WO2006068249A1 - 肥満の検査方法及び肥満の予防又は治療薬のスクリーニング方法 - Google Patents

肥満の検査方法及び肥満の予防又は治療薬のスクリーニング方法 Download PDF

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    • G01N2800/04—Endocrine or metabolic disorders

Definitions

  • Patent application title Obesity Inspection Method and Obesity Prevention or Treatment Screening Method
  • the present invention relates to a method for screening for obesity and a method for screening a medicament for preventing or treating obesity.
  • Non-patent Document 1 Since obesity can lead to diseases such as diabetes, it is important to predict the onset of obesity and improve dietary habits as soon as possible.
  • Non-patent Document 2 Many obesity-related genes have been reported (Non-patent Document 2). However, the relationship between these genes and obesity is not always clear, and development of a gene analysis method capable of predicting the onset of obesity more accurately has been sought.
  • Dalanin is a protein that is localized in endocrine cells (Non-patent Document 4) such as spleen ⁇ cells (insulin-secreting cells) and nerve cells, and forms secretory granules containing peptide hormones and bioactive amines.
  • endocrine cells such as spleen ⁇ cells (insulin-secreting cells) and nerve cells
  • secretogranin IIKSCG3 secretogranin II
  • Non-patent literature l Kopelman, P.G.Nature 404, 635-643 (2000)
  • Non-Patent Document 2 Snyder, E.E. et al.Obes. Res. 12, 369-439 (2004)
  • Non-Patent Document 3 Ottiger, H.P., Battenberg, E.F., Tsou, A.P., Bloom, F.E. & Sutcliffe,
  • Non-Patent Document 4 Hosaka M et al. Mol Biol Cell. 13, 3388-3399 (2002)
  • the present invention relates to the development and progression of obesity, as well as abnormal glucose tolerance associated with obesity, low insulin secretion.
  • the purpose of this study is to provide a test method for accurately predicting the onset of complications such as diabetes.
  • Another object of the present invention is to provide a method for screening a preventive or therapeutic agent for obesity and its complications.
  • the inventors of the present invention have made extensive studies in order to solve the above problems. As a result, we found that a single nucleotide polymorphism of the SCG3 gene is related to obesity. Furthermore, it was found that if a compound that regulates the expression of the SCG3 gene is screened, a prophylactic / therapeutic agent for obesity can be obtained, and the present invention has been completed.
  • the present invention is as follows.
  • the single nucleotide polymorphism is one or more polymorphisms selected from polymorphisms in the base corresponding to the 61st base of the base numbers of SEQ ID NOs:! To 12, respectively (1) Or method (2).
  • a probe for obesity testing having a base IJ of 10 or more nucleotides containing the base at position 61 in the nucleotide sequence of any one of SEQ ID NOs: 1 to 12 or a complementary sequence thereof.
  • a primer for testing obesity capable of amplifying a DNA fragment containing the base at position 61 in any one of the base sequences of SEQ ID NOs: 1 to 12.
  • (6) a step of adding a drug candidate substance to a cell expressing a secretogranin 3 gene or a reporter gene linked to a secretogranin 3 gene promoter, a step of measuring the expression level of the secretoniesin 3 gene or the reporter gene, And a method for screening a prophylactic or therapeutic agent for obesity, comprising a step of selecting a substance that changes the expression level.
  • FIG. 1 is a diagram showing the positions of SNPs on the SCG3 gene. # Indicates landmark SNP, * indicates insertion / deletion polymorphism, and ⁇ indicates SNPs analyzed in the primary screening.
  • FIG. 2A The transcriptional activation ability of each SNP-containing fragment (one) was analyzed in SH-SY5Y cells. The figure which shows the result analyzed. The mouth shows the results when using the major alleles and the country uses the fragments corresponding to the minor alleles. Luciferase activity was expressed as mean soil SE, and the significant difference was subjected to unpaired t test.
  • FIG. 3A Diagram showing the results of analyzing the transcriptional activation ability of each SNP-containing fragment (1) in BE (2) -C cells.
  • the mouth shows the results when using fragments corresponding to major alleles, and the country uses minor alleles.
  • the luciferase activity was expressed as mean soil SE, and the significant difference was subjected to unpaired t_test.
  • FIG. 4A is a diagram showing the results of analyzing the transcriptional activation ability of each SNP-containing fragment (one) in HIT-T15 cells.
  • the mouth shows the results when using the major alleles and the country uses the fragments corresponding to the minor alleles.
  • Luciferase activity was expressed as mean soil SE, and the significant difference was subjected to unpaired t test.
  • FIG. 4B is a diagram showing the results of analyzing the transcriptional activation ability of each SNP-containing fragment (four linked fragments) in HIT-T15 cells.
  • the mouth shows the results when using the major allele, and the country shows the results when using fragments corresponding to the minor allele.
  • Luciferase activity was expressed as mean value soil SE, and the significant difference was unpaired t-test.
  • FIG. 5A is a diagram (photograph) showing the results of a gel shift experiment using an oligonucleotide containing SNP — 2 (5 ′ Flanking -1203).
  • C, G, and A indicate the oligonucleotide corresponding to each polymorphism. Arrows indicate specific binding.
  • FIG. 5B is a diagram (photograph) showing the results of a gel shift experiment using an oligonucleotide containing SNP — 9 (Intron 1 +190).
  • C, G and A indicate the oligonucleotide corresponding to each polymorphism. The Arrows indicate specific binding.
  • FIG. 6 is a diagram (photograph) showing the result of electron microscope observation of BE (2) -C cells transfected with a plasmid containing the SCG3 gene or a control plasmid.
  • A is a BE (2) -C cell transformed with a control plasmid
  • B is an electron microscopic image of BE (2) _C cell transcribed with a plasmid containing the SCG3 gene.
  • Arrows ( ⁇ ) indicate secretory granules.
  • C is an image showing the staining result of staining BE (2) -C cells transfected with a plasmid containing the SCG3 gene with an anti-SCG3 antibody. Arrows (black triangles) indicate secretory condyles stained with SCG antibody.
  • the scale bar indicates 500 nm.
  • the test method of the present invention is a method for analyzing obesity-related single nucleotide polymo ⁇ hism (SNP) on the secretogranin III (SCG3) gene and analyzing the obesity based on the analysis. It is.
  • Obesity refers to, for example, a state in which BMKBody Mass Index (weight kg) / (height m) 2 ) is 25 or more.
  • “test” includes a test for predicting whether obesity will occur in the future and a test for predicting whether the degree of obesity will deteriorate. It also includes testing for the onset of complications such as decreased insulin secretion, impaired glucose tolerance, and diabetes in obesity. It also includes screening for whether obesity is due to subcutaneous fat accumulation.
  • the SCG3 gene is preferably a human SCG3 gene, for example, a gene having a sequence registered in GenBank Accession No. AC020892.
  • the gene is not limited to the gene of the above sequence because there is a possibility of substitution or deletion in one or more bases depending on the race or the like.
  • the single nucleotide polymorphism site of the SCG3 gene related to obesity is not particularly limited.
  • SNP-1 means the polymorphism of adenine (A) Z guanine (G) in the 144248th base of GenBank Accession No. AC020892, and the probability of becoming obese when this basic force is SA Is expensive.
  • SNP-1 has a high probability of becoming obese in the order of AA>AG> GG.
  • SNP location 5 'Flanking indicates the position relative to the transfer start point.
  • SNP-1 is a SNP at a base 1492 bases upstream from the transcription start point in the 5 ′ adjacent region.
  • dbSNP indicates the registration number of the dbSNP database (www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/) of the National Center for Biotechnology Information.
  • An SNP with this column blank is a new SNP that is not registered in the dbSNP database.
  • the base on the left side is likely to become obese (for example, in the case of SNP-2, A / C is likely to become obese SNP-5 , G / C is likely to become obese if G)).
  • SNP-1, SNP-2, SNP-5, SNP-9, SNP-11, SNP-12, SNP-16, SNP-17, SNP-20, SNP-26, SNP-27 or SNP-29 The sequences of a total length of 121 bp including the SNP base and the region of 60 bp before and after that are shown in SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 and 12, respectively. Each 61st base has a polymorphism.
  • Bases corresponding to these bases are analyzed in the present invention.
  • “equivalent” Means the corresponding base in the region having the above sequence on the human SCG3 gene. Even if the above sequence slightly changes at a position other than SNP due to differences in race, etc., the corresponding base in that region is analyzed. Including.
  • the SCG3 gene sequence may be analyzed for the sense strand or the antisense strand.
  • the sample used for the analysis of the single nucleotide polymorphism of the SCG3 gene is not particularly limited as long as it is a sample containing chromosomal DNA, but for example, a sample of body fluid such as blood and urine, cells, hair, etc. Examples include body hair.
  • body fluid such as blood and urine, cells, hair, etc. Examples include body hair.
  • Ability to directly use these samples for analysis of single nucleotide polymorphisms It is preferable to isolate chromosomal DNA from these samples by a conventional method and analyze them.
  • Single nucleotide polymorphism analysis of the SCG3 gene can be carried out by a usual single nucleotide polymorphism analysis method. Examples include, but are not limited to, sequence analysis, PCR, hybridization, and the like.
  • the sequence can be performed by an ordinary method. Specifically, a sequence reaction was performed using a primer set at the position of several tens of bases on the 5 'side of the base showing the polymorphism, and based on the analysis result, what kind of base is the corresponding position Can be determined. In addition, when performing a sequence, it is preferable to amplify a fragment containing a polymorphism in advance by PCR or the like.
  • Analysis can also be performed by examining the presence or absence of amplification by PCR.
  • a primer having a sequence corresponding to a region containing a base showing a polymorphism and corresponding to each polymorphism is prepared.
  • PCR can be performed using each primer, and the type of polymorphism can be determined by the presence or absence of amplification products.
  • a base showing a polymorphism when included in a restriction enzyme recognition sequence, it can be analyzed by the presence or absence of cleavage by a restriction enzyme (RFLP method).
  • RFLP method restriction enzyme
  • the DNA sample is first cleaved with a restriction enzyme.
  • the DNA fragments can then be separated and the power of which type of polymorphism can be determined by the size of the detected DNA fragment.
  • the present invention also provides detection reagents such as primers and probes for detecting obesity.
  • probes include probes that include the polymorphic site in the SCG3 gene and can determine the type of base at the polymorphic site based on the presence or absence of hybridization. It is. Specifically, a probe having a length of 10 bases or more having a sequence containing the 61st base of any one of SEQ ID NOs:! To 12 or a complementary sequence thereof can be mentioned. The length of the probe is more preferably 15 to 35 bases.
  • the primer examples include a primer that can be used for PCR for amplifying the polymorphic site in the SCG3 gene, or a primer that can be used for sequence analysis (sequencing) of the polymorphic site. .
  • a primer that can amplify or sequence the region containing the 61st base of any one of SEQ ID NOS: 1 to 12 can be mentioned.
  • the length of such a primer is preferably 10 to 50 bases, more preferably 15 to 35 bases.
  • a primer having a 5 ′ region of the base preferably 30 to 100 bases upstream, or a 3 ′ region of the base, preferably 30 to 100
  • examples include primers having a sequence complementary to the region downstream of the base.
  • Primers used to determine polymorphism based on the presence or absence of amplification by PCR have a sequence containing the above base, a primer containing the above base on the 3 ′ side, or a complementary sequence of the sequence containing the above base.
  • Examples include primers containing a base complementary to the above 3 'side.
  • the test reagent of the present invention may contain, in addition to these primers and probes, a polymerase polymerase for PCR, a hybridization reagent, and the like. Primers can also be used to predict whether obese patients cause decreased insulin secretion, impaired glucose tolerance, or diabetes. ⁇ 3> Screening method
  • SCG3 is localized in the arcuate nucleus, paraventricular nucleus, and lateral hypothalamus, which are known to be deeply involved in appetite regulation. It was strongly suggested that it is involved in the secretion of peptide hormones involved in the regulation of appetite. From the above, a candidate substance that can be a prophylactic or therapeutic agent for obesity can be obtained by screening a substance that regulates the expression of the SCG3 gene. It also prevents or treats complications such as impaired glucose tolerance, decreased insulin secretion, and diabetes associated with fattening. Candidate substances that can be used as therapeutics can also be obtained.
  • the screening method of the present invention comprises the step of adding a drug candidate substance to a cell expressing a reporter gene linked to the SCG3 gene or the SCG3 gene promoter, and measuring the expression level of the secretogranin 3 gene or the reporter gene.
  • a method for screening a prophylactic or therapeutic agent for obesity or its complications comprising the step of: and selecting a substance that changes the expression level.
  • SH-SY5Y cells A TCC CRL-2266
  • BE (2) -C cells ATCC CRL-2268
  • HIT-T15 cells are preferred as cells expressing the SCG3 gene. (ATCC CRL-1 777) can be used.
  • the SCG3 gene promoter is preferably a region containing at least 1.5 kbp upstream of the transcription start point of the gene. . Further, a part of the promoter may be used, for example, a short region of 10 to 50 bp including SNP may be used.
  • the SNP base is preferably a promoter with a low risk of obesity and a base containing the other base (for example, C for SNP-2 or G for SNP-9). Ms.
  • reporter gene examples include a luciferase gene, a GFP gene, and a chloramphenicol acetyltransferase gene. These reporter genes are linked to the SCG3 gene promoter, incorporated into a plasmid that is used to introduce the gene into mammalian cells, and tranfected into cells by conventional methods such as lipofection.
  • a drug candidate substance is added to the above-described nerve cell or cell into which the reporter gene has been introduced, and the expression level of the SCG3 gene or reporter gene is measured.
  • the drug candidate substance is not particularly limited.
  • it may be a low molecular weight synthetic compound or a compound contained in a natural product. It can also be a peptide.
  • Individual test substances may be used for screening, but one compound library containing these substances may be used.
  • a candidate substance for an obesity drug can be obtained by selecting a candidate substance that changes the expression level of the SCG3 gene or reporter gene.
  • the “change” includes increasing and decreasing the expression level of the SCG3 gene as compared with the case where the drug candidate substance is not added.
  • the expression level of SCG3 gene can be measured by methods such as RT_PCR, quantitative PCR, Northern blot, ELISA, Western blotting, In situ hybridization, immunohistochemical staining.
  • RT_PCR quantitative PCR
  • Northern blot Northern blot
  • ELISA Western blotting
  • Western blotting Western blotting
  • immunohistochemical staining immunohistochemical staining
  • a substance in which the expression level of the SCG3 gene or reporter gene is changed can be selected as a candidate substance for an anti-obesity drug.
  • Obesity patients selected from outpatients at university hospitals such as Tokyo Medical University and Osaka University, and hospitals such as Toyonaka Hospital and Otemae Hospital were analyzed. Patients with secondary and genetic obesity were excluded from the analysis.
  • Control subjects were arbitrarily selected from volunteers with normal weight who were examined at Tokyo Medical University.
  • chromosomal DNA was prepared from a blood sample of each subject by a normal procedure.
  • SNP Flanking-1492 AC020892.7_144248 or rs3764220; IMS-JSTl 18085
  • SNP Flanking-1492 AC020892.7_144248 or rs3764220; IMS-JSTl 18085
  • p in the comparison of major allele (A) and minor allele (G)
  • the power of 0.02 is shown (see the upper part of Tables 2 and 3).
  • the dienotype distribution and allele frequency were analyzed by chi-square test or Fisher's exact test, and the HWE test in Table 2 is based on the Hardy-Weinberg equilibrium test (Nealsen, DM, Ehm, MG & Weir, BS Am. J. Hum.Gent. 63, 153-1540 (1998)).
  • oligonucleotide For each SNP, a double-stranded oligonucleotide corresponding to a 20 bp region containing major alleles or minor alleles, or an S4 concatenation of them, is introduced with an Nhel site on the 5 'side and an Xbal site on the 3' side. Each was synthesized.
  • a reporter plasmid was constructed by incorporating the above oligonucleotide into a pGL3_Promoter Vector (Promega) containing a luciferase gene linked to the SV40 promoter. It was confirmed by sequencing that the oligonucleotide was incorporated.
  • This reporter plasmid is transferred to SH-SY5Y cells or BE (2) _C neuroblastoma cells using ribohetamine 2000 (Invitrogen) together with the phRL-TK vector (Promega) as an internal standard for transfection efficiency. Excuse me. Cells were collected 24 hours later, and luciferase activity was measured using Dua Luciferase Reporter Assay System (Promega).
  • SH-SY5Y cells and BE (2) -C cells were purchased from ATCC (American Tissue Culture Collection). These were prepared using 7 mM advanced Dulbeccos modined hagles medium (Invitrogen) supplemented with 2 mM glutamine, 5% urine fetal serum, 100 U / ml penicillin and 100 ⁇ g / ml strechmann.
  • HIT-T15 cells which are the most common spleen cell lines.
  • the ( Figure 4) As a result, HIT-T15 cells had weaker transcriptional activity than the force SH-SY5Y cells, which gave similar results. This was thought to be due to the difference between human and hamster species.
  • a 33 bp double-stranded oligonucleotide containing each SNP was labeled with digoxigenin-11-ddUTP using a digoxigenin gel shift kit.
  • Nuclear extracts of SH-SY5Y cells or BE (2) -C cells were also prepared using NE-PER extraction reagent (Pierce) and incubated with the digoxigenin_ll_ddUTP-labeled double-stranded oligonucleotide.
  • the nuclear extract was preincubated with a 100-fold excess of unlabeled oligonucleotide over the labeled oligonucleotide and then incubated with the labeled oligonucleotide.
  • Protein-DNA complexes were separated on a 5% non-denaturing polyacrylamide gel in 0.5X Tris monoborate-one EDTA buffer. The gel was transferred to a nylon membrane and the signal was detected using a chemiluminescence detection system (Roche) according to the manufacturer's protocol.
  • mice Male mice (B57BL / 6, 8 weeks old) were purchased from Sankyo Lab Service. Mice were fixed by refluxing using Tissue Fixative (Genostaff) and embedded in paraffin. The tissue piece (4 ⁇ m) was deparaffinized and the RNA probe was hybridized.
  • RNA probe As a probe, a 441 bp DNA fragment corresponding to positions 943 to 1383 of mouse cDNA (GenBank Accession No. NM_009130) is incorporated into the pGEM-T-Easy vector (Promega) to generate sense and antisense RNA probes. This was prepared by labeling with DIG RNA labeling Mitsuta (Roche).
  • Digoxigenin-labeled RNA probe is hybridized to the above tissue piece at 42 ° C for 18 hours. Let The bound labeled substance was detected using alkaline phosphatase labeled DIG antibody and NBT-BCIP which is a substrate for alkaline phosphatase.
  • ARC arcuate nucleus
  • PVN paraventricular nucleus
  • LHA lateral hypothalamic area
  • Tissue sections were prepared from olexin B (1: 500 che micon), MCri melanm-concentrating hormone (1: 500 Phenix Pharmaceuticals), NPY (neuro peptide Y), ⁇ : 200 Chemicon), BDNF ( Brain_derived neurotrophic fact or) (1: 100 Santa Cruz) or POMC proopiomelanocortin) (1: 500 Phenix Pharm aceuticals) And incubated at 4 ° C.
  • SCG3 protein was detected mainly in ARC, LHA and PVN.
  • ARC is a site involved in appetite regulation, and there are NPY and POMC neurons. As a result of double immunostaining, it was confirmed that SCG3 protein was localized at the same site as NPY and POMC in ARC.
  • LHA is a site where olexin and MCH involved in appetite suppression exist.
  • SCG3 protein was localized in the same site as olexin B and MCH in LHA.
  • Immunostaining was performed using nerve cells to examine the intracellular localization of SCG3 protein.
  • the SCG3 gene coding region was amplified by RT-PCR using a 5 'primer having a Pstl site, a 3' primer having a Sail site, and a hypothalamic cDNA as a saddle type.
  • PCR product was digested with a restriction enzyme and then incorporated into a pBI vector (Clonetech) digested with the same enzyme (pBI-SCG3).
  • pBI-SCG3 pBI vector
  • genes encoding prepro olexin, PMC, proNPY, and proMCH were amplified by RT-PCR using a 5 ′ primer having an Mlul site and a 3 ′ primer having an EcoRV site.
  • Amplification products were extinguished with Mlul and EcoRV and incorporated into pBI-SCG3 digested with the same enzymes (pBI-SCG3-preproorexin, pBI-SCG3_POMC, pBI_SCG3-proNPY, pBI-SCG3-proMCH) 0
  • pBI-SCG3-preproorexin pBI_SCG3_POMC, pB ⁇ SCG3_proNPY, and pBI-SCG3-pro MCH are added to the SH-SY5Y cells or BE (2) _C cells containing the pTet-Off vector (Clonetech), respectively. Invitrogen).
  • pTet-Off vector Clonetech
  • Invitrogen For immune cell staining, after washing with PBS, cells were fixed with 4% paraformaldehyde for 15 minutes. The cells were further treated with 0.5% Triton X-100, washed with PBS, blocked with 1% BSA for 2 hours at room temperature, and incubated at 4 ° C.
  • the antibody was reacted with an antibody against any of olexin, POMC, NPY or MCH and SCG3 antibody, and then reacted with a fluorescently labeled secondary antibody.
  • the cells were observed using a confocal laser scanning microscope.
  • SCG3 forms a granular structure and has the same intracellular localization as olexin, MCH, NPY and POMC.
  • the localization of SCG3 was examined by immunoelectron microscopic analysis in BE (2) -C cells transfected with a plasmid containing the SCG3 gene or a control plasmid.
  • a 5 'primer with a Kozak sequence and Notl recognition sequence in front of the start codon was amplified from the cDNA of the hypothalamus using a 3 'primer with an EcoRI recognition sequence added after the stop codon.
  • the amplified product was digested with Notl and EcoRI, and then inserted between the Notl site and EcoRI site of pcDNA3.1 (_) vector (Invitrogen).
  • the obtained pcDNA-SCG3 was transfected into BE (2) -C cells using FuGENE6 Transfection Reagent (Roche). After 48 hours, the cells were washed with PBS, treated with 0.05% trypsin (0.53 mM EDTA Gnvitrogen), detached from the dish, and centrifuged to collect the cells.
  • the collected cells were fixed with a force codylate buffer (pH 7.2) containing 2.5% glutaraldehyde, then treated with 2% osmium tetroxide, dehydrated, and then encapsulated in an epoxy resin. Ultrathin slices were stained with uranyl acetate and lead citrate.
  • the collected cells were fixed with force codylate buffer (pH 7.2) containing 4% paraformaldehyde, dehydrated, and packaged in LR-WHITE (registered trademark) resin.
  • Ultrathin slices were treated with anti-SCG3 goat polyclonal antibody (Santa Cruze; diluted 200-fold) and then with 5 nm gold labeled anti-goat IgG rabbit antibody (Amersham Bioscience).
  • the screening method of the present invention can accurately predict the risk and progression of obesity, obesity can be prevented or progress can be suppressed. Further, according to the screening method of the present invention, a novel preventive / therapeutic agent for obesity can be obtained.

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Abstract

　セクレトグラニン３遺伝子上に存在する一塩基多型を分析し、該分析結果に基づいて肥満を検査する。また、セクレトグラニン３の発現量を変化させる物質を選択することにより肥満の予防又は治療薬のスクリーニングを行う。

Description

明 細 書
肥満の検査方法及び肥満の予防又は治療薬のスクリーニング方法 技術分野
[0001] 本発明は肥満の検查方法、及び肥満を予防又は治療するための医薬のスクリー二 ング方法に関する。
背景技術
[0002] 近年、食生活などのライフスタイルの変化に伴って、肥満の患者が増加している（非 特許文献 1)。肥満は糖尿病などの疾患にもつながる危険性があるため、早めに肥満 発症を予測し、食生活の改善等に努めることが重要である。
肥満に寄与する要因として、遺伝的要因と環境的要因があるが、遺伝的要因として
、多くの肥満関連遺伝子が報告されている（非特許文献 2)。しかしながら、これらの 遺伝子と肥満との関連は必ずしも明確ではなぐより正確に肥満発症を予測できる遺 伝子解析法の開発が求められていた。
[0003] ダラニンは勝臓 β細胞 (インスリン分泌細胞）などの内分泌細胞（非特許文献 4)や 神経細胞に局在し、ペプチドホルモンや生理活性ァミンなどを含む分泌顆粒を形成 するタンパク質である。その一つであるセクレトグラニン IIKSCG3)は、脳及び下垂体 に特異的な mRNAとしてクローユングされ、視床下部の弓状核に発現することが報告 されている（非特許文献 3)。また、 SCG3の膝臓 /3細胞での発現も報告されている（非 特許文献 4)。し力 ながら、 SCG3の肥満への関連については全く知られていなかつ た。
非特許文献 l : Kopelman, P.G. Nature 404, 635-643 (2000)
非特許文献 2： Snyder, E.E. et al.Obes. Res. 12, 369-439 (2004)
非特許文献 3 : Ottiger, H.P., Battenberg, E.F., Tsou, A.P., Bloom, F.E. & Sutcliffe,
J.G. J. Neurosci. 10, 3135-3147 (1990)
非特許文献 4 : Hosaka M et al. Mol Biol Cell. 13, 3388-3399 (2002)
発明の開示
[0004] 本発明は、肥満の発症や進行、さらには肥満に伴う耐糖能異常、インスリン分泌低 下、糖尿病などの合併症の発症を正確に予測するための検査方法を提供することを 課題とする。本発明はまた、肥満及びその合併症の予防薬又は治療薬のスクリー二 ング方法を提供することを課題とする。
[0005] 本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討を重ねた。その結果、 SCG3遺 伝子の一塩基多型が肥満に関連することを見出した。さらに、 SCG3遺伝子の発現を 調節する化合物をスクリーニングすれば、肥満の予防 ·治療薬が得られることを見出 し、本発明を完成するに至った。
[0006] すなわち、本発明は以下の通りである。
(1)セクレトグラニン 3遺伝子上に存在する一塩基多型を分析し、該分析結果に基 づレ、て肥満を検査する方法。
(2)さらに、前記分析結果に基づいて、肥満患者におけるインスリン分泌低下、耐 糖能異常、または糖尿病の発症を予測する、 （1)の方法。
(3)前記一塩基多型が、配列番号:!〜 12それぞれの塩基配列の塩基番号 61番目 の塩基に相当する塩基における多型から選ばれる 1又は 2以上の多型である、（1)ま たは（2)の方法。
(4)配列番号 1〜： 12のいずれかの塩基配列において、塩基番号 61番目の塩基を 含む 10塩基以上の配歹 IJ、又はその相補配列を有する肥満検査用プローブ。
(5)配列番号 1〜： 12のいずれかの塩基配列において、塩基番号 61番目の塩基を 含む DNA断片を増幅することのできる肥満検査用プライマー。
(6)セクレトグラニン 3遺伝子またはセクレトグラニン 3遺伝子のプロモーターに連結 されたレポーター遺伝子を発現する細胞に医薬候補物質を添加する工程、セクレト ダラニン 3遺伝子またはレポーター遺伝子の発現量を測定する工程、及び前記発現 量を変化させる物質を選択する工程を含む、肥満の予防薬又は治療薬をスクリー二 ングする方法。
図面の簡単な説明
[0007] [図 1]SCG3遺伝子上の SNPの位置を示す図。 #がランドマーク SNP、 *が挿入/ 欠失多型、†は 1次スクリーニングで解析した SNPsを示す。
[図 2A]各 SNPを含むフラグメント（1つ）の転写活性化能を SH-SY5Y細胞において解 析した結果を示す図。口はメジャーアレル、國はマイナーアレルに相当するフラグメ ントを用いた場合の結果をそれぞれ示している。ルシフェラーゼ活性は平均値土 SE で示し、有意差は非対 t 検定に従った。
園 2B]各 SNPを含むフラグメント（4つ連結したもの）の転写活性化能を SH-SY5Y細胞 において解析した結果を示す図。口はメジャーアレル、國はマイナーアレルに相当 するフラグメントを用いた場合の結果をそれぞれ示している。ルシフェラーゼ活性は 平均値土 SEで示し、有意差は非対 t—検定に従った。
園 3A]各 SNPを含むフラグメント（1つ）の転写活性化能を BE(2)-C細胞において解析 した結果を示す図。口はメジャーアレル、國はマイナーアレルに相当するフラグメント を用いた場合の結果をそれぞれ示している。ルシフヱラーゼ活性は平均値土 SEで示 し、有意差は非対 t_検定に従った。
園 3B]各 SNPを含むフラグメント（4つ連結したもの）の転写活性化能を BE(2)-C細胞 において解析した結果を示す図。口はメジャーアレル、國はマイナーアレルに相当 するフラグメントを用いた場合の結果をそれぞれ示している。ルシフェラーゼ活性は 平均値土 SEで示し、有意差は非対 t 検定に従った。
[図 4A]各 SNPを含むフラグメント（1つ）の転写活性化能を HIT-T15細胞において解 析した結果を示す図。口はメジャーアレル、國はマイナーアレルに相当するフラグメ ントを用いた場合の結果をそれぞれ示している。ルシフェラーゼ活性は平均値土 SE で示し、有意差は非対 t 検定に従った。
[図 4B]各 SNPを含むフラグメント（4つ連結したもの）の転写活性化能を HIT-T15細胞 において解析した結果を示す図。口はメジャーアレル、國はマイナーアレルに相当 するフラグメントを用いた場合の結果をそれぞれ示している。ルシフェラーゼ活性は 平均値土 SEで示し、有意差は非対 t—検定に従った。
[図 5A]SNP_ 2 (5' Flanking -1203)を含むオリゴヌクレオチドを用いたゲルシフト実 験の結果を示す図（写真)。 C，G，Aはそれぞれの多型に対応するオリゴヌクレオチドを 示す。矢印は特異的結合を示している。
[図 5B]SNP_ 9 (Intron 1 +190)を含むオリゴヌクレオチドを用いたゲルシフト実験の 結果を示す図（写真)。 C，G,Aはそれぞれの多型に対応するオリゴヌクレオチドを示 す。矢印は特異的結合を示している。
[図 6]SCG3遺伝子を含むプラスミドまたはコントロールプラスミドをトランスフエタトした BE(2)-C細胞の電子顕微鏡による観察結果を示す図（写真)。 （A)はコントロールブラ スミドをトランスフヱタトした BE(2)-C細胞、 （B)は SCG3遺伝子を含むプラスミドをトラン スフエタトした BE(2)_C細胞の電子顕微鏡像である。矢印（→)は分泌顆粒を示す。 (C )は SCG3遺伝子を含むプラスミドをトランスフエタトした BE(2)-C細胞を抗 SCG3抗体で 染色した染色結果を示す像である。矢印（黒三角）は SCG抗体で染色された分泌顆 粒を示している。スケールバーは 500 nmを示している。
発明を実施するための最良の形態
[0008] < 1 >本発明の検査方法
本発明の検査方法は、セクレトグラニン III (SCG3)遺伝子上に存在する肥満に関連 する一塩基多型（SNP ; single nucleotide polymo卬 hism)を分析し、該分析に基づい て肥満を検査する方法である。肥満としては、例えば、 BMKBody Mass Index ; (体重 kg) / (身長 m) 2)が 25以上の状態をいう。なお、本発明において、「検査」とは将来、 肥満になるかどうかを予測ための検査、及び肥満の程度が悪化するかどうかを予測 するための検查を含む。また、肥満になった場合における、インスリン分泌能の低下 や耐糖能異常、糖尿病などの合併症の発症の検査も含む。さらに、肥満が皮下脂肪 蓄積によるものであるかどうかの検查も含む。
[0009] SCG3遺伝子としては、ヒト SCG3遺伝子が好ましく、例えば、 GenBank Accession No . AC020892に登録された配列を有する遺伝子を挙げることができる。ただし、該遺伝 子は人種の違いなどによって 1又は複数の塩基に置換や欠失等が存在する可能性 があるため、上記配列の遺伝子に限定されない。
[0010] 肥満に関連する SCG3遺伝子の一塩基多型部位は特に制限されないが、例えば、 以下に示す SNP-1、 SNP- 2、 SNP-5、 SNP- 9、 SNP- 11、 SNP_12、 SNP- 16、 SNP_17、 S NP-20、 SNP-26、 SNP_27、 SNP-29が挙げられる。
[0011] [表 1] 表 1
Figure imgf000006_0001
表 1において、例えば、 SNP-1は GenBank Accession No. AC020892の 144248番目 の塩基におけるアデニン (A) Zグァニン (G)の多型を意味し、この塩基力 SAである場 合は肥満になる確率が高い。また、アレルを考慮して解析した場合は、 SNP-1が AA >AG > GGの順で肥満になる確率が高レ、。なお、 SNP locationの 5' Flankingは、転 写開始点を基準とした位置を示している。例えば、 SNP-1は 5'隣接領域内の、転写 開始点より 1492塩基上流の塩基における SNPである。 dbSNPは National Center for Bi otechnology Informationの dbSNPァータべース (www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP /)の登録番号を示す。この欄が空欄の SNPは dbSNPデータベースに登録されていな い新規 SNPである。
その他の SNPについても同様である力 いずれについても左側の塩基が肥満になり やすい塩基である（例えば、 SNP-2の場合、 A/Cのうち Aの場合が肥満になりやす SNP - 5の場合、 G/Cのうち Gの場合が肥満になりやすレ、）。
なお、 SNP- 1、 SNP- 2、 SNP- 5、 SNP - 9、 SNP- 11、 SNP- 12、 SNP- 16、 SNP- 17、 SNP- 20、 SNP-26、 SNP-27又は SNP-29について、 SNP塩基及びその前後 60bpの領域を 含む合計 121bpの長さの配列を、それぞれ配列番号 1， 2， 3， 4, 5, 6， 7， 8， 9, 10 , 11 , 12に示した。それぞれ 61番目の塩基が多型を有する。
これらの塩基に相当する塩基を本発明においては解析する。ここで、「相当する」と は、ヒト SCG3遺伝子上の上記配列を有する領域中の該当塩基を意味し、仮に、人種 の違いなどによって上記配列が SNP以外の位置で若干変化したとしても、その中の 該当塩基を解析することも含む。
[0013] 上記 SNPの塩基の種類を調べることによって、肥満を検查することができる。検査す る SNPの数は、一種類でもよいし、複数でもよレ、。なお、 SNP- 1が Aであれば他の SNP も左側の塩基（SNP- 2 =A、 SNP- 5 = G、 SNP- 9 =A、 SNP- 11 = C、 SNP_12 =A、 SNP- 16 = C、 SNP- 17 =A、 SNP- 20 = G、 SNP- 26 = C、 SNP_27 = T、 SNP_29 = T)であると レ、うように、上記 SNPのタイプは互いに相関するため、一箇所のみを解析することによ つても十分正確な肥満の予測を行うことができる。なお、 SCG3遺伝子の配列はセンス 鎖を解析してもよレ、し、アンチセンス鎖を解析してもよレ、。
[0014] 肥満患者においては、 SNP-2が CC (SNP-1は GG)の場合、インスリンの分泌量が少 なぐ血糖値が上昇する傾向がある。したがって、肥満患者において SCG3遺伝子の 一塩基多型を調べることで、肥満患者が、インスリン分泌低下、耐糖能異常、または 糖尿病を引き起こす可能性について予測することもできる。
[0015] SCG3遺伝子の一塩基多型の解析に用レ、る試料としては、染色体 DNAを含む試 料であれば特に制限されないが、例えば、血液、尿等の体液サンプル、細胞、毛髪 等の体毛などが挙げられる。一塩基多型の解析にはこれらの試料を直接使用するこ ともできる力 これらの試料から染色体 DNAを常法により単離し、これを用いて解析 することが好ましい。
[0016] SCG3遺伝子の一塩基多型の解析は、通常の一塩基多型解析方法によって行うこ とができる。例えば、シークェンス解析、 PCR、ハイブリダィゼーシヨンなどが挙げられ るが、これらに限定されない。
[0017] シークェンスは通常の方法により行うことができる。具体的には、多型を示す塩基の 5 '側数十塩基の位置に設定したプライマーを使用してシークェンス反応を行レ、、そ の解析結果から、該当する位置がどの種類の塩基であるかを決定することができる。 なお、シークェンスを行う場合、あらかじめ多型を含む断片を PCRなどによって増幅し ておくことが好ましい。
[0018] また、 PCRによる増幅の有無を調べることによつても解析することができる。例えば、 多型を示す塩基を含む領域に対応する配列を有し、かつ、各多型に対応するプライ マーをそれぞれ用意する。それぞれのプライマーを使用して PCRを行い、増幅産物 の有無によってどのタイプの多型であるかを決定することができる。
[0019] また、多型を含む DNA断片を増幅し、増幅産物の電気泳動における移動度の違い によってどのタイプの多型であるかを決定することもできる。このような方法としては、 例 ば、 PCR-SSCP (single― strand coniormation polymorphism)法 (Geno mics. 1992 Jan 1 ; 12 (1)： 139— 146. )が挙げられる。具体的には、まず、 SCG3遺伝子の多型部位を含む DNAを増幅し、増幅した DNAを一本鎖 DNAに解 離させる。次いで、解離させた一本鎖 DNAを非変性ゲル上で分離し、分離した一本 鎖 DNAのゲル上での移動度の違いによってどのタイプの多型であるかを決定するこ とができる。
[0020] さらに、多型を示す塩基が制限酵素認識配列に含まれる場合は、制限酵素による 切断の有無によって解析することもできる（RFLP法)。この場合、まず、 DNA試料を 制限酵素により切断する。次いで、 DNA断片を分離し、検出された DNA断片の大 きさによってどのタイプの多型である力を決定することができる。
[0021] ハイブリダィゼーシヨンの有無を調べることによって多型の種類を解析することも可 能である。すなわち、各塩基に対応するプローブを用意し、いずれのプローブにハイ ブリダィズするかを調べることによって SNPがいずれの塩基であるかを調べることもで きる。
[0022] なお、本発明の検査法においては、 SCG3遺伝子の多型に加え、他の遺伝子の多 型を解析し、それらの遺伝子の多型の組合わせに基レ、て肥満の検査を行ってもょレヽ 。他の遺伝子としては、 /3アドレナリンレセプター遺伝子（日本臨床、 2002 Jul;60 Sup pi 7:565- 70.)ゃレプチン遺伝子（Hum Genet., 2001, vol.108(3), p233- 236)などが挙 げられる。
[0023] < 2 >本発明の検查用試薬
本発明はまた、肥満を検查するためのプライマーやプローブなどの検查試薬を提 供する。このようなプローブとしては、 SCG3遺伝子における上記多型部位を含み、ハ イブリダィズの有無によって多型部位の塩基の種類を判定できるプローブが挙げら れる。具体的には、配列番号:!〜 12のいずれかの塩基配列の 61番目の塩基を含む 配列、又はその相補配列を有する 10塩基以上の長さのプローブが挙げられる。プロ ーブの長さはより好ましくは、 15〜35塩基である。
また、プライマーとしては、 SCG3遺伝子における上記多型部位を増幅するための P CRに用いることのできるプライマー、又は上記多型部位を配列解析（シークェンシン グ)するために用いることのできるプライマーが挙げられる。具体的には、配列番号 1 〜 12のいずれかの塩基配列の 61番目の塩基含む領域を増幅したりシークェンシン グしたりすることのできるプライマーが挙げられる。このようなプライマーの長さは 10〜 50塩基が好ましぐ 15〜35塩基がより好ましい。
上記多型部位をシークェンシングするためのプライマーとしては、上記塩基の 5 '側 領域、好ましくは 30〜 100塩基上流の配列を有するプライマーや、上記塩基の 3 '側 領域、好ましくは 30〜 100塩基下流の領域に相補的な配列を有するプライマーが例 示される。 PCRによる増幅の有無で多型を判定するために用いるプライマーとしては 、上記塩基を含む配列を有し、上記塩基を 3 '側に含むプライマーや、上記塩基を含 む配列の相補配列を有し、上記塩基の相補塩基を 3 '側に含むプライマーなどが例 示される。
なお、本発明の検査用試薬はこれらのプライマーやプローブに加えて、 PCR用のポ リメラーゼゃバッファー、ハイブリダィゼーシヨン用試薬などを含むものであってもよい なお、上記のようなプローブやプライマーは肥満患者がインスリン分泌低下、耐糖 能異常、または糖尿病を引き起こすかどうかを予測するためにも用いることができる。 < 3 >スクリーニング方法
本発明者の研究により、 SCG3は食欲調節に深く関与することが知られている弓状 核、室傍核、視床下部外側野に局在することが明らかとなり、 SCG3はこれらの部位に おいて食欲の調節に関与するペプチドホルモンの分泌に関与していることが強く示 唆された。以上のことから、 SCG3遺伝子の発現を調節する物質をスクリーニングする ことにより、肥満の予防薬又は治療薬となりうる候補物質を得ることができる。また、肥 満に伴う、耐糖能異常、インスリン分泌低下、糖尿病などの合併症の予防薬又は治 療薬となりうる候補物質を得ることもできる。
すなわち、本発明のスクリーニング方法は、 SCG3遺伝子または SCG3遺伝子のプロ モーターに連結されたレポーター遺伝子を発現する細胞に医薬候補物質を添加す る工程、セクレトグラニン 3遺伝子またはレポーター遺伝子の発現量を測定する工程 、及び前記発現量を変化させる物質を選択する工程を含む、肥満またはその合併症 の予防薬又は治療薬のスクリーニング方法である。
[0025] SCG3遺伝子を発現する細胞としては、神経系の細胞が好ましぐ SH-SY5Y細胞 (A TCC CRL- 2266)や BE(2)-C細胞（ATCC CRL- 2268)、 HIT- T15細胞（ATCC CRL-1 777)などを用いることができる。
SCG3遺伝子のプロモーターに連結されたレポーター遺伝子を用いる場合、 SCG3 遺伝子のプロモーターとしては、上述した SNPを含む領域が好ましぐ該遺伝子の転 写開始点の上流の少なくとも 1. 5kbpを含む領域が好ましい。また、プロモーターは その一部を用いてもよぐ例えば SNPを含む 10〜50bpの短い領域を用いてもよい。 S NPを含むプロモーターを使用する場合、 SNPの塩基としては肥満の危険度が低レ、方 の塩基（例えば、 SNP-2の場合は C、 SNP-9の場合は G)を含むプロモーターが好まし レ、。
レポーター遺伝子としては、ルシフェラーゼ遺伝子、 GFP遺伝子、クロラムフエニコ ールァセチルトランスフェラーゼ遺伝子などが例示できる。これらのレポーター遺伝 子を SCG3遺伝子のプロモーターに連結し、これを哺乳類細胞に遺伝子を導入する ために用いられるプラスミドに組み込み、リポフエクシヨンなどの通常の方法にて細胞 にトランスフエクシヨンする。
[0026] 上記のような神経細胞又はレポーター遺伝子が導入された細胞に医薬候補物質を 添加し、 SCG3遺伝子またはレポーター遺伝子の発現量を測定する。
医薬候補物質としては特に制限はなぐ例えば、低分子合成化合物であってもよい し、天然物に含まれる化合物であってもよレ、。また、ペプチドであってもよレ、。スクリー ユングには個々の被検物質を用いてもよいが、これらの物質を含む化合物ライブラリ 一を用いてもょレ、。候補物質の中から SCG3遺伝子又はレポーター遺伝子の発現量 を変化させるものを選択することにより、肥満薬の候補物質を得ることができる。なお 、「変化」とは、医薬候補物質が、非添加時に比べて、 SCG3遺伝子の発現量を増加 させること、および減少させることを含む。
SCG3遺伝子の発現量は RT_PCR、定量 PCR、ノーザンブロット、 ELISA、 Western bl otting、 In situ hybridization,免疫組織染色などの方法により測定することができる。 レポーター遺伝子の発現量はレポーター遺伝子の種類にもよるが、蛍光強度などに よって測定することができる。
SCG3遺伝子またはレポーター遺伝子の発現量を変化させた物質を抗肥満薬の候 補物質として選択することができる。
実施例
[0027] 以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明する。但し、本発明はこれらの実 施例に限定されない。
[0028] (1)多型解析
まず、以下のようにして、肥満に関連する SNPの探索を行った。
東京医科大学、大阪大学などの大学病院や豊中巿病院、大手前病院などの病院 の外来患者から選ばれた肥満患者 (BMI 30)を解析の対象とした。 2次的肥満や 遺伝的肥満の患者は解析対象から除いた。
対照の被験者は東京医科大学などで検診を受けた通常体重のボランティアから任 意に選んだ。
各被験者より書面のインフォームドコンセントを得たうえで、各施設の倫理委員会及 び理化学研究所の承認を得たプロトコルに基づいて解析を行った。
[0029] く DNAの調製と SNPジエノタイピング〉
試料として、各被験者の血液サンプルから染色体 DNAを、通常の手順にて調製し た。
JSNPァ1 ~タへ1 ~ス (A database or Japanese bmgle Nucleotide Polymorphisms； snp.i ms.u-tokyo.ac.jp/indexja.html)から任意に選んだ 62663種類の SNPsを、 94人の日 本人の肥満患者（症例 1 ; 39名の男性及び 55名の女性、平均年齢 47 ± 2歳、 BMI36 . 3 ± 0. 5kg/m2)において、インベーダーアツセィ（Ohnishi, Y. et al. J. Hum. Gen et. 46, 471-477 (2001))によりジエノタイピングを行った。これらの SNPsのジエノタイプ とアレル頻度を一般的な日本人からなる 658人 (対照 1)と比較した。その結果、 SCG 3遺伝子上の SNP (5， Flanking-1492 AC020892.7_144248又は rs3764220 ; IMS-JSTl 18085)が肥満との相関を示し、メジャーアレル (A)とマイナーアレル（G)の比較で p = 0. 02を示すことがわ力、つた（表 2、 3の上段参照）。
[0030] したがって、この SCG3遺伝子に注目し、別の肥満患者（症例 2 ; 379名の男性及び 417名の女性、平均年齢 49 ± 1歳、 BMI34. 3 ± 0. 2kg/m2)及び通常体重の対照 被験者（コントロール 2 ; 285名の男性及び 489名の女性、平均年齢 52 ± 1歳、 BMI2 1. 6 ± 0. lkg/m2)について、 SCG3遺伝子上に存在する上記ランドマーク SNP (5， Flanking領域- 1492)の多型をさらに調べた。
[0031] 結果を表 2、 3 (下段）に示す。この SNPは、メジャーアレル (A)とマイナーアレル（G) の比較で p = 0.000032、マイナーアレルホモ体（GG)とその他（AG、 AA)の比較で p = 0.0000035と、肥満に対して非常に高い相関を示すことがわかった。
ジエノタイプ分布、アレル頻度は χ 2乗検定又は Fisher' s exact testによって解析し 表 2の HWEテストは Hardy-Weinberg equilibrium test (Nealsen, D.M., Ehm, M.G. & Weir, B.S. Am. J. Hum. Gent. 63， 153-1540 (1998))を示す。
[0032] [表 2] 表 2. SCG3遣 fef "のランドマーク SNP(5'Flanking— 1492) と SE¾との W¾
No. (%) of Subjects No. (%) of Chromosomes HWE Test3
Population AA AG GG A G x2 P 症例 1 (1^94) 0(0.0) 175 (93.1) 13 (6.9) 0.5 0.47 顺 1 (n=634) 486(76.7) 134 (21.1) 14(22) 1106 (872) 162 (12.8) 1.7 0.19 症例 2(n=796) 639(80.3) 154 (19.3) 3 (0.4) 1432 (89.9) 160 (10.1) 3.9 0.05 対照 2(n=711) 522(73.4) 164(23.1) 25 (3 ) 1208 (85.0) 374(15.0) 6.8 0.01
[0033] [表 3] 表 ¾Kfのランドマーク ， と AE^との ¾〜まとめ
Figure imgf000012_0001
症例 対照
Hardy- Weinberg equilibrium test^ b Fisher's exact test, c not determined [0034] 次に、上記症例 2及び対照 2について、 SCG3遺伝子内の他の SNPについても調 ベた。なお、各 SNPsの SCG3遺伝子上の位置関係を図 1に示した。
その結果（表 4)、 11種類の SNPの型は SNP— 1とほとんど完全に相関しており（ Δ の欄参照）、肥満とも有意に相関する（％ 2 P value参照）ことがわかった。危険率（Od ds ratio)及び 95%信頼区間（c丄）は Woolfの方法に従った。また、相関の非平衡係数（ Δ )は Delvin, B. & Rish, N. Genomics 29, 311-322 (1995)に従った。
以上より、これらの多型を解析することにより、肥満を予測できることが示唆された。
[0035] [表 4]
a o o o
置oPWw 21oOl ad/slSUalEA33A edios
o
i
ο 隱
o
s
一 9 ¾ sswcsds
s
： s
o S H
1 1 o ∞
Figure imgf000014_0001
次に、上記症例 2及び対照 2について、さらに、 BMI、血中インスリン値、血糖値、血 中コレステロール値、血中トリグリセリド値、血中 HDL_コレステロール値及び血圧を 測定し、それらのパラメーターと SNP-2 (5 ' Flanking-1203)の多型との関連を調べた 。結果を表 5に示す。
その結果、肥満患者では C/Cの場合に BMI、血中インスリン値、血中トリグリセリド値 及び血圧が低ぐ血糖値が高い傾向を示した。一方で、対照群ではこれらのパラメ ターは多型によって違いは見られなかった。
上記結果より、肥満患者の中でも、 SNP-2の C/C型を有する患者はインスリン抵抗 性に応答して血糖値を下げるためのインスリンを十分に分泌できないため、耐糖能異 常や糖尿病に陥る可能性が高くなることが示唆された。
[0037] [表 5] 表 5
翻 顺 ^f† (症例 + 纖
AA AC CC AA AC CC AA AC CC
N 637 156 3 522 165 24 1159 321 27
BM(kgm 34.4 ±0^ 344 ±0,5 31.2±0 21.6 0.1 21.5 ±02 21.8 ±0.5 28.6±02 27.8 ±0.4 22.8 0.7 (mmoir1) 7.36 ±0.12 7.33 ±0.26 g.88± 1.6 5.33 ±0.06 5.19±0.05 5.38 0.15 6.41 ±0.08 6.21 ±0.14 5,75 ±0.29 pmoir1) 101 4 93 9 57 11 36± 1 37±3 40±4 66±2 68±3 43 ±4 mrnof1) 5.44 ±0.04 5.42 ±0.07 5.85 ±0.19 523 ±0.05 5.27 ±0.10 5.38 ±021 5.37 ±0.03 5.36 ±0.06 5.46 ±0.18 mgdl.1) 157±4 160±9 115±25 95 ±3 96±5 101 14 m 3 127 5 102 ± 13
HDL^ immoir】） 1.35 ±0.02 1.41 ±0.04 1.34 ±0.17 1.69 ±0.02 1.68 ±0.03 1.61 ±0.07 U2±0.01 1.56±0.(B 1.58 ±0,06
(mmHg) 138 ± 1 137 ± 1 126 ±9 116 1 114± 1 112±4 L30± l 127± 1 113±4
¾fttJ± (mmHg) 85± 1 83 ± 1 79±4 73± 1 72 1 69±3 81 ± 1 78± 1 70±2
[0038] 次に、肥満の有無に関係なくランダムに選ばれた 403人の日本人被検者 (男性 144 名、女性 259名；年齢 48 ± 1歳）について、 BMI、内臓脂肪面積、皮下脂肪面積を測 定し、 SNP-2の多型との関係を調べた。結果を表 6に示した。皮下脂肪面積、内臓脂 肪面積と、 BMIの相関は、それぞれ 0.77 (pく 0.001) 0.50 (P〈0.001)であった。皮下脂 肪面積は内臓脂肪面積に対し、有意に相関を示した（r=0.27 pく 0.001)。
[0039] [表 6] 表 6
SNP-2 (5' Flanking-1203) の輕
AA AC CC
N (男'! ¾女 306(117/189) 88(26/62) 9(1/8)
m (歳） 48±1 49±1 49±3
BMl(kgm"2) 29.7 ±0.4 30.0 ±0.9 25.1 ±0.8 内臟旨肪繊 cm2) 128 ±5 124 ±7 77 ±12 皮下脂肪麵 (cm2) 252 ±7 238 ±13 195 ±16
[0040] SNP-2の多型と皮下脂肪面積および内臓脂肪面積との相関を明らかにするため、 S NP-2の多型を AAとその他 (AC、 CC)に分け、重回帰分析を行った (表 7)。その結果 、 AA型 (n = 306, P = 0.0015),女性 (Pく 0.0001)及び BMIの増カロ (P < 0.0001)は、 皮下脂肪面積の増加に有意に相関した（R2= 0.67)。 SNP-2の多型は皮下脂肪面積 に独立して影響を与えることがわ力つた。一方、内臓脂肪面積に対しては有意な相 関を示さなかった。
[0041] [表 7] 表 7
内臟旨肪 AA versus AC + CC
Independent Vanable 回 '扉数 標聰差 P 删（男 女' [¾ 1/0) 61.271 6.583 < 0.0001 mm 1.064 0.264 < 0.0001
BMI, kg m"2 5.723 0.454 < 0.0001
Genotype, 1/0 3.193 7.332 0.66
R2 41%
皮下脂肪 AA versus AC + CC
Independent Variable 回'礙、数 標賴差 P 侧（男' ft女' 1/0) -69.550 7.167 < 0.0001 權歳） -0.329 0.289 0.26
BMI,kgm2 13.044 0.495 < 0.0001
Gaiotype, 1/0 25.499 7.952 0.0015
R2 67%
[0042] (2) SCG遺伝子の転写解析 SNP— 1、 SNP— 2、 SNP— 5iま 5'隣接領域に、 SNP— 9、 SNP— 11、 SNP— 1 2はイントロン 1内に存在する。したがって、これらの多型が SCG3遺伝子の転写に与 える影響を調べるために、以下の実験を行った。
各 SNPにっき、メジャーアレル又はマイナーアレルを含む 20bp領域に相当する 2 本鎖オリゴヌクレオチドまたはそれ力 S4つ連結したものに、 5'側に Nhelサイト、 3'側に Xbalサイトを導入したオリゴヌクレオチドをそれぞれ合成した。 SV40プロモーターに連 結されたルシフェラーゼ遺伝子を含む pGL3_Promoter Vector (Promega)に上記オリ ゴヌクレオチドを組み込んでレポータープラスミドを構築した。オリゴヌクレオチドが組 み込まれたことはシークェンスによって確認した。このレポータープラスミドを、トランス フエクシヨン効率の内部標準としての phRL-TKベクター（Promega)とともに、リボフエタ トァミン 2000 (Invitrogen)を用いて SH-SY5Y細胞又は BE(2)_C神経芽細胞腫細胞にト ランスフエクシヨンした。 24時間後に細胞を回収し、 Duaト Luciferase Reporter Assay S ystem (Promega)を用いてルシフェラーゼ活性を測定した。
[0043] なお、 SH-SY5Y細胞および BE(2)— C細胞は ATCC (American Tissue Culture Colle ction)より購入した。これらは 2mMグルタミン、 5%ゥシ胎児血清、 100U/mlペニシリン 及び 100 μ g/mlストレフ マ ンン 添 ロし 7こ advanced Dulbecco s modined hagle s medium (Invitrogen)を用レヽて J¾r した。
[0044] SH-SY5Y細胞、 BE(2)_C細胞を用いた結果を図 2、 3にぞれぞれ示す。 SNP— 2及 び SNP— 9を含むフラグメントが転写活性化能を有することがわかった。また、これら のフラグメントの転写活性化能はいずれもマイナーアレルのほうが高いことがわかつ た。さらに、 SNP-2を含む 33bpの 2本鎖オリゴヌクレオチド（以下の段落で用いたフラ グメントと同じ)でも、マイナーアレルで転写活性能が高いことを確認した。
また、 SCG3は膝臓の /3細胞で発現していることが報告されていることから、ノ、ムスタ 一の瞎臓 細胞株である HIT-T15細胞においても、上記と同様の転写解析を行つ た。 （図 4)。その結果、 HIT-T15細胞でも同様の結果が得られた力 SH-SY5Y細胞よ りも転写活性は弱かった。これはヒトとハムスターという種の違いによるものと考えられ た。
[0045] 次に、これらの SNP部位にタンパク質が結合するかを調べるため、以下の実験を行 つた。
まず、各 SNP (SNP— 2又は SNP— 9)を含む 33bpの 2本鎖オリゴヌクレオチドを、 ジゴキシゲニンゲルシフトキットを用いてジゴキシゲニン- 11-ddUTPで標識した。
NE-PER抽出試薬（Pierce)を用いて SH-SY5Y細胞又は BE(2)-C細胞力も核抽出物 を調製し、上記ジゴキシゲニン _ll_ddUTPラベルした 2本鎖オリゴヌクレオチドとイン キュペートした。競合アツセィには、核抽出物を標識オリゴヌクレオチドの 100倍過剰 量の非標識オリゴヌクレオチドとプレインキュペートした後に標識オリゴヌクレオチドと インキュベートした。タンパク質- DNA複合体を、 0.5Xトリス一ホウ酸一 EDTAバッファ 一中、 5%の非変性ポリアクリルアミドゲルにて分離した。ゲルをナイロン膜に移し、シ グナルを化学発光検出システム（Roche)を用い、製造元のプロトコルに従つて検出し た。
[0046] 結果を図 5に示す。 SNP— 2又は SNP— 9のいずれのフラグメントにおいても矢印 の位置に核タンパク質の特異的な結合が見られた。この結合は、マイナーアレルに 対応するフラグメントでのみ見られ、メジャーアレルに対応するフラグメントでは見られ なかった。このことから、転写に関与する核タンパク質がこれらの領域に結合して SCG 3遺伝子の転写を調節しており、メジャーアレルの場合にはこの調節が起こらない可 能性が示唆された。
[0047] (3) SCG3の組織分布の解析
次に、 SCG3の組織分布を調べるため、 In situハイブリダィゼーシヨン及び 2重ラベ ノレ免疫組織化学を行った。
ォスのマウス（B57BL/6、 8週齢）を三共ラボサービスより購入した。マウスは Tissue Fixative (Genostaff)を用いて還流することにより固定化し、パラフィンで包埋した。組 織片（4 μ m)を脱パラフィンィ匕し、 RNAプローブをハイブリダィズさせた。
プローブは、マウス cDNA(GenBank Accession No. NM_009130)の 943〜1383番 目に相当する 441bpの DNA断片を pGEM-T-Easyベクター（Promega)に組み込 み、センスとアンチセンスの RNAプローブを生成させ、これを DIG RNAラベリングミツ タス（Roche)を用いて標識することにより調製した。
ジゴキシゲニン標識 RNAプローブを、上記組織片に 42°Cで 18時間ハイブリダィズさ せた。結合した標識物質はアルカリフォスファターゼ標識 DIG抗体及びアルカリフォス ファタ一ゼの基質である NBT-BCIPを用いて検出した。
その結果、 SCG3の mRNAは弓状核 (ARC)、室傍核（PVN)、視床下部外側野（LH A)のいずれにも検出された。
[0048] 次に免疫組織染色を行った。組織切片（厚さ 4 μ m)を、ォレキシン B (1 : 500 Che micon)、 MCri melanm-concentrating hormone) (1： 500 Phenix Pharmaceuticals)、 NPY (neuro peptide Y)、丄： 200 Chemicon)、 BDNF(Brain_derived neurotrophic fact or) (1 : 100 Santa Cruz)又は POMC proopiomelanocortin) (1： 500 Phenix Pharm aceuticals)のいずれかに対するゥサギポリクローナル抗体と、 SCG3に対するャギポリ クローナル抗体（1： 200 Santa Cruz)の組み合わせのそれぞれと 4°Cでー晚インキュ ベートした。切片を洗浄し、蛍光標識された 2次抗体 (ャギ IgGに対する Alexa Fluor56 8ロバポリクローナル抗体、及びゥサギ IgGに対する Alexa Fluor488ロバポリクローナル 抗体；いずれも 1： 2000 Molecular Probe)を加え、室温で 2時間インキュベートした。
2重免疫蛍光をォリンパスの BX51顕微鏡にて観察した。
[0049] その結果、 SCG3タンパク質は主に ARC、 LHAおよび PVNに検出された。
ARCは食欲調節に関わる部位であり、 NPYや POMCニューロンが存在する。 2重免 疫染色の結果、 ARC内では、 SCG3タンパク質は NPYや POMCと同じ部位に局在して レ、ることが確かめられた。
一方、 LHAは、食欲抑制に関与するォレキシンや MCHが存在する部位である。 2重 免疫染色の結果、 SCG3タンパク質は、 LHA内ではその一部がォレキシン Bや MCHと 同じ部位に局在することが確かめられた。
ARC LHA PVN
SCG3 〇
BDNF 〇
Figure imgf000019_0001
NPY 〇
POMC 〇
ォレキシン B - 〇
MCH - 〇 [0050] (4) SCG3タンパク質の細胞内局在
SCG3タンパク質の細胞内局在を調べるため、神経細胞を用いて免疫染色を行った
SCG3遺伝子のコード領域を、 Pstlサイトを有する 5'プライマー及び Sailサイトを有す る 3 'プライマー、及び錡型として視床下部の cDNAを用いた RT-PCRにより増幅した。
PCR産物を制限酵素で消化した後、同酵素で消化した pBIベクター（Clonetech)に組 み込んだ（pBI-SCG3)。一方、 preproォレキシン、 P〇MC、 proNPY, proMCHのそれ ぞれをコードする遺伝子を Mlulサイトを有する 5'プライマー及び EcoRVサイトを有す る 3 'プライマーを用いた RT-PCRにより増幅した。増幅産物を Mlul及び EcoRVで消 化し、同酵素で消化した pBI- SCG3にそれぞれ組み込んだ（pBI- SCG3-preproorexin 、 pBI- SCG3_POMC、 pBI_SCG3-proNPY、 pBI-SCG3-proMCH) 0
pBI-SCG3-preproorexin, pBI_SCG3_POMC、 pB卜 SCG3_proNPY、 pBI-SCG3-pro MCHを、それぞれ、 pTet-Offベクター（Clonetech)を含む SH-SY5Y細胞または BE(2) _C細胞にリポフエクトァミン 2000試薬（Invitrogen)を用いてトランスフエタトした。免疫 細胞染色のために、 PBSで洗浄後、細胞を 4%パラフオルムアルデヒドで 15分固定し た。細胞をさらに 0. 5%Triton X-100で処理し、 PBSで洗浄し、 1%BSAで室温、 2時 間ブロッキングし、 4°Cでー晚インキュベートした。上記の組織染色と同様に、ォレキ シン、 POMC、 NPY又は MCHのいずれかに対する抗体及び SCG3抗体で反応させ、 次いで、蛍光標識された 2次抗体を反応させた。細胞は共焦点レーザー走査顕微鏡 を用いて観察した。
[0051] その結果、 SCG3は顆粒状の構造を形成し、ォレキシン、 MCH、 NPY及び POMCと 細胞内局在が同じであることがわかった。以上より、 SCG3はこれらの食欲調節に関与 するペプチドの分泌を担っており、 SNPによってこの発現や機能に変化が生じること により、肥満が起こることが示唆された。
[0052] (5)電子顕微鏡による解析
SCG3遺伝子を含むプラスミドまたはコントロールプラスミドでトランスフエタトした BE(2) -C細胞において、 SCG3の局在を免疫電子顕微鏡解析によって調べた。
まず、開始コドンの前に Kozak配列及び Notl認識配列を付カ卩した 5'プライマー、及 び終止コドンの後に EcoRI認識配列を付加した 3 'プライマーを用い、視床下部の cD NAからヒト SCG3遺伝子のコード領域を増幅した。増幅産物を Notlと EcoRIで消化した 後、 pcDNA3.1(_)ベクター（Invitrogen)の Notl部位と EcoRI部位の間に挿入した。得ら れた pcDNA- SCG3を、 FuGENE6 Transfection Reagent (Roche)を用いて、 BE(2)- C 細胞にトランスフエタトした。 48時間後、細胞を PBSで洗浄し、 0.05%トリプシン一 0.53 mM EDTA Gnvitrogen)で処理してディッシュからはがし、遠心分離を行って細胞を回 収した。
回収した細胞を 2.5%グルタルアルデヒドを含む力コジル酸バッファー（pH7.2)で固 定化し、次いで、 2%四酸化オスミウムで処理し、脱水した後、エポキシ樹脂に包坦し た。超薄片を酢酸ゥラニル及びクェン酸鉛で染色した。
一方、免疫組織染色のためには、回収した細胞を 4%パラホルムアルデヒドを含む 力コジル酸バッファー（pH7.2)で固定化し、脱水し、 LR-WHITE (登録商標）樹脂に包 坦した。超薄片を抗 SCG3ャギポリクローナル抗体 (Santa Cruze ; 200倍希釈)で処理し 、次いで、 5 nmの金で標識された抗ャギ IgGゥサギ抗体 (Amersham Bioscience)で処 理した。
それぞれの像を透過型電子顕微鏡 (JEOL)を用いて観察した（図 6)。 SCG3遺伝子 をトランスフエタトした BE(2)-C細胞では顆粒が観察された力 コントロールベクターを トランスフエタトした細胞では観察されなかった。免疫電子顕微鏡解析の結果、顆粒 は抗 SCG3抗体で染色され、 SCG3が神経細胞内で分泌顆粒を形成していることが わかった。
産業上の利用の可能性
本発明の検查方法により、肥満の発症リスクや進行を正確に予測することができる ため、肥満を予防したり、進行を抑えたりすることができる。また、本発明のスクリー二 ング方法によれば、肥満の新規な予防 ·治療薬を得ることができる。

Claims

請求の範囲
[1] セクレトグラニン 3遺伝子上に存在する一塩基多型を分析し、該分析結果に基づい て肥満を検査する方法。
[2] さらに、前記分析結果に基づいて、肥満患者におけるインスリン分泌低下、耐糖能異 常、または糖尿病の発症を予測する、請求項 1に記載の方法。
[3] 前記一塩基多型が、配列番号:!〜 12それぞれの塩基配列の塩基番号 61番目の塩 基に相当する塩基における多型から選ばれる 1又は 2以上の多型である、請求項 1又 は 2に記載の方法。
[4] 配列番号:!〜 12のいずれかの塩基配列において、塩基番号 61番目の塩基を含む 1 0塩基以上の配歹 IJ、又はその相補配列を有する肥満検査用プローブ。
[5] 配列番号:!〜 12のいずれかの塩基配列において、塩基番号 61番目の塩基を含む D NA断片を増幅することのできる肥満検査用プライマー。
[6] セクレトグラニン 3遺伝子またはセクレトグラニン 3遺伝子のプロモーターに連結され たレポーター遺伝子を発現する細胞に医薬候補物質を添加する工程、セクレトグラ ニン 3遺伝子またはレポーター遺伝子の発現量を測定する工程、及び前記発現量を 変化させる物質を選択する工程を含む、肥満の予防薬又は治療薬をスクリーニング する方法。
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