WO2006059691A1 - 抗肥満薬のスクリーニング方法 - Google Patents

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WO2006059691A1
WO2006059691A1 PCT/JP2005/022107 JP2005022107W WO2006059691A1 WO 2006059691 A1 WO2006059691 A1 WO 2006059691A1 JP 2005022107 W JP2005022107 W JP 2005022107W WO 2006059691 A1 WO2006059691 A1 WO 2006059691A1
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agf
growth factor
angiopoietin
mice
related growth
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PCT/JP2005/022107
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English (en)
French (fr)
Inventor
Kunio Yasunaga
Noboru Yamaji
Kunitake Abe
Yuichi Oike
Original Assignee
Astellas Pharma Inc.
Keio University
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Publication date
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    • G01N2800/04—Endocrine or metabolic disorders
    • G01N2800/044—Hyperlipemia or hypolipemia, e.g. dyslipidaemia, obesity

Definitions

  • the present invention relates to a screening method for anti-obesity drugs.
  • Leptin is a weight gain suppressive hormone, and it is known that lack of leptin increases appetite, reduces energy consumption, and causes obesity.
  • the discovery of such factors involved in the accumulation of adipose tissue and the enlargement of adipocytes is very useful for the development of therapeutic agents for diseases such as obesity, diabetes, and hyperlipidemia (non-patented Reference 6).
  • Angiopoietin-related growth factor is a secreted protein having a coiled-coil domain on the N-terminal side and a fibrinogen-like domain on the C-terminal side.
  • AGF is the same as NL8 reported in Patent Document 1, and it has been reported that when NL8 is stably expressed in CHO cells and subcutaneously transplanted into nude mice, CHO becomes tumorigenic. .
  • Tg transgenic
  • Patent Document 1 Non-Patent Document 7
  • Patent Documents 3 to 13 disclose polypeptides having the same amino acid sequence as human AGF of the present specification.
  • Expression distribution analysis Patent Document 3 and Patent Document 4
  • Growth inhibitory activity induced by vascular endothelial growth factor (VEGF) stimulation (Patent Document 4)
  • Overexpression in growth factor-treated human umbilical vein endothelial cells HUV EC Patent Document 5 and Patent Document 6 describe that the same polypeptide as AGF is related to the promotion or inhibition of angiogenesis, angiogenesis, and many of the diseases of cardiovascular, endothelium, and angiogenesis that are treated by the polypeptide. These diseases are listed (Patent Documents 3 to 9).
  • Patent Documents 10 to 13 suggest that AGF is used for proliferation of epithelial cells and wound healing.
  • Non-Patent Document 1 “Metabolism”, (USA), 1987, 36 ⁇ , p.54-59
  • Non-Patent Document 2 “Japanese Clinical”, 2003, 61 ⁇ , Special Issue 6, Obesity, p.649-654
  • Non-patent document 3 “Japanese clinical”, 2002, 60 ⁇ , special issue 9, Diabetes of the new era 3, p.31 0-331
  • Non-Patent Document 4 "Ayumi of Medicine", 2000, 192 ⁇ , P.513—518
  • Non-Patent Document 5 “Ayumi of Medicine”, 2000, 192 ⁇ , P.541—545
  • Non-Patent Document 6 “Trends in Molecular Medicine” ⁇ ⁇ Medicines (Trends in Molecular Medicine)
  • Non-Patent Document 7 “Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America J” , (USA), 2003, 100 ⁇ , p. 9494-9499
  • Patent Document 1 International Publication No. 99/15653 Pamphlet
  • Patent Document 2 Pamphlet of International Publication No. 03/083114
  • Patent Document 3 International Publication No. 00/32221 Pamphlet
  • Patent Document 4 Pamphlet of International Publication No. 00/53753
  • Patent Document 5 Pamphlet of International Publication No. 02/00690
  • Patent Document 6 International Publication No. 02/08284 Pamphlet
  • Patent Document 7 US Patent Application Publication No. 2004/0043927
  • Patent Document 8 US Patent Application Publication No. 2003/0105012
  • Patent Document 9 US Patent Application Publication No. 2003/0105011
  • Patent Document 10 US Patent No. 6350450 Specification
  • Patent Document 11 US Patent No. 6413770
  • Patent Document 12 Japanese Patent Laid-Open No. 2000-300263
  • Patent Document 13 US Pat. No. 6,420,542
  • An object of the present invention is to provide novel antiobesity agents, diabetes therapeutic agents, and novel therapeutic agents for Z or hyperlipidemia. It is to provide a screening method.
  • AGF has anti-obesity, anti-diabetic, and anti-hyperlipidemic effects by producing and analyzing AGF knockout (KO) mice and AGF transgenic (Tg) mice. Clarified that it has.
  • AGF KO mice show marked obesity, the fat tissue weight associated with obesity increases, the fat cells become hypertrophied, and the amount of triglycerides in skeletal muscle and liver tissue, which is known to increase with obesity, increases. It was found that anti-insulinemia and glucose tolerance deteriorated (Reference Examples 4 to 8).
  • AGF Tg mice CAG—AGF Tg mice; mice that forcibly expressed AGF throughout the body
  • suppressed weight gain suppressed adipose tissue weight increase
  • suppressed adipocyte hypertrophy suppressed skeletal muscle.
  • the amount of triglyceride in the liver tissue was decreased, and further, insulin sensitivity was improved, and lipid metabolism and glucose tolerance were improved (Reference Examples 4 to 7 and Reference Examples 15 to 16).
  • Enhancers ie, substances with AGF agonist activity and AGF / cell binding promoters are useful as anti-obesity agents, anti-diabetic agents, and active ingredients in anti-obesity agents or anti-hyperlipidemic agents Showing
  • the present inventors have been able to measure the amount of AGF protein by ELISA (enzyme-linked ELISA (enzyme-linked ELISA).
  • An immunosorbent assay) system was constructed (Examples 3, 4, 7, 10), and a quantitative PCR method for measuring the amount of AGF gene was established (Example 13).
  • a method for obtaining DNA for the mouse AGF promoter region and screening for an AGF expression enhancer using the DNA was constructed (Example 15).
  • AGF promotes mitogen-activated protein kinase (MAPK) phosphate, and analyzed AMAP by analyzing MAPK phosphate.
  • a screening method for an enhancer was constructed (Example 16).
  • a screening method for an AGF binds to the cell surface, and a screening method for an AGF function-enhancing agent by analyzing the binding of AGF to cells was constructed (Example 17). That is, the present inventors constructed a novel screening method for anti-obesity drugs, antidiabetic drugs, and Z or hyperlipidemia drugs (Examples 3, 4, 7, 10, 13, and 15-17). ) And provided to complete the present invention.
  • An anti-obesity agent, an anti-diabetic agent, and a therapeutic agent for Z or hyperlipidemia including a step of analyzing whether or not the test substance enhances the expression and Z or function of angiopoietin-related growth factor A screening method;
  • a step of contacting a cell with a test substance and an angiopoietin-related growth factor i) a step of contacting a cell with a test substance and an angiopoietin-related growth factor; and ii) a step of measuring the amount of angiopoietin-related growth factor bound to the cell and analyzing the change in the amount of the binding dependent on the test substance.
  • test substance enhances the expression and Z or function of angiopoietin-related growth factor
  • a method for screening an angiopoietin-related growth factor expression enhancer and Z or a function enhancer comprising:
  • a step of contacting a cell with a test substance and an angiopoietin-related growth factor i) a step of contacting a cell with a test substance and an angiopoietin-related growth factor; and ii) a step of measuring the amount of angiopoietin-related growth factor bound to the cell and analyzing the change in the amount of the binding dependent on the test substance.
  • WO 04/108920 published after the priority date of the present application, discloses that AGF has anti-obesity, diabetes and Z or hyperlipidemia treatment effects. Also book Published after the priority date Nature
  • anti-obesity drugs include both drugs used for the treatment of obese patients and drugs used prophylactically for subjects who are prone to fullness.
  • diabetes therapeutic agent includes both agents used for the treatment of patients with diabetes and agents used prophylactically in subjects with a tendency to diabetes.
  • hyperlipidemic agent includes both drugs used for the treatment of patients with hyperlipidemia and drugs used prophylactically for subjects with a tendency to hyperlipidemia. Is included.
  • screening in the present specification is a substance in which a substance having a target activity is screened out from a large number of test substances, and a substance has a target property with respect to a certain test substance. It includes both detecting force or not.
  • the "AGF expression enhancer” in the present specification refers to a substance that enhances the amount of AGF protein or gene.
  • the “AGF function-enhancing agent” refers to a substance that enhances the function of AGF.
  • a substance useful as an anti-obesity drug, diabetes therapeutic drug, and Z or hyperlipidemia therapeutic drug can be screened.
  • FIG. 1 is a drawing schematically showing the structure of plasmid pBS-loxP-lox71-mAGF-jS geo.
  • the symbols “pro.” And “pri.” Mean promoter and primer, respectively.
  • FIG. 2 is a graph showing changes in body weight of AGF KO mice.
  • the horizontal axis indicates the age (weeks), and the vertical axis indicates the body weight (g).
  • the symbols “WT”, “HTR”, and “HM” mean WT mouse, hetero KO mouse, and homo KO mouse, respectively.
  • FIG. 3 is a graph showing changes in the weight of genital fat (white adipose tissue) in CAG-AGF Tg mice (standard diet).
  • the vertical axis represents white adipose tissue weight (g) Z body weight (g).
  • T and Tg mean WT mouse and Tg mouse, respectively.
  • FIG. 4 is a graph showing changes in the weight of genital fat (white adipose tissue) in CAG-AGF Tg mice (high fat diet load).
  • the vertical axis represents white adipose tissue weight (g) Z body weight (g).
  • the symbols “WT” and “Tg” mean WT mouse and Tg mouse, respectively.
  • the vertical axis represents the white adipose tissue weight (g).
  • the symbols “WT” and “H” are the white adipose tissue weight (g).
  • TR and HM are WT mouse, AGF hetero KO mouse, and AGF homolog, respectively.
  • FIG. 6 is a graph showing changes in genital fat (white adipose tissue) weight (white adipose tissue weight Z body weight) in AGF KO mice.
  • the vertical axis represents white adipose tissue weight (g) Z body weight (g).
  • the symbols “WT”, “HTR”, and “HM” mean WT mouse, AGF hetero KO mouse, and AGF homo KO mouse, respectively.
  • FIG. 7 is a drawing showing the morphology of adipocytes in CAG-AGF Tg mice. The symbol “TG”
  • FIG. 8 is a drawing showing the morphology of adipocytes in AGF homozygous KO mice.
  • FIG. 9 is a drawing showing the morphology of fat cells of Rita Imate WT mice.
  • FIG. 10 is a graph showing the TG content in the tissue (liver) of CAG-AGF Tg mice.
  • the horizontal axis shows the high-fat diet load (for months), and the vertical axis shows the TG content (mgZg tissue).
  • the symbols “WT” and “Tg” mean WT mouse and Tg mouse, respectively.
  • FIG. 11 is a graph showing the TG content in the tissue (skeletal muscle) of CAG-AGF Tg mice.
  • the horizontal axis shows the high-fat diet load (in months), and the vertical axis shows the TG content (mgZg tissue).
  • T and Tg mean WT mouse and Tg mouse, respectively.
  • FIG. 12 is a graph showing the TG content in tissues of AGF KO mice. Vertical axis is TG content (mg
  • FIG. 13 is a graph showing the results of glucose tolerance test (blood glucose level) in AGF KO mice.
  • the horizontal axis represents time (minutes) and the vertical axis represents blood glucose levels (mgZdL).
  • the symbols “WT” and “HM” mean WT mice and homo KO mice, respectively.
  • FIG. 14 is a graph showing the results of glucose tolerance test (plasma insulin) in AGF KO mice.
  • the horizontal axis represents time (minutes) and the vertical axis represents plasma insulin (ngZmL).
  • the symbols “WT” and “HM” mean WT mice and homo KO mice, respectively.
  • FIG. 15 is a graph showing the results of a glucose metabolism test in mice administered with mouse AGF-expressing adenovirus.
  • the black circle is the result of the mouse administered with mAGF-Adeno
  • the white circle is the result of the mouse administered with Cont-Adeno.
  • the horizontal axis is the elapsed time (minutes), and the vertical axis is the blood glucose level (mgZd U).
  • FIG. 16 is a graph showing plasma insulin concentrations (vertical axis; ng / mL) of CAG-AGF Tg mice and Rita Imate WT mice bred with a high fat diet.
  • the symbols “TG” and “NTG” mean CAG-AGF Tg mouse and Rita-mate WT mouse, respectively.
  • FIG. 17 is a graph showing serum cholesterol concentrations (vertical axis; mg / dL) of CAG-AGF Tg mice and Rita Imate WT mice bred with a high fat diet.
  • the symbols “TG” and “NTG” mean CAG-AGF Tg mouse and Rita-mate WT mouse, respectively.
  • FIG. 18 is a graph showing serum free fatty acid concentrations (vertical axis; ⁇ Eq / L) of CAG-AGF Tg mice and Rita mate WT mice bred on a high fat diet.
  • the symbols “TG” and “NTG” mean CAG-AGF Tg mouse and Rita-mate WT mouse, respectively.
  • FIG. 19 is a graph showing the results of a glucose metabolism test in CAG-AGF Tg mice and Rita Imate WT mice.
  • the symbols “TG” and “NTG” mean CAG-AGF Tg mouse and Rita Imate WT mouse, respectively. Further, the horizontal axis is the elapsed time (minutes), and the vertical axis is the blood glucose level (mg / dL).
  • FIG. 20 is a graph showing the results of an insulin sensitivity test of CAG-AGF Tg mice and Rita Imate WT mice.
  • the symbols “TG” and “NTG” mean CAG-AGF Tg mouse and Rita-mate WT mouse, respectively.
  • the horizontal axis is the elapsed time (minutes), and the vertical axis is the ratio (%) of blood glucose level after administration to blood glucose level before insulin administration.
  • FIG. 21 Visceral adipose tissue weight in K14—AGF Tg mice and Rita mate WT mice. It is a graph which shows.
  • the symbols “K14 AGF” and “NTG” mean K14 AGF Tg mouse and Rita-mate WT mouse, respectively.
  • the vertical axis represents the percentage (%) of the built-in fat tissue weight per body weight.
  • FIG. 22 is a graph showing the weight of subcutaneous fat and weave in K14-AGF Tg mice and Rita Imate WT mice.
  • the symbols “K14 AGF” and “NTG” mean K14 AGF Tg mouse and Rita-mate WT mouse, respectively.
  • the vertical axis represents the percentage (%) of the subcutaneous fat tissue weight per body weight.
  • FIG. 23 is a graph showing the results of an insulin sensitivity test in K14-AGF Tg mice and Rita Imate WT mice.
  • the symbols “K14—AGF” and “NTG” mean K14—A GF Tg mouse and Ritamate WT mouse, respectively.
  • the horizontal axis represents the elapsed time (minutes), and the vertical axis represents the ratio (%) of the blood glucose level after administration to the blood glucose level before insulin administration.
  • FIG. 24 is a graph showing the results of a glucose metabolism test in mice administered with human AGF-expressing adenovirus. Black circles are the results for mice administered with hAGF-Adeno, and white circles are the results for mice administered with Cont-Adeno. The horizontal axis is the elapsed time (minutes), and the vertical axis is the blood glucose level (mgZdL).
  • FIG. 25 is a graph showing mouse AGF promoter activity in FaO cells. The vertical axis is the activity (correction value).
  • AGF has the action of anti-obesity, anti-diabetes, and anti-hyperlipidemia. Therefore, the AGF expression-enhancing agent and Z or AGF function-enhancing agent are anti-obesity agents, glycouria,
  • the screening method of the present invention is based on a novel finding that it is useful as a therapeutic agent and an active ingredient of a therapeutic agent for Z or hyperlipidemia.
  • a screening method using the change in the amount of AGF protein or gene as an index (hereinafter referred to as AGF type screening method),
  • promoter type screening method Screening method using mouse AGF promoter
  • MAPK type screening method Screening method using MAPK phosphate change as an index
  • test substance used in the screening method of the present invention is not particularly limited.
  • commercially available compounds including peptides
  • various known compounds including peptides registered in the chemical file.
  • Compound groups obtained by combinatorial chemistry technology Tetrahedron, ⁇ ⁇ , 813 ⁇ —81a3, 199 ⁇
  • microbial culture supernatants derived from plants and marine organisms
  • the AGF type screening method of the present invention comprises:
  • an AGF expression enhancing agent can be screened, and the AGF expression enhancing agent screened by the AGF type screening method of the present invention includes an anti-obesity agent, a diabetes therapeutic agent, And Z or can be used as an active ingredient in antihyperlipidemic drugs.
  • the cell used in the AGF type screening method of the present invention is not particularly limited as long as it is a force expressing endogenous AGF or a cell capable of expressing it.
  • a mouse skeletal myoblast cell line And C2C12 cells ATCC number: CRL-1772
  • human liver cancer cell line HepG2 ATCC number: HB-8065
  • the cells are not limited to cultured cells
  • the AGF type screening method includes contacting a test substance with animal cells by administering a test substance to the animal. Contact the test substance using the culture supernatant, cell lysate of the cell contacted with the test substance, or a sample (serum, tissue-derived cell, etc.) obtained from the animal to which the test substance has been administered.
  • the amount of endogenous AGF protein or gene in the cultured cells is measured, and changes in the amount of endogenous AGF protein or gene dependent on the test substance are analyzed.
  • the measurement of the amount of AGF protein can be performed by a known method, for example, immunoassay or Western blotting, and is preferably performed by immunoassay.
  • measuring the amount of AGF protein For example, measuring the amount of AGF protein
  • An AGF type screening method which is a measurement by an immunoassay containing, is also included in the present invention.
  • AGF gene amount is measured by a known method such as quantitative PCR (polymerase).
  • Example 13 For measurement of the mouse AGF gene amount, measurement by the quantitative PCR method described in Example 13 is particularly preferred.
  • SEQ ID NO: 51 was used as a primer for the measurement of the rat AGF gene amount, except that the oligonucleotide pair represented by SEQ ID NO: 43 and SEQ ID NO: 44 was used as a primer.
  • Measurement by quantitative PCR using the same method as described in Example 13 is particularly preferred except that the oligonucleotide pair represented by column number 52 is used.
  • the primer set used in the quantitative PCR method is not particularly limited as long as it is a forward and reverse primer set designed so that the AGF gene can be specifically amplified.
  • AGF gene sequence for example, the sequence of GenBank database accession numbers NM—145154 (mouse), NM—031917 (human), XM—216613 (rat)], analysis software (Primer
  • primer sets include SEQ ID NOs: 29 and 30 (mouse AGF content measurement; primer set used in Example 13), SEQ ID NOs: 43 and 44 (human AGF content measurement; the primer), SEQ ID NOs: 51 and 52 ( Rat AGF amount measurement; the above-mentioned primer).
  • the conditions (ELISA) described in Example 3, Example 4, Example 7, or Example 10 or the conditions described in Example 13 quantitative P Substances with AGF expression level (protein quantity or gene quantity) of 1.5 times or more (preferably 2 times or more, more preferably 4 times or more) by the CR method)
  • the substance is a compound
  • a substance having the above activity at a molZL concentration preferably 1 ⁇ mol / L, more preferably 0.1 ⁇ molZL
  • the promoter type screening method of the present invention comprises:
  • the ⁇ 1 is a vector in which a reporter gene is fused downstream of DNA having a base force of No. 16 to No. 6684 in the base sequence represented by Nos. 16 to 5572 or SEQ ID No. 2.
  • Transformed cells with test article Contacting the and, ii) measuring the expression of the reporter gene and analyzing the change in the expression dependent on the test substance
  • an AGF expression enhancer can be screened, and the AGF expression enhancing agent screened by the promoter type screening method of the present invention is an anti-obesity agent, diabetes mellitus. It can be used as an active ingredient in therapeutic agents and Z or hyperlipidemia therapeutic agents.
  • DNA having promoter activity of angiopoietin-related growth factor including a nucleotide sequence that is 90% or more identical to a nucleotide sequence represented by SEQ.
  • the promoter preferably lacks 1 to 10 bases in the base sequence represented by SEQ ID NO: 1, which also has the base strengths of 672 to 5572.
  • a DNA having a deleted, substituted, and Z or inserted sequence and having promoter activity of an angiopoietin-related growth factor, or a sequence having base strengths from 672 to 5572 in the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 DNA having a nucleotide sequence of 90% or more identity and having promoter activity of an angiopoietin-related growth factor
  • the 16th sequence containing the sequence having the basic strengths of 672 to 5572 is also used.
  • DNA consisting of a sequence having the basic strength of No. 16 to No. 5572 in the base sequence represented by SEQ ID NO: 1, or
  • DNA consisting of a sequence having the basic strength of No. 16 to No. 6684 in the base sequence represented by SEQ ID NO: 2
  • the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 is a sequence of a mouse AGF promoter region having a length of about 5.6 kb upstream of exon 1 of the mouse AGF gene.
  • the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 is about 6.7 kb upstream of exon 2 of mouse AGF gene (consisting of about 5.6 kb upstream of exon 1, about 100 b exon 1 and about 1 kb in intron 1). This is the sequence of the mouse AGF promoter region.
  • Reporter gene Atsey (Tamura et al., Transcription Factor Research Method, Yodosha, 1993) is a method for analyzing (detecting or measuring) gene expression regulation using reporter gene expression as a marker.
  • regulation of gene expression is controlled by a portion called a promoter region located in the 5 'upstream region, and the gene expression level at the transcription stage can be estimated by measuring the activity of this promoter.
  • the test substance activates the promoter, it activates transcription of a reporter gene located downstream of the promoter region.
  • the promoter activity can be detected by substituting the reporter gene expression for promoter activity. Therefore, by the reporter gene assembly using the AGF promoter region, the effect of the test substance on the regulation of AGF expression can be detected by replacing the expression of the reporter gene.
  • the "reporter gene” fused with the promoter is a commonly used one.
  • the enzyme gene is not particularly limited, but is preferably an enzyme gene that can be easily quantitatively measured.
  • CAT chloramphie-cholacetyltransferase gene
  • Luc luciferase gene
  • GFP green fluorescent protein gene
  • the reporter gene may be functionally fused with the promoter.
  • the reporter gene fused with the promoter is stably or transiently expressed in cells (eg, animal cells or yeast).
  • test substance-dependent changes in promoter activity are analyzed by comparing the expression level of the reporter gene when the test substance is brought into contact with the transformed cells in the culture medium and when the test substance is not in contact. be able to.
  • a method for producing a transformed cell using a vector in which a reporter gene is fused downstream of a promoter can be performed by a conventional method.
  • the method described in Example 15 can be used.
  • the method for analyzing the expression level of the reporter gene is appropriately selected depending on the protein encoded by the reporter gene.
  • the reporter gene encodes a fluorescent protein (for example, luciferase)
  • the introduced cells are lysed by an appropriate method, luciferin as a substrate is added to the supernatant of the cell lysate, and then an appropriate fluorescence is obtained. Fluorescence is measured using a detector (for example, ML3000; Dynatech Laboratories, etc.) to obtain the expression level of the reporter gene.
  • This reaction can also be performed using an appropriate commercially available detection kit, specifically, for example, Luciferase Atsy System (Promega).
  • a substance having a reporter activity of 1.5 times or more (preferably 2 times or more, more preferably 4 times or more) under the conditions described in Example 15 is used. If the substance is selected as a substance having AGF expression enhancing activity and the substance is a compound, the substance having the above activity at a concentration of 10 ⁇ molZL (preferably 1 ⁇ ol / more preferably 0.1 ⁇ molZL) It selects as a substance which has an expression enhancement activity.
  • the MAPK type screening method of the present invention comprises:
  • step iii) Analyzing the effect of the test substance having AGF agonist activity in step ii) on body weight fluctuation, blood glucose level, and Z or blood lipid content
  • Example 16 As shown in Example 16, it was found that phosphorylation of MAPK p38, MAPK p42, and MAPK p44 was enhanced by adding AGF to cells. This result shows that it is possible to determine the hyperfunction of AGF by analyzing the change of MAPK phosphate. Therefore, according to the MAPK-type screening method of the present invention, an AGF function-enhancing agent can be screened, and the AGF function-enhancing agent screened by the MAPK-type screening method of the present invention is an anti-obesity agent or anti-diabetic agent. It can be used as an active ingredient in drugs for treating Z or hyperlipidemia.
  • the cell used in the MAPK type screening method of the present invention is preferably a cell that expresses at least one of MAPK and binds to AGF.
  • a cell that expresses at least one of MAPK and binds to AGF for example, human umbilical vein endothelial cell HUVEC (CAMBREX), Muscle segment C2C12 cells, progenitor chondrocyte cell line ATDC5 (Cell Differ. Dev., 1990, 30 (2),
  • a culture supernatant or a cell lysate of a cell contacted with a test substance is prepared, phosphorylation of MAPK is measured, and the change in phosphorylation dependent on the test substance is analyzed.
  • the measurement of phosphorylation of MAPK can be performed, for example, by Western blotting or immunoassay using an anti-phosphorylated MAPK antibody, and preferably performed by Western blotting. It is particularly preferable to carry out by blotting.
  • Examples of the MAPK include MAPK p38, MAPK p42, and MAPK p44.
  • at least one MAPK is analyzed.
  • a substance having AGF agonist activity for example, the amount of phosphate protein is 1.5 times or more under the conditions described in Example 16 (preferably
  • the substance having an AGF function promoting activity is a compound, the substance having the above activity at a concentration of 10 molZL (preferably 1 ⁇ mol / L, more preferably 0.1 ⁇ molZL) has AGF function-promoting activity.
  • a concentration of 10 molZL preferably 1 ⁇ mol / L, more preferably 0.1 ⁇ molZL
  • the cell-binding screening method of the present invention comprises:
  • step iii) Analyzing the effect of the test substance that promotes the binding of AGF and cells in step ii) on body weight fluctuation, blood glucose level, and Z or blood lipid content
  • Example 17 As shown in Example 17, it was found that AGF binds to the cell surface. This result indicates that a substance that promotes the binding of AGF to cells is an agent that enhances the function of AGF. Therefore, according to the cell-binding screening method of the present invention, an AGF function-enhancing agent can be screened, and the AGF function-enhancing agent screened by the cell-binding screening method of the present invention is an anti-obesity agent. It can be used as an active ingredient in drugs, antidiabetics, and Z or hyperlipidemia.
  • the cells used in the cell-binding screening method of the present invention are preferably cells to which AGF binds.
  • Examples thereof include precursor chondrocyte cell line ATDC5.
  • the amount of AGF bound to the cell can be measured by a known binding assay such as flow cytometry, cell ELISA, or a binding assay that measures the amount of labeled AGF bound, It is particularly preferred to carry out by flow cytometry as described in Example 17.
  • the amount of AGF protein bound to a cell is 1.5 times or more (preferably under the conditions described in Example 17 for binding between AGF and a cell, preferably Is selected as a substance having an AGF function-enhancing activity, and if the substance is a compound, 10 Is 1 A substance having the above activity at ⁇ mo ⁇ / more preferably 0.1 ⁇ mol ZL) is selected as a substance having an AGF function promoting activity.
  • the screening method of the present invention enhances AGF expression by carrying out steps i) and ii) above.
  • the anti-obesity effect of a test substance can be confirmed by examining body weight fluctuation, fat weight, or change in fat weight in a small animal by administration of the test substance.
  • a small animal for example, a mouse, a rat or the like can be used, and an obese model animal can be used in addition to a normal animal.
  • obesity models that can be used in obese model animals such as obZob mice, dbZdb mice, and Zucker rats. It is possible to use an obesity model that promotes weight gain or fat weight gain.
  • the effect of the test substance on body weight fluctuation can be analyzed, for example, by measuring the body weight over time and comparing the amount of change in body weight between the test substance administration group and the control group.
  • the fat weight can be determined, for example, by dissecting a euthanized mouse, removing all the genital fat, measuring the weight, and comparing the fat weight between the test substance administration group and the control group.
  • the antidiabetic effect of the test substance can be confirmed by examining the change in blood glucose level of the small animal by administration of the test substance.
  • mice and rats are used as small animals.
  • diabetes model animals can be used.
  • many available model animals such as KKZAy mice and dbZdb mice are known.
  • models of diabetes such as streptozotocin-induced diabetes models, are available.
  • the effect of the test substance on the blood glucose level can be examined by measuring the blood glucose level at any time and the fasting blood glucose level and analyzing the change in the blood glucose level between the test substance administration group and the control group.
  • the antihyperlipidemic effect of the test substance can be confirmed by examining the change in the lipid content in the blood of the small animal by administration of the test substance.
  • small animals for example, mice, rats, rabbits and the like can be used, and in addition to normal animals, hyperlipidemia model animals can be used.
  • hyperlipidemia model animal many available model animals such as, for example, Zucker rat and WHHL rabbit are known.
  • the effect of the test substance on the blood lipid content is to measure the blood triglyceride, blood cholesterol, and blood free fatty acid concentrations, and analyze the change in blood lipid content between the test substance administration group and the control group. Can be examined. Methods other than administering the test substance to normal animals or hyperlipidemic model animals can be carried out in the same manner as in Reference Example 15.
  • a targeting vector having the HSV—tk gene in that order were prepared by the following method.
  • mouse genomic library (Mouse library) according to the attached manual using a cDNA corresponding to the entire protein coding region of mouse AGF produced in the same manner as in Example 1 of WO03 / 083114 as a probe.
  • Genomic, 129 SVJ Library (Stratagene) was screened, and a phage clone having an approximately 17.9kbp sequence (including AGF gene, mouse-pub-genome sequence AC073775.2 90644-10854 4) was isolated, It was subcloned into plasmid pBluescript (Stratagene). This plasmid clone (pBN2) was cut with the restriction enzymes Sail and Mfel to cut out about 6.2 kbp of 5, long arm (including 90664-96900 of mouse-pub-genome sequence AC073775.2).
  • PCR was performed using the plasmid pBN2 as a cage and the primer set having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 6 and SEQ ID NO: 7, and about 2.
  • Okbp 3 short arm (mouse-pub). -containing 105903 to 107914 of genome sequence AC073775.2). 5, long arm and 3, short arm, respectively, plasmid pPNT (Cell,
  • the obtained targeting vector was cleaved with the restriction enzyme Notl, and the ES cell line Rl (Proce edings
  • ES cells were cultured in a medium containing G418 to obtain a resistant strain.
  • ES cell force was also extracted by DNA, and clones in which only homologous recombination occurred were identified by Southern plot analysis. Specifically, Southern blot analysis was performed using DNA cleaved with the restriction enzyme Hindlll using DNA consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 8 including exon 4 and exon 5 of AGF as a probe. As a result, a 6.5 Kb DNA fragment could be detected by homologous recombination with respect to the wild type 4.6 Kb.
  • the obtained ES cell line was microinjected into a blastocyst obtained from BDF 2 mouse which is the second generation of a C57BLZ6 mouse and DBAZ2 mouse hybrid, and the manipulated embryo was transplanted into the uterus.
  • Manipulation Chimera mice were born from mice that became pregnant after transplanting embryos.
  • a heterozygous mouse hereinafter referred to as AGF hetero KO mouse
  • AGF homozygous KO mice Homozygous mice (hereinafter referred to as AGF homozygous KO mice) were obtained by crossing AGF heterozygous KO mice.
  • PCR was performed using the genomic DNA isolated from the tail of the pups as a saddle type, and the genotype of the mouse was confirmed by the size of the DNA fragment generated by PCR. That is, the tail was treated with proteinase K, and DNA was extracted with phenol / chloroform. The extracted DNA was recovered by isopropanol precipitation and ethanol precipitation, and dissolved in Tris-EDTA buffer (pH 8.0) (hereinafter referred to as TE solution). Based on the neomycin resistance gene sequence and the genomic sequence deleted by targeting, a primer having the following nucleotide sequence was designed.
  • Reverse primer SEQ ID NO: 12 [0060] The obtained genomic DNA derived from mouse pups was subjected to PCR using the above primers. PCR was performed using DNA polymerase (ExTaq; Takara) and heat denaturation at 95 ° C (5 minutes), followed by 95 ° C (1 minute), 60 ° C (1 minute), and 72 ° C ( A cycle consisting of 1 minute) was carried out 30 cycles, followed by extension reaction at 72 ° C (7 minutes), and the size of the amplified fragment was examined.
  • DNA polymerase ExTaq; Takara
  • 72 ° C A cycle consisting of 1 minute
  • the mouse genotype was also examined by performing the Southern plot analysis of Reference Example 1 (2). As a result, a 6.5 kbp band of the mutant allele was detected in the AGF homozygous KO mouse, and a 6.5 kbp band of the mutant allele and a 4.6 kbp band of the wild type allele were detected in the AGF hetero KO mouse. In the Rita Mate WT mouse, a 4.6 kbp band of the wild type allele was detected.
  • Serum lysis buffer [0.5mol / L HEPES (pH7.2), 1% TritonX-100, 10% glycerol,
  • SourCE SourCE was diluted 5000 times with 3% BSA-containing TBS-T.
  • AGF homozygous KO mice the AGF band was deleted! /, Confirming the AGF deficiency.
  • CAG modified chic en beta-actin
  • CAG-AGF Tg mice in which mouse AGF was forcibly expressed in the whole body under the control of a promoter with CMV-IE enhancer) promoter [GENE, 108 (1991) 193-200] were prepared.
  • CAG-AGF Tg mice in which mouse AGF was forcibly expressed in the whole body under the control of a promoter with CMV-IE enhancer promoter [GENE, 108 (1991) 193-200] were prepared.
  • CAG promoter 1.7 kb
  • 1 ⁇ 71 sequence a blastcidin gene (bsr)
  • poly A signal sequence 0.5 kb
  • lox P sequence Mouse AGF cDNA sequence
  • IRES internal regulatory system forcDNA sequence
  • Ribosomal entry site-A plasmid into which ⁇ -geo-poly A sequence (4.5 kb) was inserted in order was prepared by the following method.
  • PCR (after reaction at 95 ° C for 10 minutes) using mouse AGF full-length cDNA (WO03 / 083114) as a cage and DNA consisting of the nucleotide sequences represented by SEQ ID NO: 13 and SEQ ID NO: 14 as a primer set
  • the reaction was performed at 94 ° C for 15 seconds, 60 ° C for 30 seconds, and 72 ° C for 2 minutes for 45 cycles), and the resulting PCR product was transferred to the pZErO-2 cloning vector (Invitrogen). ) was subcloned.
  • the obtained plasmid was cleaved with restriction enzymes Hindlll and Sall and inserted into Hindlll and Sail sites of plasmid pBluescriptll SK (Stratagene) to prepare plasmid pBS-mAGF having the mouse AGF full-length gene.
  • the plasmid pU—San in order to introduce the IRES- ⁇ -geo-poly ⁇ gene into the plasmid pBS—mAGF, the plasmid pU—San (Hum
  • Plasmid pC with CAG promoter, 1 ⁇ 71 sequence, bsr, and poly A signal sequence AGlox71bsr (Nucleic Acids Res. 1997; 25 (4): 868-872) has a structure in which a loxP sequence is inserted on the 3rd side of the poly A signal and bsr and polyA signal are sandwiched between 1 ⁇ 71 sequence and loxP sequence.
  • the digested 811 ) P fragment was cleaved with the restriction enzyme Smal and then BAP (bacterial
  • the plasmid was inserted into the plasmid pCAGlox71bsr that had been treated with (alkaline phosphatase) to prepare the plasmid loxP — 1 ⁇ 71.
  • sequencing was performed using the T3 primer (SEQ ID NO: 16), and the nucleotide sequence of the region containing the inserted loxP sequence was examined. As a result, it was confirmed that the base sequence read with the T3 primer was identical with the base sequence represented by SEQ ID NO: 15, and loxP and 1 ⁇ 71 were in the same direction.
  • the plasmid ⁇ — 1 ⁇ 71 was cleaved with the restriction enzyme Spel, and the resulting fragment containing the CAG promoter, 1 ⁇ 71 sequence, bsr, poly A signal sequence, and loxP sequence was transferred to the plasmid pBS—mAGF—jS geo Spel site.
  • the target plasmid pBS-loxP-lox71-mAGF-jS geo was prepared by insertion.
  • 8 geo is shown in FIG.
  • This plasmid was digested with restriction enzyme Notl, and linear DNA fragments [CAG promoter (promoter), 1 ⁇ 71 sequence, bsr, poly A signal sequence (pA), 1 ox P sequence, mouse AGF cDNA sequence, and IRES—j8—geo Containing poly A sequence (pA)].
  • ES cells were cultured in the presence of / 418 (200 / ⁇ 8 ⁇ ), and cells having a gene structure from which 1 ⁇ 71-loxP was removed were selected. 15 clones of cells have CAG promoter (1.7 kb), 1 ⁇ 71 The ES cell has a row, a mouse AGF cDNA sequence, and an IRES- ⁇ -geo-poly ⁇ sequence (4.5 kb), and AGF is constitutively expressed under the control of the CAG promoter.
  • Tg mouse By crossing the chimeric mouse with the C57BLZ6 mouse, a Tg mouse in which AGF was constitutively expressed under the control of the CAG promoter was obtained.
  • PCR was performed using genomic DNA isolated from the tails of pups as cages. The tail was treated with proteinase K, and the DNA was extracted with phenol 'black mouth form. The extracted DNA was recovered by isopropanol precipitation and ethanol precipitation and dissolved in TE solution.
  • the transgene amplifies a 325 bp fragment in the PCR that detects AGF cDNA, and amplifies a 320 bp fragment in the PCR that detects LacZ!
  • fragments of these sizes should not be amplified from mouse genomic DNA.
  • PCR was performed on the obtained genomic DNA derived from pups. PCR was performed at 94 ° C (5 minutes) using DNA polymerase (ExTaq; Takara). After denaturation, 28 cycles of 94 ° C (1 minute), 62 ° C (1 minute 30 seconds), and 72 ° C (1 minute 30 seconds) were performed, followed by 72 ° C (7 minutes) ) And the size of the amplified fragment was examined.
  • SEQ ID NO: 21 and SEQ ID NO: 22 were used as primers, and commercially available reagents (SYBR
  • PCR was performed using Green PCR Master Mix (Applied Biosystems).
  • SEQ ID NO: 23 and SEQ ID NO: 24 were used as primers
  • SEQ ID NO: 25 was used as a TACKMAN probe
  • commercially available reagents TaqMan
  • PCR was performed using Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems) [0071] The PCR reaction was carried out by repeating the initial denaturation reaction at 95 ° C (10 minutes) and then repeating the cycle reaction with 94 ° C (15 seconds) and 60 ° C (60 seconds) force 45 times. Carried out. For the standard curve for calculating the gene expression level, the same reaction was performed using the above cDNA or mouse genomic DNA as a saddle type, and the gene expression level was calculated as a relative value between samples.
  • CAG-AGF Tg mice were backcrossed to C57BLZ6 for 2 generations to obtain F2 CAG—AGF Tg mice.
  • CAG-AGF Tg mice and Rita Mate WT mice were normally raised on a standard diet (CE-2; Claire). Comparing the weights of 6-week-old female mice, CAG-AG F Tg mice ⁇ or 15.7g ⁇ 0.8 g (SD), WT mice ⁇ or 17.8g ⁇ 0.5 g (SD), 12
  • CAG—AGF Tg mice were 19.5 g ⁇ 0.7 g (SD) and WT mice were 23.5 g ⁇ 2.5 g (SD).
  • CAG—AGF Tg mice Was found to have less weight.
  • CAG-AGF Tg mice had a weight gain suppression with a standard diet and a marked weight gain suppression with a high fat diet, and that AGF had a weight gain suppression effect.
  • AGF homozygous KO mice, AGF heterozygous KO mice, and Rita mate WT mice were normally raised on a standard diet. Each mouse was weighed every week until 24 weeks of age. The result is shown in figure 2. As shown in FIG. 2, it was found that the AGF homozygous KO mice began to gain weight compared to the WT mice from about 12 weeks of age, and continued to gain weight and became markedly obese. A In the GF hetero KO mice, the expression was intermediate between AGF homo KO mice and Rita Imate WT mice.
  • AGF KO mice Reproductive organ fat (WAT), brown fat (BAT), liver, heart, kidney, and spleen of 20-week-old female AGF homozygous KO mice, AGF heterozygous KO mice, and Rita Mate WT mice fed on a standard diet Each tissue was collected and the tissue weight per body weight was measured. As a result, brown fat, liver, heart, kidney, and spleen did not change in yarn and weave weight in AGF homo KO mice, AGF hetero KO mice, and WT mice. On the other hand, with regard to genital fat, AGF homozygous KO mice had increased tissue weight per mouse and body weight than WT mice.
  • AGF hetero KO mice had intermediate tissue weights between AGF homo KO mice and WT mice. That is, weight in AGF KO mice It was shown that the increase in calorie increased because the weight of white adipose tissue such as genital adipose tissue increased. This reveals that AGF KO mice have the opposite phenotype of CAG-AGF Tg mice, and the weight of adipose tissue without affecting other organ weights as a physiological activity of AGF. It became clear that there was an increase inhibitory effect. The results regarding genital fat tissue (white adipose tissue) are shown in FIG. 5 (white adipose tissue weight) and FIG. 6 (white adipose tissue weight Z body weight).
  • FIG. 8 AGF homo KO mice
  • FIG. 9 Reni-mate WT mice
  • the RAT mate WT mouse had a normal fat cell size, but the AGF homozygous KO mouse had a fat cell hypertrophy. Further In addition, fat accumulation in BAT was observed in AGF homozygous KO mice compared to Rita-mate WT mice.
  • triglyceride (TG) content in skeletal muscle and liver is known to increase in addition to the increase in adipose tissue (Japanese clinical, 1995, 53 ⁇ , 1995 special issue, obesity) P354-p358). Therefore, the TG content in the skeletal muscle (gastrocnemius) and liver tissues of CAG-AGF Tg mice was examined.
  • CAG-AGF Tg mice (Tg) and Rita mate WT mice (W T) were fed with high fat diet (high
  • the TG content in skeletal muscle (gastrocnemius) and liver tissue of AGF KO mice was examined.
  • Skeletal muscle and liver tissue strength of AGF KO mice and Rita mate WT mice TG in the tissue was extracted by the method described in (1) above.
  • the concentration of the extracted TG was measured using a kit (Triglyceride E Test Koichi; Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) to determine the TG content in the tissue.
  • the results are shown in FIG.
  • AGF KO mice were found to have significantly increased TG content in skeletal muscle and liver tissue compared to WT mice.
  • AGF KO mice were found to have the opposite phenotype of CAG—AGF Tg mice, and it was found that the physiological activity of AGF has the ability to reduce TG content in skeletal muscle and liver.
  • Glucose tolerance test of AGF homozygous KO mice and Rita Imate WT mice Blood insulin levels were examined. Mice were fasted for 16 hours, lg / kg D-glucose was administered by intraperitoneal injection (ip), and blood was collected from the ocular vein before administration and 15, 30, 60, and 120 minutes after administration. The blood glucose level was measured using Daltest Ace (Sanwa Chemical Laboratory), and the blood insulin concentration was measured using the RIA 2 antibody method (SRL). The results are shown in FIG. 13 (blood glucose level) and FIG. 14 (plasma insulin).
  • Human AGF and mouse AGF were expressed and purified according to the method described in WO03 / 083114 (Example 19). That is, an expression plasmid obtained by inserting a DNA fragment of about 1.4 kbp (human) or about 1.3 kbp (mouse) obtained by PCR into a plasmid pcDNA-Signal-FLAG was introduced into HEK293 cells. Culture supernatants of cell lines expressing human AGF and mouse AGF were added to anti-FLAG-M2 monoclonal antibody agarose affinity gel (A NTI-FLAG
  • Human and mouse recombinant AGF proteins were obtained by affinity purification using M2 Monoclonal Antibody Agarose Affinity Gel (Sigma).
  • Plasmid pCR2.1-mNew (Example 1 of WO03 / 083114) containing the full-length mouse AGF cDNA was used as a saddle, using a forward primer (SEQ ID NO: 45) and reverse primer (SEQ ID NO: 46).
  • PCR using pfu DNA polymerase at 95 ° C for 10 minutes, followed by 45 cycles of 94 ° C for 15 seconds, 60 ° C for 30 seconds, 72 ° C for 2 minutes was performed.
  • the obtained PCR product was subcloned into pCR4Blunt—TOPO (Invitrogen), followed by restriction fermentation.
  • pCEP4dE2 FLAG (prepared in Example 2 of WO02 / 42448) cleaved with Xbal and Notl, and pCEPdE2-mAGF-FLAG Got.
  • pCEPdE2 mAGF-FLAG as a saddle, using a forward primer (SEQ ID NO: 47) and reverse primer (SEQ ID NO: 48) with PCR (PyroBest DNA polymerase, 95 ° C for 2 minutes, 98 ° C for 20 seconds, A cycle of 60 ° C for 30 seconds, 72 ° C for 1 minute and 30 seconds was performed 20 times, followed by 72 ° C for 7 minutes).
  • the obtained PCR product was subcloned into pCR4Blunt—TOPO (Invitrogen), then cleaved with restriction enzymes Bglll and Xhol, and the resulting DNA fragment of about 1.4 kbp was converted into adenovirus production vector pAdTrack-CMV ( Proc.
  • Virus particles were prepared using this plasmid or pAdTrack-CMV (empty vector) as a control. Specifically, it was prepared by the following method.
  • Escherichia coli BJ5183 (Stratagene) was transformed into plasmid pAdEasy— 1 (He
  • E. coli BJ5183 containing plasmid pAdEasy-1 (hereinafter referred to as E. coli BJ5183 (pAdEasy-1)).
  • E. coli BJ5183 pAdEasy-1
  • the previously prepared plasmid pAdTracK—CMV—mAGF or pAdTrack—CMV was cleaved with the restriction enzyme Pmel and used to transform E. coli BJ5183 (pAd Easy-1).
  • the clones of the resulting transformants were also prepared with plasmids and cleaved by the restriction enzyme Pacl. Examined. By selecting a clone in which a 3 kb or 4.5 kb extra band appeared, a clone that had undergone recombination as designed at the arm site of the plasmid was obtained.
  • the obtained virus particle concentration was determined in the same manner as in Example 15 of WO02 / 42448.
  • Mouse AGF protein-expressing adenovirus and pAdTrack prepared in Reference Example 10 CMV control adenovirus was infected to human fetal kidney cell line 293 (ATCC number: CRL-1573) to approximately 100 virus particles per cell. Specifically, 293 cells were seeded at 3 x 10 5 in a 6-well plate coated with type I collagen (Asahi Techno Glass) and cultured in 2 mL of 10% FBSZ penicillin 100 IUZmL and streptomycin 100 ⁇ g / mL ZDMEM.
  • adenovirus 6 ⁇ 10 7 particles were added, cultured for 1 ⁇ g, and replaced with 2 mL of penicillin 100 IUZmL and streptomycin 100 gZmLZDMEM medium.
  • penicillin 100 IUZmL and streptomycin 100 gZmLZDMEM medium On the second day after infection, collect the culture supernatant, centrifuge at 3,000 rpm for 5 minutes, and centrifuge the supernatant with a 20% gel gradient gel (Daiichi Kagaku). Polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) was performed.
  • Reference Example 12 Production of human AGF-expressing adenovirus
  • a plasmid containing the full length cDNA of human AGF (prepared in Example 18 of WO03 / 083114; hereinafter referred to as PCR2.1-hNew) is used as a saddle type, forward primer (SEQ ID NO: 49) and reverse primer (SEQ ID NO: 50).
  • PCR was performed using PyroBest TM DNA polymerase (Takara Shuzo) in the presence of 5% formamide, repeating cycles of 98 ° C for 20 seconds, 64 ° C for 30 seconds, and 74 ° C for 3 minutes 35 times.
  • PCR product was subcloned into pCR4Blunt—TOPO (Invitrogen), cleaved with restriction enzymes Hindlll and Xhol, and inserted into pCEP4 (Invitrogen) cleaved with Hindlll and Xhol to obtain pCEP-hAGF .
  • pCEP An approximately 0.43 kbp DNA fragment generated by cleaving hAGF with restriction enzymes Kpnl and Mlul, an expression plasmid containing full-length human AGF cDNA (produced in Example 19 of WO03 / 083114; hereinafter pcDNA-SF) — A DNA fragment of about 0.98 kb p generated by cleaving hAGF) with restriction enzymes Mlul and Xhol was used as a shuttle vector pAdTrack—CMV (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 2509-2514, 1998) to complete pAdTracK—CMV—hAGF. Using this plasmid or pAdTrac kCMV as a control, the pAdEasy system (Proc. 2) was prepared in the same manner as in Example 14 and Example 15 of WO02 / 42448.
  • virus particles were prepared.
  • the obtained virus particle concentration was determined in the same manner as in Example 15 of WO02 / 42448.
  • Human embryonic kidney cell line 293 was infected with human AGF protein-expressing adenovirus and pAdTrack-CMV control adenovirus prepared in Reference Example 10 and Reference Example 12 in the same manner as in Reference Example 11 to obtain a culture supernatant.
  • Human AGF protein expression in the culture supernatant was detected using the same method as in Reference Example 11 except that anti-SF-YP-030 IgG prepared in Example 1 was used as the primary antibody.
  • human AG F that is not detected when the supernatant infected with the control adenovirus is used as a sample, but only when the supernatant infected with human AGF protein-expressing adenovirus is used as a sample.
  • a band was detected in the molecular weight, and it was found that the human AGF protein was expressed by the method of Reference Example 13 using the human AGF protein expression adenovirus prepared in Reference Example 12.
  • mice Female C57BLZ6 mice (Claire) from 8 weeks old high fat diet (high fat
  • mice were injected with the mouse AGF-expressing adenovirus (mAGF-Adeno) or control adenovirus (Cont-Adeno) prepared in Reference Example 10 for 5 x 10 9 PFUZ mice every Z weeks for tail vein injection.
  • mAGF-Adeno mouse AGF-expressing adenovirus
  • Cont-Adeno control adenovirus
  • mice treated with mA GF—Adeno it was found that administration of a virus having the AGF gene caused AGF protein to be expressed in vivo, and this AGF protein caused weight loss.
  • a glucose metabolism test was performed using these mice. These mice were fasted for 16 hours, 0.4 gZkg of D-glucose was administered by intraperitoneal injection (ip), and blood was collected from the ocular vein before administration and 15, 30, 60, 90, and 120 minutes after administration. . The blood glucose level was measured using Daltest Ace (Sanwa Chemical Laboratory). The results are shown in Fig. 15.
  • a glucose tolerance test was conducted on CAG-AGF Tg mice (Reference Example 2). The effect of improving glucose tolerance by AGF was examined. 4-month-old female CAG—AGF Tg mice and Rita mate WT mice are fasted for 16 hours, followed by intraperitoneal injection (ip) of lgZkg D-glucose, and before, and after administration 15, 30, 60 Blood was collected from the ocular vein after 120 minutes. The blood glucose level was measured using Daltest Ace (Sanwa Chemical Laboratory). The results are shown in FIG.
  • CAG-AGF Tg mice are retaliated at all times after glucose administration. It became clear that glucose tolerance was lower than WT mice and glucose tolerance was improved. That is, it was revealed that glucose tolerance was improved by the action of AGF protein highly expressed in CAG-AGF Tg mice.
  • CAG-AGF Tg mice were found to have increased insulin sensitivity with a greater decrease in blood glucose level than Rita-mate WT mice at all times after insulin administration. In other words, it became clear that insulin sensitivity was enhanced by the action of the AGF protein highly expressed in CAG-AGF Tg mice.
  • a Tg mouse (Example 8 of WO03 / 083114 publication) in which AGF was forcibly expressed under the control of the K14 promoter was prepared.
  • This mouse has a high expression of epidermal cell strength AGF protein, and it is known that angiogenesis and tissue regeneration are caused by the action of the expressed AGF.
  • AGF highly expressed in epidermal cells exhibits anti-obesity and anti-diabetic effects using mice that highly expressed AGF throughout the body. It was confirmed.
  • K14-AGF Tg mice The insulin sensitivity of K14-AGF Tg mice was examined. Eight months old female K14—AGF T g mice and Rita Imate WT mice were administered 0.75 unit Zkg of insulin intraperitoneally. Blood was collected from the ocular vein at 20, 40, 60, 80, and 100 minutes after insulin administration, and the blood glucose level was measured using Daltest Ace (Sanwa Chemical Laboratory). The ratio of blood glucose level after administration to blood glucose level before insulin administration is shown in FIG.
  • K14-AGF Tg mice were found to have increased insulin sensitivity with a greater decrease in blood glucose level than Rita-mate WT mice at all times after insulin administration. In other words, it became clear that insulin sensitivity was enhanced by the action of the AGF protein highly expressed in CAG-AGF Tg mice.
  • mouse AGF showed an effect of inhibiting weight loss and improving glucose tolerance. Therefore, it was confirmed by conducting the following tests that human AGF has a similar effect.
  • human AGF-expressing adenovirus (hAGF-Adeno) and control adenovirus (Cont-Adeno) prepared in Reference Example 12 were administered to 3 mice each in the same manner as in Reference Example 14, the body weight after 13 days was The average decrease was 4.6 g in the hAGF-Adeno-treated mice, and the average was 0.1 lg in the Cont-Adeno-treated mice.
  • a glucose metabolism test was carried out in the same manner as in Reference Example 14 except that D-glucose injected intraperitoneally was 0.5 gZkg, and blood was collected after administration at 30, 60, 90, and 120 minutes.
  • hAGF-Adeno-administered mice had lower blood glucose levels and improved glucose tolerance than Cont-Adeno-administered mice at all times after glucose administration. That is, it was revealed that weight loss was caused by the action of hAGF protein highly expressed in mice treated with hAGF-Adeno and that glucose tolerance was improved.
  • the rabbit was immunized with the full-length human AGF purified protein prepared in Reference Example 9 to obtain an antibody. Immunization was performed every 2 weeks using 500 g for the first immunization and 250 g for the second to fourth immunizations. Two weeks after the final immunization, antiserum was obtained by whole blood collection. Antiserum to protein Purification was performed using an A column (Amersham Bioscience) to obtain an IgG antibody (hereinafter referred to as anti-SF—YP-030 IgG).
  • a peptide (SEQ ID NO: 4) (hereinafter referred to as peptide A) in which a Cys residue was added to the N-terminus of a peptide (SEQ ID NO: 3), which is a partial sequence of human AGF, was synthesized and purified.
  • Peptide A was bound to the carrier protein cythyroglobulin (Sigma) to produce an antigen, and 100 g of the peptide was immunized 8 times in total every 2 weeks. One week after the final immunization, whole blood was collected to obtain serum.
  • a peptide column was prepared with peptide A.
  • the serum was affinity purified using the affinity column to obtain an IgG antibody that binds to peptide A (hereinafter, anti-YP-030-A IgG).
  • the antibody concentration was determined by measuring the absorbance at 280 nm and setting the molecular extinction coefficient to 1.38.
  • Fab ′ and EMCS-HRP were mixed and reacted at 4 ° C. for 16 hours, and then the fraction bound to Fab and HRP was collected by gel filtration using a Superdex 200 16 / 60HR column.
  • a human AGF antibody Fab ′ fragment (HRP-anti-SF-YP-030 Fab ′) was obtained.
  • the antibody concentration was determined by measuring the absorbance at 280 nm and setting the molecular extinction coefficient to 1.38.
  • Anti-YP-030-A IgG prepared in Example 1 at 20 ⁇ g / mL and ELISA microprobe. Place rate (NUNC) 100 ⁇ L / well and let stand at 4 ° C. Aspirate the solution in the well, wash twice with PBS (phosphate buffered saline), add 300 LZ well with blocking solution (1% BS A, 0.05% NaN, PBS), 4 ° C
  • Example 4 Measurement of AGF protein concentration in cell culture supernatant and human serum
  • the amount of AGF protein in the culture supernatant of 293 cells infected with Adeno-AGF or Adeno-Cont was measured.
  • Each culture supernatant is diluted 2 to 32 times with the diluent, and the human AGF concentration in the sample is measured by adding the culture supernatant as a sample when adding standard human AGF purified protein using the ELISA system described above did.
  • no AGF protein was detected in the culture supernatant of cells infected with Adeno-Cont.
  • AGF protein at a concentration of about 640 ⁇ gZmL was detected in the culture supernatant of cells infected with Adeno-AGF. was detected.
  • human serum (Chemicon) was diluted 20-fold with a diluent, and human serum was added as a sample at the time of addition of standard human AGF purified protein using the ELISA system. The concentration was examined. As a result, AGF protein strength was detected by LISA, and it was found that the AGF concentration in the serum was about 100 nanograms ZmL.
  • Example 3 As described above, it was proved that the ELISA system constructed in Example 3 can be used for measuring the human AGF concentration in the sample. Therefore, the culture supernatant of the cells contacted with the test substance Alternatively, by measuring the AGF concentration in the sample with this ELIS A system using a cell lysate as a sample, an AGF expression-enhancing agent (that is, an anti-obesity agent, a therapeutic agent for diabetes, and a therapeutic agent for Z or hyperlipidemia) Can be screened.
  • an AGF expression-enhancing agent that is, an anti-obesity agent, a therapeutic agent for diabetes, and a therapeutic agent for Z or hyperlipidemia
  • hAGF-Fg human AGF fibrinomonodiene domain
  • pcDNA3.1-signal-FLAG PcDNA3.1-SF-Bam was prepared according to the package insert.
  • a plasmid pcDNA—SF—hAGF (see Reference Example 12) containing the full-length cDNA of human AGF was used as a cage, and pfu DNA polymerase (Stratagene) was used at 95 ° C. for 10 minutes, PCR was performed by repeating a cycle of 94 ° C for 15 seconds, 55 ° C for 1 minute, and 72 ° C for 1 minute 30 seconds 40 times.
  • SEQ ID NO: 55 and SEQ ID NO: 56 were used as primers at this time.
  • the generated fragment is subcloned into the EcoRV site of pZEr02.1 (Invitrogen), then cleaved with restriction enzymes BamHI and Xhol, and the generated DNA fragment of about 0.7 kbp is pcD NA3.1-SF-Bam BamHI.
  • the hAGF-Fg expression plasmid was completed by insertion into the Xhol site.
  • Transfection Reagent (Roche) was introduced into the human fetal kidney cell line HEK293 cells (Invitrogen) according to the attached instructions. The day after the introduction of the plasmid, the medium was replaced with a medium containing lmgZmL dieneticin, and the culture was continued to obtain a stable expression strain of drug resistance (hereinafter referred to as 293 / hAGFFg).
  • the cells were cultured in a roller bottle coated with type I collagen (Corning Corporation) using culture medium (10% FBS, DMEM, and antibiotics) until confluent. The medium was replaced with serum-free medium and cultured for 4 days, and the culture supernatant was collected. Culture supernatant After centrifugation, filtration was performed, and the protein was purified using M2 affinity gel (Sigma). The purified protein was dialyzed against 50 mmol ZL Tris—HCl (pH 8.0) containing 0.1% CHAPS, adsorbed onto an anion exchange column (HiTrap Q HP column), and separated and purified with a NaCl concentration gradient of 0 to 250 mmol ZL. The obtained hAGF-Fg protein fraction was subjected to SDS-PAGE and then stained with CBB (Coomassie brilliant blue) to confirm that high-purity hAGF-Fg protein was obtained. Sales kit (Micro
  • Protein concentration was determined using BCA Protein Assay Kit (Pierce).
  • hAGF-Fg protein Using purified hAGF-Fg protein as an antigen, a monoclonal antibody (anti-hAGFFgMoAb) producing clone was obtained by a conventional method.
  • emeraldion prepared by calcining purified hAGF-Fg protein with the same amount of Freud's Complete Adjuvant (DIFCO) was added to a 6-week-old BALB / c mouse with a protein amount of 50 g Z mouse. It was injected subcutaneously and intradermally. Thereafter, immunization was performed 4 times in total every 7 days. Four days after the fourth immunization, blood was sampled from the tail vein to obtain serum.
  • DIFCO Freud's Complete Adjuvant
  • the serum binding activity to hAGF-Fg protein was examined to confirm that the titer was increased.
  • the final immunization was performed in the same manner as described above 8 days after the test blood collection, and 4 days later, the spleen was collected and used for cell fusion.
  • Spleen cells and P3X63Ag8.653 cells were cell-fused using polyethylene glycol and cultured on 96 well plates in HAT selection medium. The culture supernatant was used to examine the binding activity to hAGF-Fg protein, and positive wells were selected. The binding activity was examined by the following method.
  • the color reaction was stopped by adding 100 LZ of 24. Absorbance at A was measured using an absorptiometer.
  • the cells of the selected well were subjected to primary cloning by limiting dilution. In the same manner as described above, the binding activity to the hA GF-Fg protein was examined, and positive wells were selected.
  • IgG antibody was purified using Qualex). The absorbance at 260 nm of the IgG antibody solution was measured, and the protein concentration was determined with a molecular extinction coefficient of 1.3.
  • the IgG antibody prepared in Example 6 is diluted to 50 ⁇ gZmL in 50 mmol / L carbonate buffer (pH 9.6), and ELISA microplate (NUNC) is used. Place the LZ well and leave it at 4 ° C. The solution in the well was removed by aspiration, washed twice with PBS, then added with blocking solution (1% BSA, PBS) in 300 LZ well, and allowed to stand at 4 ° C for blocking. After washing twice with washing solution (PBS with 0.02% CHAPS), standard human AGF purified protein was serially diluted to 30-0.3 ngZmL with diluent (1% BSA, 0.02% CHAPS-containing PBS).
  • Example 2 Each LZ well was added and reacted at room temperature for 1.5 hours. After washing with the washing solution 5 times, the primary antibody “anti-YP-030-A 0” prepared in Example 1 is prepared to 1.5 / z gZmL with the diluent, added in 100 LZ units, and then at room temperature for 1 hour. Reacted. After washing 5 times with the washing solution, HRP-labeled secondary antibody (HRP-labeled Anti-rabbit IgG; MBL) was diluted 2000-fold with a diluent, added 100 LZ at a time, and reacted at room temperature for 1 hour. After washing 5 times with the washing solution, the substrate reaction solution (R & D) was added in 100 LZ wells and reacted at room temperature for 20 minutes. Stop the reaction solution (IN H SO) with 100 LZ
  • Peptides (SEQ ID NO: 27 and SEQ ID NO: 28) with a Cys residue added to the C-terminal and N-terminal of peptides (SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 26), which are partial sequences of mouse AGF, were synthesized and purified. — 126 and YP—127— B were obtained.
  • Antigens were prepared by binding each peptide to the carrier protein thyroglobulin (Sigma), and 100 g of the peptide was immunized 8 times in total every 2 weeks. One week after the final immunization, whole blood was collected to obtain serum. A utility column was prepared for each peptide.
  • Serum was purified using the affinity column V and IgG antibody against peptide ⁇ -126 (hereinafter referred to as anti-YP-126 IgG) and IgG antibody against peptide YP-127-B (hereinafter referred to as anti-YP-127-).
  • anti-YP-126 IgG IgG antibody against peptide ⁇ -126
  • anti-YP-127-B IgG antibody against peptide YP-127-B
  • Example 8 The anti-YP-126 IgG of Example 8 was reacted with EMCS-HRP prepared in the same manner as in Example 2, and the antibody fraction labeled with HRP was collected by gel filtration to obtain HRP-anti-YP-126 IgG. Named.
  • Anti-YP-127-B IgG prepared in Example 8 was added at 20 ⁇ g / mL in an ELISA microplate (NUNC) 100 ⁇ L / well and allowed to stand at 4 ° C. The solution in the well was removed by suction, washed twice with PBS, and then the blocking solution was added with 300 LZ well and left standing at 4 ° C for blocking. After washing twice with the washing solution, the standard mouse AGF purified protein was diluted 2-fold from 100 to 0.39 ngZmL with the diluted solution, added with 100 LZ wells, and reacted at 37 ° C for 1 hour.
  • NUNC ELISA microplate
  • 3 ⁇ 3-L1 cells are a mouse-derived cultured cell line that is often used as a model cell for white adipocytes.
  • 3T3-L1 cells were spread on a 24-well collagen-coated plate (Asahi Techno Glass Co., Ltd.) so that there were 500000 per well. After almost confluent, 0.5 mmol / L-3-isobutyl-1-methylxanthine Then, the medium was changed to Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) containing 10% urine fetal serum supplemented with 0.25 ⁇ mol ZL dexamethasone and 10 ⁇ g ZmL insulin, and differentiation into adipocytes was started. Two more days later, the medium was changed to DMEM containing 10% urine fetal serum, and then the medium was changed every two days to start differentiation induction. The culture supernatant from 6th day to 8th day after the start of differentiation induction was collected and used as the culture supernatant of adipocyte 3T3-L1.
  • DMEM Dulbecco's modified Eagle's medium
  • C2C12 cells were cultured for 48 hours as they were in Dulbecco's modified tidal medium (DMEM) containing 15% urine fetal serum without addition of a stimulant.
  • DMEM Dulbecco's modified tidal medium
  • Each treatment group power RNeasy mini kit (R Neasy
  • RNA was prepared using the Mini Kit (Qiagen) according to the package insert, and 500 ng of each group was converted to cDNA using the Thermoscript RT-PCR system kit (Invitrogen).
  • Example 13 Measurement of AGF gene expression level in C2C12 cells by quantitative PCR >> DNA having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 29 as a mouse AGF amplification primer And the DNA derived from the C2 C12 cell culture supernatant obtained in Example 12 in the form of a DNA comprising the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 30 and a sequence detector (ABI PRISM 7 900; Applied Biosystems) ) was used to measure the AGF gene expression level in C2C12 cells by quantitative PCR. PCR was performed using SYBR GREEN PCR Master Mix (Applied Biosystems) 95.
  • PCR was carried out under the same conditions using the above cDNA as a saddle, the oligonucleotide shown in SEQ ID NO: 31 and the oligonucleotide shown in SEQ ID NO: 32 as a primer set. went.
  • PCR was performed under the same conditions using the mouse AGF and cyclophilin primer set with the mouse genome (Clontech) as a saddle type, and a standard curve for calculating the mRNA expression level was obtained.
  • AGF The expression level of AGF in each sample was calculated by correcting with the expression level of cyclophilin. As a result, in C2C12 cells, AGF was induced about 6-fold by insulin and about 8-fold by adipocyte 3T3-L1 culture supernatant compared to the absence of stimulant. Turned out to be.
  • the AGF expression-enhancing drug ie, anti-obesity drug, diabetes therapeutic drug, and Z It was also found that a drug for treating hyperlipidemia can be screened.
  • a forward primer (SEQ ID NO: 33) and reverse primer (SEQ ID NO: 34) were used to clone a region of about 5.6 kb upstream of exon 1 and mouse BAC clone ( RP23-369H22; Children's Hospital Oakland)
  • taq TM (Takara Shuzo), 94 ° C for 5 minutes, 94 ° C for 1 minute, 58 ° C for 1 minute for 30 seconds, and 72 ° C for 3 minutes for 32 cycles, followed by PCR at 72 ° C for 10 minutes Went.
  • the resulting PCR product was cloned into a cloning vector (pGEM R -T Subcloning into Easy Vector Systems (Promega) gave pGEM-5.6 kb.
  • DNA sequence was analyzed using DNA sequencer (Model PRISM3700; Applied Biosystems) using DNA sequencing reagent (BigDye3.1; Applied Biosystems) according to the attached instructions. The base sequences No. 1 to No. 5557 in the base sequence were determined.
  • PCR using DNA polymerase TaKaRa Ex taq, 94 ° C) after 4 kb, about 2 kb, about 2.15 kb, and about 2.5 kb fragments using the following primers and pGEM-5.6 kb as a saddle type.
  • pGEM5.6 6 kb was treated with restriction enzyme BamHI, and the resulting fragment containing SEQ ID NO: 1 from 16th to 5572 was treated with restriction enzyme Bglll.
  • pGL5.6 kb is the promoter sequence inserted by inserting the insert in the forward direction.
  • the luciferase gene is present downstream (3 'side) of pGL5.6 kR, and the luciferase gene is present upstream (5' side) of the inserted promoter sequence with the insert inserted in the opposite direction.
  • This fragment was inserted into pGL3-basic treated with the restriction enzyme Bglll, and the 16th nucleotide in the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2 which is about 6.7 kb of exon 2 upstream region containing about 5.6 kb of exon 1 upstream.
  • SEQ ID NO: 2 which is about 6.7 kb of exon 2 upstream region containing about 5.6 kb of exon 1 upstream.
  • An expression plasmid pGL-6. 7 kb containing No. 6 to No. 6684 was obtained.
  • FaO cells J. Cell Science, 2000, 113, 1069-1074
  • Renilla Renilla
  • PhRL—TK Promega And each of these reporter plasmids were cotransformed. That is, FaO cells are grown in growth medium [low glucose (low
  • Glucose DMEM, 10% fetal calf serum (FCS)], culture up to subconfluent on a type I collagen-coated 12-well plate and replace the medium with serum-free Opti-MEM R I (Invitrogen) Thereafter, the plasmid was transfected using a transfection reagent (Lipofectamine TM Reagent; Invitrogen). Three hours after transfection, an equal amount of low glucose DMEM and 20% FCS was added, and after 12 hours, the medium was replaced with low glucose DMEM and 10% FCS. After an additional 12 hours of incubation, the luciferase activity was measured using the Dual-Glo TM Luciferase Atsy system (Dua ⁇ Glo TM
  • C2C12 cells are cultured on a type I collagen-coated 12-well plate until confluent in growth medium (DMEM, 10% FCS) and then replaced with differentiation medium (DMEM, 2% horse serum) for 7 days. The muscle was differentiated with. After culturing in a serum-free medium containing 1% BSA for 12 hours, the medium was replaced with the same medium, and AGF protein was added or the same amount of PBS was added to a final concentration of 1 ⁇ g ZmL.
  • DMEM growth medium
  • FCS differentiation medium
  • the muscle was differentiated with. After culturing in a serum-free medium containing 1% BSA for 12 hours, the medium was replaced with the same medium, and AGF protein was added or the same amount of PBS was added to a final concentration of 1 ⁇ g ZmL.
  • the culture medium was aspirated and removed, and 50 / z L of cell lysate [50 mmol ZL HEPES (pH 7.2), l% TritonX—100, 10% glycerol, 10 mmol / L Na PO, 100 mmol / L NaF, 100 ⁇ mol / L Na VO, 40mmol
  • HUVEC human umbilical vein endothelial cells
  • progenitor soft A similar test was carried out on the bone cell line ATDC5 cells, and it was confirmed that MAPK phosphorylation was enhanced by AGF stimulation.
  • HUVEC was grown in growth medium (Asahi Techno Glass) and ATD C5 cells were grown in growth medium (DMEM / F12, 5% FCS) to subconfluent, respectively, and used for the above-mentioned.
  • ATDC5 cells were cultured to subconfluent in growth medium (DMEMZF12, 5% FCS), and the cells were detached from the plate using a cell scriber. After washing the cells twice with FCM buffer (0.1% BSA / lmmol / L CaCl / lmmol / L MgCl ZPBS),
  • Mouse AGF protein or human AGF protein was added to a final concentration of 10 gZmL without addition, and reacted at 4 ° C for 30 minutes.
  • fluorescein isothiocyanate (FITC) -labeled M2 antibody Sigma was added to a final concentration of 10 ⁇ gZmL and reacted at 4 ° C. for 30 minutes.
  • FITC fluorescein isothiocyanate
  • PI iodide iodide
  • the cells were analyzed with a flow cytometer (Cytomics FC 500; Beckman Coulter), and the FITC intensity of PI-negative cells from which dead cells were removed was measured.
  • the test substance is allowed to react with the cell in advance or simultaneously with the addition of the AGF protein, whereby the AGF function-enhancing activity of the test substance can be measured.
  • Obesity drugs, antidiabetic drugs, and Z or hyperlipidemia drugs are examples of the test substance.
  • the screening method of the present invention comprises an anti-obesity agent, a therapeutic agent for diabetes, and Z or hyperlipidemia. It can be applied to therapeutic drug screening.
  • Each base sequence represented by SEQ ID NOs: 6, 9, 10, 13, 14, 16, 19, 20, 34-40, 42, 45-50, and 53-56 is an artificially synthesized primer sequence.
  • the amino acid sequence represented by the sequence of SEQ ID NO: 4 is the sequence of peptide ⁇
  • the base sequence represented by the sequence of SEQ ID NO: 15 is a sequence containing loxP
  • the amino acid sequence thus obtained is the sequence of peptide ⁇ -126
  • the amino acid sequence represented by the sequence of SEQ ID NO: 28 is the sequence of peptide ⁇ -127-B.

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Abstract

　本発明は、試験物質が、アンジオポエチン関連増殖因子の発現及び／又は機能を亢進するか否かを分析する工程を含む、抗肥満薬、糖尿病治療薬、及び／又は高脂血症治療薬をスクリーニングする方法に関する。また、アンジオポエチン関連増殖因子の発現亢進剤及び／又は機能亢進剤をスクリーニングする方法に関する。

Description

明 細 書
抗肥満薬のスクリーニング方法
技術分野
[0001] 本発明は、抗肥満薬のスクリーニング方法に関する。
背景技術
[0002] 肥満の有害性は広く知られて 、るにもかかわらず、近年肥満が顕著に増加して 、る 。肥満つまり脂肪組織の過剰蓄積が多彩な疾患の原因となっていることは周知の事 実であり、疾患としての肥満症を治療対象にすることが提唱されている。肥満を原因 の一つとして発症する疾患として、例えば、腰痛、膝関節痛、及び変形性関節症があ る。これらの整形外科学的疾患は肥満による体重増加が直接の原因となりうる。肥満 に伴う脂肪の過剰蓄積は、糖尿病、高脂血症、高血圧、又は動脈硬化性疾患の原 因となっている。特に内臓脂肪の蓄積力これらの疾患の発症に関与していることが明 らかにされて ヽる（非特許文献 1)。
[0003] 基本的な肥満改善方法としては、運動療法と食事療法があるが、どちらも継続的な 実施が困難である。また、運動又は食事療法以外の改善方法としては医薬品の使用 があり、現時点では、世界的に見ると、シブトラミンとオルリスタツトが主に使用されて いる。しかし、それらの効果は弱ぐどちらも副作用の問題がある。 日本ではマジンド ールのみが認可されているが、適用が高度肥満者に限定されており、投与期間も限 定されている (非特許文献 2)。
[0004] 社会の近代化に伴い、日本のみならず世界的に糖尿病患者は急増している。特に 、患者数の多い II型糖尿病は、肥満や脂肪の過剰蓄積が発症に関与していることが 知られている。 II型糖尿病の治療としては、肥満症と同様に運動療法と食事療法があ るが、継続的な実施が困難であり、医薬品が使用されている。重度の糖尿病患者で はインスリン療法が行なわれている。しかし、インスリン療法には低血糖の副作用の危 険性が常にある。経口血糖降下薬として、チアゾリジン系薬剤又はスルホニルゥレア（ SU)薬等が多く使用されている。しかしながら、チアゾリジン系薬剤には、肝障害'浮 腫 ·心不全という副作用があり、 SU薬には肥満を助長する副作用が危惧され、安全 で、体重増加を伴わないインスリン抵抗性改善薬が強く求められている (非特許文献
3)。
[0005] 肥満の糖尿病患者の内臓脂肪では脂肪細胞の肥大化が観察される。この肥大化 した脂肪細胞力 は、インスリン抵抗性を惹起するようなアディポサイト力イン類が産 生及び分泌され、近傍の脂肪細胞及び Z又は筋細胞に作用して、インスリン抵抗性 を引き起こしていると考えられる。このように、脂肪組織は、糖尿病病態において、ィ ンスリン抵抗性を増強する方向に関わる組織へと変化する (非特許文献 4及び 5)。
[0006] 肥満や糖尿病の原因となる脂肪組織の蓄積に関与する因子としては、レブチンが よく知られている。レプチンは、体重増加抑制ホルモンであり、レプチンを欠失するこ とで食欲が亢進し、エネルギー消費が減弱し肥満となることが知られている。このよう な脂肪組織の蓄積、及び脂肪細胞の肥大化に関与する因子の発見は、肥満症、糖 尿病、又は高脂血症等の疾患の治療薬開発に非常に有用である (非特許文献 6)。
[0007] アンジォポェチン関連増殖因子（AGF)は、 N末端側にコイルドコイル (Coiled-coil )ドメインを、 C末端側にフイブリノ一ゲン様 (Fibrinogen-like)ドメインを持つ分泌タン パク質である。 AGFは、特許文献 1で報告された NL8と同一であり、 NL8を CHO細 胞に安定発現させて、ヌードマウスに皮下移植すると、 CHOが腫瘍形成能を持つよ うになることが報告されている。また、 AGFを K14プロモーターを用いて表皮細胞に 強制発現させたトランスジエニック (Tg)マウス等を用いて、 AGFに、血管新生活性、 表皮細胞増殖活性、軟骨細胞増殖活性、創傷治癒促進活性、及び組織再生活性が あることが示されている（特許文献 1、非特許文献 7)。更に、特許文献 3〜13には、 本明細書のヒト AGFと同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドが開示されている。 発現分布解析 (特許文献 3及び特許文献 4)、血管内皮増殖因子 (VEGF)刺激によ る増殖阻害活性 (特許文献 4)、増殖因子処理したヒト臍帯静脈血管内皮細胞 HUV ECにおける過剰発現 (特許文献 5及び特許文献 6)から、 AGFと同一のポリペプチド が血管形成、血管新生の促進又は阻害に関することが記載され、前記ポリペプチド によって処置される心臓血管、内皮、及び血管新生の疾患として多数の疾患が列挙 されている（特許文献 3〜9)。また、特許文献 10〜13には、 AGFを上皮細胞等の増 殖や創傷治癒に用いることが示唆されている。 [0008] 非特許文献 1 :「メタボリズム（Metabolism)」，（米国)， 1987年， 36卷， p.54— 59 非特許文献 2 :「日本臨床」， 2003年， 61卷，増刊号 6,肥満症， p.649 - 654 非特許文献 3 :「日本臨床」， 2002年， 60卷，増刊号 9,新時代の糖尿病学 3, p.31 0- 331
非特許文献 4 :「医学のあゆみ」， 2000年， 192卷， P.513— 518
非特許文献 5 :「医学のあゆみ」， 2000年， 192卷， P.541— 545
非特許文献 6 :「トレンズ'イン'モレキュラ^ ~ ·メディスン（Trends inMolecular Medicine
)」， （オランダ）， 2002年， 8卷， 9号， p. 442-447
非特許文献 7：「プロシデイング ·ォブ ·ザ ·ナショナル ·アカデミー ·ォブ ·サイエンス ·ォ ブ .サ.ュナイテイツド.ステート.ォ: ·アメリカ (Proceedings of the national academy of sciences of the United Statesof America) J , (米国）， 2003年， 100卷， p. 9494— 9499
特許文献 1：国際公開第 99/15653号パンフレット
特許文献 2 :国際公開第 03/083114号パンフレット
特許文献 3：国際公開第 00/32221号パンフレット
特許文献 4 :国際公開第 00/53753号パンフレット
特許文献 5：国際公開第 02/00690号パンフレット
特許文献 6 :国際公開第 02/08284号パンフレット
特許文献 7：米国特許出願公開第 2004/0043927号明細書
特許文献 8：米国特許出願公開第 2003/0105012号明細書
特許文献 9：米国特許出願公開第 2003/0105011号明細書
特許文献 10：米国特許第 6350450号明細書
特許文献 11：米国特許第 6413770号明細書
特許文献 12：特開 2000-300263号公報
特許文献 13：米国特許第 6420542号明細書
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0009] 本発明の課題は、抗肥満薬、糖尿病治療薬、及び Z又は高脂血症治療薬の新規 スクリーニング方法を提供することにある。
課題を解決するための手段
[0010] 本発明者らは鋭意検討した結果、 AGFノックアウト (KO)マウス及び AGFトランスジ エニック (Tg)マウスの作製及び解析により、 AGFが抗肥満、抗糖尿、及び抗高脂血 症の作用を有することを明らかにした。すなわち、 AGF KOマウスが顕著な肥満を 示し、肥満に伴う脂肪組織の重量が増カロ、脂肪細胞が肥大化、肥満で増加すること が知られている骨格筋及び肝臓組織中のトリグリセリド量が増加すること、抗インスリ ン血症となり、耐糖能が悪ィ匕することを見出した (参考例 4〜8)。一方、 AGF Tgマ ウス（CAG— AGF Tgマウス；全身に AGFを強制発現したマウス）は体重増加が抑 制され、脂肪組織の重量増加が抑制され、脂肪細胞の肥大化は抑制され、骨格筋 及び肝臓組織中トリグリセリド量は減少されること、更には、インスリン感受性の向上、 並びに脂質代謝及び耐糖能が改善されることを見出した (参考例 4〜7及び参考例 1 5〜16)。更に、 AGF発現アデノウイルス投与マウスにおいて、体重増加が抑制され 、且つ耐糖能が改善されたこと (参考例 14及び参考例 19)、別の AGF Tgマウス (K 14-AGF Tgマウス；表皮に AGFを強制発現したマウス）において、抗肥満作用、 脂肪組織減少作用、インスリン感受性亢進作用を有すること (参考例 17及び参考例 18)を見出した。
[0011] これらの知見は、 AGFが抗肥満薬、糖尿病治療薬、及び Z又は高脂血症治療薬 の有効成分となることを明らかにしたば力りでなぐ AGFの発現亢進剤並びに AGF 機能亢進剤（すなわち、 AGFァゴニスト活性を有する物質、及び AGFと細胞との結 合促進剤)が、抗肥満薬、糖尿病治療薬、及び Z又は高脂血症治療薬の有効成分 として有用であることを示して 、る。
[0012] 本発明者らは、 AGFのタンパク質量を測定できる ELISA (enzyme-linked
immunosorbent assay)系を構築し（実施例 3、 4、 7、 10)、 AGF遺伝子量を測定する 定量 PCR法を確立した（実施例 13)。また、マウス AGFプロモーター領域の DNAを 取得して、その DNAを利用した AGF発現亢進剤をスクリーニングする方法を構築し た（実施例 15)。更に、 AGFによりマイトジェン活性ィ匕プロテインキナーゼ (MAPK) のリン酸ィ匕が亢進することを見出し、 MAPKのリン酸ィ匕を分析することによる AGF機 能亢進剤のスクリーニング方法を構築した (実施例 16)。カロえて、 AGFは細胞表面に 結合することを見出し、 AGFの細胞への結合を分析することによる AGF機能亢進剤 のスクリーニング方法を構築した (実施例 17)。すなわち、本発明者らは、抗肥満薬、 糖尿病治療薬、及び Z又は高脂血症治療薬の新規スクリーニング方法を構築し (実 施例 3、 4、 7、 10、 13、及び 15〜17)、提供して本発明を完成させた。
すなわち、本発明は、
[1]試験物質が、アンジォポェチン関連増殖因子の発現及び Z又は機能を亢進す るカゝ否かを分析する工程を含む、抗肥満薬、糖尿病治療薬、及び Z又は高脂血症 治療薬をスクリーニングする方法；
[2]分析する工程が、
i)細胞に試験物質を接触させる工程、及び
ii)前記細胞における内在性のアンジォポェチン関連増殖因子のタンパク質量又は 遺伝子量を測定し、試験物質依存的な内在性のアンジォポェチン関連増殖因子の タンパク質量又は遺伝子量の変化を分析する工程
を含む、 [1]の方法；
[3]アンジォポェチン関連増殖因子のタンパク質量又は遺伝子量の測定力 アンジ ォポェチン関連増殖因子のタンパク質量の測定である、 [2]の方法；
[4]アンジォポェチン関連増殖因子のタンパク質量又は遺伝子量の測定力 アンジ ォポェチン関連増殖因子の遺伝子量の測定である、 [2]の方法；
[5]分析する工程が、
i)配列番号 1で表される塩基配列における第 672番〜第 5572番の塩基力もなる配 列において、 1〜10個の塩基が欠失、置換、及び Z若しくは挿入された配列を含み 、且つアンジォポェチン関連増殖因子のプロモーター活性を有する DNA、又は配 列番号 1で表される塩基配列における第 672番〜第 5572番の塩基力もなる配列と の同一性が 90%以上である塩基配列を含み、且つアンジォポェチン関連増殖因子 のプロモーター活性を有する DNAの下流にレポーター遺伝子が融合されたべクタ 一により形質転換された細胞に、試験物質を接触させる工程、及び
ii)レポーター遺伝子の発現を測定し、試験物質依存的な前記発現の変化を分析す る工程
を含む、 [1]の方法；
[6]分析する工程が、
i)細胞に試験物質を接触させる工程、及び
ii)マイトジェン活性ィ匕プロテインキナーゼのリン酸ィ匕を測定し、試験物質依存的な前 記リン酸化の変化を分析する工程
を含む、 [1]の方法；
[7]分析する工程が、
i)細胞に、試験物質及びアンジォポェチン関連増殖因子を接触させる工程、及び ii)アンジォポェチン関連増殖因子の細胞への結合量を測定し、試験物質依存的な 前記結合量の変化を分析する工程
を含む、 [1]の方法；
[8]試験物質が、アンジォポェチン関連増殖因子の発現及び Z又は機能を亢進す るか否かを分析する工程、及び
前記工程で選択した試験物質の、体重変動、血糖値、及び Z又は血中脂質含量に 与える作用を分析する工程
を含む、アンジォポェチン関連増殖因子の発現亢進剤及び Z又は機能亢進剤をス クリーニングする方法；
[9]アンジォポェチン関連増殖因子の発現及び Z又は機能を亢進するか否力を分 析する工程が、
i)細胞に試験物質を接触させる工程、及び
ii)前記細胞における内在性のアンジォポェチン関連増殖因子のタンパク質量又は 遺伝子量を測定し、試験物質依存的な内在性のアンジォポェチン関連増殖因子の タンパク質量又は遺伝子量の変化を分析する工程
を含む、 [8]の方法；
[10]アンジォポェチン関連増殖因子のタンパク質量又は遺伝子量の測定力 アン ジォポェチン関連増殖因子のタンパク質量の測定である、 [9]の方法；
[11]アンジォポェチン関連増殖因子のタンパク質量又は遺伝子量の測定力 アン ジォポェチン関連増殖因子の遺伝子量の測定である、 [9]の方法；
[12]アンジォポェチン関連増殖因子の発現及び Z又は機能を亢進するか否力を分 析する工程が、
i)配列番号 1で表される塩基配列における第 672番〜第 5572番の塩基力もなる配 列において、 1〜10個の塩基が欠失、置換、及び Z若しくは挿入された配列を含み 、且つアンジォポェチン関連増殖因子のプロモーター活性を有する DNA、又は配 列番号 1で表される塩基配列における第 672番〜第 5572番の塩基力もなる配列と の同一性が 90%以上である塩基配列を含み、且つアンジォポェチン関連増殖因子 のプロモーター活性を有する DNAの下流にレポーター遺伝子が融合されたべクタ 一により形質転換された細胞に、試験物質を接触させる工程、及び
ii)レポーター遺伝子の発現を測定し、試験物質依存的な前記発現の変化を分析す る工程
を含む、 [8]の方法；
[13]アンジォポェチン関連増殖因子の発現及び Z又は機能を亢進するか否力を分 析する工程が、
i)細胞に試験物質を接触させる工程、
ii)マイトジェン活性ィ匕プロテインキナーゼのリン酸ィ匕を測定し、試験物質依存的な前 記リン酸化の変化を分析する工程
を含む、 [8]の方法;並びに
[14]アンジォポェチン関連増殖因子の発現及び Z又は機能を亢進するか否力を分 析する工程が、
i)細胞に、試験物質及びアンジォポェチン関連増殖因子を接触させる工程、及び ii)アンジォポェチン関連増殖因子の細胞への結合量を測定し、試験物質依存的な 前記結合量の変化を分析する工程
を含む、 [8]の方法
に関する。
本願優先日後に公開された国際公開第 04/108920号パンフレットには、 AGFに抗 肥満、糖尿病及び Z又は高脂血症治療効果があることが開示されている。また、本 願優先日後に出版された Nature
Medicine, 11(4), 400-408, 2005には、 AGFと肥満及びインスリン抵抗性との関係が 開示されている。し力しながら、本願優先日においては、特許文献 3〜9に AGFが関 与するとして多数列挙された疾患の中に糖尿病が含まれるものの、 AGFと糖尿病と の関係について裏づけは示されておらず、 AGFと抗肥満及び Z又は高脂血症との 関係は全く知られていなかつた。
[0015] 本明細書における「抗肥満薬」には、肥満患者の治療のために使用する薬剤と、肥 満傾向にある対象に予防的に使用する薬剤との両方が含まれる。本明細書における 「糖尿病治療薬」には、糖尿病である患者の治療のために使用する薬剤と、糖尿病 傾向にある対象に予防的に使用する薬剤との両方が含まれる。本明細書における「 高脂血症治療薬」には、高脂血症である患者の治療のために使用する薬剤と、高脂 血症傾向にある対象に予防的に使用する薬剤との両方が含まれる。
[0016] 本明細書における「スクリーニング」とは、多数の試験物質の中から目的の活性を有 する物質を篩い分けること、及び、ある試験物質について、その物質が目的の性質を 有する物質である力否かを検出することの両方を含む。
[0017] 本明細書における「AGFの発現亢進剤」とは、 AGFのタンパク質量又は遺伝子の 量を亢進させる物質をいう。「AGFの機能亢進剤」とは、 AGFの機能を亢進させる物 質をいう。
発明の効果
[0018] 本発明のスクリーニング方法によれば、抗肥満薬、糖尿病治療薬、及び Z又は高 脂血症治療薬として有用な物質をスクリーニングすることができる。
図面の簡単な説明
[0019] [図 1]プラスミド pBS— loxP— lox71— mAGF— jS geoの構造を模式的に示す図面 である。記号「pro.」及び「pri.」は、それぞれ、プロモーター及びプライマーを意味 する。
[図 2]AGF KOマウスの体重変化を示すグラフである。横軸は週齢 (週）を、縦軸は 体重（g)を示す。また、記号「WT」、「HTR」、及び「HM」は、それぞれ、 WTマウス、 ヘテロ KOマウス、及びホモ KOマウスを意味する。 [図 3]CAG— AGF Tgマウス (標準食)の生殖器脂肪（白色脂肪組織)重量変化を 示すグラフである。縦軸は、白色脂肪組織重量 (g) Z体重 (g)を示す。また、記号「W
T」及び「Tg」は、それぞれ、 WTマウス及び Tgマウスを意味する。
[図 4]CAG— AGF Tgマウス (高脂肪食負荷)の生殖器脂肪（白色脂肪組織)重量 変化を示すグラフである。縦軸は、白色脂肪組織重量 (g) Z体重 (g)を示す。また、 記号「WT」及び「Tg」は、それぞれ、 WTマウス及び Tgマウスを意味する。
[図 5]AGF KOマウスの生殖器脂肪（白色脂肪組織)重量変化（白色脂肪組織重量
)を示すグラフである。縦軸は、白色脂肪組織重量 (g)を示す。また、記号「WT」、「H
TR」、及び「HM」は、それぞれ、 WTマウス、 AGFヘテロ KOマウス、及び AGFホモ
KOマウスを意味する。
[図 6]AGF KOマウスの生殖器脂肪（白色脂肪組織)重量変化（白色脂肪組織重量 Z体重)を示すグラフである。縦軸は、白色脂肪組織重量 (g) Z体重 (g)を示す。ま た、記号「WT」、「HTR」、及び「HM」は、それぞれ、 WTマウス、 AGFヘテロ KOマ ウス、及び AGFホモ KOマウスを意味する。
[図 7]CAG— AGF Tgマウスの脂肪細胞の形態を示す図面である。また、記号「TG
」及び「NTG」は、それぞれ、 Tgマウス及び WTマウスを意味する。
[図 8]AGFホモ KOマウスの脂肪細胞の形態を示す図面である。
[図 9]リタ一メイト WTマウスの脂肪細胞の形態を示す図面である。
[図 10]CAG— AGF Tgマウスの組織 (肝臓）中 TG含量を示すグラフである。横軸は 高脂肪食負荷 (箇月間)を、縦軸は TG含量 (mgZg組織)を示す。また、記号「WT」 及び「Tg」は、それぞれ、 WTマウス及び Tgマウスを意味する。
[図 11]CAG— AGF Tgマウスの組織 (骨格筋）中 TG含量を示すグラフである。横軸 は高脂肪食負荷 (箇月間)を、縦軸は TG含量 (mgZg組織)を示す。また、記号「W
T」及び「Tg」は、それぞれ、 WTマウス及び Tgマウスを意味する。
[図 12]AGF KOマウスの組織中 TG含量を示すグラフである。縦軸は TG含量 (mg
Zg組織)を示す。また、横軸の記号「L」及び「SM」は、それぞれ、肝臓及び骨格筋 を意味し、記号「WT」、「HTR」、及び「HM」は、それぞれ、 WTマウス、ヘテロ KOマ ウス、及びホモ KOマウスを意味する。 [図 13]AGF KOマウスの糖負荷試験の結果 (血糖値)を示すグラフである。横軸は 時間（分)を、縦軸は血糖値 (mgZdL)を示す。また、記号「WT」及び「HM」は、そ れぞれ、 WTマウス及びホモ KOマウスを意味する。
[図 14]AGF KOマウスの糖負荷試験の結果 (血漿インスリン）を示すグラフである。 横軸は時間（分)を、縦軸は血漿インスリン (ngZmL)を示す。また、記号「WT」及び 「HM」は、それぞれ、 WTマウス及びホモ KOマウスを意味する。
[図 15]マウス AGF発現アデノウイルス投与マウスの糖代謝試験の結果を示すグラフ である。黒丸は、 mAGF— Adeno投与マウスの結果であり、白丸は、 Cont— Adeno 投与マウスの結果である。また、横軸は経過時間（分)であり、縦軸は血糖値 (mgZd Uである。
[図 16]高脂肪食で飼育した CAG—AGF Tgマウス及びリタ一メイト WTマウスの血 漿中インスリン濃度 (縦軸; ng/mL)を示すグラフである。記号「TG」及び「NTG」は 、それぞれ、 CAG-AGF Tgマウス及びリタ一メイト WTマウスを意味する。
[図 17]高脂肪食で飼育した CAG—AGF Tgマウス及びリタ一メイト WTマウスの血 清コレステロール濃度 (縦軸； mg/dL)を示すグラフである。記号「TG」及び「NTG」 は、それぞれ、 CAG—AGF Tgマウス及びリタ一メイト WTマウスを意味する。
[図 18]高脂肪食で飼育した CAG—AGF Tgマウス及びリタ一メイト WTマウスの血 清遊離脂肪酸濃度 (縦軸； μ Eq/L)を示すグラフである。記号「TG」及び「NTG」は 、それぞれ、 CAG—AGF Tgマウス及びリタ一メイト WTマウスを意味する。
[図 19]CAG—AGF Tgマウス及びリタ一メイト WTマウスの糖代謝試験の結果を示 すグラフである。記号「TG」及び「NTG」は、それぞれ、 CAG—AGF Tgマウス及び リタ一メイト WTマウスを意味する。また、横軸は経過時間（分)であり、縦軸は血糖値（ mg/dL)である。
[図 20]CAG—AGF Tgマウス及びリタ一メイト WTマウスのインスリン感受性試験の 結果を示すグラフである。記号「TG」及び「NTG」は、それぞれ、 CAG—AGF Tg マウス及びリタ一メイト WTマウスを意味する。また、横軸は経過時間（分)であり、縦 軸は、インスリン投与前の血糖値に対する、投与後の血糖値の割合（％)である。
[図 21]K14— AGF Tgマウス及びリタ一メイト WTマウスにおける内臓脂肪組織重量 を示すグラフである。記号「K14 AGF」及び「NTG」は、それぞれ、 K14 AGF Tgマウス及びリタ一メイト WTマウスを意味する。また、縦軸は、体重当たりの内蔵脂 肪組織重量の百分率（％)である。
[図 22]K14—AGF Tgマウス及びリタ一メイト WTマウスにおける皮下脂肪糸且織重量 を示すグラフである。記号「K14 AGF」及び「NTG」は、それぞれ、 K14 AGF Tgマウス及びリタ一メイト WTマウスを意味する。また、縦軸は、体重当たりの皮下脂 肪組織重量の百分率（％)である。
[図 23]K14—AGF Tgマウス及びリタ一メイト WTマウスのインスリン感受性試験の 結果を示すグラフである。記号「K14— AGF」及び「NTG」は、それぞれ、 K14— A GF Tgマウス及びリタ一メイト WTマウスを意味する。また、横軸は経過時間（分)で あり、縦軸は、インスリン投与前の血糖値に対する、投与後の血糖値の割合（％)であ る。
[図 24]ヒト AGF発現アデノウイルス投与マウスの糖代謝試験の結果を示すグラフであ る。黒丸は、 hAGF— Adeno投与マウスの結果であり、白丸は、 Cont— Adeno投与 マウスの結果である。また、横軸は経過時間（分)であり、縦軸は血糖値 (mgZdL)で ある。
[図 25]FaO細胞でのマウス AGFプロモーター活性を示すグラフである。縦軸は活性 (補正値)である。
発明を実施するための最良の形態
本発明のスクリーニング方法は、 AGFが抗肥満、抗糖尿病、及び抗高脂血症の作 用を有し、従って、 AGF発現亢進剤及び Z又は AGF機能亢進剤が、抗肥満薬、糖 尿病治療薬、及び Z又は高脂血症治療薬の有効成分として有用であるとの新規知 見に基づくものであり、その具体的なスクリーニング手法の違いにより、本発明のスク リー-ング方法には、
(1) AGFのタンパク質量又は遺伝子量の変化を指標とするスクリーニング方法 (以下 、 AGF型スクリーニング方法と称する）、
(2)マウス AGFプロモーターを利用するスクリーニング方法（以下、プロモーター型ス クリーニング方法と称する）、 (3) MAPKのリン酸ィ匕の変化を指標とするスクリーニング方法 (以下、 MAPK型スク リーニング方法と称する）、
(4) AGFの細胞への結合量の変化を指標とするスクリーニング方法 (以下、細胞結 合型スクリーニング方法と称する）
が含まれる。
[0021] 本発明のスクリーニング法で使用する試験物質としては、特に限定されるものでは ないが、例えば、市販の化合物（ペプチドを含む）、ケミカルファイルに登録されてい る種々の公知化合物（ペプチドを含む）、コンビナトリアル ·ケミストリー技術 (Terrettら , J.Steele.Tetrahedron,第 δΐ卷，第 813δ— 81ァ3頁， 199δ年）によって得られた化合物 群、微生物の培養上清、植物や海洋生物由来の天然成分、動物組織抽出物、ある いは、本発明のスクリーニング法により選択された化合物（ペプチドを含む）を化学的 又は生物学的に修飾した化合物（ペプチドを含む）を挙げることができる。
[0022] (l)AGF型スクリーニング方法
本発明の AGF型スクリーニング方法は、
i)細胞に試験物質を接触させる工程、及び
ii)前記細胞における内在性の AGFのタンパク質量又は遺伝子量を測定し、試験物 質依存的な内在性の AGFのタンパク質量又は遺伝子量の変化を分析する工程 を含み、所望により、
前記工程 ii)で AGF発現亢進活性を有する試験物質の、体重変動、血糖値、及び Z 又は血中脂質含量に与える作用を分析する工程
を更に含むことができる。
[0023] 本発明の AGF型スクリーニング方法によれば、 AGF発現亢進剤をスクリーニング することができ、本発明の AGF型スクリーニング方法によりスクリーニングされた AGF 発現亢進剤は、抗肥満薬、糖尿病治療薬、及び Z又は高脂血症治療薬の有効成分 として使用することができる。
[0024] 本発明の AGF型スクリーニング方法で用いる細胞は、内在性の AGFを発現してい る力、あるいは、発現する可能性のある細胞である限り、特に限定されるものではない 力 AGFを発現している細胞であることが好ましぐ例えば、マウス骨格筋芽細胞株 C2C12細胞（ATCC番号： CRL- 1772)、ヒト肝臓癌細胞株 HepG2 (ATCC番号： HB- 8065)を挙げることができる。また、細胞は、培養細胞に限定されず、動物に試験物 質を投与することにより動物の細胞に試験物質を接触させることも AGF型スクリー- ング方法に含まれる。試験物質を接触させた細胞の培養上清、細胞溶解液、又は試 験物質を投与した動物から得た検体 (血清、組織由来細胞など)等を試料 (サンプル )として用いて、試験物質を接触させた細胞における内在性の AGFのタンパク質量 又は遺伝子量を測定し、試験物質依存的な内在性の AGFのタンパク質量又は遺伝 子量の変化を分析する。
[0025] AGFのタンパク質量の測定は、公知の方法、例えば、ィムノアッセィ又はウェスタン ブロッテイングにより実施することができ、ィムノアッセィにより実施することが好ましぐ 実施例 3、実施例 4、実施例 7、又は実施例 10に記載の ELISAにより実施することが 特に好ましい。
例えば、 AGFのタンパク質量の測定が、
i) AGFに結合する固定ィ匕抗体又はそのフラグメントに試料を反応させる工程、及び ii)前記固定ィ匕抗体又はそのフラグメントと前記試料中に含まれる AGFとの結合によ り形成される複合体に、非標識又は標識 AGF抗体又はそのフラグメントを反応させる 工程
を含むィムノアッセィによる測定である、 AGF型スクリーニング方法も、本発明に含ま れる。
[0026] AGFの遺伝子量（mRNA量）の測定は、公知の方法、例えば、定量 PCR (polymer ase
chain reaction)法又はノーザンブロッテイングなどにより実施することができ、定量 PC R法により実施することが好ましい。マウス AGF遺伝子量の測定には、実施例 13に 記載の定量 PCR法による測定が特に好ましい。また、ヒト AGF遺伝子量の測定には 、プライマーとして配列番号 43及び配列番号 44で表されるオリゴヌクレオチド対を用 いること以外は、ラット AGF遺伝子量の測定には、プライマーとして配列番号 51と配 列番号 52で表されるオリゴヌクレオチド対を使用すること以外は、実施例 13に記載と 同様の方法を用いた定量 PCRによる測定が特に好ま U、。 [0027] 定量 PCR法に用いるプライマーセットとしては、 AGF遺伝子を特異的に増幅するこ とができるように設計した順方向及び逆方向プライマーセットであれば特に限定はさ れず、そのようなプライマーの設定は、例えば、 AGF遺伝子配列 [例えば、 GenBank データベースァクセッション番号 NM— 145154 (マウス）、 NM— 031917 (ヒト）、 XM— 216613 (ラット）の配列]を元に、解析ソフト（Primer
Express; Applied Biosystems社）を用いて適切な位置を検索し、設定することができ る。より好ましいプライマーセットとしては、配列番号 29及び 30 (マウス AGF量測定； 実施例 13で用いたプライマーセット）、配列番号 43及び 44 (ヒト AGF量測定;前記プ ライマー）、配列番号 51及び 52 (ラット AGF量測定;前記プライマー）が挙げられる。
[0028] 本発明の AGF型スクリーニング方法では、例えば、実施例 3、実施例 4、実施例 7、 又は実施例 10に記載の条件 (ELISA)、あるいは、実施例 13に記載の条件（定量 P CR法)で、 AGFの発現量 (タンパク質量又は遺伝子量）が 1. 5倍以上 (好ましくは 2 倍以上、より好ましくは 4倍以上)となる物質を、 AGF発現亢進活性を有する物質とし て、選択し、物質が化合物の場合は、 molZLの濃度 (好ましくは 1 μ mol/L, より好ましくは 0. 1 μ molZL)で前記活性を持つ物質を、 AGF発現亢進活性を有す る物質として、選択する。
[0029] (2)プロモーター型スクリーニング方法
本発明のプロモーター型スクリーニング方法は、
i)配列番号 1で表される塩基配列における第 672番〜第 5572番の塩基力もなる配 列において、 1〜10個の塩基が欠失、置換、及び Z若しくは挿入された配列を含み 、且つアンジォポェチン関連増殖因子のプロモーター活性を有する DNA、配列番 号 1で表される塩基配列における第 672番〜第 5572番の塩基力もなる配列との同 一性が 90%以上である塩基配列を含み、且つアンジォポェチン関連増殖因子のプ 口モーター活性を有する DNA、あるいは、配列番号 1で表される塩基配列における 第 672番〜第 5572番、第 548番〜第 5572番、第 239番〜第 5572番、若し <は第 16番〜第 5572番、又は配列番号 2で表される塩基配列における第 16番〜第 6684 番の塩基力 なる配列力 なる DNAの下流にレポーター遺伝子が融合されたべクタ 一により形質転換された細胞に、試験物質を接触させる工程、及び ii)レポーター遺伝子の発現を測定し、試験物質依存的な前記発現の変化を分析す る工程
を含み、所望により、
前記工程 ii)で AGF発現亢進活性を有する試験物質の、体重変動、血糖値、及び Z 又は血中脂質含量に与える作用を分析する工程
を更に含むことができる。
[0030] 本発明のプロモーター型スクリーニング方法によれば、 AGF発現亢進剤をスクリー ユングすることができ、本発明のプロモーター型スクリーニング方法によりスクリーニン グされた AGF発現亢進剤は、抗肥満薬、糖尿病治療薬、及び Z又は高脂血症治療 薬の有効成分として使用することができる。
[0031] 配列番号 1で表される塩基配列における第 672番〜第 5572番の塩基力もなる配 列において、 1〜10個の塩基が欠失、置換、及び Z若しくは挿入された配列を含み 、且つアンジォポェチン関連増殖因子のプロモーター活性を有する DNA、配列番 号 1で表される塩基配列における第 672番〜第 5572番の塩基力もなる配列との同 一性が 90%以上である塩基配列を含み、且つアンジォポェチン関連増殖因子のプ 口モーター活性を有する DNA、あるいは、配列番号 1で表される塩基配列における 第 672番〜第 5572番、第 548番〜第 5572番、第 239番〜第 5572番、若し <は第 16番〜第 5572番、又は配列番号 2で表される塩基配列における第 16番〜第 6684 番の塩基力 なる配列力 なる DNAの、抗肥満薬、糖尿病治療薬、及び Z又は高 脂血症治療薬スクリーニングのための使用も本発明に含まれる。
[0032] 本発明のプロモーター型スクリーニング方法では、プロモーターとして、好ましくは、 配列番号 1で表される塩基配列における第 672番〜第 5572番の塩基力もなる配列 において、 1〜10個の塩基が欠失、置換、及び Z若しくは挿入された配列を含み、 且つアンジォポェチン関連増殖因子のプロモーター活性を有する DNA、又は 配列番号 1で表される塩基配列における第 672番〜第 5572番の塩基力もなる配列 との同一性が 90%以上である塩基配列を含み、且つアンジォポェチン関連増殖因 子のプロモーター活'性を有する DNA
を用いるが、更に好ましくは、第 672番〜第 5572番の塩基力もなる配列を含む第 16 番〜第 5572番の内の任意の長さの配列からなる DNAを、特に好ましくは、 配列番号 1で表される塩基配列における第 672番〜第 5572番の塩基力もなる配列 力 なる DNA、
配列番号 1で表される塩基配列における第 548番〜第 5572番の塩基力もなる配列 力 なる DNA、
配列番号 1で表される塩基配列における第 239番〜第 5572番の塩基力もなる配列 力 なる DNA、
配列番号 1で表される塩基配列における第 16番〜第 5572番の塩基力もなる配列か らなる DNA、又は
配列番号 2で表される塩基配列における第 16番〜第 6684番の塩基力もなる配列か らなる DNA
を用いる。
[0033] 配列番号 1で表される塩基配列は、マウス AGF遺伝子のェクソン 1上流の約 5. 6k bの長さのマウス AGFプロモーター領域の配列である。また、配列番号 2で表される 塩基配列は、マウス AGF遺伝子のェクソン 2上流の約 6. 7kb (ェキソン 1上流約 5. 6 kb、ェキソン 1約 100b、及びイントロン 1約 lkbからなる）の長さのマウス AGFプロモ 一ター領域の配列である。
[0034] レポーター遺伝子アツセィ (田村ら、転写因子研究法、羊土社、 1993年）は、レポ一 ター遺伝子の発現をマーカーとして遺伝子の発現調節を分析 (検出又は測定)する 方法である。一般に遺伝子の発現調節はその 5'上流域に存在するプロモーター領 域と呼ばれる部分で制御されており、転写段階での遺伝子発現量はこのプロモータ 一の活性を測定することで推測することができる。試験物質がプロモーターを活性ィ匕 すれば、プロモーター領域の下流に配置されたレポーター遺伝子の転写を活性ィ匕 する。このようにプロモーター活性ィ匕作用すなわち発現亢進作用をレポーター遺伝 子の発現に置き換えて検出することができる。従って、 AGFプロモーター領域を用い たレポーター遺伝子アツセィにより、 AGFの発現調節に対する試験物質の作用はレ ポーター遺伝子の発現に置き換えて検出することができる。
[0035] 前記プロモーターと融合される「レポーター遺伝子」は、一般に用いられるものであ れば特に限定されないが、定量的測定が容易な酵素遺伝子などが好ましい。例えば 、バクテリアトランスポゾン由来のクロラムフエ-コールァセチルトランスフェラーゼ遺 伝子（CAT)、ホタル由来又はゥミシィタケ由来のルシフェラーゼ遺伝子 (Luc)、又は クラゲ由来の緑色蛍光タンパク質遺伝子 (GFP)等が挙げられる。レポーター遺伝子 は、前記プロモーターと機能的に融合されていればよい。前記プロモーターと融合さ れたレポーター遺伝子を細胞 (例えば、動物細胞又は酵母）に安定あるいは一過性 に発現させる。っ 、で形質転換された細胞に試験物質を培養液中で接触した場合と 接触しな力つた場合のレポーター遺伝子の発現量を比較することにより、試験物質 依存的なプロモーター活性の変化を分析することができる。
[0036] プロモーターの下流にレポーター遺伝子が融合されたベクターによる形質転換細 胞の作製方法は、常法により実施することができ、例えば、実施例 15に記載の方法 を用いることができる。また、レポーター遺伝子の発現量の解析方法としては、前記レ ポーター遺伝子がコードするタンパク質により適宜選択される。例えば、レポーター 遺伝子が蛍光タンパク質 (例えば、ルシフェラーゼ）をコードする場合、導入細胞を適 当な方法により溶解し、この細胞溶解液の上清中に基質となるルシフェリンを添加し た後、適当な蛍光検出器 (例えば、 ML3000 ;ダイナテックラボラトリーズ社等）を用い て蛍光を測定し、レポーター遺伝子の発現量とする。また、この反応は適当な市販の 検出キット、具体的には、例えば、ルシフェラーゼアツセィシステム (プロメガ社)等を 用いて行うこともできる。
[0037] 本発明のプロモーター型スクリーニング方法では、例えば、実施例 15に記載の条 件で、レポーター活性が 1. 5倍以上 (好ましくは 2倍以上、より好ましくは 4倍以上）と なる物質を、 AGF発現亢進活性を有する物質として選択し、物質が化合物の場合は 、 10 μ molZLの濃度（好ましくは 1 μ ol/ より好ましくは 0. 1 μ molZL)で前 記活性を持つ物質を、 AGF発現亢進活性を有する物質として選択する。
[0038] (3) MAPK型スクリーニング方法
本発明の MAPK型スクリーニング方法は、
i)細胞に試験物質を接触させる工程、
ii) MAPKのリン酸ィ匕を測定し、試験物質依存的な前記リン酸化の変化を分析するェ 程、及び
iii)前記工程 ii)で AGFァゴニスト活性を有する試験物質の、体重変動、血糖値、及 び Z又は血中脂質含量に与える作用を分析する工程
を含む。
[0039] 実施例 16に示すように、細胞への AGF添カ卩により、 MAPK p38、 MAPK p42 、及び MAPK p44のリン酸化が亢進されることが判明した。この結果は、 MAPKの リン酸ィ匕の変化を分析することにより、 AGFの機能亢進を判定することが可能である ことを示している。従って、本発明の MAPK型スクリーニング方法によれば、 AGF機 能亢進剤をスクリーニングすることができ、本発明の MAPK型スクリーニング方法に よりスクリーニングされた AGF機能亢進剤は、抗肥満薬、糖尿病治療薬、及び Z又 は高脂血症治療薬の有効成分として使用することができる。
[0040] 本発明の MAPK型スクリーニング方法で用いる細胞は、 MAPKの少なくとも 1つを 発現し、 AGFが結合する細胞であることが好ましぐ例えば、ヒト臍帯静脈血管内皮 細胞 HUVEC (CAMBREX社）、筋分ィ匕 C2C12細胞、前駆軟骨細胞株 ATDC5細 胞（Cell Differ.Dev., 1990, 30(2),
109-116)を挙げることができる。試験物質を接触させた細胞の、例えば、培養上清又 は細胞溶解液を調製し、 MAPKのリン酸化を測定し、試験物質依存的な前記リン酸 化の変化を分析する。
[0041] MAPKのリン酸化の測定は、例えば、抗リン酸化 MAPK抗体を用いるウェスタン ブロッテイング又はィムノアッセィにより実施することができ、ウェスタンブロッテイング により実施することが好ましぐ実施例 16に記載のウェスタンブロッテイングにより実 施することが特に好ましい。
[0042] MAPKとしては、 MAPK p38、 MAPK p42、又は MAPK p44を挙げることが でき、本発明の MAPK型スクリーニング方法では、少なくとも 1つの MAPK (好ましく は 2種類以上の MAPK)を分析する。
[0043] 本発明の MAPK型スクリーニング方法では、 AGFァゴ-スト活性を有する物質、 例えば、実施例 16に記載の条件で、リン酸ィ匕タンパク質量が 1. 5倍以上 (好ましくは
2倍以上、より好ましくは 4倍以上)となる物質を、 AGF機能亢進活性を有する物質と して選択し、物質が化合物の場合は、 10 molZLの濃度 (好ましくは 1 μ mol/L, より好ましくは 0. 1 μ molZL)で前記活性を持つ物質を、 AGF機能亢進活性を有す る物質として選択する。
[0044] (4)細胞結合型スクリーニング方法
本発明の細胞結合型スクリーニング方法は、
i)細胞に、試験物質及び AGFを接触させる工程、及び
ii) AGFの細胞への結合量を測定し、試験物質依存的な前記結合量の変化を分析 する工程
を含み、所望により、
iii)前記工程 ii)で AGFと細胞との結合を促進する試験物質の、体重変動、血糖値、 及び Z又は血中脂質含量に与える作用を分析する工程
を更に含むことができる。
[0045] 実施例 17に示すように、 AGFは細胞表面に結合することが判明した。この結果は、 AGFの細胞への結合を促進する物質は、 AGFの機能亢進剤となることを示して 、る 。従って、本発明の細胞結合型スクリーニング方法によれば、 AGF機能亢進剤をスク リー-ングすることができ、本発明の細胞結合型スクリーニング方法によりスクリーニン グされた AGF機能亢進剤は、抗肥満薬、糖尿病治療薬、及び Z又は高脂血症治療 薬の有効成分として使用することができる。
[0046] 本発明の細胞結合型スクリーニング方法で用いる細胞は、 AGFが結合する細胞で あることが好ましぐ例えば、前駆軟骨細胞株 ATDC5細胞を挙げることができる。
[0047] AGFの細胞への結合量は、公知の結合アツセィ、例えば、フローサイトメトリー、セ ルエラィザ (cell ELISA)、又は標識 AGFの結合量を測定するバインディングアツセィ 等により測定することができ、実施例 17に記載のフローサイトメトリーにより実施するこ とが特に好ましい。
[0048] 本発明の細胞結合型スクリーニング方法では、 AGFと細胞との結合促進剤、例え ば、実施例 17に記載の条件で、細胞への AGFタンパク質の結合量が 1. 5倍以上（ 好ましくは 2倍以上、より好ましくは 4倍以上）となる物質を、 AGF機能亢進活性を有 する物質として選択し、物質が化合物の場合は、 10
Figure imgf000021_0001
は1 μ mo\/ より好ましくは 0. 1 μ molZL)で前記活性を持つ物質を、 AGF機能亢 進活性を有する物質として選択する。
[0049] (5)抗肥満作用、抗糖尿病作用、及び抗高脂血症作用の確認方法
本発明のスクリーニング方法 (AGF型スクリーニング方法、プロモーター型スクリー ユング方法、 MAPK型スクリーニング方法、及び細胞結合型スクリーニング方法を含 む)では、前記工程 i)及び ii)を実施することにより、 AGF発現亢進活性を有する、 A GFァゴニスト活性を有する、又は AGFと細胞との結合を促進する試験物質の抗肥 満、抗糖尿病、及び Z又は抗高脂血症の各作用を、所望により、例えば、前記試験 物質の投与による実験動物での体重変動、血糖値、及び Z又は血中脂質含量を分 析すること〖こよって確認することができる。
[0050] 例えば、試験物質の抗肥満作用は、試験物質投与による小動物での体重変動、脂 肪重量、又は脂肪重量の変化を調べることで確認することができる。小動物としては 、例えば、マウス、ラットなどを使用することができ、正常動物に加えて肥満モデル動 物も利用が可能である。肥満モデルとしては、例えば、 obZobマウス、 dbZdbマウス 、 Zuckerラットなどの肥満モデル動物で利用可能なものが多く知られて 、るのにカロ え、高脂肪食、高カロリー食などの負荷を与えて体重増加や脂肪重量の増加を促進 させた肥満モデルの利用が可能である。
[0051] 試験物質の体重変動に与える作用は、例えば、経時的に体重を測定し、試験物質 投与群とコントロール群との体重の変化量を比較することで分析することができる。脂 肪重量は、例えば、安楽死させたマウスを解剖し、生殖器脂肪を全摘し重量を測定 し、試験物質投与群とコントロール群との脂肪重量を比較することで調べられる。脂 肪重量の変化は、例えば、麻酔下で、実験動物用 X線 CT (ァロカ社)を用いて横隔 膜から腹腔の最下部までの領域を 2mm間隔で撮影し、内臓脂肪組織重量及び皮 下脂肪組織重量を計測し、試験物質投与群とコントロール群との各脂肪重量を比較 することで調べられる。正常動物又は肥満モデル動物に試験物質を投与すること以 外の方法は、参考例 4、参考例 5、又は参考例 17と同様に実施することができる。
[0052] また、試験物質の抗糖尿病作用は、試験物質投与による小動物の血糖値の変化を 調べることで確認することができる。小動物としては、例えば、マウス、ラットなどを使 用することができ、正常動物に加えて糖尿病モデル動物の利用が可能である。糖尿 病モデル動物としては、例えば、 KKZAyマウス、 dbZdbマウスなど多くの利用可能 なモデル動物が知られている。更に、ストレブトゾトシン誘発糖尿病モデルなどの糖 尿病モデルが利用可能である。試験物質の血糖値に与える作用は、随時血糖値、 絶食時血糖値を測定し、試験物質投与群とコントロール群との血糖値の変化を分析 することで調べられる。更に、糖負荷試験や、インスリン抵抗性試験で血糖値を測定 することで、試験物質投与群とコントロール群との耐糖能やインスリン感受性を調べる ことが可能である。正常動物又は糖尿病モデル動物に試験物質を投与すること以外 の方法は、参考例 8、参考例 16、又は参考例 18と同様に実施することができる。
[0053] 更に、試験物質の抗高脂血症作用は、試験物質投与による小動物の血中脂質含 量の変化を調べることで確認できる。小動物としては、例えば、マウス、ラット、ラビット などを使用することができ、正常動物に加えて高脂血症モデル動物の利用が可能で ある。高脂血症モデル動物としては、例えば、 Zuckerラット、 WHHLラビットなどの多 くの利用可能なモデル動物が知られている。試験物質の血中脂質含量に与える作 用は、血中トリグリセリド、血中コレステロール、血中遊離脂肪酸の濃度を測定し、試 験物質投与群とコントロール群との血中脂質含量の変化を分析することで調べられる 。正常動物又は高脂血症モデル動物に試験物質を投与すること以外の方法は、参 考例 15と同様に実施することができる。
実施例
[0054] 以下、実施例によって本発明を具体的に説明する力 これらは本発明の範囲を限 定するものではない。なお、特に断りがない場合は、公知の方法（「Molecular Clonin g」, Sambrook, J.ら, し old spring Harbor Laboratory
Press, 1989年など）に従って実施可能である。また、市販の試薬やキットを用いる場 合には、市販品の指示書に従って実施可能である。
[0055] KO動物及び Tg動物の作製については、特に断りがない場合は、 Manipulating the Mouse Embryo. A Laboratory Manual. 2nd Edition, B. Hogan, R. Beddington, F. Costantini, E. Lacy, Cold Spring Harbor, New York, Cold Spring Harbor
Laboratory Press, 1994に従って、 ES細胞を用いたキメラマウス作製については、 AL Joyner: Gene Targeting, A
Practical Approach, OXFORD UNIVERSITY PRESS, 1993又はバイオマ-ユアルシリ ーズ 8,ジーンターゲッティング ES細胞を用いた変異マウスの作製，相沢慎一 Z著 ,羊土社， 1994等に従って実施可能である。
[0056] 《参考例 1 :AGF KOマウスの作製》
(1)ターゲッティングベクターの作製
マウス AGF遺伝子の 5，側のゲノム配列（5 ' long arm)、 pgkプロモーター、ネオマイ シン耐性遺伝子、マウス AGF遺伝子のェクソン（exon) 2の一部とェクソン 3を含むゲ ノム配列（3 ' short
arm)、及び HSV— tk遺伝子を順にもつターゲッティングベクターを以下の方法で作 製した。
[0057] すなわち、 WO03/083114号公報の実施例 1と同様に作製したマウス AGFのタンパ ク質コード領域全長に対応する cDNAをプローブとして、添付マニュアルに従ってマ ウスゲノミックライブラリー (Mouse
Genomic, 129 SVJ Library;ストラタジーン社）のスクリーニングを行い、約 17. 9kbp の配列（AGF遺伝子を含む、 mouse- pub- genome配列 AC073775.2の 90644〜10854 4)を持つファージクローンを単離し、プラスミド pBluescript (ストラタジーン社）にサブ クロー-ングした。このプラスミドクローン（pBN2)を制限酵素 Sail及び Mfelで切断 することで、約 6. 2kbpの 5，ロングアーム（mouse- pub- genome配列 AC073775.2の 90 664〜96900を含む）を切り出した。また、前記プラスミド pBN2を铸型にして、配列番 号 6及び配列番号 7で表される塩基配列力 なるプライマーセットを用いて PCRを行 い、約 2. Okbpの 3，ショートアーム（mouse- pub- genome配列 AC073775.2の 105903 〜107914を含む）を得た。 5，ロングアーム及び 3，ショートアームを、それぞれ、プラス ミド pPNT (Cell,
1991, 65(7), 1153- 1163)の Xholサイト及び Xbalサイトへ挿入してターゲッティングべ クタ一を完成した。
[0058] (2)相同組み換え ES細胞の取得
得られたターゲッティングベクターを制限酵素 Notlで切断し、 ES細胞株 Rl (Proce edings
of the National Academy of Sciences, Vol 90, 8424-8428, 1993)へ電気穿孔法で導 入した。 G418を含んだ培地で ES細胞を培養し、耐性株を得た。 ES細胞力も DNA を抽出し、相同組み換えのみが起きているクローンをサザンプロット解析によって同 定した。具体的には、 AGFのェクソン 4とェクソン 5を含む、配列番号 8で表される塩 基配列からなる DNAをプローブとして、制限酵素 Hindlllで切断した DNAを用いて サザンブロット解析を行った。その結果、野生型の 4. 6Kbに対して相同組換えでは 6 . 5Kbの DNA断片を検出することができた。
(3)AGF KOマウスの作製
得られた ES細胞株を、 C57BLZ6マウスと DBAZ2マウス交雑第 2代である BDF 2マウスより得た胚盤胞へマイクロインジェクションし、操作胚を子宮へ移植した。操作 胚を移植し妊娠したマウスより、キメラマウスを出産させた。キメラマウスを C57BL/6 マウスと交配することによって、 AGFの開始コドンを欠失した変異アレルを持つへテ 口接合体マウス（以下、 AGFヘテロ KOマウスと称する）を得た。 AGFヘテロ KOマウ ス同士の交配によってホモ接合体マウス（以下、 AGFホモ KOマウスと称する）を得た 。仔マウスの尻尾より単離したゲノム DNAを铸型として PCRを行い、マウスの遺伝子 型を、 PCRによって生じる DNA断片のサイズによって確かめた。すなわち、尻尾をプ ロティナーゼ Kで処理し、 DN Aをフエノール'クロ口ホルム抽出した。抽出した DNA は、イソプロパノール沈殿及びエタノール沈殿によって回収し、トリスー EDTA緩衝液 (pH8. 0) (以下、 TE溶液と称する）に溶解した。ネオマイシン耐性遺伝子配列及び ターゲッティングによって欠失するゲノム配列に基づいて次の塩基配列力 なるブラ イマ一をデザインした。
(ネオマイシン耐性遺伝子）
フォワードプライマー：配列番号 9
リバースプライマー：配列番号 10
(ゲノム DNA)
フォワードプライマー：配列番号 11
リバースプライマー：配列番号 12 [0060] 得られた仔マウス由来ゲノム DNAについて、前記プライマーを用いて PCRを行つ た。 PCRは DNAポリメラーゼ（ExTaq;Takara社）を用いて、 95°C (5分間）の熱変性 を行った後、 95°C (1分間）、 60°C (1分間）、及び 72°C (1分間）からなるサイクルを 3 0サイクル実施し、更に 72°C (7分間）の伸長反応を行い、増幅される断片のサイズを 調べた。変異アレルがある場合は、ネオマイシン耐性遺伝子を検出する PCRにおい て 545bpのバンドが検出され、野生型アレルがある場合は、マウス AGFェクソン 1を 含むゲノム DNAを検出する PCRにお!/、て 322bpのバンドが検出される。これらの結 果より、マウスの遺伝子型を判定した。その結果、 AGFホモ KOマウスでは、変異ァレ ルのバンドが検出され、野生型アレルのバンドが検出されず、 AGFヘテロ KOマウス では、変異アレルのバントと野生型アレルのバンドが共に検出され、野生型マウス [以 下、リタ一メイト（Littermate)WTマウスと称する]では変異アレルのバンドが検出され ず、野生型アレルのバンドが検出された。
[0061] また、前記参考例 1 (2)のサザンプロット解析を行なうことでも、マウスの遺伝子型を 調べた。その結果、 AGFホモ KOマウスでは、変異アレルの 6. 5kbpのバンドが検出 され、 AGFヘテロ KOマウスでは、変異アレルの 6. 5kbpのバントと野生型アレルの 4 . 6kbpのバンドが共に検出され、リタ一メイト WTマウスでは野生型アレルの 4. 6kbp のバンドが検出された。
[0062] 更に、 AGF KOマウス力 採血した血液を 37°Cに 30分間静置後、遠心し、その 上清から血清を得た。血清をリシス（lysis)バッファー [0.5mol/L HEPES (pH7.2), 1% TritonX- 100, 10%グリセロール，
10mmol/L Na P 0 , 0.1mol/L NaF, O.lmmol/L Na VO ,
4 2 7 3 4
4mmol/L EDTA (pH8) , 0.05mg/mLァプロチュン， lmmol/L PMSF, O.lmmol/Lロイ ぺプチン，
0.025mmol/Lぺプスタイン A]で 20倍希釈したものを 2 X SDSサンプルバッファーで 倍量希釈した。 1レーン当たり 20 Lを 10%アクリルアミドゲルにて電気泳動を行い、 ウェスタンブロッテイングを行なった。ウェスタンブロッテイングは、ブロッキング剤とし て 5%ゥシ血清アルブミン（BSA)含有 TBS -T[20mmol/L
Tris-HCl (pH 7.5), 150mmol/L NaCl, 0.05%(w/v) Tween20]を、 1次抗体として抗マ ウス AGF抗体 (WO03/083114号公報）を、 2次抗体として抗ラビット抗体 (ALI3404； BI 0
SourCE社）を 3%BSA含有 TBS—Tで 5000倍に希釈したものを各々使用した。 AG Fホモ KOマウスでは、 AGFのバンドが欠失して!/、ることより AGFの欠損を確認した。
[0063] 《参考例 2 : CAG— AGF Tgマウスの作製》
本実施例では、 CAG (modined chic en beta- actin
promoter with CMV- IE enhancer)プロモーター [GENE, 108(1991) 193- 200]制御下 に全身にマウス AGFを強制発現させた AGF Tgマウス（以下、 CAG— AGF Tgマ ウスと称する）を作製した。プラスミド pBluescriptll KS ( + ) (ストラタジーン社)のマ ルチクローニングサイトに、 CAGプロモーター（1. 7kb)、 1οχ71配列、ブラストサイジ ン遺伝子（bsr)、ポリ Aシグナル配列（0. 5kb)、lox P配列、マウス AGF cDNA配 列、及び IRES (internal
ribosomal entry site) - β— geo—ポリ A配列（4. 5kb)を順に挿入したプラスミドを以 下の方法で作製した。
[0064] マウス AGF全長 cDNA(WO03/083114号公報）を铸型に、配列番号 13及び配列 番号 14で表される塩基配列からなる DNAをプライマーセットとして PCR(95°Cで 10 分間の反応後、 94°Cで 15秒間、 60°Cで 30秒間、及び 72°Cで 2分間からなる反応を 45サイクル実施）を行 、、得られた PCR産物を pZErO - 2クローユングベクター（ィ ンビトロジェン社）にサブクローユングした。得られたプラスミドを制限酵素 Hindlllと S allで切断し、プラスミド pBluescriptll SK (ストラタジーン社）の Hindlllと Sailサイト へ挿入してマウス AGF全長遺伝子をもつプラスミド pBS— mAGFを作製した。次に、 プラスミド pBS— mAGFに IRES— β—geo—ポリ Α遺伝子を導入するために、この 遺伝子を持つプラスミド pU— San (Hum
Mol Genet 8:387-396 1999)を制限酵素 Sailと Bglllで切断して IRES— β—geo— ポリ A遺伝子を切り出し、 pBS— mAGFの Bglllと Sailサイトへ挿入し、マウス AGF c DNA配列及び IRES— β— geo—ポリ Α配列を持つプラスミド pBS— mAGF— j8 ge oを作製した。
[0065] CAGプロモーター、 1οχ71配列、 bsr、及びポリ Aシグナル配列を持つプラスミド pC AGlox71bsr (Nucleic Acids Res. 1997;25(4):868- 872)の、ポリ Aシグナルの 3，側に 、 loxP配列を挿入して、 bsrと polyAシグナルを 1οχ71配列と loxP配列で挟んだ構造 を持つプラスミドを作製した。すなわち、 10 ？を含むリン酸化
Figure imgf000028_0001
処理した811) Pの断片（配列番号 15)を、制限酵素 Smalでの切断後 BAP (bacterial
alkaline phosphatase)処理したプラスミド pCAGlox71bsrへ挿入し、プラスミド loxP — 1οχ71を作製した。プラスミド ΊοχΡ— 1ρχ71に挿入された loxP配列を確認するため に、 T3プライマー（配列番号 16)を用いてシークェンシングを行い、挿入した loxP配 列を含む領域の塩基配列を調べた。その結果、 T3プライマーで読んだ塩基配列が 、前記配列番号 15で表される塩基配列と一致し、 loxPと 1οχ71が同じ方向であること を確認した。プラスミド ΊοχΡ— 1οχ71を制限酵素 Spelで切断し、得られた CAGプロモ 一ター、 1οχ71配列、 bsr、ポリ Aシグナル配列、及び loxP配列を含む断片を、プラス ミド pBS— mAGF— jS geoの Spelサイトへ挿入し、 目的のプラスミド pBS—loxP—lo x71— mAGF— jS geoを作製した。得られたプラスミド pBS—loxP—lox71—mAG F— |8 geoの構造を図 1に示す。このプラスミドを制限酵素 Notlで切断し、直鎖 DNA 断片 [CAGプロモーター（promoter)、 1οχ71配列、 bsr、ポリ Aシグナル配列（pA)、 1 ox P配列、マウス AGF cDNA配列、及び IRES— j8— geo ポリ A配列（pA)を 含む]を得た。
[0066] TT2 ES細胞 [Anal. Biochem., 1993, 214(1):
70- 76]に電気穿孔法で前記直鎖 DNA断片を導入した (0. 8V, 3 ^ F) 0 4 ^ g/mL ブラストサイジン存在下で ES細胞を培養して、遺伝子が導入された細胞を選択し、 2 0クローンを榭立した。これらの細胞に CAG— Creベクター（Blood,
1326-1333, VollOO, 2002)をサークルのまま電気穿孔法で導入した（0. 8V, 3 F)
[0067] CAGプロモーターによって発現した Creリコンビナーゼ力 1οχ71—1οχΡ間の遺伝 子を除去すれば、 AGF及び |8— geoが CAGプロモーター活性によって発現する。 そこで、 β geo発現クローンを選択するために、 Ο418 (200 /ζ 8Ζπιυ存在下で E S細胞を培養し、 1οχ71— loxP間が除去された遺伝子構造を持つ細胞を選択した。 この段階で選ばれた 15クローンの細胞は、 CAGプロモーター（1. 7kb)、 1οχ71配 列、マウス AGF cDNA配列、及び IRES— β— geo—ポリ Α配列（4. 5kb)をもち、 CAGプロモーターの制御下に AGFが恒常的に発現している ES細胞となる。 CAG - Creベクターを導入する前の 1οχ71 - ΙοχΡ間が除去されて!、な!/、各クローンの ES 細胞をネガティブコントロールとして、選ばれた 15クローンの ES細胞で AGFが発現 していることを、参考例 1 (3)と同様の抗 AGF抗体を用いたウェスタンブロッテイング で確認した。すなわち、 ES細胞をリシスバッファー及び 2 X SDSサンプルバッファー で 2倍希釈したものをサンプルとしてウェスタンブロッテイングを行 、、 AGFが発現し ていることを確認した。 AGFの発現を確認した ES細胞の中から、 8— 1、 8— 2、及び 9—1の 3ラインを選び、これを各々胚盤胞へマイクロインジェクションし、操作胚を子 宫へ移植した。操作胚を移植し妊娠したマウスより、キメラマウスを出産させた。キメラ マウスを C57BLZ6マウスと交配することによって CAGプロモーターの制御下に AG Fが恒常的に発現している Tgマウスを得た。 Tgマウスを同定するため、仔マウスの尻 尾より単離したゲノム DNAを铸型として PCRを行った。尻尾をプロティナーゼ Kで処 理し、 DNAをフエノール'クロ口ホルム抽出した。抽出した DNAは、イソプロパノール 沈殿及びエタノール沈殿によって回収し、 TE溶液に溶解した。
マウス AGF cDNA配列及び LacZ配列に基づいて次の塩基配列からなるプライ マーをデザインした。
(AGF)
フォワードプライマー：配列番号 17
リバースプライマー：配列番号 18
(LacZ)
フォワードプライマー：配列番号 19
リバースプライマー：配列番号 20
このプライマーを用いて PCRを行うと、導入遺伝子からは、 AGF cDNAを検出す る PCRにお!/、て 325bp断片が増幅され、 LacZを検出する PCRにお!/、ては 320bp 断片が増幅され、マウスゲノム DNAからはこれらのサイズの断片は増幅されないは ずである。前記プライマーを用いて、得られた仔マウス由来ゲノム DNAについて PC Rを行った。 PCRは DNAポリメラーゼ（ExTaq;Takara社）を用いて、 94°C (5分間）熱 変性を行った後、 94°C (1分間）、 62°C (1分 30秒間）、及び 72°C (1分 30秒間）から なるサイクルを 28サイクル実施し、更に 72°C (7分間）の伸長反応を行い、増幅される 断片のサイズを調べた。その結果、 3ラインとも、 AGF cDNAを検出する PCR及び LacZを検出する PCR共にバンドが確認された。すなわち、 3ラインともジャームライン トランスミッションを確認し、それぞれ CAGプロモーターの制御下に AGFが恒常的に 発現して!/ヽる Tgマウスであることが確認された。
[0069] 《参考例 3 : CAG— AGF Tgマウスの AGF遺伝子発現》
参考例 2で作製した C AG— AGF Tgマウスで、 AGF遺伝子がどの程度発現して いるかを調べた。 CAG—AGF Tgマウス及び同腹の野生型マウス（リタ一メイト WT マウス)の白色脂肪 (WAT)、褐色脂肪 (BAT)、大脳、小脳、視床下部、心臓、肝臓 、腎臓、脾臓、骨格筋、及び脾臓の各組織よりトリゾール試薬 (Invitrogen社)を用いて 総 RNAを調製した。市販の RNA精製試薬（RNeasy；キアゲン社)及び DNァーゼ（キ ァゲン社）を用いて総 RNAを DNァーゼ処理及びクリーンアップした。 DNァーゼ処 理した総 RNA0. 5 μ gを、スーパースクリプト 'ファーストストランドシステム（RT— PC R用） (LIFE
TECHNOLOGIES社）を用いて cDNAに変換した。
[0070] AGF及び内部標準の 18Sリボゾ一マル RNA(18SrRNA)の発現量は定量 PCR法 で行なった。定量 PCRは、シークェンスディテクシヨンシステム (ABI
PRISM 7900HT Sequence Detection System; Applied Biosystems社）を用いて、リア ルタイムの蛍光量を計測することで測定した。铸型として cDNAを、プライマーとして 各遺伝子毎にデザインしたプライマー及びタックマンプローブ（Taq
Man probe)を使用した。 AGF遺伝子の発現量測定には、プライマーとして配列番号 21と配列番号 22を用い、 PCR試薬として巿販の試薬 (SYBR
Green PCR Master Mix;アプライドバイオシステムズ社）を用いて PCRを行った。 18S rRNAの発現量測定には、プライマーとして配列番号 23と配列番号 24を、タックマン プローブとして配列番号 25を用い、 PCR試薬として巿販の試薬 (TaqMan
Universal PCR Master Mix；アプライドバイオシステムズ社）を使用して PCRを行った [0071] PCRの反応は、 95°C (10分間）の初期変性反応を実施した後、 94°C (15秒間）と 6 0°C (60秒間）力もなるサイクル反応を 45回繰り返すことにより実施した。遺伝子発現 量算出の標準曲線は、上記 cDNA又はマウスゲノム DNAを铸型として用いて同様 の反応を行な 、、遺伝子の発現量はサンプル間の相対値で算出した。
その結果、 CAG-AGF Tgマウスの組織では、 WTマウスの組織に比べて AGF 遺伝子の発現量が上昇していることが判った。特に、骨格筋、 BAT、心臓での発現 上昇が顕著であった。
[0072] 《参考例 4：遺伝子改変マウスの体重変化》
(l) CAG-AGF Tgマウスの体重変化
CAG-AGF Tgマウスを C57BLZ6に 2世代戻し交配し、 F2の CAG— AGF T gマウスを得た。 CAG-AGF Tgマウス及びリタ一メイト WTマウスを標準食（CE- 2 ; クレア社)で通常に飼育した。 6週齢の雌マウスの体重を比較したところ、 CAG-AG F Tgマウス ίま 15. 7g±0. 8g (SD)、 WTマウス ίま 17. 8g±0. 5g (SD)であり、 12 週齢の雌マウスの体重を比較したところ、 CAG— AGF Tgマウスは 19. 5g±0. 7g (SD)、 WTマウスは 23. 5g± 2. 5g (SD)であり、 CAG—AGF Tgマウスの方が体 重が少ないことが判った。
[0073] 次に、同じマウスを引き続き高脂肪食負荷して体重の変動を調べた。高脂肪食 (hig h
fat diet 32 ;クレア社)で通常に 12週間飼育し、体重の変動を調べた。その結果、 12 週間での体重増加量力 CAG—AGF Tgマウスは、 7. lg± lg (SD)であったのに 対して、 WTマウスは 21. 8g±4g (SD)であった。これらのことより、 CAG—AGF T gマウスでは、標準食での体重増加抑制、高脂肪食での顕著な体重増加抑制がある ことが判り、 AGFに体重増加抑制作用があることが判った。
[0074] (2)AGF KOマウスの体重変化
AGFホモ KOマウス、 AGFヘテロ KOマウス、及びリタ一メイト WTマウスを標準食で 通常に飼育した。 1週間毎に 24週齢まで各マウスの体重を測定した。結果を図 2に 示す。図 2に示すように、 AGFホモ KOマウスでは、約 12週齢より、 WTマウスに比べ て体重が重くなり始め、その後も体重増加が続き、顕著な肥満となることが判った。 A GFヘテロ KOマウスでは、 AGFホモ KOマウスとリタ一メイト WTマウスの中間的な表 現型となった。
[0075] 《参考例 5：遺伝子改変マウスの臓器重量変化》
(l) CAG-AGF Tgマウスの臓器重量変化
CAG-AGF Tgマウスでは体重増加が抑制されていることが判った力 その原因 を明らかにするために、臓器の重量を測定した。 CAG-AGF Tgマウス及びリタ一 メイト WTマウスの、生殖器脂肪 (WAT)、褐色脂肪 (BAT)、肝臓、心臓、腎臓、及び 脾臓の各組織を採取し、体重当たりの組織重量を計測した。標準食で飼育した 12週 齢のマウスと、高脂肪食で 12週齢〜 24週齢の 12週間飼育したマウスで調べた。そ の結果、褐色脂肪、肝臓、心臓、腎臓、及び脾臓では、標準食飼育及び高脂肪食飼 育共に、 CAG-AGF Tgマウスと WTマウスで組織重量の変化はなかった。一方、 生殖器脂肪（白色脂肪組織)は、標準食飼育及び高脂肪食飼育共に、 CAG-AGF
Tgマウスの方力 WTマウスよりも体重当たりの組織重量が減少していた。すなわち , CAG-AGF Tgマウスで体重増加が抑制されていたのは、白色脂肪組織の重量 増加が抑制されていたためであることが示された。すなわち、 AGFは、他の臓器重量 には何ら影響を与えず、肥満などに伴う脂肪組織重量の増加を抑制する作用がある ことが判った。白色脂肪組織に関する結果を図 3 (標準食)及び図 4 (高脂肪食負荷） に示す。
[0076] (2)AGF KOマウスの臓器重量変化
AGF KOマウスでは体重が増加していることが判った力 その原因を明らかにす るために、臓器の重量を測定した。標準食で飼育した 20週齢雌の AGFホモ KOマウ ス、 AGFヘテロ KOマウス、及びリタ一メイト WTマウスの、生殖器脂肪（WAT)、褐色 脂肪 (BAT)、肝臓、心臓、腎臓、及び脾臓の各組織を採取し、体重当たりの組織重 量を計測した。その結果、褐色脂肪、肝臓、心臓、腎臓、及び脾臓は、 AGFホモ KO マウス、 AGFヘテロ KOマウス、及び WTマウスで糸且織重量の変化はなかった。一方 、生殖器脂肪は、 AGFホモ KOマウスの方が、 WTマウスよりも、マウス個体当たり及 び体重当たりの組織重量が増加していた。 AGFヘテロ KOマウスは、 AGFホモ KO マウスと WTマウスの中間的な組織重量となった。すなわち、 AGF KOマウスで体重 が増カロしていたのは、生殖器脂肪組織等の白色脂肪組織の重量が増加していたた めであることが示された。このことより、 AGF KOマウスは、 CAG— AGF Tgマウス と逆の表現型となることが明らカゝとなり、 AGFの生理活性として他の臓器重量には影 響を与えずに脂肪組織の重量増加抑制作用があることが明らかとなった。生殖器脂 肪組織（白色脂肪組織)に関する結果を図 5 (白色脂肪組織重量)及び図 6 (白色脂 肪組織重量 Z体重）に示す。
[0077] 《参考例 6：遺伝子改変マウスの脂肪細胞形態変化》
(l) CAG-AGF Tgマウスの脂肪細胞形態変化
高脂肪食負荷することで白色脂肪組織の重量が増大し、更に脂肪細胞が肥大化 することが知られて!/、る。脂肪細胞の肥大化は糖尿病の悪性化と関連があることが知 られている（医学のあゆみ， 192, 513- 518, 2000 ;医学のあゆみ， 192, 541— 5 45, 2000)ため、 CAG— AGF Tgマウスの脂肪細胞の形態を調べた。高脂肪食で 12週齢〜 24週齢の 12週間飼育した CAG— AGF Tgマウス及びリタ一メイト WTマ ウスの生殖器脂肪組織を採取し、 10%中性緩衝ホルマリン液 (Wako)で固定し、パラ フィン包埋後、薄切切片の作製及びへマトキシリンーェォジン (H&E)染色を行なつ た。結果を図 7に示す。リタ一メイト WTマウス (NTG)では、脂肪細胞が肥大化してい た力 CAG-AGF Tgマウス (TG)では、脂肪細胞の肥大化が抑制されて、ほぼ正 常の大きさに維持されていた。
[0078] (2)AGF KOマウスの脂肪細胞形態変化
糖尿病モデルマウスや肥満モデルマウスでは、脂肪組織の重量増大に伴って脂肪 細胞が肥大化していることが知られている [Diabetologia, 14(3), 141-148, 1978]。脂 肪細胞の肥大化は糖尿病の悪性化と関連があることが知られているため、 AGF K Oマウスの脂肪細胞の形態を調べた。 AGFホモ KOマウス及びリタ一メイト WTマウス の生殖器脂肪組織 (WAT)及び褐色脂肪組織 (BAT)を採取し、 10%中性緩衝ホ ルマリン液で固定し、ノ ラフィン包埋後、薄切切片の作製及びへマトキシリン—ェォ ジン (H&E)染色を行なった。結果を図 8 (AGFホモ KOマウス）及び図 9 (リタ一メイト WTマウス）に示す。リタ一メイト WTマウスの WATは、脂肪細胞が正常の大きさであ つたが、 AGFホモ KOマウスの WATは、脂肪細胞が肥大化していることが判った。更 に、 AGFホモ KOマウスではリタ一メイト WTマウスに比べて BATでの脂肪の蓄積が 観察された。
[0079] 《参考例 7 :遺伝子改変マウスの組織中トリグリセリド含量変化》
(l) CAG-AGF Tgマウスの組織中トリグリセリド含量変化
肥満では、脂肪組織の増大に加えて、骨格筋や肝臓中でのトリグリセリド (TG)含量 の増加が起きることが知られている（日本臨床、 1995年、 53卷、 1995年特別号、肥満 症、 p354-p358)。そこで CAG— AGF Tgマウスの骨格筋 (腓腹筋)及び肝臓組織 中の TG含量を調べた。 CAG-AGF Tgマウス（Tg)及びリタ一メイト WTマウス（W T)を高脂肪食 (high
fat diet 32 ;クレア社)で 1箇月間及び 3箇月間飼育し、各マウスの骨格筋及び肝臓組 織から、クロ口ホルム一メタノール溶液を用いて、組織中の TGを抽出した（生化学実 験講座 3、脂質の化学、東京化学同人)。抽出した TGの濃度をキット（トリグリセライド Eテストヮコ一；和光純薬工業社)を用いて測定し、組織中の TG含量を求めた。結果 を図 10 (肝臓)及び図 11 (骨格筋）に示す。骨格筋と肝臓共に CAG— AGF Tgマウ スは WTマウスに比べて、組織中の TG含量が減少していることが判った。このことより 、肥満によって増加することが知られている骨格筋や肝臓中の TG含量を、 AGFが 減少させる活性があることが明ら力となった。
[0080] (2)AGF KOマウスの組織中 TG含量
AGF KOマウスの骨格筋 (腓腹筋)及び肝臓組織中の TG含量を調べた。 AGF KOマウス及びリタ一メイト WTマウスの骨格筋及び肝臓組織力 前記（1)の方法で、 組織中の TGを抽出した。抽出した TGの濃度をキット（トリグリセライド Eテストヮコ一； 和光純薬工業社)を用いて測定し、組織中の TG含量を求めた。結果を図 12に示す 。 AGF KOマウスは WTマウスに比べて、骨格筋及び肝臓組織中の TG含量が顕著 に増加していることが判った。 AGF KOマウスは CAG— AGF Tgマウスと逆の表 現型となることが判り、 AGFの生理活性として、骨格筋や肝臓中の TG含量を減少さ せる活性があることが明らかとなつた。
[0081] 《参考例 8 :AGF KOマウスの血糖値及び血中インスリン濃度変化》
AGFホモ KOマウス及びリタ一メイト WTマウスの糖負荷試験を行 、、血糖値及び 血中インスリン濃度を調べた。マウスを 16時間絶食後、 lg/kgの D—グルコースを 腹腔内注射 (ip)による投与し、投与前、並びに投与後 15、 30、 60、及び 120分後 に眼静脈より採血した。ダルテストエース（三和化学研究所)を用いて血糖値を、 RIA 2抗体法 (SRL社)を用いて血中インスリン濃度を測定した。結果を図 13 (血糖値)及 び図 14 (血漿インスリン）に示す。
[0082] WTマウスは、糖負荷により上昇した血糖値が投与後 30分後から減少し始めるのに 対して、 AGFホモ KOマウスは、糖負荷によって血糖値がより大きく上昇し、投与後 6 0分後でも血糖値は減少し始めなかった。これらのことより、 AGFホモ KOマウスでは 耐糖能異常が起きていることが判った。血中インスリン濃度は、 WTマウスでは、糖負 荷によりインスリン濃度が上昇した力 AGFホモ KOマウスでは、糖負荷前から血中ィ ンスリン濃度が顕著に高値であり、高インスリン血症の状態にあることが判った。これ らのことより、 AGF遺伝子を欠失した AGFホモ KOマウスでは、糖尿病が惹起される ことが判り、 AGFに抗糖尿病作用があることが明らかとなった。
[0083] 《参考例 9：マウス AGFとヒト AGFの発現及び精製》
ヒト AGF及びマウス AGFを WO03/083114号公報（実施例 19)に記載の方法に従 つて発現し、精製した。すなわち、 PCRにより得られた約 1. 4kbp (ヒト)又は約 1. 3k bp (マウス）の DNA断片をプラスミド pcDNA— Signal— FLAGに挿入して得られた 発現プラスミドを HEK293細胞に導入した。ヒト AGF及びマウス AGFの発現細胞株 の培養上清を、抗 FLAG— M2モノクローナル抗体ァガロースァフィ-ティーゲル (A NTI-FLAG
M2 Monoclonal Antibody Agarose Affinity Gel;シグマ社）を用いてァフィ-ティー精 製してヒト及びマウスのリコンビナント AGFタンパク質を得た。
[0084] 《参考例 10：マウス AGF発現アデノウイルスの作製》
マウス AGFの全長 cDNAを含有するプラスミド pCR2. 1 - mNew (WO03/083114 号公報の実施例 1)を铸型として、フォワードプライマー（配列番号 45)とリバースブラ イマ一（配列番号 46)を使用して PCR(pfu DNAポリメラーゼを用い、 95°C10分間 の後、 94°C15秒、 60°C30秒、 72°C2分のサイクルを 45回）を実施した。得られた P CR産物を pCR4Blunt— TOPO (インビトロジェン社）にサブクローユング後、制限酵 素 Xbalと Notlで切断し、 Xbalと Notlで切断した C末端 FLAG付加型発現ベクター pCEP4dE2— FLAG (WO02/42448号公報の実施例 2と同様に作製）に挿入して、 p CEPdE2- mAGF - FLAGを得た。 pCEPdE2— mAGF - FLAGを铸型として、 フォワードプライマー（配列番号 47)とリバースプライマー（配列番号 48)を使用して P CR(PyroBest DNAポリメラーゼを用い、 95°C2分間の後、 98°C20秒、 60°C30 秒、 72°C1分 30秒のサイクルを 20回、続いて 72°C7分）を実施した。得られた PCR 産物を pCR4Blunt— TOPO (インビトロジェン社）にサブクロー-ング後、制限酵素 Bglllと Xholで切断し生じた約 1. 4kbpの DNA断片を、アデノウイルス作製用シャト ルベクター p AdTrack - CMV (Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 95:2509-2514, 1998)の BglII、 Xhol部位に挿入して、 pAdTra cK— CMV— mAGFを完成させた。このプラスミド又はコントロールとして pAdTrack — CMV (空ベクター）を用い、ウィルス粒子を調製した。具体的には、以下の方法に より調製した。
[0085] 大腸菌 BJ5183 (ストラタジーン社）を、プラスミド pAdEasy— 1 (He
T.- C.ら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95, 2509-2514, 1998)でトランスフォームして、 プラスミド pAdEasy— 1を含む大腸菌 BJ5183 [以下、大腸菌 BJ5183 (pAdEasy- 1)と称する]を作製した。先に調製したプラスミド pAdTracK—CMV— mAGF又は pAdTrack— CMVを制限酵素 Pmelで切断し、これを用いて大腸菌 BJ5183 (pAd Easy- 1)をトランスフォームした。プラスミド pAdEasy— 1とプラスミド pAdTracK— CMV— mAGF又は pAdTrack— CMVとがリコンビネーションしたクローンを選択す るために、得られたトランスフォーマントのクローン力もプラスミドを調製して、制限酵 素 Paclによる切断パターンを調べた。 3kb又は 4. 5kbのエキストラバンド（extra band)が出現するクローンを選択することにより、プラスミドのアーム部位で、デザイン どおりにリコンビネーションを起こしたクローンを得た。
得られたウィルス粒子濃度は、 WO02/42448号公報の実施例 15と同様の方法で求 めた。
[0086] 《参考例 11：アデノウイルスを用 、たマウス AGFタンパク質の発現》
参考例 10にて調製したマウス AGFタンパク質発現アデノウイルス及び pAdTrack CMVコントロールアデノウイルスをヒト胎児腎臓細胞株 293 (ATCC番号： CRL- 15 73)に、細胞 1個当たりおよそ 100個のウィルス粒子になるように感染させた。具体的 には、 I型コラーゲンでコートした 6穴プレート (旭テクノグラス）に 3 X 105で 293細胞を 蒔き、 2mLの 10%FBSZペニシリン 100IUZmL、ストレプトマイシン 100 μ g/mL ZDMEM培地で 1晚培養した後、アデノウイルス 6 X 107粒子を添カ卩し、 1晚培養し 、 2mLのペニシリン 100IUZmL、ストレプトマイシン 100 gZmLZDMEM培地 に置換した。感染後 2日目に培養上清を回収し、 3, 000回転 Z分で 5分間の遠心分 離を行 ヽ、上清をゲル濃度 4 20%のグラジェントゲル (第一化学薬品）で SDSポリ アクリルアミドゲル電気泳動（SDS— PAGE)を実施した。一次抗体として抗マウス A GF抗体 (WO03/083114号公報の実施例 5)、二次抗体として西洋わさびパーォキシ ダーゼ標識ャギ抗ゥサギ IgGポリクローナル抗体（Biosource社）を用いたウェスタン ブロッテイングを行った。コントロールアデノウイルスにより感染させた上清をサンプル とした場合には検出されず、マウス AGFタンパク質発現アデノウイルスにより感染さ せた上清をサンプルとした場合にのみ、予想されるマウス AGF分子量にバンドが検 出され、参考例 10で作製したマウス AGFタンパク質発現アデノウイルスにより、参考 例 11の方法でマウス AGFタンパク質が発現されることがわ力つた。
《参考例 12：ヒト AGF発現アデノウイルスの作製》
ヒト AGFの全長 cDNAを含有するプラスミド (WO03/083114号公報の実施例 18で 作製；以下、 PCR2. 1—hNew)を铸型として、フォワードプライマー（配列番号 49)と リバースプライマー（配列番号 50)を使用して PCR (PyroBest™ DNAポリメラーゼ (宝酒造）を用い 5%ホルムアミド存在下で 98°C20秒、 64°C30秒、 74°C3分のサイク ルを 35回繰り返した）を実施した。得られた PCR産物を pCR4Blunt— TOPO (イン ビトロジェン社）にサブクロー-ング後、制限酵素 Hindlllと Xholで切断し、 Hindlllと Xholで切断した pCEP4 (Invitrogen)に挿入して、 pCEP— hAGFを得た。 pCEP— hAGFを制限酵素 Kpnl及び Mlulで切断し生じた約 0. 43kbpの DNA断片、全長ヒ ト AGF cDNAを含む発現プラスミド (WO03/083114号公報の実施例 19で作製；以 下、 pcDNA—SF— hAGF)を制限酵素 Mlul及び Xholで切断し生じた約 0. 98kb pの DNA断片を、アデノウイルス作製用シャトルベクター pAdTrack—CMV (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:2509-2514, 1998)の Kpnl、 Xhol部位に挿入して、 pAdTr acK— CMV— hAGFを完成させた。このプラスミド又はコントロールとして pAdTrac k CMVを用 、、 WO02/42448号公報の実施例 14及び実施例 15と同様の方法で p AdEasyシステム（Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 95:2509-2514, 1998)を利用して、ウィルス粒子を調製した。得 られたウィルス粒子濃度は、 WO02/42448号公報の実施例 15と同様の方法で求めた
[0088] 《参考例 13：アデノウイルスを用いたヒト AGFタンパク質の発現》
参考例 10及び参考例 12にて調製したヒト AGFタンパク質発現アデノウイルス及び pAdTrack— CMVコントロールアデノウイルスをヒト胎児腎臓細胞株 293に、参考例 11と同様の方法で感染させ培養上清を得た。一次抗体として実施例 1で作製した抗 SF-YP-030 IgGを使用すること以外は参考例 11と同じ方法を用いて、培養上 清中のヒト AGFタンパク質発現を検出した。その結果、コントロールアデノウイルスに より感染させた上清をサンプルとした場合には検出されず、ヒト AGFタンパク質発現 アデノウイルスにより感染させた上清をサンプルとした場合にのみ、予想されるヒト AG F分子量にバンドが検出され、参考例 12で作製したヒト AGFタンパク質発現アデノウ ィルスにより、参考例 13の方法でヒト AGFタンパク質が発現されることがわかった。
[0089] 《参考例 14：高脂肪食負荷マウスへのマウス AGF発現アデノウイルス投与》
雌の C57BLZ6マウス（クレア社）に 8週齢から高脂肪食（high fat
diet 32 ;クレア社)を与えた。高脂肪食負荷マウスは体重が増加し、本試験のウィルス 投与時である 38週齢時で約 54gと、肥満となった。これらのマウス各 4匹に、参考例 1 0で作製した、マウス AGF発現アデノウイルス (mAGF-Adeno)又はコントロールァ デノウィルス（Cont— Adeno)を、 5 X 109PFUZマウス Z週ずつ、尾静脈注射にて 投与した。最初にアデノウイルスを投与してから 12日後の体重力 mAGF-Adeno 投与マウスで、平均 7. 3g減少し、 Cont— Adeno投与マウスで 1. 4g減少した。 mA GF— Adeno投与マウスでは、 AGF遺伝子を持つウィルスを投与することで生体内 で AGFタンパク質が発現して、この AGFタンパク質が体重減少を引き起こしたことが 判った。 [0090] 更にこれらのマウスを用いて、糖代謝試験を実施した。これらのマウスを 16時間絶 食後、 0. 4gZkgの D—グルコースを腹腔内注射 (ip)により投与し、投与前、並びに 投与後 15、 30、 60、 90、及び 120分後に眼静脈より採血した。ダルテストエース（三 和化学研究所)を用 、て血糖値を測定した。その結果を図 15に示す。
mAGF— Adeno投与マウスは、グルコース投与後のすべての時間において Cont —Adeno投与マウスよりも血糖値が低ぐ耐糖能が改善していることが明ら力となった 。すなわち、 mAGF— Adeno投与マウスで高発現された AGFタンパク質の作用によ り、耐糖能が改善されたことが明らかとなった。
[0091] 《参考例 15 :高脂肪食負荷による CAG— AGF Tgマウスの血中インスリン及び脂質 濃度》
6週齢の CAG— AGF Tgマウス（参考例 2)及びリタ一メイト WTマウス（雌）を、高 脂肪食で 12週間飼育した。眼静脈より採血し、インスリンィムノアッセィ (栄研化学)を 用いて血漿中インスリン濃度を、 Lタイプヮコー コレステロール (和光純薬)を用いて 血清コレステロール濃度を、及び NEFA C—テストヮコー（和光純薬）を用いて血清 遊離脂肪酸濃度を、各キットに添付のプロトコールに従って測定した。結果を図 16 ( 血漿中インスリン濃度、 ng/mL) ,図 17 (血清コレステロール濃度、 mg/dL) ,図 1 8 (血清遊離脂肪酸濃度、 /z EqZL)に示す。
その結果、インスリン濃度、コレステロール濃度、遊離脂肪酸濃度の何れも、 CAG -AGF Tgマウス（TG)の方力 リタ一メイト WTマウス（NTG)よりも低いことがわか つた。このことより、 CAG-AGF Tgマウスで高発現された AGFタンパク質の作用に より、インスリン感受性が亢進したこと、脂質代謝が改善したことが明らかとなった。
[0092] 《参考例 16 : CAG— AGF Tgマウスの糖代謝試験》
CAG-AGF Tgマウス (参考例 2)の糖負荷試験を行!ヽ、 AGFによる耐糖能改善 効果を調べた。 4ヶ月齢の雌の CAG— AGF Tgマウス及びリタ一メイト WTマウスを 16時間絶食後、 lgZkgの D—グルコースを腹腔内注射 (ip)により投与し、投与前、 並びに投与後 15、 30、 60、及び 120分後に眼静脈より採血した。ダルテストエース（ 三和化学研究所)を用いて血糖値を測定した。結果を図 19に示す。
CAG-AGF Tgマウスは、グルコース投与後のすべての時間においてリタ一メイト WTマウスよりも血糖値が低ぐ耐糖能が改善していることが明ら力となった。すなわち 、 CAG-AGF Tgマウスで高発現された AGFタンパク質の作用により、耐糖能が 改善されたことが明らかとなった。
[0093] 次に、 4ヶ月齢の雌の CAG— AGF Tgマウス及びリタ一メイト WTマウスに、 0. 75 単位 Zkgのインスリンを腹腔内投与した。インスリン投与後、 20、 40、及び 60分後に 眼静脈より採血し、ダルテストエース (三和化学研究所)を用いて血糖値を測定した。 インスリン投与前の血糖値に対する、投与後の血糖値の割合を図 20に示す。
CAG-AGF Tgマウスはインスリン投与後すベての時間においてリタ一メイト WT マウスよりも血糖値の低下が大きぐインスリン感受性が亢進していたことが判った。 すなわち、 CAG-AGF Tgマウスで高発現された AGFタンパク質の作用により、ィ ンスリン感受性が亢進したことが明ら力となった。
[0094] 《参考例 17 :K14— AGF Tgマウスの体重及び脂肪重量変化》
K14プロモーター制御下に AGFを強制発現させた Tgマウス（WO03/083114号公 報の実施例 8)を作製した。
このマウスは、表皮細胞力 AGFタンパク質を高発現し、発現した AGFの作用によ り血管新生、組織再生が引き起こされることが判っている。全身に AGFを高発現した マウスを用いて参考例 4、参考例 5、及び参考例 16で示したのと同様に、表皮細胞で 高発現された AGFが抗肥満、及び抗糖尿病の作用を示すことを確認した。
[0095] 8ヶ月齢雌の K14—AGF Tgマウス及びリタ一メイト WTマウス各 5匹の体重を測定 したところ、 K14—AGF Tgマウスは平均約 21gであり、リタ一メイト WTマウスの平 均約 31gと比べて、体重が減少していることが明ら力となった。次に、 K14-AGF T gマウス及びリタ一メイト WTマウスの横隔膜から腹腔の最下部までの領域を 2mm間 隔で、実験動物用 X線 CT (ァロカ社)で撮影し、内臓脂肪組織重量及び皮下脂肪組 織重量を計測した。結果を図 21 (内臓脂肪組織重量)及び図 22 (皮下脂肪組織重 量）に示す。
内臓脂肪及び皮下脂肪共に K14— AGF Tgマウスのほうがリタ一メイト WTマウス に比べて、顕著に脂肪組織重量が減少していることが明らかとなった。すなわち、 C AG-AGF Tgマウスの場合と同様に、発現した AGFに抗肥満作用、及び脂肪組 織を減少する作用があることが判った。
[0096] 《参考例 18 :K14— AGF Tgマウスのインスリン感受性試験》
K14-AGF Tgマウスのインスリン感受性を調べた。 8ヶ月齢雌の K14— AGF T gマウス及びリタ一メイト WTマウスに、 0. 75単位 Zkgのインスリンを腹腔内投与した 。インスリン投与後、 20、 40、 60、 80、及び 100分後に眼静脈より採血し、ダルテスト エース（三和化学研究所)を用いて血糖値を測定した。インスリン投与前の血糖値に 対する、投与後の血糖値の割合を図 23に示す。
K14-AGF Tgマウスはインスリン投与後すベての時間においてリタ一メイト WT マウスよりも血糖値の低下が大きぐインスリン感受性が亢進していたことが判った。 すなわち、 CAG-AGF Tgマウスで高発現された AGFタンパク質の作用により、ィ ンスリン感受性が亢進したことが明ら力となった。
[0097] 《参考例 19：高脂肪食負荷マウスへのヒト AGF発現アデノウイルス投与》
参考例 14では、マウス AGFの体重減少抑制作用及び耐糖能改善作用を示した。 そこで、ヒト AGFに同様の作用があることを以下の試験を実施することで確認した。 参考例 12で作製したヒト AGF発現アデノウイルス (hAGF-Adeno)及びコントロー ルアデノウイルス（Cont—Adeno)を各 3匹のマウスに、参考例 14と同様に投与した ところ、 13日後の体重が、 hAGF— Adeno投与マウスで平均 4. 6g減少し、 Cont— Adeno投与マウスで平均 0. lg増加した。更に、腹腔内注射した D—グルコースが 0 . 5gZkg、投与後の採血を 30、 60、 90、及び 120分後に行ったこと以外は、参考例 14と同様に糖代謝試験を実施したところ、図 24に示すように、 hAGF— Adeno投与 マウスは、グルコース投与後の全ての時間において Cont— Adeno投与マウスよりも 血糖値が低ぐ耐糖能が改善していることが明らかになった。すなわち、 hAGF— Ad eno投与マウスで高発現された hAGFタンパク質の作用により、体重減少が引き起こ されたこと、及び耐糖能が改善されたことが明らかとなった。
[0098] 《実施例 1：抗ヒト AGF抗体作製》
前記参考例 9で作製した全長ヒト AGF精製タンパク質を、ゥサギに免疫して抗体を 得た。初回免疫に 500 g、 2回目〜 4回目の免疫に 250 gを使用して 2週間毎に 免疫した。最終免疫後 2週間目に、全採血により抗血清を得た。抗血清をプロテイン Aカラム (アマシャムバイオサイエンス）を用いて精製し、 IgG抗体 (以下、抗 SF— YP -030 IgG)を得た。
[0099] ヒト AGFの部分配列であるペプチド (配列番号 3)の N末端に Cys残基を付加した ペプチド (配列番号 4) (以下、ペプチド A)を合成及び精製した。ペプチド Aをキヤリ ァタンパク質のゥシサイログロブリン (シグマ社）に結合して抗原を作製し、 100 gの ペプチドを 2週間毎に、合計 8回ゥサギに免疫した。最終免疫後 1週間目に全採血を 行い、血清を得た。ペプチド Aでァフィユティーカラムを作製した。ァフィユティーカラ ムを用いて血清をァフィユティー精製し、ペプチド Aに結合する IgG抗体 (以下、抗 Y P-030-A IgG)を得た。抗体の濃度は 280nmの吸光度を測定して、分子吸光 係数を 1. 38として求めた。
[0100] 《実施例 2 :抗 SF— YP— 030 IgGの HRP標識》
0. ImolZLクェン酸緩衝液に透析した抗 SF— YP— 030 IgGに、攪拌しながら、 ペプシン (シグマ）を添加し、 37°Cで 1時間反応して抗体を部分切断した。反応液を 0 . ImolZLリン酸緩衝液（pH6. 0)で平衡化した Superdex 200 16Z60HRカラ ム（アマシャムバイオサイエンス）を用いたゲルろ過により F (ab' ) を採取した。得られ
2
た F (ab，） に 2—メルカプトェチルァミン塩酸塩 (ナカライテスタ）を添加後 37°Cで 90
2
分間反応して還元し、 ULTROGEL ACA54カラム（BIOSEPRA社）を用いたゲル ろ過により Fab，を採取した。架橋剤 EMCS [N-(6-Maleimidocaproyloxy)succinimide ； DOJINDO社]と西洋わさびペルォキシダーゼ (HRP；東洋紡）を混合し、 37°C60分 間反応させ、 0. lmol/Lリン酸緩衝液 (pH6. 0)で平衡ィ匕した P6— DGカラム（BIO RAD社）を用いたゲルろ過により EMCSと HRPのコンジユゲート画分（以下、 EMCS — HRP)を採取した。続いて、 Fab'と EMCS— HRPを混合し 4°C16時間反応させ た後、 Superdex 200 16/60HRカラムを用いたゲルろ過にて Fab，と HRPとの 結合画分を採取し、 HRP標識抗ヒト AGF抗体 Fab'フラグメント（HRP—抗 SF—YP -030 Fab' )を得た。抗体の濃度は 280nmの吸光度を測定して、分子吸光係数 を 1. 38として求めた。
[0101] 《実施例 3 :ヒト AGF検出 ELISA系構築》
実施例 1で作製した抗 YP— 030— A IgGを 20 μ g/mLで、 ELISA用マイクロプ レート（NUNC社）〖こ 100 μ L/ゥエル入れ、 4°Cでー晚静置した。ゥエル内の溶液を 吸引除去し、 PBS (リン酸緩衝化生理食塩水）で 2回洗浄後、ブロッキング液（1%BS A、 0. 05%NaN、 PBS)を 300 LZゥエル添加し、 4°Cでー晚静置し、ブロッキン
3
グした。洗浄液 (0. 05%Tween20添加 lOmmolZLリン酸緩衝液)で 2回洗浄後、 標準ヒト AGF精製タンパク質を希釈液（1%BSA, 0. 05%Tween20含有 PBS)で 1 00〜0. 39ngZmLまで 2倍連続希釈し、 100 LZゥヱルずつ添カ卩し、 37°Cで 1時 間反応した。洗浄液で 7回洗浄後、実施例 2で作製した HRP標識抗体 (HRP—抗 S F-YP-030 Fab，）を希釈液で: gZmLに調製し、 100 LZゥエルずつ添カロ 後、 37°Cで 0. 5時間反応した。洗浄液で 9回洗浄後、 TMBZ基質液 (IBL社)を 100 LZゥエルずつ添加後、室温で 30分間反応した。反応停止液（IN H SO )を 10
2 4 ゥエル添加し、発色反応を停止した。吸光光度計 (スぺクトラマックス）を用い て A450nmでの吸光度を測定した。スぺクトラマックスに添付のプログラムを用いて 解析したところ、直線性が得られる濃度領域があり、検量線を作成することができた。 以上のようにしてヒト AGFを検出する ELISA系を構築することができた。
[0102] 《実施例 4：細胞培養上清中及びヒト血清中の AGFタンパク質濃度測定》
参考例 13にて、 Adeno— AGF又は Adeno - Contを感染させた 293細胞の培養 上清中の AGFタンパク質量を測定した。各培養上清を希釈液で 2〜32倍希釈し、前 記 ELISA系を用いて標準ヒト AGF精製タンパク質の添加時に、サンプルとして培養 上清を添加することによって、サンプル中のヒト AGF濃度を測定した。その結果、 Ad eno— Contを感染させた細胞の培養上清からは AGFタンパク質は検出されなかつ た力 Adeno— AGFを感染させた細胞の培養上清からは、約 640 μ gZmLの濃度 の AGFタンパク質が検出された。
[0103] また、ヒト血清 (ケミコン社)を希釈液で 20倍希釈して、前記 ELISA系を用いて標準 ヒト AGF精製タンパク質の添加時に、サンプルとしてヒト血清を添加することによって 、血清中の AGF濃度を調べた。その結果、 AGFタンパク質力 ¾LISAにて検出され て、血清中の AGF濃度は約 100ナノグラム ZmLであることが判った。
[0104] 以上のように、実施例 3で構築した ELISA系は、サンプル中のヒト AGF濃度の測定 に利用可能であることがわ力つた。従って、試験物質を接触させた細胞の培養上清 又は細胞溶解液をサンプルとして用いて本 ELIS A系によりサンプル中の AGF濃度 を測定することにより、 AGF発現亢進剤 (すなわち、抗肥満薬、糖尿病治療薬、及び Z又は高脂血症治療薬)をスクリーニングすることができる。
[0105] 《実施例 5：ヒト AGFフイブリノ一ジエンドメインタンパク質の発現及び精製》
ヒト AGFフイブリノ一ジエンドメイン（以下、 hAGF—Fgと記す)タンパク質を抗体作 製の免疫原として利用するために、 hAGF—Fgの発現ベクターを構築した。まず、 p cDNA3. 1— signal— FLAG (WO01/34785の実施例 7—1)のクローユングサイトで ある BamHIサイトの位置を、挿入する cDNAの直前となるように改良したベクター pc DNA3. 1— SF— Bamを作製した。すなわち、オリゴヌクレオチド (配列番号 53)とォ リゴヌクレオチド（配列番号 54)をプライマーとして用い、巿販キット（Quickchange Site-Directed Mutagenesis Kit;ストラタジーン社）を使用して、 pcDNA3. 1— signal —FLAGを铸型として、添付文書に従って pcDNA3. 1— SF— Bamを作製した。
[0106] 次に、ヒト AGFの全長 cDNAを含有するプラスミド pcDNA— SF— hAGF (参考例 12参照）を铸型とし、 pfu DNAポリメラーゼ (ストラタジーン社)を用い、 95°C10分、 続いて、 94°C15秒、 55°C1分、及び 72°C1分 30秒のサイクルを 40回繰り返す PCR を行った。この際のプライマーとして、配列番号 55及び配列番号 56を用いた。生成 した断片を一度 pZEr02. 1 (インビトロジェン社）の EcoRV部位にサブクローンした 後、制限酵素 BamHI及び Xholで切断し、生成した約 0. 7kbpの DNA断片を pcD NA3. 1— SF— Bamの BamHI、 Xhol部位に挿入することにより hAGF— Fgの発現 プラスミドを完成させた。
[0107] 続いて、この発現プラスミドを、トランスフエクシヨン試薬（FuGENETM6
Transfection Reagent ;ロシュ社)を用いて、添付指示書に従い、ヒト胎児腎臓細胞株 HEK293細胞 (インビトロジェン社）に導入した。プラスミド導入の翌日に lmgZmL ジエネティシン含有の培地に置換して培養を継続し、薬剤耐性の安定発現株 (以下、 293/hAGFFg)を得た。
[0108]
Figure imgf000044_0001
タイプ Iコラーゲンでコートしたローラーボトル（コ一二ング社）で 、培養培地（10%FBS, DMEM,及び抗生物質）を用いてコンフルェントになるまで 培養した。無血清培地に置換して、 4日間培養し、培養上清を回収した。培養上清を 遠心後、フィルトレーシヨンし、 M2ァフィ二ティーゲル（シグマ社）を用いてァフィ-テ ィー精製した。精製タンパク質を 0. 1%CHAPS含有 50mmolZL Tris— HCl (pH 8. 0)に透析し、陰イオン交換カラム (HiTrap Q HPカラム）に吸着させ、 0〜250 mmolZLの NaCl濃度勾配で分離精製した。得られた hAGF— Fgタンパク質画分 を SDS— PAGE後、 CBB (Coomassie brilliant blue)染色し、高純度の hAGF— Fg タンパク質が得られたことを確認した。巿販キット (Micro
BCA Protein Assay Kit;ピアス社）を用いてタンパク質濃度を定量した。
《実施例 6 :抗 hAGF— Fg抗体作製》
精製 hAGF— Fgタンパク質を抗原として用いて、常法によりモノクローナル抗体 (抗 hAGFFgMoAb)産生クローンを得た。すなわち、精製 hAGF— Fgタンパク質に同 量のフロイドコンプリートアジュバント（Freund' s Complete Adjuvant ;DIFCO社）をカロ えて作製したェマルジヨンを、 6週齢の BALB/cマウスに、タンパク質量として 50 g Zマウスとなるように皮下及び皮内に注射した。以後 7日間毎に、合計 4回免疫した。 4回免疫後の 4日後に尾静脈より試採血して血清を得た。 hAGF— Fgタンパク質に 対する血清の結合活性を調べて、力価が上昇していることを確認した。試採血 8日後 に、上記と同様の方法で最終免疫を行い、その 4日後に脾臓を採取して細胞融合に 用いた。脾臓細胞と P3X63Ag8. 653細胞 (ATCC社）をポリエチレングリコールを用 いて細胞融合し、 HAT選択培地にて 96ゥエルプレートで培養した。培養上清を用い て hAGF— Fgタンパク質に対する結合活性を調べ、陽性ゥエルを選択した。結合活 性は次の方法で調べた。 11八0 ー 8タンパク質を501187111しで、 ELISA用マイクロ プレート（NUNC社）に 50 μ L/ゥエル入れ、 4°Cでー晚静置した。ゥエル内の溶液を 吸引除去し、 PBSで 2回洗浄後、ブロッキング液（0. 1%BSA, 0. 05%NaN , PBS
3
)を 200 LZゥエル添カ卩し、 4°Cでー晚静置し、ブロッキングした。洗浄液 (0. 05% Tween20添加 10mmol/Lリン酸緩衝液）で 2回洗浄後、ハイプリドーマの培養上 清を希釈用緩衝液 (0. 1%BSA, 0. 05%Tween20含有 PBS)で 2倍希釈し、 50 LZゥエルずつ添加し、 37°Cで 1時間反応した。洗浄液で 4回洗浄後、 HRP標識抗 マウス IgG抗体（Biosource社）を希釈用緩衝液で 5000倍希釈し、 50 μ LZゥエルず つ添加後、 37°Cで 0. 5時間反応した。洗浄液で 6回洗浄後、基質用緩衝液 [K HP O —タエン酸緩衝液（0. 03%H O ) pH5. 1]で溶解したオルトフエ-レンジアミン（
4 2 2
OPD Tablet ;シグマ社)を 100 LZゥエルずつ添加後、室温で 15分間反応した。反 応停止液（IN H SO )
2 4を 100 LZゥ ル添加し、発色反応を停止した。吸光光度 計を用いて A での吸光度を測定した。
490nm
[0110] 選択したゥエルの細胞を限界希釈法により 1次クローユングした。上記と同様に hA GF—Fgタンパク質に対する結合活性を調べ、陽性ゥエルを選択した。
得られた各クローンを大量培養して、培養上清カも抗マウス IgGァガロースビーズ（ American
Qualex社)を用いて IgG抗体を精製した。 IgG抗体溶液の 260nmの吸光度を測定し て、分子吸光係数を 1. 3としてタンパク質濃度を求めた。
[0111] 《実施例 7：ヒト AGF検出 ELISA系構築》
実施例 6で作製した IgG抗体 (抗 hAGFFgMoAb # 7A)を 2. 5 μ gZmLとなるよ うに 50mmol/L炭酸バッファー（pH9. 6)に希釈して、 ELISA用マイクロプレート（ NUNC社）〖こ 100 LZゥエル入れ、 4°Cでー晚静置した。ゥエル内の溶液を吸引除 去し、 PBSで 2回洗浄後、ブロッキング液（1%BSA, PBS)を 300 LZゥエル添カロ し、 4°Cでー晚静置し、ブロッキングした。洗浄液（0. 02%CHAPS添加 PBS)で 2回 洗浄後、標準ヒト AGF精製タンパク質を希釈液（1%BSA, 0. 02%CHAPS含有 P BS)で 30〜0. 3ngZmLまで連続希釈し、 100 LZゥエルずつ添カ卩し、室温で 1. 5時間反応した。洗浄液で 5回洗浄後、実施例 1で作製した 1次抗体「抗 YP— 030— A 0」を希釈液で1. 5 /z gZmLに調製し、 100 LZゥヱルずつ添加後、室温で 1時間反応した。洗浄液で 5回洗浄後、 HRP標識した 2次抗体 (HRP標識 Anti-rabbit IgG ;MBL社）を希釈液で 2000倍希釈し、 100 LZゥ ルずつ添加後、室温で 1時 間反応した。洗浄液で 5回洗浄後、基質反応液 (R&D社)を 100 LZゥエルずつ添 加後、室温で 20分間反応した。反応停止液（IN H SO )を 100 LZゥエル添カロ
2 4
し、発色反応を停止した。吸光光度計 (サファイア; TACAN社)を用いて A での
450nm 吸光度を測定した。その結果、直線性を有する検量線を作成することができた。以上 のように、ヒト AGFフイブリノ一ジエンドメインに対するモノクローナル抗体を用いても、 ヒト AGFを検出する ELISA系の構築が可能であった。 [0112] 《実施例 8 :抗マウス AGF抗体作製》
マウス AGFの部分配列であるペプチド (配列番号 5及び配列番号 26)の C末端及 び N末端に Cys残基をそれぞれ付加したペプチド (配列番号 27及び配列番号 28)を 合成及び精製し、ペプチド ΎΡ— 126及び YP— 127— Bを得た。各ペプチドをキヤリ ァタンパク質のゥシサイログロブリン (シグマ社）に結合して抗原を作製し、 100 gの ペプチドを 2週間毎に、合計 8回ゥサギに免疫した。最終免疫後 1週間目に全採血を 行い、血清を得た。各ペプチドでァフィユティーカラムを作製した。ァフィユティーカラ ムを用 V、て血清をァフィユティー精製し、ペプチド ΎΡ - 126に対する IgG抗体 (以下 、抗 YP— 126 IgG)及びペプチド YP— 127— Bに対する IgG抗体（以下、抗 YP— 127— B IgG)を得た。
[0113] 《実施例 9 :抗 YP— 126 IgGの HRP標識》
実施例 8の抗 YP— 126 IgGと実施例 2と同様に作製した EMCS— HRPとを反応 させ、ゲルろ過にて HRPにより標識された抗体画分を採取し、 HRP—抗 YP— 126 IgGと名づけた。
[0114] 《実施例 10 :マウス AGF検出 ELISA系の構築》
実施例 8で作製した抗 YP— 127— B IgGを 20 μ g/mLで、 ELISA用マイクロプ レート（NUNC社）〖こ 100 μ L/ゥエル入れ、 4°Cでー晚静置した。ゥエル内の溶液を 吸引除去し、 PBSで 2回洗浄後、ブロッキング液を 300 LZゥエル添カ卩し、 4°Cで一 晚静置し、ブロッキングした。洗浄液で 2回洗浄後、標準マウス AGF精製タンパク質 を希釈液で 100〜0. 39ngZmLまで 2倍連続に希釈し 100 LZゥエルずつ添カロし 、 37°Cで 1時間反応した。洗浄液で 7回洗浄後、実施例 9で作製した HRP標識抗体 (HRP—抗 YP— 126 IgG)を希釈液で 1 μ gZmLに調製し、 100 LZゥエルず つ添加後、 37°Cで 0. 5時間反応した。洗浄液で 9回洗浄後、 TMBZ基質液 (IBL社） を 100 LZゥエルずつ添加後、室温で 30分間反応した。反応停止液（IN H SO
2 4
)を 100 /z LZゥエル添加し、発色反応を停止した。吸光光度計 (スぺクトラマックス） を用いて A450nmでの吸光度を測定した。なお、ブロッキング液、洗浄液及び希釈 液は、実施例 3と同じものを用いた。スぺクトラマックスに添付のプログラムを用いて、 標準曲線を描き、直線性が得られた濃度領域で、検量線を作成することができた。以 上のようにしてマウス AGFを検出する ELISA系を構築することができた。
[0115] 《実施例 11 : 3T3— L1の脂肪細胞への分化》
10%ゥシ血清を含むダルベッコ改変イーグル培地（DMEM)で培養したマウス 3Τ 3— L1細胞 (ATCC番号: CL-173)の脂肪細胞への分ィ匕法は、基本的に、公知の方 法（江崎ら、医学のあゆみ、 503-506、 1998)に従った。なお、 3Τ3— L1細胞は、白色 脂肪細胞のモデル細胞としてよく使われるマウス由来の培養細胞株である。
3T3—L1細胞を 24穴コラーゲンコートプレート (旭テクノグラス社）に 1穴当たり 500 00個になるように撒き、ほぼコンフルェントとなった後に、 0. 5mmol/L— 3—イソブ チルー 1ーメチルキサンチン、 0. 25 μ molZLデキサメタゾン、及び 10 μ gZmLィ ンスリンを添カ卩した 10%ゥシ胎児血清を含むダルベッコ改変イーグル培地（DMEM )に培地を変更し、脂肪細胞への分化を開始した。更に 2日後、培地を 10%ゥシ胎児 血清を含む DMEMに変更し、その後、 2日おきに培地を入れ替え、分化誘導を開始 した。分化誘導開始後 6日目力 8日目までの培養上清を回収し、脂肪細胞 3T3— L 1の培養上清とした。
[0116] 《実施例 12 :铸型 cDNAの調製》
24穴コラーゲンコートプレート（旭テクノグラス社）に C2C12細胞（ATCC番号： CRL -1772)を 1穴あたり 20000個になるように撒き、 15%ゥシ胎児血清を含むダルベッコ 改変イーグル培地（DMEM)で 1昼夜培養した。翌日にインスリン（Biomedical Technologies Inc社）を終濃度 lOOnmolZLの濃度で添加、あるいは培地を上記方 法で取得した 3T3— L1培養上清に変更し、そのまま 48時間培養した。対照群として は、 C2C12細胞を刺激剤を加えない 15%ゥシ胎児血清を含むダルベッコ改変ィー ダル培地（DMEM)でそのまま 48時間培養した。各処理群力 RNeasyミニキット（R Neasy
Mini Kit ;キアゲン社）を用いて添付文書に従いトータル RNAを調製し、各群 500ng をサーモスクリプト RT—PCRシステムキット（インビトロジェン社）を用いて cDNAに変 換した。
[0117] 《実施例 13：定量 PCRによる C2C12細胞における AGF遺伝子発現量の測定》 マウス AGF増幅プライマーとして配列番号 29で表される塩基配列力 なる DNA及 び配列番号 30で表される塩基配列カゝらなる DNAを、铸型として実施例 12で得た C2 C12細胞培養上清由来の各 cDNAを用い、シークェンスディテクター（ABI PRISM 7 900 ; Applied Biosystems社）を用いて、 C2C12細胞における AGF遺伝子発現量の 測定を定量 PCRで行った。 PCRは SYBR GREEN PCRマスターミックス（SYBR GREEN PCR Master Mix; Applied Biosystems社）を用い、 95。C、 10分間の反応のあ と、 95°C、 15秒、 60°C、 1分のサイクルを 50回繰り返した。また内部標準としてマウス サイクロフィリンの発現量を算出するため、上記 cDNAを铸型として、配列番号 31で 示されるオリゴヌクレオチドと配列番号 32で示されるオリゴヌクレオチドをプライマーセ ットとして同条件の PCRを行った。また、マウスゲノム (クロンテック社)を铸型として、 上記マウス AGF及びサイクロフィリンのプライマーセットを用いた同条件の PCRを行 い、 mRNA発現量算出の標準曲線を得た。各サンプルにおける AGFの発現量は、 サイクロフィリンの発現量で補正することにより算出した。その結果、 C2C12細胞に おいて、刺激剤がない場合に比べ、 AGFは、インスリンにより約 6倍に発現が誘導さ れ、また脂肪細胞 3T3— L1培養上清により約 8倍に発現が誘導されることが判明し た。
[0118] 以上により、試験物質を接触させた C2C 12細胞の培養上清力も調製した cDNAを 铸型として定量 PCRを行うことにより、 AGF発現亢進薬 (すなわち抗肥満薬、糖尿病 治療薬、及び Z又は高脂血症治療薬)をスクリーニングすることができることがわかつ た。
[0119] 《実施例 14 :マウス AGFプロモーター領域のクローユング及びレポータープラスミド 構築》
マウス AGFプロモーター領域としてェキソン 1上流の約 5. 6kbの長さの領域をクロ 一-ングするために、フォワードプライマー（配列番号 33)、リバースプライマー（配列 番号 34)を利用し、マウス BACクローン（RP23-369H22 ; Children' s Hospital Oaklan d)を铸型にし、 DNAポリメラーゼ（TaKaRa Ex
taq™;宝酒造社)を用い、 94°C5分間の後、 94°C1分、 58°C1分 30秒間、及び 72°C 3分間のサイクルを 32回、続いて 72°C10分間の条件で PCRを行った。得られた PC R産物をクロー-ングベクター（pGEMR- T Easy Vector Systems；プロメガ社）にサブクローユングして pGEM— 5. 6kbを得た。 DN Aシーケンス試薬 (BigDye3.1；アプライドバイオシステムズ）を用い、添付の説明 書に従 、、 DNAシーケンサー（モデル PRISM3700；アプライドバイオシステムズ）を用 いて、 DNA配列を解析し、配列番号 1で表される塩基配列における第 1番〜第 557 2番の塩基配列を決定した。
[0120] ェキソン 1上流約 2. 8kbの Xholサイトより更に上流の約 0. 5kb,約 0. 9kb,約 1.
4kb,約 2kb,約 2. 15kb,及び約 2. 5kbのフラグメントを下記のプライマーを用い、 pGEM- 5. 6kbを铸型として PCR(DNAポリメラーゼ TaKaRa Ex taqを用い、 9 4。C5分間の後、 94。C1分、 60。C2分、 72。C2分のサイクルを 25回、続いて 72。C10 分間）を行い作製した。最終的にェキソン 1上流約 2. 8kbの先につなげて各々約 3. 3kb,約 3. 7kb,約 4. 2kb,約 4. 8kb,約 5kb,及び約 5. 3kbのフラグメントを作製 するためである。
[0121] [表 1] 名前 フォヮ一ドプライマ一 リバースプライマー PCR産物の長さ
3. 3kb 配列番号 3 5 配列番号 4 1 0. 5kb
3. 7kb 配列番号 3 6 配列番号 4 1 0. 9kb
4. 2kb 配列番号 3 7 配列番号 4 1 1. 4kb
4. 8kb 配列番号 3 8 配列番号 4 1 2kb
5kb 配列番号 3 9 配列番号 4 1 2. 15kb
5. 3kb 配列番号 4 0 配列番号 4 1 2. 5kb
[0122] PCRで得られた各断片をクローユングベクター（pGEMR-T
Easy Vector Systems；プロメガ社）に各々サブクローユングし、プラスミド 3. 3kb,プラ スミド 3. 7kb,プラスミド 4. 2kb,プラスミド 4. 8kb,プラスミド 5kb,及びプラスミド 5. 3kbを得た。
pGEM5. 6kbを制限酵素 BamHIで処理し、得られた配列番号 1の第 16番〜第 5 572番を含む断片を、制限酵素 Bglllで処理したルシフェラーゼアツセィシステム用 ベクター pGL3— basic (プロメガ社）に挿入し、 pGL— 5. 6kb及び pGL— 5. 6kRを 得た。 pGL5. 6kbは、インサートが正方向に挿入されて挿入したプロモーター配列 の下流（3 '側）にルシフェラーゼ遺伝子が存在し、 pGL5. 6kRは、インサートが逆方 向に挿入されて挿入したプロモーター配列の上流（5 '側）にルシフェラーゼ遺伝子が 存在する。 pGEM5. 6kbを制限酵素 Xholと BamHIで処理し、得られた配列番号 1 の第 2741番〜第 5572番を含む断片を、制限酵素 Xholと Bglllで処理した pGL3— basicに挿入し、 pGL— 2. 8kbを得た。 pGEM5. 6kbを制限酵素 Kpnlと BamHIで 処理し、得られた配列番号 1の第 5121番〜第 5572番を含む断片を、制限酵素 Kp nlと Bglllで処理した pGL3— basicに挿入し、 pGL— 0. 5kbを作製した。次にサブク ローニングしたプラスミド 3. 3kb,プラスミド 3. 7kb,プラスミド 4. 2kb,プラスミド 4. 8 kb,プラスミド 5kb,及びプラスミド 5. 3kbを制限酵素 Xholで処理し、得られた断片 を、制限酵素 Xholで処理した pGL— 2. 8kbに挿入し、各々配列番号 1の第 2174 番〜第 5572番を含む pGL— 3. 3kb、配列番号 1の第 1760番〜第 5572番を含む pGL- 3. 7kb、配列番号 1の第 1267番〜第 5572番を含む pGL— 4. 2kb、配列番 号 1の第 672番〜第 5572番を含む pGL— 4. 8kb、配列番号 1の第 548番〜第 557 2番を含む pGL— 5kb、配列番号 1の第 239番〜第 5572番を含む pGL— 5. 3kbを 得た。
[0123] 更に、ェキソン 1上流約 5. 6kb、ェキソン 1約 100b、及びイントロン 1約 lkbからなる 、ェキソン 2上流約 6. 7kbの領域をクローユングするために、前記と同様の PCRを、 フォワードプライマー（配列番号 33)及びリバースプライマー（配列番号 42)を使用し て実施した。得られた 6. 7kbの断片をサブクローユングし、塩基配列を解読し、配列 番号 2で表される塩基配列における第 1番〜第 6684番の塩基配列を決定した。得ら れたクローンを制限酵素 BamHIで処理した。この断片を pGL3— basicを、制限酵素 Bglllで処理したものに挿入し、ェキソン 1上流約 5. 6kbを含むェキソン 2上流領域約 6. 7kbである配列番号 2で表される塩基配列における第 16番〜第 6684番を含む 発現プラスミド pGL - 6. 7kbを得た。
[0124] 《実施例 15：マウス AGFプロモーター領域 DNA配列の解析》
pGL— basic (空ベクター）、又は実施例 14で得られたレポータープラスミドのレポ 一ター活性を測定するために、 FaO細胞（J.Cell Science, 2000, 113, 1069-1074)へ 、ゥミシィタケ（renilla)由来ルシフェラーゼ発現べクタ一である phRL—TK (プロメガ 社）とこれらのレポータープラスミド各々をコトランスフエクシヨンした。すなわち、 FaO 細胞を増殖培地 [低グルコース (low
glucose) DMEM、 10%牛胎児血清（FCS) ]で、タイプ Iコラーゲンコートした 12ゥェ ルプレートにサブコンフルェントまで培養し、無血清の Opti— MEMRI (インビトロジェ ン社）に培地交換後、トランスフエクシヨン試薬（Lipofectamine™Reagent;インビトロジ ェン社）を用いて、前記プラスミドをトランスフエクシヨンした。トランスフエクシヨン後 3時 間で等量の低グルコース DMEM、 20%FCSを添カ卩し、更に 12時間後に培地を低 グルコース DMEM、 10%FCSに置換した。更に 12時間培養後、ルシフェラーゼ活 性を、 Dual— Glo™ルシフェラーゼアツセィシステム（Dua卜 Glo™
Luciferase Assay System;プロメガ社）を使用して、添付プロトコールに従って測定し た。プロモーターを導入したプラスミドから発現するホタルルシフェラーゼ活性を、内 部補正用のプラスミド phRL—TKから発現するゥミシィタケルシフェラーゼ活性で割 つた値を、レポーター活性として、結果を図 25に示す。その結果、 pGL- 3. 3kb、 p
GL- 3. 7kb、及び pGL— 4. 2kbを導入した場合、活性が観察されず、 pGL— 4. 8 kb、 pGL— 5kb、 pGL— 5. 3kb、pGL— 5. 6kb、及び pGL— 6. 7kbを導入した場 合には観察されることがわ力つた。ェキソン 1上流 5. 6kbを逆方向につないだ場合は プロモーター活性がなくなることが判った。更に、 pGL— 0. 5kb及び pGL— 2. 8kb を用いて同じ実験をしたところ、いずれもプロモーター活性は見出されな力つた。す なわち、配列番号 1で表される塩基配列における第 672番〜第 5572番、第 548番
〜第 5572番、第 239番〜第 5572番、若しくは第 16番〜第 5572番、又は配列番号
2で表される塩基配列における第 16番〜第 6684番の塩基力もなる配列は、 AGFプ 口モーター活性を有することがわ力つた。 これらの DNA配列を利用したレポーターアツセィを構築することができ、前記領域 に AGFプロモーター活性が含まれることを見出した。本アツセィ系において、 AGFプ 口モーター活性を有する DNA配列を含むプラスミド導入後の細胞に試験物質を添 加し、ルシフェラーゼ活性の変化を分析することにより、 AGF遺伝子のプロモーター 活性を促進し、 AGFの発現を亢進する物質である抗肥満薬、糖尿病治療薬、及び Z又は高脂血症治療薬をスクリーニングすることができる。 [0125] 《実施例 16 : AGF刺激による MAPKリン酸ィ匕亢進》
C2C12細胞を、タイプ Iコラーゲンコートした 12ゥエルプレートに増殖培地（DME M, 10%FCS)でコンフルェントまで培養後、分化培地（DMEM, 2%ゥマ血清）に 置換して 7日間培養することで筋分化させた。 1%BSAを含む無血清培地で 12時間 培養後に同培地に置換し、最終 1 μ gZmLとなるように AGFタンパク質を添加又は 同量の PBSを添加した。添加 10分間後に培養液を吸引除去し、 50 /z Lの細胞溶解 液 [50mmolZL HEPES (pH7. 2) , l%TritonX— 100, 10%グリセロール， 10 mmol/L Na P O , 100mmol/L NaF, 100 μ mol/L Na VO , 40mmol
4 2 7 3 4
/L EDTA, 50 μ g/mLァプロチュン， lmmol/Lフエ-ルメチルスルホ -ルフル オライド（PMSF) , 0. lmmol/Lロイぺプチン， 25 molZL ぺプスタチン A]を添 加することで反応を停止して細胞を溶解した。得られたサンプルに SDS—サンプル 緩衝液 [20%グリセロール， 130mmolZL Tris— HCl (pH6. 8) , 10%2—メルカ プトエタノール， 6%SDS, 0. 2mg/mLブロモフエノールブルー]を添カ卩して、 SDS — PAGEを行い、ポリフッ化ビ-リデン (PVDF)膜へブロッテイングした。一次抗体と して、抗リン酸化 MAPK p38抗体（Cell signaling #9211)、抗リン酸化 MAPK p42 Zp44抗体（Cell signaling #9101)、抗 MAPK p38抗体（Cell
signaling #9212)、又は抗 MAPK p42Z44抗体（Cell signaling #9102)を使用、二 次抗体として HRP標識抗マウス IgG抗体 (実施例 9)を使用してウェスタンプロッティ ングを行い、 MAPK p38、MAPK p42、及び MAPK ρ44のリン酸化状態を検 出した。スキャナーでウェスタンブロッテイングの結果を取り込み、画像解析ソフトを用 いて各リン酸ィ匕バンドの濃度を定量した。その結果、 AGFタンパク質の添カ卩により、リ ン酸化 MAPK p38は 1. 6倍、リン酸化 MAPK p42は 3. 4倍、リン酸化 MAPK p 44は 4. 3倍に各々リン酸ィ匕が亢進されることを見出した。
[0126] すなわち、 AGFァゴ-スト刺激による細胞での反応を検出するアツセィ系を構築す ることができた。本アツセィ系において、細胞に試験物質を添カ卩し、 MAPKのリン酸 化の変化を分析することにより、 AGFァゴニスト活性を持つ物質である抗肥満薬、糖 尿病治療薬、及び Z又は高脂血症治療薬をスクリーニングすることができる。
更に、筋分化 C2C12細胞以外に、ヒト臍帯静脈血管内皮細胞 HUVEC、前駆軟 骨細胞株 ATDC5細胞にぉ 、ても同様の試験を実施し、 MAPKリン酸化が AGF刺 激によって亢進されることを確認した。 HUVECは増殖培地 (旭テクノ硝子)で、 ATD C5細胞は増殖培地（DMEM/F12, 5%FCS)で各々サブコンフルェントまで培養 して前記アツセィに使用した。
[0127] 《実施例 17：細胞株への AGFタンパク質の結合》
ATDC5細胞を、増殖培地（DMEMZF12, 5%FCS)でサブコンフルェントまで 培養して、セルスクレバーを使用して細胞をプレートより剥がした。 FCM緩衝液 (0. 1 %BSA/lmmol/L CaCl /lmmol/L MgCl ZPBS)で細胞を 2回洗浄後、
2 2
無添加、又は最終 10 gZmLとなるようにマウス AGFタンパク質又はヒト AGFタン ノ ク質を添加し 4°Cで 30分間反応させた。 FCM緩衝液で細胞を洗浄後、フルォレセ インイソチオシァネート（FITC)標識 M2抗体 (シグマ社)を最終 10 μ gZmLとなるよ うに添加して 4°Cで 30分間反応させた。更に、 FCM緩衝液で細胞を 3回洗浄後、 1 μ gZmLとなるようにヨウ化プロビジゥム（PI)を添加して死細胞を染色した。細胞を フローサイトメーター（Cytomics FC 500 ;ベックマン'コールター社）で解析し、死細胞 を除去した PI陰性細胞の FITC強度を計測した。
[0128] ヒト AGFタンパク質及びマウス AGFタンパク質には FLAG配列が付カ卩されて!/、るの で、 FLAG配列を認識する M2抗体を反応させることで、細胞に結合した AGFタンパ ク質に FITC標識 M2抗体が結合し、 AGFタンパク質が結合した細胞の蛍光強度が 強くなる。測定の結果、マウス AGFタンパク質を添加した場合に蛍光強度が 1. 5倍 に、ヒト AGFタンパク質を添加した場合に細胞では蛍光強度が 8. 1倍となり、細胞に AGFタンパク質が結合したことが判った。細胞への AGFタンパク質の結合量を多く する物質は、 AGFのシグナルを強くするため、 AGF機能亢進剤となる。本結合アツ セィ系にて、細胞へ、事前又は AGFタンパク質添加と同時に試験物質を反応させる ことで、試験物質の AGF機能亢進活性を測定することができ、 AGF機能亢進剤 (す なわち、抗肥満薬、糖尿病治療薬、及び Z又は高脂血症治療薬)をスクリーニングす ることがでさる。
産業上の利用可能性
[0129] 本発明のスクリーニング方法は、抗肥満薬、糖尿病治療薬、及び Z又は高脂血症 治療薬のスクリーニングの用途に適用することができる。
以上、本発明を特定の態様に沿って説明したが、当業者に自明の変形や改良は 本発明の範囲に含まれる。
配列表フリーテキスト
以下の配列表の数字見出し < 223 >には、「Artificial Sequence」の説明を記載す る。配列番号 6、 Ί、 9、 10、 13、 14、 16、 19、 20、 34〜40、 42, 45〜50、及び 53 〜56で表される各塩基配列は、人工的に合成したプライマー配列であり、配列番号 4の配列で表されるアミノ酸配列は、ペプチド Αの配列であり、配列番号 15の配列で 表される塩基配列は、 loxPを含む配列であり、配列番号 27の配列で表されるァミノ 酸配列は、ペプチド ΎΡ— 126の配列であり、配列番号 28の配列で表されるアミノ酸 配列は、ペプチド ΎΡ— 127— Bの配列である。

Claims

請求の範囲
[1] 試験物質が、アンジォポェチン関連増殖因子の発現及び Z又は機能を亢進する か否力を分析する工程を含む、抗肥満薬、糖尿病治療薬、及び Z又は高脂血症治 療薬をスクリーニングする方法。
[2] 分析する工程が、
i)細胞に試験物質を接触させる工程、及び
ii)前記細胞における内在性のアンジォポェチン関連増殖因子のタンパク質量又は 遺伝子量を測定し、試験物質依存的な内在性のアンジォポェチン関連増殖因子の タンパク質量又は遺伝子量の変化を分析する工程
を含む、請求項 1に記載の方法。
[3] アンジォポェチン関連増殖因子のタンパク質量又は遺伝子量の測定力 アンジォ ポェチン関連増殖因子のタンパク質量の測定である、請求項 2に記載の方法。
[4] アンジォポェチン関連増殖因子のタンパク質量又は遺伝子量の測定力 アンジォ ポェチン関連増殖因子の遺伝子量の測定である、請求項 2に記載の方法。
[5] 分析する工程が、
i)配列番号 1で表される塩基配列における第 672番〜第 5572番の塩基力もなる配 列において、 1〜10個の塩基が欠失、置換、及び Z若しくは挿入された配列を含み 、且つアンジォポェチン関連増殖因子のプロモーター活性を有する DNA、又は配 列番号 1で表される塩基配列における第 672番〜第 5572番の塩基力もなる配列と の同一性が 90%以上である塩基配列を含み、且つアンジォポェチン関連増殖因子 のプロモーター活性を有する DNAの下流にレポーター遺伝子が融合されたべクタ 一により形質転換された細胞に、試験物質を接触させる工程、及び
ii)レポーター遺伝子の発現を測定し、試験物質依存的な前記発現の変化を分析す る工程
を含む、請求項 1に記載の方法。
[6] 分析する工程が、
i)細胞に試験物質を接触させる工程、及び
ii)マイトジェン活性ィ匕プロテインキナーゼのリン酸ィ匕を測定し、試験物質依存的な前 記リン酸化の変化を分析する工程
を含む、請求項 1に記載の方法。
[7] 分析する工程が、
i)細胞に、試験物質及びアンジォポェチン関連増殖因子を接触させる工程、及び ii)アンジォポェチン関連増殖因子の細胞への結合量を測定し、試験物質依存的な 前記結合量の変化を分析する工程
を含む、請求項 1に記載の方法。
[8] 試験物質が、アンジォポェチン関連増殖因子の発現及び Z又は機能を亢進する か否カゝを分析する工程、及び
前記工程で選択した試験物質の、体重変動、血糖値、及び Z又は血中脂質含量に 与える作用を分析する工程
を含む、アンジォポェチン関連増殖因子の発現亢進剤及び Z又は機能亢進剤をス クリーニングする方法。
[9] アンジォポェチン関連増殖因子の発現及び Z又は機能を亢進するか否力を分析 する工程が、
i)細胞に試験物質を接触させる工程、及び
ii)前記細胞における内在性のアンジォポェチン関連増殖因子のタンパク質量又は 遺伝子量を測定し、試験物質依存的な内在性のアンジォポェチン関連増殖因子の タンパク質量又は遺伝子量の変化を分析する工程
を含む、請求項 8に記載の方法。
[10] アンジォポェチン関連増殖因子のタンパク質量又は遺伝子量の測定力 アンジォ ポェチン関連増殖因子のタンパク質量の測定である、請求項 9に記載の方法。
[11] アンジォポェチン関連増殖因子のタンパク質量又は遺伝子量の測定力 アンジォ ポェチン関連増殖因子の遺伝子量の測定である、請求項 9に記載の方法。
[12] アンジォポェチン関連増殖因子の発現及び Z又は機能を亢進するか否力を分析 する工程が、
i)配列番号 1で表される塩基配列における第 672番〜第 5572番の塩基力もなる配 列において、 1〜10個の塩基が欠失、置換、及び Z若しくは挿入された配列を含み 、且つアンジォポェチン関連増殖因子のプロモーター活性を有する DNA、又は配 列番号 1で表される塩基配列における第 672番〜第 5572番の塩基力もなる配列と の同一性が 90%以上である塩基配列を含み、且つアンジォポェチン関連増殖因子 のプロモーター活性を有する DNAの下流にレポーター遺伝子が融合されたべクタ 一により形質転換された細胞に、試験物質を接触させる工程、及び
ii)レポーター遺伝子の発現を測定し、試験物質依存的な前記発現の変化を分析す る工程
を含む、請求項 8に記載の方法。
[13] アンジォポェチン関連増殖因子の発現及び Z又は機能を亢進するか否力を分析 する工程が、
i)細胞に試験物質を接触させる工程、
ii)マイトジェン活性ィ匕プロテインキナーゼのリン酸ィ匕を測定し、試験物質依存的な前 記リン酸化の変化を分析する工程
を含む、請求項 8に記載の方法。
[14] アンジォポェチン関連増殖因子の発現及び Z又は機能を亢進するか否力を分析 する工程が、
i)細胞に、試験物質及びアンジォポェチン関連増殖因子を接触させる工程、及び ii)アンジォポェチン関連増殖因子の細胞への結合量を測定し、試験物質依存的な 前記結合量の変化を分析する工程
を含む、請求項 8に記載の方法。
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