WO2006073070A1 - 細胞の培養方法およびその利用 - Google Patents

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Susumu Goto
Shohei Kishishita
Shinya Takuma
Chikashi Hirashima
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Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha
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    • C12N2510/00—Genetically modified cells
    • C12N2510/02—Cells for production

Definitions

  • the present invention relates to a cell culturing method and use thereof, and more particularly to a cell culturing method and a method for causing a cell to produce a protein using the cell culturing method.
  • serum derived from mammals cannot be sterilized by autoclaving etc., it may be contaminated with viruses or mycoplasma, many of which are harmless, but may be an additional unknown factor in terms of stable production.
  • serum contains more than 500 proteins, which complicates the isolation and purification of the desired protein, which is a cell product from the culture medium.
  • a method using purified proteins derived from serum such as fetuin, insulin, transferrin and the like instead of serum has been performed.
  • a method using a medium component extracted from a mammal has been tried.
  • Patent Documents 1 and 2 a method of adding an enzymatic degradation product of fish meat or a fish meat extract to a culture medium has been reported (Patent Documents 1 and 2). By this method, it became possible to produce a high amount of protein without using the urine fetal serum, which was generally required.
  • Patent Document 1 International Publication No. 99/63058 Pamphlet
  • Patent Document 2 Japanese Patent Laid-Open No. 2003-334068
  • An object of the present invention is to allow cells to produce proteins at high yields by performing fed-batch culture using a medium containing an enzymatic degradation product of fish meat or a fish meat extract.
  • the present inventors performed a fed-batch culture using a medium to which an enzymatic degradation product of fish meat or a fish meat extract was added.
  • the present inventors have found that protein can be produced with higher yield, and have completed the present invention.
  • the gist of the present invention is as follows.
  • [0012] Initiate cell culture in a medium supplemented with a fish meat enzymatic degradation product or fish meat extract, and at least once, add the fish meat enzymatic degradation product or fish meat extract to the medium during cell culture.
  • a method for culturing cells characterized by comprising: [0013] (3) The culture method according to (2), wherein the cells are cultured by a fed-batch culture method.
  • a method for producing a protein by starting cell culture in an initial culture medium, and further culturing cells at least once by adding a fed-batch medium to the culture medium during cell culture.
  • a production method comprising adding an enzymatic degradation product or fish extract of fish to at least one of an initial culture medium or a fed-batch medium.
  • a method for producing a protein comprising culturing cells in a medium supplemented with an enzymatic degradation product or fish extract of fish meat, and at least once in the medium during cell culture.
  • the enzymatic decomposition product of fish meat or fish meat extract is added to the medium at the start of cell culture, but also the enzymatic decomposition product of fish meat or fish meat extract is added to the medium during cell culture. In this way, the desired protein can be produced in cells with higher yield.
  • Fig. 1 shows a mammal-free component-free medium supplemented with 5 g / L of salmon hydrolyzate (initial medium) and a mammal-derived component supplemented with 30 g / L of salmon hydrolyzate. It is a graph which shows the antibody protein density
  • Fig. 2 shows a mammal-free component-free medium supplemented with 15 g / L of salmon hydrolyzate (initial culture medium) and a mammal-free component-free medium supplemented with 75 g / L of salmon hydrolyzate It is a graph which shows the antibody protein density
  • FIG. 3 shows a mammal-free component-free medium supplemented with 5 g / L of salmon hydrolyzate (initial culture medium) and a mammal-free component-free medium supplemented with 30 g / L of salmon hydrolyzate ( 2 is a graph showing the antibody protein concentration (g / L) produced in CHO cells cultivated in a fed-batch medium.
  • cell culture is started with an initial culture medium, and a fed-batch medium is added to the culture medium at least once.
  • a fed-batch medium is added to the culture medium at least once.
  • an enzymatic degradation product or fish extract of fish meat is added to at least one of the initial culture medium and fed-batch medium.
  • cell culture is started in a medium supplemented with a fish meat enzymatic degradation product or fish meat extract, and further, at least once, the fish meat enzymatic degradation is performed on the medium during cell culture.
  • cells can be cultured well without adding a component derived from a mammalian cell to a medium generally used as a medium for animal cell culture. .
  • cell culture methods are classified into a batch method, a continuous method, and a fed-batch method.
  • any culture method may be used, but a fed-batch culture method or a continuous method is preferably used, and a fed-batch culture method is particularly preferably used.
  • the batch method is a culture method in which a small amount of a seed culture solution is added to a medium, and cells are grown without newly adding a medium or discharging the culture solution during the culture.
  • the continuous method is a culture method in which a medium is continuously added and continuously discharged during culture.
  • the continuous method includes perfusion culture.
  • the fed-batch culture method is intermediate between the batch method and the continuous method, it is also referred to as a semi-batch culture, and is a force-continuous method in which the medium is added continuously or sequentially during the culture.
  • This is a culture method in which the continuous culture solution is not discharged.
  • the medium added in the fed-batch culture (hereinafter referred to as fed-batch medium) is different from the medium that is already used for the culture (hereinafter referred to as the initial medium). Alternatively, only specific components may be added.
  • the initial culture medium generally refers to a culture medium used in the first stage of cell culture.
  • the medium before adding the fed-batch medium may be used as the initial medium.
  • the enzymatic decomposition product of fish meat or the fish meat extract may be contained in either the fed-batch medium or the initial medium. It is preferable that both the initial medium and the enzymatic decomposition product of fish meat or fish extract are contained.
  • the concentration of the enzymatic decomposition product of fish meat or the extract of fish meat in the fed medium may be higher than the concentration of enzymatic decomposition product of fish meat or the extract of fish meat in the initial culture medium. preferable.
  • the concentration of enzymatic degradation product or fish extract in the initial medium is usually 1-30 g / L, preferably 3-20 g / L, more preferably 5-15 g / L.
  • the concentration of enzymatic degradation product of fish meat or fish meat extract in fed-batch culture is usually 5 to 150 g / L, 10 to 120 g / L, preferably 10 to 120 g / L, 20 to 90 IL is also more preferred as 30 to 75 where g / L is more preferred.
  • the ratio of the amount of the culture medium at the beginning of the culture and the amount of the fed-batch medium is not particularly limited. However, when the volume of the medium at the beginning of the culture is assumed to be 1, the feeding medium is usually 0.01 to 10, preferably 0.1 to 1. More preferably, it is 0.2-0.3.
  • the feeding medium may be added continuously or sequentially. When added sequentially, the number of times of addition is not particularly limited, and may be added once or dividedly in a plurality of times.
  • the fish meat includes red fish such as salmon, soudagazo, salmon, salmon, sword fish, salmon, salmon, salmon, salmon, salmon, flat eyes, salmon And fish such as white fish such as salmon, preferably salmon, soda gasso, salmon, salmon, salmon, salmon.
  • the fish meat extract used in the present invention is, for example, cut into a suitable piece of the fish meat or minced into a paste form, and the soluble component is heated with hot water, eg, 90-95 ° C. It can be obtained by extracting several tens of hours with water. Specific examples include boiled simmered soup at the time of bonito manufacturing and cook drain at the time of canned manufacturing.
  • the enzymatic decomposition product of fish meat is, for example, a boiled fish meat, or a minced paste, or an appropriate amount of water added to the fish meat extract obtained as described above. It can be obtained by subjecting it to protein denaturation by heating, if necessary, followed by treatment with a proteolytic enzyme, and removing oil or insoluble matter by centrifugation or filtration as appropriate. It is recommended to use a strong fish extract or enzymatic digest of fish after adjusting the pH to about 7-7.4.
  • proteolytic enzymes include proteinases and / or peptidases.
  • proteinase refers to an enzyme that hydrolyzes a protein using the protein as a substrate
  • peptidase refers to a peptide-bound hydrolase that uses the peptide as a substrate. That is, the activity of a protease on a protein substrate can be distinguished as proteinase activity, and the activity on a peptide substrate can be distinguished as peptidase activity.
  • proteinase is used to catalyze the cleavage of the peptide bond chain from the middle by the activity of a protease on a protein substrate, and thus endopeptidase is used herein as a type of proteinase.
  • enzyme of plant origin such as papain, chymopapain, promelain, and physin
  • an enzyme of microbial origin such as mold, bacteria, and yeast.
  • Enzymes such as peptidase and dipeptidase are listed. These enzymes can be used alone or in combination. When used in combination, they may be added simultaneously or stepwise.
  • the enzymatic decomposition product of fish meat according to the present invention is preferably an enzymatic decomposition product of fish meat obtained by treating with the above-mentioned proteinase and then treating with peptidase.
  • Enzymatic treatment varies depending on the type of enzyme used. Usually pH 2 — 12, preferably pH 4-8, 30 — 90. C, preferably 40_65. 30 minutes-72 hours at a temperature of C, preferably 3_2 4 hours. In that case, the enzyme is used in an amount of 0.001-10 W / W%, preferably 0.1-1 W / W%, more preferably 0.2-0.6 W / W% of the protein as a substrate. After deactivating the enzyme in the enzyme digest of fish meat obtained in this way by heating, etc., the enzyme digest is prepared by removing the oily insolubles by appropriate centrifugation, filtration, etc. be able to.
  • Fish meat includes fish viscera and meat, but the ratio between the viscera and meat is not particularly limited.
  • Japanese Patent Laid-Open No. 2003-334068 It is possible to use the ratio described in.
  • each component used in a cell (preferably animal cell) culture medium can be used as appropriate.
  • these include amino acids, vitamins, lipid factors.
  • trace metal elements, surfactants, growth cofactors, nucleosides and the like may be added.
  • copper sulfate, manganese sulfate, zinc sulfate, magnesium sulfate, nickel chloride, tin chloride, magnesium chloride, sodium silicate, etc. preferably copper sulfate, zinc sulfate, magnesium sulfate, etc.
  • the preferred embodiment of the present invention may contain antibiotics such as streptomycin, penicillin G potassium and gentamicin, and pH indicators such as phenol red.
  • the medium is a commercially available medium for animal cell culture, for example, D-MEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium), D-MEM / F-12 1: 1 Mixture (Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F—12 ), RPMI1640, CHO—S—SFMII (Invitrogen), CHO—SF (Sigma—Aldrich), EX-CELL 301 (JRH biosciences), CD-CHO (Invitrogen), IS CHO-V (Irvine Scientific) ), PF-ACF-CHO (Sigma-Aldrich), etc., can be prepared by adding fish extract or enzymatic digest of fish meat.
  • D-MEM Dulbecco's Modified Eagle Medium
  • D-MEM / F-12 1 1 Mixture (Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F—12 ), RPMI1640, CHO—S—SFMII (Invitrogen), CHO—SF
  • the medium to which the fish meat extract or the fish enzyme hydrolyzate is added is not particularly limited, and any medium may be used, but a serum-free medium that does not contain mammal-derived serum.
  • a mammal-free component-free medium that does not contain a mammal-derived component isolated from a mammal is preferred.
  • the content of other components in the medium is 0.05 to 1500 mg / L for amino acids, 0 • 001 to 10 mg / L for vitamins, 0 to 200 mg / L for lipid factors, and 1 to 20 g / l for energy sources.
  • the osmotic pressure regulator is 0.1_10000mg / iron source is 0.1_500mg / L, pH buffer is 1_10000mg / L, trace metal elements are 0.00001-200mg / resurfactant is 0-5000mg / L, growth Cofactors of 0.05- — ⁇ g / L and nucleoside in the range of 0.001_50mg / L are appropriate, and can be determined as appropriate depending on the type of cells to be cultured and the type of desired protein.
  • the pH of the medium varies depending on the cells to be cultured, and generally a pH of 6.8 to 7.6, and in many cases pH 7.0 to 7.4 is appropriate.
  • the culture method of the present invention is not particularly limited, and can be used for culturing various cells (eg, bacterial cells, fungal cells, insect cells, plant cells, animal cells, etc.).
  • various cells eg, bacterial cells, fungal cells, insect cells, plant cells, animal cells, etc.
  • the method of the present invention can also be used when culturing animal cells to obtain a natural protein produced by the animal cells.
  • the method can also be used for culturing BHK cells, HeLa cells, and the like. it can.
  • Particularly preferred animal cells in the present invention are CHO cells into which a gene encoding a desired protein has been introduced.
  • the desired protein is not particularly limited, and antibodies (natural antibodies, low molecular weight antibodies, chimeric antibodies, humanized antibodies, etc.) and physiologically active proteins (granulocyte colony stimulating factor (G-CSF), granulocyte macrophage colony stimulation) Factor (GM-CSF), erythropoietin, interferon, interleukins such as IL-1 and IL-6, t-PA, urokinase, serum albumin, blood coagulation factor, etc.) preferable.
  • G-CSF granulocyte colony stimulating factor
  • GM-CSF granulocyte macrophage colony stimulation
  • erythropoietin interferon
  • interleukins such as IL-1 and IL-6
  • t-PA urokinase
  • serum albumin serum albumin
  • blood coagulation factor etc.
  • antibodies produced by the production method of the present invention include artificial antibodies such as chimeric antibodies, humanized antibodies, and ispedfic antibodies derived from only human, mouse, rat, hamster, rabbit, monkey, and other animal-derived monoclonal antibodies. Also included are modified recombinant antibodies. Also, antibody The immunoglobulin class is not particularly limited, and may be any class such as IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, etc., IgA, IgD, IgE, IgM, etc. IgG and IgM are preferred when used as a pharmaceutical. Furthermore, the antibodies of the present invention include antibody fragments such as Fv, Fab, F (ab), etc. that can be obtained only with whole antibodies, and variable regions of antibodies with a linker such as a peptide linker.
  • a linker such as a peptide linker
  • Single-chain Fv (scFv, sc (Fv), etc.), low molecular weight antibody, etc.
  • CHO cells usually have a gas phase CO concentration of 0-40%, preferably 2-
  • the culture may be performed at 10 to 14 days at 30 to 39 ° C, preferably about 37 ° C in a 10% atmosphere.
  • a fermenter tank culture apparatus for example, a fermenter tank culture apparatus, an air lift culture apparatus, a culture flask culture apparatus, a spinner flask culture apparatus, a microcarrier culture apparatus
  • the culture can be performed using a fluidized bed type culture apparatus, a holofiber type culture apparatus, a roller bottle type culture apparatus, a filled tank type culture apparatus, or the like.
  • the production of protein in animal cells may be obtained simply by culturing it, or may require special operations. However, these operations or conditions may be appropriately determined depending on the animal cells to be cultured. It ’s fine.
  • CHO cells transformed with a vector containing a gene encoding a mouse-human chimeric antibody by genetic engineering procedures can be cultured for 14 days, preferably 7-10, under the conditions described above.
  • the desired protein can be obtained in the medium in about several days.
  • recombinant antibodies natural antibodies, antibody fragments, low molecular weight antibodies, chimeric antibodies, humanized antibodies, bispecific antibodies, etc.
  • recombinant proteins granulocyte colony stimulating factor (G-CSF), Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF), erythropoietin, in Terferon, interleukins such as IL-1 and IL-6, t_PA, urokinase, serum albumin
  • Blood coagulation factors can be produced at high production.
  • the medium composition and preparation method are as follows.
  • the mammal-free component-free medium component used for the initial medium was made approximately twice the concentration of the initial medium, and 30 g / L of koji hydrolyzate was dissolved and then sterilized by filtration.
  • Cell CHO cell line that produces the recombinant anti-gandalioside G M3 human antibody (L612) described in WO 2005/005636 pamphlet.
  • the class of this antibody is IgM.
  • the medium composition and preparation method are as follows.
  • the mammal-free component-free medium component used for the initial medium is approximately equal to the initial medium.
  • the concentration was adjusted to 4 times, and 75 g / L of koji hydrolyzate was added and dissolved, followed by filtration sterilization.
  • An initial medium is added to the jar-type cell culture device, and the above CHO cell line is added to each cell so that the amount is 1 xlO 6 cells / mL when fed or 0.5 xlO 6 cells / mL when not fed.
  • the culture was started at 37 ° C and 10% CO.
  • the fed-batch medium is added from the second day of culture.
  • the mixture was fed at a constant flow rate and cultured until the 10th day. Sampling was performed at the start of culture and on days 3, 5, 7, and 10. About the culture supernatant of each sample, the concentration of antibody protein produced by affinity chromatography using a protein A column was measured.
  • the antibody protein concentration without fed-batch was about 0.5 IL even after 7 days of culture.
  • a solution containing sputum hydrolyzate was fed, it was possible to obtain a high antibody protein concentration of 1.1 g / L or more in 7 days of culture and over 1.4 g / L in 10 days.
  • the medium composition and preparation method are as follows.
  • Fed-batch medium Mammal-derived component-free medium component was doubled with respect to the initial medium, added with 30 g / L of hydrolyzate, and then sterilized by filtration. As a comparative control, a product containing no hydrolyzate was used.
  • the fed-fed medium was fed at a constant flow rate and cultured until the 14th day. Appropriate sump during culture I made a ring. With respect to the culture supernatant of each sample, the concentration of protein produced by the BIACORE method was measured using the portion of the amino acid sequence of MPL to which sc (Fv) 2 binds. As shown in Fig. 3, in fed-batch culture without sputum hydrolyzate, the protein concentration was about 450 mg / L after 14 days of culture. In contrast, when a solution containing sputum hydrolyzate was fed, a high protein concentration exceeding 760 mg / L could be obtained after 14 days of culture.
  • a commercially available salmon was used as the fish meat.
  • Enzyme degradation was performed by adding 1200 kg of water to 840 kg of minced cocoons and incubating with plant-derived papain 3.2 kg at pH 6.0 and 65 ° C for 1 hour. Next, after enzymatic digestion with 3.2 kg of mold-derived exopeptidase under the above conditions for 15 hours, the enzyme was inactivated by heating to 95 ° C. Thereafter, insoluble matters and oil were removed by centrifugal separation and filtration, and concentrated to prepare about 150 kg of an enzymatic degradation product of fish meat.
  • the present invention it is possible to stably cultivate cells without using expensive proteins such as fetal bovine serum, which have large variations in quality. Furthermore, by culturing cells by the method of the present invention, the risk of contamination by abnormal prions or viruses, which has been a problem in recent years, is eliminated, and the ability to produce and provide safe biopharmaceuticals at a high level is provided. S can

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Abstract

　魚肉の酵素分解物又は魚肉抽出物を含む培地を用いて、細胞にタンパク質を高生産させる。魚肉の酵素分解物又は魚肉抽出物を添加した培地で細胞の培養を開始し、さらに、少なくとも１回、細胞培養中の培地に魚肉の酵素分解物又は魚肉抽出物を加えることを特徴とする細胞の培養方法。この培養方法を利用して、所望のタンパク質を製造する方法。

Description

明 細 書
細胞の培養方法およびその利用
技術分野
[0001] 本発明は、細胞の培養方法およびその利用に関し、より詳細には、細胞の培養方 法とそれを利用して細胞にタンパク質を生産させる方法に関する。
背景技術
[0002] 動物細胞を培養して該動物細胞の産生する天然型タンパク質を得ようとする場合、 あるいは所望のタンパク質をコードする遺伝子を導入した動物細胞を培養して所望 のタンパク質等を製造する場合には、塩類、糖類、アミノ酸類、およびビタミン類等の 基礎栄養物のほかに、該動物細胞の増殖のために、通常、哺乳動物由来の抽出物 、具体的には牛胎児血清などの血清が 5〜20%の範囲で培地に添加されている。し 力 ながら、力かる哺乳動物由来の血清は、培地のコストの 75〜95%を占めること、 品質にロット間差があるため安定した増殖が得られないという欠点がある。また、哺乳 動物由来の血清はオートクレーブ等で滅菌できないので、ウィルス又はマイコプラズ マ汚染される可能性があり、その多くは無害であるものの、安定生産という点からは付 加的な未知の要因となりうる。更に血清には 500種以上のタンパク質が含まれており 、このため培養培地からの細胞産物である所望のタンパク質の単離、精製を複雑化 する。このような安定生産上の問題を解消するために、血清の代わりとして、フエツイ ン、インスリン、トランスフェリンなどの血清由来の純化されたタンパク質を使用する方 法が行われている。また、製造コストの観点から、哺乳動物より抽出された培地成分 を使用する方法も試みられてレ、る。
[0003] し力、し、近年、哺乳動物由来の成分にっレ、ては、狂牛病（mad cow disease)、ゥシ 海綿状脳症（Bovine Spongiform Enc印 halopathy： BSE)、感染性海綿状脳症（Transm issible Spongiform Encepnaiopathy： TSh 更に クロイツフエノレト 'ヤコブ丙 (Creutzf eld-Jakob Disease : CJD)などとの関係が懸念され、安全性の点からこれら哺乳動物 由来の成分を含有しない動物細胞培養用培地の出現が望まれている。
[0004] 動物細胞を培養する際、使用する培地中に上記のような哺乳動物由来の成分を添 加しないと、培養の早い時期に細胞の生存率の著しい低下が生じ、培養液中の生細 胞数が減少するため長期培養あるいは大量培養を行うことができないという問題があ つに。
[0005] 上記のような問題を解決する為、培養用培地に魚肉の酵素分解物又は魚肉抽出 物を添加する方法が報告されている（特許文献 1、 2)。当該方法により、一般的に必 須とされていたゥシ胎児血清を使用することなぐタンパク質を高産生することが可能 となった。
[0006] し力 ながら、製造コストの観点から、タンパク質の生産量はできるかぎり多い方が 好ましぐさらなる改良が望まれていた。
[0007] 特許文献 1：国際公開第 99/63058号パンフレット
特許文献 2：特開 2003— 334068号公報
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0008] 本発明は、魚肉の酵素分解物又は魚肉抽出物を含む培地を用いて流加培養を行 うことにより、細胞にタンパク質を高生産させることを目的とする。
課題を解決するための手段
[0009] 本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意努力した結果、魚肉の酵素分解物 又は魚肉抽出物を添加した培地を用いて流加培養を行うことにより、細胞に所望のタ ンパク質をより高い収量で産生させることができることを見出し、本発明を完成させる に至った。
[0010] 本発明の要旨は以下の通りである。
[0011] (1)初発培地で細胞の培養を開始し、さらに、少なくとも 1回、細胞培養中の培地に 流加培地を加える培養方法にぉレ、て、初発培地または流加培地の少なくとも一方に 魚肉の酵素分解物又は魚肉抽出物が添加されていることを特徴とする細胞の培養 方法。
[0012] (2)魚肉の酵素分解物又は魚肉抽出物を添加した培地で細胞の培養を開始し、さら に、少なくとも 1回、細胞培養中の培地に魚肉の酵素分解物又は魚肉抽出物をカロえ ることを特徴とする細胞の培養方法。 [0013] (3)細胞を流加培養法で培養する（2)の培養方法。
[0014] (4)細胞が所望のタンパク質をコードする遺伝子を導入したものである請求項（1)〜
(3)のレ、ずれかの培養方法。
[0015] (5)所望のタンパク質が抗体である（4)の培養方法。
[0016] (6)細胞が動物細胞である請求項（1)〜（5)のレ、ずれかの培養方法。
[0017] (7)細胞が哺乳動物細胞である（6)の培養方法。
[0018] (8)哺乳動物細胞が CHO細胞である（7)の培養方法。
[0019] (9)初発培地で細胞の培養を開始し、さらに、少なくとも 1回、細胞培養中の培地に 流加培地をカ卩えて細胞を培養することにより、タンパク質を製造する方法であって、 初発培地または流加培地の少なくとも一方に魚肉の酵素分解物又は魚肉抽出物が 添加されてレ、ることを特徴とする製造方法。
[0020] (10)タンパク質を製造する方法であって、魚肉の酵素分解物又は魚肉抽出物を添 カロした培地で細胞の培養を開始し、さらに、少なくとも 1回、細胞培養中の培地に魚 肉の酵素分解物又は魚肉抽出物をカ卩えることを特徴とする製造方法。
[0021] (11)細胞を流加培養法で培養する（10)の製造方法。
[0022] (12)細胞が所望のタンパク質をコードする遺伝子を導入したものである（9)〜（： 11) のいずれかの製造方法。
[0023] (13)所望のタンパク質が抗体である（12)の製造方法。
[0024] (14)細胞が動物細胞である（9)〜（13)のレ、ずれかの製造方法。
[0025] (15)細胞が哺乳動物細胞である（14)の製造方法。
[0026] (16)哺乳動物細胞が CHO細胞である（15)の製造方法。
発明の効果
[0027] 本発明において、細胞の培養開始時の培地に魚肉の酵素分解物又は魚肉抽出物 を添加するだけでなく、細胞培養中の培地にも魚肉の酵素分解物又は魚肉抽出物 をカ卩えることによって、より高い収量で所望のタンパク質を細胞に生産させることがで きる。
本明細書は、本願の優先権の基礎である日本国特許出願、特願 2005- 000747号の 明細書および/または図面に記載される内容を包含する。 図面の簡単な説明
[0028] [図 1]図 1は、鰹加水分解物 5 g/Lを添加した哺乳動物由来成分不含培地 (初発培地 )及び鰹加水分解物 30 g/Lを添加した哺乳動物由来成分不含培地（流加培地）で培 養した CHO細胞が培地中に産生した抗体タンパク質濃度 (g/L)を示すグラフである。
[図 2]図 2は、鰹加水分解物 15 g/Lを添加した哺乳動物由来成分不含培地 (初発培 地)及び鰹加水分解物 75 g/Lを添加した哺乳動物由来成分不含培地（流加培地）で 培養した CHO細胞が培地中に産生した抗体タンパク質濃度 (g/L)を示すグラフである
[図 3]図 3は、鰹加水分解物 5 g/Lを添加した哺乳動物由来成分不含培地 (初発培地 )及び鰹加水分解物 30 g/Lを添加した哺乳動物由来成分不含培地（流加培地）で培 養した CHO細胞が培地中に産生した抗体タンパク質濃度 (g/L)を示すグラフである。 発明を実施するための最良の形態
[0029] 以下、本発明の実施の形態についてより詳細に説明する。
[0030] 本発明においては、初発培地で細胞の培養を開始し、さらに、少なくとも 1回、細胞 培養中の培地に流加培地を加える。ここで、初発培地または流加培地の少なくとも一 方に魚肉の酵素分解物又は魚肉抽出物が添加されている。
[0031] さらに、本発明の好ましい態様として、魚肉の酵素分解物又は魚肉抽出物を添加し た培地で細胞の培養を開始し、さらに、少なくとも 1回、細胞培養中の培地に魚肉の 酵素分解物又は魚肉抽出物を加える。
[0032] 本発明によれば、従来動物細胞培養用培地として一般的に使用されている培地に おいて哺乳動物細胞由来の成分を添加しなくても、良好に細胞を培養することがで きる。
[0033] 一般に、細胞培養方法は、回分法 (batch culture),連続法 (continuous culture),流 加培養法 (fed-batch culture)に分類される。本発明の方法においては、いずれの培 養方法を用いてもよいが、好ましくは、流加培養法又は連続法が用いられ、特に好ま しくは、流加培養法が用いられる。
[0034] 回分法は、培地に少量の種培養液を加え、培養中に新たに培地を加えたり又は培 養液を排出したりせずに、細胞を増殖させる培養方法である。 [0035] 連続法は、培養中に連続的に培地を加え、かつ、連続的に排出させる培養方法で ある。なお、連続法には、灌流培養も含まれる。
[0036] 流加培養法は回分法と連続法の中間にあたる為、半回分法 (semi-batch culture)と も呼ばれ、培養中に連続的に又は逐次的に培地が加えられる力 連続法のような連 続的な培養液の排出が行われない培養方法である。流加培養の際に加えられる培 地（以下、流加培地という）は、既に培養に使用されている培地（以下、初発培地とい う）と同じ培地である必要はなぐ異なる培地を添加してもよいし、特定の成分のみを 添加してもよい。
[0037] 本発明において初発培地とは、通常、細胞培養の最初の段階で使用されている培 地のことをいう。但し、流加培地を複数回に分けて添加する場合には、流加培地をそ れぞれ添加する前の培地を初発培地としてもよい。
[0038] 本発明の方法において、流加培養法を採用する場合、魚肉の酵素分解物又は魚 肉抽出物は流加培地又は初発培地のいずれかに含まれていればよいが、流加培地 および初発培地の両方に魚肉の酵素分解物又は魚肉抽出物が含まれていることが 好ましレ、。また、初発培地中の魚肉の酵素分解物又は魚肉抽出物の濃度と比較して 、流加培地中の魚肉の酵素分解物又は魚肉の抽出物の濃度の方が高くなつてレ、る ことが好ましい。初発培地中の魚肉の酵素分解物又は魚肉抽出物の濃度は、通常、 1〜30 g/Lが適当であり、 3〜20 g/Lが好ましぐ 5〜15 g/Lがより好ましレ、。流加培 地中の魚肉の酵素分解物又は魚肉の抽出物の濃度は、通常、 5〜150 g/L10〜120 g/Lが適当であり、 10〜120 g/Lが好ましく、 20〜90 g/Lがさらに好ましぐ 30〜75も I Lがより好ましい。培養当初の培地と流加培地の量の比は特に限定されなレ、が、通常 、培養当初の培地の容量を 1とした場合に流加培地は 0.01〜10であり、好ましくは 0.1 〜1であり、さらに好ましくは 0.2〜0.3である。流加培地は連続的に加えられてもよいし 、逐次加えられてもよい。逐次加えられる場合、添加の回数は特に限定されず、 1回 でもよいし、複数回に分けて添加されてもよい。
[0039] 本発明で使用する魚肉の酵素分解物又は魚肉抽出物について、魚肉としては、鰹 、ソウダガッォ、鮪、鯖、秋刀魚、鰯、鰺、鮭などの赤身魚や、鳕、鱸、平目、鲽、鯛な どの白身魚などの魚肉が挙げられ、好ましくは鰹、ソウダガッォ、鳕、鯖、鮭、鰯であ る。
[0040] 本発明で使用する魚肉抽出物は、例えば、上記魚肉を適当な断片に切断したりあ るいはミンチしてペースト状にして、その可溶性成分を熱水、例えば 90— 95°Cの熱水 で数十分力、ら数十時間抽出することによって得ることが出来る。具体的には、鰹節製 造時の鰹煮汁や缶詰製造時のクックドレン等が挙げられる。
[0041] また、魚肉の酵素分解物は、例えば、魚肉を煮たものをそのまま、あるいは、ミンチ してペースト状にしたもの、あるいは上記のようにして得られた魚肉抽出物に適量の 水をカ卩え、必要に応じて加熱してタンパク変性させた後、タンパク質分解酵素で処理 し、適宜遠心分離や濾過等により油分ゃ不溶化物を除去することによって得ることが できる。力かる魚肉抽出物あるいは魚肉の酵素分解物は pHを 7 _ 7.4程度に調整して 使用するのがよい。
[0042] タンパク質分解酵素としては、プロティナーゼ及び/又はぺプチダーゼが挙げられ る。本明細書において、プロティナ一ゼの語は、タンパク質を基質としてタンパク質を 加水分解する酵素をいい、ぺプチダーゼの語は、ペプチドを基質とするペプチド結 合加水分解酵素をいう。すなわち、プロテアーゼのタンパク質基質に対する活性をプ ロティナーゼ活性、ペプチド基質に対する活性をぺプチダーゼ活性として区別するこ とができる。タンパク質基質に対するプロテアーゼの活性によって、ペプチド結合鎖 の中程からの切断を触媒するときにはプロティナーゼという用語を用レ、、従ってェン ドぺプチダーゼは本明細書ではプロティナーゼの 1種として使用している。
[0043] 具体的には、パパイン、キモパパイン、プロメライン、フイシンなどの植物起源の酵 素およびカビ、細菌、酵母などの微生物起源の酵素で、エンドべプチダーゼ、ェキソ ぺプチダーゼ、アミノぺプチダーゼ、カノレボキシぺプチダーゼ、ジぺプチダーゼなど の酵素等が挙げられる。これらの酵素は単独あるいは併用して使用することができる 。併用する場合は、それらを同時に添加してもよいし、段階的に添加してもよい。
[0044] 本発明における魚肉の酵素分解物としては、上記のプロティナーゼで処理し、次い でぺプチダーゼで処理して得られる魚肉の酵素分解物が好ましい。
[0045] 酵素処理は、使用する酵素の種類によって異なる力 通常、 pH2 _ 12、好ましくは p H4— 8で、 30_90。C、好ましくは 40_ 65。Cの温度で、 30分— 72時間、好ましくは 3 _2 4時間行う。その際、酵素は基質としてのタンパク質の 0.001— 10W/W%、好ましくは 0 .1— 1W/W%、さらに好ましくは 0.2— 0.6W/W%程度使用する。このようにして得られた 魚肉の酵素分解物中の酵素を加温などによって失活させた後、遠心分離や濾過等 を適宜行って油分ゃ不溶化物を除去することによって酵素分解物を調製することが できる。
[0046] 魚肉には魚の内臓と正肉が含まれるが、内臓と正肉の比率は特に限定されず、い 力、なる比率を用いてもょレ、が、例えば、特開 2003-334068号に記載の比率を用いるこ とが可能である。
[0047] 本発明で用いる培地の他の成分としては、通常、細胞（好ましくは、動物細胞）培養 培地で使用されている各成分が適宜使用できるが、これらにはアミノ酸、ビタミン類、 脂質因子、エネルギー源、浸透圧調節剤、鉄源、 pH緩衝剤を含む。上記成分のほ か、例えば、微量金属元素、界面活性剤、増殖補助因子、ヌクレオシドなどを添加し ても良い。
[0048] 具体的には、例えば、 L-ァラニン、 L-アルギニン、 L-ァスパラギン、 L-ァスパラギン 酸、 L-システィン、 L-シスチン、 L-グノレタミン、 L-グルタミン酸、グリシン、 L-ヒスチジン 、 L-イソロイシン、 L-ロイシン、 L-リジン、 L-メチォニン、 L-オル二チン、 L-フエニルァ ラニン、 L—プロジン、し一セジン、 L_スレ才ニン、し一卜!;プ卜ファン、し一チ Πシン、し一/ ジン 等、好ましくは L-ァラニン、 L-アルギニン、 L-ァスパラギン、 L-ァスパラギン酸、 L-シ スチン、 L-グノレタミン、 L-グノレタミン酸、グリシン、 L-ヒスチジン、 L-イソロイシン、 L-口 イシン、 L-リジン、 L-メチォニン、 L-フエ二ルァラニン、 L-プロリン、 L-セリン、 L-スレオ ニン、 L-トリプトファン、 L-チロシン、 L-バリン等のアミノ酸類； i—イノシトール、ビォチ ン、葉酸、リポ酸、ニコチンアミド、ニコチン酸、 p -アミノ安息香酸、パントテン酸カルシ ゥム、塩酸ピリドキサール、塩酸ピリドキシン、リボフラビン、塩酸チアミン、ビタミン B12 、ァスコルビン酸等、好ましくはピオチン、葉酸、リポ酸、ニコチン酸アミド、パントテン 酸カルシウム、塩酸ピリドキサール、リボフラビン、塩酸チアミン、ビタミン B12、ァスコ ルビン酸等のビタミン類；塩化コリン、酒石酸コリン、リノ一ノレ酸、ォレイン酸、コレステ ロール等、好ましくは塩化コリン等の脂質因子；グルコース、ガラクトース、マンノース 、フルクトース等、好ましくはグルコース等のエネルギー源；塩化ナトリウム、塩化カリ ゥム、硝酸カリウム等、好ましくは塩ィ匕ナトリウム等の浸透圧調節剤； EDTA鉄、クェン 酸鉄、塩化第一鉄、塩化第二鉄、硫酸第一鉄、硫酸第二鉄、硝酸第二鉄等、好まし くは塩化第二鉄、 EDTA鉄、クェン酸鉄等の鉄源類;炭酸水素ナトリウム、塩化カルシ ゥム、リン酸二水素ナトリウム、 HEPES、 MOPS等、好ましくは炭酸水素ナトリウム等の p H緩衝剤を含む培地を例示できる。
[0049] 上記成分のほか、例えば、硫酸銅、硫酸マンガン、硫酸亜鉛、硫酸マグネシウム、 塩化ニッケル、塩化スズ、塩化マグネシウム、亜ケィ酸ナトリウム等、好ましくは硫酸銅 、硫酸亜鉛、硫酸マグネシウム等の微量金属元素； Tween80、プル口ニック F68等の 界面活性剤；および組換え型インシュリン、組換え型 IGF、組換え型 EGF、組換え型 F GF、組換え型 PDGF、組換え型 TGF-ひ、塩酸エタノールァミン、亜セレン酸ナトリウ ム、レチノイン酸、塩酸プトレツシン等、好ましくは亜セレン酸ナトリウム、塩酸エタノー ノレアミン、組換え型 IGF、塩酸プトレツシン等の増殖補助因子；デォキシアデノシン、 デォキシシチジン、デォキシグアノシン、アデノシン、シチジン、グアノシン、ゥリジン 等のヌクレオシドなどを添加してもよレ、。なお上記本発明の好適例においては、ストレ プトマイシン、ペニシリン Gカリウム及びゲンタマイシン等の抗生物質や、フエノールレ ッド等の pH指示薬を含んでいても良い。
[0050] 培地は、市販の動物細胞培養用培地、例えば、 D-MEM (Dulbecco's Modified Eagl e Medium), D-MEM/F-12 1: 1 Mixture (Dulbecco's Modified Eagle Medium： Nutrie nt Mixture F— 12)、 RPMI1640, CHO— S— SFMII(Invitrogen社)、 CHO— SF (Sigma— Aldr ich社)、 EX-CELL 301 (JRH biosciences社)、 CD-CHO (Invitrogen社)、 IS CHO- V ( Irvine Scientific社)、 PF-ACF-CHO (Sigma-Aldrich社)などの培地に、魚肉抽出物 又は魚肉の酵素分解物を添加することにより調製することが可能である。
[0051] 本発明において、魚肉抽出物又は魚肉酵素分解物を添加する培地は、特に限定 されず、レ、かなる培地を用いてもよいが、哺乳動物由来の血清を含まない無血清培 地が好ましぐ特に哺乳類動物から単離された哺乳動物由来成分を含まない哺乳動 物由来成分不含培地が好ましレ、。
[0052] 魚肉抽出物又は魚肉の酵素分解物を添加する培地力 無血清培地又は動物由来 成分不含培地である場合には、通常、培養される細胞は無血清培地又は動物由来 成分不含培地中でも生育できるようにそれらの培地に馴化されている。細胞の馴化 方法は既に当業者によく知られている。
[0053] また、培地中のその他の成分の含量は、アミノ酸は 0.05— 1500mg/L、ビタミン類は 0 • 001— 10mg/L、脂質因子は 0— 200mg/L、エネルギー源は 1一 20g/レ浸透圧調節 剤は 0.1 _ 10000mg/レ鉄源は 0.1 _500mg/L、 pH緩衝剤は 1 _ 10000mg/L、微量金 属元素は 0.00001— 200mg/レ界面活性剤は 0— 5000mg/L、増殖補助因子は 0.05— ΙΟΟΟΟ μ g/Lおよびヌクレオシドは 0.001 _50mg/Lの範囲が適当であり、培養する細 胞の種類、所望のタンパク質の種類などにより適宜決定できる。
[0054] 培地の pHは培養する細胞により異なる力 S、一般的には pH6. 8〜7. 6、多くの場合 pH7.0〜7. 4が適当である。
[0055] 本発明の培養方法は特に限定されることなく種々の細胞（例えば、細菌細胞、真菌 細胞、昆虫細胞、植物細胞、動物細胞など）の培養に使用できる。例えば、遺伝子ェ 学的操作によって所望のタンパク質をコードする遺伝子を組み込んだ COS細胞や C HO細胞、あるいは、抗体を産生するマウス ヒト、マウス マウス、マウス ラット等の ハイプリドーマに代表される融合細胞を培養することが可能である。本発明の方法は 、動物細胞を培養して該動物細胞の産生する天然型タンパク質を得ようとする場合 にも使用でき、上述した細胞の他に、 BHK細胞、 HeLa細胞などの培養にも使用で きる。
[0056] 本発明において特に好ましい動物細胞は所望のタンパク質をコードする遺伝子が 導入された CHO細胞である。所望のタンパク質は特に限定されず、抗体 (天然抗体、 低分子化抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、など)や生理活性タンパク質 (顆粒球コロニ 一刺激因子（G-CSF)、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF)、エリス口 ポェチン、インターフェロン、 IL-1や IL-6等のインターロイキン、 t-PA、ゥロキナーゼ、 血清アルブミン、血液凝固因子、など）など如何なるタンパク質でもよいが、特に抗体 が好ましい。
本発明の製造方法で生産される抗体としては、ヒト、マウス、ラット、ハムスター、ゥサ ギ、サル等の動物由来のモノクローナル抗体だけでなぐキメラ抗体、ヒト人化抗体、 b ispedfic抗体など人為的に改変した遺伝子組み換え型抗体も含まれる。また、抗体の 免疫グロブリンクラスは特に限定されるものではなぐ IgGl、 IgG2、 IgG 3, IgG4など の IgG、 IgA、 IgD、 IgE、 IgMなどいずれのクラスでもよいが、医薬として用いる場合 は IgG及び IgMが好ましい。さらに本発明の抗体としては wholeの抗体だけでなぐ Fv 、 Fab, F(ab)などの抗体断片や、抗体の可変領域をペプチドリンカ一等のリンカ一で
2
結合させた 1価または 2価以上の一本鎖 Fv (scFv、 sc(Fv)など）の低分子化抗体など
2
も含まれる。
[0057] 培養条件は使用する細胞の種類によって異なるので、適宜好適な条件を決定すれ ばよレ、。例えば CHO細胞であれば通常、気相の CO濃度が 0_40%、好ましくは、 2-
2
10%の雰囲気下、 30_39°C、好ましくは、 37°C程度で、 1 _ 14日間培養すればよい。
[0058] また、動物細胞培養用の各種の培養装置としては、例えば発酵槽型タンク培養装 置、エアーリフト型培養装置、カルチャーフラスコ型培養装置、スピンナーフラスコ型 培養装置、マイクロキャリアー型培養装置、流動層型培養装置、ホロファイバー型培 養装置、ローラーボトル型培養装置、充填槽型培養装置等を用いて培養することが できる。
[0059] 本発明の方法により細胞（好ましくは、動物細胞）を培養することにより、タンパク質 を高産生させることが可能となる。
[0060] 動物細胞のタンパク質の産生は、単にそれを培養するのみで良いものや、特殊な 操作を必要とするものも存在するがそれらの操作又は条件等は培養する動物細胞に より適宜決定すれば良い。例えば遺伝子工学的操作によりマウスーヒトキメラ抗体を コードする遺伝子を含むベクターでトランスフォームされた CHO細胞では、前記のよう な条件下で培養を実施することにより、 1 14日間、好ましくは 7— 10日間程度で所望 のタンパク質を培地中に得ることができる。これを常法 (例えば、抗体工学入門、地人 書館、 p.102-104 ; Affinity Chromatography Principles & Methods,アマシャム ファノレ マシア バイテク (株）、 P.56-60など参照）に従い単離、精製することによって、所望の タンパク質を得ることができる。
[0061] 本発明により、組換え抗体 (天然抗体、抗体断片、低分子化抗体、キメラ抗体、ヒト 化抗体、 bispecific抗体など）、遺伝子組換えタンパク質 (顆粒球コロニー刺激因子（G -CSF)、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF)、エリスロポエチン、イン ターフェロン、 IL-1や IL-6等のインターロイキン、 t_PA、ゥロキナーゼ、血清アルブミン
、血液凝固因子、など)などを高い生産量で製造することができる。
実施例
[0062] 以下、本発明を実施例及び参考例によって具体的に説明する。なお、これらの実 施例等は、本発明を説明するためのものであって、本発明の範囲を限定するもので はない。
[0063] 〔実施例 1〕鰹加水分解物を用いた流加培養
培地組成及び調製法は以下の通りである。
初発培地：哺乳動物由来成分不含培地に参考例 1で調製した鰹加水分解物 5 g/Lを 添加し、溶解後濾過滅菌した。
流加培地:初発培地に用いる哺乳動物由来成分不含培地成分を初発培地に対し約 2倍濃度とし、鰹加水分解物 30 g/Lを加えて溶解後濾過滅菌した。
細胞：国際公開第 2005/005636号パンフレットに記載の組換え型抗ガンダリオシド G M3ヒト抗体（L612)を産生する CHO細胞株。本抗体のクラスは IgMである。
[0064] ジャー型細胞培養装置に初発培地を加え、これに上記 CHO細胞株を、 2 xlO5 cells AnLとなるよう加えて 37°C、 10% COの条件で培養を開始した。流加培養では、培養 3 日目より流加培地を一定流速で流加し、 14日目まで培養を行った。培養開始時およ び 3、 7、 10、 14日目にサンプリングを行った。各サンプルの培養上清について、サイ ズ排除クロマトグラフィーにより産生された抗体タンパク質濃度を測定した。図 1に示 すように、流加を行わない場合の抗体タンパク質濃度は 10日間の培養で 0.6 g/L程 度であった。これに対し、鰹加水分解物を含む溶液を流加すると、 10日間の培養で 1. 2 g/L以上、 14日間では 1.7 g/Lを超える高い抗体タンパク質濃度を得ることができた
[0065] 〔実施例 2〕鰹加水分解物を用いた流加培養
培地組成及び調製法は以下の通りである。
初発培地：哺乳動物由来成分不含培地に参考例 1で調製した鰹加水分解物 15 g/L を添加し、溶解後濾過滅菌した。
流加培地:初発培地に用いる哺乳動物由来成分不含培地成分を初発培地に対し約 4倍濃度とし、鰹加水分解物 75 g/Lを加えて溶解後濾過滅菌した。
細胞：国際公開第 92/19759号パンフレットの実施例 10に記載されたヒトェロンゲーシ ヨンファクター I aプロモーターを利用し、特開平 8-99902号公報の参考例 2に記載さ れた方法に準じて作成したヒト型化 PM-1抗体 (抗ヒト IL-6レセプター抗体)を産生する CH〇細胞株。本抗体のクラスは IgGlである。
[0066] ジャー型細胞培養装置に初発培地を加え、これに上記 CHO細胞株を、流加を行う 場合は 1 xlO6 cells/mL,行わない場合は 0.5 xlO6 cells/mLとなるようそれぞれ加えて 37°C、 10% COの条件で培養を開始した。流加培養では、培養 2日目より流加培地を
2
一定流速で流加し、 10日目まで培養を行った。培養開始時および 3、 5、 7、 10日目に サンプリングを行った。各サンプルの培養上清について、プロテイン Aカラムを用いた ァフィ二ティークロマトグラフィーにより産生された抗体タンパク質濃度を測定した。図
2に示すように、流加を行わない場合の抗体タンパク質濃度は 7日間の培養で 0.5も I L程度であった。これに対し、鰹加水分解物を含む溶液を流加すると、 7日間の培養 で 1.1 g/L以上、 10日間では 1.4 g/Lを超える高い抗体タンパク質濃度を得ることがで きた。
[0067] 〔実施例 3〕鰹加水分解物を用いた流加培養
培地組成及び調製法は以下の通りである。
初発培地：哺乳動物由来成分不含培地に参考例 1で調製した鰹加水分解物 5 g/Lを 添加し、溶解後濾過滅菌した。比較対照用として鰹加水分解物を含まないものを用 いた。
流加培地：哺乳動物由来成分不含培地成分を初発培地に対し 2倍濃度とし、鰹加水 分解物 30 g/Lを加えて溶解後濾過滅菌した。比較対照用として鰹加水分解物を含ま ないものを用いた。
細胞：国際公開第 2005/056604号パンフレットに記載の方法で作製した、 MPl^結合 性 single chain (Fv) (sc(Fv) )を産生する、組換え CHO細胞。
2 2
培養結果：ジャー型細胞培養装置に初発培地を加え、これに上記 CH〇細胞株を、 3 xlO5 cells/mLとなるよう加えて 37°C、 10% COの条件で培養を開始した。培養 3日目よ
2
り流加培地を一定流速で流加し、 14日目まで培養を行った。培養期間中適宜サンプ リングを行った。各サンプルの培養上清について、 MPLのアミノ酸配列のうち sc(Fv)2 が結合する部分を用いて、 BIACORE法により産生されたタンパク質濃度を測定した。 図 3に示すように、鰹加水分解物を含まない流加培養ではタンパク質濃度は 14日間 の培養で 450 mg/L程度であった。これに対し、鰹加水分解物を含む溶液を流加する と、 14日間の培養で 760 mg/Lを超える高いタンパク質濃度を得ることができた。
[0068] 〔参考例 1〕鰹の酵素分解物の調製
魚肉として市販の鰹を使用した。鰹をミンチ状にカットしたもの 840kgに水 1200kgを加 え、植物由来のパパイン 3.2kgで、 pH6. 0、 65°Cの条件下で 1時間インキュベートし、 酵素分解を行った。次に、カビ由来のェキソぺプチダーゼ 3.2kgでさらに上記条件下 で 15時間酵素分解を行った後、 95°Cに加熱することで酵素を失活させた。その後遠 心分離、濾過により不溶物、油分を除去、濃縮して、魚肉（鰹）の酵素分解物約 150k gを調製した。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本 明細書にとり入れるものとする。
産業上の利用可能性
[0069] 本発明により、牛胎児血清等の高価で品質のばらつきが大きいタンパク質を使用 することなぐ安定的に細胞を培養することが可能である。さらに、本発明の方法で細 胞を培養することにより、近年問題となっている異常プリオンあるいはウィルス等によ る汚染の危険性が除去され、安全なバイオ医薬品を高生産し、提供すること力 Sできる

Claims

請求の範囲
[I] 初発培地で細胞の培養を開始し、さらに、少なくとも 1回、細胞培養中の培地に流加 培地を加える培養方法にぉレ、て、初発培地または流加培地の少なくとも一方に魚肉 の酵素分解物又は魚肉抽出物が添加されていることを特徴とする細胞の培養方法。
[2] 魚肉の酵素分解物又は魚肉抽出物を添加した培地で細胞の培養を開始し、さらに、 少なくとも 1回、細胞培養中の培地に魚肉の酵素分解物又は魚肉抽出物を加えるこ とを特徴とする細胞の培養方法。
[3] 細胞を流加培養法で培養する請求項 2記載の培養方法。
[4] 細胞が所望のタンパク質をコードする遺伝子を導入したものである請求項 1〜3のい ずれかに記載の培養方法。
[5] 所望のタンパク質が抗体である請求項 4記載の培養方法。
[6] 細胞が動物細胞である請求項 1〜5のいずれかに記載の培養方法。
[7] 細胞が哺乳動物細胞である請求項 6記載の培養方法。
[8] 哺乳動物細胞が CHO細胞である請求項 7記載の培養方法。
[9] 初発培地で細胞の培養を開始し、さらに、少なくとも 1回、細胞培養中の培地に流加 培地を加えて細胞を培養することにより、タンパク質を製造する方法であって、初発 培地または流加培地の少なくとも一方に魚肉の酵素分解物又は魚肉抽出物が添カロ されてレ、ることを特徴とする製造方法。
[10] タンパク質を製造する方法であって、魚肉の酵素分解物又は魚肉抽出物を添加した 培地で細胞の培養を開始し、さらに、少なくとも 1回、細胞培養中の培地に魚肉の酵 素分解物又は魚肉抽出物を加えることを特徴とする製造方法。
[II] 細胞を流加培養法で培養する請求項 10記載の製造方法。
[12] 細胞が所望のタンパク質をコードする遺伝子を導入したものである請求項 9〜： 11の いずれかに記載の製造方法。
[13] 所望のタンパク質が抗体である請求項 12記載の製造方法。
[14] 細胞が動物細胞である請求項 9〜： 13のいずれかに記載の製造方法。
[15] 細胞が哺乳動物細胞である請求項 14記載の製造方法。
[16] 哺乳動物細胞が CHO細胞である請求項 15記載の製造方法。
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