μ gを FBS及び抗生物 質を含まない D- MEMに希釈し（総量で 242 μ L)、撹拌後 LipofectAMINE PLUS reage nt 8 /z Lを添加、再度撹拌し室温で 15分間放置した。放置後、予め LipofectAMINE r eagent 12 μ Lを FBS及び抗生物質を含まない D- MEMに希釈したものを（総量で 250 μ L)添カ卩し室温で 15分間放置した。放置後、 FBS及び抗生物質を含まない D-MEM を 2mL添カ卩し撹拌後、 PBSで 1回洗浄した LLC/F/M/#72-17細胞へこのトランスフエク シヨン混合液を添カ卩した。 37°C, 5% COインキュベーターで 3時間培養後、トランスフ
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ェクシヨン混合液を除去することなぐ 20% FBSを含む D- MEMを 2.5mL添カ卩し 24時間 培養した。培養後、トリプシンで細胞を剥がし、 96wellプレートに約 5cells/well或いは 2 5cells/wellの昔 ij合で希釈し、 3 μ g/mLの Blasticidin S (Invitrogen, Groningen, Netherl ands)を含む 10% FBS入りの D- MEMで約 2週間培養した。単一の細胞から広がったク ローンを 6wellプレートまで拡大培養した。得られたクローンについて、下記の要領で 遺伝子の発現を誘導した。各クローンを 12wellプレートに播き、ほぼコンフルェントの 状態で、 5% FBSを含む MEMで希釈した Cre DNAリコンビナーゼを発現する組み換え アデノウイルス（AxCANCre)を Saitoらの方法（Saito, I. et al., Nucl. Acid. Res. 23, 38 16-3821 (1995), Arai, T. et al" J. Virol. 72, 1115-1121 (1998))で MOI 5で感染させ た。 32°Cで 2日間培養後、下記 [8]の手順で 3遺伝子を欠損する SeV18+NotI/PLmut Δ M Δ F Δ HN-GFP (SeV/PLmut Δ Μ Δ F Δ HN-GFP)の再構成サンプルを実際に作 製し、そのサンプルを用いてヘルパー細胞の評価を行い、最も生産性の高力つた LL C/F/M/HN#17-5を取得した。さらに、再度限外希釈した後、細胞のクローユングお よび生産性評価を行 、、 SeV/PLmut Δ M Δ F Δ HN- GFPの生産性の高!、クローンと して、 TriRE#7を選択した。
[8] GFP遺伝子を有する M/F/HN 3遺伝子欠失型 SeVベクターの再構成と増幅
GFP遺伝子を有する M/F/HN 3遺伝子欠失型 SeVベクター（SeV18+NotI/PLmut Δ M Δ F Δ HN-GFP: SeV/PLmut Δ Μ Δ F Δ ΗΝ- GFPとも記載）の再構成は Liらの報告（ Li, H.-O. et al., J. Virology 74. 6564-6569 (2000), WOOO/70070)を改変して実施し た。 LLC- MK細胞を 5xl06 cells/dishで 10cmのシャーレに播き、 24時間培養後、ソラ
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レン (psoralen)と長波長紫外線 (365應)で 20分間処理した T7ポリメラーゼを発現する リコンビナントワクシニアウィルス（PLWUV- VacT7 : Fuerst, T.R. et al., Proc. Natl. Ac ad. Sci. USA 83, 8122-8126 (1986))を室温で 1時間感染させた（MOI=2)。細胞を血 清を含まな 、MEMで洗浄した後、プラスミド pSeV18+NotI/PLmut Δ M Δ F Δ HN-GFP , pGEM/NP, pGEM/P, pGEM/L及び pGEM/F- HN (Kato, A. et al" Genes Cells 1, 569-579 (1996))をそれぞれ 12 g, 4 g, 2 g, 4 g及び 4 μ g/dishの量比で Opti- MEM (Gibco-BRL, Rockville, MD)に懸濁し、 1 μ g DNA/5 μ L相当の SuperFect tra nsfection reagent (Qiagen, Bothell, WA)を入れて混合し、室温で 15分間放置後、最 終的に 3% FBSを含む Opti-MEM 3mLに入れ、細胞に添カ卩して培養した。 5時間培養 後血清を含まない MEMで 2回洗净し、 40 g/mLの Cytosine- D- arabinoforanoside ( AraC : Sigma, St丄 ouis, MO)及び 7.5 g/mLの Trypsin (Gibco—BRL, Rockville, MD) を含む MEMで培養した。 24時間培養後、 40 μ g/mLの AraC及び 7.5 μ g/mLの Trypsi nを含む MEMで培地交換し更に 2日間 37°Cで培養した（P0)。これらの細胞を回収し、 ペレットを 2mLZdishあたりの Opti-MEMに懸濁した。凍結融解を 3回繰り返した後、 ライゼートを調製し、このライゼートを用いて、上記 [7]の細胞の評価を行った。
[0112] 上記 [7]の各クローンについて、下記の要領で遺伝子の発現を誘導した。各クロー ンを 12wellプレートに播き、ほぼコンフルェントの状態で、 5% FBSを含む MEMで希釈 したじ DNAリコンビナーゼを発現する組み換えアデノウイルス (AxCANCre)を Saito らの方法（Saito, I. et al, Nucl. Acid. Res. 23, 3816-3821 (1995), Arai, T. et al, J. Virol. 72, 1115-1121 (1998))で MOI 5で感染させた。 32°Cで 2日間培養後、上記ライ ゼートを 1 wellあたり 100 μ 1添カ卩することでトランスフエクシヨンし、 40 μ g/mLの AraC 及び 7.5 μ g/mLの Trypsinを含み血清を含まない MEMを用い 32°Cで培養した。 GFP 蛍光の広がりの良力つたクローンを用いてベクターの回収を継続し、ベクター生産性 を評価した。上記 [7]記載のように、最も生産性の高かった LLC/F/M/HN#17-5を取 得し、さらに、再度限外希釈した後、細胞のクローユングおよび生産性評価を行い、 S eV/PLmut Δ M Δ F Δ HN- GFPの生産性の高!、クローンとして、 TriRE#7を選択した。
[0113] このヘルパー細胞（TriRE#7)を用いて調製した SeV18+NotI/PLmut Δ M Δ F Δ HN- GFP (SeV/PLmut Δ Μ Δ F Δ HN— GFP)のタイターは lxlO8 GFP— CIU/mL以上（GFP— CIUの定義は WO00Z70070に記載）あり、 in vitroおよび in vivo実験に使用可能な十 分なタイターを調製することに成功した。また、遠心などの一般的な方法により、さら に濃縮することも容易である。
産業上の利用可能性
[0114] 本発明により、染色体非傷害型の細胞質型ベクターを用いた遺伝子導入造血細胞 による造血細胞移植が可能になった。本発明の方法は、宿主染色体内へのインテグ レーシヨンを介さないため、癌抑制遺伝子の不活ィ匕や癌遺伝子の活性ィ匕などの危険 を伴わずに遺伝子を導入することができ、安全なベクターシステムを構築することが 可能である。先天性免疫不全性疾患には造血細胞移植が有効性を示さな 、症例が 存在するため、これらの治療には遺伝子治療のみが残されたオプションとなる。本発 明の方法を、これらの難治性疾患に対する新たな遺伝子治療へ適用することが期待 される。

Claims

請求の範囲
[I] 造血細胞移植組成物の製造方法であって、マイナス鎖 RNAウィルスベクターを造 血細胞に導入し、該造血細胞および薬学的に許容される媒体を含む組成物を調製 することを含む方法。
[2] マイナス鎖 RNAウィルスベクター力 エンベロープ構成蛋白質をコードする 1つまた は複数の遺伝子が変異または欠損して 、る、請求項 1に記載の方法。
[3] エンベロープ構成蛋白質をコードするすべての遺伝子が変異または欠損している、 請求項 2に記載の方法。
[4] エンベロープ構成蛋白質をコードする少なくとも 1つの遺伝子が欠損している、請求 項 2に記載の方法。
[5] 該少なくとも 1つの遺伝子力 遺伝子である、請求項 4に記載の方法。
[6] エンベロープ構成蛋白質をコードするすべての遺伝子が欠損している、請求項 4に 記載の方法。
[7] マイナス鎖 RNAウィルスがパラミクソウィルス科ウィルスである、請求項 1に記載の方 法。
[8] パラミクソウィルス科ウィルスがセンダイウィルスである、請求項 7に記載の方法。
[9] 請求項 1から 8の 、ずれかに記載の方法により得られる造血細胞移植組成物。
[10] 遺伝子導入された血液細胞を造血細胞力 生成させる方法であって、
(a)マイナス鎖 RNAウィルスベクターを造血細胞に接触させる工程、および
(b)工程 (a)の造血細胞を動物に注入する工程、を含む方法。
[II] 工程 (b)の注入前に該動物を免疫抑制する工程をさらに含む、請求項 10に記載の 方法。
[12] マイナス鎖 RNAウィルスベクターにおいて、エンベロープ構成蛋白質をコードする 1 つまたは複数の遺伝子が変異または欠損している、請求項 10に記載の方法。
[13] エンベロープ構成蛋白質をコードするすべての遺伝子が変異または欠損している、 請求項 12に記載の方法。
[14] エンベロープ構成蛋白質をコードする少なくとも 1つの遺伝子が欠損している、請求 項 12に記載の方法。
[15] 該少なくとも 1つの遺伝子力 遺伝子である、請求項 14に記載の方法。
[16] エンベロープ構成蛋白質をコードするすべての遺伝子が欠損している、請求項 14 に記載の方法。
[17] マイナス鎖 RNAウィルスがパラミクソウィルス科ウィルスである、請求項 10に記載の 方法。
[18] パラミクソウィルス科ウィルスがセンダイウィルスである、請求項 17に記載の方法。
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