WO2006059712A1 - ヒトステロイドサルファターゼに結合するモノクローナル抗体 - Google Patents

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WO2006059712A1
WO2006059712A1 PCT/JP2005/022169 JP2005022169W WO2006059712A1 WO 2006059712 A1 WO2006059712 A1 WO 2006059712A1 JP 2005022169 W JP2005022169 W JP 2005022169W WO 2006059712 A1 WO2006059712 A1 WO 2006059712A1
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sts
human
human sts
disease
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PCT/JP2005/022169
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Hiroshi Sasaki
Hironobu Sasano
Takashi Suzuki
Akiko Furuya
Original Assignee
Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd.
Kyowa Medex Co., Ltd.
Tohoku University
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    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/573—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for enzymes or isoenzymes
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    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/40—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against enzymes

Definitions

  • the present invention relates to an antibody that specifically binds to human steroid sulfatase (hereinafter abbreviated as STS) and does not bind to arylsulfatase other than human STS (hereinafter abbreviated as ARS).
  • STS human steroid sulfatase
  • ARS arylsulfatase other than human STS
  • the present invention relates to an antibody fragment and a hybridoma that produces the antibody.
  • the present invention provides an immunological detection method or immunological quantification method for human STS, an immunological detection reagent or kit for human STS, and an immunological quantification reagent or kit using the antibody or antibody fragment, Furthermore, immunological detection of human STS using the antibody or antibody fragment for determination of human STS-related diseases, selection of drugs suitable for treatment of human STS-related diseases, and determination of the pathology of human STS-related diseases Method or immunological quantification method, reagent or kit for immunological detection of human STS, and reagent or kit for immunological quantification
  • Steroid sulfatase (E.C.3.1.6.2.) Is an enzyme that desulfates 3 ⁇ steroid sulfate.
  • the conversion of cholesterol sulfate to cholesterol is essential for normal exfoliation of the stratum corneum in the upper epidermis, and the congenital defect of STS causes ichthyosis (Non-patent Document 1).
  • STS catalyzes the conversion of estrone precursors such as estrone sulfate to estrone in vivo (Non-patent Document 2).
  • the resulting estrone is further converted to estradiol, which is a dehydrogenase-activating hormone.
  • Estradiol is a kind of estrogen.
  • Some breast, ovarian and uterine cancers are hormone-dependent tumors in which estrogen is deeply involved in their development and proliferation.
  • the ratio of estrogen ⁇ estrone sulfate or the enzyme activity of STS is significantly higher in breast cancer and cadaver cancer tissues than in normal yarn and tissue (Non-patent Document 3, Non-Patent Document 4).
  • STS in hormone-dependent tumors may be upregulated at the protein level by analysis using antibodies against STS.
  • Non-patent Document 5 By immunohistochemical staining using an anti-human STS monoclonal antibody, It is known that the expression of STS is enhanced as compared with normal tissues (Non-patent Document 5). In addition, as a result of immunohistochemical staining of the cancerous part of 113 patients with invasive ductal carcinoma using anti-human STS monoclonal antibody, 74.3% were STS positive, and the expression of STS was tumor size, It showed a positive correlation with recurrence risk and poor prognosis (Non-patent Document 6).
  • Breast cancer can be broadly classified into breast cancer, lobular cancer, and Paget's disease, depending on the site of occurrence.
  • Non-patent Document 8 Cancers that are only in the breast ducts are called non-invasive cancers, and those that infiltrate the stroma are called invasive cancers. There is a trend. The existence of STS activity has been confirmed in epithelial cancer cells (Non-patent Document 8).
  • Endometriosis is a tumor-like benign disease in which tissues similar to the endometrium are ectopically located outside the uterine lumen. Since the eclampsia is proliferated by estrogen, in endometriosis it is increased by estrogen. Uterine adenomyosis is a subtype of endometriosis, in which the eclamptic intima penetrates into the eclampsia layer. Of the 21 patients with eclampsia, 78% of the adenomyosarcoma showed STS expression, and STS expression was restricted to glandular epithelial cells (Non-patent Document 7).
  • Non-patent Document 4 As a method for examining the expression of STS, a method for measuring enzyme activity (Non-patent Document 4), a method for quantifying mRNA amount (Non-Patent Document 9), or a detection method and a quantifying method using an antibody (Non-patent Document 4) References 5 and 6) are known.
  • STS is a protein belonging to the ARS family. To date, six types of ARS A, B, C, D, E, and F are known, and human STS is the same protein as ARS C.
  • Non-Patent Document 2 Endocrinology, 90, 390 (1972)
  • Non-Patent Document 3 J. steroid Biochem., 33, 1049 (1989)
  • Non-Patent Document 4 Asia- Oceania, J. Obstet. Gynaecol, 15, 101 (1989)
  • Non-Patent Document 5 Breast Cancer, 6, 331 (1999)
  • Non-Patent Document 6 Cancer Research, 63, 276 (2003)
  • Non-Patent Document 7 Obstetrics & Gynecology, 98, 815 (2001)
  • Non-patent literature 8 Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism, 65, 164 (1987)
  • Non-patent literature 9 Cancer Research, 59, 377 (1999)
  • Non-Patent Document 10 Cell, 49, 443 (1987)
  • An object of the present invention is to provide an antibody or antibody fragment that specifically binds to human STS and does not bind to ARS other than human STS, and a hybridoma that produces the antibody.
  • an object of the present invention is to provide an immunological detection method or immunological quantification method of human STS, a reagent or kit for immunological detection of human STS, and an immunological quantification reagent using the antibody or antibody fragment.
  • a kit and further, human STS-related diseases using the antibody or antibody fragment for determining human STS-related diseases, selecting drugs suitable for the treatment of human STS-related diseases, and determining the pathology of human STS-related diseases. It is intended to provide an immunological detection method or immunological quantification method, a reagent or kit for immunological detection of human STS, and a reagent or kit for immunological quantification.
  • the present invention relates to the following (1) to (53).
  • STS human steroid sulfatase
  • the antibody or antibody fragment according to (1) which is arylsulfatase other than human STS, arylsulfatase, arylsulfatase, arylsulfatase 0, arylsulfatase E, or arylsulfatase F.
  • a human STS-related disease is determined by immunologically detecting or quantifying human STS in a sample using the antibody or antibody fragment of any one of (1) to (5) A method for immunological detection or immunological quantification of human STS in a specimen.
  • human STS in a sample is immunologically detected or quantified, and a human STS-related disease is detected from the detection or quantification result.
  • human STS in a specimen is immunologically detected or quantified, and a human STS-related disease is detected from the detection or quantification result.
  • a method for immunological detection or immunological quantification of human STS for determining the pathological condition of a human is a method for immunological detection or immunological quantification of human STS for determining the pathological condition of a human.
  • a reagent or kit for immunological detection of human STS in a specimen characterized in that it comprises the antibody or antibody fragment according to any one of (1) to (5).
  • a reagent or kit for immunological quantification of human STS in a specimen characterized in that it comprises the antibody or antibody fragment according to any one of (1) to (5).
  • a reagent or kit for determining a human STS-related disease comprising the antibody or antibody fragment according to any one of (1) to (5).
  • a reagent or kit for drug selection suitable for treatment of human STS-related diseases characterized by comprising any one of (1) to (5).
  • Human STS-related disease is an estrogen-dependent disease involving human STS (29) A reagent or kit according to 1.
  • a reagent or kit for determining a disease state of a human STS-related disease comprising the antibody or antibody fragment according to any one of (1) to (5).
  • a diagnostic agent for human STS-related diseases comprising the antibody or antibody fragment according to any one of (1) to (5).
  • a diagnostic agent for a disease state of a human STS-related disease characterized by comprising any one of (1) to (5).
  • the method according to (42), wherein the human STS-related disease is an estrogen-dependent disease involving human STS.
  • the estrogen-dependent disease involving human STS is a disease selected from a malignant tumor, a benign tumor, and a skin disease.
  • the hyperpridoma according to (6) or (7) is cultured in a medium, and the monoclonal antibody or antibody fragment according to any one of (3) to (5) is produced and accumulated in the culture.
  • FIG. 1 shows a Coomassie brilliant-stained image of SDS-polyacrylamide electrophoresis of human STS, which also purified human placental force used as an antigen.
  • the left lane shows human STS with purified human placental force, and the right lane shows molecular weight markers. Purified human STS is indicated by an arrow
  • FIG. 2 shows the reactivity of monoclonal antibodies to human placenta-derived purified human STS in a binding ELISA.
  • the left and right columns show the reactivity with anti-human STS monoclonal antibody KM1049 and anti-human STS monoclonal antibody KM1053, respectively.
  • the vertical axis shows the absorbance at 415 nm.
  • the black columns show the results when human STS purified from human placenta as an antigen, and the white columns show the results when BSA is immobilized.
  • FIG. 3 shows the reactivity of anti-human STS monoclonal antibody KM1049 and anti-human STS monoclonal antibody KM1053 in Western blotting with purified human STS derived from human placenta and human STS expressing E. coli. Indicated. Lane 1 shows human STS expressed in E. coli, and lane 2 shows purified human STS derived from human placenta.
  • FIG. 4 shows the ARS activity of human STS gene-introduced cells.
  • the vertical axis shows the enzyme activity per unit protein mass.
  • CDNA3-1 indicates the activity of a control cell into which a plasmid containing no human STS gene is introduced, and cs3-l indicates the activity of a cell into which a human STS gene is introduced.
  • FIG. 5 shows the reactivity of the monoclonal antibody by immunoprecipitation with human STS derived from cs3-l cells into which human STS gene has been introduced.
  • Lane 1 shows the result of immunoprecipitation with the negative control monoclonal antibody KM1063, Lane 2 with the anti-human STS monoclonal antibody KM1053, and Lane 3 with the anti-human STS monoclonal antibody KM1049.
  • FIG. 6 shows the reactivity of monoclonal antibodies and human STS gene-introduced cells by immunocytostaining (flow cytometry).
  • the white chromatogram shows the results when using the monoclonal antibody KM1063 as a negative control
  • the black chromatogram shows the results when using the anti-human STS monoclonal antibody KM1053.
  • A shows the result in the control cell CDNA3-1 cell into which the plasmid was introduced
  • B contains the human STS gene
  • B shows the result in the cell cs3-l cell into which the human STS gene was introduced.
  • FIG. 7 shows the ARS activity of various ARS gene-introduced cells.
  • the vertical axis is Shows ARS activity per cell.
  • the ARS activity of the cells is shown by introducing the negative control various ARS genes, and the right column shows the ARS activity of the cells introduced by the various ARS genes.
  • a ⁇ is ARS A transgenic cell, B ⁇ is ARS B transgenic cell, C ⁇ is ARS D transgenic cell, D ⁇ is ARS E transgenic cell, E is ARS F The result of a transgenic cell is shown.
  • FIG. 8 shows the reactivity of monoclonal antibody KM1049 with ARS derived from various ARS gene-introduced cells in Western blotting.
  • Lane 1 shows ARS A
  • Lane 2 shows ARS B
  • Lane 3 and ARS C Lane 4 and ARS D
  • Lane 5 and ARS E Lane 6 and ARS F, respectively.
  • FIG. 9 shows the reactivity of the anti-human STS monoclonal antibody KM1053 with various ARS gene-introduced human STSs in immunoprecipitation.
  • Lane 1 is ARS A
  • Lane 2 is ARS B
  • Lane 3 is ARS C
  • Lane 4 is ARS D
  • Lane 5 is ARS E
  • Lane 6 is ARS F.
  • FIG. 10 shows the reactivity of anti-human STS monoclonal antibody KM1049 and anti-human STS monoclonal antibody KM1053 with various ARSs in binding ELISA.
  • A shows the results using anti-human STS monoclonal antibody KM1049
  • B shows the results using anti-human STS monoclonal antibody KM1053.
  • the vertical axis indicates the absorbance at 415 °
  • the horizontal axis indicates the antibody concentration.
  • ⁇ indicates animal cell expression purified ARS C
  • broken line ⁇ indicates ARS A
  • country indicates ARS B.
  • FIG. 11 shows a calibration curve of purified animal cell-derived human ST S by sandwich ELISA using anti-human STS monoclonal antibody KM1053 and piotinized anti-human STS monoclonal antibody KM1049.
  • the horizontal axis represents protein concentration, and the vertical axis represents 415 absorbance.
  • ⁇ indicates animal cell expression purified human STS, and broken line ⁇ indicates recombinant purified IL-1 ⁇ which is a negative control.
  • the present invention relates to an antibody that specifically binds to human STS and does not bind to ARS other than human STS.
  • ARS other than human STS examples include ARS A, B, D, E and F.
  • Human of the present invention examples of antibodies that specifically bind to STS but do not bind to ARS other than human STS include antibodies that specifically bind to human STS (AR SC) and do not bind to A, B, D, E, and F of ARS. Can be raised.
  • Examples of the antibody of the present invention include polyclonal antibodies and monoclonal antibodies, and preferably include monoclonal antibodies.
  • polyclonal antibodies include antisera from immunized animals or polyclonal antibodies purified from the antisera.
  • the polyclonal antibody of the present invention includes any antibody that specifically binds to human STS and does not exhibit cross-reactivity with ARS other than STS.
  • a human STS was immunized with the animal's sera, and the animal's serum was collected, and the fractions reactive to ARS A, B, D, E, and F, which are ARS other than human STS, were removed.
  • polyclonal antibodies prepared by known affinity purification methods examples of mammals other than humans include mouse, rat, nomstar, guinea pig, rabbit, goat, horse, mouse, sheep, goat, pig, and chicken.
  • Monoclonal antibodies may include antibodies or antibody fragments produced by wild or hybridoma, or recombinant antibodies or antibody fragments produced by a transformant transformed with an expression vector containing an antibody gene. .
  • Hypridoma cell line KM1053 As a specific example of the monoclonal antibody of the present invention, anti-human STS monoclonal antibody KM1053 produced by Hypridoma cell line KM1053 can be mentioned.
  • Hypridoma cell line KM1053 was established on April 27, 2004 in accordance with the Budapest Treaty. National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Patent Biological Deposit Center (Tsukuba Nadahigashi, 1-chome, 1-chome, Ibaraki, Japan) Deposited as BP-10015.
  • the monoclonal antibody of the present invention includes the above-described hyperidoma cell line KM1053.
  • monoclonal antibodies that bind to the same epitope to which the monoclonal antibody produced by (FERM BP-10015) binds.
  • a gene recombinant antibody is obtained by modifying the above-described monoclonal antibody of the present invention using gene recombination technology.
  • the recombinant antibody include human chimeric antibodies, humanized antibodies, human antibodies or antibody fragments such as antibodies produced by genetic recombination.
  • the recombinant antibody of the present invention include antibodies that retain the characteristics of a monoclonal antibody in the recombinant antibody.
  • the human chimeric antibody is an antibody heavy chain (hereinafter referred to as H chain) V region (hereinafter, antibody heavy chain variable region is referred to as VH) of an antibody of a non-human animal, and an antibody light chain.
  • V region hereinafter referred to as L chain
  • V region hereinafter referred to as antibody variable region light chain VL
  • CH human antibody heavy chain constant region
  • CH human antibody light chain constant region
  • the human chimeric antibody of the present invention obtains cDNA encoding VH and VL from the hyperprideoma producing the monoclonal antibody of the present invention, and has genes encoding human antibody CH and human antibody CL.
  • a human chimeric antibody expression vector inserted into an animal cell expression vector can be constructed and introduced into animal cells for expression and production.
  • the structure of the human chimeric antibody of the present invention may belong to any immunoglobulin (Ig) class, but it may be an IgG type, or an IgGl, IgG2, IgG3, or IgG4 immunoglobulin belonging to the IgG type. C region is preferred.
  • the humanized antibody is also called a human complementarity determining region (hereinafter referred to as CDR) transplanted antibody or a reshaped antibody.
  • CDR human complementarity determining region
  • the humanized antibody was constructed by constructing a gene encoding the V region obtained by substituting the VH and VL CDR sequences of any human antibody with the VH and VL CDR sequences of the monoclonal antibody of the present invention. It can be produced from cocoons by introducing it into an expression vector for animal cells having a gene encoding CL of human antibody and expressing it.
  • the structure of the C region of the humanized antibody of the present invention may be V, or may belong to the immortal immunoglobulin (Ig) class, but may be an IgG type, or an IgGl, IgG2, IgG3,
  • the immunoglobulin C region, such as IgG4, is preferred.
  • a human antibody originally means an antibody naturally present in the human body, but a human antibody phage library produced by recent advances in genetic, cell engineering, and developmental technology, and a human antibody Includes production of transgenic animal strength antibodies
  • Antibodies present in the human body for example, isolated human peripheral blood lymphocytes that produce human antibodies
  • the lymphocytes that produce the antibody can be cultured as antibody-regenerating cells by immortalizing and single-cloning by infecting with EB virus or the like, and the antibody can be purified from the culture. Can do.
  • the human antibody phage library is a library in which antibody fragments prepared from human antibody-producing cells such as B cells or lymphocytes are inserted into phage vectors to express antibody fragments such as Fab and scFv on the phage surface. I mean. From the library, phages expressing antibody fragments having a desired antigen-binding activity can be recovered using the binding activity to the substrate on which the antigen is immobilized as an index. The antibody fragment can be further converted into a human antibody molecule having two complete heavy chains and two complete light chains using genetic engineering techniques.
  • a human antibody-producing transgenic animal means an animal in which a human antibody gene is integrated in the genome.
  • a human antibody-producing transgenic animal can be created by introducing a human antibody gene into a mouse ES cell, transplanting the ES cell to another mouse early embryo, and generating it.
  • Human antibody-producing transgenic animal-powered human antibodies can be produced from the culture by obtaining and culturing human antibody-producing hyperpridoma using conventional methods for producing hyperidoma in mammals other than humans. The antibody can be purified.
  • Examples of the antibody fragment of the present invention include an antibody fragment obtained by digesting an antibody with an appropriate peptidase or an antibody fragment produced by gene recombination.
  • Antibody fragments include Fab (Fragment of antigen binding, Fab, F, ab 2, single chain antibody (hereinafter referred to as scFv) [Science, 242, 423 (1988)], dimer Variable region (also called Diabody) [Natur e BiotechnoL, 15, 629 (1997)], and disulfide stabilized V region fragment (hereinafter referred to as dsFv) [Molecular Immunol, 32, 249 (1995)
  • peptides containing the amino acid sequences of CDRs of the above VH and VL hereinafter referred to as peptides containing CDRs
  • Fab is an N-terminal half of the H chain obtained by cleaving the peptide part at the top of the two disulfide bonds that bridge the two H chains at the hinge region of IgG with the enzyme papain, and the L chain. It is an antibody fragment having an antigen binding activity with a molecular weight of about 30,000 composed of the whole.
  • the Fab of the present invention can be obtained by treating the monoclonal antibody of the present invention with the enzyme nopain.
  • a Fab is produced by inserting a DNA encoding the Fab fragment of the antibody into a prokaryotic expression vector or a eukaryotic expression vector, and expressing the vector by introducing the vector into a prokaryotic or eukaryotic organism. Can do.
  • Fab ' is an antibody fragment having an antigen binding activity of about 50,000 molecular weight obtained by cleaving the disulfide bond between the hinges of F (ab') 2 described below.
  • the Fa of the present invention can be obtained by treating the monoclonal antibody F (a) 2 of the present invention with a reducing agent dithiothreitol.
  • a DNA encoding the Fa fragment of the antibody is inserted into a prokaryotic expression vector or a eukaryotic expression vector, and the vector is expressed by introducing it into a prokaryotic or eukaryotic organism to produce Fab ′.
  • F (ab ') 2 is obtained by treating the lower part of two pairs of disulfide bonds in the hinge region of IgG with the enzyme trypsin. It is an antibody fragment having the antigen binding activity.
  • F (ab ′) 2 of the present invention can be obtained by treating the monoclonal antibody of the present invention with a reducing agent dithiothreitol. Alternatively, by inserting the DNA encoding the F (ab ′) 2 fragment of the antibody into a prokaryotic expression vector or eukaryotic expression vector, and introducing the vector into a eukaryotic organism. It can be expressed to produce F (ab ′) 2.
  • scFv is a VH-P-VL or VL-P-VH polypeptide in which one VH and one VL are linked using an appropriate peptide linker (hereinafter referred to as P). Indicated.
  • P peptide linker
  • the scFV of the present invention obtains cDNA of VH and VL from the monoclonal antibody of the present invention, inserts the DNA encoding the scFv fragment of the antibody into a prokaryotic expression vector or eukaryotic expression vector, Can be expressed by introducing it into prokaryotes or eukaryotes to produce scFv.
  • Diabody is an antibody fragment in which scFv with the same or different antigen-binding specificity forms a dimer, an antibody having a bivalent antigen-binding activity against the same antigen or a bispecific antigen-binding activity against different antigens It is a fragment.
  • the diabody of the present invention obtains cDNA of VH and VL from the monoclonal antibody of the present invention, inserts the DNA encoding the diabody fragment of the antibody into a prokaryotic expression vector, or inserts the DNA into a eukaryotic expression vector. Can be expressed by introducing it into prokaryotes or eukaryotes to produce diabody.
  • dsFv is obtained by binding a polypeptide in which one amino acid residue in each of VH and VL is replaced with a cysteine residue by a disulfide bond.
  • the amino acid residue to be substituted with the cysteine residue can be selected based on the three-dimensional structure prediction of the antibody according to the method shown by Reiter et al. [Protein Engineering, 7, 697 (1994)]. Any of the monoclonal antibodies of the present invention can be used as VH and VL contained in the dsFv of the present invention.
  • dsFv of the present invention cDNA of VH and VL is obtained from the monoclonal antibody of the present invention, and a DNA encoding the dsFv fragment of the antibody is inserted into a prokaryotic expression vector or a eukaryotic expression vector.
  • the dsFv can be produced by expressing the vector by introducing it into a prokaryotic or eukaryotic organism.
  • the peptide containing CDR is composed of at least one region of CDR of VH or VL.
  • a peptide containing a plurality of CDRs can be produced by binding directly or via an appropriate peptide linker.
  • the VH molecule and VL molecule were synthesized from mRNA prepared from the hybridoma producing the monoclonal antibody of the present invention, and the gene fragment containing VH or VL was cloned by a method such as PCR. It can be produced by expressing in an appropriate combination of expression vector and host. In order to obtain a molecule due to its affinity with the human STS molecule, it can be said that the expression vector is a phage expression vector and the host is E. coli. It is expressed by expressing and producing a VH molecule and a VL molecule as a fusion protein with a desired protein.
  • Peptides containing the CDR of the present invention are obtained from the monoclonal antibody of the present invention from VH and V Expression is obtained by obtaining cDNA from L, inserting DNA encoding the peptide containing the CDR of the antibody into a prokaryotic expression vector or eukaryotic expression vector, and introducing the vector into prokaryotic or eukaryotic organisms.
  • a peptide containing CDR can be produced.
  • a peptide containing CDR can also be produced by a chemical synthesis method such as Fmoc method (fluoromethyloxycarbol method) or tBoc method (t_ptyoxycarboxyl method).
  • the monoclonal antibody or antibody fragment of the present invention comprises a derivative of an antibody in which a radioisotope, protein, drug, or the like is introduced or bound to the antibody or antibody fragment either chemically or genetically. Include.
  • the derivative of the antibody of the present invention includes the N chain side or the C terminal side of the H chain or L chain of the monoclonal antibody or antibody fragment of the present invention, and further appropriate substituents or side chains in the antibody or antibody fragment. Furthermore, it can be produced by chemically binding a radioisotope, protein, or drug to a sugar chain in an antibody or antibody fragment [Introduction to antibody engineering, Osamu Kimemitsu, Jinjinshokan Co., Ltd. (1994)].
  • the DNA encoding the anti-human STS antibody or antibody fragment and the DNA linked to the protein encoding the ligated DNA are inserted into a prokaryotic expression vector or eukaryotic expression vector, and the vector is inserted. It can be expressed and genetically engineered by introduction into prokaryotic or eukaryotic organisms.
  • the drug may be any substance such as a radioisotope, protein, or small molecule.
  • Examples of the drug when the derivative of the antibody of the present invention is used as a detection method, a quantification method, a detection reagent, a quantification reagent or a diagnostic agent include labels used in usual immunoassay methods.
  • Labels include radioisotopes, enzymes such as alkaline phosphatase, peroxidase and luciferase, luminescent substances such as attalidum esters, mouth fins, fluorescein isothiocyanate (FITC), rhodamine isothiocyanate (HRIT C), etc. And fluorescent materials.
  • substances such as piotin can be used as a label as a drug.
  • the substance is bound with a radioactive isotope, an enzyme such as alkaline phosphatase, peroxidase, or luciferase, a luminescent substance such as ataridum ester or loffin, or a fluorescent substance such as FITC or RITC, such as avidin.
  • a radioactive isotope an enzyme such as alkaline phosphatase, peroxidase, or luciferase, a luminescent substance such as ataridum ester or loffin, or a fluorescent substance such as FITC or RITC, such as avidin.
  • Secondary labeling substances that can bind to the substance with specific and high affinity can be used It is a substance to be damped.
  • the present invention also relates to an immunological detection method or immunological quantification method for human STS in a specimen using the antibody or antibody fragment of the present invention described above.
  • Immunological detection methods or immunological quantification methods include fluorescent antibody methods, immunoenzyme antibody methods (ELISA), immunological assay methods such as radioactive substance-labeled immunoantibody method (RIA), immune cell staining methods, immunological methods.
  • Immunochemical staining methods such as tissue staining method, Western blotting method, dot blotting method, immunoprecipitation method [Monoclonal antibody experiment manual, Kodansha Scientific (1987), secondary biochemistry experiment course 5 Immunobiochemical research method, Tokyo Chemical Doujin (1986)].
  • Examples of the immunological measurement method include any known immunological measurement method.
  • immunoassays depend on the labeling method, depending on the radioimmunoassay (RIA), enzyme immunoassay (EIA or ELISA), fluorescence immunoassay (FIA), luminescence immunoassay (luminescent) immunoassay), physicochemical detection methods (TIA, LAPIA, PCIA) and the like, preferably enzyme immunoassay methods.
  • RIA radioimmunoassay
  • EIA or ELISA enzyme immunoassay
  • FIA fluorescence immunoassay
  • FIA fluorescence immunoassay
  • luminescence immunoassay luminescence immunoassay
  • physicochemical detection methods TIA, LAPIA, PCIA
  • enzyme immunoassay methods preferably enzyme immunoassay methods.
  • any known enzyme edited by Yuji Ishikawa et al., Enzyme Immunoassay, Medical School
  • any known enzyme edited by Yuji Ishikawa et al., Enzyme Immunoassay, Medical School
  • alkaline phosphatase, peroxidase, luciferase and the like can be used.
  • any known luminescent substance [Imai Kazuhiro, Bioluminescence and Chemiluminescence, Yodogawa Shoten; Clinical Laboratory 42 (1998)] can be used.
  • ataridium and its derivatives, ruthenium complex compounds, mouth fins and the like can be used.
  • ruthenium complex compound for example, those described in Clin. Chem. 37, 1534 (1991) are preferable.
  • the compound emits electrochemically with an electron donor
  • any known fluorescent material (Akira Kawao, fluorescent antibody method, manufactured by Soft Science) can be used.
  • FITC, RITC, etc. can be used.
  • other fluorescent materials include quantum dot [Science, 281, 2016 (1998)].
  • a phycopyriprotein such as phycoerythrin, GFP (Green fluorescent Protein)! / ⁇ may be a fluorescent protein such as its related protein.
  • the immunological measurement method is a method of measuring the amount of antibody or the amount of antigen using the above-described various labeled antigens or antibodies.
  • the immunological assay of the present invention may be any method as long as it is a method for detecting or measuring an antigen.
  • the competitive method and the sandwich method [Immunology Illustrated 5th edition, Nankodo] are mentioned, but the sandwich method is preferable.
  • the sandwich method is a method in which a first antibody is bound to a solid phase, an antigen to be measured is trapped, and a labeled second antibody is reacted.
  • an antibody to be used in the sandwich method antibody fragments such as Fab, Fab ′, and F (ab) 2 described above, which may be either polyclonal antibodies or monoclonal antibodies, may be used.
  • the combination of the two types of antibodies used in the sandwich method may be a combination of antibodies or antibody fragments that recognize different epitopes! /, Or a combination of polyclonal and monoclonal antibodies or antibody fragments.
  • Specific examples include a combination of anti-human STS monoclonal antibody KM1053, which is an example of the monoclonal antibody of the present invention, and known anti-human STS monoclonal antibody KM104 9 [Cancer Research, 63, 2762 (2003)].
  • the fluorescent antibody method is a method in which a sample considered to contain human STS is reacted with the antibody or antibody fragment of the present invention and further labeled with a fluorescent substance such as FITC, or an anti-mouse immunoglobulin (Ig) antibody or Immunoglobulin G (IgG) antibody! / ⁇ is a method in which fluorescent fragments are measured by flow cytometry or fluorescence microscope after reacting antibody fragments.
  • a derivative in which the antibody or antibody fragment of the present invention is directly labeled with a fluorescent substance can also be used.
  • a derivative labeled with the antibody or antibody fragment with piotin or the like is reacted and then or At the same time, after reacting a secondary labeling substance labeled with a fluorescent substance, the fluorescent dye may be measured by flow cytometry or a fluorescence microscope.
  • a luminescent substance such as an atelidum ester or a mouth fin instead of the fluorescent substance.
  • a luminescence measuring instrument can be used as the measuring instrument.
  • the immunoenzyme antibody method is to react a sample considered to contain human STS with the antibody or antibody fragment of the present invention, and further with an anti-mouse Ig antibody or IgG antibody or antibody fragment to which an enzyme label such as peroxidase is applied. After the enzyme substrate is colored as a result of the enzyme reaction If it is a substance that produces the drug substance, the dye color reaction is measured with an absorptiometer. In this method, a derivative obtained by directly labeling the antibody or antibody fragment of the present invention with an enzyme can be used, and a derivative labeled with the antibody or antibody fragment is reacted with piotin or the like, and then or simultaneously. A method of measuring a dye color reaction with an absorptiometer after reacting with a secondary labeling substance labeled with an enzyme may be used.
  • the luminescence can also be measured with a luminescence measuring device.
  • the compound exhibiting chemiluminescence by an enzyme include peroxidase substrates such as luminol compounds and lucigen compounds. Or as a substrate for alkaline phosphatase, for example, 3-(2 — aaamantyl) — 4— methoxy— 4— (3 '-phosphoryloxy) pheny ⁇ 1,2— dioxetane, a phosphate derivative of agridi-um APS2, APS3, APS5, etc. [Lumigen Inc. Luminescent Compound, H.
  • luciferin Alternatively, luciferin, coelenterazine and the like are listed as luciferase substrates.
  • Radioactive-labeled immunoantibody method refers to an anti-mouse Ig antibody or a radiolabeled anti-mouse Ig antibody or antibody fragment reacted with a specimen considered to contain human STS.
  • IgG antibody is a method in which antibody fragments are reacted and then measured with a scintillation counter or the like.
  • a derivative obtained by directly labeling the antibody or antibody fragment of the present invention with a radioactive substance can be used, and the derivative labeled with the antibody or antibody fragment is reacted with piotin or the like, and then or simultaneously.
  • a method may be used in which a secondary labeling substance labeled with a radioactive substance is reacted and then measured with a scintillation counter or the like.
  • the immunochemical staining method includes human STS or a microorganism or animal cell expressing human STS! /, Or an insect cell reacted with the antibody of the present invention, and further, a fluorescent substance such as FITC, peroxidase, or piotin.
  • the antibody of the present invention to which an enzyme label such as the above is applied is a method in which an antibody fragment is reacted and then observed using a microscope or flow cytometry.
  • the immune cell staining method can be used to detect the antibody of the present invention or cultured cells derived from force-collected cells or microbes such as human or animal living tissues, human or animal or insects, and the like. Is a method for analyzing the expression of human STS after binding antibody fragments and using techniques such as flow cytometry to analyze the amount or state of antibody binding in a single cell.
  • the immune cell staining method the above-mentioned cells are directly fixed on a slide glass or cultured on a slide glass, and then the antibody or antibody fragment of the present invention is reacted, and then the expression of human STS contained in the cells is observed with a microscope. Alternatively, a method of observing or quantifying using a camera or the like is also included.
  • a clot is prepared with agarose or the like, and then the clot is frozen or wrapped in paraffin. It is a method of burying, slicing the tissue piece into sections, fixing the sections to glass or other glass slides, and observing or quantifying the expression of human STS using a microscope or a camera by the same procedure as above.
  • a tissue piece collected from a human or animal body tissue is fixed or fixed with a fixative such as formalin or ethanol, and the tissue piece is fixed.
  • a fixative such as formalin or ethanol
  • Frozen or embedded in paraffin prepared a tissue section from the tissue piece, fixed the tissue section on a glass slide such as glass, removed unwanted substances such as deparaffin, and further with antigen as needed
  • the expression of human STS contained in the tissue section is observed or quantified using a microscope or a camera. is there.
  • an immunostaining method using a fluorescent substance, a luminescent substance, an enzyme, and a radioactive substance-labeled antibody is possible, and the above-described immunological measurement method suitable for each label and Detection or measurement can be performed by a similar procedure.
  • Western blotting refers to human STS or cell extracts of human STS-expressing microorganisms, animal cells, or insect cells.
  • SDS-polyacrylamide gel electrophoresis [Antioodies-A Laboratory Manual, Cold bpnng Haroor Laboratory ( 1988)]
  • the fractionated protein group is blotted onto a PVDF membrane or a -trocellulose membrane by Gelka et al.
  • the antibody or antibody fragment of the present invention is allowed to react with the membrane.
  • This is a method for confirming after reacting a secondary antibody antibody or antibody fragment that is capable of binding to the antibody of the present invention, which is labeled with an enzyme such as a fluorescent substance, peroxidase, or piotin.
  • the dot blotting method refers to human STS or microorganisms or animal cells expressing human STS.
  • a cell extract of insect cells is blotted onto a trocellulose membrane, and the antibody of the present invention is reacted with the membrane, followed by enzyme labeling such as a fluorescent substance such as FITC, peroxidase, biotin, etc. This is a method of confirming after reacting a secondary antibody antibody or antibody fragment capable of binding to the antibody of the invention.
  • the immunoprecipitation method is a method in which a human STS or a cell extract of a microorganism, animal cell, or insect cell expressing human STS is reacted with the antibody or antibody fragment of the present invention, followed by protein G-sepharose or the like. This is a method of precipitating an antigen-antibody complex by covering a carrier having a specific binding ability to munoglobulin.
  • the antibody of the present invention can be prepared, for example, as follows.
  • An expression vector containing cDNA encoding human STS is introduced into Escherichia coli, yeast, insect cells, animal cells, etc. to obtain recombinant human STS.
  • a fusion protein in which a tag protein is fused to the C-terminus or N-terminus of a recombinant protein that is an immunogen can also be used as an immunogen.
  • the term “tag protein” means that the target protein is excessively added to the end of the desired protein for the purpose of easily separating the protein by affinity purification or for tracking the behavior of the target protein. A protein to be added.
  • tag proteins examples include dartathione-S-transferase (GST), protein A, j8-galactosidase, maltose-binding protein (MBP), and the like.
  • GST dartathione-S-transferase
  • MBP maltose-binding protein
  • human STS can be purified from human thread and tissue expressing a large amount of STS such as placenta and used as an antigen.
  • a synthetic peptide having a human STS partial sequence can also be used as an antigen.
  • human STS is purified from human placental tissue as follows. All operations are performed at 4 ° C.
  • placental tissue homogenate is prepared in buffer A [0.25 mmol / L saccharose, 5 mmol / L EDTA, 10 mmol / L Tris-acetate buffer (pHLO)] after shredding.
  • buffer A 0.5 mmol / L saccharose, 5 mmol / L EDTA, 10 mmol / L Tris-acetate buffer (pHLO)
  • the obtained microsomal fraction is buffer B [lmmol / L LOmmol / L Tris-HCl buffer (pH7.) Containing EDTA, lmmol / L Dithioerythreitol (DTE), 0.05% phenylmethansulfonylfluoride (PMSF), 0.5% Triton X-100 5)] is added and stirred at room temperature for 1 hour to dissolve. Centrifuge at 105000 Xg for 1 hour to remove insoluble fraction.
  • the obtained supernatant was passed through a PBE94 column equilibrated with Buffer B (pH 8.0), washed with 2 volumes of the same buffer, and then Coffer C [lmmol / L EDTA, lmmol / L DTE , 0.05% PMSF, 0.5% Triton X- 100, eluting with 12. 5% polybuffer 7 4 (pH4.0 )]. Further, the eluted fraction was passed through a phase-sepharose column equilibrated with buffer B, washed with a sufficient amount of the same buffer, and then eluted with the same stopper to which 1.25% Triton X-100 was added. Used as purified human STS.
  • the human STS obtained in this manner can be used as a standard substance in the detection method or quantification method of human STS, in addition to being used as an antigen when preparing the following antibody-producing cells.
  • Immunization involves administering the antigen subcutaneously, intravenously, or intraperitoneally with an appropriate adjuvant (for example, complete Freund's Adjuvant, aluminum hydroxide gel and pertussis vaccine).
  • an appropriate adjuvant for example, complete Freund's Adjuvant, aluminum hydroxide gel and pertussis vaccine.
  • an appropriate adjuvant for example, complete Freund's Adjuvant, aluminum hydroxide gel and pertussis vaccine.
  • an appropriate adjuvant for example, complete Freund's Adjuvant, aluminum hydroxide gel and pertussis vaccine.
  • a carrier protein such as ushi serum albumin (hereinafter abbreviated as BSA) or keyhole Limpet hemocyanin (hereinafter abbreviated as KLH) and a conjugate are used. Made and used as an immunogen.
  • BSA ushi serum albumin
  • KLH keyhole Limpet hemocyanin
  • the antigen is administered 5 to 10 times every 1 to 2 weeks after the first administration. Three to seven days after each administration, blood is collected from the fundus venous plexus, and the serum reacts with the antigen (Anti bodies-A Laboratory Manual, Cold bpnng Haroor Laboratory (1988))
  • the source of antibody-producing cells is a mouse, rat or hamster whose serum shows a sufficient antibody titer against the antigen used for immunization.
  • the spleen is removed from the immunized mouse, rat or hamster 3 to 7 days after the final administration of the antigen, and the spleen cells are collected. To take. The spleen is shredded in MEM medium (Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.), loosened with tweezers, centrifuged (1200 rpm, 5 minutes), the supernatant was discarded, and Tris monosalt-ammum buffer ( Treat with pH7.65) for 1-2 minutes to remove erythrocytes, wash 3 times with MEM medium, and provide as antibody-producing cells.
  • myeloma cells cell lines obtained from mice are used.
  • myeloma cell line P3- X63Ag8- Ul (P3- Ul) myeloma cell line P3- X63Ag8- Ul (P3- Ul) [Current Topics in Microbiology and Immunology, 18, 1 (1978)], P3- NSl / 1 — Ag41 (NS— 1) [Eur opean J. Immunology, 6, 511 (1976)], SP2 / 0-Agl4 (SP-2) [Nature, 276, 269 (19 78)], P3— X63— Ag8653 ( 653) [J.
  • This mouse force also collected ascites, centrifuged (3000 rpm, 5 minutes) to remove the solids, salted out with 40-50% ammonium sulfate, force pruric acid precipitation method, DEAE-Sepharose column, Purify using a protein A-column or gel filtration column to obtain IgG or IgM fractions to obtain purified monoclonal antibodies.
  • the subclass of the antibody is determined by enzyme immunoassay using a sub-clustering kit.
  • the amount of protein is quantified based on the Raleigh method or absorbance at 280 hours.
  • antigen purified recombinant human STS, purified human STS or a human STS partial peptide that has obtained strength such as human placenta is used.
  • the antigen is a partial peptide
  • a conjugate with a carrier protein such as BSA or KLH is prepared and used.
  • BSA-PBS PBS solution containing 1% BSA
  • Hypidoma culture supernatant of monoclonal antibody or purified antibody 1 ⁇ Dispense 10 ⁇ g / mL in 20-100 ⁇ L / well and leave at room temperature for 2-3 hours or at 4 ° C. After washing thoroughly with PBS or PBS containing 0.05% Tween 20 (hereinafter referred to as Tween-PBS), the antibody was labeled with piotin, enzyme, chemiluminescent substance, or radioactive compound.
  • the antibody of the present invention can detect or quantify microorganisms, animal cells, insect cells, and the like expressing human STS or human STS contained in a specimen by using an immunological technique.
  • an immunological technique any known immunological measurement method or the like is used.
  • the immunological measurement method of the present invention include western blotting, immunoprecipitation, immunocytostaining, immunohistochemical staining, A sandwich ELISA method or the like is preferably used.
  • specimens examples include human-derived biological samples, microorganisms considered to express human STS, cells or tissues derived from animals, insects, and the like, and human-derived biological samples are preferable.
  • biological samples derived from humans include biological samples collected from human individuals suspected of suffering from diseases related to human STS.
  • biological samples include tissues or cells at the disease site, or tissues or cells that are released from the disease site and contained in body fluids such as blood, lymph, peritoneal fluid, milk, eclampsia, urine, and sweat. Is done. further
  • the body fluid containing STS released from the tissue or cells is also included.
  • Biological samples also include cultured human tumor cells, tissues or cells collected from human individuals suspected of suffering from diseases associated with human STS, and extracts prepared from these tissues or cells. Is done.
  • a sample obtained by processing a biological sample collected from these human individuals may also be used as the biological sample. Examples of processing include dilution, concentration, extraction, and pathological section preparation. Examples of the treatment in the preparation of a pathological section include a series of treatments such as formalin fixation, excision, embedding, slicing, and extension.
  • the tissue or cell collection method includes fine needle aspiration cytology and needle biopsy (mammotome).
  • Surgical biopsy Surgical biopsy, papillary fluid cytology (milk cytology), cell collection with a duct endoscope, etc. can give.
  • liquid fractions such as plasma or serum and solid fractions such as cells are separated by centrifugation or filtering. It is desirable to use it afterwards.
  • the fractionated liquid fraction and solid fraction can be used as a biological sample.
  • the tissue or cells are preferably collected directly from the disease site, but even a biological sample free from disease site can be used as the specimen of the present invention.
  • the disease site may be a primary lesion or a metastatic lesion.
  • a method for preparing an extract from the above tissues or cells a method in which collected tissues or cells are vigorously stirred together with a liquid, a method in which a cell membrane is destroyed with acid or alkali, a cell membrane in a surfactant is used.
  • Examples include a method of destroying tissue or cells and obtaining a cytoplasm by a method of disrupting cells, a method of disrupting with ultrasound, a method of disrupting cells with a hypotonic solution, a method of repeatedly freezing and thawing.
  • Detection of human STS by Western blotting using the antibody of the present invention can be carried out as follows.
  • culture supernatant of hyperidoma producing monoclonal antibody of the present invention or purified monoclonal antibody of 1-10 / zg / mL of the present invention is allowed to react at room temperature for 2 hours or at 4 ° C. .
  • the secondary antibody is piotin, enzyme, chemiluminescent substance or radiation compound. 1 to 50 g / mL of anti-immunoglobulin antibody labeled with the above is allowed to react at room temperature for 1 to 2 hours.
  • a reaction corresponding to the labeling substance of the second antibody is performed, and a protein with a molecular weight predicted from the amino acid sequence of human STS is bound to an antibody that specifically binds to human STS and does not bind to ARS other than STS. Confirm that it does not react with antigens that do not contain human STS and ARS other than STS.
  • Immunoprecipitation using the antibody of the present invention can be performed by the following method.
  • the antibody of the present invention (1 to 10 ⁇ g / reaction) is added to the sample prepared as described above, and reacted at 4 ° C for 1 hour. Further, 5 to 20 L of a carrier having a specific binding ability to immunoglopurin such as protein G-sepharose is added thereto, followed by reaction at 4 ° C for 1 hour, followed by centrifugation to obtain a precipitate fraction. The precipitate fraction is washed several times with a cell extraction buffer and then subjected to Western blotting as an exudate.
  • a carrier having a specific binding ability to immunoglopurin such as protein G-sepharose
  • the antibody of the present invention is immobilized on a 96-well plate for ELISA and then blocked with BSA-PBS. If the antibody is the culture supernatant of a monoclonal antibody-producing hyperpridoma, the antibody or protein A or protein G that binds to the animal immunoglobulin of the antibody-producing cells used in the preparation of the hyperidoma is used in advance for ELISA. After immobilizing in a well plate and blocking with BSA-PBS, dispense and bind the Hypridoma strain culture supernatant. Discard the BSA-PBS and wash with PBS.
  • the sample remaining in each well of the plate after thoroughly washing with cell extraction buffer or Tween-PBS is subjected to the above Western blotting to detect or quantify the immunoprecipitated human STS.
  • detection can be performed by immunocytostaining human STS as follows. Togashi.
  • the cells For various human tumor cells, wash floating cells with PBS. Adherent cells are washed with trypsin or EDTA and then washed with PBS. Cell souls collected from patients by neuropsy etc. are treated with collagenase and then washed with PBS. These cells are treated with a surfactant or methanol to improve antibody permeability. After blocking with normal human serum or the like, the cells are dispensed in 1 ⁇ 10 5 to 1 ⁇ 10 6 cell Z-tubes to produce the monoclonal antibody of the present invention, the culture supernatant of the hybridoma of the present invention, or the purified monochrome of the present invention. -React with 1 to 10; ⁇ / ⁇ ⁇ for 30 minutes at room temperature.
  • human STS can be detected or quantified by immunohistochemical staining as follows.
  • Examples of human tissue collection include a method of collecting a tissue containing a target tissue such as a diseased site obtained by surgery or biopsy.
  • the collected tissue can be used as a sample as it is.
  • a section is prepared by an appropriate method and used for the reaction with the antibody.
  • an operation such as antigen activation or endogenous substance blocking reaction may be added.
  • a method of preparing a section a method in which it is frozen in an unfixed state and a frozen section is prepared and then fixed, a method in which a frozen section is frozen after fixing and a section in which the sample is fixed and embedded in paraffin or the like and then sectioned is prepared. And the like.
  • the method of fixing after freezing and preparing a frozen section is to cut the tissue into small pieces, place in a frozen embedding medium such as OCT compound, and freeze rapidly with dry ice / acetone. After air-drying, a method is used in which a section is prepared and fixed using the following fixative. If the sections are not prepared immediately, they can be air-dried with acetone, sealed, and stored in a deep freezer as a frozen cell mass. [0090] As a method for freezing after fixation and preparing a frozen section, the tissue is minced and then fixed with the following fixative, and washed with, for example, PBS or PBS containing 10 to 20% sucrose.
  • the tissue is minced, fixed with the following fixative, dehydrated with ethanol, xylene, etc., and then paraffin embedded.
  • a method of preparing a norafine block and preparing a section with a paraffin block force is used. If sections are not prepared immediately, they can be stored as paraffin blocks.
  • Examples of the fixing method include immersion fixing, injection fixing, deaeration fixing, freeze replacement fixing, freeze drying fixing, and the like.
  • the fixing time is preferably from half a day to one week, but generally from 1 to 2 days is more preferable.
  • the fixed time can be shortened to several hours by using a microwave or a household microwave oven.
  • a method for preparing a section there is a method using a cryostat in the case of a frozen section, or a method using a microtome in the case of a paraffin section.
  • fixative examples include aldehyde-based fixatives that cause cross-linking formation in protein / peptide chains centered on aldehydes, and organic solvent-based fixatives based on protein coagulation precipitation.
  • fixatives Revised 4th edition Watanabe / Nakane Enzyme Antibody Method”, Hiroshi Nakura, Yoshiyuki Nagamura, Hiroshi Tsutsumi, edited by Interdisciplinary Planning Co., Ltd.
  • a cytospin For blood cells or microorganisms collected from human or animal biological tissues, or cultured cells such as humans or animals or insects, if they are floating cells, use a cytospin to slide glass. After the cells are pelleted by centrifugation, the clot is made, and the clot force can be prepared according to the above method.
  • the method for forming a coagulum include a method of encapsulating in agarose or a method of adding fibrinogen and then thrombin to form an artificial fibrin clot.
  • Staining of a section using the enzyme-labeled antibody method can be performed, for example, by the following method.
  • the inhibition of endogenous substance activity may be performed after the reaction of the antibody or antibody fragment of the present invention.
  • Inhibition of the activity of the endogenous substance can be carried out, for example, using the following solution under the appropriate reaction conditions for each type of solution or section used and the force that can be reacted for 5 minutes to 1 hour at room temperature. preferable.
  • Endogenous substances include substances that affect the reaction that are present in the prepared sections in immunohistochemical staining. Specific examples include endogenous peroxidase, endogenous alkaline phosphatase, and endogenous piotin.
  • the cleaning solution is not particularly limited as long as it can be used as a cleaning solution, but PBS, phosphate buffer, Tris-HCl buffer, or the like can be used.
  • the pH is preferably 6.5 to 7.8, more preferably 7.2 to 7.6.
  • the buffer concentration is preferably 0.2 to 0.005 mol / L, but more preferably 0.1 to 0.01 mol / L! /.
  • normal animal serum normal animal serum, BSA, skim milk, casein solution and the like are preferably used.
  • animals used for normal animal sera non-human or mouse animals that can be used by all animal species are suitable, such as eagle, hidge, rabbit, and pig.
  • normal serum normal serum of the same type as the animal species derived from the anti-mouse Ig or IgG antibody used as the secondary antibody.
  • concentration of serum at the time of use is suitably 1 to 5%, which can be arbitrarily selected within the range of 0.1 to 20%.
  • the blocking temperature can be freely set in the range of 4 ° C to 37 ° C.
  • the blocking time can be set appropriately according to the reaction temperature. At room temperature, 10 minutes to 1 hour is preferable.
  • the antibody diluent may be any antibody that can be used as a diluent, but PBS containing BSA is preferably used.
  • the concentration of BSA is preferably 0.1-5%.
  • surfactants can be added.
  • Triton X-100, Tween 20 and the like can be used as the type of surfactant to be added.
  • the concentration of the surfactant is preferably 0.005 to 0.5%, more preferably 0.01 to 0.2%.
  • the antibody concentration is 0.
  • the reaction temperature can be freely set in the range of 4 ° C to 37 ° C as long as the reactivity of the antibody does not change.
  • the reaction time can be set according to the reaction temperature.For example, when the reaction temperature is 4 ° C, the reaction time is 1 hour or more. When the reaction temperature is room temperature, the reaction time is preferably 10 minutes to 8 hours.
  • color reaction solution when peroxidase is used as a labeling enzyme, 3,3'-diamino benzidine (DAB) solution, 3-amino-9-ethylcarbazole solution and 4-clo-1-1-naphtho Can be used. It is desirable to use a DAB solution with hydrogen peroxide water added during use. Imidazole may be added as a sensitizer for color reaction using DAB solution.
  • DAB 3,3'-diamino benzidine
  • Imidazole may be added as a sensitizer for color reaction using DAB solution.
  • alkaline phosphatase When alkaline phosphatase is used as the labeling enzyme, Fast Red, Fast Red Violet or Fast Blue salts can be used as color formers, and Neufuxin solution (Merck) or BCIP / NBT solution ( (Sigma) can also be used.
  • Neufuxin solution Merck
  • BCIP / NBT solution (Sigma)
  • glucose oxidase is used as a labeling enzyme
  • a mixed solution containing glucose, phenazine methosulfate (PMS) and chromogen is used.
  • the chromogen may be any chromogen that can be reduced by PMS to produce an insoluble pigment, but for example, tetrazolium such as NBT, TNBT, BSPT, INT (all from Pierce). Salt.
  • the coloring reaction time is preferably 30 seconds to 20 minutes, more preferably 1 to 10 minutes.
  • a solution obtained by diluting the antibody or antibody fragment of the present invention that is not enzyme-labeled with the above diluent is reacted with the sample, washed with the above washing solution, etc., and then reacted with a secondary antibody that can bind to the antibody or antibody fragment of the present invention. It is also possible to carry out a color reaction after washing again.
  • the secondary antibody may be any antibody that can bind to the antibody or antibody fragment of the present invention and is labeled for detection.
  • the antibody of the present invention is a mouse monoclonal antibody, an enzyme-labeled anti-mouse Ig or IgG antibody can be used!
  • reaction conditions of the enzyme-labeled antibody or antibody fragment of the present invention and the reaction conditions of the enzyme-labeled secondary antibody capable of binding to the antibody or antibody fragment of the present invention are the same as in the reaction.
  • antigens are often hidden by aldehyde fixation, and contact between antigen and antibody may be inhibited. In this case, the staining property can be improved by the antigen activation treatment.
  • the section can be subjected to proteolytic enzyme treatment or heat treatment.
  • proteolytic enzyme can be used as long as it does not cleave at the antibody recognition site on the antigen, but limited proteases are particularly preferred, for example, trypsin, pronase, pepsin, actinase, ficin, proteinase. 1, subtilisin, papain, etc.
  • the heat treatment includes heating with a microwave irradiator, an electronic range, an autoclave, a pressure cooker, a water bath, a steamer, a hot plate, or the like in water or an arbitrary buffer.
  • the buffer used for the heat treatment include citrate buffer, EDTA solution, sodium hydroxide sodium citrate buffer, Tris-HCl buffer, borate buffer, glycine hydrochloride buffer, carbonate buffer, An acetate buffer or the like can be used.
  • the salt concentration of the buffer is 0.0005 to 0.2 mol / L, preferably 0.001 to 0.1 mol / L.
  • the buffer solution has a pH of 5.0 to 10, preferably pH 5.5 to 9.5. Further, urea aqueous solution, aluminum chloride aqueous solution, periodic acid aqueous solution and the like can also be used. The concentration of these aqueous solutions is preferably 0.1 to 7%, more preferably 1 to 5%.
  • treatment such as acid or alkali treatment can also be used.
  • NaOH, KOH, etc. are used for alkali treatment
  • hydrochloric acid, formic acid, acetic acid, etc. are used for acid treatment.
  • protein modifiers such as urea and guanidine can also be used for the antigen activation treatment.
  • High-sensitivity staining methods include PAP (peroxidase anti-peroxidase) method or its modified four-step PAP method, Double bridge PAP method, PAP method using Fab fragment, Hapten sandwich method, avidin 'piotin complex formation ABC (avidin biotinylated-peroxidase complex) method, LAB (labeled avidin— biotin) method, BRAB (bridge avidin— biotin) ) Method, LSAB (labelled strept avidin biotin) method using streptavidin ⁇ lj, SABC (streptavid in biotin complex) method, CSA (catalyzed signal amplification) method using biotin tyramid, and a variation of ABC method Method using avidin antibody, method using piotin protein A, method combining PAP method and ABC method, ABC method using colloidal gold-labeled anti-peroxidase antibody, method using enzyme-labeled protein A, enzyme-labeled polymer method,
  • the enzyme-labeled polymer method is a method that uses a polymer in which an enzyme and a primary antibody, or an enzyme and a secondary antibody are bound to a polymer such as dextran.
  • a chromogenic enzyme such as alkaline phosphatase or glucose oxidase can be used in place of peroxidase.
  • examples of such methods include avidin 'biotin complex and these chromogenic enzymes, APAAP (alkaline phosphatase-anti alkaline phosphatase) method, and indirect method using peroxidase-labeled anti-FITC antibody.
  • kits include, for example, Vector Stain Kit (manufactured by Vector), Strept AB Complex (manufactured by DAKO), AB Complex (manufactured by DAKO), SAB-PO kit (manufactured by -Chilei), S AB-AP kit (-Chilei), Super Sensitive Ready-to-Use Detection Kit (BioGene x), Polyvalant staining kit (ScyTek), EPOS system (DAKO), EnVision system (DAKO), Super Sensitive Non-Biotin HRP Ready-to-Use Detection Kit (BioGenex), Simple stain system (-Chilei), etc.
  • the LAB method and the LSAB method can be performed, for example, under the following conditions.
  • the reaction of the antibody or antibody fragment of the present invention or after blocking the activity of endogenous substances After the reaction of the antibody or antibody fragment of the present invention or after blocking the activity of endogenous substances, it is washed with a washing solution, reacted with a piotin-labeled anti-mouse Ig antibody or a piotin-labeled anti-mouse IgG antibody, and then avidin-labeled peroxidase Alternatively, react with streptavidin-labeled peroxidase.
  • the reaction conditions for the piotin-labeled anti-mouse Ig antibody or the piotin-labeled anti-mouse IgG antibody and the avidin-labeled peroxidase are the same as the reaction conditions for the above-described enzyme-labeled antibody or antibody fragment of the present invention.
  • a commercially available automatic immunostaining device or the like is used. It can also be used.
  • Automatic immunostaining devices include HIS-20 (manufactured by Sakura Seiki), i6000 (manufactured by Kyowa Medettas), ST5050 (manufactured by Leica), HX benchmark (manufactured by Ventana 'Japan), Autostainer (manufactured by DAKO), Horizon (Made by DAKO).
  • a method suitable for the labeling substance of the antibody can be used. That is, when an enzyme is selected as a labeling substance, an optical microscope, a confocal laser scanning microscope, etc. are selected. When a fluorescent substance is selected as a labeling substance, a fluorescence microscope, a confocal laser scanning microscope, a fluorescence image analysis device, etc. are selected. In the case of a radioactive substance, autoradiography, a radiation image analyzer, etc. can be used. In the case of a luminescent substance, a luminescence image analyzer, etc. can be used.
  • the image data obtained by the microscope can be processed according to the purpose, and the image data can be input as a digital signal to the image analyzer using a digital image input system such as a digital camera. can do.
  • the image analyzer can measure the area, shortest diameter, longest diameter, circumference, etc. of positive staining sites, and measure the transmittance, optical concentration, absorbance, etc. of positive staining sites. Quantitative analysis can be performed according to purposes such as product positive rate and distribution.
  • human STS in a sample can be quantified, for example, by the following method.
  • the first anti-human STS antibody is immobilized on a 96-well plate for ELISA and then blocked with BSA-PBS. Discard the BSA-PBS and wash well with PBS. Then, prepare a human STS preparation with a known concentration or a test sample with an unknown concentration, and incubate at 4 ° C for 1 hour or at room temperature for 2 hours. After washing well with Tween-PBS, a second anti-human STS antibody that has a different epitope from the first antibody that is solidified is reacted. The second antibody is previously labeled with piotin, an enzyme, a chemiluminescent substance, or a radioactive compound.
  • the concentration of the test sample can be calculated from a calibration curve prepared by serially diluting human STS standards with known concentrations.
  • the method If either one of the first anti-human STS antibody and the second human STS antibody used in the above is an antibody of the present invention, only STS can be specifically measured.
  • Specific combinations of the first anti-human STS antibody and the second human STS antibody include, for example, the anti-human STS monoclonal antibody KM1053 produced by the hyperidoma FERM BP-10015 of the present invention and a known anti-human.
  • a combination of STS monoclonal antibody KM1049 [Cancer Research, 63, 2762 (2003)] and the like can be mentioned.
  • the immunological detection reagent or immunological quantification reagent for human STS is obtained by the immunological technique shown in 2. (1) to (5) above.
  • the constituent elements include an anti-human STS antibody, a carrier for immobilizing the anti-human STS antibody, a solid phase on which the anti-human STS antibody is immobilized, a labeled secondary antibody used for detection or the like.
  • kit or reagent of the present invention may be combined with a device suitable for measurement to form a kit.
  • the anti-human STS antibody specifically binds to human STS and does not exhibit cross-reactivity with ARS other than STS, and is not particularly limited as long as it is an antibody, but for example, the hyperidoma FER M BP-10015 of the present invention.
  • the anti-human STS monoclonal antibody KM1053 and the like produced by is preferably used.
  • the anti-human STS antibody used in the present invention can be a fragmented antibody fragment as required.
  • antibody fragments include peptides including Fab, Fab ', F (a) 2, scFv, dsFv, diabody and CDR, VH or a fusion protein thereof, VL or a fusion protein thereof.
  • the above antibody or antibody fragment can be detected using a secondary antibody, or can be directly detected by labeling the antibody.
  • the secondary antibody is an antibody that can bind to the antibody. Any antibody can be used as long as it is a polyclonal antibody or a monoclonal antibody or a peptide containing Fab, Fa, F (a) 2, scFv, dsFv, diabody and CDR. Can do.
  • the antibody or antibody fragment used for the secondary antibody is used after being labeled for detection.
  • any known edited by Koji Ishikawa et al., Enzyme Immunoassay, Medical Shoin)
  • Enzymes luminescent materials, fluorescent materials or radioisotopes
  • the label is an enzyme, alkaline phosphatase, peroxidase, luciferase, etc.
  • the label is a luminescent substance, attalide-umester, mouth fins, etc.
  • the label is a fluorescent substance, green fluorescein protein, red fluorescent protein, Sense protein, FITC, etc., and 14C, 32P, 1251, etc. can be used for radioisotopes.
  • detection can be performed using labeled avidin, streptavidin, or the like using piotin labeling.
  • a method of labeling an antibody or antibody fragment with the above-mentioned label a method of genetic engineering binding or a method of chemical binding is used. Methods for genetic engineering are described in the literature [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93, 974 (1996); Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93, 7826 (1996)]. Can be done according to.
  • the chemical bonding can be performed according to the method described in the literature [Science, 261, 212 (1993)].
  • a method of chemically combining radioisotopes can be performed according to the method described in the literature [Antibody Immunoconjugates and Radiopharmaceuticals, 3, 60 (1990); Anticancer Research, 11, 2003 (199 1)]. .
  • Examples of the method for measuring the amount of label include an absorbance method (colorimetric method), a fluorescence method, a luminescence method, and a radioactivity method.
  • the label is an enzyme
  • the amount of the label can be measured by reacting the enzyme substrate with the enzyme and measuring the produced substance.
  • the amount of beloxidase can be measured by, for example, an absorbance method or a fluorescence method.
  • an absorbance method for example, a reaction between peroxidase and its substrate hydrogen peroxide and a chromogenic chromogen is performed, and the absorbance of the reaction solution is measured with a spectrophotometer or the like.
  • the method of measuring with is mentioned.
  • the oxidative coloring chromogen include a leuco chromogen and an acid coupling chromogen.
  • Leuco-type chromogens are substances that are converted to pigments alone in the presence of peracid-active substances such as peracid hydrogen and peroxidase.
  • peracid-active substances such as peracid hydrogen and peroxidase.
  • CCAP 10-N-carboxymethylcarbamoyl-3,7-bis (dimethylamino) -10H-phenothiazine
  • MCDP 10-N-methylcarbamoyl-3,7-bis (dimethylamino) -10H-phenothiazine
  • DA-64 4,4, -bis (dimethylamino) diphenylamine sodium salt
  • BCMA bis [3-bis (4-phenylphenol) methyl-4-dimethylaminophenol] amine
  • Oxidative coupling chromogen is a substance in which two compounds are acid-coupled to form a dye in the presence of peroxide active substances such as hydrogen peroxide and peroxidase.
  • peroxide active substances such as hydrogen peroxide and peroxidase.
  • the combination of the two compounds include a combination of a coupler and an aryline (Trinder reagent), a combination of a coupler and a phenol.
  • the coupler include 4-aminoantipyrine (4-AA) and 3-methyl-2-benzothiazolinone hydrazine.
  • Examples of a method for measuring the amount of peroxidase by a fluorescence method include a method in which peroxidase is reacted with a combination of peroxyhydrogen and its fluorescent substance, and the intensity of the generated fluorescence is measured. can give.
  • Examples of the fluorescent substance include 4-hydroxyphenol acetic acid, 3- (4-hydroxyphenol) propionic acid, and coumarin.
  • the amount of alkaline phosphatase can be measured by, for example, a luminescence method.
  • the method for measuring the amount of alkaline phosphatase by the luminescence method include a method of reacting alkaline phosphatase with its substrate and measuring the luminescence intensity of the produced luminescence with a luminescence intensity meter.
  • alkaline phosphatase substrates include 3- (2, -spiroadamantane) -4-methoxy-4- (3, -phosphoryloxy) phenol-1,2-dioxetane 'disodium salt.
  • AMPPD 2-Chloroguchi-5- ⁇ 4-Methoxyspiro [1,2-dioxetane-3,2,-(5, -Chlorochi) tricyclo [3.3.1.13,7] decane] -4-yl ⁇ Phenol phosphate 'Disodium salt (CDP-StarTM), 3- ⁇ 4-methoxyspiro [1,2-dioxetane-3,2,-(5, -cloguchi) tricyclo [3.3.1.13, 7] decane ]-4-yl ⁇ Phenol phosphate 'Disodium salt (CSPDTM), [10-Methyl-9 (10H) -Ataridiylidene] Phenoxymethyl phosphate' Disodium salt (LumigenTM APS-5) Etc.
  • the amount of ⁇ -D-galactosidase can be measured by, for example, an absorbance method (colorimetric method).
  • an absorbance method colorimetric method
  • the method for measuring the amount of ⁇ -D-galactosidase by the absorbance method include, for example, a method of reacting j8-D-galactosidase with its substrate and measuring the absorbance of the reaction solution with a spectrophotometer, etc. Can be raised.
  • the substrate for j8-D-galactosidase include 2-chloro-4-nitrophenol 13-D-galactoside.
  • the amount of radioisotope can be determined by measuring the radioactivity with a scintillation counter or the like.
  • a carrier for immobilizing the anti-human STS antibody any carrier can be used as long as it can bind and hold the antibody.
  • materials formed by molding various polymer materials to suit the application are used. It is done.
  • the shape of the carrier for immobilizing the antibody and the like is fine particles such as tubes, beads, plates and latex, and the force such as a stick.
  • the materials are polystyrene, polycarbonate, polyvinyltoluene, polypropylene, polyethylene, polyvinyl chloride, nylon, polymethacrylate.
  • polymer materials such as silicate, gelatin, agarose, cellulose and polyethylene terephthalate, glass, ceramics, magnetic particles and metals.
  • a known method such as a physical method and a chemical method or a combination thereof can be used.
  • physical bonds include physical adsorption.
  • the chemical bond include a covalent bond and a non-covalent bond.
  • non-covalent bonds include electrostatic bonds, hydrogen bonds, hydrophobic bonds, and coordinate bonds.
  • a polystyrene 96-well immunoassay microterplate prepared by immobilizing peptides in a hydrophobic phase.
  • the antibody to be immobilized may be directly immobilized on the solid phase, or the antibody may be immobilized on the solid phase after passing through piotin-avidin or the like.
  • the solid phase on which the above-mentioned anti-human STS antibody is immobilized protects the functional groups remaining on the carrier by blocking.
  • a substance used for blocking in an immunoassay usually a protein, a surfactant, a commercially available blocking reagent, etc. are used, but as a normal protein used for blocking of the present invention, BSA, KLH or casein Etc. are used.
  • Examples of the diluted solution of the biological sample include an aqueous solution containing a stabilizer in a surfactant or a buffer.
  • the aqueous solution should be prepared as an isotonic solution with salts, sugars, buffers, etc., in order to prevent changes in serum component concentration due to expansion and contraction of blood cells such as red blood cells.
  • the salt is not particularly limited, and examples thereof include alkali metal halides such as sodium chloride and potassium salt.
  • the saccharide is not particularly limited, and examples thereof include sugar alcohols such as mannitol and sorbitol.
  • reaction buffer may be used as long as the antibody-immobilized antibody on the solid phase and the antigen in the biological sample can undergo a binding reaction.
  • surfactants preservatives, stabilizers, reaction accelerators or enzyme activity regulators may be added. Any washing solution can be used as long as unreacted substances can be removed and washed, and the antigen-antibody reaction is not affected.
  • a buffer, a surfactant, a protein such as BSA or casein, an antiseptic or a stabilizer may be added. For example, Tween-PBS is used.
  • the buffer used in the sample dilution, reaction buffer, or washing solution is not particularly limited as long as the buffer used in the buffer has a buffering capacity.
  • Good buffers include, for example, MES (2-morpholinoethanesulfonic acid) buffer, bis-tris [bis (2-hydroxyethyl) iminotris (hydroxymethyl) methane] buffer, ADA [N- (2-acetamido ) Iminoniacetic acid] buffer, PIPES [piperazine-N, N, -bis (2-ethanesulfonic acid)] buffer, ACES ⁇ 2- [N- (2-acetamido) amino] ethanesulfonic acid ⁇ buffer, MOPSO (3-morpholino-2-hydroxypropanesulfonic acid) buffer, BES ⁇ 2- [ ⁇ , ⁇ -bis (2-hydroxyethyl) amino] ethanesulfonic acid ⁇ buffer, MOPS (3-morpholinopropanesulfonic acid) Buffer, TES ⁇ 2- ⁇ N- [Tris (hydroxymethyl) methyl] amino ⁇ ethanesulfonic acid> buffer, HEPES [N- (2-hydroxyeth
  • Examples of the enzyme activity regulator and enzyme stabilizer include metal ions such as magnesium ion, manganese ion, and zinc ion.
  • the content of these metal ions in the reagent is not particularly limited as long as the enzyme is stabilized in the measurement.
  • Examples of antiseptics include sodium azide and antibiotics.
  • the content of these preservatives in the reagent is not particularly limited as long as it is such a content that the substance to be measured in the sample can be appropriately measured in the measurement.
  • Human STS reference materials include human STS obtained by genetic recombination technology or obtained from biological samples, cells expressing human STS, and partial peptides of human STS.
  • An immunological detection reagent or kit for human STS in a specimen of the present invention and an immunological quantitative reagent or kit are used for determination or diagnosis of human STS-related diseases, selection of drugs suitable for treatment of human STS-related diseases, It can be used for the determination or diagnosis of human STS-related diseases.
  • the human STS-related disease includes any disease, regardless of whether it is mild or severe, as long as human STS is involved in the pathological condition.
  • Examples of human STS-related diseases include estrogen-dependent diseases in which human STS is involved in pathological conditions, and specific examples include estrogen-dependent tumors in which human STS is involved in pathological conditions.
  • Examples of estrogen-dependent tumors include tumors with estrogen-dependent cell proliferation, such as malignant tumors, benign tumors, and skin diseases.
  • malignant tumors include breast cancer, uterine cancer, ovarian cancer, prostate cancer, and Skills gastric cancer.
  • Breast cancer and uterine cancer are preferred.
  • breast cancer include ductal cancer, lobular cancer, Paget's disease and the like, and invasive ductal cancer, in which breast cancer is preferred, is particularly preferable.
  • endometrial cancer also called endometrial cancer, is particularly preferred.
  • the disease site may be a primary lesion or a metastatic lesion.
  • Examples of benign tumors include endometriosis, uterine adenomyosis, uterine fibroids, etc., but eclampsia and eclampsia are preferred.
  • Examples of skin diseases include ichthyosis.
  • human STS in the specimen is detected, or human STS is healthy.
  • human STS is healthy.
  • the abundance of human STS is increased as compared with normal tissues, it is determined that human STS is positive or that human STS is up-regulated.
  • Such a patient is determined or diagnosed as having a human STS-related disease.
  • a drug suitable for the treatment of the human STS-related disease can be selected.
  • human STS-related diseases include estrogen-dependent diseases in which human STS is involved in the pathology, a drug suitable for the treatment of estrogen-dependent diseases may be selected.
  • Specific examples of drugs suitable for the treatment of human STS-related diseases include STS inhibitors.
  • Examples of drugs suitable for the treatment of estrogen-dependent diseases include hormone therapy agents.
  • any STS inhibitor may be used as long as it has a function of inhibiting the function of STS.
  • nortropiny ⁇ arylsulfonylurea or a derivative thereof [Bioorg anic & Medicinal Cnemistry Letters, 1 ⁇ , 3b / '3 (2003)], estrone— 3—O—sulfamate3 ⁇ 4 ⁇ or its derivatives, 2-difluoromethyloestrone 3—O—sulphamate [Biochemical & Biophysic al Research Communications, 317, 169 (2004)], bipheny ⁇ 4—O— sulfamate or ⁇ masano derivatives, 2 ', 4'-dicyanobiphenyl-4-0-sulfamate [Journal of Steroid Biochemistry & Molecular Biology, 87, 141 (2003)], estrone derivatives [Bioorganic & Medicinal Chemis try, 11, 1685 (2003)], 2-Alkylchromen- 4- one 6-0-sulfamates [J
  • the hormone therapy agent includes any drug that has a function of inhibiting the function of estrogen, but an anti-estrogen agent, a selective aromatase inhibitor, a luteinizing hormone-stimulating hormone inhibitor or Specific examples include progesterone preparations. Examples include goseralin and medroxyprogesterone acetate.
  • the immunological detection reagent or kit for human STS in the specimen of the present invention and the immunological determination reagent or kit can be used for the determination or diagnosis of the pathological condition of human STS-related diseases. .
  • Examples of the determination or diagnosis of the pathology of human STS-related diseases include grasping the current state of human STS-related diseases and predicting prognosis.
  • the current status of human STS-related diseases includes, for example, the degree of progression, progression, exacerbation, or tolerance after treatment.
  • the prognosis of the disease includes the possibility of recurrence, the degree of metastasis, or the survival rate of affected patients.
  • Purified human STS was also obtained for human placenta tissue as follows. All operations were performed at 4 ° C.
  • the obtained microsomal fraction was prepared by adding buffer B [lmmol / L EDTA, lmmol / L dithioerythreitol (DTE), 0.05% phenylmethylsulfurfluoride (PMSF), 0.5% triton X-100. 10 mmol / L Tris-hydrochloric acid buffer solution (PH7.5)] was added and stirred at room temperature for 1 hour to dissolve.
  • the eluted fraction was passed through a phenyl sepharose column equilibrated with buffer B, washed with a sufficient amount of the same buffer, and eluted with the same buffer containing 1.25% Triton X-100.
  • the elution fraction thus obtained was used as purified human STS.
  • Purified human STS was tested for purity using SDS-denatured polyacrylamide gel electrophoresis (hereinafter referred to as SDS-PAGE).
  • Figure 1 shows the results of SDS-PAGE staining of purified human STS obtained with Kumashi brilliant blue. As indicated by the arrow, purified human STS was stained as a single band with a molecular weight of 63 KDa, and the purity of purified human STS was estimated to be 90% or more.
  • Purified human STS obtained in (1) above was administered to 5-week-old female mice (Balb / c) together with 2 mg of aluminum gel and pertussis vaccine (manufactured by Chiba Serum Research Laboratories) 1 X 10 9 cells, and 2 weeks later More similarly prepared immunogen was administered once a week for a total of 4 times. Blood was collected from the fundus venous plexus, the serum antibody titer was examined by the enzyme immunoassay shown below, and the spleen was removed 3 days after the final immunization from the mouse that showed a sufficient antibody titer.
  • the spleen is shredded in MEM medium (manufactured by Nissui Pharmaceutical), loosened with tweezers, centrifuged (1200 rpm, 5 minutes), the supernatant was discarded, and Tris monosalt-ammoum The cells were treated with a buffer solution (pH 7.65) for 1-2 minutes to remove erythrocytes, washed 3 times with MEM medium, and used for cell fusion.
  • MEM medium manufactured by Nissui Pharmaceutical
  • tweezers centrifuged (1200 rpm, 5 minutes
  • Tris monosalt-ammoum The cells were treated with a buffer solution (pH 7.65) for 1-2 minutes to remove erythrocytes, washed 3 times with MEM medium, and used for cell fusion.
  • the purified human STS obtained in (1) above was used as the antigen for Atsey.
  • BSA was used as the negative control antigen.
  • Purified human STS or BSA was dispensed into a 96-well EIA plate at 50 ⁇ L / well and left at 4 ° C for adsorption. After washing, BSA-PBS was added at 100 / z L / well and reacted at room temperature for 1 hour to block remaining active groups. BSA—PBS was discarded, and the immunized mouse antiserum, anti-human STS monoclonal antibody culture supernatant or purified monoclonal antibody was dispensed at 50 ⁇ L / well and allowed to react for 2 hours.
  • peroxidase-labeled Usagi anti-mouse immunoglobulin (Dako) (50 ml / well) was added at 50 L / well and allowed to react for 1 hour at room temperature.
  • ABTS substrate solution [2, 2 Dissolve 0.55 g of '-Azino-bis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) ammonium in 1 L of 0.1 mol / L citrate buffer (pH 4.2) and peroxidize immediately before use.
  • a solution containing hydrogen water added at 1 ⁇ L / mL is colored with 50 L / well and colored, and the absorbance at 415 nm (hereinafter referred to as OD415) is applied to a plate reader (NJ2001; Nippon Intermed). ).
  • the 8-azaguan metabolite mouse myeloma cell line P3-U1 [European Journal of Immunology, 6, 511 (1976)] was cultured in normal medium, and at least 2 X 10 7 cells were secured during cell fusion. It used for cell fusion.
  • mice spleen cells obtained in (2) above and the myeloma cells obtained in (4) were mixed at a ratio of 10: 1, centrifuged (1200 rpm, 5 minutes), the supernatant was removed, after thoroughly loosened the precipitated cell group, while stirring, 37 ° C, polyethylene of glycol -1000 (PEG-1000) 2g, MEM medium 2mL and dimethylsulfoxide 0.7mL of a mixture of 1 X 10 8 cells mouse splenocytes Add 0.2 to 1 mL per minute, add 1 to 2 mL of MEM medium several times every 1 to 2 minutes, and then add MEM medium so that the total volume is 50 mL. After centrifugation (900 rpm, 5 minutes), the supernatant was removed, the cells were loosened gently, and the cells were suspended in lOOmL of HAT medium gently by suction and suction with a pipette.
  • the monoclonal antibodies produced by the Hypridoma cell line KM1053 and Hypridoma cell line KM1049 are called anti-human STS monoclonal antibody KM1053 and anti-human STS monoclonal antibody KM1049, respectively.
  • mice (Balb / c) treated with pristane were injected intraperitoneally with 5 to 20 ⁇ 10 6 cells Z each of the mice obtained in (5) above. After 10-21 days, the hyperidoma developed ascites tumor. Ascites was collected from mice with ascites (1-8 mL / animal) and centrifuged (3000 rpm, 5 minutes) to remove solids. The obtained ascites was prepared by the fpr from the force prillic acid precipitation method [Antioodies-A Laooratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, (1988)] and used as a purified monoclonal antibody.
  • the antibody subclass was determined by enzyme immunoassay using a sub-clustering kit (manufactured by ZYMED). The results are shown in Table 1.
  • Plasmid pSVL—STS [J. Biol. Chem., 264, 13865 (1989)] (lng / L) containing human STS gene 0.5 L, 10-fold concentration of Pfo polymerase buffer 5 L, 2 mmol / L dNTP 2 L 40 ⁇ mol / L of the primer having the nucleotide sequence shown in SEQ ID NOs: 1 and 2, respectively, 0.5 ⁇ L, DMSO 5 L, Pfo polymerase (STRATAGENE) 0.5 ⁇ L, and sterile water 36 ⁇ L Overlay with mineral oil and heat at 94 ° C for 5 minutes, then perform 16 reaction cycles consisting of 94 ° C for 1 minute, 50 ° C for 1 minute and 72 ° C for 2 minutes, followed by 72 ° C.
  • the reaction was carried out at C for 7 minutes.
  • the PCR product was fractionated by agarose gel electrophoresis, and the obtained amplified fragment of about 1.7 kb was extracted using the GENECLEAN Spin Kit (manufactured by BIO101).
  • the extracted fragment was digested with ⁇ lHI and 1 and ligated to pQE30 (QIAGEN) extinguished with ⁇ iHI and ⁇ ml using DNA Ligation Kit ver.2 (Takara Shuzo).
  • Escherichia coli DH5 ⁇ strain was transformed by the method of [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69, 2110 (1972)].
  • a plasmid was extracted from the obtained transformant using a plasmid extraction kit (manufactured by QIAGEN) to obtain an expression plasmid pQE-STS.
  • the DNA sequence of pQE-STS was confirmed using DNA Sequencer 373 (Perkin Elmer dry soil) and BigDye Terminator ycle Sequencing Fb Ready Reaction Kit (Perkin Elmer). In addition to the areas where the changes were made, there was no change.
  • pQE-STS was introduced into Escherichia coli M15 [pREP4] strain in the same manner as described above to prepare human STS-expressing Escherichia coli strain M15 [pREP4] / pQE-STS.
  • the STS-expressing E. coli strain M15 [pREP4] / pQE-STS strain prepared in (1) above is 50 mg / L After culturing at 37 ° C in LB medium containing picillin and 10 mg / L kanamycin, diluting the culture medium 50 times and culturing for 1 hour, add IPTG to a final concentration of 4 mmol / L. I was accompanied. After 4 hours of culture, the cells were collected by centrifugation.
  • the recovered human STS-expressing E. coli strain and purified human STS derived from human placenta are dissolved in 1-fold PAGE buffer [2% SDS, 62 mmol / L Tris-HCl buffer (pH 6.8), 10% Glycerol].
  • the mixture was heat-treated at 95 ° C for 5 minutes, fractionated by SDS-polyacrylamide electrophoresis [Ant3 ⁇ 4odies-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, (1988)], and then blotted on a PVDF membrane. After blocking the membrane with BSA-PBS, anti-human STS monoclonal antibody KM1 053 or anti-human STS monoclonal antibody KM1049 was reacted at room temperature for 2 hours.
  • a peroxidase-labeled anti-mouse immunoglobulin antibody (manufactured by DAKO) was reacted as a second antibody at room temperature for 1 hour. After washing thoroughly with Tween-PBS, detection was performed using an ECL-detection kit (Amersham) and exposed on an X-ray film.
  • FIG. 3 shows the results.
  • Anti-human STS monoclonal antibody KM1053 and anti-human STS monoclonal antibody KM1049 both reacted not only with placenta-derived purified human STS obtained in Example 1 (1) but also with recombinant human STS expressed in E. coli.
  • anti-human STS monoclonal antibody KM1053 and anti-human STS monoclonal antibody KM1049 can detect human STS by Western blotting and can be applied to the determination or diagnosis of various diseases involving STS. It was done.
  • the plasmid pSVL-STS containing the human STS gene [J. Biol. Chem., 264, 13865 (1989)] was digested with restriction enzymes 1 and ⁇ , and the resulting digested fragments were separated by agarose gel electrophoresis, and about A fragment containing a 2.4 kb human STS gene was extracted.
  • the extracted fragment was ligated to pBlueScriptllSK (-) digested with 1 and HI, and transformed into E. coli DH5 ⁇ strain by the method of Cohen et al. [Proc. Natl. Aca d. Sci. USA, 69, 2110 (1972)]. did.
  • Plasmids were extracted from the resulting transformants using a plasmid extraction kit (QIAGEN) to obtain pBS-STS.
  • pBS-STS was digested with II and 20 ⁇ 1 and a fragment containing the human STS gene was obtained as described above.
  • the fragment of the animal cell expression vector pcDNA3 manufactured by Invitrogen
  • the expression plasmid pcSTS was obtained by inserting into the Notl-Xhol site.
  • pcSTS is produced by CHO / dDXBl cells [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 4216 (1980) as follows by the electoral position method [Cytotechnology, 3, 133 (1990)]. ] Was introduced.
  • CHO / dDXBll cells were supplemented with 5% urine fetal serum (Life technologies), 0.09% baking soda (Life technologies), 1% Penicillin-streptomycin (Life technologies) 7 Cells subcultured in a medium (Life Technologies) (hereinafter referred to as A3 medium) were used.
  • CHO / dDXBll cells were washed with K-PBS buffer [137 nmol / L potassium chloride, 2.7 nmol / L sodium chloride, 8.1 mmol / L disodium monohydrogen phosphate, 1.5 nmol / L dihydrogen phosphate Suspend in sodium, 4 mMol / L salt-magnesium buffer] to 8 X 10 6 cells / mL, mix 200 L of cell suspension (containing 1.6 X 10 6 cells) with 4 g of the above plasmid. did.
  • K-PBS buffer [137 nmol / L potassium chloride, 2.7 nmol / L sodium chloride, 8.1 mmol / L disodium monohydrogen phosphate, 1.5 nmol / L dihydrogen phosphate Suspend in sodium, 4 mMol / L salt-magnesium buffer] to 8 X 10 6 cells / mL, mix 200 L of cell suspension (containing 1.6 X 10 6 cells) with 4
  • the mixed solution was transferred to a cuvette (distance between electrodes: 2 mm), and gene introduction was performed using a GenePulser II (BioRad) device under conditions of a pulse voltage of 0.35 kV and an electric capacity of 250 F. After leaving the cuvette on ice, suspend the cell suspension in the cuvette in a cell culture vessel containing A3 medium, 37 ° C, 5% CO
  • the resulting transformed cells are diluted with B3 medium to 1.25 cells / mL, and the diluted solution is dispensed in 200 L portions into a 96-well plate, subjected to single cell cloning, and transformed cells cs3- 1 Cell lines were obtained.
  • Cells into which human STS was introduced were selected by measuring the arylsulfatase activity of the transformed cells obtained above.
  • TT buffer 50mmol / L Tris-HCl buffer (pH7.2) containing 1% Triton X-100
  • NPS p-Nitrophenylsulfate
  • the beads were washed 3 times with the above lysis buffer. After washing, add 35 L of double PAGE buffer [4% SDS ⁇ 124 mmol / L Tris-HCl buffer (pH 6.8), 20% Glycerol] to the beads and heat at 95 ° C for 5 minutes.
  • the treated and adsorbed protein on the precipitated beads was subjected to electrophoresis on a 10% SDS-PAGE gel.
  • the fractionated protein was transferred to a PVDF membrane, and Western blotting was performed in the same manner as described in (2) above. Western blotting method KM1049 was used as the secondary antibody, and HRP-labeled Usagi anti-mouse antibody (DAKO) was used as the secondary antibody. The results are shown in FIG.
  • Anti-human STS monoclonal antibody KM1053 was able to immunoprecipitate human STS, but anti-human STS monoclonal antibody KM1049 was not able to immunoprecipitate human STS. It has been shown that KM1053 can detect human STS by immunoprecipitation and can be applied to the diagnosis of various diseases related to STS.
  • Human STS was detected by the immunocytostaining method using the anti-human STS monoclonal antibody obtained in Example 1 (5) as follows.
  • the cells were the human STS gene-introduced cell line cs3-l cell constructed in (3) above and CDNA3 in which pcDNA3 plasmid not containing human STS gene was introduced into the parental CHO / dDXBll cell as a negative control. -1 cell was used.
  • the cells were detached with EDTA, washed with PBS, and then treated with ice-cooled 100% methanol at 4 ° C for 10 minutes in order to increase the antibody permeability of the cell membrane. After washing with PBS, blocking was performed with lmg / mL human immunoglobulin (manufactured by Kappel) for 30 minutes at room temperature. The reaction was dispensed at 1 ⁇ 10 5 cells / reaction, and the culture supernatant of the anti-human STS monoclonal antibody KM1053 producing hybridoma was added and reacted at room temperature for 30 minutes.
  • FITC-labeled anti-mouse immunoglobulin antibody antibody that specifically reacts with mouse immunoglobulin; Wako Pure Chemical Industries
  • FITC-labeled anti-mouse immunoglobulin antibody is dispensed in 100 L / tube and protected from light at 4 ° C for 30 minutes. Reacted.
  • analysis was performed with a cell analyzer (Coulter, Inc .; EPICS XL systemll).
  • the anti-human STS monoclonal KM1053 does not react with CDNA3-1 cells that do not express human STS, and the cell line into which the human STS gene has been introduced cs3-l It showed specific reactivity to cells.
  • the negative mouse IgGl class monoclonal antibody did not react with any cells. Therefore, anti-human STS monoclonal antibody KM1053 is It was shown that STS can be detected and applied to diagnosis of various diseases related to STS.
  • the sections were kept at room temperature using the blocking solution derived from normal rabbit sera attached to the Histofine SAB-PO (M) (hereinafter referred to as “Histofine”) used in the detection step described later. And blocked for 30 minutes. After blocking, the sample was diluted with primary antibody diluent [PBS containing 0.5% BSA, 0.05% azide (disodium phosphate 32.27 g, monosodium phosphate 4.5 g, salt 80 g, distilled water 1 liter)] 8.33 The reaction was allowed to proceed overnight at 4 ° C with anti-human STS monoclonal antibody K M1053 diluted to g / mL. At this time, normal mouse IgG was simultaneously used as a negative control for the primary antibody.
  • primary antibody diluent PBS containing 0.5% BSA, 0.05% azide (disodium phosphate 32.27 g, monosodium phosphate 4.5 g, salt 80 g, distilled water 1 liter)
  • peroxidase blocking solution all mL of 30% hydrogen peroxide solution is adjusted with methanol to lOOmL
  • Peroxidase blocking solution all mL of 30% hydrogen peroxide solution is adjusted with methanol to lOOmL
  • the reaction was washed and reacted for 30 minutes at room temperature using the secondary antibody solution (Piotin-labeled anti-mouse IgG + IgA + IgM Usagi antibody) attached to the Histofine.
  • the reaction was washed and reacted at room temperature for 30 minutes using the avidin-labeled peroxidase solution attached to the Histofine.
  • DAB color development was performed as follows.
  • anti-human STS monoclonal KM1053 capable of staining 90% or more of cancer tissue is an antibody suitable for immunohistochemical staining of cancer
  • anti-human STS monoclonal K M1053 Since human STS can be detected by immunocytostaining, it has been shown that it can be applied to the diagnosis of various diseases involving STS.
  • PCR cloning of the ARS A gene was performed from the human placenta cDNA library (Clontech).
  • cDNA library (0.5 ⁇ g / ⁇ L) 20 ⁇ L, 10-fold concentration of KOD polymerase buffer 5 ⁇ L, 2 mmol / L dNTP 2 ⁇ 40 ⁇ mol / L Primer 0.5 ⁇ L, DMSO 5 ⁇ KOD polymerase (Toyobo Co., Ltd.) 0.5 ⁇ L, and sterilized water 21.5 L, mineral oil is overlaid, heated at 94 ° C for 5 minutes, then at 94 ° C 1 25 reaction cycles of 1 minute at 45 ° C and 2 minutes at 72 ° C were performed for 25 minutes, followed by a reaction at 72 ° C for 10 minutes.
  • the PCR product was fractionated by agarose gel electrophoresis, and the obtained amplified fragment of about 1.5 kb was extracted using GENECLEAN Spin Kit (manufactured by BIO101). The extracted fragment was used as a saddle and the same PCR reaction was performed as above, and the amplified fragment was extracted as described above.
  • the obtained amplified fragment was digested with Hindm and ai, and ligated to pBluescript SK (-) digested with Hindlll and al using a DNA ligation kit ver.2 (Takara Shuzo), followed by the method of Cohen et al. [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69, 2110 (1972)] was transformed into E.
  • Plasmids were extracted from the resulting transformants using a plasmid extraction kit (KPromega) to obtain pBS-ARS A2 and pBS-ARS 5.
  • pB The DNA sequences of S-ARS A2 and pBS-ARS 5 were confirmed using DNA Sequencer 377 (Perkin Elmer) and BigDye Terminator Cycle sequencing FS Ready Reaction Kit (Perkin Elmer: ⁇ ). It was found that there was a single mutation in ARS A2 and a deletion mutation at positions 464-526 in pBS-ARS A5.
  • pBS-ARS A2 was digested with ilindlll and ⁇ ⁇ ⁇ , separated by agarose gel electrophoresis, and the extracted fragment (0.8 kbp) was extracted from pBS-ARS A5 ilindm- PBS-ARS A ′ containing the translation region of complete ARS A was obtained by inserting into the S1BI fragment (3.5 kbp).
  • the target plasmid pBS-ARS is obtained by digesting pBS-ARS A 'with ⁇ MI and generating fragments of 0.5, 0.6, and 3.4 kbp by analysis of agarose electrophoresis and by sequencing near the mutation point. It was confirmed that A 'was acquired.
  • pBS-ARS A ′ was digested with Hindlll and ⁇ , and a fragment containing ARS ⁇ was obtained in the same manner as described above. The fragment was inserted into the Hiadin-ai site of animal cell expression vector pAGE210 [J. Biochem., 101, 1307 (1987)] to obtain an expression plasmid PAGE210-ARS A.
  • PAGE210-ARS A was digested with ⁇ and linearized. After phenol chloroform extraction, ethanol precipitation was performed, and the recovered linear plasmid was dissolved in 1 ⁇ g / L.
  • CHO / DG44 cells Somatic Cell and Moleculer Genetics, 12, 555 (1986)] have 10% urine fetal serum (Life technologies), 1% HT Supplement (Life technologies), 1% Penicillin- A subculture of IMDM medium (Life technologies) (hereinafter referred to as A1 medium) supplemented with streptomycin (Life technologies) was used.
  • CHO / DG44 cells in K-PBS buffer [137 nmol / L potassium chloride, 2.7 nmol / L sodium chloride, 8.1 mmol / L disodium monohydrogen phosphate, 1.5 nmol / L monosodium dihydrogen phosphate, 4 mmol / L Suspended in a magnesium chloride buffer to give 8 ⁇ 10 6 cells / mL, and 200 ⁇ L of the cell suspension (containing 1.6 ⁇ 10 6 cells) was mixed with 4 g of the above linear plasmid.
  • the mixture was transferred to a cuvette with a distance between electrodes of 2 mm, and gene introduction was performed using a GenePulser II (BioRad) device under conditions of a pulse voltage of 0.30 kV and an electric capacity of 250 F.
  • the cell suspension in the cuvette was suspended in 10 mL of A1 medium, and 100 L was dispensed into a 96-well plate at 37 ° C in a 5% carbon dioxide incubator. .
  • B1 medium IMDM medium supplemented with hygromycin B (hereinafter referred to as B1 medium), and the culture was continued. Passaging was continued while diluting, and a transformed cell line resistant to hygromycin B was obtained about 2 weeks after gene transfer.
  • the obtained transformed cells were subcultured three times in B1 medium supplemented with 50, 100 or 500 nmol / L Methotrexate (MTX) (approximately 2 weeks). ) To obtain strains resistant to each concentration of MTX. In addition, the obtained expression strain was subcultured in EX-CELL 301 (manufactured by JRH Bioscience) to acclimate the serum, and transformed cells into which ARS A had been introduced were obtained.
  • EX-CELL 301 manufactured by JRH Bioscience
  • the aryl sulfatase activity of the transformed cells obtained above was measured by the following method, and cells into which ARS A had been introduced were selected.
  • NCS p-Nitrocatecholsulfate
  • the reaction was carried out. Extract 100 L of the reaction solution at 0 and 30 minutes after the start of the reaction, mix with 50 ⁇ L of IN NaOH to stop the reaction, and then measure the absorbance at 490 nm using a Microplate reader benchmark (manufactured by BIO-RAD). The enzyme activity of the cells was determined. The results are shown in Figure 7-A. Control cell line introduced with plasmid pAGE210 not containing ARS A gene Vector 1 cell line and transformation of pAGE210-ARS A plasmid containing ARS A gene into the ⁇ ⁇ (100) cell line were compared for arylsulfatase activity However, it was confirmed that the transformant 7 (100) cell line has ararylsulfatase activity.
  • a plasmid pMPSVHE-ASB [Gene, 68, 213 (1988)] containing the human-derived ARS B gene was digested with restriction enzyme E £ 2RI and blunt-ended with Blunting Kit (Takara Shuzo) and digested with ⁇ HI.
  • the obtained digested fragments were separated by agarose gel electrophoresis, and then a fragment containing about 2.3 kb of ARS B was extracted using GENECLEAN Spin Kit (manufactured by BIO101).
  • the extracted fragment was inserted into the ⁇ lHI-site of animal cell expression vector pAGE210 [J. Biochem., 101, 1307 (1987)] using DNA Ligation Kit ver.2 (Takara Shuzo).
  • Escherichia coli J Ml 10 strain (dam ", dcm") was transformed with the vector by the method of Cohen et al. [ Proc . Natl. Acad. Sci. USA, 69, 2110 (1972)]. Plasmid extraction kit (P The plasmid was extracted using romega) to obtain pAGE210-ARS B.
  • the obtained transformed cells are subcultured 3 times (approximately 2 weeks) in B1 medium supplemented with 50, 100 or 500 nmol / L Methotrexate (MTX).
  • MTX Methotrexate
  • a strain resistant to each concentration of MTX was obtained.
  • the obtained expression strain was subcultured in a medium of EX-CELL 301 (manufactured by JRH Bioscience) to acclimate with serum.
  • the cells into which ARS B had been introduced were selected by measuring the aryl sulfatase activity of the transformed cells obtained above.
  • pAGE210-ARS D is transferred to CHO / DG44 cells [Somatic Cell and Molecular Genetics, 12, 555 (1986)] as follows by the electoral position method [Cytotechnology, 3, 133 (1990)]. Introduced.
  • PAGE210-ARS D was digested with sputum and linearized. The reaction solution was extracted with phenol chloroform and then recovered by ethanol precipitation, and the recovered linear plasmid was dissolved. On the other hand, CHO / DG44 cells were supplemented with 10% urine fetal serum (Life technologies), 1% HT Supplement (Life technologies), 1% Penicillin-streptomycin (Life technologies) A subculture of IMDM medium (Life technologies) (hereinafter referred to as A4 medium) was used.
  • CHO / DG44 cells in K-PBS buffer [137 nmol / L potassium chloride, 2.7 nmol / L sodium chloride, 8.1 mmol / L disodium monohydrogen phosphate, 1.5 nmol / L sodium dihydrogen phosphate, 4 mmol / L Suspended in a magnesium chloride buffer solution to give 8 ⁇ 10 6 cells / mL, and 200 L of cell suspension (containing 6 ⁇ 10 6 cells) was mixed with 4 g of the linear plasmid.
  • the mixture was transferred to a cuvette (distance between electrodes: 2 mm), and gene introduction was performed using a GenePulserll (BioRad) apparatus under conditions of a pulse voltage of 0.30 kV and an electric capacity of 250 F. After leaving the cuvette on ice, the cell suspension in the cuvette was suspended in four 10 cm dishes containing 12 mL of A medium and cultured in a 37 ° C, 5% CO incubator. After culturing for 1 day, 10%
  • IMDM medium (Life technologies) supplemented with baby serum (Life technologies), 1% Penicillin—streptomycin (Life technologies), 300 ⁇ g / mL hygromycin (hereinafter referred to as B4 medium)
  • B4 medium 300 ⁇ g / mL hygromycin
  • the obtained transformed cells were serially transferred 3 times approximately every 2 weeks in B1 medium supplemented with 50, 100 or 500 nmol / L Methotrexate (MTX). And strains resistant to each concentration of MTX were obtained. In addition, the obtained expression strain was subcultured in B4 medium to make it acclimatized with serum.
  • MTX Methotrexate
  • the cells into which ARS D was introduced were selected by measuring the arylsulfatase activity of the transformed cells obtained above.
  • Cells suspended in 100 mmol / L Tris-HCl buffer (pH 7.5) were sonicated and centrifuged at approximately 8000 X g for 5 minutes. It measured using Protein assay reagent kit (made by PIERCE).
  • the reaction was conducted at 37 ° C for 4 hours.
  • the absorbance at 415 nm of the reaction solution was measured using a Microplate reader Benchmark (manufactured by BIO-RAD) to determine the aryl sulfatase activity of the cells.
  • Plasmids were extracted from the resulting transformants using a plasmid extraction kit (Promega) to obtain pBS-ARSE.
  • pBS-ARS E was digested with Kmil and tUndlll to obtain a fragment containing ARS E as described above. The fragment was inserted into the KMl-Mindlll site of animal cell expression vector pAGE210 [J. Biochem., 101, 1307 (1 987)] to obtain expression plasmid pAGE210-ARSE.
  • the obtained transformed cells were diluted with B4 medium to 1.25 cells / mL, dispensed 200 L each into a 96-well plate, and single cell cloning was performed. Furthermore, in order to carry out transgene amplification, the transformed cells obtained were passaged three times in sequence in B4 medium supplemented with 50, 100 or 500 nmol / L Methotrexate (MTX) (approximately 2 weeks). ⁇ Resistant to various concentrations of MTX Acquired stocks. In addition, the obtained expression strain was subcultured in B4 medium to make it acclimatized.
  • MTX Methotrexate
  • the cells into which ARS E had been introduced were selected by measuring the aryl sulfatase activity of the transformed cells obtained above.
  • Cells suspended in TC buffer [50 mmol / L Tris-HCl buffer (pH 7.8) containing 1% CHAPS] were centrifuged at approximately 8000 X g for 5 minutes and 50 ⁇ L of supernatant and p-Nitrophenylsulfate ( NPS) substrate solution [50 mmol / L Tris-HCl buffer solution ( ⁇ 7.8) containing 20 mmol / L NPS, 1% CHAPS] 50 / ⁇ L was mixed and reacted at 37 ° C for 5 minutes.
  • TC buffer 50 mmol / L Tris-HCl buffer (pH 7.8) containing 1% CHAPS
  • the absorbance at 415 nm of the reaction solution was measured using a Microplate reader Benchmark (manufactured by BIO-RAD) to determine the enzyme activity of the cells.
  • the protein concentration of the supernatant was measured using a BCA Protein assay reagent kit (PIERCE).
  • Plasmids were extracted from the obtained transformants using a plasmid extraction kit (Promega) to obtain pBS-ARS F.
  • pBS-ARS F was digested with 1 and ffindlll to obtain a fragment containing the gene encoding ARS F in the same manner as described above. The fragment was inserted into the I-Hindlll site of an animal cell expression vector pAGE210 [J. Biochem., 101, 1307 (1987)] to obtain an expression plasmid pAGE210-ARS F.
  • the obtained transformed cells were diluted with B4 medium to 1.25 cells / mL, dispensed 200 L each into a 96-well plate, and single cell cloning was performed. Furthermore, in order to carry out transgene amplification, the transformed cells obtained were passaged three times in sequence in B4 medium supplemented with 50, 100 or 500 nmol / L Methotrexate (MTX) (approximately 2 weeks). As a result, transformed cell lines resistant to various concentrations of MTX were obtained.
  • MTX Methotrexate
  • the cells into which ARS F had been introduced were selected by measuring the arylsulfatase activity of the transformed cell line obtained above.
  • the protein amount of was measured using a BCA Protein assay reagent kit (PIERCE).
  • the resulting cell-free extract of human STS gene-introduced cells (cells suspended in 100 mmol / L Tris-HCl buffer ( ⁇ 7.5) were sonicated and centrifuged at approximately 8000 X g for 5 minutes.
  • Protein 5 ⁇ g / ray Cell-free extract of cells transfected with ARS D, ARS E, and ARS F genes [LOOmmol / L Tris-hydrochloric acid buffer (PH7.5) suspended ultrasonically, approximately 8000 X g After centrifugation for 5 minutes, the supernatant protein, 20 g / lane], was fractionated by SDS-polyacryl electrophoresis and transferred to a PVDF membrane. After blocking with BSA-PBS, anti-human STS monoclonal antibody KM1049 was reacted at room temperature for 2 hours.
  • a peroxidase-labeled anti-mouse immunoglobulin antibody (manufactured by Dako) was reacted as a second antibody for 1 hour at room temperature. After washing with Tween-PBS, detection was performed using an ECL-detection kit (Amersham) and exposed on an X-ray film.
  • Protein A bepharose beads (Protein A bepharoseTM and L-4B, Amersham Biosciences, Buckinghamshire, UK) is swollen in distilled water in a microtube and visually confirmed that the amount of beads is about 20 L. While I was barking. After vortexing, leave on ice for 10 minutes to allow the beads to settle naturally, discard the supernatant, wash the beads again with lmL of distilled water, and centrifuge for 12 seconds with a desktop simple centrifuge to sediment the beads. (Hereafter, the desktop simple centrifuge was used for the sedimentation of beads). The supernatant was discarded, Wash, buffer - After standing [0.1 mol / L Tris containing 0.05% Tween 20 HCl buffer (.
  • the cross-reactivity of anti-human STS monoclonal antibody KM1049 and anti-human STS monoclonal antibody KM1053 to ARS A and ARS B was examined by binding ELISA in which human STS as ARS A, ARS B and ARS C was solidified.
  • Animal cell expression purification ARS A, ARS B and purified human STS obtained by the method described in Example 1 (1) were immobilized on a plate at 2 ⁇ g / mL, and the method described in Example 1 (3) Similarly, a binding ELISA was performed, and the results are shown in FIG.
  • the anti-human STS monoclonal antibody KM1053 is a monoclonal antibody specific for human STS that does not react with arylsulfatase other than human STS. It was shown that there is.
  • Anti-human STS monoclonal antibody KM1049 purified antibody was subjected to piotin treatment using NHS-Lc-Biotin (PIERCE). That is, add 250 mL of 0.5 mg / L carbonate buffer (pH 9.2) to purified anti-human STS monoclonal antibody KM1049 at a concentration of 1 mL / mg / mL, and add 250 ⁇ L of lmg / mL. NHS-Lc-Biotin (lmg / mL) was added, and the mixture was stirred at room temperature for 3 hours. The product dialyzed overnight in PBS was used as the piotinylated anti-human STS monoclonal antibody KM1049.
  • PIERCE 0.5 mg / L carbonate buffer
  • Human STS gene-introduced cell line Human STS was purified from cs3-l cells using anti-human STS monoclonal antibody KM1053 antibody strength ram as follows.
  • Example 2 Ten mg of anti-human STS monoclonal antibody KM1053 was coupled to 5 mL of Hi-Trap NHS-activated (Pharmacia Biotech). The same 33-1 cells (about 50 X 107 cells) obtained in Example 2 (3) were statically cultured in a B3 medium in a petri dish. After washing the petri dish with PBS, the cells on the petri dish were collected with a cell scraper.
  • TC S buffer 50 mmol / L Tris-HCl buffer (pH 7.8) containing 1% CHAPS, 0.5 mol / L NaCl
  • the purified anti-human STS monoclonal antibody KM1053 at a concentration of 10 ⁇ g / mL was dispensed into a 96-well EIA plate at 50 L / well and allowed to stand at 4 ° C for adsorption. After washing, 1% BSA-PBS was added at 100 L / well and reacted at room temperature for 1 hour to block remaining active groups. Discard 1% BSA-PBS, and add 50 ⁇ L / fold of a 2-fold dilution series of purified human STS or control protein (recombinant purified IL-1 ⁇ ) obtained in (2) above from ⁇ ⁇ g / mL. The solution was dispensed in holes and allowed to react overnight at 4 ° C.
  • human STS could be quantified by using anti-human STS monoclonal antibody KM1053, and its detection limit concentration was about 0.01 ⁇ g / mL.
  • STS human steroid sulfatase
  • ARS arylsulfatase other than human STS
  • Antibodies or antibody fragments and hybridomas that produce the antibodies are provided.
  • a human STS immunological detection method or immunological quantification method, a human STS immunological detection reagent or kit, and an immunological quantification reagent or the like using the antibody or antibody fragment Kits and further, immunology of human STS using the antibody or antibody fragment for determining human STS-related diseases, selecting drugs suitable for treatment of human STS-related diseases, and determining the pathology of human STS-related diseases Detection method or immunological determination method, reagent or kit for immunological detection of human STS and reagent for immunological determination or A kit is provided.

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Abstract

　ヒトステロイドスルファターゼ（Steroid sulfatase；以下、ＳＴＳと略記する）と特異的に結合する抗体が求められている。 　本発明により、ヒトＳＴＳと特異的に結合し、ヒトＳＴＳ以外のアリルサルファターゼに結合しない抗体または抗体断片、該抗体を生産するハイブリドーマが提供される。また、本発明は、該抗体または抗体断片を用いる、ヒトＳＴＳの免疫学的検出方法または免疫学的定量方法、ヒトＳＴＳの免疫学的検出用試薬またはキットおよび免疫学的定量用試薬またはキット、さらには、ヒトＳＴＳ関連疾患を判定、ヒトＳＴＳ関連疾患の治療に適する薬剤の選択およびヒトＳＴＳ関連疾患の病態を判定するための、該抗体または抗体断片を用いる、ヒトＳＴＳの免疫学的検出方法または免疫学的定量方法、ヒトＳＴＳの免疫学的検出用試薬またはキットおよび免疫学的定量用試薬またはキットが提供される。

Description

明 細 書
ヒトステロイドサルファターゼに結合するモノクローナル抗体
技術分野
[0001] 本発明は、ヒトステロイドスサファターゼ（Steroid sulfatase；以下、 STSと略記する）と 特異的に結合し、ヒト STS以外のァリルサルファターゼ（以下、 ARSと略記する）に結 合しない抗体または抗体断片、該抗体を生産するハイブリドーマに関する。また、本 発明は、該抗体または抗体断片を用いる、ヒト STSの免疫学的検出方法または免疫 学的定量方法、ヒト STSの免疫学的検出用試薬またはキットおよび免疫学的定量用 試薬またはキット、さらには、ヒト STS関連疾患を判定、ヒト STS関連疾患の治療に適 する薬剤の選択およびヒト STS関連疾患の病態の判定のための、該抗体または抗体 断片を用いる、ヒト STSの免疫学的検出方法または免疫学的定量方法、ヒト STSの 免疫学的検出用試薬またはキットおよび免疫学的定量用試薬またはキットに関する
背景技術
[0002] ステロイドサルファターゼ（STS) (E.C.3.1.6.2.)は 3 β ステロイド硫酸を脱硫酸化 する酵素である。表皮上層において角質の正常な剥離に必須な、コレステロール硫 酸力もコレステロールへの変換は、 STSにより触媒されており、 STSの先天的欠損は 魚鱗症を惹起する（非特許文献 1)。また、 STSは生体内において、エストロゲンの前 駆体であるエストロン硫酸カゝらエストロンへの変換を触媒する（非特許文献 2)。生成 したエストロンはさらにデヒドロゲナーゼの働き活性化ホルモンであるェストラジオ一 ルに変換される。エストラジオールはエストロゲンの一種である。
[0003] 乳癌、卵巣癌および子宮癌の一部はその発生と増殖にエストロゲンが深く関与する ホルモン依存性腫瘍である。乳癌や子宫体癌組織ではエストロゲン Ζエストロン硫酸 の比、あるいは STSの酵素活性が正常糸且織に比べ有意に高い（非特許文献 3、非特 許文献 4)。また、 STSに対する抗体を用いた解析により、ホルモン依存性腫瘍での S TSは蛋白質レベルで発現亢進して ヽる。
[0004] 抗ヒト STSモノクローナル抗体を用いた免疫組織染色により、乳癌組織では、周囲 の正常組織に比べ STSの発現が亢進して 、ることが知られて 、る（非特許文献 5)。 また、抗ヒト STSモノクローナル抗体を用いて 113例の浸潤性乳管癌患者の癌部の免 疫組織染色を行った結果、 74.3%が STS陽性であり、さらに STSの発現が腫瘍の大き さ、再発リスクおよび予後の不良と正の相関を示した (非特許文献 6)。
[0005] 乳癌はその発生部位によって、乳管癌、小葉癌、パジェット病に大きく分類できる。
乳管内のみにある癌を非浸潤性癌と呼び、間質に浸潤して 、るものを浸潤性癌と呼 子宫体癌は子宫体部の内膜にできる癌である力 近年日本人において増加傾向 が見られる。子宫体癌細胞において、 STS活性の存在が確認されている（非特許文 献 8)。
子宮内膜症とは、子宮内膜に類似した組織が、子宮内腔以外の場所に異所性に 存在する類腫瘍性の良性疾患である。子宫内膜はエストロゲンによって増殖するの で、子宮内膜症ではエストロゲンによって増生する。子宮腺筋症とは、子宮内膜症の 亜型で、子宫内膜が子宫筋層内に侵入したものである。 21例の子宫腺筋症患者のう ち、その 78%の腺筋組織に STSの発現が認められ、 STSの発現は腺上皮細胞に限 局していた (非特許文献 7)。一方、正常子宮組織においては、内膜基底層の腺上皮 細胞に STSの発現が認められたことから、内膜基底層および腺筋組織が STSによつ て産生されたエストロゲンの供給原となっていると考えられる。
[0006] STSの発現を調べる方法としては、酵素活性測定方法 (非特許文献 4)、 mRNA量 の定量などの方法 (非特許文献 9)、または抗体を用いた検出方法および定量方法（ 非特許文献 5、 6)が知られている。
ヒト STSに対する抗体としては、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体の報 告されて!/ヽる (非特許文献 6、 10)。
[0007] STSは ARSファミリーに属する蛋白質である。現在までに ARS A,B,C,D,E,Fの 6種 類の ARSが知られており、ヒト STSは ARS Cと同一の蛋白質である。
非特許文献 l : LancetI, 70 (1978)
非特許文献 2 : Endocrinology, 90, 390 (1972)
非特許文献 3 : J. steroid Biochem., 33, 1049 (1989) 非特許文献 4 : Asia- Oceania, J.Obstet. Gynaecol, 15, 101 (1989)
非特許文献 5 : Breast Cancer, 6, 331 (1999)
非特許文献 6 : Cancer Research, 63, 276 (2003)
非特許文献 7 : Obstetrics & Gynecology, 98, 815 (2001)
非特許文献 8 Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism, 65, 164 (1987) 非特許文献 9 : Cancer Research, 59, 377 (1999)
非特許文献 10 : Cell, 49, 443 (1987)
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0008] 本発明の目的は、ヒト STSと特異的に結合し、ヒト STS以外の ARSに結合しない抗 体または抗体断片、該抗体を生産するハイブリドーマを提供することにある。また、本 発明の目的は、該抗体または抗体断片を用いる、ヒト STSの免疫学的検出方法また は免疫学的定量方法、ヒト STSの免疫学的検出用試薬またはキットおよび免疫学的 定量用試薬またはキット、さらには、ヒト STS関連疾患を判定、ヒト STS関連疾患の治 療に適する薬剤の選択およびヒト STS関連疾患の病態の判定のための、該抗体また は抗体断片を用いる、ヒト STSの免疫学的検出方法または免疫学的定量方法、ヒト S TSの免疫学的検出用試薬またはキットおよび免疫学的定量用試薬またはキットを提 供することにある。
課題を解決するための手段
[0009] 本発明は以下の（1)〜（53)に関する。
(1) ヒトステロイドスルファターゼ (以下、 STSと略記する）と特異的に結合し、ヒト ST S以外のァリルスルファターゼに結合しない抗体または抗体断片。
(2) ヒト STS以外のァリルスルファターゼ力 ァリルスルファタ一ゼ 、ァリルスルファ ターゼ ァリルスルファタ一ゼ0、ァリルスルファターゼ Eまたはァリルスルファターゼ Fである（1)に記載の抗体または抗体断片。
(3) 抗体が、モノクローナル抗体である（1)または（2)に記載の抗体または抗体断 片。
[0010] (4) モノクローナル抗体力 ハイプリドーマ KM1053 (FERM BP-10015)力 生産され るモノクローナル抗体が結合するェピトープと結合するモノクローナル抗体である（3) に記載のモノクローナル抗体または抗体断片。
(5) ハイプリドーマ KM1053 (FERM BP-10015)から生産される（3)に記載のモノクロ ーナル抗体または抗体断片。
(6) (3)〜（5)の 、ずれか 1項に記載のモノクローナル抗体または抗体断片を生産 するハイプリドーマ。
(7) ハイプリドーマが、ハイプリドーマ KM1053 (FERM BP- 10015)である（6)に記載 のノヽイブリドーマ。
[0011] (8) (1)〜（5)のいずれか 1項に記載の抗体または抗体断片を用いることを特徴と する、検体中のヒト STSの免疫学的検出方法。
(9) (1)〜（5)の 、ずれか 1項に記載の抗体または抗体断片を用いることを特徴と する、検体中のヒト STSの免疫学的定量方法。
(10) 免疫学的定量方法が、酵素免疫測定法である（9)に記載の方法。
(11) 検体が、ヒト由来の生体試料である（8)〜（10)のいずれ力 1項に記載の方法
[0012] (12) (1)〜（5)のいずれか 1項に記載の抗体または抗体断片を用いて検体中のヒ ト STSを免疫学的に検出または定量し、ヒト STS関連疾患を判定するための、検体 中のヒト STSの免疫学的検出方法または免疫学的定量方法。
(13) ヒト STS関連疾患が、ヒト STSが関与するエストロゲン依存性疾患である（12) に記載の方法。
(14) ヒト STSが関与するエストロゲン依存性疾患が悪性腫瘍、良性腫瘍および皮 膚疾患から選ばれる疾患である（13)に記載の方法。
(15) (1)〜（5)のいずれか 1項に記載の抗体または抗体断片を用いて、検体中の ヒト STSを免疫学的に検出または定量し、検出または定量結果よりヒト STS関連疾患 の治療に適する薬剤を選択するための、検体中のヒト STSの免疫学的検出方法また は免疫学的定量方法。
[0013] (16) ヒト STS関連疾患力 ヒト STSが関与するエストロゲン依存性疾患である（15) に記載の方法。 (17) ヒト STSが関与するエストロゲン依存性疾患が悪性腫瘍、良性腫瘍および皮 膚疾患から選ばれる疾患である（16)に記載の方法。
(18) ヒト STS関連疾患の治療に適する薬剤がホルモン療法剤または STS阻害剤 である（15)〜（17)のいずれか 1項に記載の方法。
(19) (1)〜（5)のいずれか 1項に記載の抗体または抗体断片を用いて、検体中の ヒト STSを免疫学的に検出または定量し、検出または定量結果よりヒト STS関連疾患 の病態を判定するための、ヒト STSの免疫学的検出方法または免疫学的定量方法。
(20) ヒト STS関連疾患が、ヒト STSが関与するエストロゲン依存性疾患である（19) に記載の方法。
[0014] (21) ヒト STSが関与するエストロゲン依存性疾患が悪性腫瘍、良性腫瘍および皮 膚疾患から選ばれる疾患である（20)に記載の方法。
(22) (1)〜（5)の ヽずれか 1項に記載の抗体または抗体断片を含有することを特 徴とする、検体中のヒト STSの免疫学的検出用試薬またはキット。
(23) (1)〜（5)の ヽずれか 1項に記載の抗体または抗体断片を含有することを特 徴とする、検体中のヒト STSの免疫学的定量用試薬またはキット。
(24) 免疫学的定量が、酵素免疫測定法を用いる定量である（23)に記載の試薬ま たはキット。
[0015] (25) 検体力 ヒト由来の生体試料である（22)〜（24)のいずれ力 1項に記載の試 薬またはキット。
(26) (1)〜（5)のいずれか 1項に記載の抗体または抗体断片を含有することを特 徴とする、ヒト STS関連疾患判定用試薬またはキット。
(27) ヒト STS関連疾患が、ヒト STSが関与するエストロゲン依存性疾患である（26) に記載の試薬またはキット。
[0016] (28) ヒト STSが関与するエストロゲン依存性疾患が悪性腫瘍、良性腫瘍および皮 膚疾患から選ばれる疾患である（27)に記載の試薬またはキット。
(29) (1)〜（5)の ヽずれか 1項に記載の抗体または抗体断片を含有することを特 徴とする、ヒト STS関連疾患の治療に適する薬剤選択用試薬またはキット。
(30) ヒト STS関連疾患が、ヒト STSが関与するエストロゲン依存性疾患である（29) に記載の試薬またはキット。
[0017] (31) ヒト STSが関与するエストロゲン依存性疾患が悪性腫瘍、良性腫瘍および皮 膚疾患から選ばれる疾患である（30)に記載の試薬またはキット。
(32) ヒト STS関連疾患治療に適する薬剤が、ホルモン療法剤または STS阻害剤 である（29)〜（31)の 、ずれか 1項に記載の試薬またはキット。
(33) (1)〜（5)のいずれか 1項に記載の抗体または抗体断片を含有することを特 徴とする、ヒト STS関連疾患の病態判定用試薬またはキット。
(34) ヒト STS関連疾患が、ヒト STSが関与するエストロゲン依存性疾患である（33) に記載の試薬またはキット。
[0018] (35) ヒト STSが関与するエストロゲン依存性疾患が、悪性腫瘍、良性腫瘍および 皮膚疾患力 選ばれる疾患である（34)に記載の試薬またはキット。
(36) (1)〜（5)のいずれか 1項に記載の抗体または抗体断片を含有することを特 徴とする、ヒト STS関連疾患の診断薬。
(37) ヒト STS関連疾患が、ヒト STSが関与するエストロゲン依存性疾患である（36) に記載の診断薬。
[0019] (38) ヒト STSが関与するエストロゲン依存性疾患が悪性腫瘍、良性腫瘍および皮 膚疾患から選ばれる疾患である（37)に記載の診断薬。
(39) (1)〜（5)の ヽずれか 1項に記載の抗体または抗体断片を含有することを特 徴とする、ヒト STS関連疾患の病態の診断薬。
(40) ヒト STS関連疾患が、ヒト STSが関与するエストロゲン依存性疾患である（39) に記載の診断薬。
[0020] (41) ヒト STSが関与するエストロゲン依存性疾患が悪性腫瘍、良性腫瘍および皮 膚疾患から選ばれる疾患である（40)に記載の診断薬。
(42) (1)〜（5)のいずれか 1項に記載の抗体または抗体断片を用いて、検体中の ヒト STSを免疫学的に検出または定量し、検出または定量結果よりヒト STS関連疾患 を診断する方法。
(43) ヒト STS関連疾患が、ヒト STSが関与するエストロゲン依存性疾患である（42) に記載の方法。 [0021] (44) ヒト STSが関与するエストロゲン依存性疾患が悪性腫瘍、良性腫瘍および皮 膚疾患から選ばれる疾患である（43)に記載の方法。
(45) (1)〜（5)のいずれか 1項に記載の抗体または抗体断片を用いて、検体中の ヒト STSを免疫学的に検出または定量し、検出または定量結果よりヒト STS関連疾患 の治療に適する薬剤を選択する方法。
(46) ヒト STS関連疾患力 ヒト STSが関与するエストロゲン依存性疾患である（45) に記載の方法。
[0022] (47) ヒト STSが関与するエストロゲン依存性疾患が悪性腫瘍、良性腫瘍および皮 膚疾患から選ばれる疾患である（46)に記載の方法。
(48) ヒト STS関連疾患の治療に適する薬剤がホルモン療法剤または STS阻害剤 である（45)〜（47)の 、ずれか 1項に記載の方法。
(49) (1)〜（5)のいずれか 1項に記載の抗体または抗体断片を用いて、検体中の ヒト STSを免疫学的に検出または定量し、検出または定量結果よりヒト STS関連疾患 の病態を診断する方法。
(50) ヒト STS関連疾患力 ヒト STSが関与するエストロゲン依存性疾患である（49) に記載の方法。
[0023] (51) ヒト STSが関与するエストロゲン依存性疾患が悪性腫瘍、良性腫瘍および皮 膚疾患から選ばれる疾患である（50)に記載の方法。
(52) (22)〜 (41)のいずれか 1項に記載の試薬、キットまたは診断薬を製造するた めの（1)〜（5)の 、ずれか 1項に記載の抗体または抗体断片の使用。
(53) (6)または（7)に記載のハイプリドーマを培地に培養し、培養物中に（3)〜（5 )の 、ずれか 1項に記載のモノクローナル抗体または抗体断片を生成蓄積させ、培養 物から抗体または抗体断片を採取することを特徴とする（3)〜（5)の ヽずれか 1項に 記載のモノクローナル抗体または抗体断片の製造方法。
[0024] 以下、本発明を詳細に説明する。本願は、 2004年 12月 2日に出願された日本国 特許出願 2004— 350246号の優先権を主張するものであり、当該特許出願の明細 書および図面に記載される内容を包含する。
図面の簡単な説明 [0025] [図 1]図 1には、抗原として用いたヒト胎盤力も精製したヒト STSの SDS-ポリアクリルァ ミド電気泳動のクマシ一ブリリアント染色像を示した。左のレーンはヒト胎盤力も精製し たヒト STSを、右のレーンは分子量マーカーを示す。精製したヒト STSは矢印で示す
[図 2]図 2には、モノクローナル抗体の、バインディング ELISAにおけるヒト胎盤由来精 製ヒト STSに対する反応性を示した。左右のカラムはそれぞれ抗ヒト STSモノクロ一 ナル抗体 KM1049および抗ヒト STSモノクローナル抗体 KM1053での反応性を示す。 縦軸は 415nmでの吸光度を示す。黒塗りのカラムは、抗原としてヒト胎盤カゝら精製した ヒト STSを、白抜きのカラムは BSAを固相化した場合の結果を示す。
[0026] [図 3]図 3には、ウェスタンブロッテイングでの抗ヒト STSモノクローナル抗体 KM1049 および抗ヒト STSモノクローナル抗体 KM1053のヒト胎盤由来精製ヒト STSおよび大 腸菌発現ヒト STSとの反応性をそれぞれ示した。レーン 1は大腸菌発現のヒト STSを 、レーン 2はヒト胎盤由来精製ヒト STSをそれぞれ示す。
[図 4]図 4には、ヒト STS遺伝子導入細胞の ARS活性を示した。縦軸は単位蛋白質量 当たりの酵素活性を示す。 CDNA3-1はヒト STS遺伝子が含まれていないプラスミドを 導入したコントロール細胞の、 cs3-lはヒト STS遺伝子を導入した細胞の活性をそれ ぞれ示す。
[0027] [図 5]図 5には、免疫沈降法でのモノクローナル抗体とヒト STS遺伝子を導入した細胞 cs3-l細胞由来のヒト STSとの反応性を示す。レーン 1は、陰性対照であるモノクロ一 ナル抗体 KM1063で、レーン 2は抗ヒト STSモノクローナル抗体 KM1053で、レーン 3 は抗ヒト STSモノクローナル抗体 KM1049で免疫沈降を行った結果をそれぞれ示す。
[図 6]図 6には、免疫細胞染色（フローサイトメトリー）でのモノクローナル抗体とヒト ST S遺伝子導入細胞との反応性を示した。 白抜きのクロマトグラムは陰性対照であるモ ノクローナル抗体 KM1063を、黒塗りのクロマトグラムは抗ヒト STSモノクローナル抗体 KM1053を用いた場合の結果を示す。 Aにはヒト STS遺伝子が含まれて ヽな 、プラス ミドを導入したコントロール細胞 CDNA3-1細胞での、 Bにはヒト STS遺伝子を導入した 細胞 cs3-l細胞での結果を示した。
[0028] [図 7]図 7には、各種 ARS遺伝子導入細胞の ARS活性を示した。いずれの図も縦軸は 細胞当たりの ARS活性を示す。 V、ずれの図も左のカラムは陰性対照の各種 ARS遺伝 子を導入して ヽな 、細胞の ARS活性を、右のカラムは各種 ARS遺伝子を導入した細 胞の ARS活性をそれぞれ示す。 A〖こは ARS A遺伝子導入細胞の、 B〖こは ARS B遺伝 子導入細胞の、 C〖こは ARS D遺伝子導入細胞の、 D〖こは ARS E遺伝子導入細胞の、 Eには ARS F遺伝子導入細胞の結果を示す。
[図 8]図 8には、ウェスタンブロッテイングでの、モノクローナル抗体 KM1049との各種 A RS遺伝子導入細胞由来の ARSとの反応性を示す。レーン 1は ARS A、レーン 2は ARS B、レーン 3ίま ARS C、レーン 4ίま ARS D、レーン 5ίま ARS E、レーン 6ίま ARS Fをそれ ぞれ示す。
[0029] [図 9]図 9には、免疫沈降での、抗ヒト STSモノクローナル抗体 KM1053の各種 ARS遺 伝子導入細胞由来ヒト STSとの反応性を示した。レーン 1は ARS A、レーン 2は ARS B 、レーン 3は ARS C、レーン 4は ARS D、レーン 5は ARS E、レーン 6は ARS Fをそれぞ れ示す。
[図 10]図 10は、バインディング ELISAでの抗ヒト STSモノクローナル抗体 KM1049およ び抗ヒト STSモノクローナル抗体 KM1053の各種 ARSとの反応性を示した。 Aは、抗ヒ ト STSモノクローナル抗体 KM1049を用いた結果を、 Bは、抗ヒト STSモノクローナル 抗体 KM1053を用いた結果をそれぞれ示す。縦軸は 415應の吸光度を、横軸は抗体 濃度をそれそれ示す。參は動物細胞発現精製 ARS Cを、破線の▲は ARS Aを、國は ARS Bをそれぞれ示す。
[0030] [図 11]図 11には、抗ヒト STSモノクローナル抗体 KM1053とピオチン化抗ヒト STSモノ クローナル抗体 KM1049を用いたサンドイッチ ELISAによる動物細胞由来精製ヒト ST Sの検量曲線を示した。横軸は蛋白質濃度、縦軸は 415應の吸光度をそれぞれ示す 。參は動物細胞発現精製ヒト STSを、破線の△は陰性対照である組換え精製 IL-1 β をそれぞれ示す。
発明を実施するための最良の形態
[0031] 本発明は、ヒト STSに特異的に結合し、ヒト STS以外の ARSに結合しない抗体に関 する。
ヒト STS以外の ARSとしては、 ARSの A、 B、 D、 Eおよび Fがあげられる。本発明のヒト STSと特異的に結合し、ヒト STS以外の ARSに結合しない抗体としては、ヒト STS (AR S C)に特異的に結合し、 ARSの A、 B、 D、 Eおよび Fには結合しない抗体などがあげ られる。
[0032] 本発明の抗体としては、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体などがあげられる 力 好ましくはモノクローナル抗体があげられる。
ポリクローナル抗体としては、免疫を施された動物の抗血清、または該抗血清から 精製されたポリクローナル抗体をあげることができる。本発明のポリクローナル抗体と しては、ヒト STSと特異的に結合し、 STS以外の ARSに交叉反応性を示さないポリク ローナル抗体であればいかなるものも包含される力 具体的には、ヒト以外の哺乳動 物にヒト STSを免疫して、その動物の血清を採取し、ヒト STS以外の ARSである ARS の A、 B、 D、 Eおよび Fに反応性を示す画分を除去した画分を公知のァフィユティー精 製法により、調製したポリクローナル抗体などがあげられる。ヒト以外の哺乳動物とし ては、例えば、マウス、ラット、ノヽムスター、モルモット、ゥサギ、ャギ、ゥマ、ゥシ、ヒッ ジ、ャギ、ブタ、 -ヮトリなどがあげられる。
[0033] モノクローナル抗体としては、ノ、イブリドーマにより生産された抗体または抗体断片 、あるいは抗体遺伝子を含む発現ベクターで形質転換した形質転換体により生産さ れる遺伝子組換え抗体または抗体断片をあげることができる。
本発明のモノクローナル抗体の具体例としては、ハイプリドーマ細胞株 KM1053が 生産する抗ヒト STSモノクローナル抗体 KM1053をあげることができる。ハイプリドーマ 細胞株 KM1053は平成 16年 4月 27日付でブタペスト条約に基づき独立行政法人産業 技術総合研究所 特許生物寄託センター（日本国 茨城県つくば巿東 1丁目 1番地 1 中央第 6)〖こ FERM BP-10015として寄託されている。
[0034] また、本発明のモノクローナル抗体としては、上記のハイプリドーマ細胞株 KM1053
(FERM BP-10015)により生産されるモノクローナル抗体が結合するェピトープと同一 のェピトープに結合するモノクローナル抗体なども包含される。
遺伝子組換え抗体は、上記本発明のモノクローナル抗体を遺伝子組換え技術を用 いて改変したものである。遺伝子組換え抗体としては、ヒト型キメラ抗体、ヒト化抗体、 ヒト抗体または抗体断片など、遺伝子組換えにより製造される抗体などがあげられる。 本発明の遺伝子組換え抗体をしては、遺伝子組換え抗体において、モノクローナル 抗体の特徴を保持して ヽる抗体があげられる。
[0035] ヒト型キメラ抗体は、ヒト以外の動物の抗体の抗体重鎖 (以下、 H鎖と表記する) V領 域 (以下、抗体重鎖可変領域を VHと表記する）、および抗体軽鎖 (L鎖と表記する) V 領域 (以下、抗体可変領域軽鎖を VLと表記する）と、ヒト抗体の重鎖定常領域 (以下 、 CHと表記する）またはヒト抗体の軽鎖定常領域 (以下、 CLと表記する）とからなる抗 体を意味する。
[0036] 本発明のヒト型キメラ抗体は、本発明のモノクローナル抗体を生産するハイプリドー マから、 VHおよび VLをコードする cDNAを取得し、ヒト抗体 CHおよびヒト抗体 CLをコ ードする遺伝子を有する動物細胞用発現ベクターに挿入したヒト型キメラ抗体発現べ クタ一を構築し、動物細胞へ導入することにより発現させ製造することができる。 本発明のヒト型キメラ抗体の構造としては、いずれのィムノグロブリン (Ig)クラスに属 するものでもよいが、 IgG型、さらには IgG型に属する IgGl、 IgG2、 IgG3、 IgG4などのィ ムノグロブリンの C領域が好まし 、。
[0037] ヒト化抗体は、ヒト型相補性決定領域（complementarity determining region;以下、 CDRと表記する）移植抗体または新形態抗体 (reshaped antibody)などとも呼ばれる。 ヒト化抗体は、本発明のモノクローナル抗体の VHおよび VLの CDR配列で任意のヒ ト抗体の VHおよび VLの CDR配列をそれぞれ置換した V領域をコードする遺伝子を構 築し、ヒト抗体の CHおよびヒト抗体の CLをコードする遺伝子を有する動物細胞用発 現ベクターにそれぞれ導入し、発現させること〖こより製造することができる。
[0038] 本発明のヒト化抗体の C領域の構造としては、 V、ずれのィムノグロブリン (Ig)クラスに 属するものでもよいが、 IgG型、さらには IgG型に属する IgGl、 IgG2、 IgG3、 IgG4などの ィムノグロブリンの C領域が好まし 、。
ヒト抗体は、元来、ヒト体内に天然に存在する抗体を意味するが、最近の遺伝子ェ 学的、細胞工学的、発生工学的な技術の進歩により作製されたヒト抗体ファージライ ブラリー、およびヒト抗体産生トランスジエニック動物力 得られる抗体なども包含する
[0039] ヒト体内に存在する抗体は、例えば、ヒト抗体を産生するヒト末梢血リンパ球を単離 し、 EBウィルスなどを感染させて不死化、単一クローンィ匕することにより、該抗体を産 生するリンパ球を抗体再生細胞として培養することができ、培養物中より該抗体を精 製することができる。
ヒト抗体ファージライブラリ一は、 B細胞またはリンパ球などのヒト抗体産生細胞から 調製した抗体 cDNAをファージベクター中に挿入することにより、 Fab、 scFvなどの抗 体断片をファージ表面に発現させたライブラリーのことをいう。該ライブラリーより、抗 原を固定化した基質に対する結合活性を指標として所望の抗原結合活性を有する 抗体断片を発現しているファージを回収することができる。該抗体断片は、さらに遺 伝子工学的手法を用いて、 2本の完全な H鎖および 2本の完全な L鎖力 なるヒト抗体 分子に変換することも可能である。
[0040] ヒト抗体産生トランスジエニック動物は、ヒト抗体遺伝子がゲノム内に組み込まれた 動物を意味する。具体的には、マウス ES細胞ヘヒト抗体遺伝子を導入し、該 ES細胞 を他のマウス初期胚へ移植後、発生させることによりヒト抗体産生トランスジエニック動 物を創製することができる。ヒト抗体産生トランスジエニック動物力ものヒト抗体の作製 方法は、通常のヒト以外の哺乳動物で行われているハイプリドーマ作製方法によりヒト 抗体産生ハイプリドーマを取得し、培養することで培養物中より該抗体を精製すること ができる。
[0041] 本発明の抗体断片としては、抗体を適当なぺプチダーゼで消化して得られる抗体 断片または遺伝子組換えにより作製される抗体断片があげられる。抗体断片は、 Fab (Fragment of antigen bindingノ、 Fab、 F、abノ 2、一本鋇抗体 (Single chain Fv; 下、 s cFvと称す） [Science, 242, 423 (1988)]、 2量体化可変領域（Diabodyとも称す） [Natur e BiotechnoL, 15, 629 (1997)]、およびジスルフイド安定化 V領域断片（disulfide stabi lized Fv;以下、 dsFvと称す） [Molecular Immunol, 32, 249 (1995)]などが包含される 。また、抗体断片としては、上記 VHおよび VLの CDRのアミノ酸配列を含むペプチド（ 以下、 CDRを含むペプチドと表記する） [J. Biol. Chem., 271, 2966 (1996)]も包含す る。あるいは、 VHと VLをジスルフイド結合によって一体ィ匕せず、それぞれ別の分子（ それぞれ VH分子、 VL分子として表記する)として発現させたもの [Nature Biotechnolo gy, 14, 1714 (1996)]も抗体断片として包含する。 [0042] Fabは、 IgGのヒンジ領域で 2本の H鎖を架橋している 2つのジスルフイド結合の上部 のペプチド部分を酵素パパインで切断して得られる H鎖の N末端側半分と、 L鎖全体 で構成される分子量約 3万の抗原結合活性を有する抗体断片である。
本発明の Fabは、本発明のモノクローナル抗体を酵素ノ パインで処理して取得する ことができる。または、該抗体の Fab断片をコードする DNAを原核生物発現ベクターあ るいは真核生物発現ベクターに挿入し、該ベクターを原核生物あるいは真核生物に 導入することにより発現させ、 Fabを製造することができる。
[0043] Fab'は、下記 F(ab')2のヒンジ間のジスルフイド結合を切断して得られる分子量約 5 万の抗原結合活性を有する抗体断片である。
本発明の Fa は、本発明のモノクローナル抗体の F(a ） 2を還元剤ジチオスレイト ール処理して得ることができる。また、該抗体の Fa 断片をコードする DNAを原核生 物発現ベクターあるいは真核生物発現ベクターに挿入し、該ベクターを原核生物あ るいは真核生物に導入することにより発現させ、 Fab'を製造することもできる。
[0044] F(ab')2は、 IgGのヒンジ領域の 2対のジスルフイド結合の下部を酵素トリプシンで処 理して得ることができる、 2つの Fab領域力ヒンジ部分で結合した分子量約 10万の抗 原結合活性を有する抗体断片である。
本発明の F(ab')2は、本発明のモノクローナル抗体を還元剤ジチオスレィトール処理 して得ることができる。または、該抗体の F(ab')2断片をコードする DNAを原核生物発 現ベクターある 、は真核生物発現ベクターに挿入し、該ベクターを原核生物ある ヽ は真核生物に導入することにより発現させ、 F(ab')2を製造することができる。
[0045] scFvは、一本の VHと一本の VLとを適当なペプチドリンカ一（以下、 Pと表記する）を 用いて連結した、 VH- P-VLないしは VL-P-VHポリペプチドに示される。本発明で使 用される scFvに含まれる VHおよび VLは、本発明のモノクローナル抗体のいずれのも のも用いることができる。
本発明の scFVは、本発明のモノクローナル抗体から、 VHならびに VLを cDNAを取 得し、該抗体の scFv断片をコードする DNAを原核生物発現ベクターあるいは真核生 物発現ベクターに挿入し、該ベクターを原核生物あるいは真核生物に導入すること により発現させ、 scFvを製造することができる。 [0046] Diabodyは、抗原結合特異性の同じまたは異なる scFvが 2量体を形成した抗体断片 で、同じ抗原に対する 2価の抗原結合活性、または異なる抗原に対する 2特異的な 抗原結合活性を有する抗体断片である。
本発明の Diabodyは、本発明のモノクローナル抗体から、 VHならびに VLを cDNAを 取得し、該抗体の Diabody断片をコードする DNAを原核生物発現ベクターある 、は真 核生物発現ベクターに挿入し、該ベクターを原核生物あるいは真核生物に導入する ことにより発現させ、 Diabodyを製造することができる。
[0047] dsFvは、 VHおよび VL中のそれぞれ 1アミノ酸残基をシスティン残基に置換したポリ ペプチドをジスルフイド結合により結合させたものである。システィン残基に置換する アミノ酸残基は Reiterらに示された方法 [Protein Engineering, 7, 697 (1994)]に従つ て、抗体の立体構造予測に基づいて選択することができる。本発明の dsFvに含まれ る VHならびに VLは、本発明のモノクローナル抗体のいずれのものも用いることができ る。
[0048] 本発明の dsFvは、本発明のモノクローナル抗体から、 VHならびに VLを cDNAを取 得し、該抗体の dsFv断片をコードする DNAを原核生物発現ベクターあるいは真核生 物発現ベクターに挿入し、該ベクターを原核生物あるいは真核生物に導入すること により発現させ、 dsFvを製造することができる。
CDRを含むペプチドは、 VHまたは VLの CDRの少なくとも 1領域以上を含んで構成 される。複数の CDRを含むペプチドは、直接または適当なペプチドリンカ一を介して 結合させること〖こよって製造することができる。
[0049] VH分子と VL分子は、本発明のモノクローナル抗体の生産ハイプリドーマから調製 された mRNAから cDNAを合成し、 VHまたは VLを含む遺伝子断片をそれぞれ、 PCR などの方法でクローユングし、これを適当な発現ベクターと宿主の組み合わせで発現 することによって製造することができる。ヒト STS分子との親和性のょ 、分子を得るた めに、該発現ベクターをファージ発現ベクター、宿主を大腸菌とすることも好ましい態 様と言える。 VH分子と VL分子を所望の蛋白質との融合蛋白質として発現し製造する ことちでさる。
[0050] 本発明の CDRを含むペプチドは、本発明のモノクローナル抗体から、 VHならびに V Lを cDNAを取得し、該抗体の CDRを含むペプチドをコードする DNAを原核生物発現 ベクターある 、は真核生物発現ベクターに挿入し、該ベクターを原核生物あるいは 真核生物に導入することにより発現させ、 CDRを含むペプチドを製造することができ る。また、 CDRを含むペプチドは、 Fmoc法（フルォレメチルォキシカルボ-ル法）、 tBo c法 (t_プチルォキシカルボ-ル法)などの化学合成法よつて製造することもできる。
[0051] 本発明のモノクローナル抗体または抗体断片は、該抗体または抗体断片に放射性 同位元素、蛋白質、または薬剤などをィ匕学的に、あるいは遺伝子工学的に導入また は結合させた抗体の誘導体を包含する。
本発明の抗体の誘導体は、本発明のモノクローナル抗体または抗体断片の H鎖あ るいは L鎖の、 N末端側あるいは C末端側、さらには抗体あるいは抗体断片中の適当 な置換基あるいは側鎖、さらには抗体または抗体断片中の糖鎖に放射性同位元素、 蛋白質、または薬剤などをィ匕学的に結合させることにより製造することができる [抗体 工学入門、金光修著、（株)地人書館（1994)]。
[0052] または、抗ヒト STS抗体または抗体断片をコードする DNAと、結合させた 、蛋白質 をコードする DNAを連結させた DNAを原核生物発現ベクターあるいは真核生物発現 ベクターに挿入し、該ベクターを原核生物あるいは真核生物に導入することにより発 現させて遺伝子工学的に製造することができる。
薬剤としては、放射線同位元素、蛋白質、低分子などいかなるものでもよい。
[0053] 本発明の抗体の誘導体を検出方法、定量方法、検出試薬、定量試薬または診断 薬として使用する場合の薬剤としては、通常の免疫学的測定法で用いられる標識体 があげられる。標識体としては、放射性同位元素、アルカリフォスファターゼ、ペルォ キシダーゼ、ルシフェラーゼなどの酵素、アタリジ-ゥムエステル、口フィンなどの発光 物質、フルォレツセインイソチオシアナート (FITC)、ローダミンイソチオシアナ一 HRIT C)などの蛍光物質などがあげられる。また、薬剤として、ピオチンなどの物質も標識 体として用いることが可能である。該物質は、放射性同位元素、アルカリフォスファタ ーゼ、ペルォキシダーゼ、ルシフェラーゼなどの酵素、アタリジ-ゥムエステル、ロフィ ンなどの発光物質、 FITC、 RITCなどの蛍光物質などが結合された、例えばアビジン などの、該物質に特異的かつ高親和性をもって結合しうる 2次標識物質を使用可能 せしめる物質である。
[0054] また、本発明は上記の本発明の抗体または抗体断片を用いる検体中のヒト STSを 、免疫学的検出方法または免疫学的定量方法に関する。免疫学的検出方法または 免疫学的定量方法としては、蛍光抗体法、免疫酵素抗体法 (ELISA)、放射性物質標 識免疫抗体法 (RIA)などの免疫学的測定法、免疫細胞染色法、免疫組織染色法など の免疫化学染色法、ウェスタンブロッテイング法、ドットブロッテイング法、免疫沈降法 [ 単クローン抗体実験マニュアル、講談社サイエンティフィック（1987)、続生化学実験 講座 5免疫生化学研究法、東京化学同人（1986)]などがあげられる。
[0055] 免疫学的測定法としては、任意の公知の免疫学的測定方法があげられる。
上述のように、免疫学的測定法は標識方法の違いにより、放射免疫測定法 (RIA)、 酵素免疫測定法 (EIAまたは ELISA)、蛍光免疫測定法 (FIA)、発光免疫測定法 (lumi nescent immunoassay)、物理化学的検出法（TIA、 LAPIA、 PCIA)などがあげられるが 、好ましくは酵素免疫測定法があげられる。
[0056] 酵素免疫測定法で用いる標識体としては、任意の公知 (石川榮次ら編、酵素免疫 測定法、医学書院）の酵素を用いることができる。例えば、アルカリフォスファターゼ、 ペルォキシダーゼ、ルシフェラーゼなどを用いることができる。
発光免疫測定法で用いる標識体としては、任意の公知 [今井一洋編、生物発光と 化学発光、廣川書店；臨床検査 42 (1998)]の発光物質を用いることができる。例えば 、アタリジ-ゥムおよびその誘導体、ルテニウム錯体ィ匕合物、口フィンなどを用いること ができる。ルテニウム錯体化合物としては、例えば Clin. Chem. 37, 1534 (1991)など に記載されたものが好ましい。該化合物は電子供与体と共に電気化学的に発光する
[0057] 蛍光免疫測定法で用いる標識体としては、任意の公知 (川生明著、蛍光抗体法、ソ フトサイエンス社製)の蛍光物質を用いることができる。例えば、 FITC、 RITCなどを用 いることができる。その他の蛍光物質として、例えば quantum dot [Science, 281, 2016 (1998)]があげられる。または、フィコエリスリンなどのフィコピリ蛋白質、 GFP(Green flu orescent Protein)ある!/ヽはこれの類縁蛋白質のように蛍光を発する蛋白質であっても よい。 [0058] 免疫学的測定法とは、上述した各種標識を施した抗原または抗体を用いて、抗体 量または抗原量を測定する方法である。本発明の免疫学的測定法としては、抗原の 検出または測定を行う方法であればいかなる方法でもよい。例えば、競合法、サンド イッチ法 [免疫学イラストレイテッド 第 5版、南光堂]があげられるが、サンドイッチ法 が好ましい。
サンドイッチ法は、固相に第一の抗体を結合させた後、測定したい抗原をトラップさ せ、標識した第二の抗体を反応させる方法である。サンドイッチ法に用いる抗体とし ては、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体のいずれを用いてもよぐ上述した Fa b、 Fab'、 F(ab)2などの抗体断片を用いてもよい。サンドイッチ法で用いる 2種類の抗 体の組み合わせとしては、異なるェピトープを認識する抗体あるいは抗体断片の組 み合わせでもよ!/、し、ポリクローナル抗体とモノクローナル抗体あるいは抗体断片の 組み合わせでもよい。具体的には、本発明のモノクローナル抗体の一例である抗ヒト STSモノクローナル抗体 KM1053および公知の抗ヒト STSモノクローナル抗体 KM104 9 [Cancer Research, 63, 2762 (2003)]の組み合わせなどがあげられる。
[0059] 蛍光抗体法とは、ヒト STSを含むと考えられる検体に、本発明の抗体または抗体断 片を反応させ、さらに FITCなどの蛍光物質でラベルした抗マウスィムノグロブリン (Ig) 抗体またはィムノグロブリン G (IgG)抗体ある!/ヽは抗体断片を反応させた後、蛍光色 素をフローサイトメトリーまたは蛍光顕微鏡などで測定する方法である。該方法は、蛍 光物質で直接的に本発明の抗体または抗体断片を標識した誘導体も使用可能であ り、また、ピオチンなどで該抗体または抗体断片で標識した誘導体を反応せしめ、次 にまたは同時に、蛍光物質で標識された 2次標識物質を反応させた後、蛍光色素を フローサイトメトリーまたは蛍光顕微鏡などで測定する方法であってもよい。
[0060] 蛍光物質の代わりにアタリジ-ゥムエステル、口フィンなどの発光物質を使用して上 記の方法を実施することも可能である。この場合、測定器は発光測定器を用いること ができる。
免疫酵素抗体法とは、ヒト STSを含むと考えられる検体に、本発明の抗体または抗 体断片を反応させ、さらにペルォキシダーゼなどの酵素標識を施した抗マウス Ig抗体 または IgG抗体あるいは抗体断片を反応させた後、酵素の基質が酵素反応の結果色 原体を生ずる物質であった場合には、その色素呈色反応を吸光光度計などで測定 する方法である。該方法は、酵素で直接的に本発明の抗体または抗体断片を標識し た誘導体も使用可能であり、また、ピオチンなどで該抗体または抗体断片で標識した 誘導体を反応せしめ、次にまたは同時に、酵素で標識された 2次標識物質を反応さ せた後、色素呈色反応を吸光光度計などで測定する方法であってもよい。
[0061] また、酵素の基質が酵素反応の結果、化学発光を呈する物質であった場合には、 該発光を発光測定器で測定することも可能である。酵素により化学発光を呈する化 合物としては、パーォキシダーゼの基質として、例えばルミノール化合物、ルシゲ- ン化合物などがあげられる。あるいはアルカリフォスファタ一ゼの基質として、例えば 3 -(2 — aaamantyl)— 4— methoxy— 4— (3' -phosphoryloxy) pheny卜 1,2— dioxetane 、ァグリ ジ-ゥムのリン酸誘導体である APS2, APS3, APS5など [以上 Lumigen Incの発光化合 物、 H. Akhavan- Tafti, Z. Arghavani et al、 John Wiley and Sons, Chichester, 497 (19 97)]があげられる。あるいはルシフェラーゼの基質としてルシフェリン、セレンテラジン などがあげられる。
[0062] 放射性物質標識免疫抗体法 (RIA)とは、ヒト STSを含むと考えられる検体に、本発 明の抗体または抗体断片を反応させ、さらに放射性物質標識を施した抗マウス Ig抗 体または IgG抗体ある ヽは抗体断片を反応させた後、シンチレーシヨンカウンターなど で測定する方法である。該方法は、放射性物質で直接的に本発明の抗体または抗 体断片を標識した誘導体も使用可能であり、また、ピオチンなどで該抗体または抗体 断片で標識した誘導体を反応せしめ、次にまたは同時に、放射性物質で標識された 2次標識物質をを反応させた後、シンチレーシヨンカウンターなどで測定する方法で あってもよい。
[0063] 免疫化学染色法とは、ヒト STSまたはヒト STSを発現した微生物、動物細胞ある!/、 は昆虫細胞に、本発明の抗体を反応させ、さらに FITCなどの蛍光物質、ペルォキシ ダーゼ、ピオチンなどの酵素標識を施した本発明の抗体ある ヽは抗体断片を反応さ せた後、顕微鏡またはフローサイトメトリーなどを用いて観察する方法である。
免疫細胞染色法は、ヒトまたは動物の生体組織など力 採取した細胞または微生 物、ヒトまたは動物あるいは昆虫などに由来する培養細胞などに、本発明の抗体また は抗体断片を結合させた後、フローサイトメトリーなど単一細胞の抗体の結合量また は結合状態を解析する手技を用いて、ヒト STSの発現を解析する方法である。免疫 細胞染色法は、上記の細胞をスライドガラス上に直接固着またはスライドガラス上で 培養した後、本発明の抗体または抗体断片を反応させた後、該細胞に含まれるヒト S TSの発現を顕微鏡またはカメラなどを用いて観察または定量する方法も包含する。 また、免疫細胞染色法は、上記の細胞を固定液を用いて固定ィ匕した後または固定ィ匕 せず、ァガロースなどにて凝塊を作製し、その後、該凝塊を凍結またはパラフィンへ 包埋し、該組織片を切片へスライスし、該切片をガラスなどのスライドガラスに固着せ しめ、上記と同様の処置によってヒト STSの発現を顕微鏡またはカメラなどを用いて 観察または定量する方法であってもよ 、。
[0064] 免疫組織染色法は、ヒトまたは動物の生体組織力ゝら採取した組織片などを、ホルマ リンやエタノールなどの固定液を用いて固定ィ匕した後または固定せず、該組織片を 凍結またはパラフィンへ包埋し、該組織片から組織切片を調製し、該組織切片をガラ スなどのスライドガラスに固着せしめ、脱パラフィンなどの不要物を除く処理、さらに必 要に応じて抗原と抗体の反応性を向上させる処理を施した後、本発明の抗体または 抗体断片で反応させた後、組織切片に含まれるヒト STSの発現を顕微鏡またはカメ ラなどを用いて観察または定量する方法である。
[0065] 上記免疫染色法にお!、て、蛍光物質、発光物質、酵素、放射性物質標識抗体を 用いた免疫染色法が可能であり、それぞれの標識に適した上述の免疫学的測定法 と同様の手技によって検出または測定が可能である。
ウェスタンブロッテイング法とは、ヒト STSまたはヒト STSを発現した微生物、動物細 胞あるいは昆虫細胞などの細胞抽出液などを SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動 [A ntioodies-A Laboratory Manual, Cold bpnng Haroor Laboratory (1988)]で分 [≤fしに 後、分画した蛋白質群をゲルカゝら PVDF膜あるいは-トロセルロース膜にブロッテイン グし、該膜に本発明の抗体または抗体断片を反応させ、さらに FITCなどの蛍光物質 、ペルォキシダーゼ、ピオチンなどの酵素標識を施した、本発明の抗体に結合できる 二次抗体抗体または抗体断片を反応させた後、確認する方法である。
[0066] ドットブロッテイング法とは、ヒト STSまたはヒト STSを発現した微生物、動物細胞あ るいは昆虫細胞の細胞抽出液などを-トロセルロース膜にブロッテイングし、該膜に 本発明の抗体を反応させ、さらに FITCなどの蛍光物質、ペルォキシダーゼ、ビォチ ンなどの酵素標識を施した、本発明の抗体に結合できる二次抗体抗体または抗体断 片を反応させた後、確認する方法である。
[0067] 免疫沈降法とは、ヒト STSまたはヒト STSを発現した微生物、動物細胞あるいは昆 虫細胞の細胞抽出液を本発明の抗体または抗体断片と反応させた後、プロテイン G- セファロースなどのィムノグロブリンに特異的な結合能を有する担体をカ卩えて抗原抗 体複合体を沈降させる方法である。
以下に、本発明の抗体の作製方法、並びに該抗体の利用方法を詳細に説明する
1.本発明の抗体の作製
[0068] 本発明の抗体は例えば、以下のようにして作製することができる。
(1)抗原の調製
ヒト STSをコードする cDNAを含む発現ベクターを大腸菌、酵母、昆虫細胞、動物細 胞などに導入して組換えヒト STSを得る。免疫原である組換え蛋白質の C末又は N末 にタグ蛋白質を融合させた融合蛋白質を免疫原として用いることもできる。ここで、「タ グ蛋白質」とは、目的蛋白質のァフィユティー精製により分離を容易に行うためやそ の他、目的蛋白質の挙動を追跡するためなどの目的で、所望の蛋白質の末端に余 分に付加する蛋白質をいう。タグ蛋白質としては、ダルタチオン- S-トランスフェラーゼ (GST)、プロテイン A、 j8 -ガラクトシダーゼ、マルトース—バインディングプロテイン（ MBP)などがあげられる。あるいは、胎盤などの STSを多量に発現しているヒト糸且織か らヒト STSを精製し、抗原に用いることもできる。また、ヒト STS部分配列を有する合成 ペプチドを抗原に用いることもできる。
[0069] 例えば、ヒト胎盤組織からのヒト STSの精製は以下のように行う。操作は全て 4°Cで 行う。胎盤組織は細断後バッファー A[0.25mol/Lサッカロース、 5mmol/L EDTAで含 む、 10mmol/Lトリス-酢酸緩衝液 (pHLO) ]中でホモジネートを調製する。 10000 X gで 20分間遠心分離して得られた上清を、さらに 105000 X gで 1時間遠心分離して得られ た沈殿をミクロソーム画分とする。得られたミクロソーム画分はバッファー B[lmmol/L EDTA、 lmmol/Lジチォエリスレイトール（Dithioerythreitol; DTE)、 0.05%フエ-ルメ チルスルフォ-ルフルォロイド (phenylmethansulfonylfluoride; PMSF)、 0.5%トリトン X— 1 00を含む lOmmol/Lトリス-塩酸緩衝液 (pH7.5) ]を加えて室温 1時間攪拌し、可溶ィ匕 する。 105000 X gで 1時間遠心分離して不溶性画分を除く。得られた上清をバッファ 一 B (pH8.0)で平衡化した PBE94カラムに通塔し、 2倍容量の同バッファ一にて洗浄 後、ノ ッファー C [lmmol/L EDTA、 lmmol/L DTE、 0.05% PMSF、 0.5%トリトン X— 100を 含む、 12.5% polybuffer74 (pH4.0) ]で溶出する。さらに溶出画分はバッファー Bで平 衡化したフエ-ルセファロースカラムに通塔し、充分量の同バッファーで洗浄後 1.25% トリトン X- 100を加えた同ノ ッファーで溶出し、溶出画分を精製ヒト STSとして用いる 。この様にして得られたヒト STSは、以下の抗体産生細胞を作製する際の抗原として の使用できる以外に、ヒト STSの検出方法または定量方法において、標準物質として 使用することちできる。
[0070] (2)動物の免疫と抗体産生細胞の調製
3〜20週令のマウス、ラットまたはハムスターに上記（1)に記載の方法で調製した抗 原を免疫して、その動物の脾、リンパ節、末梢血中の抗体産生細胞を採取する。 免疫は、動物の皮下あるいは静脈内あるいは腹腔内に、適当なアジュバント〔例え ば、フロインドの完全アジュバント（Complete Freund' s Adjuvant)や水酸化アルミ-ゥ ムゲルと百日咳菌ワクチンなど〕とともに抗原を投与することにより行う。抗原が部分べ プチドである場合には、ゥシ血清アルブミン (以下、 BSAと略記する）やキーホーリンブ トへモシァ-ン（Keyhole Limpet hemocyanin;以下、 KLHと略記する）などのキャリア 蛋白質とコンジュゲートを作製し、これを免疫原として用いる。
[0071] 抗原の投与は、 1回目の投与の後 1〜2週間おきに 5〜10回行う。各投与後 3〜7日 目に眼底静脈叢より採血し、その血清が抗原と反応することを酵素免疫測定法〔Anti bodies - A Laboratory Manual, Cold bpnng Haroor Laboratory (1988)〕なと（？調べる 。免疫に用いた抗原に対し、その血清が十分な抗体価を示したマウス、ラットまたは ハムスターを抗体産生細胞の供給源とする。
[0072] 抗体産生細胞と骨髄腫細胞の融合に供するにあたって、抗原の最終投与後 3〜7 日目に、免疫したマウス、ラットまたはハムスターより脾臓などを摘出し、脾細胞を採 取する。脾臓を MEM培地（日水製薬社製）中で細断し、ピンセットでほぐし、遠心分 離（1200rpm、 5分間）した後、上清を捨て、トリス一塩ィ匕アンモ-ゥム緩衝液 (pH7.65) で 1〜2分間処理し赤血球を除去し、 MEM培地で 3回洗浄して抗体産生細胞として提 供する。
[0073] (3)骨髄腫細胞の調製
骨髄腫細胞としては、マウスから得られた株化細胞を使用する。たとえば、 8-ァザグ ァニン耐性マウス（BALB/c由来）骨髄腫細胞株 P3- X63Ag8- Ul (P3- Ul) [Current T opics in Microbiology and Immunology, 18, 1 (1978)]、 P3— NSl/1— Ag41 (NS— 1) [Eur opean J. Immunology, 6, 511 (1976)]、 SP2/0 - Agl4 (SP- 2) [Nature, 276, 269 (19 78)]、 P3— X63— Ag8653 (653) [ J. Immunology ,123, 1548 (1979)]、 P3— X63— Ag8 (X63) ( Nature, 256:495-497, 1975)などが用いられる。これらの細胞株は、 8-ァザグァニン 培地〔RPMI- 1640培地にグルタミン（1.5mmol/L)、 2-メルカプトエタノール（5 X 10"5mo 1/L)、ジェンタマイシン（10 μ g/mL) および牛胎児血清（FCS)をカ卩えた培地（以下、 正常培地という。 )に、さらに 8-ァザグァニン（15 g/mL)をカ卩えた培地〕で継代する 力 細胞融合の 3〜4日前に正常培地に継代し、融合当日 2 X 107個以上の細胞数を 確保する。
[0074] (4)細胞融合
上記（2)で免疫した抗体産生細胞と上記（3)で得られた骨髄腫細胞を MEM培地ま たは PBS (リン酸ニナトリウム 1.83g、リン酸一カリウム 0.21g、食塩 7.65g、蒸留水 1リット ル、 pH7.2)でよく洗浄し、細胞数が、抗体産生細胞:骨髄腫細胞 = 5〜10 : 1になるよ う混合し、遠心分離（1200rpm、 5分間）した後、上清を捨て、沈澱した細胞群をよくほ ぐした後、攪拌しながら、 37°Cで、ポリエチレングライコール -1000 (PEG-1000) 2g、 M EM 2mLおよびジメチルスルホキシド 0.7mLの混液を 108個の抗体産生細胞当たり 0. 2〜lmLをカ卩え、 1〜2分間毎に MEM培地 l〜2mLを数回加えた後、 MEM培地をカロえ て全量が 50mLになるようにする。遠心分離 (900rpm、 5分間）後、上清を捨て、ゆるや かに細胞をほぐした後、メスピペットによる吸込み、吹出しでゆるやかに細胞を HAT培 地〔正常培地にヒポキサンチン（10— 4mol/L)、チミジン（1.5 X 10— 5mol/L)およびァミノ プテリン (4 X 10"7mol/L)をカ卩えた培地〕 lOOmL中に懸濁する。この懸濁液を 96穴培養 用プレートに 100 μ L/穴ずつ分注し、 5%COインキュベータ一中、 37°Cで 7〜14日間
2
培養する。
[0075] 培養後、培養上清の一部をとり後述 (6)の酵素免疫測定法などにより、ヒト STSに 結合し、ヒト STSを含まな 、抗原および STS以外の ARSに結合しな 、ものを選択する 。ついで、限界希釈法によりクローユングを 2回繰り返し〔1回目は、 HT培地（HAT培 地力もアミノプテリンを除いた培地）、 2回目は、正常培地を使用する〕、安定して強い 抗体価の認められたものを抗ヒト STSモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ株として 選択する。
[0076] (5)モノクローナル抗体の調製
プリスタン処理〔2,6,10,14-テトラメチルぺンタデカン(Pristane) 0.5mLを腹腔内投与 し、 2週間飼育する〕した 8〜10週令のマウスまたはヌードマウスに、（4)で得られた抗 ヒト STSモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ細胞 2 X 106〜5 X 107細胞 Z匹を腹腔 内注射する。 10〜21日でノヽイブリドーマは腹水癌化する。このマウス力も腹水を採取 し、遠心分離 (3000rpm、 5分間）して固形分を除去後、 40〜50%硫酸アンモ-ゥムで 塩析した後、力プリル酸沈殿法、 DEAE-セファロースカラム、プロテイン A-カラムある いはゲル濾過カラムによる精製を行ない、 IgGあるいは、 IgM画分^^め、精製モノク ローナル抗体とする。
抗体のサブクラスの決定は、サブクラスタイピングキットを用いて酵素免疫測定法に より行う。蛋白質量の定量は、ローリー法または 280應での吸光度より算出する。
[0077] (6)酵素免疫測定法 (バインディング ELISA)
抗原としては、精製された組換えヒト STS、ヒト胎盤など力も得られた精製ヒト STSあ るいはヒト STS部分ペプチドを用いる。抗原が部分ペプチドである場合には、 BSAや KLHなどのキャリア蛋白質とコンジュゲートを作製して、これを用いる。
[0078] これらを 96穴の EIA用プレートに 1〜50 μ g/mLで 10〜100 μ L/穴ずつ分注し、 4°C でー晚放置してプレートにコートする。次いで、 1%BSAを含む PBS溶液（以下、 BSA- P BSと記す）を 100〜200 L/穴分注し、室温で 1〜2時間または、 4°Cで 1〜2晚放置し て、プレート上に残った蛋白質との結合残基をブロック (ブロッキング)する。その後、 BSA-PBSを捨て、 PBSでよく洗浄した後、第一抗体として被免疫動物血清、本発明の モノクローナル抗体のハイプリドーマ培養上清もしくは精製抗体 1〜： 10 μ g/mLを 20〜 100 μ L/穴で分注し、室温で 2〜3時間または、 4°Cでー晚放置する。 PBSまたは、 0.0 5%トウィーン 20を含む PBS (以下、 Tween-PBSと記す)で、よく洗浄した後、第二抗体と してピオチン、酵素、化学発光物質あるいは放射線ィ匕合物などで標識した抗ィムノグ ロブリン抗体 1〜50 μ g/mLを 50〜100 μ L/穴ずつ分注し、室温 1〜2時間反応させる 。 Tween-PBSでよく洗浄した後、第二抗体の標識物質に応じた反応を行う。
[0079] 2.本発明の抗体の利用
本発明の抗体は、免疫学的手法を用いて、検体中に含まれるヒト STSまたはヒト ST Sを発現した微生物、動物細胞あるいは昆虫細胞などを検出または定量することがで きる。免疫学的手法としては、任意の公知の免疫学的測定法などが用いられるが、 本発明の免疫学的測定法としては、ウェスタンブロッテイング、免疫沈降法、免疫細 胞染色、免疫組織染色またはサンドイッチ ELISA法などが好適に用いられる。
[0080] 検体としては、例えばヒト由来の生体試料、ヒト STSを発現すると考えられる微生物 、動物あるいは昆虫などに由来する細胞または組織などがあげられるが、ヒト由来の 生体試料が好ましい。
ヒト由来の生体試料としては、ヒト STSが関連する疾患に羅患したことが疑われるヒ ト個体力 採取した生体試料などがあげられる。生体試料としては、具体的には、疾 患部位の組織または細胞、あるいは疾患部位力 遊離し血液やリンパ液、腹腔液、 乳汁、子宫粘液、尿、汗などの体液に含まれる組織または細胞も包含される。さらに
、上記組織または細胞中から遊離した STSを含む上記体液も包含される。また、生 体試料としては、ヒト腫瘍培養細胞、ヒト STSが関連する疾患に羅患したことが疑わ れるヒト個体から採取した組織または細胞および該組織または該細胞より調製した抽 出液なども包含される。また、これらのヒト個体から採取した生体試料を加工処理した サンプルも生体試料として使用してもよい。加工処理としては、例えば希釈、濃縮、抽 出、病理切片作製上の処理などがあげられる。病理切片作製上の処理としては、例 えばホルマリン固定、切出し、包埋、薄切、伸展などの一連の処理があげられる。
[0081] 上記組織または細胞の採取方法としては、穿刺吸引細胞診、針生検 (マンモトーム
)、外科生検、乳頭分泌液細胞診 (乳汁細胞診）、乳管内視鏡による細胞採取などが あげられる。
血液、リンパ液、腹腔液、乳汁、子宫粘液、尿、汗などの体液サンプルは、遠心分 離またはフィルター処理などにより、血漿または血清などの液体画分と細胞などの固 体画分を分画してから使用することが望ましい。この場合、分画した液体画分と固体 画分を生体試料として、用いることもできる。組織または細胞は、疾患部位カゝら直接 採取することが望ま U、が、疾患部位力 遊離した生体試料であっても本発明の検 体として用いることができる。疾患部位としては、例えば、 STSが関連する疾患が転 移性の癌である場合には、原発巣であっても、転移巣であってもよい。
[0082] 上記の組織または細胞などから、抽出液を調製する方法としては、採取した組織ま たは細胞を液体とともに激しく攪拌する方法、酸またはアルカリで細胞膜を破壊する 方法、界面活性剤で細胞膜を破壊する方法、超音波で破砕する方法、低張液で細 胞を破壊する方法、凍結および融解を繰り返す方法などによって組織または細胞を 破壊し細胞質を得る方法があげられる。上記方法で細胞を破壊後、遠心操作などに よって抽出液から破壊されていない細胞片などを取り除く操作を行うことが望ましい。 以下に、具体的にヒト STSまたはヒト STSを発現した微生物、動物細胞あるいは昆 虫細胞などを検出または定量する方法について記載する。
[0083] (1)ウェスタンブロッテイング法
本発明の抗体を用い、ヒト STSをウェスタンブロッテイングにより検出するには、以下 のように行うことができる。
抗原としては大腸菌などで発現した組換えヒト STSを用いるか（1〜10 g/レーン） 、あるいはヒト胎盤組織、各種ヒト腫瘍培養細胞またはバイオプシーなどにより患者よ り採取した細胞力も調製した細胞溶解液 (5 X 106〜5 X 107細胞/ mL)を用いる（10〜5 0 μ g/レーン)。 SDS-ポリアクリルアミド電気泳動 [Antibodies - A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988〕にて分画後、 PVDF膜あるいは-トロセルロー ス膜にブロッテイングする。 BSA-PBSでブロッキング後、本発明のモノクローナル抗体 を生産するハイプリドーマの培養上清もしくは精製した本発明のモノクローナル抗体 1 〜10 /z g/mLを室温で 2時間または 4°Cでー晚反応させる。 PBSまたは Tween-PBSでよ く洗浄した後、第二抗体としてピオチン、酵素、化学発光物質あるいは放射線化合物 などで標識した抗ィムノグロブリン抗体 1〜50 g/mLを室温 1〜2時間反応させる。よ く洗浄した後、第二抗体の標識物質に応じた反応を行ない、ヒト STSと特異的に結合 し、 STS以外の ARSに結合しない抗体がヒト STSのアミノ酸配列より予測される分子 量の蛋白質と反応し、ヒト STSを含まない抗原および STS以外の ARSとは反応しない ことを確認する。
[0084] (2)免疫沈降法
本発明の抗体を用いた免疫沈降は以下の方法で行うことができる。
抗原としては大腸菌などで発現した組換えヒト STSを用いるか（1〜10 g/レーン） 、あるいはヒト胎盤組織、各種ヒト腫瘍培養細胞またはバイオプシーなどにより患者よ り採取した細胞力も調製した細胞溶解液 (5 X 106〜5 X 107細胞/ mL)を用いる（10〜5 0 g/レーン）。
[0085] 上記のように調製したサンプルに本発明の抗体（1〜10 μ g/反応）を加え、 4°Cで 1 時間反応させる。そこにさらにプロテイン G-セファロースなどィムノグロプリンに特異 的な結合能を有する担体を 5〜20 L加え 4°C、 1時間反応させた後、遠心分離し沈 殿画分を得る。沈殿画分は細胞抽出バッファ一にて数回洗浄後、免液沈降物として 、ウェスタンブロッテイングに供する。
[0086] あるいは以下のような方法によっても行うことができる。すなわち、 ELISA用 96穴プレ 一トに本発明の抗体を固相化した後、 BSA-PBSによりブロッキングする。抗体がモノク ローナル抗体産生ハイプリドーマの培養上清である場合には、ハイプリドーマの調製 に用いた抗体産生細胞の動物のィムノグロブリンに結合する抗体またはプロテイン A あるいはプロテイン Gなどをあらかじめ ELISA用 96穴プレートに固相化し BSA-PBSで ブロッキングした後、ハイプリドーマ株培養上清を分注して結合させる。 BSA-PBSを捨 て PBSで洗浄した後、上記のように調製したサンプルを 20〜100 L/穴で分注し、室 温で 2時間または 4°Cでー晚反応させる。細胞抽出バッファーまたは Tween-PBSでよ く洗浄した後のプレートの各ゥエルに残存するサンプルを上記のウェスタンブロッティ ングに供し、免疫沈降されたヒト STSの検出または定量を行う。
[0087] (3)免疫細胞染色法
本発明の抗体を用い、以下のようにして、ヒト STSの免疫細胞染色により検出するこ とがでさる。
各種ヒト腫瘍細胞は、浮遊細胞は PBSにて洗浄し、付着細胞はトリプシン、 EDTAな どで浮遊ィ匕させた後 PBSで洗浄する。またノィォプシ一などにより患者より採取した 細胞魂はコラゲナーゼなどで処理した後、 PBSで洗浄する。これらの細胞は抗体の通 過性を良くするため界面活性剤やメタノールなどで処理する。正常ヒト血清などを用 いてブロッキングした後 1 X 105〜1 X 106細胞 Zチューブで分注し、本発明のモノクロ ーナル抗体を生産するノ、イブリドーマの培養上清もしくは精製した本発明のモノクロ ーナル抗体 1〜10 ;^/π^を室温で 30分間反応させる。洗浄後、蛍光色素で標識し た抗ィムノグロブリン抗体 1〜50 μ g/mLを 100〜500 μ L/チューブずつ分注し、室温 3 0分間遮光反応させる。よく洗浄した後、グリセリンで封入し蛍光顕微鏡にて顕鏡する 力 あるいはフローサイトメトリーにて解析する。
[0088] (4)免疫組織染色法
本発明の抗体を用い、以下のようにして、ヒト STSを免疫組織染色により検出また は定量することができる。
ヒト組織の採取については、手術時あるいはバイオプシーなどによって得られる病 変部位など目的とする組織を含む組織を採取する方法などがあげられる。採取した 組織はそのまま検体として使用することができる。
検体は、採取後、適当な方法により切片を作製して抗体との反応に供する。また、 必要に応じて抗原の賦活化、内因性物質の阻止反応などの操作を加えて行ってもよ い。
[0089] 切片を作製する方法としては、未固定で凍結し、凍結切片を作製後、固定する方 法、固定後凍結し、凍結切片を作製する方法および固定後にパラフィンなどに包埋 し、切片を作製する方法などがあげられる。
未固定で凍結し、凍結切片を作製後、固定する方法としては、組織を細切した後、 OCTコンパウンドなどの凍結包埋剤に入れてドライアイス ·アセトンなどにて急速に凍 結し、アセトンを風乾後、切片を作製し、下記の固定液を用いて固定する方法などが 用いられる。直ちに切片を作製しない場合には、アセトン風乾後、密封して凍結細胞 塊としてディープフリーザー中で保管することができる。 [0090] 固定後凍結し、凍結切片を作製する方法としては、組織を細切した後、下記の固定 液を用いて固定し、例えば PBSまたは 10〜20%のショ糖を含む PBSなどで洗浄し、 0 CTコンパウンドなどの凍結包埋剤に入れてドライアイス 'アセトンなどにて急速に凍結 し、アセトンを風乾後、切片を作製する方法などが用いられる。直ちに切片を作製し ない場合には、アセトン風乾後、密封して凍結細胞塊としてディープフリーザー中で 保管することができる。
[0091] 固定後にパラフィンなどに包埋し、切片を作製する方法としては、組織を細切し、下 記の固定液により固定した後、エタノール、キシレンなどで脱水、透徹し、パラフィン 包埋して、ノラフィンブロックを作製し、パラフィンブロック力も切片を作製する方法な どが用いられる。直ちに切片を作製しない場合には、パラフィンブロックとして保管す ることがでさる。
[0092] 固定方法としては、浸漬固定、注入固定、脱気固定、凍結置換固定、凍結乾燥固 定などがあげられる。浸漬固定の場合の固定時間は、半日〜 1週間が好ましいが、一 般的には 1〜2日間がより好ましい。また、マイクロウエーブや家庭用電子レンジを利 用することで固定時間を数時間に短縮することもできる。
切片を作製する方法としては、凍結切片の場合にはクリオスタツトを用いる方法が、 またはパラフィン切片の場合にはミクロトームを用いる方法があげられる。
[0093] 固定液としては、アルデヒド系を中心とした蛋白質 ·ペプチド鎖に架橋形成を生じさ せるアルデヒド系固定液および蛋白質の凝固沈殿を基本とする有機溶剤系固定液 などがあげられる。アルデヒド系固定液としては例えば、 10〜20%の非緩衝ホルマリ ン、 10%緩衝ホルマリン、緩衝 4%パラホルムアルデヒド、 PLP (periodate-lysine-paraf ormaldehyde)、ザンボ-液、ブアン液（飽和ピクリン酸：ホルマリン原液：氷酢酸 = 15： 5 : 1)、ダルタールアルデヒドなどがあげられる。有機溶剤系固定液として例えば、エタ ノール、アセトン、カルノア液（エタノール：クロ口ホルム：氷酢酸 =6 : 3 : 1)、メタカン液 (メタノール:クロ口ホルム：氷酢酸 = 6 : 3 : 1)などがあげられる。また、別の固定液（「 改訂四版 渡辺 ·中根 酵素抗体法」、名倉宏、長村義之、堤寛 編集 学際企画株 式会社出版）として、カルポジイミド固定液、ノラベンゾキノン液、ァクロレイン液、昇 汞加ホルマリン系固定液、ホルマリン.エタノール混合液（ホルマリン原液： 100%エタ ノール：水 = 1： 8： 1)、酢酸エタノール ·ホルマリン混合液（ホルマリン原液：氷酢酸：ェ タノール =2： 1 : 17)なども用いられる。
[0094] ヒトまたは動物の生体組織などから採取した血液細胞や微生物、ヒトまたは動物あ るいは昆虫などの培養細胞などについては、それが浮遊細胞の場合には、サイトスピ ンを用いてスライドガラスへ貼付する方法、遠心分離によって細胞をペレット化した後 、凝塊を作らせ、該凝塊力 上記方法に従って切片を作製することができる。凝塊を 作らせる方法としては、ァガロースに封入する方法あるいはフイブリノ一ゲン次いでト ロンビンを添加して人工的なフイブリン塊を作らせる方法などがあげられる。
[0095] 酵素標識抗体法を用いる切片の染色は、例えば、以下の方法で行うことができる。
凍結切片の場合には、切片を適切な洗浄液で洗浄後、内因性物質の活性阻止を 行った後、ブロッキング液にてブロッキングを行う。ブロッキング後、酵素標識した本 発明の抗体または抗体断片を希釈液で希釈した液を反応させ、後述する洗浄液で 洗浄後、発色反応を行う。適宜、メチルグリーンなどで核染色を行うこともできる。ある いは、細胞像を明瞭にするためにへマトキシリンなどで染色を行うこともできる。
[0096] パラフィン切片の場合には、キシレン、トルエン、ベンゼンなどで脱パラフィン操作を 行った後、 100%エタノール、 70%エタノールになじませた後に水洗し、内因性物質 の活性阻止を行う。この場合、内因性物質の活性阻止より後の操作は、凍結切片の 場合と同様に行うことができる。
また、内因性物質の活性ィ匕阻止は、本発明の抗体または抗体断片の反応後に行 つてもよい。
[0097] 内因性物質の活性阻止は、例えば、下記の溶液を用いて、室温で 5分〜 1時間反 応させることでできる力 用いる溶液や切片の種類毎の適切な反応条件で行うことが 好ましい。
内因性物質としては、免疫組織染色において、作製した切片中に存在する、反応 に影響を与える物質があげられ、具体的には、内因性ペルォキシダーゼ、内因性ァ ルカリフォスファターゼおよび内因性ピオチンなどがあげられる。
[0098] 内因性ペルォキシダーゼの活性阻止のためには、 0.2〜2%の過ヨウ素酸水溶液、 1〜5%過酸化水素水、 0.1〜0.5%過酸化水素加メタノールまたは 0.1〜0.5%過酸化 水素を含む 0.05〜0.2%アジィ匕ナトリウム水溶液などを、内因'性ァノレカリフォスファタ ーゼの活性阻止のためには、レバミゾールの希釈液などを用いて切片を処理する方 法が用いられる。内因性ピオチンの活性阻止の場合には、 0.01〜0.1%のアビジン水 溶液を反応させた後、次いで 0.001〜0.01%のピオチン水溶液を用いて切片を処理 する方法などが用いられる。
[0099] 洗浄液としては、洗浄液として用いられるものであれば、いかなるものでもよいが、 P BSまたはリン酸緩衝液またはトリス塩酸緩衝液などを用いることができる。 pHは 6.5〜7 .8が好適で、 7.2〜7.6がより好ましい。緩衝液の濃度は 0.2〜0.005mol/Lが好適であ るが、 0.1〜0.01mol/Lがより好まし!/、。
ブロッキング液としては、正常動物血清、 BSA、スキムミルク、カゼイン溶液などが好 適に用いられる。正常動物血清に用いられる動物としては、ヒトまたはマウス以外で はすべての動物種が使用できる力 ャギ、ヒッジ、ゥサギ、ブタなどが好適である。後 述の酵素非標識の本発明の抗体により免疫組織染色法を行う場合には、二次抗体 として用いる抗マウス Igまたは IgG抗体の由来の動物種と同種の正常血清を用いるの が好ましい。使用する際の血清の濃度は 0.1〜20%の範囲で任意に選べる力 1〜5 %が好適である。ブロッキング温度は 4°C〜37°Cの範囲で自由に設定できる。ブロッ キング時間は反応温度にしたがって適切に設定できる力 室温の場合には 10分〜 1 時間が好ましい。
[0100] 抗体の希釈液としては、希釈液として用いられるものであれば、いかなるものでもよ いが、 BSAを含む PBSが好適に用いられる。 BSAの濃度は 0.1〜5%が好ましい。さら に、界面活性剤を添加することできる。添加する界面活性剤の種類としては、トライト ン X-100、ツイーン 20などが用いることができる。界面活性剤の濃度は 0.005〜0.5% が好ましぐ 0.01〜0.2%がより好ましい。
[0101] 酵素標識した本発明の抗体または抗体断片を反応させる場合には、抗体濃度は 0.
33〜30 μ g/mLで反応させるのが好適である力 1〜25 μ g/mLがより好ましぐ 4〜16 μ g/mLが特に好ましい。反応温度は抗体の反応性が変化しない範囲であればよぐ 4°C〜37°Cの範囲で自由に設定することができる。反応時間は反応温度にしたがつ て設定することができ、例えば、反応温度が 4°Cの場合には反応時間は 1時間以上で あり、反応温度が室温の場合には反応時間は 10分〜 8時間が好ましい。
[0102] 発色反応液としては、ペルォキシダーゼを標識酵素とする場合には、 3,3' -diamino benzidine (DAB)液、 3-ァミノ- 9-ェチルカルバゾール溶液および 4-クロ口- 1-ナフトー ルなどを用いることができる。 DAB液は使用時に過酸ィ匕水素水を添加して使用するこ とが望ましい。 DAB液を用いる発色反応の増感剤として、イミダゾールを添加してもよ い。
アルカリフォスファターゼを標識酵素とする場合には、ファストレッドまたはファストレ ッドバイオレットまたはファストブルーの各塩を発色剤とすることもができ、また、ニュー フクシン液 (Merck社製)あるいは BCIP/NBT液 (Sigma社製）を利用することもできる。
[0103] グルコースォキシダーゼを標識酵素とする場合には、例えばグルコース、 phenazine methosulfate (PMS)および色原体を含む混合液が用いられる。色原体としては PMS によって還元されて不溶性の色素を生じるものであればいかなる色原体であってもよ いが、例えば、 NBT、 TNBT、 BSPT、 INT (いずれも Pierce社製）などのテトラゾリゥム塩 などがあげられる。この場合の発色反応時間としては、 30秒〜 20分間が好ましぐ 1〜 10分間がより好ましい。
[0104] 上記は、酵素標識した本発明の抗体または抗体断片を用いた免疫細胞染色法の 例示であるが、以下のようにして酵素非標識の本発明の抗体または抗体断片を用い ることち可會である。
酵素非標識の本発明の抗体または抗体断片を上記希釈液で希釈した液を検体に 反応させ、上記洗浄液などで洗浄後、本発明の抗体または抗体断片に結合できる二 次抗体を反応させ、洗浄液で再び洗浄した後に、発色反応を行うことも可能である。
[0105] 二次抗体としては、本発明の抗体または抗体断片に結合できる抗体であって、検 出のために標識ィ匕されていればいかなるものでもよい。具体的には、本発明の抗体 がマウスモノクローナル抗体の場合には、酵素標識抗マウス Igまたは IgG抗体などを 用!/、ることができる。
酵素非標識の本発明の抗体または抗体断片の反応条件および本発明の抗体また は抗体断片結合できる、酵素標識した二次抗体の反応条件については、上記酵素 標識した本発明の抗体または抗体断片を反応させる際の反応条件と同様である。 [0106] ホルマリン固定パラフィン包埋された切片では、アルデヒド固定によってしばしば抗 原が隠された状態になるため抗原と抗体の接触が阻害されることがある。この場合、 抗原の賦活ィ匕処理によって、染色性を向上させることが可能である。
賦活ィ匕処理としては、例えば、該切片を蛋白質分解酵素処理または加熱処理など 力 Sあげられる。蛋白質分解酵素は抗原上の抗体認識部位に対して切断活性がなけ れば任意のものが使用できるが、特に限定分解酵素が好ましぐ例えば、トリプシン、 プロナーゼ、ペプシン、ァクチナーゼ、フイシン、プロティナ一ゼ1、サブチリシン、パ パインなどがあげられる。
[0107] 加熱処理としては、水または任意の緩衝液中で、マイクロウエーブ照射器、電子レ ンジ、オートクレーブ、圧力鍋、ウォーターバス、蒸し器、ホットプレートなどによる加熱 操作をすることがあげられる。加熱処理に用いられる緩衝液としては、例えば、クェン 酸緩衝液、 EDTA溶液、水酸ィ匕ナトリウム加クェン酸緩衝液、トリス塩酸緩衝液、ホウ 酸緩衝液、グリシン塩酸緩衝液、炭酸緩衝液、酢酸緩衝液などを用いることができる 。緩衝液の塩濃度は 0.0005〜0.2 mol/Lで、好ましくは 0.001〜0.1 mol/Lである。緩 衝液の pHは 5.0〜10で、好ましくは pH5.5〜9.5である。さらには、尿素水溶液、塩化 アルミニウム水溶液、過ヨウ素酸水溶液なども用いることができる。これらの水溶液の 濃度は、 0.1〜7%が好ましぐ 1〜5%がより好ましい。
また、賦活化処理としては、酸またはアルカリ処理などの処理も用いることができる。 アルカリ処理には、 NaOH、 KOHなどが用いられ、酸処理には、塩酸、ギ酸、酢酸な どが用いられる。さらに、抗原の賦活化処理には、尿素、グァ-ジンなどの蛋白質変 性剤を用いることもできる。
[0108] 染色強度を向上させる目的で以下の高感度染色法 [「改訂四版 渡辺 ·中根 酵素 抗体法」、名倉宏、長村義之、堤寛 編集 学際企画株式会社出版]を行ってもよい 高感度染色法としては、 PAP (peroxidase anti-peroxidase)法あるいはその変法とし ての四段階 PAP法、 Double bridge PAP法、 Fab fragmentを用いる PAP法、 Hapten sa ndwich法、アビジン 'ピオチン複合体形成の原理を応用した ABC (avidin biotinylated -peroxidase complex)法、 LAB (labeled avidin— biotin)法、 BRAB (bridge avidin— biotin )法、 streptavidinを禾 lj用した LSAB (labelled strept avidin biotin)法、 SABC (streptavid in biotin complex)法、ビォチンィ匕した tyramidを使用した CSA (catalyzed signal amplifi cation)法、 ABC法の変法として抗ァビジン抗体を用いる方法、ピオチンィ匕プロテイン Aを用いる方法、 PAP法と ABC法を組み合わせる方法、コロイド金標識抗ペルォキシ ダーゼ抗体による ABC法、酵素標識プロテイン Aを用いる方法、酵素標識ポリマー法 、金属標識抗体を用いたィムノコロイド法などが用いられる。
[0109] 酵素標識ポリマー法は、デキストランなどの高分子ポリマーに酵素と一次抗体、また は酵素と二次抗体を結合させたものを利用する方法である。
また、高感度染色法としては、発色酵素をペルォキシダーゼの代わりにアルカリフ ォスファターゼ、グルコースォキシダーゼなどの発色酵素を利用できる。アビジン'ビ ォチン複合体とこれらの発色酵素の糸且み合わせ、 APAAP (alkaline phosphatase- anti alkaline phosphatase)法またはペルォキシダーゼ標識抗 FITC抗体を用いる間接法な どもあげられる。
[0110] 本発明の免疫組織染色法には、上記の原理を使用した市販のキットも利用すること ができる。市販のキットとしては、例えば Vector Stain Kit (Vector社製）、 Strept AB C omplex (DAKO社製）、 AB Complex (DAKO社製）、 SAB- POキット（-チレイ社製）、 S AB— APキット（-チレイ社製）、 Super Sensitive Ready— to— Use Detection Kit (BioGene x社製）、 Polyvalant染色キット（ScyTek社製）、 EPOS system (DAKO社製）、 EnVision system (DAKO社製)、 Super Sensitive Non— Biotin HRP Ready— to— Use Detection Kit (BioGenex社製）、 Simple stain system (-チレイ社製）などがあげられる。
[0111] LAB法、 LSAB法は、例えば以下の条件により行うことができる。
本発明の抗体あるいは抗体断片の反応後または内因性物質の活性阻止の後、洗 浄液で洗浄し、ピオチン標識抗マウス Ig抗体またはピオチン標識抗マウス IgG抗体を 反応し、次 、でアビジン標識ペルォキシダーゼまたはストレプトアビジン標識ペルォ キシダーゼを反応させる。ピオチン標識抗マウス Ig抗体またはピオチン標識抗マウス I gG抗体およびアビジン標識ペルォキシダーゼの反応条件にっ 、ては、上記の酵素 標識した本発明の抗体または抗体断片の反応条件と同様である。
[0112] また、上記の免疫細胞染色法を行うためには、市販の自動免疫染色装置などを使 用することもできる。自動免疫染色装置としては、 HIS-20 (サクラ精機社製)、 i6000 ( 協和メデッタス社製）、 ST5050 (ライカ社製）、 HXベンチマーク (ベンタナ 'ジャパン社 製）、 Autostainer(DAKO社製）、 Horizon (DAKO社製）などがあげられる。
免疫染色像の定性的または定量的判定方法としては、抗体の標識物質に応じて適 した方法を利用することができる。すなわち、酵素を標識物質として選択した場合に は光学顕微鏡、共焦点レーザースキャン顕微鏡などを、蛍光物質を標識物質として 選択した場合には蛍光顕微鏡、共焦点レーザースキャン顕微鏡、蛍光画像解析装 置などを、放射性物質の場合にはオートラジオグラフィー、放射線画像解析装置など を、発光物質の場合には発光画像解析装置などを用いることができる。
[0113] 顕微鏡で得られた画像について、目視にて染色陽性部位の形態および濃淡を検 知することができ、これによつて定性的または定量的判定ができる。
あるいは、顕微鏡で得られた画像に対して、目的に合った画像処理を行い、鮮明に 表現するために、デジタルカメラなどのデジタル画像入力システムを用いて画像解析 装置に画像データをデジタル信号として入力することができる。画像解析装置では、 染色陽性部位の面積、最短径、最長径、周長などの計測、および染色陽性部位の 透過率、光学的濃度、吸光度などを計測可能で、これらの測定値に基づいた反応産 物の陽性率、分布など目的に応じた定量解析ができる。
[0114] (5)サンドイッチ ELISA
本発明の抗体を用いたサンドイッチ ELISAにより、検体中のヒト STSは例えば、以下 の方法により定量することができる。
ELISA用 96穴プレートに第一の抗ヒト STS抗体を固相化した後、 BSA-PBSによりブ ロッキングする。 BSA- PBSを捨て PBSでよく洗浄した後、濃度既知のヒト STS標品ある いは濃度未知の被験サンプルをカ卩え、 4°Cで 1晚あるいは室温 2時間反応させる。 Tw een-PBSでよく洗浄した後、固層化した第一抗体とは認識するェピトープが異なる第 二の抗ヒト STS抗体を反応させる。第二抗体はあらかじめピオチン、酵素、化学発光 物質あるいは放射線ィ匕合物などで標識しておく。二次抗体の反応後、洗浄し、第二 抗体の標識物質に応じた検出反応を行う。濃度既知のヒト STS標準物質を段階的に 希釈して作製した検量線より、被験サンプルの濃度を算出することができる。該方法 に用いられる第一の抗ヒト STS抗体と第 2のヒト STS抗体のうちの!/、ずれか一方の抗 体が本発明の抗体であれば、 STSのみを特異的に測定することができる。第一の抗 ヒト STS抗体と第 2のヒト STS抗体の、具体的な組み合わせとしては、例えば、本発 明のハイプリドーマ FERM BP-10015が生産する抗ヒト STSモノクローナル抗体 KM10 53と公知の抗ヒト STSモノクローナル抗体 KM1049 [Cancer Research, 63, 2762 (2003 )]の組み合わせなどがあげられる。
[0115] 本発明の抗ヒト STS抗体を含む、ヒト STSの免疫学的検出試薬または免疫学的定 量試薬は、上記の 2. (1)〜（5)で示された免疫学的手法を用いる検出方法または 定量方法に用いられ、該方法が実施できる構成要素を含むヒト STSの検出試薬また は定量試薬の各構成要素と実質的に同一、またはその一部と実質的に同一な物質 が含まれていれば、構成または形態が異なっていても、本発明の試薬に包含される。
[0116] 構成要素としては、抗ヒト STS抗体、抗ヒト STS抗体を固定ィ匕するための担体、抗ヒ ト STS抗体が固定化された固相、検出に用いる標識された二次抗体またはその抗体 断片などがあげられ、また必要に応じ、生体試料の処理試薬、生体試料の希釈液、 反応緩衝液、洗浄液、標識の検出用試薬またはヒト STSの標準物質などを含む、キ ットの形態であってもよ 、。
[0117] また、本発明のキットまたは試薬に、測定に適した機器を組み合わせて、キットとし てもよい。
抗ヒト STS抗体としては、ヒト STSに特異的に結合し、 STS以外の ARSに交叉反応 性を示さな 、抗体であれば特に制限はな 、が、例えば本発明のハイプリドーマ FER M BP-10015が生産する抗ヒト STSモノクローナル抗体 KM1053などが好適に用いら れる。本発明に用いられる抗ヒト STS抗体は、必要に応じて断片化した抗体断片を 用!/、ることができる。
[0118] 抗体断片としては、 Fab、 Fab'、 F(a ） 2、 scFv、 dsFv、 diabodyおよび CDRを含むぺ プチド、 VHまたはその融合蛋白質、 VLまたはその融合蛋白質などがあげられる。 上記の抗体あるいは抗体断片は、二次抗体を用いて検出することができ、また、該 抗体を標識化して直接検出することもできる。
二次抗体を用いて検出する場合の、二次抗体としては、抗体に結合できる抗体で あれば、いかなる抗体でも用いることができ、該抗体はポリクローナル抗体であっても モノクローナル抗体よぐあるいは Fab、 Fa 、 F(a ） 2、 scFv、 dsFv、 diabodyおよび C DRを含むペプチドなどを用いることができる。二次抗体に用いられる抗体あるいは抗 体断片は、検出のために標識ィ匕して使用される。
[0119] 上記の抗ヒト STS抗体あるいは抗体断片または該抗体を検出するための二次抗体 あるいは抗体断片を標識する物質としては、任意の公知 (石川榮次ら編、酵素免疫 測定法、医学書院)の酵素、発光物質、蛍光物質あるいは放射性同位元素などを用 いることができる。例えば、標識が酵素であればアルカリフォスファターゼ、ペルォキ シダーゼ、ルシフェラーゼなどを、標識が発光物質であればアタリジ-ゥムエステル、 口フィンなどを、標識が蛍光物質であればグリーンフルオレセンスプロテイン、レッドフ ルオレセンスプロテイン、 FITCなどを、放射性同位元素であれば 14C、 32P、 1251など を用いることができる。また、ピオチン標識を用いて、標識ィ匕されたアビジンやストレブ トァビジンなどを用いて検出することもできる。
[0120] 抗体あるいは抗体断片を上記の標識により標識ィ匕する方法としては、遺伝子工学 的に結合させる方法や、化学的に結合させる方法が用いられる。遺伝子工学的に結 合させる方法は、文献 [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93, 974 (1996); Proc. Natl. Aca d. Sci. USA, 93, 7826 (1996)]記載の方法に従って行うことができる。化学的に結合 させる方法は、文献 [Science, 261, 212 (1993)]記載の方法に従って行うことができる 。また、放射性同位元素をィ匕学的に結合させる方法は、文献 [Antibody Immunoconj ugates and Radiopharmaceuticals , 3, 60 (1990); Anticancer Research, 11, 2003 (199 1)]記載の方法に従って行うことができる。
[0121] 標識量を測定する方法としては、吸光度法 (比色法)、蛍光法、発光法、放射活性 法などがあげられる。標識が酵素である場合、酵素の基質を当該酵素と反応させ、生 成した物質を測定することにより、標識量を測定することができる。
酵素がペルォキシダーゼである場合には、例えば吸光度法、蛍光法などによりべ ルォキシダーゼ量を測定することができる。吸光度法によりペルォキシダーゼ量を測 定する方法としては、例えばペルォキシダーゼとその基質である過酸ィヒ水素および 酸化発色型色原体の組み合わせとを反応させ、反応液の吸光度を分光光度計など で測定する方法などがあげられる。酸化発色型色原体としては、例えばロイコ型色原 体、酸ィ匕カップリング発色型色原体などがあげられる。
[0122] ロイコ型色原体は、過酸ィヒ水素およびペルォキシダーゼなどの過酸ィヒ活性物質の 存在下、単独で色素へ変換される物質である。具体的には、。-フエ-レンジァミン、 1 0-N-カルボキシメチルカルバモイル- 3, 7-ビス（ジメチルァミノ） - 10H-フエノチアジン（ CCAP)、 10- N-メチルカルバモイル- 3, 7—ビス（ジメチルァミノ）- 10H-フエノチアジ ン（MCDP)、 N- (カルボキシメチルァミノカルボ-ル） -4,4， -ビス（ジメチルァミノ）ジフ ェ-ルァミンナトリウム塩（DA- 64)、 4,4，-ビス（ジメチルァミノ）ジフエ-ルァミン、ビス 〔3-ビス（4-クロ口フエ-ル)メチル -4-ジメチルァミノフエ-ル〕ァミン（BCMA)などがあ げられる。
[0123] 酸化カップリング発色型色原体は、過酸ィヒ水素およびペルォキシダーゼなどの過 酸化活性物質の存在下、 2つの化合物が酸ィ匕的カップリングして色素を生成する物 質である。 2つの化合物の組み合わせとしては、カプラーとァ-リン類（トリンダー試薬 )との組み合わせ、カプラーとフエノール類との組み合わせなどがあげられる。カプラ 一としては、例えば 4-ァミノアンチピリン（4-AA)、 3-メチル -2-ベンゾチアゾリノンヒド ラジンなどがあげられる。ァ-リン類としては、 N- (3-スルホプロピル）ァ-リン、 N-ェ チル- N- (2-ヒドロキシー 3-スルホプロピル） -3-メチルァ-リン（TOOS)、 N-ェチル - N - (2-ヒドロキシ- 3-スルホプロピル） -3,5-ジメチルァ-リン（MAOS)、 N-ェチル - N- (2- ヒドロキシ- 3-スルホプロピル）- 3,5-ジメトキシァ-リン（DAOS)、 N-ェチル - N- (3-ス ルホプロピル） -3-メチルァ-リン（TOPS)、 N- (2-ヒドロキシ -3-スルホプロピル） -3,5- ジメトキシァ-リン（HDAOS)、 Ν,Ν-ジメチル- 3-メチルァ-リン、 Ν,Ν-ジ（3-スルホプロ ピル） -3,5-ジメトキシァ-リン、 Ν-ェチル - Ν- (3-スルホプロピル） -3-メトキシァ-リン、 Ν-ェチル - Ν- (3-スルホプロピル）ァ-リン、 Ν-ェチル - Ν- (3-スルホプロピル） -3,5- ジメトキシァ-リン、 Ν- (3-スルホプロピル）- 3,5-ジメトキシァ-リン、 Ν-ェチル - Ν- (3- スルホプロピル） -3, 5-ジメチルァ-リン、 Ν-ェチル - Ν- (2-ヒドロキシ -3-スルホプロピ ル） -3-メトキシァ-リン、 Ν-ェチル -Ν- (2-ヒドロキシ -3-スルホプロピル）ァ-リン、 Ν- ェチル - Ν- (3-メチルフエ-ル） -Ν，-サクシ-ルエチレンジァミン（EMSE)、 Ν-ェチル- Ν- (3-メチルフエ-ル） -Ν，-ァセチルエチレンジァミン、 Ν-ェチル - Ν- (2-ヒドロキシ -3 -スルホプロピル） -4-フルォロ- 3,5-ジメトキシァ-リン（F- DAOS)などがあげられる。 フエノール類としては、フエノール、 4-クロ口フエノール、 3-メチルフエノール、 3-ヒドロ キシ -2,4,6-トリョード安息香酸 (HTIB)などがあげられる。
[0124] 蛍光法によりペルォキシダーゼ量を測定する方法としては、例えばペルォキシダー ゼとその基質である過酸ィヒ水素および蛍光物質の組み合わせとを反応させ、生成し た蛍光の強度を測定する方法などがあげられる。当該蛍光物質としては、例えば 4-ヒ ドロキシフエ-ル酢酸、 3-（4-ヒドロキシフエ-ル）プロピオン酸、クマリンなどがあげら れる。
[0125] 酵素がアルカリ性ホスファターゼである場合には、例えば発光法などによりアルカリ 性ホスファタ一ゼ量を測定することができる。発光法によりアルカリ性ホスファターゼ 量を測定する方法としては、例えばアルカリ性ホスファターゼとその基質とを反応させ 、生成した発光の発光強度を発光強度計などで測定する方法などがあげられる。ァ ルカリ性ホスファタ一ゼの基質としては、例えば 3- (2， -スピロアダマンタン) -4-メトキ シ- 4- (3，-ホスホリルォキシ）フエ-ル- 1,2-ジォキセタン'ニナトリウム塩 (AMPPD)、 2 -クロ口- 5- {4-メトキシスピロ [1,2-ジォキセタン- 3,2， -（5， -クロ口）トリシクロ [3.3.1.13,7 ]デカン]- 4-ィル }フエ-ル ホスフェート 'ニナトリウム塩（CDP- StarTM)、 3- {4-メトキ シスピロ [1,2-ジォキセタン- 3,2，-（5，-クロ口）トリシクロ [3.3.1.13, 7]デカン]- 4-ィル } フエ-ル ホスフェート 'ニナトリウム塩（CSPDTM)、 [10-メチル -9 (10H) -アタリジ-ル イデン]フエノキシメチルリン酸 '二ナトリウム塩（LumigenTM APS-5)などがあげられる
[0126] 酵素が β -D-ガラクトシダーゼである場合には、例えば吸光度法 (比色法)などによ り β -D-ガラクトシダーゼ量を測定することができる。吸光度法 (比色法）により β -D- ガラクトシダーゼ量を測定する方法としては、例えば j8 -D-ガラクトシダーゼとその基 質とを反応させ、反応液の吸光度を分光光度計などで測定する方法などがあげられ る。 j8 -D-ガラクトシダーゼの基質としては、例えば 2-クロ口- 4-ニトロフエ-ル 13 - D- ガラクトシドなどがあげられる。
[0127] 標識が、放射性同位元素である場合、放射性同位元素の量は、放射活性をシンチ レーシヨンカウンターなどにより測定することにより決定することができる。 抗ヒト STS抗体を固定ィ匕するための担体としては、抗体を結合させて保持できるも のであればいかなるものも包含されるが、各種高分子素材を用途に合うように成形し た素材が用いられる。
[0128] 抗体などを固定ィ匕させる担体の形状としてはチューブ、ビーズ、プレート、ラテックス などの微粒子、スティックなど力 素材としてはポリスチレン、ポリカーボネート、ポリビ ニルトルエン、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリ塩化ビニル、ナイロン、ポリメタクリレ ート、ゼラチン、ァガロース、セルロース、ポリエチレンテレフタレートなどの高分子素 材、ガラス、セラミックス、磁性粒子や金属などがあげられる。
[0129] 抗体の固相化の方法としては物理的方法と化学的方法またはこれらの併用など、 公知の方法が用いられる。物理的結合としては、例えば物理吸着などがあげられる。 化学的結合としては、例えば共有結合、非共有結合などがあげられる。非共有結合 としては、例えば静電的結合、水素結合、疎水結合、配位結合などがあげられる。例 えば、ポリスチレン製 96ゥエルの免疫測定用マイクロタープレートにペプチドなどを疎 水固相化したものがあげられる。
[0130] 固定化させる抗体は、直接抗体を固相に固定ィ匕してもよいし、抗体をピオチン—ァ ビジンなどを介してから、固相に固定ィ匕してもよい。
上記の抗ヒト STS抗体を固定ィ匕させた固相は、ブロッキングにより、担体上に残存 する官能基を保護する。免疫学的測定法のブロッキングに用いられる物質としては、 通常蛋白質、界面活性剤および市販のブロッキング試薬などが用いられるが、本発 明のブロッキングに用いられる通常の蛋白質としては、 BSA、 KLHまたはガゼインなど が用いられる。
[0131] 生体試料の希釈液としては、界面活性剤、緩衝剤などに安定化剤を含む水溶液な どがあげられる。検体として全血を用いる場合には、水性溶液は、赤血球などの血球 の膨張や収縮による血清中の成分濃度の変化を防止する目的で、塩類、糖類など、 緩衝剤などにより等張液に調製されたものであることが好ましい。塩類としては、特に 制限はないが、例えば塩ィ匕ナトリウム、塩ィ匕カリウムなどのハロゲン化アルカリ金属塩 などがあげられる。糖類としては、特に制限はないが、例えば、マン-トール、ソルビト ールなどの糖アルコールなどがあげられる。 [0132] 反応緩衝液としては、抗体固定ィ匕固相の抗体と生体試料中の抗原とが結合反応を することができればいかなるものであってもよい。また、必要に応じて、界面活性剤、 防腐剤、安定化剤、反応促進剤あるいは酵素活性調節剤などを添加してもよい。 洗浄液としては、通常未反応の物質を除去、洗浄でき、抗原抗体反応に影響を与 えなければ、いかなるものも使用することができる。また、必要に応じて、緩衝剤、界 面活性剤、 BSAやカゼインなどの蛋白質、防腐剤あるいは安定化剤などを添加しても よい。例えば、 Tween-PBSなどが使用される。
[0133] 検体の希釈液、反応緩衝液あるいは洗浄液などに用いられる緩衝液としては、緩 衝液に用いる緩衝剤は緩衝能を有するものならば特に限定されないが、 ρΗ1〜11の 例えば乳酸緩衝剤、クェン酸緩衝剤、酢酸緩衝剤、コハク酸緩衝剤、フタル酸緩衝 剤、リン酸緩衝剤 (但し、標識がアルカリ性ホスファターゼである場合を除く）、トリエタ ノールァミン緩衝剤、ジエタノールァミン緩衝剤、リジン緩衝剤、ノ レビツール緩衝剤 、トリス (ヒドロキシメチル)ァミノメタン緩衝剤、イミダゾール緩衝剤、リンゴ酸緩衝剤、 シユウ酸緩衝剤、グリシン緩衝剤、ホウ酸緩衝剤、炭酸緩衝剤、グリシン緩衝剤、グッ ド緩衝剤などがあげられる。グッド緩衝剤としては、例えば MES (2-モルホリノエタンス ルホン酸)緩衝剤、ビス-トリス [ビス（2-ヒドロキシェチル)イミノトリス（ヒドロキシメチル） メタン]緩衝剤、 ADA[N- (2-ァセトアミド)イミノニ酢酸]緩衝剤、 PIPES [ピペラジン- N, N， -ビス（2-エタンスルホン酸） ]緩衝剤、 ACES { 2- [N- (2-ァセトアミド）ァミノ]ェタン スルホン酸 }緩衝剤、 MOPSO (3-モルホリノ- 2-ヒドロキシプロパンスルホン酸）緩衝剤 、 BES{2- [Ν,Ν-ビス（2-ヒドロキシェチル）ァミノ]エタンスルホン酸 }緩衝剤、 MOPS (3 -モルホリノプロパンスルホン酸）緩衝剤、 TES〈2-{N- [トリス（ヒドロキシメチル)メチル ]アミノ}エタンスルホン酸〉緩衝剤、 HEPES [N- (2-ヒドロキシェチル） - N， -（2-スルホ ェチル）ピぺラジン]緩衝剤、 DIPSO{3- [Ν,Ν-ビス（2—ヒドロキシェチル）ァミノ]- 2-ヒ ドロキシプロパンスルホン酸 }緩衝剤、 TAPSO〈2-ヒドロキシ -3-{ [Ν-トリス（ヒドロキシメ チル)メチル]アミノ}プロパンスルホン酸〉緩衝剤、 POPSO [ピペラジン- Ν,Ν' -ビス（2- ヒドロキシプロパン- 3-スルホン酸）]緩衝剤、 HEPPSO[N- (2-ヒドロキシェチル） - N， - ( 2-ヒドロキシ -3-スルホプロピル）ピぺラジン]緩衝剤、 EPPS [N- (2-ヒドロキシェチル） - N， - (3-スルホプロピル）ピぺラジン]緩衝剤、トリシン [N-トリス（ヒドロキシメチル)メチ ルグリシン]緩衝剤、ビシン [Ν,Ν-ビス（2-ヒドロキシェチル）グリシン]緩衝剤、 TAPS { 3 -[N-トリス（ヒドロキシメチル)メチル]ァミノプロパンスルホン酸 }緩衝剤、 CHES[2- (N- シクロへキシルァミノ）エタンスルホン酸]緩衝剤、 CAPSO [3- (N-シクロへキシルァミノ ) -2-ヒドロキシプロパンスルホン酸]緩衝剤、 CAPS [3- (N-シクロへキシルァミノ）プロ パンスルホン酸]緩衝剤などがあげられる。
[0134] 酵素活性調節剤、酵素安定化剤としては、例えばマグネシウムイオン、マンガンィ オン、亜鉛イオンなどの金属イオンがあげられる。試薬中のこれらの金属イオンの含 量としては、測定において、酵素が安定ィ匕される含量であれば特に制限はない。 防腐剤としては、例えばアジィ匕ナトリウム、抗生物質などがあげられる。試薬中のこ れらの防腐剤の含量としては、測定において、検体中の被測定物質が適切に測定さ れるような含量であれば特に制限はな 、。
[0135] ヒト STSの標準物質としては、遺伝子組換え技術により取得された、あるいは生体 試料から取得されたヒト STSや、ヒト STSが発現している細胞、ヒト STSの部分べプチ ドなどがあげられる。
本発明の検体中のヒト STSの免疫学的検出試薬またはキット、並びに免疫学的定 量試薬またはキットは、ヒト STS関連疾患の判定または診断、ヒト STS関連疾患の治 療に適する薬剤の選択、ヒト STS関連疾患の病態の判定または診断などに用いるこ とがでさる。
[0136] ヒト STS関連疾患は、軽度、重度に関わらず、ヒト STSが病態に関与する疾患であ ればいかなる疾患も包含される。ヒト STS関連疾患としては、ヒト STSが病態に関与 するエストロゲン依存性疾患があげられ、具体的には、ヒト STSが病態に関与するェ ストロゲン依存性腫瘍があげられる。
[0137] エストロゲン依存性腫瘍としては、エストロゲン依存的な細胞の増殖を伴う腫瘍があ げられ、例えば悪性腫瘍、良性腫瘍、皮膚疾患などがあげられる。悪性腫瘍としては 、具体的には乳癌、子宮癌、卵巣癌、前立腺癌、スキルス胃癌などがあげられるが、 乳癌、子宮癌が好ましい。乳癌としては、例えば乳管癌、小葉癌、パジェット病などが あげられるが、乳管癌が好ましぐ浸潤性乳管癌が特に好ましい。子宮癌であれば、 子宮内膜癌とも呼ばれる子宮体癌が特に好ましい。 [0138] 疾患が悪性腫瘍である場合、疾患部位としては、原発巣であっても転移巣であって もよい。良性腫瘍としては、例えば子宮内膜症、子宮腺筋症、子宮筋腫などがあげら れるが、子宫内膜症、子宫腺筋症が好ましい。皮膚疾患としては、例えば魚鱗症など があげられる。
本発明の検体中のヒト STSの免疫学的検出試薬またはキット、並びに免疫学的定 量試薬またはキットによる検出または定量の結果、検体中のヒト STSが検出され、ま たはヒト STSが健常人または通常組織と比較して、ヒト STSの存在量が増大して 、る 場合には、ヒト STSが陽性である、またはヒト STSが発現亢進していると判断される。 このような患者は、ヒト STS関連疾患であると判定または診断される。
[0139] 上記のようにして、ヒト STS関連疾患であると判定または診断された患者には、ヒト S TS関連疾患の治療に適した薬剤を選択することができる。また、ヒト STS関連疾患は 、ヒト STSが病態に関与するエストロゲン依存性疾患を含むため、エストロゲン依存性 疾患の治療に適した薬剤を選択してもよ ヽ。
ヒト STS関連疾患の治療に適した薬剤としては、具体的には、 STS阻害剤があげら れる。
[0140] エストロゲン依存性疾患の治療に適した薬剤としては、例えば、ホルモン療法剤が あげられる。
STS阻害剤としては、 STSの機能を阻害する機能を有する薬剤であれば、いかな るものでもよいが、具体的には nortropiny卜 arylsulfonylureaまたはその誘導体 [Bioorg anic & Medicinal Cnemistry Letters, 1ό, 3b /'3 (2003)]、 estrone— 3— O— sulfamate¾た ίまその誘導体、 2-difluoromethyloestrone 3— O— sulphamate [Biochemical & Biophysic al Research Communications, 317, 169 (2004)]、 bipheny卜 4— O— sulfamateまた ίまその 誘導体、 2 ',4'-dicyanobiphenyl-4-0-sulfamate [Journal of Steroid Biochemistry & M olecular Biology, 87, 141 (2003)]、エストロン誘導体 [Bioorganic & Medicinal Chemis try, 11, 1685 (2003)]、 2- Alkylchromen- 4- one 6-0- sulfamates [Journal of Medicinal Chemistry, 46, 5091 (2003)]、クマリン誘導体、 667 COUMATE, 2-methoxyoestradio 1 bis- sulphamate [Journal of Steroid Biochemistry & Molecular Biology, 86, 423 (200 3)]、 3— sulfamoyloxy— 17alpha— p— tert— butylbenzyl(or benzyl)estra— 1 ,3,5 (10)— trien— 1 7beta— ol、並び【こ 2— methoxy— 3— sulfamoyloxy— 17alpha— benzylestra— 1,3,5 (10)— trien— 17beta-oほたはこれらの類縁体 [Cancer Research, 63, 6442 (2003)]などがあげられ る。
[0141] また、ホルモン療法剤としては、エストロゲンの機能を阻害する機能を有する薬剤で あればいかなる薬剤も包含されるが、抗エストロゲン剤、選択的ァロマターゼ阻害剤、 黄体ホルモン分泌刺激ホルモン抑制剤またはプロゲステロン製剤などがあげられ、 具体的には、タエン酸タモキシフェン、タエン酸トレミフェン、フルべストラント、酢酸リ ユープロレリン、メピチォスタン、ェチニルエストラジオール、アナストロゾール、レトロ ゾール、ェクセメスタン、塩酸フアドロゾール水和物、ゴセラリン、酢酸メドロキシプロゲ ステロンなどがあげられる。
[0142] さらに、本発明の検体中のヒト STSの免疫学的検出試薬またはキット、並びに免疫 学的定量試薬またはキットは、ヒト STS関連疾患の病態の判定または診断などに用 いることがでさる。
ヒト STS関連疾患の病態の判定または診断としては、例えばヒト STS関連疾患の現 状を把握することや予後を予測することなどがあげられる。ヒト STS関連疾患の現状と しては、例えば疾患の進展度、進行度、増悪度または治療薬投与後の寛容度などが あげられる。疾患の予後としては、再発の可能性、病巣の転移度または罹患患者の 生存率などがあげられる。
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明は下記実施例に限定さ れるものではない。
実施例 1
[0143] 抗ヒト STSモノクローナル抗体の作製
(1)抗原の調製
ヒト胎盤組織力も以下のようにして精製ヒト STSを取得した。操作は全て 4°Cで行つ た。
胎盤組織ははさみで細断後、バッファー A[0.25mol/Lサッカロース， 5mmol/L EDT Aで含む 10mmol/Lトリス-酢酸緩衝液 (pH7.0) ]中で細胞懸濁液を調製し、該細胞顕 濁液を 10000 X gで 20分間遠心分離し、上清を回収した。回収した上清をさらに 10500 0 X gで 1時間遠心分離して得られた沈殿をミクロソーム画分とした。
[0144] 得られたミクロソーム画分はバッファー B[lmmol/L EDTA, lmmol/Lジチォェリスレ ィトール（Dithioerythreitol; DTE)、 0.05%フエ-ルメチルスルフォ-ルフルォロイド（p henylmethansulfonylfluoride;PMSF)、 0.5%トリトン X- 100を含む 10mmol/Lトリス-塩酸 緩衝液 (PH7.5) ]を加えて室温にて 1時間攪拌し、可溶ィ匕した。可溶化後、該溶液を 1 05000 X gで 1時間遠心分離して不溶性画分を除き、得られた上清を、ノ ッファー C [l mmol/L EDTA, lmmol/Lジチォエリスレイトール（Dithioerythreitol; DTE)、 0.05%フ ェ-ルメチルスルフォ-ルフルォロイド（phenylmethansulfonylfluoride;PMSF)、 0.5%ト リトン X-100を含む 10mmol/Lトリス-塩酸緩衝液（pH8.0) ]で平衡化した PBE94カラム に通塔し、 2倍容量の同バッファ一にて洗浄後、ノ ッファー D[ lmmol/L EDTA, lmmo 1/L DTE, 0.05% PMSF, 0.5%トリトン X- 100を含む 12.5% polybuffer74 (pH4.0) ]で溶出 した。さらに溶出画分はバッファー Bで平衡ィ匕したフエ二ルセファロースカラムに通塔 し、充分量の同バッファーで洗浄後 1.25%トリトン X-100をカ卩えた同バッファーで溶出 した。このようにして得られた溶出画分を精製ヒト STSとして用いた。精製ヒト STSは S DS変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動（以下、 SDS-PAGEと表記する）を用いて、純 度を検定した。
[0145] 図 1に得られた精製ヒト STSの SDS-PAGEのクマシ一ブリリアントブルーでの染色の 結果を示した。矢印の位置に示されるように、精製ヒト STSは分子量 63KDaの単一バ ンドとして染色され、精製ヒト STSの純度は、 90%以上と推定された。
[0146] (2)動物の免疫と抗体産生細胞の調製
上記（1)で得られた精製ヒト STSをアルミニウムゲル 2mgおよび百日咳ワクチン (千 葉県血清研究所製) 1 X 109細胞とともに 5週令雌マウス (Balb/c)に投与し、 2週間後 より同様に調製した免疫原を 1週間に 1回、計 4回投与した。眼底静脈叢より採血し、 その血清抗体価を以下に示す酵素免疫測定法で調べ、十分な抗体価を示したマウ スから最終免疫の 3日後に脾臓を摘出した。
[0147] 脾臓を MEM培地（日水製薬社製）中で細断し、ピンセットでほぐし、遠心分離（1200 rpm、 5分間）した後、上清を捨て、トリス一塩ィ匕アンモ-ゥム緩衝液 (pH7.65)で 1〜2 分間処理し赤血球を除去し、 MEM培地で 3回洗浄して細胞融合に用いた。 [0148] (3)酵素免疫測定法
アツセィ用の抗原には上記（1)で得られた精製ヒト STSを用いた。陰性対照の抗原 には BSAを用いた。
[0149] 96穴の EIA用プレートに精製ヒト STS、あるいは BSAを 50 μ L/穴で分注し、 4°Cで一 晚放置して吸着させた。洗浄後、 BSA-PBSを 100 /z L/穴でカ卩え、室温 1時間反応させ て残っている活性基をブロックした。 BSA— PBSを捨て、被免疫マウス抗血清、抗ヒト S TSモノクローナル抗体の培養上清もしくは精製モノクローナル抗体を 50 μ L/穴で分 注し 2時間反応させた。 Tween-PBSで洗浄後、ペルォキシダーゼ標識ゥサギ抗マウス ィムノグロブリン (ダコ社製）を 50 L/穴でカ卩えて室温、 1時間反応させ、 Tween-PBS で洗浄後、 ABTS基質液 [2, 2'-アジノ-ビス（3-ェチルベンゾチアゾリン- 6-スルホン酸 )アンモ -ゥムの 0.55gを 1Lの 0.1mol/Lクェン酸緩衝液 (pH4.2)に溶解し、使用直前 に過酸化水素水を 1 μ L/mLで添カ卩した溶液]を 50 L/穴でカ卩えて発色させ、 415nm の吸光度（以下、 OD415などと表記する）をプレートリーダー（NJ2001;日本インターメ ッド社製)にて測定した。
[0150] (4)マウス骨髄腫細胞の調製
8-ァザグァ -ン而性マウス骨髄腫細胞株 P3-U1 [European Journal of Immunology, 6, 511 (1976)]を正常培地で培養し、細胞融合時に 2 X 107個以上の細胞を確保し、 細胞融合に供した。
[0151] (5)ハイブリドーマの作製
上記（2)で得られたマウス脾細胞と (4)で得られた骨髄腫細胞とを 10： 1になるよう混 合し、遠心分離（1200rpm、 5分間）した後、上清を除き、沈澱した細胞群をよくほぐし た後、攪拌しながら、 37°Cで、ポリエチレングライコール -1000 (PEG-1000) 2g、 MEM 培地 2mLおよびジメチルスルホキシド 0.7mLの混液を 1 X 108個マウス脾細胞当たり 0.2 〜lmLをカ卩え、 1〜2分間毎に MEM培地 l〜2mLを数回加えた後、 MEM培地をカ卩えて 全量が 50mLになるようにした。遠心分離 (900rpm、 5分間）した後、上清を除き、ゆる やかに細胞をほぐした後、メスピペットによる吸込み、吸出しでゆるやかに細胞を HAT 培地 lOOmL中に懸濁した。
[0152] この懸濁液を 96穴培養用プレートに 100 μ L/穴ずつ分注し、 5%COインキュベータ 一中、 37°Cで 10〜14日間培養した。この培養上清を上記（3)に記載した酵素免疫測 定法で調べ、精製ヒト STSに反応して BSAに反応しない穴の細胞を選び、さらに HT 培地、続いて正常培地を用いる 2回クローユングを行い、抗ヒト STSモノクローナル抗 体産生ハイブリドーマ KM1053と KM1049が得られた。ハイプリドーマ細胞株 KM1053 およびハイプリドーマ細胞株 KM1049が産生するモノクローナル抗体をそれぞれ抗ヒ ト STSモノクローナル抗体 KM1053および抗ヒト STSモノクローナル抗体 KM1049と称 す。
[0153] (6)モノクローナル抗体の精製
プリスタン処理した 8週令ヌード雌マウス（Balb/c)に上記（5)で得られたノ、イブリドー マ株を 5〜20 X 106細胞 Z匹それぞれ腹腔内注射した。 10〜21日後に、ハイプリドー マは腹水癌化した。腹水のたまったマウスから、腹水を採取（l〜8mL/匹)し、遠心分 離 (3000rpm、 5分間）して固形分を除去した。得られた腹水は、力プリル酸沈殿法 [A ntioodies - A Laooratory Manual, Cold spring Harbor Laboratory, (1988) ]【こより ffr 製し、精製モノクローナル抗体とした。
[0154] 抗体のサブクラスはサブクラスタイピングキット (ZYMED社製)を用いて酵素免疫測 定法により行ない決定した。結果を表 1に示した。
[表 1]
Figure imgf000047_0001
(7)モノクローナル抗体の胎盤由来精製ヒト STSとの反応性 (バインディング ELISA) 上記（5)で選択された抗ヒト STSモノクローナル抗体の精製ヒト STSとの反応性を ( 3)に示した酵素免疫測定法にて調べた。図 2に示すように、得られた抗ヒト STSモノ クローナル抗体 KM1053および抗ヒト STSモノクローナル抗体 KM1049はいずれも精 製ヒト STSに特異的に結合した。
実施例 2
[0156] 抗ヒト STSモノクローナル抗体の反応性
(1)大腸菌発現組換えヒト STSの作製
ヒト STS遺伝子を含むプラスミド pSVL— STS[J. Biol. Chem., 264, 13865 (1989)] (lng / L)を 0.5 L、 10倍濃度の Pfo polymerase緩衝液 5 L、 2mmol/L dNTP 2 L、 40 μ mol/Lの配列番号 1および 2に示された塩基配列のプライマーをそれぞれ 0.5 μ L、 DMSO 5 L、 Pfo polymerase (STRATAGENE社製） 0.5 μ L、滅菌水 36 μ Lからなる溶 液にミネラルオイルを上層し、 94°Cで 5分間加熱した後、 94°Cで 1分間、 50°Cで 1分間 、 72°Cで 2分間からなる反応サイクルを 16サイクル行い、続けて 72°Cで 7分間反応させ た。 PCR産物をァガロースゲル電気泳動で分画し、得られた約 1.7 kbの増幅断片を G ENECLEAN Spin Kit(BIO101社製）を用いて抽出した。得られた抽出断片を ^ lHIと 1で消化し、 DNAライゲーシヨンキット ver.2(宝酒造社製）により ^ iHIと^ mlで消 化した pQE30(QIAGEN社製）に連結した後、コーェンらの方法 [Proc. Natl. Acad. Sci . U.S.A., 69, 2110 (1972)]により大腸菌 DH5 α株を形質転換した。得られた形質転 換体よりプラスミド抽出キット (QIAGEN社製)を用いてプラスミドを抽出し、発現プラス ミド pQE- STSを取得した。 pQE- STSの DNA配列を DNAシークェンサ一 373(Perkin El mer干土製)および BigDye Terminatorし ycle Sequencing Fb Ready Reaction Kit(Perkin Elmer社製)を使用して確認したところ、意図的にプライマーに変異を導入した箇所 以外に変異は認められな力つた。
[0157] pQE-STSを上記と同様の方法で大腸菌 M15[pREP4]株に導入し、ヒト STS発現大 腸菌株 M15[pREP4]/pQE-STSを作製した。
(2)ウェスタンブロッテイング
実施例 1 (5)で得られた抗ヒト STSモノクローナル抗体を用いてウェスタンブロッティ ングによるヒト STSを以下のようにして検出した。
[0158] 上記（1)で作製された STS発現大腸菌株 M15[pREP4]/pQE-STS株を 50mg/Lアン ピシリンおよび 10mg/Lカナマイシンを含む LB培地にて 37°Cでー晚シード培養し、培 養液を 50倍に希釈して 1時間培養した後、終濃度が 4mmol/Lとなるように IPTGを添カロ した。 4時間の培養後、菌体を遠心分離により回収した。
回収したヒト STS発現大腸菌株体およびヒト胎盤由来精製ヒト STSを 1倍濃度の PA GE buffer [2%SDS、 62mmol/Lトリス-塩酸緩衝液（pH6.8)、 10%Glycerol]に溶解して 95°Cで 5分間加熱処理し、 SDS-ポリアクリルアミド電気泳動〔Ant¾odies - A Laborato ry Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, (1988)〕にて分画後、 PVDF膜にブロッ ティングした。該膜を BSA-PBSでブロッキング後、抗ヒト STSモノクローナル抗体 KM1 053または抗ヒト STSモノクローナル抗体 KM1049を室温で 2時間反応させた。反応後 、 Tween-PBSで洗浄した後、第二抗体としてペルォキシダーゼ標識抗マウスィムノグ ロブリン抗体 (DAKO社製)を室温で 1時間反応させた。 Tween-PBSでよく洗浄した後 、検出は ECL-detection kit (アマシャム社製）を用いて行い、 X線フィルム上に感光さ せた。
[0159] 図 3に結果を示した。抗ヒト STSモノクローナル抗体 KM1053および抗ヒト STSモノク ローナル抗体 KM1049は、いずれも実施例 1 (1)で得られた胎盤由来精製ヒト STSだ けでなく、大腸菌発現の組換えヒト STSにも反応した。
以上のことから、抗ヒト STSモノクローナル抗体 KM1053および抗ヒト STSモノクロ一 ナル抗体 KM1049はウェスタンブロッテイングによりヒト STSを検出することができ、 ST Sが関与する各種疾病の判定または診断に応用できることが示された。
[0160] (3)ヒト STS遺伝子導入細胞株の造成
ヒト STS遺伝子を含むプラスミド pSVL- STS[J. Biol. Chem., 264, 13865 (1989)]を制 限酵素 1および β ΐΗΙで消化し、得られた消化断片をァガロースゲル電気泳動で 分離後、約 2.4kbのヒト STS遺伝子を含む断片を抽出した。抽出した断片を 1と HIで消化した pBlueScriptllSK (-)に連結した後、コーェンらの方法 [Proc. Natl. Aca d. Sci. U.S.A., 69, 2110 (1972)]により大腸菌 DH5 α株を形質転換した。得られた形 質転換体よりプラスミド抽出キット (QIAGEN社製)を用いてプラスミドを抽出し、 pBS-S TSを取得した。 pBS-STSを I Iおよび 20^1で消化し、上記と同様にしてヒト STS遺伝 子含む断片を得た。該断片を動物細胞発現用ベクター pcDNA3 (Invitrogen社製)の Notl- Xholサイトに挿入し、発現プラスミド pcSTSを取得した。
[0161] pcSTSは、エレクト口ポレーシヨン法 [Cytotechnology, 3, 133 (1990)]により以下のよ うにして、 CHO/dDXBl l細胞 [Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 77, 4216 (1980)]へ導 入した。
CHO/dDXBl l細胞は、 5%ゥシ胎児血清 (Life technologies社製）、 0.09%重曹 (Life t echnologies社 )、 1% Penicillin— streptomycin(Life technologies社製)を添カロし 7こ α MEM 1900培地 (Life technologies社製）（以下、 A3培地とする)で継代培養した細胞を 用いた。
[0162] CHO/dDXBl l細胞を K-PBS緩衝液 [137nmol/L塩化カリウム、 2.7nmol/L塩化ナトリ ゥム、 8.1mmol/Lリン酸一水素ニナトリウム、 1.5nmol/Lリン酸二水素一ナトリウム、 4m mol/L塩ィ匕マグネシウム緩衝液]に懸濁して 8 X 106細胞/ mLとし、細胞懸濁液 200 L( 1.6 X 106個の細胞を含む)を上記プラスミド 4 gと混和した。該混和液をキュベット (電 極間距離 2mm)に移し、 GenePulserII(BioRad社製）装置を用いてパルス電圧 0.35kV、 電気容量 250 Fの条件で遺伝子導入を行った。キュベットを氷上で静置後、キュべ ット中の細胞懸濁液を、 A3培地を含む細胞培養用容器に懸濁し、 37°C、 5%COイン
2 キュベータ一で培養した。 24時間の培養後、 5%ゥシ胎児透析血清 (Life technologies 社製)、 0.09%重曹 (Life technologies社製)、 1% Penicillin— streptomycin(Life technolog ies社製）、 600 μ g/mL G418 sulfateを添カ卩した α ΜΕΜ2000培地 (Life technologies社 製) (以下、 B3培地と表記する)に培地交換し、培養を続けた。途中希釈しながら継代 を続け、遺伝子導入より約 2週間後に、 G418に耐性を持つ形質転換細胞株を取得し た。
[0163] 得られた形質転換細胞を 1.25細胞/ mLとなるよう B3培地で希釈し、希釈液を 96穴プ レートに 200 Lずつ分注し、シングルセルクローユングを行い、形質転換細胞 cs3- 1 細胞株を取得した。
上記で取得された形質転換細胞のァリルサルファターゼ活性を測定することにより 、ヒト STSが導入された細胞を選択した。 TT緩衝液 [1%トリトン X-100を含む 50mmol/ Lトリス-塩酸緩衝液 (pH7.2) ]に懸濁した細胞を超音波破砕し、約 8000 X gで5分間 遠心分離した上清 50 μ Lと p- Nitrophenylsulfate(NPS)基質溶液 [20mmol/L NPSを含 む 250mmol/Lトリス-酢酸緩衝液 (pH8.2) ]50 Lを混和し、 37°C、 1時間反応を行った 。反応後、該反応液に IN NaOH 400 Lを添加して反応を停止し、 420nmにおける吸 光度（OD420)を Microplate reader Benchmark(BIO- RAD社製）を用いて測定し、細 胞の酵素活性を求めた。 p-Nitrophenol(NP)のモル吸光係数を Elmm°1A 9.6、 1時間に 1 μ mol/Lの ΝΡを生じる酵素量を lUnitとして定義した。
[0164] 結果を、図 4に示した。ヒト STS遺伝子を含まない pcDNA3プラスミドを導入したコン トロール株 CDNA3- 1および pcSTSプラスミドを導入した形質転^ ¾cs3- 1細胞株のァリ ルサルファターゼ酵素活性を比較した場合、 cs3-l細胞株で有意な活性の上昇が認 められた。
従って、ヒト STS遺伝子の導入により、ァリルサルファターゼ酵素活性を発現する細 胞株が得られたことが確認できた。
[0165] (4)免疫沈降
実施例 1 (5)で得られた抗ヒト STSモノクローナル抗体を用いて、免疫沈降によるヒ ト STSを以下のようにして検出した。
上記（3)で造成したヒト STS遺伝子導入細胞株 cs3-l細胞を溶解緩衝液 [1%トリトン X-100を含む 50mmol/Lトリス-塩酸緩衝液 (pH7.2) ]にて溶解した後、遠心分離を行 い、上清を回収した。
[0166] 回収した上清 100 μ Lに対し、抗ヒト STSモノクローナル抗体 KM1053または抗ヒト S TSモノクローナル抗体 KM1049を産生するハイブリドーマの培養上清 50 μ Lあるいは 陰性対照のマウス IgGlクラスモノクローナル抗体を混合し、氷上に 60分間静置して反 応させた。反応後、溶解緩衝液で平衡化した Protein G Sepharose 4FF (Pharmacia社 製） 100 Lをカ卩え、 4°Cにて 60分間、撹拌しながら反応させた。反応後、 14000rpm、 4 °Cで 15秒間の遠心分離を行った後、上清を除去し、沈殿したビーズを回収した。該ビ ーズは上記の溶解緩衝液で 3回洗浄した。洗浄後、該ビーズに 35 Lの 2倍濃度の P AGE buffer [4%SDSゝ 124mmol/Lトリス-塩酸緩衝液（pH6.8)、 20%Glycerol]をカロえ 、 95°Cで 5分間加熱処理し、沈殿したビーズに吸着した蛋白質を 10% SDS-PAGEゲル による電気泳動に供した。分画した蛋白質を PVDF膜に転写し、上記（2)に記載の方 法と同様にしてウェスタンブロッテイング法を行った。ウェスタンブロッテイング法の一 次抗体には KM1049を、二次抗体には HRP標識ゥサギ抗マウス抗体 (DAKO社製)を それぞれ用いた。結果を図 5に示した。
[0167] 抗ヒト STSモノクローナル抗体 KM1053はヒト STSを免疫沈降することができたが、 抗ヒト STSモノクローナル抗体 KM1049はヒト STSを免疫沈降することはできなかった 以上のことから、抗ヒト STSモノクローナル抗体 KM1053は免疫沈降により、ヒト STS を検出することができ、 STSが関与する各種疾病の診断に応用できることが示された
[0168] (5)免疫細胞染色
実施例 1 (5)で得られた抗ヒト STSモノクローナル抗体を用いた免疫細胞染色法に よりヒト STSを以下のようにして検出した。
細胞は、上記（3)で造成したヒト STS遺伝子導入細胞株 cs3-l細胞と、陰性対照と して親株である CHO/dDXBll細胞にヒト STS遺伝子が含まれていない pcDNA3プラ スミドを導入した CDNA3- 1細胞用いた。
細胞を EDTAにより剥離し、 PBSで洗浄した後、細胞膜の抗体透過性を上げるため 、氷冷した 100%メタノールにて 4°Cで 10分間処理した。 PBSで洗浄後、 lmg/mLヒトイ ムノグロブリン (カッペル社製）にて室温で 30分間ブロッキングした。反応当たり 1 X 105 細胞/となるように分注し、抗ヒト STSモノクローナル抗体 KM1053産生ハイブリドーマ の培養上清を加えて室温で 30分間反応させた。反応後、 PBSで洗浄後、 FITC標識 抗マウスィムノグロブリン抗体 (マウスィムノグロブリンに特異的に反応する抗体;和光 純薬)を 100 L/チューブで分注し、 4°C、 30分間遮光反応させた。 PBSで洗浄した後 、セルアナライザー（コールター社； EPICS XL systemll)にて解析した。
[0169] 結果を図 6に示した。図 6に示されるように、免疫細胞染色法において、抗ヒト STS モノクローナル KM1053はヒト STSを発現していない CDNA3-1細胞には反応せず、ヒ ト STS遺伝子が導入された細胞株 cs3-l細胞に特異的な反応性を示した。また、陰 性対照のマウス IgGlクラスのモノクローナル抗体はいずれの細胞とも反応しなかった 以上のことから、抗ヒト STSモノクローナル抗体 KM1053は免疫細胞染色により、ヒト STSを検出することができ、 STSが関与する各種疾病の診断に応用できることが示さ れた。
[0170] (6)免疫組織染色
実施例 1 (5)で選択された抗ヒト STSモノクローナル抗体 KM1053を用いて、免疫組 織染色法によるヒト STSを以下のようにして検出した。
乳管癌標本 25例を用いた。標本は、 10%ホルマリンで固定後、ノ ラフィン包埋された ブロック力ゝら、切片を調製して使用した。
[0171] 切片は、後述する検出段階で用いたヒストファイン SAB-PO(M) (以下、ヒストファイン と記す。 -チレイ社製）に添付のゥサギ正常血清由来のブロッキング溶液を用いて室 温にて、 30分間ブロッキングした。ブロッキング後、該標本を第一次抗体希釈液 [0.5% BSA、 0.05%ァザイドを含む PBS (リン酸ニナトリウム 32.27g、リン酸一ナトリウム 4.5g、食 塩 80g、蒸留水 1リットル）]で 8.33 g/mLに希釈した抗ヒト STSモノクローナル抗体 K M1053で 4°Cにて、一晩反応させた。この時、同時に第一次抗体の陰性対照として、 正常マウス IgGを用いた。
[0172] 反応後、洗浄し、内因性ペルォキシダーゼ (以下、ペルォキシダーゼと記す)の活 性をブロックするため、ペルォキシダーゼブロッキング液（lmLの 30%過酸化水素水を メタノールで全量を lOOmLに調整)で室温にて 30分間反応させた。反応後、洗浄し、 ヒストファインに添付の第二次抗体溶液 (ピオチン標識抗マウス IgG+IgA+IgMゥサギ 抗体)を用いて、室温にて 30分間反応させた。反応後、洗浄し、ヒストファインに添付 のアビジン標識ペルォキシダーゼ溶液を用いて、室温にて 30分間反応させた。反応 後、洗浄し、 DAB発色を行った。 DAB発色は以下の通りに行った。
[0173] lOOmLの 50mmol/Lトリス-塩酸緩衝液 (pH7.6)に、 6mLの DAB溶液 {40mLの 250mm ol/Lトリス-塩酸緩衝液（pH8.3)に lgの DAB (3,3'- Diaminobenzidine, tetrahydrochlor ide;同仁社製）を溶解し、同緩衝液で 200mLに調整 }および 20 μ Lの 30%過酸化水素 水を添加した DAB発色溶液を調製し DAB発色反応に供した。発色反応は 1〜5分間 行った。
DAB発色後、洗浄し、細胞像をわ力りやすくするために、定法に従ってへマトキシリ ン染色を行った後、顕微鏡下で観察した。 [0174] 25例の標本の癌部のうち、シグナルが観察された領域力 0%以上であった標本は (2 +)、 10%〜50%であった標本は (1+)、 10%未満であった標本は (-)として、各標本をそれ ぞれ分類した。
結果は、（2+)と判定された標本は 9例（36%)、（1+)と判定された標本は 14例（54%)、（- )と判定された標本は 2例 (8%)であった。一方、第一次抗体に陰性対照を用いた場合 には、全ての標本にぉ 、てシグナルは観察されな力つた。
[0175] 以上のことから、癌組織の 90%以上を染色することが可能な抗ヒト STSモノクローナ ル KM1053は、癌の免疫組織染色法に適した抗体であり、抗ヒト STSモノクローナル K M1053は免疫細胞染色により、ヒト STSを検出することができるので、 STSが関与す る各種疾病の診断に応用できることが示された。
実施例 3
[0176] 抗ヒト STSモノクローナル抗体の反応特異性
(1)各種 ARS遺伝子導入細胞株の造成
(l - l)ARS A遺伝子導入細胞の造成
human placenta cDNA library(Clontech社製）より ARS A遺伝子の PCRクロー-ング を行った。 cDNA library(0.5 ^ g/ ^ L) 20 ^ L、 10倍濃度の KOD polymerase緩衝液 5 μ L、 2mmol/L dNTP 2 μ 40 μ mol/Lの配列番号 1および 2記載の塩基配列で示さ れるプライマーをそれぞれ 0.5 μ L、 DMSO 5 μ KOD polymerase (東洋紡社製） 0.5 μ L、滅菌水 21.5 Lからなる溶液にミネラルオイルを上層し、 94°Cで 5分間加熱した 後、 94°Cで 1分間、 45°Cで 1分間、 72°Cで 2分間の反応サイクルを 25サイクル行い、続 V、て 72°Cで 10分間反応を行なった。 PCR産物をァガロースゲル電気泳動で分画し、 得られた約 1.5kbの増幅断片を GENECLEAN Spin Kit(BIO101社製）を用いて抽出し た。抽出した断片を铸型として上記と同様の PCR反応を行い、上記と同様にして増幅 断片の抽出を行なった。得られた増幅断片を Hindmと aiで消化し、 DNAライゲーシ ヨンキット ver.2(宝酒造社製）により Hindlllと alで消化した pBluescript SK (-)に連結 した後、コーェンらの方法 [Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 69, 2110 (1972)]により大 腸菌 JM110 (danf , dcnf)に形質転換した。得られた形質転換体よりプラスミド抽出キ ッ KPromega社製）を用いてプラスミドを抽出し、 pBS- ARS A2と pBS- ARS 5を得た。 pB S-ARS A2と pBS- ARS 5の DNA配列を DNAシークェンサ一 377(Perkin Elmer社製）お よび BigDye Terminator Cycle sequencing FS Ready Reaction Kit(Perkin Elmer社:^ )を使用して確認したところ、 pBS-ARS A2には一ヶ所の変異、 pBS-ARS A5には 464- 526位に欠失変異が存在することがゎカゝつた。それぞれ変異が導入された領域が異 なっていたので、 pBS-ARS A2を ilindlllおよび β^ΐΒΙで消化しァガロースゲル電気泳 動で分離後、抽出した断片 (0.8kbp)を pBS-ARS A5の ilindm-S lBI断片（3.5kbp) に挿入することにより完全型 ARS Aの翻訳領域を含む pBS-ARS A'を取得した。 pBS- ARS A'を ^MI消化してァガロース電気泳動の解析により 0.5、 0.6および 3.4kbpの断 片が出現すること、および変異点近傍のシーケンスを行うことにより、 目的としたプラス ミド pBS-ARS A'を取得したことを確認した。
pBS-ARS A'を Hindlllおよひ Ίΐで消化し、上記と同様にして ARS Αを含む断片を 得た。該断片を動物細胞発現用ベクター pAGE210[J. Biochem., 101, 1307 (1987)] の Hiadin- aiサイトに挿入し、発現プラスミド PAGE210-ARS Aを取得した。
PAGE210-ARS Aは Ε≤βΙで消化し、線状化した。フエノールクロ口ホルム抽出処理の 後、エタノール沈殿を行い、回収した線状ィ匕プラスミドを ΤΕに 1 μ g/ Lとなるよう溶解 した。一方、 CHO/DG44細胞 [Somatic Cell and Moleculer Genetics, 12, 555 (1986)] は、 10%ゥシ胎児血清 (Life technologies社製）、 1% HT Supplement(Life technologies 社製）、 1% Penicillin-streptomycin (Life technologies社製）を添カ卩した IMDM培地 (Lif e technologies社製）（以下、 A1培地とする)で継代したものを用いた。 CHO/DG44細 胞を K- PBS緩衝液 [137nmol/L塩化カリウム、 2.7nmol/L塩化ナトリウム、 8.1mmol/L リン酸一水素ニナトリウム、 1.5nmol/Lリン酸二水素一ナトリウム、 4mmol/L塩化マグ ネシゥム緩衝液]に懸濁して 8 X 106細胞/ mLとし、細胞懸濁液 200 μ L(1.6 X 106個の 細胞を含む)を上記線状ィ匕プラスミド 4 gと混和した。該混和液を電極間距離 2mmの キュベットに移し、 GenePulserII(BioRad社製）装置を用いてパルス電圧 0.30kV、電気 容量 250 Fの条件で遺伝子導入を行った。キュベットを氷上で静置後、キュベット中 の細胞懸濁液を 10mLの A1培地に懸濁し、 100 Lずつ 96穴 plateに分注したものを 37 °C、 5%炭酸ガス培養器中で培養した。 1日間培養後、 10%ゥシ胎児透析血清 (Life t echnologies社:^)、 1% Penicillin— streptomycin(Life technologies社製)、 300 μ g/mL ハイグロマイシン Bを添カ卩した IMDM培地 (Life technologies社製）（以下、 B1培地とす る)に培地交換し、培養を続けた。途中希釈しながら継代を続け、遺伝子導入より約 2 週間後に、ハイグロマイシン Bに耐性を持つ形質転換細胞株を取得した。
[0178] 導入遺伝子の増幅を行うため、得られた形質転換細胞を、 50、 100または 500nmol/ Lの Methotrexate(MTX)を添カ卩した B1培地中で順次 3回の継代 (約 2週間)を行 、、各 濃度の MTXに耐性を有する株を取得した。また、得られた発現株を EX-CELL 301 (J RH Bioscience社製)培地で継代培養することにより無血清馴化を行ない、 ARS Aが 導入された形質転換細胞を取得した。
[0179] 上記で取得された形質転換細胞のァリルサルファターゼ活性を以下の方法により 測定し、 ARS Aが導入された細胞を選択した。
形質転換細胞の培養上清 100 μ Lと p-Nitrocatecholsulfate(NCS)基質溶液 [lOmmol /L K NCSを含む 500mmol/L酢酸ナトリウム緩衝液（ρΗδ.0) ] 100 μ Lを混和し、 37°C
2
で反応を行った。反応開始から 0および 30分後に該反応液を 100 L抜き取り、 IN N aOH 50 μ Lと混和して反応を停止後、 490nmにおける吸光度を Microplate reader Be nchmark(BIO- RAD社製）を用いて測定し、細胞の酵素活性を求めた。その結果を、 図 7-Aに示した。 ARS A遺伝子を含まないプラスミド pAGE210を導入したコントロール 細胞株 Vector 1細胞株および ARS A遺伝子を含む pAGE210- ARS Aプラスミドを導入 した形質転^ ¾Α7(100)細胞株のァリルサルファターゼ活性を比較したところ、形質 転 ·Α7(100)細胞株は、ァリルサルファターゼ活性を有して ヽることが確認された。
[0180] (1 2)ARS B遺伝子導入細胞の造成
ヒト由来 ARS B遺伝子を含むプラスミド pMPSVHE- ASB[Gene, 68, 213(1988)]を制限 酵素 E£2RIで消化し Blunting Kit (宝酒造)により平滑末端化したものを、 ^HIで消化 した。得られた消化断片をァガロースゲル電気泳動で分離後、約 2.3kbの ARS Bを含 む断片を GENECLEAN Spin Kit(BIO101社製）を用いて抽出した。抽出断片を DNAラ ィゲーシヨンキット ver.2(宝酒造社製）により動物細胞発現用ベクター pAGE210[J. Bio chem., 101, 1307 (1987)]の ^ lHI- サイトに挿入し、該断片挿入ベクターを用い てコーェンらの方法 [proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 69, 2110 (1972)]により大腸菌 J Ml 10株 (dam",dcm")を形質転換した。得られた形質転換体よりプラスミド抽出キット (P romega社製）を用いてプラスミドを抽出し、 pAGE210- ARS Bを取得した。
[0181] で消化し、線状化した pAGE210-ARS Βを用い、上記（1—1)と同様に CHO/D G44細胞 [Somatic Cell and Molecular Genetics, 12, 555(1986)]へ導入し、形質転換 株を取得した。
導入遺伝子の増幅を行うため、得られた形質転換細胞を、 50、 100または 500nmol/ Lの Methotrexate(MTX)を添カ卩した B1培地中で順次 3回の継代 (約 2週間)を行 、、各 濃度の MTXに耐性を有する株を取得した。また、得られた発現株を EX-CELL 301 (J RH Bioscience社製)培地で継代培養することにより無血清馴化を行なった。
[0182] 上記で取得された形質転換細胞のァリルサルファターゼ活性を測定することにより 、 ARS Bが導入された細胞を選択した。培養上清 100 /z Lと p- Nitrocatecholsulfate (N CS)基質溶液 [10mmol/L K NCSを含む 500mmol/L酢酸ナトリウム緩衝液 (pH6.0) ] 1
2
00 Lを混和し、 37°Cで反応を行った。反応開始から 30および 90分後に、該反応液 の 490nmにおける吸光度を Microplate reader Benchmark(BIO- RAD社製）を用いて 測定し、細胞の酵素活性を求めた。
[0183] その結果を、図 7-Bに示した。 ARS B遺伝子を含まない pAGE210プラスミドを導入し たコントロール細胞株 Vectorl細胞株および ARS B遺伝子を含む pAGE210- ARS Bプ ラスミドを導入した形質転換株 B45(100)細胞株のァリルサルファターゼ活性を比較し たところ、形質転^ ttB45(100)細胞株は、明らかにァリルサルファターゼ活性を有し ていることが確認された。
[0184] (1 3)ARS D遺伝子導入細胞の造成
ヒト由来 ARS D遺伝子を含むプラスミド pcDL- SR296(ARSD)[Cell, 81, 15 (1995)]を 制限酵素0i2lで消化し、得られた消化断片をァガロースゲル電気泳動で分離後、約 2kbの ARS D遺伝子を含む断片を GENECLEAN Spin Kit(BIO101社製）を用いて抽 出した。抽出断片を DNAライゲーシヨンキット ver.2(T宝酒造社製）により動物細胞発 現用ベクター pAGE210[J. Biochem., 101, 1307 (1987)]の Iサイトに挿入し、コーェ ンらの方法 [Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 69, 2110 (1972)]により大腸菌 JM109株を 形質転換した。得られた形質転換体よりプラスミド抽出キット (Promega社製)を用いて プラスミドを抽出し、 pAGE210-ARS Dを取得した。 [0185] pAGE210-ARS Dは、エレクト口ポレーシヨン法 [Cytotechnology, 3, 133 (1990)]によ り以下のようにして CHO/DG44細胞 [Somatic Cell and Molecular Genetics, 12, 555 ( 1986)]へ導入した。
PAGE210-ARS Dは ΕΠで消化し、線状化した。該反応液をフエノールクロ口ホル ム抽出したの後、エタノール沈殿法を行い回収し、回収した線状ィ匕プラスミドを ΤΕ〖こ 溶解した。一方、 CHO/DG44細胞は、 10%ゥシ胎児血清 (Life technologies社製）、 1% の HT Supplement(Life technologies社製)、 1% Penicillin- streptomycin(Life technolog ies社製）を添カ卩した IMDM培地 (Life technologies社製) (以下、 A4培地とする)で継代 したものを用いた。 CHO/DG44細胞を K- PBS緩衝液 [137nmol/L塩化カリウム、 2.7nm ol/L塩化ナトリウム、 8.1mmol/Lリン酸一水素ニナトリウム、 1.5nmol/Lリン酸二水素一 ナトリウム、 4mmol/L塩化マグネシウム緩衝液]に懸濁して 8 X 106細胞/ mLとし、細胞 懸濁液 200 L(l.6 X 106個の細胞を含む)を上記線状ィ匕プラスミド 4 gと混和した。該 混和液をキュベット (電極間距離 2mm)に移し、 GenePulserll (BioRad社製）装置を用い てパルス電圧 0.30kV、電気容量 250 Fの条件で遺伝子導入を行った。キュベットを 氷上で静置後、キュベット中の細胞懸濁液を 12mLの A培地を含む 10cmディッシュ 4枚 に懸濁し、 37°C、 5%COインキュベータ一中で培養した。 1日間培養後、 10%ゥシ胎
2
児邊 血清 (Life technologies社製)、 1% Penicillin— streptomycin(Life technologies社 製）、 300 μ g/mLハイグロマイシン Βを添カ卩した IMDM培地 (Life technologies社製）（以 下、 B4培地とする)に培地交換し、培養を続けた。途中希釈しながら継代を続け、遺 伝子導入より約 2週間後に、ハイグロマイシン Bに耐性を持つ形質転換細胞株を取得 した。
[0186] 導入遺伝子の増幅を行うため、得られた形質転換細胞を、 50、 100または 500nmol/ Lの Methotrexate(MTX)を添カ卩した B1培地中で約 2週間毎に順次 3回の継代を行い、 各濃度の MTXに耐性を有する株を取得した。また、得られた発現株を B4培地で継代 培養することにより無血清馴化を行なった。
上記で取得された形質転換細胞のァリルサルファターゼ活性を測定することにより 、 ARS Dが導入された細胞を選択した。 100mmol/Lトリス-塩酸緩衝液 (pH7.5)に懸濁 した細胞を超音波破砕し、約 8000 X gで 5分間遠心分離した上清の蛋白質量を BCA Protein assay reagent kit(PIERCE社製）を用いて測定した。 2mg/mL蛋白質濃度に調 製した該上清 50 μ Lと p- Nitrophenylsulfate(NPS)基質溶液 [20mmol/L NPSを含む 100 mmol/Lトリス-塩酸緩衝液 (pH7.5) ]50 Lを混和し、 37°C、 4時間反応を行った。該 反応液の 415nmにおける吸光度を Microplate reader Benchmark(BIO- RAD社製）を 用いて測定し、細胞のァリルサルファターゼ活性を求めた。
[0187] 結果を、図 7-Cに示した。 ARS D遺伝子を含まない pAGE210プラスミドを導入したコ ントロール細胞株 Vector2細胞株および ARS D遺伝子を含む pAGE210-ARS Dプラス ミドを導入した形質転換株 D-b-100M細胞株のァリルサルファターゼ活性を比較した ところ、形質転 ·Ο-1)-100Μ細胞株は、明らかにァリルサルファターゼ活性を有し ていることが確認された。
[0188] (1 4) ARS E遺伝子導入細胞の造成
ヒト由来 ARS E遺伝子を含むプラスミド pcDL- SR296(ARSE)[Cell, 81, 15 (1995)]を 制限酵素0 lおよび aiで消化し、得られた消化断片をァガロースゲル電気泳動で 分離後、約 2.5kbの ARS Eを含む断片を GENECLEAN Spin Kit(BIO101社製）を用い て抽出した。抽出断片を DNAライゲーシヨンキット ver.2(宝酒造社製）により Xhol Clal で消化した pBluescript SK (-)に連結した後、コーェンらの方法 [Proc. Natl. Acad. Sci . U.S.A., 69, 2110 (1972)]により大腸菌 JM109株を形質転換した。得られた形質転換 体よりプラスミド抽出キット (Promega社製)を用いてプラスミドを抽出し、 pBS-ARS Eを 取得した。 pBS-ARS Eを Kmilおよび tUndlllで消化し、上記と同様にして ARS Eを含む 断片を得た。該断片を動物細胞発現用ベクター pAGE210[J. Biochem., 101, 1307 (1 987)]の KMl-Mindlllサイトに挿入し、発現プラスミド pAGE210-ARS Eを取得した。
[0189] で消化し、線状化した pAGE210-ARS Εを用い、上記（1— 1)と同様に CHO/D
G44細胞 [Somatic Cell and Molecular Genetics, 12, 555 (1986)]へ導入し、形質転換 株を取得した。
得られた形質転換細胞を 1.25細胞/ mLとなるよう B4培地で希釈し、 96穴プレートに 2 00 Lずつ分注し、シングルセルクローユングを行った。さらに、導入遺伝子の増幅 を行うため、得られた开質転換細胞を、 50、 100または 500nmol/Lの Methotrexate(MT X)を添加した B4培地中で順次 3回の継代 (約 2週間)を行 ヽ、各濃度の MTXに耐性を 有する株を取得した。また、得られた発現株を B4培地で継代培養することにより無血 清馴化を行なった。
[0190] 上記で取得された形質転換細胞のァリルサルファターゼ活性を測定することにより 、 ARS Eが導入された細胞を選択した。 TC緩衝液 [1% CHAPSを含む 50mmol/Lトリス -塩酸緩衝液 (pH7.8) ]に懸濁した細胞を、約 8000 X gで 5分間遠心分離した上清 50 μ Lと p- Nitrophenylsulfate(NPS)基質溶液 [20mmol/L NPS, 1% CHAPSを含む 50mmol /Lトリス-塩酸緩衝液 (ρΗ7.8) ]50 /ζ Lを混和し、 37°C、 5分間反応を行った。該反応液 の 415nmにおける吸光度を Microplate reader Benchmark(BIO- RAD社製）を用いて 測定し、細胞の酵素活性を求めた。 p-Nitrophenol(NP)のモル吸光係数を ELMMQL/L=32. 7とし、 5分間に 1 μ mol/Lの ΝΡを生産する酵素量を lUnitとして定義した。また、該上 清の蛋白質濃度は BCA Protein assay reagent kit(PIERCE社製）を用いて測定した。
[0191] 結果を、図 7-Dに示した。宿主細胞である CHO/DG44細胞および ARS E遺伝子を 含む PAGE210-ARS Eプラスミドを導入した形質転換株 E-a21-50M細胞株のァリルサ ルファターゼ活性を比較したところ、形質転^ ¾E-a21-50M細胞株は、明らかにァリ ルサルファターゼ活性を有していることが確認された。
[0192] (1 5)ARS F遺伝子導入細胞の造成
ヒト由来 ARS F遺伝子を含むプラスミド pcDL- SR296(ARS F) [GENOMICS, 42, 192 ( 1997)]を制限酵素 E^RIで消化し、得られた消化断片をァガロースゲル電気泳動で 分離後、約 2kbの ARS Fを含む断片を GENECLEAN Spin Kit(BIO101社製）を用いて 抽出した。抽出断片を DNAライゲーシヨンキット ver.2(宝酒造社製）により E^RIで消化 した pBluescript SK (-)に連結した後、コーェンらの方法 [Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A ., 69, 2110 (1972)]により大腸菌 JM109株を形質転換した。得られた形質転換体より プラスミド抽出キット (Promega社製)を用いてプラスミドを抽出し、 pBS-ARS Fを取得し た。 pBS-ARS Fを 1および ffindlllで消化し、上記と同様にして ARS Fをコードする 遺伝子を含む断片を得た。該断片を動物細胞発現用ベクター pAGE210[J. Biochem. , 101, 1307 (1987)]の I- Hindlllサイトに挿入し、発現プラスミド pAGE210- ARS Fを 取得した。
[0193] FSQIで消化し、線状化した pAGE210-ARS Fを用い、上記（1— 1)と同様に CHO/D G44細胞 [Somatic Cell and Molecular Genetics, 12, 555 (1986)]へ導入し、形質転 換株を取得した。
得られた形質転換細胞を 1.25細胞/ mLとなるよう B4培地で希釈し、 96穴プレートに 2 00 Lずつ分注し、シングルセルクローユングを行った。さらに、導入遺伝子の増幅 を行うため、得られた开質転換細胞を、 50、 100または 500nmol/Lの Methotrexate(MT X)を添加した B4培地中で順次 3回の継代 (約 2週間)を行 ヽ、各濃度の MTXに耐性を 有する形質転換細胞株を取得した。
[0194] 上記で取得された形質転換細胞株のァリルサルファターゼ活性を測定することによ り、 ARS Fが導入された細胞を選択した。 TTN緩衝液 [1%トリトン X- 100, 150mmol/L NaClを含む 100mmol/Lトリス-塩酸緩衝液 (pH7.5) ]に懸濁した細胞を、約 8000 X gで 5分間遠心分離した上清の蛋白質量を BCA Protein assay reagent kit(PIERCE社製） を用いて測定した。 0.2mg/mL蛋白質濃度に調製した該上清 20 Lと 4-methylumbelli ferylsulfate(MUS)基質溶液 [0.1mmol/L MUS, 100mmol/Lトリス-塩酸緩衝液 (pH7.5) ]20 Lを混和し、 37°C、 5分間反応を行った。該反応液に 4mol/L Glycine-NaOH(pH 10.3)160 Lを添加することで反応を停止し、 355nm (励起波長)/ 460nm (蛍光波長)に おける蛍光強度を ARVO 1420 Multilabel counter(WALLAC社製）を用いて測定し、 細胞の酵素活性を求めた。
[0195] 結果を、図 7— Eに示した。宿主細胞である CHO/DG44細胞および ARS F遺伝子を 含む PAGE210-ARS Fプラスミドを導入した形質転^ ¾F-a31細胞株のァリルサルフ ァターゼ活性を比較したところ、形質転 E-a21-50M細胞株は、明らかにァリルサ ルファターゼ活性を有して 、ることが確認された。
[0196] (2)抗ヒト STSモノクローナル抗体 KM1049の反応特異性
上記（1)で造成した各種 ARS遺伝子導入細胞を用いて抗ヒト STSモノクローナル K M1049の STS特異性を以下のように検討した。
上記（ 1 1)で得られた ARS A遺伝子導入細胞および上記（ 1 2)で得られた ARS B遺伝子導入細胞の無血清培養上清 (7.5 μ L/レーン)、実施例 1 (1)で得られたヒト STS遺伝子導入細胞の無細胞抽出液 [100mmol/Lトリス-塩酸緩衝液 (ρΗ7.5)に懸濁 した細胞を超音波破砕し、約 8000 X gで 5分間遠心分離した上清の蛋白質 5 μ g/レー ン]、および ARS D、 ARS E、 ARS F各遺伝子導入細胞の無細胞抽出液 [lOOmmol/L トリス-塩酸緩衝液 (PH7.5)に懸濁した細胞を超音波破砕し、約 8000 X gで 5分間遠心 分離した上清の蛋白質、 20 g/レーン]を SDS-ポリアクリル電気泳動にて分画後、 P VDF膜に転写した。 BSA-PBSでブロッキング後、抗ヒト STSモノクローナル抗体 KM10 49を室温で 2時間反応させた。 Tween-PBSでよく洗浄した後、第二抗体としてペルォ キシダーゼ標識抗マウスィムノグロブリン抗体〔ダコ社製〕を室温で 1時間反応させた 。 Tween- PBSで洗浄した後、検出は ECL- detection kit (アマシャム社製）を用いて行 い、 X線フィルム上に感光させた。
結果を図 8に示した。抗ヒト STSモノクローナル抗体 KM1049は STS (ARS C)以外 にも、 ARS D、 ARS E、 ARS Fに対しても結合することが明らかになった。
[0197] (3)抗ヒト STSモノクローナル抗体 KM1053の反応特異性
上記（1)で造成した各種 ARS遺伝子導入細胞を用いて抗ヒト STSモノクローナル K M1053のヒト STS特異性を、免疫沈降を用いて以下のようにして検討した。
Protein A bepharoseビ ~~ズ (Protein A bepharoseTMし L- 4B、 Amersham Bioscienc es、 Buckinghamshire, UK)をマイクロチューブ中で蒸留水に膨潤させながら、ビーズ の量が約 20 Lになるように目で確認しながらカ卩えた。ボルテックスで攪拌後、氷上で 10分間静置し、ビーズを自然沈降させた後、上清を捨て、再度蒸留水 lmLでビーズ を洗浄後、卓上簡易遠心機で 12秒間遠心してビーズを沈降させた (以降、ビーズの 沈降は同様に卓上簡易遠心機を用いた)。上清を捨て、 Wash buffer [0.05%トウィーン 20を含む 0.1mol/Lトリス-塩酸緩衝液 (pH7.5) ]を lmLカ卩え、氷上で 10分間静置した 後、ビーズを自然沈降させ、上清を除去した。 gの抗ヒト STSモノクローナル KM10 53を、ビーズを含む反応液に添カ卩し、ボルテックスで攪拌した。 Wash bufferを 980 μ Lカロえボルテックスで攪拌後、ローテ一ターで攪拌しながら 4°Cで一晩反応させた。ビ ーズを沈降後、 Wash buffer 980 μ Lで 2回ビーズを洗浄した。
[0198] 上記（2)で調製した各ァリルサルファターゼ溶液を蛋白質量で一反応当たり lmgと なるよう〖こ添加し、ボルテックスで攪拌後 Wash bufferを最終容量が 1 mLになるように 添加した。また、陰性対照は Wash bufferのみ 980 L添カ卩した。攪拌しながら 4°Cで 2 時間反応させ、各酵素溶液をビーズに吸着させた。ビーズを沈降し上清を除去後、 0 .5 mLの Wash bufferで 2回ビーズを洗浄し、さらに 0.5 mLの 0.1mol/Lトリス-塩酸（pH7 .5)緩衝液で 2回ビーズを洗浄した。ビーズを自然沈降後、上清を除去し、各ァリルサ ルファターゼ溶液が吸着したビーズに 1.2倍濃度の Sample buffer [75mmol/Lトリス-塩 酸緩衝液 (pH7.5)、 2.4% SDS、 6% 2-メルカプトエタノール、 0.0045% bromophenol blue 、 10% glycerol] 60 L添カ卩した。ボルテックスで攪拌後、 95°Cで 5分間インキュベート した。上清を SDS-ポリアクリル電気泳動にて分画後、 PVDF膜にブロッテイングした。 B SA— PBSでブロッキング後、抗ヒト STSモノクローナル抗体 KM1049を室温で 2時間反 応させた。 Tween-PBSでよく洗浄した後、第二抗体としてペルォキシダーゼ標識抗マ ウスィムノグロブリン抗体を室温で 1時間反応させた。 Tween-PBSでよく洗浄した後、 検出は ECL-detection kit (アマシャム社製）を用いて行い、 X線フィルム上に感光さ せた。
[0199] 結果を図 9に示した。図 9に示すように、抗ヒト STSモノクローナル抗体 KM1053によ る免疫沈降によりヒト STSのシグナルのみが検出され、図 9で認められた ARS D、 ARS E, ARS Fのシグナルが消失したことから抗ヒト STSモノクローナル抗体 KM1053が AR S D、 ARS E, ARS Fに結合しないこと力 ^明ら力となった。
(4)抗ヒト STSモノクローナル抗体 KM1049および抗ヒト STSモノクローナル抗体 KM1 053の ARS A、 ARS Bに対する交叉反応性の検討
ARS A、 ARS Bおよび ARS Cであるヒト STSを固層化したバインディング ELISAにより 抗ヒト STSモノクローナル抗体 KM1049および抗ヒト STSモノクローナル抗体 KM1053 の ARS A、 ARS Bに対する交叉反応性を検討した。動物細胞発現精製 ARS A、 ARS Bおよび実施例 1 (1)に記載の方法で取得した精製ヒト STSを 2 μ g/mLでプレートに 固相化し、実施例 1 (3)に記載の方法と同様にしてバインディング ELISAを行い、結 果を図 10に示した。
[0200] 図 10に示されるように、抗ヒト STSモノクローナル抗体 KM1053および抗ヒト STSモ ノクローナル抗体 KM1049は、いずれも ARS Aまたは ARS Bに対する交叉反応性は示 さなかった。
上記（2)、 （3)および（4)の結果、抗ヒト STSモノクローナル抗体 KM1053はヒト STS 以外のァリルサルファターゼに反応せず、ヒト STSに特異的なモノクローナル抗体で あることが示された。
実施例 4
[0201] ヒト STS定量系の構築
(1)抗ヒト STSモノクローナル抗体 KM1049のピオチン化
抗ヒト STSモノクローナル抗体 KM1049精製抗体を、 NHS- Lc- Biotin (PIERCE社製） を用いてピオチンィ匕した。すなわち、 lmLの lmg/mLの濃度の精製された抗ヒト STS モノクローナル抗体 KM1049に、 250 /z Lの 0.5mol/L炭酸緩衝液（pH9.2)を加え、 250 μ Lの lmg/mLの濃度の NHS- Lc- Biotin (lmg/mL)を加えて、室温で、 3時間撹拌し た。 PBSで終夜透析したものを、ピオチン化抗ヒト STSモノクローナル抗体 KM1049と して用いた。
[0202] (2)ヒト STS精製
ヒト STS遺伝子導入細胞株 cs3-l細胞より抗ヒト STSモノクローナル抗体 KM1053抗 体力ラムを用いて、以下のようにしてヒト STSを精製した。
[0203] 5mL容積の Hi- Trap NHS- activated (Pharmacia Biotech社製）に、抗ヒト STSモノク ローナル抗体 KM1053を 10 mgカップリングさせた。実施例 2 (3)で得られたじ33-1細 胞（約 50 X 107 cells)はシャーレにて、 B3培地で静置培養を行った。該シャーレを PB Sで洗浄した後、セルスクレイパーでシャーレ上の細胞を回収した。これを 50mLの TC S buffer [1% CHAPS, 0.5mol/L NaClを含む 50mmol/Lトリス-塩酸緩衝液（pH7.8) ] で懸濁し、氷上にてマイクロチップをつなげた Ultrasonic disruptor MODEL UR-200P (TOMY社製）で、出力 6にて 5秒ごとの οη-οί¾10〜12回繰り返して超音波破砕を行 つた後、冷却遠心機で 10000rpm、 10分間、 4°Cで遠心分離し、その上清を 0.45 μ mの フィルター（Sartorius社製）に通し、 TCS bufferで平衡化した抗体カラムに、流速 2.5 m L/minで通塔し、吸着させた。これを 25mLの TCS bufferで洗浄した後、 DioC buffer [1 0% Dioxane, 1% CHAPS, 0.5mol/L NaClを含む 20mmol/Lトリス緩衝液（pHll) ]にて 溶出した。最初の 4mLは廃棄し、次の 26mLを予め 1.3mLの lmol/Lトリス-塩酸緩衝液 (PH6.8)を分注した容器に回収し、回収と同時に中和した。回収した溶液を centriplu s 50 (amicon社製）に移し、スイングローターで 3000rpm、約 20分間室温にて遠心分離 し、約 5mLに濃縮されたところで等量の TC buffer[l% CHAPSを含む 50mmol/Lトリス -塩酸緩衝液 (pH7.8) ]を加えさらに遠心分離した。この操作を 5回繰り返して脱塩、 濃縮を行い、液量が約 4 mLになったところで、 centricon 30 (amicon社製）に移し替え 、約 lmLになるまで濃縮し、精製ヒト STSを得た。得られた STSは STS定量系の標準 抗原として用いた。
[0204] (3)ヒト STS定量系
96穴の EIA用プレートに 10 μ g/mLの濃度の精製した抗ヒト STSモノクローナル抗体 KM1053を 50 L/穴で分注し、 4°Cでー晚放置して吸着させた。洗浄後、 1%BSA-PBS を 100 L/穴でカ卩え、室温 1時間反応させて残っている活性基をブロックした。 1%BSA -PBSを捨て、上記（2)で取得した精製ヒト STSあるいはコントロール蛋白質 (組換え 精製 IL-1 β )を ί μ g/mLから作製した 2倍希釈系列の溶液を 50 μ L/穴で分注し 4°Cで 一晩反応させた。 Tween-PBSで洗浄後、上記（1)で調製した 10 g/mLの濃度のビ ォチン化抗ヒト STSモノクローナル抗体 KM1049を 50 μ L/穴でカ卩えて 50 μ L/穴で分 注し、さらに Tween-PBSで洗浄後アビジン- HRP (VECTOR社製）を 50 μ L/穴で分注 し室温、 1時間反応させた。 Tween-PBSで洗浄後、 ABTS基質液を用いて発色させ 0 D415nmの吸光度をプレートリーダー（NJ2001;日本インターメッド社製）にて測定した 。図 11に結果を示した。
[0205] 図 11に示されるように、抗ヒト STSモノクローナル抗体 KM1053を用いることにより、 ヒト STSを定量することができ、その検出限界濃度は約 0.01 μ g/mLであった。
産業上の利用可能性
[0206] 本発明によれば、ヒトステロイドスサファターゼ（Steroid sulfatase；以下、 STSと略記 する）と特異的に結合し、ヒト STS以外のァリルサルファターゼ (以下、 ARSと略記する )に結合しない抗体または抗体断片、該抗体を生産するハイブリドーマが提供される 。また、本発明によれば、該抗体または抗体断片を用いる、ヒト STSの免疫学的検出 方法または免疫学的定量方法、ヒト STSの免疫学的検出用試薬またはキットおよび 免疫学的定量用試薬またはキット、さらには、ヒト STS関連疾患を判定、ヒト STS関連 疾患の治療に適する薬剤の選択およびヒト STS関連疾患の病態の判定のための、 該抗体または抗体断片を用いる、ヒト STSの免疫学的検出方法または免疫学的定量 方法、ヒト STSの免疫学的検出用試薬またはキットおよび免疫学的定量用試薬また はキットが提供される。
配列表フリーテキスト
配列番号 1-人工配列の説明：合成 DNA 配列番号 2-人工配列の説明：合成 DNA 配列番号 3-人工配列の説明：合成 DNA 配列番号 4-人工配列の説明：合成 DNA

Claims

請求の範囲
[I] ヒトステロイドスルファターゼ（以下、 STSと略記する）と特異的に結合し、ヒト STS以 外のァリルスルファターゼに結合しない抗体または抗体断片。
[2] ヒト STS以外のァリルスルファターゼが、ァリルスルファタ一ゼ八、ァリルスルファタ一 ゼ 、ァリルスルファタ一ゼ0、ァリルスルファターゼ Eまたはァリルスルファターゼ Fで ある請求項 1記載の抗体または抗体断片。
[3] 抗体が、モノクローナル抗体である請求項 1または 2に記載の抗体または抗体断片。
[4] モノクローナル抗体が、ハイプリドーマ KM1053 (FERM BP-10015)から生産されるモ ノクローナル抗体が結合するェピトープと結合するモノクローナル抗体である請求項
3に記載のモノクローナル抗体または抗体断片。
[5] ハイプリドーマ KM1053 (FERM BP-10015)力も生産される請求項 3に記載のモノクロ ーナル抗体または抗体断片。
[6] 請求項 3〜5の 、ずれか 1項に記載のモノクローナル抗体または抗体断片を生産す るハイブリドーマ。
[7] ハイプリドーマが、ハイプリドーマ KM1053 (FERM BP-10015)である請求項 6に記載 のノヽイブリドーマ。
[8] 請求項 1〜5のいずれか 1項に記載の抗体または抗体断片を用いることを特徴とする
、検体中のヒト STSの免疫学的検出方法。
[9] 請求項 1〜5のいずれか 1項に記載の抗体または抗体断片を用いることを特徴とする
、検体中のヒト STSの免疫学的定量方法。
[10] 免疫学的定量方法が、酵素免疫測定法である請求項 9に記載の方法。
[II] 検体が、ヒト由来の生体試料である請求項 8〜10のいずれか 1項に記載の方法。
[12] 請求項 1〜5のいずれか 1項に記載の抗体または抗体断片を用いて検体中のヒト ST
Sを免疫学的に検出または定量し、ヒト STS関連疾患を判定するための、検体中のヒ ト STSの免疫学的検出方法または免疫学的定量方法。
[13] ヒト STS関連疾患力 ヒト STSが関与するエストロゲン依存性疾患である請求項 12記 載の方法。
[14] ヒト STSが関与するエストロゲン依存性疾患が悪性腫瘍、良性腫瘍および皮膚疾患 力 選ばれる疾患である請求項 13記載の方法。
[15] 請求項 1〜5のいずれか 1項に記載の抗体または抗体断片を用いて、検体中のヒト S TSを免疫学的に検出または定量し、検出または定量結果よりヒト STS関連疾患の治 療に適する薬剤を選択するための、検体中のヒト STSの免疫学的検出方法または免 疫学的定量方法。
[16] ヒト STS関連疾患力 ヒト STSが関与するエストロゲン依存性疾患である請求項 15に 記載の方法。
[17] ヒト STSが関与するエストロゲン依存性疾患が悪性腫瘍、良性腫瘍および皮膚疾患 力 選ばれる疾患である請求項 16記載の方法。
[18] ヒト STS関連疾患の治療に適する薬剤がホルモン療法剤または STS阻害剤である 請求項 15〜 17のいずれか 1項に記載の方法。
[19] 請求項 1〜5のいずれか 1項に記載の抗体または抗体断片を用いて、検体中のヒト S
TSを免疫学的に検出または定量し、検出または定量結果よりヒト STS関連疾患の病 態を判定するための、ヒト STSの免疫学的検出方法または免疫学的定量方法。
[20] ヒト STS関連疾患力 ヒト STSが関与するエストロゲン依存性疾患である請求項 19に 記載の方法。
[21] ヒト STSが関与するエストロゲン依存性疾患が悪性腫瘍、良性腫瘍および皮膚疾患 力も選ばれる疾患である請求項 20記載の方法。
[22] 請求項 1〜5のいずれか 1項に記載の抗体または抗体断片を含有することを特徴とす る、検体中のヒト STSの免疫学的検出用試薬またはキット。
[23] 請求項 1〜5のいずれか 1項に記載の抗体または抗体断片を含有することを特徴とす る、検体中のヒト STSの免疫学的定量用試薬またはキット。
[24] 免疫学的定量が、酵素免疫測定法を用いる定量である請求項 23に記載の試薬また はキット。
[25] 検体が、ヒト由来の生体試料である請求項 22〜24のいずれか 1項に記載の試薬ま たはキット。
[26] 請求項 1〜5のいずれか 1項に記載の抗体または抗体断片を含有することを特徴とす る、ヒト STS関連疾患判定用試薬またはキット。
[27] ヒト STS関連疾患力 ヒト STSが関与するエストロゲン依存性疾患である請求項 26に 記載の試薬またはキット。
[28] ヒト STSが関与するエストロゲン依存性疾患が悪性腫瘍、良性腫瘍および皮膚疾患 力も選ばれる疾患である請求項 27記載の試薬またはキット。
[29] 請求項 1〜5のいずれか 1項に記載の抗体または抗体断片を含有することを特徴とす る、ヒト STS関連疾患の治療に適する薬剤選択用試薬またはキット。
[30] ヒト STS関連疾患力 ヒト STSが関与するエストロゲン依存性疾患である請求項 29に 記載の試薬またはキット。
[31] ヒト STSが関与するエストロゲン依存性疾患が悪性腫瘍、良性腫瘍および皮膚疾患 力も選ばれる疾患である請求項 30記載の試薬またはキット。
[32] ヒト STS関連疾患治療に適する薬剤が、ホルモン療法剤または STS阻害剤である請 求項 29〜31のいずれ力 1項に記載の試薬またはキット。
[33] 請求項 1〜5のいずれか 1項に記載の抗体または抗体断片を含有することを特徴とす る、ヒト STS関連疾患の病態判定用試薬またはキット。
[34] ヒト STS関連疾患力 ヒト STSが関与するエストロゲン依存性疾患である請求項 33に 記載の試薬またはキット。
[35] ヒト STSが関与するエストロゲン依存性疾患が、悪性腫瘍、良性腫瘍および皮膚疾 患力も選ばれる疾患である請求項 34記載の試薬またはキット。
[36] 請求項 1〜5のいずれか 1項に記載の抗体または抗体断片を含有することを特徴とす る、ヒト STS関連疾患の診断薬。
[37] ヒト STS関連疾患力 ヒト STSが関与するエストロゲン依存性疾患である請求項 36に 記載の診断薬。
[38] ヒト STSが関与するエストロゲン依存性疾患が悪性腫瘍、良性腫瘍および皮膚疾患 力も選ばれる疾患である請求項 37に記載の診断薬。
[39] 請求項 1〜5のいずれか 1項に記載の抗体または抗体断片を含有することを特徴とす る、ヒト STS関連疾患の病態の診断薬。
[40] ヒト STS関連疾患力 ヒト STSが関与するエストロゲン依存性疾患である請求項 39に 記載の診断薬。
[41] ヒト STSが関与するエストロゲン依存性疾患が悪性腫瘍、良性腫瘍および皮膚疾患 力 選ばれる疾患である請求項 40に記載の診断薬。
[42] 請求項 1〜5のいずれか 1項に記載の抗体または抗体断片を用いて、検体中のヒト S
TSを免疫学的に検出または定量し、検出または定量結果よりヒト STS関連疾患を診 断する方法。
[43] ヒト STS関連疾患力 ヒト STSが関与するエストロゲン依存性疾患である請求項 42に 記載の方法。
[44] ヒト STSが関与するエストロゲン依存性疾患が悪性腫瘍、良性腫瘍および皮膚疾患 力 選ばれる疾患である請求項 43に記載の方法。
[45] 請求項 1〜5のいずれか 1項に記載の抗体または抗体断片を用いて、検体中のヒト S
TSを免疫学的に検出または定量し、検出または定量結果よりヒト STS関連疾患の治 療に適する薬剤を選択する方法。
[46] ヒト STS関連疾患力 ヒト STSが関与するエストロゲン依存性疾患である請求項 45に 記載の方法。
[47] ヒト STSが関与するエストロゲン依存性疾患が悪性腫瘍、良性腫瘍および皮膚疾患 力 選ばれる疾患である請求項 46に記載の方法。
[48] ヒト STS関連疾患の治療に適する薬剤がホルモン療法剤または STS阻害剤である 請求項 45〜47の!、ずれ力 1項に記載の方法。
[49] 請求項 1〜5のいずれか 1項に記載の抗体または抗体断片を用いて、検体中のヒト S
TSを免疫学的に検出または定量し、検出または定量結果よりヒト STS関連疾患の病 態を診断する方法。
[50] ヒト STS関連疾患力 ヒト STSが関与するエストロゲン依存性疾患である請求項 49に 記載の方法。
[51] ヒト STSが関与するエストロゲン依存性疾患が悪性腫瘍、良性腫瘍および皮膚疾患 力も選ばれる疾患である請求項 50に記載の方法。
[52] 請求項 22〜41のいずれか 1項に記載の試薬、キットまたは診断薬を製造するための 請求項 1〜5のいずれか 1項に記載の抗体または抗体断片の使用。
[53] 請求項 6または 7に記載のハイプリドーマを培地に培養し、培養物中に請求項 3〜5 の 、ずれか 1項に記載のモノクローナル抗体または抗体断片を生成蓄積させ、培養 物から抗体または抗体断片を採取することを特徴とする請求項 3〜5のいずれか 1項 に記載のモノクローナル抗体または抗体断片の製造方法。
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