WO2006054625A1 - 癌細胞特異的細胞増殖抑制剤 - Google Patents

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WO2006054625A1
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Motoki Takagi
Akira Shimamoto
Yasuhiro Furuichi
Ayumi Sato
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Genecare Research Institute Co., Ltd.
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    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering N.A.

Definitions

  • the present invention relates to a cell growth inhibitor containing a compound that suppresses the expression of the RecQl gene, particularly an siRNA having an effect of suppressing the expression of the gene.
  • RecQ DNA helicase family genes are widely distributed from prokaryotes such as Escherichia coli to higher eukaryotes including humans, and are conserved during evolution and diversified with multicellularization.
  • the RecQ gene in E. coli is the first discovery of the RecQ family gene, identified as a gene that works in conjugative recombination and UV injury repair RecF pathways (see Non-Patent Document 1), and has the function of suppressing erroneous recombination. It is shown (see Non-Patent Document 2).
  • the SGS1 gene in budding yeast and the Rqhl gene in fission yeast are known as the only RecQ homologues, both of which play a major role in stabilizing the genome, mainly acting as a repressive agent (See Non-Patent Documents 3 and 4).
  • RecQ homologues there are multiple RecQ homologs in higher eukaryotes, and in humans the RTS gene (see Non-Patent Document 5, Patent Documents 1 and 2) identified by the present inventors and RecQL5 gene (Non-Patent Document 5, Patent Document).
  • RecQ family genes including RecQLl (see Non-Patent Document 6), BLM, WRN, RTS, and RecQL5 genes are known.
  • the BLM, WRN, and RTS genes are genes responsible for Bloom syndrome (see Non-patent document 7), Werner syndrome (see Non-patent document 8), and Rosmond-Thomson syndrome (see Non-patent document 9), respectively. These all play an important role in the genomic stability of cells.
  • Non-patent Document 10 Chromosome breaks and sister chromatid exchanges (SCE) are frequently seen in cells derived from patients with Bloom syndrome (see Non-Patent Document 11).
  • SCE sister chromatid exchanges
  • trisomies of chromosome 2 and chromosome 8 are frequently observed in lymphocytes derived from patients in the Rossmond-Thomson syndrome group (see Non-Patent Document 12).
  • telomere length is observed compared to a cell line derived from a healthy person (see Non-Patent Document 13).
  • the lymphocyte cell line derived from a healthy person was continuously subcultured, it was immortalized at a rate of about 15%, whereas the cell line derived from a patient with Werner's syndrome was not able to be immortalized.
  • WRN helicase plays a role in maintaining the structure of telomeres and is essential for the immortalization (carcinogenesis) of lymphoid cell lines.
  • WRN helicase forms a focus in the nucleus in response to a DNA damaging agent, and is one of the WRN-binding proteins, RPA that is a single-stranded DNA-binding protein, and the focus of recombinant repair factor RAD51. It is suggested that it is involved in the repair reaction through homologous recombination because of the coincidence of localization (see Non-Patent Document 15). WRN helicase is also known to bind to DNA-dependent protein kinase complex (DNA-PK) and flap endonuclease l (FEN-l).
  • DNA-PK DNA-dependent protein kinase complex
  • FEN-l flap endonuclease l
  • WRN helicase plays an important role in the processing of DNA double-strand break ends in non-homologous end-joining repair pathways by binding to DNA-PK (see Non-Patent Document 16).
  • WRN helicase binds to FEN-1 and becomes active, and is thought to provide a place to accurately reconstruct a replicating fork by homologous recombination while processing the Okazaki fragment. (See Non-Patent Document 17).
  • BLM helicase is localized in a specific structure PML body found in the nucleus and binds to topoisomerase III (see Non-Patent Document 18). It is also thought to work to maintain telomeres, and has the activity to unwind the G-quadruplex structure (see Non-Patent Document 19). It has also been reported that Holliday juction is unwound and interacts with Rad51 protein (see Non-Patent Document 20). These findings suggest that BLM helicase also works in concert with other DNA metabolizing enzymes and plays an important role in DNA recombination repair and telomere maintenance.
  • RecQl, BLM, WRN, RTS, and RecQ5 are hardly expressed in cells in the resting phase. It is highly expressed in a cell line that has been transformed with a normal virus and promoted to grow (see Non-Patent Document 21).
  • TPA which is a carcinogenic promoter
  • expression of RecQl, BLM, WRN, and RTS is induced with the induction of cell division (see Non-Patent Document 21).
  • RecQ DNA helicase family 1 repairs the cell's genome (BLM, WRN, RTS), while also involved in maintaining the structure of telomeres (BLM, WRN), and certain cells It plays an important role in the immortalization of tumors (WRN), and its expression is induced by cell division (RecQl, BLM, WRN, RTS). .
  • Patent Document 1 Japanese Patent Application No. 9-200387
  • Patent Document 2 Japanese Patent Application No. 11-11218
  • Patent Document 3 Japanese Patent Application No. 10-81492 (Japanese Patent Laid-Open No. 11-276173)
  • Non-patent literature 1 Nakayama H, Nakayama K, Nakayama R, Inno N, Nakayama Y, Hana wait PC, ⁇ Isolation and genetic characterization of a thymineless death-resistant mutant of Escherichia coli K12: identification of a new mutation (recQl) ⁇ That block the RecF recombination pathway. '', Mol Gen Genet., 1984, Vol.
  • Non-Patent Document 2 Hanada K, Ukita T, Kohno Y, Saito K, Kato J, Ikeda H, ⁇ RecQ DN
  • a helicase is a suppressor of illegitimate recombination in Escherichia coli. '', Proc N atl Acad Sci US A., 1997, Vol. 94, p. 3860-3865
  • Non-Patent Document 3 Myung K, Datta A, Chen C, Kolodner RD, “SGS1, the Saccharomy ces cerevisiae homologue of BLM and WRN, suppresses genome instability and hom eologous recombination.” Nat Genet., 2001, Vol. 27 , p.113-116
  • Non-Patent Document 4 Doe CL, Dixon J, Osman F, Whitby MC, ⁇ Partial suppression of the e fission yeast rqhl (-) phenotype by expression of a bacterial Holliday junction resol vase. '', EMBO J. ⁇ 2000, Vol.19, p.2751-2762
  • Non-Patent Document 5 Kitao S, Ohsugi I, Ichikawa K, Goto M, Furuichi Y, Shimamoto A, ⁇ Loning of two new human helicase genes of the RecQ family: biological significance of multiple species in higher eukaryotes.J, Genomics 1998, Vol.54, p.443-452
  • Non-patent literature b SeKi, M., Miyazawa, H., Tada, S., Yanagisawa, J., Yamaoka, T., Hosh ino, S., Ozawa, K., Eki, T., Nogami, M.
  • Non-Patent Document 7 Ellis NA, Groden J, Ye TZ, Straughen J, Lennon DJ, Ciocci S, Proytc heva M, German J, ⁇
  • the Bloom s syndrome gene product is homologous to RecQ helicases-'', Cell, 1995 , Vol.83, p.655-666
  • Non-Patent Document 8 Yu CE, Oshima J, Fu YH, Wijsman EM, Hisama F, Alisch R, Matthew s S, Nakura J, Miki T, Ouais S, Martin GM, Mulligan J, Schellenberg GD, ⁇ Positio nal cloning of the Werner's syndrome gene. '', Science, 1996, Vol.272, p.258-26 2
  • Non-Patent Document 9 Kitao S, Shimamoto A, Goto M, Miller RW, Smithson WA, Lindor NM, Furuichi Y, ⁇ Mutations in RECQL4 cause a subset of cases of Rothmund- Thom son syndrome.J, Nat Genet., 1999 Year, Vol.22, p.82—84
  • Non-Patent Document 10 Goto M, "Hierarchical deterioration of body systems in Werner's syndrome: implications for normal ageing.”, Mech.Aging Dev., 1997, Vol.98, p.239-254
  • Non-Patent Document 11 Ellis NA, German J, "Molecular genetics of Bloom's syndrome.”, Hum Mol Genet., 1996, Vol. 5, p.1457-1463
  • Non-Patent Document 12 Lindor NM, Devries EM, Michels W, Schad CR, Jalal SM, Donovan KM, Smithson WA, Kvols LK, Thibodeau SN, Dewald GW, Rothmund-Thomson syndrome in siblings: evidence for acquired in vivo mosaicism. '', Clin Genet., 1996, Vol. 49, p.124-129
  • Non-Patent Document 13 Tahara H, Tokutake Y, Maeda S, Kataoka H, Watanabe T, Satoh M, Matsumoto T, Sugawara M, Ide T, Goto M, Furuichi Y, Sugimoto M, ⁇ Abnormal telomere dynamics of B- lymphoblastoid cell strains from Werner's syndrome patient s transformed by Epstein— Barr virus. ”, Oncogene, 1997 Cattle, Vol. 15, p.
  • Non-Patent Document 14 Sugimoto M, Furuicni, Ide T, Goto M,“ Incorrect us of "immort alization for B— lymphoblastoid cell lines transformed by Epstein— Barr virus.”, Virol., 1999, Vol. 73, p.9690-9691
  • Non-Patent Document 15 Sakamoto S, Nishikawa K, Heo SJ, Goto M, Furuichi Y, Shimamoto A, ⁇ Werner neiicase relocates into nuclear foci in response to DNA damaging age nts and co-localizes with RPA and Rad51. '', Genes Cells. ⁇ 2001, Vol.6, p.421-4 30
  • Non-Patent Document 16 Yannone SM, Roy S, Chan DW, Murphy MB, Huang S, Campisi J, Chen DJ, "Werner syndrome protein is regulated and phosphorylated by DNA-dependent protein kinase.”, J Biol Chem. ⁇ 2001, Vol.276, p.38242-38248
  • Non-Patent Document 17 Brosh RM Jr, von Kobbe C, Sommers JA, Karmakar P, Opresko PL, Piotrowski J, Dianova I, Dianov GL, Bohr VA, ⁇ Werner syndrome protein interac ts with human flap endonuclease 1 and stimulates its cleavage activity. ", EMBO J. ⁇ 2001, Vol. 20, p.5791-5801
  • Non-Patent Document 18 Johnson FB, Lombard DB, Neff NF, Mastrangelo MA, Dewolf W, Ellis NA, Marciniak RA, Yin Y, Jaenisch R, Guarente L, [Association of the Bloom s yndrome protein with topoisomerase Illalpha in somatic and meiotic cells. '', Cancer Res., 2000, Vol. 60, p.1162-1167
  • Non-Patent Document 19 Mohaghegh P, Karow JK, Brosh Jr RM Jr, Bohr VA, Hickson ID, ⁇
  • the Bloom's and Werner's syndrome proteins are DNA structure-specific helicases .J, Nucleic Acids Res., 2001, Vol. 29 , p.2843— 2849
  • Non-Patent Document 20 Wu L, Davies SL, Levitt NC, Hickson ID, “Potential role for the BLM helicase in recombinational repair via a conserved interaction with RAD51.J, J Biol Chem., 2001, Vol. 276, p. 19375-19381
  • Non-Patent Document 21 Kawabe, T., Tsuyama, N., Kitao, S., Nishikawa, K., Shimamoto, A., Shiratori, M., Matsumoto, T., Anno, K., Sato, T., Mitsui, Y., Seki, M., Enomoto, T., Goto, M., Ellis, NA, Ide, T., Furuicni, Y., and Sugimoto, M., ⁇ Differential regulation of human RecQ family helicases in cell transformation and cell cycle. '', Oncog ene. ⁇ 2000, Vol. 19, No. 41, p.4764-4772.
  • the present invention has been made in view of such circumstances, and an object of the present invention is to provide a cancer cell-specific cell growth inhibitor that targets suppression of RecQl helicase gene expression. Means for solving the problem
  • RecQ DNA helicase family genes are known to be upregulated in tumor cell lines (eg cancer cells).
  • the present inventors examined the effect of suppression of RecQl gene expression on cancer cell proliferation, using siRNA having an inhibitory effect on the RecQl gene belonging to the human RecQ helicase family gene. As a result, the present inventors observed that the suppression of Rec Q1 gene expression resulted in the suppression of cell proliferation in cancer cells, but these effects were normal cells of human TIG3 cells (normal doubling).
  • the present inventors have found for the first time that a cell growth-inhibiting action specific to cancer cells can be seen by suppressing the expression of the RecQl gene. Therefore, the RecQl gene is considered to be a target molecule for an anticancer drug with very good side effects.
  • the present inventors have succeeded in finding an siRNA molecule having a cell growth inhibitory effect specifically for cancer cells. A drug containing the molecule is expected to be an effective drug with few side effects in cancer treatment.
  • siRNA molecules for the RecQl gene of the present application do not act on normal cells. It can be said that it is very difficult to predict this in advance. That is, the siRNA molecule provided by the present invention has an advantageous effect (a cell growth-inhibiting effect specific to cancer cells that does not act on normal cells) that cannot be predicted even by those skilled in the art.
  • the present invention relates to a cancer cell-specific cell growth inhibitor targeting the expression of RecQl helicase gene, and particularly to a cancer cell-specific cell growth inhibitor containing siRNA having an effect of suppressing RecQl gene expression. More specifically,
  • RNA capable of suppressing the expression of the RecQl gene by the RNAi effect the RNA having the nucleotide sequence ability according to SEQ ID NO: 1-32 or SEQ ID NO: 40-43, and the RNA Double-stranded RNA containing a structure that is hybridized with a complementary sequence of RNA.
  • the double-stranded RNA according to [1] which has a structure in which one or more DNAs or RNAs are overhanged at the ends.
  • SEQ ID NO: 1 to 32 or SEQ ID NO: 40 to 43 A DNA vector that can express strong RNA.
  • a cancer cell-specific cell growth inhibitor comprising the RNA according to [1] or [2] or the DNA according to [3].
  • An anticancer agent comprising the cancer cell-specific cell growth inhibitor according to [4] as an active ingredient is provided.
  • the cancer cell preferably refers to a human cancer cell (human-derived cancer cell).
  • a cancer cell-specific cell comprising a step of administering the RNA according to [1] or [2] or the DNA according to [3] to an individual (subject, subject, patient, etc.) To suppress the growth of cancer (method of cancer treatment),
  • FIG. 1 is a diagram showing the base sequence of siRNA for the RecQl gene used in the examples. All sequences are RNA and the overhang sequence of all siRNAs is the TT of deoxynucleotide.
  • FIG. 2 is a graph showing the expression level of RecQl gene in HeLa cells into which siRNA for RecQl gene has been introduced.
  • FIG. 3 is a graph showing the survival rate after 96 hours in HeLa cells into which siRNA for the RecQl gene has been introduced.
  • FIG. 4 is a graph showing the results of quantification of mRNA expression 48 hours later by semi-quantitative RT-PCR after introducing siRNA for RecQl gene into TIG3 cells.
  • NS is a control siRNA.
  • 15 and 24 are the siRNA sequence numbers shown in FIG. Gene expression when non-silencing siRNA was introduced was defined as 100%.
  • FIG. 5 is a graph showing the survival rate after 96 hours in TIG3 cells introduced with siRNA against the RecQl gene.
  • NS is a control siRNA.
  • 15 and 24 are the SEQ ID NOs of the siRNA shown in FIG. When the number of cells when non-silencing siRNA is introduced is 100% Represents the number of cells.
  • FIG. 6 is a graph showing the results of evaluating the efficacy of siRNA against RecQl gene.
  • NT refers to untreated tumor-bearing mice.
  • the present inventors have found that by suppressing the expression of the RecQl gene belonging to the RecQ DNA helicase family gene, cell proliferation is specifically suppressed by cancer cells (tumor cells).
  • cancer cells tumor cells
  • the present inventors have found an RNA molecule that effectively suppresses cell growth in a cancer cell-specific manner by suppressing RecQl gene expression by the RNAi effect.
  • the present invention first provides RNA (siRNA, shRNA) capable of suppressing RecQl gene expression by the RNAi effect.
  • the RNA has a cancer cell-specific cell growth inhibitory action.
  • cancer cell-specific means that it acts on cancer cells, but does not substantially act on normal cells (does not show an effective effect). The case where the action on normal cells is significantly lower than the action on cancer cells is also included in the “cancer cell characteristic” in the present invention.
  • RecQl gene NM—002907 (SEQ ID NO: 33), NM—032941 (SEQ ID NO: 34), BC00105 2 (SEQ ID NO: 35), D37984 (SEQ ID NO: 36), L36140 (SEQ ID NO: 37)
  • amino acid sequence of the protein encoded by the RecQl gene of the present invention is shown in SEQ ID NO: 38.
  • the RecQl gene of the present invention is not particularly limited, but is usually derived from animals, more preferably derived from mammals, and most preferably derived from humans.
  • RNA that can suppress the expression of the RecQl gene of the present invention by the RNAi (RNA interferance) effect (sometimes simply referred to as "siRNA of the present invention” in the present specification) is more specific.
  • Can include RNA containing the base sequence set forth in any of SEQ ID NOs: 1-32.
  • SEQ ID NOs: 1-32 of! Examples thereof include double-stranded RNA (siRNA) having one strand of RNA having the base sequence described in any one of them.
  • the present invention is an RNA (siRNA) capable of suppressing the expression of the RecQl gene by the RNAi effect, comprising an RNA comprising the base sequence set forth in any of SEQ ID NOs: 1-32 and complementary to the RNA Provided is a double-stranded RNA comprising a structure hybridized with an RNA having a different sequence.
  • siRNA siRNA
  • siRNA of the present invention comprising the base sequence (5′-cuacggcuuuggagauaua-3 ′) described in SEQ ID NO: 1 can be exemplified by RNA molecules having the following structure.
  • RNA molecules having one end closed in the above RNA molecule for example, siRNA (shRNA) having a hairpin structure is also included in the present invention. That is, a molecule capable of forming a double-stranded RNA structure in the molecule is also included in the present invention.
  • shRNA siRNA
  • (xxxx) n” represents a polynucleotide having an arbitrary base and sequence power.
  • RNA capable of suppressing RecQl gene expression by the RNAi effect, wherein any of SEQ ID NOs: 1-32
  • a double-stranded RNA having a structural ability obtained by hybridizing an RNA comprising the base sequence described in the above and an RNA comprising a sequence complementary to the RNA can be suitably shown.
  • a double-stranded RNA having a structure in which one or a plurality of RNAs are added or deleted at the end of the double-stranded RNA is also included in the present invention.
  • the RNA forming the double strand preferably has homology with a partial sequence of the RecQl gene.
  • the length of RNA in the region forming a double strand is usually 15 to 30 bp, preferably about 15 to 27 bp, more preferably 19 to 21 bp. Length, most preferably a force that is the length of 19 bp (for example, siRNA having one strand of the RNA described in SEQ ID NO: 1-32) Not limited to these lengths.
  • RNA ribonucleotides
  • one or more ribonucleotides constituting siRNA may be a corresponding deoxyribonucleotide.
  • This “corresponding” refers to the same base species (adenine, guanine, cytosine, thymine (uracil)) although the structures of the sugar moieties are different.
  • a deoxyribonucleotide corresponding to a ribonucleotide having adenine refers to a deoxyribonucleotide having adenine.
  • the “plurality” is not particularly limited, but preferably refers to a small number of about 2 to 5
  • RNAi refers to the introduction of a double-stranded RNA into a cell, which is a sense RNA that has a sequence power that is homologous to the mRNA sequence of the target gene, and an antisense RNA that also has a complementary sequence power.
  • a force called DICER comes into contact with double-stranded RNA and a small double-stranded RNA force called mall interfering RNA or siRNA. It is thought to be broken down into fragments.
  • the double-stranded RNA having an RNAi effect in the present invention preferably refers to this siRNA.
  • RNA capable of suppressing the expression of the RecQl gene by the RNAi effect which is an RNA having a nucleotide sequence ability set forth in any one of SEQ ID NOS: 1-32, It is a double-stranded RNA having a hybridized structure with an RNA having a typical sequence.
  • DNA capable of expressing the siRNA (double-stranded RNA) of the present invention is also included in the present invention. That is, the present invention provides a DNA (vector) capable of expressing the double-stranded RNA of the present invention.
  • the DNA (vector) capable of expressing the double-stranded RNA of the present invention is usually a DNA that encodes one strand of the double-stranded RNA and a DNA force that encodes the other strand of the double-stranded RNA.
  • Each DNA has a structure linked to a promoter so that each can be expressed.
  • the above-mentioned DNA of the present invention can be easily prepared by those skilled in the art using general genetic engineering techniques. More specifically, various known expression of DNA encoding the RNA of the present invention
  • the expression vector of the present invention can be prepared by appropriately inserting it into the vector.
  • double-stranded RNA having an RNAi effect is a sense RNA whose expression is suppressed, consisting of a sequence homologous to a continuous RNA region in the mRNA of the target gene, and complementary to the sense RNA It is a double-stranded RNA that also has antisense RNA power consisting of a sequence.
  • the double-stranded RNA of the present invention preferably has an overhang of several bases at the end. .
  • the length and sequence of the base that forms this overhang are not particularly limited.
  • the overhang may be either DNA or RNA.
  • a 2-base overhang can be exemplified.
  • TT two thymines
  • UU three uracils
  • double-stranded RNA having an overhang of other bases most preferably 19-base double-stranded RNA and two bases (TT)
  • Molecules having an overhang of 2 can be preferably used.
  • the double-stranded RNA of the present invention includes a molecule having a basic strength NA that forms an overhang in this way.
  • the siRNA molecule of the present invention is TT, the siRNA molecule of the present invention is
  • a molecule such as 3′-TTgaugccgaaaccucuauau-3 ⁇ 4 (ai ⁇ ⁇ number: 3 9 + TT) (a molecule having TT added to the 3 ′ side) can be exemplified.
  • the above-mentioned "double-stranded RNA having an RNAi effect on the RecQl gene" of the present invention can be appropriately prepared by those skilled in the art based on the base sequence disclosed in the present specification.
  • the double-stranded RNA of the present invention can be prepared based on the base sequence described in any one of SEQ ID NOs: 1-32. If one strand (for example, the base sequence described in any one of SEQ ID NOs: 1 to 32) is found, the base sequence of the other strand is easily known to those skilled in the art. Can know.
  • the siRNA of the present invention can be appropriately prepared by those skilled in the art using a commercially available nucleic acid synthesizer. In addition, for synthesis of a desired RNA, it is possible to use a general synthesis contract service.
  • the siRNA of the present invention (for example, the nucleotide sequence described in any one of SEQ ID NOs: 1 to 32 is The double-stranded RNA molecule that is a chain of) has a cancer cell-specific cell growth inhibitory action, and therefore the present invention is a cancer cell-specific cell growth inhibitor containing the siRNA of the present invention as an active ingredient. I will provide a.
  • the siRNA of the present invention when the cell growth inhibitory action in cancer cells is caused by induction of apoptosis, the siRNA of the present invention is expected to be a cancer cell-specific apoptosis inducer.
  • Apoptosis generally refers to cell death caused by cells themselves under physiological conditions. Examples of the form of apoptosis include chromosomal aggregation of cell nuclei, fragmentation of cell nuclei, disappearance of cell surface microvilli, and cytoplasmic aggregation. Accordingly, the apoptosis-inducing action in the present invention refers to, for example, the action of inducing the above-mentioned apoptotic form in cells, but is not necessarily limited to only inducing the above-mentioned form. A person skilled in the art can appropriately determine whether or not cell apoptosis has occurred.
  • the cancer cell-specific apoptosis inducer of the present invention is expected to be, for example, an anticancer agent (anticancer agent) having a mechanism of apoptosis induction.
  • the present invention also provides an anticancer agent (pharmaceutical composition for cancer treatment) containing the cancer cell-specific cell growth inhibitor of the present invention as an active ingredient.
  • the agent of the present invention can be provided in a state of being mixed with a pharmaceutically acceptable carrier.
  • pharmaceutically acceptable carriers include surfactants, excipients, coloring agents, flavoring agents, preservatives, stabilizers, buffering agents, suspending agents, isotonic agents, binders, disintegrating agents, lubricants.
  • the above-mentioned carrier can be added if necessary. Specifically, light anhydrous carboxylic acid, lactose, crystalline cellulose, mannitol, starch, carmellose calcium, carmellose sodium, hydroxypropylcellulose, hydroxypropylmethylcellulose, polyvinylacetal jetylaminoacetate, polybulu Pyrrolidone, gelatin, medium chain fatty acid tridalylide, polyoxyethylene hydrogenated castor oil 60, sucrose, carboxymethylcellulose, corn starch, inorganic salt And the like.
  • Examples of the dosage form of the drug include tablets, powders, pills, powders, granules, fine granules, soft and hard capsules, film coating agents, pellets, sublingual agents, Examples include parenteral preparations such as injections, suppositories, transdermal preparations, ointments, plasters, liquids for external use, etc., and those skilled in the art will find the optimal dosage form according to the route of administration and the subject of administration. You can select.
  • a viral vector such as a retrovirus, adenovirus, or Sendai virus
  • a non-viral vector such as a liposome
  • non-viral vectors such as ribosomes, polymer micelles, and cationic carriers can be used. Examples of administration methods include in vivo methods and ex vivo methods.
  • the present invention also includes the above-described pharmaceutical composition having a cancer cell-specific cell growth inhibitory action.
  • the dosage of the drug or pharmaceutical composition of the present invention can be appropriately determined finally by the judgment of a doctor in consideration of the type of dosage form, administration method, patient age and weight, patient symptom, and the like. .
  • the type of cancer expected to have a cell growth inhibitory effect is not particularly limited.
  • examples include cancer, fetal cancer, bladder cancer, chronic myelogenous leukemia, acute lymphoblastic leukemia, glioblastoma, liver cancer, glioblastoma, melanoma, kidney cancer, knee cancer, gastric cancer, prostate cancer, etc. can do.
  • the present invention also relates to cancer cell-specific cell proliferation, comprising the step of administering the RNA or DNA of the present invention or the agent of the present invention to an individual (eg, a patient) or a cell tissue (cancer cell tissue, etc.).
  • the present invention relates to a method for suppressing cancer and a method for suppressing cancer specifically for cancer cells (cancer cell-specific cancer treatment method).
  • the individual in the method of the present invention is preferably a human, but is not particularly limited, and may be a non-human animal.
  • administration to an individual is, for example, intraarterial injection, intravenous injection, subcutaneous injection, etc. This can be done by methods known to those skilled in the art.
  • the dosage varies depending on the weight and age of the subject (patient etc.), the administration method, etc., but those skilled in the art can appropriately select an appropriate dosage.
  • the present invention relates to the use of the RNA or DNA of the present invention or the agent of the present invention in the production of a cancer cell-specific cytostatic or anticancer agent.
  • HeLa cells human eclampsia cancer cells
  • TIG3 cells normal diploid fibroblasts
  • HeLa cells and TIG3 cells using Dulbecco's modified Eagle's medium containing 10% fetal bovine serum and 50 g / ml gentamicin,
  • the cells were cultured at 37 ° C. under 5% CO.
  • siRNAs for the RecQl gene were obtained by the method of Elbasher et al. (Elbasher, MS et al. Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian eel Is. Nature 411, 494-498 (2001).) And Reynolds (Reynolds A. et al., Rational siRNA design for RNA interference. Nat Biotechnol. 3, 326-30. (2004)). Each siRNA sequence is shown in FIG. siRNA was synthesized at Qiagen.
  • RecQl genes, primers for RT-PCR of ⁇ -,- ⁇ tin genes, and TaqMan probes were purchased from Applied Biosystems. RT-PCR reaction was performed using QuantiTect Probe RT-PCR Kit (Qiagen) according to the manual. RecQl mRNA expression was quantitatively compared using j8-actin as a standard. The expression level of RecQl gene mRNA in cells into which control siRNA that does not affect RecQl gene expression was 100% was compared, and the expression of RecQl mRNA in cells into which each siRNA had been introduced was compared.
  • HeLa cells which are human cervical cancer cells
  • siRNA-treated groups over 70% of the gene expression suppression effect was observed for all siRNAs (Fig. 2).
  • Fig. 3 when the number of living HeLa cells after 96 hours was compared with the NS-siRNA-treated group, growth inhibition of 30% or more was observed in all siRNA-treated groups (Fig. 3).
  • RecQl-siRNA strongly inhibits cancer cell growth and normal cell growth. Has been shown to have little effect.
  • siRNA and 27 mer dsRNA sequences used for animal studies are shown below.
  • SiRNA deoxynucleotides 27mer dsRNA sequence for RecQ1 used in animal experiments
  • dsRNA sequences are RNA and have no overhangs.
  • mice Male BALBZcA nude mice were also purchased from CLEA Japan, Inc. A549 cells (5 ⁇ 10 6 ZO.lml) were implanted subcutaneously on the back of nude mice (7 weeks old). Administration of siRNA was started on day 8 after tumor cell transplantation.
  • 22 ⁇ g siRNA having a phosphorylated 5 ′ end was mixed with 5 ⁇ g of polyethyleneimine (molecular weight 10,000, Wako) in 50 ⁇ 1 physiological saline. This mixture is applied to the top of the solid tumor every 3 days, 6 times (8, 11, 14 , 17, 20, and 23). Tumor volume was measured with calipers.
  • the formula for calculating the tumor volume was L XW 2 Z2. Where L is the major axis of the tumor and W is the minor axis. Statistical significance of tumor volume was analyzed by using t-test.
  • RecQl-siRNAs have the ability to inhibit tumor growth NS-siRNA mixed with polyethyleneimine (siRN A, which does not affect gene expression in humans and mice) has no effect on tumors. Volume increased ( Figure 6). Mice treated with a mixture of RecQl-siRNA and polyethyleneimine showed no weight loss compared to non-cancer-bearing mice, indicating that there were no significant side effects of this treatment.
  • the drug of the present invention can be said to be a very practical and highly effective drug in that the cell growth inhibitory action is specific to cancer cells.

Abstract

　RecQヘリカーゼファミリー遺伝子であるRecQ1の遺伝子の発現を抑制することにより、癌細胞において細胞増殖の抑制効果が観察されるものの、これらの効果は正常細胞であるヒトTIG3細胞（正常二倍体線維芽細胞株）では認められないことを見出した。即ち、本発明者らは、RecQ1遺伝子に対するsiRNAが、当該遺伝子の発現抑制を介して癌細胞特異的な細胞増殖抑制作用を持つことを見出した。

Description

明 細 書
癌細胞特異的細胞増殖抑制剤
技術分野
[0001] 本発明は、 RecQl遺伝子の発現を抑制する化合物、特に該遺伝子の発現抑制効 果を有する siRNAを含有する、細胞増殖抑制剤に関する。
背景技術
[0002] RecQ DNAヘリカーゼファミリー遺伝子は大腸菌のような原核生物から、ヒトを含む 高等真核生物にまで広く存在し、進化の過程で保存され多細胞化にともなって多様 化した遺伝子である。大腸菌における RecQ遺伝子が RecQファミリー遺伝子の最初の 発見であり、接合組換え、 UV傷害修復 RecF経路ではたらく遺伝子として同定され（ 非特許文献 1参照）、誤った組換えを抑制する機能をもつことが示されて ヽる (非特許 文献 2参照)。出芽酵母では SGS1遺伝子が、分裂酵母では Rqhl遺伝子がそれぞれ 唯一の RecQホモログとして知られ、何れも組換えに対して主に抑制的に作用し、ゲノ ムの安定化に重要な役割を果たしている (非特許文献 3および 4参照)。一方高等真 核生物では複数の RecQホモログが存在し、ヒトでは本発明者らが同定した RTS遺伝 子 (非特許文献 5、特許文献 1および 2参照）と RecQL5遺伝子 (非特許文献 5、特許文 献 3参照）を含め 5つの RecQファミリー遺伝子、 RecQLl (非特許文献 6参照）、 BLM、 WRN、 RTS、そして RecQL5遺伝子が知られている。これらのうち BLM、 WRN、そして R TS遺伝子はそれぞれブルーム症候群 (非特許文献 7参照）、ウェルナー症候群 (非 特許文献 8参照）、ロスモンド-トムソン症候群 (非特許文献 9参照)の原因遺伝子であ り、これらは何れも細胞のゲノム安定性に重要な働きをして 、る。
[0003] ウェルナー症候群の患者由来の線維芽細胞やリンパ球系細胞株では、ゲノム不安 定性を示す染色体の転座や欠失が高頻度で起こることが報告されて ヽる (非特許文 献 10参照)。ブルーム症候群の患者由来の細胞では、染色体の切断や姉妹染色分 体交換（SCE)が高頻度に見られる (非特許文献 11参照)。またロスモンド-トムソン症 候群の患者由来のリンパ球においては 2番染色体や 8番染色体のトリソミーが高頻度 で認められる（非特許文献 12参照)。これらの事実は、これら 3つの遺伝病の原因遺 伝子がそれぞれコードする WRNヘリカーゼ、 BLMヘリカーゼ、そして RTSヘリカーゼ が細胞のゲノム安定ィ匕に重要な役割を果たしていることを示す。
[0004] ウェルナー症候群の患者由来のリンパ球系細胞株では、健常人由来の細胞株と比 較してテロメァ長の異常が認められる（非特許文献 13参照)。また健常人由来のリン パ球系細胞株を継代し続けると、 15%程度の割合で不死化するのに対し、ウェルナー 症候群の患者由来の細胞株では細胞の不死化が認められな力つた (非特許文献 14 参照）。これらの事実は WRNヘリカーゼがテロメァの構造維持に働き、リンパ球系細 胞株の不死化 (癌化）に必須であることを示す。
[0005] WRNヘリカーゼは DNA傷害剤に応答して核内でフォーカスを形成し、 WRN結合タ ンパク質の一つで一本鎖 DNA結合タンパク質である RPA、および組換え修復因子 RA D51のフォーカスと局在が一致することから、相同組換えを介した修復反応に関与す ることが示唆されている（非特許文献 15参照)。また WRNヘリカーゼは DNA依存性タ ンパクキナーゼ複合体 (DNA-PK)およびフラップエンドヌクレアーゼ l(FEN-l)と結合 することが知られている。 WRNヘリカーゼは DNA-PKと結合することにより非相同末端 結合修復経路において DNA二重鎖切断末端のプロセシングに重要な役割を果たす (非特許文献 16参照)。一方、 WRNヘリカーゼは FEN-1に結合して活性ィ匕し、ォカザ キフラグメント (Okazaki fragment)をプロセシングしながら、相同組換えによる複製フォ ークの再構築を正確に行う場を提供すると考えられている (非特許文献 17参照)。以 上の知見は、 WRNヘリカーゼが DNA複製期における DNA修復に重要な役割を果た すことを示唆する。
[0006] BLMヘリカーゼは核内に見られる特異的な構造体 PML bodyに局在し、トポイソメラ ーゼ IIIと結合する（非特許文献 18参照)。またテロメァ維持にも働くと考えられており、 G- quadruplex構造を巻き戻す活性をもつ（非特許文献 19参照）。また Holliday juction をほどき Rad51タンパク質と相互作用することが報告されている (非特許文献 20参照） 。これらの知見から BLMヘリカーゼも他の DNA代謝酵素と協調的に働き、 DNA組換 え修復やテロメァ維持に重要な役割を果たすと考えられる。
[0007] ヒトの 5つの RecQ DNAヘリカーゼファミリー、 RecQl、 BLM, WRN、 RTS、 RecQ5のう ち、制止期にある細胞では RecQ 1、 BLM, WRN、 RTSはほとんど発現しておらず、一 方ウィルスで形質転換し、増殖が促進された細胞株で高発現している（非特許文献 2 1参照)。また制止期の細胞に発癌のプロモーターである TPAを添加すると細胞分裂 の誘導にともなって RecQl、 BLM、 WRN、 RTSの発現が誘導される（非特許文献 21参 照）。これらの知見は RecQ DNAヘリカーゼファミリーの細胞増殖における重要性を示 唆している。
[0008] 以上を総合すると、 RecQ DNAヘリカーゼファミリ一は細胞のゲノムを修復し (BLM、 WRN、 RTS),一方テロメァの構造維持にも関与しており (BLM、 WRN)、またある種の 細胞の不死化に重要な役割を果たし (WRN)、さらに細胞分裂にともなって発現が誘 導される (RecQl、 BLM、 WRN、 RTS)こと力 、制癌の標的として有望な分子であると 考えられる。
[0009] し力しながら、癌細胞の増殖を抑制し得る化合物であっても、正常細胞に対して同 様に増殖抑制効果を有する場合、該化合物は有用な抗癌剤として期待できない。 Re cQl遺伝子の発現を抑制する化合物が正常細胞に対してどのように作用するのか、 あるいは、該化合物が癌細胞特異的に細胞増殖抑制効果を有する力否かについて は、これまでのところ全く知られていない。
特許文献 1：特願平 9-200387号
特許文献 2 :特願平 11-11218号
特許文献 3：特願平 10-81492号 (特開平 11-276173号）
非特干文献 1 : Nakayama H, Nakayama K, Nakayama R, Inno N, Nakayama Y, Hana wait PC著、「Isolation and genetic characterization of a thymineless death-resistant mutant of Escherichia coli K12: identification of a new mutation (recQl) that blocks the RecF recombination pathway.」、 Mol Gen Genet.、 1984年、 Vol.195, p.474 -概 非特許文献 2 : Hanada K, Ukita T, Kohno Y, Saito K, Kato J, Ikeda H著、「RecQ DN A helicase is a suppressor of illegitimate recombination in Escherichia coli.」、 Proc N atl Acad Sci U S A., 1997年、 Vol.94, p. 3860-3865
非特許文献 3 : Myung K, Datta A, Chen C, Kolodner RD著、「SGS1, the Saccharomy ces cerevisiae homologue of BLM and WRN, suppresses genome instability and hom eologous recombination.」 Nat Genet.、 2001年、 Vol.27, p.113 - 116 非特許文献 4 : Doe CL, Dixon J, Osman F, Whitby MC著、「Partial suppression of th e fission yeast rqhl(-) phenotype by expression of a bacterial Holliday junction resol vase.」、 EMBO J.ゝ 2000年、 Vol.19, p.2751-2762
非特許文献 5 : Kitao S, Ohsugi I, Ichikawa K, Goto M, Furuichi Y, Shimamoto A著、 「し loning of two new human helicase genes of the RecQ family: biological significance of multiple species in higher eukaryotes.J、 Genomics.、 1998年、 Vol.54、 p.443-452 非特許文献 b : SeKi, M., Miyazawa, H., Tada, S., Yanagisawa, J., Yamaoka, T., Hosh ino, S., Ozawa, K., Eki, T., Nogami, M.,, Okumura K.,ら著、「Molecular cloning of cDNA encoding human DNA helicase Ql which has homology to Escherichia coli Re c Q helicase and localization of the gene at chromosome 12pl2.」、 Nucleic Acids Res .、 1994年、 Vol.22, No.22、 p. 4566-4573
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非特許文献 17 : Brosh RM Jr, von Kobbe C, Sommers JA, Karmakar P, Opresko PL, Piotrowski J, Dianova I, Dianov GL, Bohr VA著、「Werner syndrome protein interac ts with human flap endonuclease 1 and stimulates its cleavage activity.」、 EMBO J.ゝ 2001年、 Vol. 20、 p.5791-5801
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非特許文献 19 : Mohaghegh P, Karow JK, Brosh Jr RM Jr, Bohr VA, Hickson ID著、 「The Bloom's and Werner's syndrome proteins are DNA structure-specific helicases .J , Nucleic Acids Res., 2001年、 Vol.29, p.2843— 2849
非特許文献 20 : Wu L, Davies SL, Levitt NC, Hickson ID著、「Potential role for the BLM helicase in recombinational repair via a conserved interaction with RAD51.J、 J Biol Chem.、 2001年、 Vol. 276、 p.19375- 19381
非特許文献 21 : Kawabe, T., Tsuyama, N., Kitao, S., Nishikawa, K., Shimamoto, A., Shiratori, M., Matsumoto, T., Anno, K., Sato, T., Mitsui, Y., Seki, M., Enomoto, T. , Goto, M., Ellis, N.A., Ide, T., Furuicni, Y., and Sugimoto, M.著、「Differential regu lation of human RecQ family helicases in cell transformation and cell cycle.」、 Oncog ene.ゝ 2000年、 Vol.19, No.41、 p.4764-4772.
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0010] 本発明はこのような状況に鑑みてなされたものであり、 RecQlヘリカーゼ遺伝子の 発現抑制をターゲットする癌細胞特異的な細胞増殖抑制剤の提供を課題とする。 課題を解決するための手段
[0011] 腫瘍細胞において RecQ DNAヘリカーゼファミリーの発現が著しく高いことが見出さ れ、 RecQ DNAヘリカーゼファミリー遺伝子の発現の抑制を指標とした、腫瘍の増殖 を抑制する化合物のスクリーニング方法が知られている。また、 RecQヘリカーゼ遺伝 子の発現を抑制する化合物は癌細胞の増殖を抑制する、という可能性が示唆されて V、る（特許文献「特開 2000-166600号」参照)。
し力しながら、 RecQl遺伝子の発現抑制と癌細胞特異的な細胞増殖抑制との関係 は、これまでのところ知られていなかった。
ある化合物について癌細胞増殖抑制作用を有することが分力つた場合であっても、 正常細胞に対する増殖抑制作用の有無が不明な化合物は、効果的な医薬品とはな らない。該化合物が正常細胞に対しても増殖抑制作用が見られる場合、副作用の危 険を伴うからである。実際にこれまでのところ、種々の抗癌剤が副作用を有することを 示す知見が報告されている (例えば、 Komarov P. G. et al.， Science Vol.285, 1733-1 737, 1999; Kamarova E. A. and Gudkov A. V. Biochemistry (Moscow) Vol.65, 41-4 8, 2000; Botchkarev V. A. Cancer Research Vol.60, 5002-5006, 2000)。細胞増殖抑 制作用が癌細胞特異的なものであり、正常細胞には作用しないような薬剤を開発す ることができれば、副作用の少ない非常に有用な抗癌剤となることが期待される。 [0012] 本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を行なった。 RecQ DNAヘリカーゼ ファミリー遺伝子は、腫瘍細胞系（例えば癌細胞など）において発現が上昇している ことが知られている。本発明者らは、ヒトの RecQヘリカーゼファミリー遺伝子に属する R ecQl遺伝子について、その発現抑制効果を有する siRNAを用いて、 RecQl遺伝子の 発現抑制が癌細胞の増殖に及ぼす影響を検討した。その結果、本発明者らは、 Rec Q1遺伝子の発現を抑制することにより、癌細胞において細胞増殖の抑制効果が観 察されるものの、これらの効果は正常細胞であるヒト TIG3細胞 (正常二倍体線維芽細 胞株)では認められないことを見出した。即ち、本発明者らは、 RecQl遺伝子の発現 を抑制することによって癌細胞特異的な細胞増殖抑制作用が見られることを初めて 見出した。従って、 RecQl遺伝子は非常に優れた副作用の少ない制癌剤のターゲッ ト分子と考えられる。また本発明者らは、癌細胞に対して特異的に細胞増殖抑制効 果を有する siRNA分子を見出すことに成功した。該分子を含む薬剤は、癌治療にお いて副作用の少ない有効な医薬となることが期待される。
上述のように、既存の抗癌剤の多くは副作用を有するものであることから、本願の Re cQl遺伝子についての siRNA分子のように、癌細胞増殖抑制作用を有する分子が正 常細胞には作用しないということを予め予想することは、非常に困難であるものと言え る。即ち、本発明によって提供される siRNA分子は、当業者であっても予測できない ような有利な効果 (正常細胞には作用せず、癌細胞特異的な細胞増殖抑制効果)を 有する。
[0013] 即ち、本発明は、 RecQlヘリカーゼ遺伝子の発現をターゲットとする癌細胞特異的 な細胞増殖抑制剤、特に、 RecQl遺伝子発現抑制効果を有する siRNAを含有する癌 細胞特異的細胞増殖抑制剤に関し、より具体的には、
〔1〕 RecQl遺伝子の発現を RNAi効果により抑制し得る RNAであって、配列番号： 1 〜32、または、配列番号: 40〜43のいずれかに記載の塩基配列力 なる RNAと、該 RNAと相補的な配列カゝらなる RNAとがノ、イブリダィズした構造を含む二本鎖 RNA。 〔2〕 末端において 1もしくは複数の DNAまたは RNAがオーバーハングした構造を有 する〔1〕に記載の二本鎖 RNA。
〔3〕 配列番号： 1〜32、または、配列番号: 40〜43のいずれかに記載の塩基配列 力 なる RNAを発現し得る DNAベクター。
〔4〕 〔1〕または〔2〕に記載の RNA、または〔3〕に記載の DNAを含有する、癌細胞特 異的細胞増殖抑制剤。
[5] 〔4〕に記載の癌細胞特異的細胞増殖抑制剤を有効成分として含有する抗癌剤 、を提供するものである。なお、上記癌細胞は、好ましくは、ヒトの癌細胞 (ヒト 由来 癌細胞)を指す。
さらに本発明は、
〔6〕 〔1〕もしくは〔2〕に記載の RNA、または〔3〕に記載の DNAを、個体 (対象者、被 検者、患者等)へ投与する工程を含む、癌細胞特異的に細胞の増殖を抑制する方 法 (癌の治療方法)、
〔7〕 〔1〕もしくは〔2〕に記載の RNA、または〔3〕に記載の DNAの、癌細胞特異的抗 癌剤 (癌細胞特異的細胞増殖抑制剤）の製造における使用、
に関する。
図面の簡単な説明
[図 1]実施例にて用いた RecQl遺伝子に対する siRNAの塩基配列を記載した図であ る。すべての配列は RNAであり、すべての siRNAのオーバーハング配列はデォキシヌ クレオチドの TTである。
[図 2]RecQl遺伝子に対する siRNAを導入した HeLa細胞における RecQl遺伝子の発 現量を示す図である。
[図 3]RecQl遺伝子に対する siRNAを導入した HeLa細胞における 96時間後の生存率 を示す図である。
[図 4]RecQl遺伝子に対する siRNAを TIG3細胞に導入し、 48時間後の mRNAの発現 を半定量 RT-PCRにより定量した結果を示すグラフである。 NSはコントロール siRNA である。 15と 24は、図 1に示す siRNAの配列番号である。非サイレンシング siRNAを導 入したときの遺伝子発現を 100%とした。
[図 5]RecQl遺伝子に対する siRNAを導入した TIG3細胞における 96時間後の生存率 を示すグラフである。 NSはコントロール siRNAである。 15と 24は、図 1に示す siRNAの 配列番号である。非サイレンシング siRNAを導入したときの細胞数を 100%としたときの 細胞数を表す。
[図 6]RecQl遺伝子に対する siRNAの薬効評価の結果を示す図である。 NTは未処理 の担癌マウスを指す。
発明を実施するための最良の形態
[0015] 本発明者らによって、 RecQ DNAヘリカーゼファミリー遺伝子に属する RecQl遺伝 子の発現を抑制することにより、癌細胞 (腫瘍細胞)特異的に細胞増殖が抑制される ことが見出された。また、本発明者らは、 RecQl遺伝子の発現を RNAi効果によって抑 制することにより、効果的に癌細胞特異的に細胞増殖抑制作用を有する RNA分子を 見出した。
[0016] 従って、本発明はまず、 RecQl遺伝子の発現を RNAi効果によって抑制し得る RNA( siRNA, shRNA)を提供する。該 RNAは、癌細胞特異的な細胞増殖抑制作用を有する 。本発明において「癌細胞特異的」とは、癌細胞に対して作用するが、正常細胞に対 しては実質的に作用しない (効果的な作用を示さない)ことを言う。正常細胞に対する 作用が、癌細胞に対する作用よりも有意に低い場合も、本発明における「癌細胞特 異的」に含まれる。
[0017] 本発明の RecQl遺伝子の塩基配列に関する情報は、当業者においては、公共の 遺伝子データベース (例えば、 GenBank等)から容易に取得することができる。上記遺 伝子の GenBankのァクセッション番号の一例を以下に示す。
RecQl遺伝子： NM— 002907 (配列番号： 33)、 NM— 032941 (配列番号： 34)、 BC00105 2 (配列番号： 35)、 D37984 (配列番号： 36)、 L36140 (配列番号： 37)
[0018] また、本発明の RecQl遺伝子によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列の一例 を配列番号： 38に示す。
[0019] また、本発明の RecQl遺伝子は特に制限されるものではないが、通常、動物由来で あり、より好ましくは哺乳動物由来であり、最も好ましくはヒト由来である。
[0020] 本発明の RecQl遺伝子の発現を RNAi (RNA interferance； RNA干渉）効果により抑 制し得る RNA (本明細書において単に「本発明の siRNA」と記載する場合あり）は、より 具体的には、配列番号： 1〜32のいずれかに記載の塩基配列を含む RNAを挙げるこ とができる。また、本発明の siRNAのより好ましい態様においては、配列番号： 1〜32 の！、ずれかに記載の塩基配列からなる RNAを一方の鎖とする二本鎖 RNA (siRNA)を 挙げることができる。
[0021] 本発明は、 RecQl遺伝子の発現を RNAi効果により抑制し得る RNA(siRNA)であって 、配列番号： 1〜32のいずれかに記載の塩基配列からなる RNAと、該 RNAと相補的 な配列カゝらなる RNAとがハイブリダィズした構造を含む二本鎖 RNAを提供する。
例えば、配列番号： 1に記載の塩基配列（5'-cuacggcuuuggagauaua-3')を含むこと を特徴とする本発明の siRNAとは、以下のような構造の RNA分子を例示することがで きる。
5' -c uac ggc uuuggagauaua-3' (配列番号： 1 )
I I I I I I I I I I I I I I I I I I I
3' -gaugc c gaaaccucuauau-5 ( 列番号： 3 9 )
(上記「I」は水素結合を表す。）
[0022] なお、上記 RNA分子において一方の端が閉じた構造の分子、例えば、ヘアピン構 造を有する siRNA(shRNA)も本発明に含まれる。即ち、分子内において二本鎖 RNA構 造を形成し得る分子もまた本発明に含まれる。
例えば、
0 -cuacggcuuuggagauaua (目 G列 号： 1)、xxxx)n uauaucuccaaagccguag (目列番 ： d 9) -3' のような分子もまた本発明に含まれる。（上記「(xxxx)n」は任意塩基および配列 数力もなるポリヌクレオチドを表す。 )
[0023] 本発明における siRNAの好まし!/、態様にお!、ては、 RecQl遺伝子の発現を RNAi効 果により抑制し得る RNA(siRNA)であって、配列番号： 1〜32のいずれかに記載の塩 基配列からなる RNAと、該 RNAと相補的な配列からなる RNAとがハイブリダィズした構 造力 なる二本鎖 RNAを好適に示すことができる。ただし、この二本鎖 RNAの末端に おいて、例えば、 1もしくは複数の RNAが付加もしくは欠失された構造の二本鎖 RNA もまた、本発明に含まれる。その場合、二本鎖を形成する RNAは、 RecQl遺伝子の部 分配列と相同性を有することが好ましい。本発明の siRNAにおいて二本鎖を形成する 領域の RNAの長さは、通常 15〜30 bpの長さであり、好ましくは 15〜27 bp程度の長さ であり、より好ましくは 19〜21bpの長さであり、最も好ましくは 19 bp (例えば、配列番号 ： 1〜32のいずれかに記載の RNAを一方の鎖とする siRNA)の長さである力 必ずしも これらの長さに限定されな 、。
[0024] また、本発明における siRNAは、必ずしも全てのヌクレオチドがリボヌクレオチド (RN A)でなくともよい。即ち、本発明において、 siRNAを構成する 1もしくは複数のリボヌク レオチドは、対応するデォキシリボヌクレオチドであってもよい。この「対応する」とは、 糖部分の構造は異なるものの、同一の塩基種 (アデニン、グァニン、シトシン、チミン（ ゥラシル)）であることを指す。例えば、アデニンを有するリボヌクレオチドに対応する デォキシリボヌクレオチドとは、アデニンを有するデォキシリボヌクレオチドのことを言 う。また、前記「複数」とは特に制限されないが、好ましくは 2〜5個程度の少数を指す
[0025] 一般的に RNAiとは、標的遺伝子の mRNA配列と相同な配列力 なるセンス RNAお よびこれと相補的な配列力もなるアンチセンス RNAと力 なる二本鎖 RNAを細胞内に 導入することにより、標的遺伝子 mRNAの破壊を誘導し、標的遺伝子の発現が阻害さ れる現象を言う。 RNAi機構の詳細については未だに不明な部分もある力 DICERと いわれる酵素（RNase III核酸分解酵素ファミリーの一種）が二本鎖 RNAと接触し、二 本鎖 RNA力 mall interfering RNAまたは siRNAと呼ばれる小さな断片に分解されるも のと考えられている。本発明における RNAi効果を有する二本鎖 RNAとは、好ましくは ゝこの siRNAを指す。
[0026] 本発明の好ましい態様においては、 RecQl遺伝子の発現を RNAi効果により抑制し 得る RNAであって、配列番号： 1〜32のいずれかに記載の塩基配列力 なる RNAと、 該 RNAと相補的な配列カゝらなる RNAとがハイブリダィズした構造を有する二本鎖 RNA である。
[0027] さらに、本発明の siRNA (二本鎖 RNA)を発現し得る DNAもまた、本発明に含まれる 。即ち本発明は、本発明の二本鎖 RNAを発現し得る DNA (ベクター）を提供する。本 発明の上記二本鎖 RNAを発現し得る DNA (ベクター）は、通常、該ニ本鎖 RNAの一 方の鎖をコードする DNA、および該ニ本鎖 RNAの他方の鎖をコードする DNA力 そ れぞれ発現し得るようにプロモーターと連結した構造を有する DNAである。本発明の 上記 DNAは、当業者においては、一般的な遺伝子工学技術により、容易に作製する ことができる。より具体的には、本発明の RNAをコードする DNAを公知の種々の発現 ベクターへ適宜挿入することによって、本発明の発現ベクターを作製することが可能 である。
[0028] 一般的に、 RNAi効果を有する二本鎖 RNAは、発現を抑制した 、標的遺伝子の mR NAにおける連続する RNA領域と相同な配列からなるセンス RNA、および該センス RN Aに相補的な配列からなるアンチセンス RNA力もなる二本鎖 RNAである。
[0029] また、通常、末端に数塩基のオーバーハングを有する二本鎖 RNAは RNAi効果が高 いことから、本発明の二本鎖 RNAは、末端に数塩基のオーバーハングを有することが 望ましい。このオーバーハングを形成する塩基の長さ、および配列は特に制限されな い。また、このオーバーハングは、 DNAおよび RNAのいずれであってもよい。好ましく は、 2塩基のオーバーハングを例示することができる。本発明においては例えば、 TT (チミンが 2個）、 UU (ゥラシルカ ¾個）、その他の塩基のオーバーハングを有する二本 鎖 RNA (最も好ましくは 19塩基の二本鎖 RNAと 2塩基 (TT)のオーバーハングを有する 分子）を好適に用いることができる。本発明の二本鎖 RNAには、このようにオーバー ハングを形成する塩基力 ¾NAであるような分子も含まれる。
例えば、オーバーハング部分の塩基が TTである場合には、本発明の siRNA分子と しては、
5' -cuacggcuuuggagauauaTT-3 (酉己歹 ϋ番 ： 1 + ΤΤ )
Ι Ι Ι Ι Ι Π Ι Ι ΙΙ Ι Ι ΙΙ Ι Ι Ι Ι
3' -TTgaugccgaaaccucuauau-¾ (ai歹幡号： 3 9 + TT ) のような分子 (3'側に TTが付加された分子)を例示することができる。
[0030] 本発明の上記「RecQl遺伝子に対して RNAi効果を有する二本鎖 RNA」は、当業者 においては、本明細書によって開示された塩基配列を基に、適宜作製することがで きる。具体的には、配列番号： 1〜32のいずれかに記載の塩基配列を基に、本発明 の二本鎖 RNAを作製することができる。一方の鎖 (例えば、配列番号： 1〜32のいず れかに記載の塩基配列）が判明して 、れば、当業者にぉ 、ては容易に他方の鎖湘 補鎖）の塩基配列を知ることができる。本発明の siRNAは、当業者においては市販の 核酸合成機を用いて適宜作製することが可能である。また、所望の RNAの合成につ いては、一般の合成受託サービスを利用することが可能である。
[0031] 本発明の siRNA (例えば、配列番号： 1〜32のいずれかに記載の塩基配列を一方 の鎖とする二本鎖 RNA分子）は、癌細胞特異的な細胞増殖抑制作用を有することか ら、本発明は、本発明の siRNAを有効成分として含有する癌細胞特異的細胞増殖抑 制剤を提供する。
[0032] 本発明において癌細胞における細胞増殖抑制作用が、アポトーシスの誘導に起因 する場合には、本発明の siRNAは、癌細胞特異的なアポトーシス誘導剤となることが 期待される。
アポトーシスとは一般的に、生理的条件下で細胞自らが積極的に引き起こす細胞 死を言う。アポトーシスの形態としては、例えば、細胞核の染色体凝集、細胞核の断 片化、細胞表層微絨毛の消失、細胞質の凝集等が挙げられる。従って、本発明にお けるアポトーシス誘導作用とは、例えば、細胞において上記のアポトーシスの形態を 誘導する作用を指すが、必ずしも、上記の形態の誘導のみに限定されるものではな い。当業者においては、細胞のアポトーシス誘導が起こっているか否かについて、適 宜、判断することが可能である。
[0033] 本発明の、癌細胞特異的なアポトーシス誘導剤は、例えば、アポトーシス誘導作用 を機序とする抗癌剤 (制癌剤)となることが期待される。
[0034] また本発明は、本発明の癌細胞特異的な細胞増殖抑制剤を有効成分として含有 する抗癌剤 (癌治療のための医薬組成物)を提供する。
[0035] 本発明の薬剤は、薬学上許容される担体と混合された状態として、提供されることも 可能である。これら薬学上許容される担体として、例えば界面活性剤、賦形剤、着色 料、着香料、保存料、安定剤、緩衝剤、懸濁剤、等張化剤、結合剤、崩壊剤、滑沢 剤、流動性促進剤、矯味剤等が挙げられるが、これらに制限されず、その他常用の 担体を適宜使用することができる。
[0036] 本発明の薬剤の製剤化にあたっては、常法に従い、必要に応じて上記担体を添カロ することができる。具体的には、軽質無水ケィ酸、乳糖、結晶セルロース、マン-トー ル、デンプン、カルメロースカルシウム、カルメロースナトリウム、ヒドロキシプロピルセ ルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルァセタールジェチルァミノ アセテート、ポリビュルピロリドン、ゼラチン、中鎖脂肪酸トリダリセライド、ポリオキシェ チレン硬化ヒマシ油 60、 白糖、カルボキシメチルセルロース、コーンスターチ、無機塩 類等を挙げることができる。
[0037] 上記薬剤の剤型の種類としては、例えば経口剤として錠剤、粉末剤、丸剤、散剤、 顆粒剤、細粒剤、軟 '硬カプセル剤、フィルムコーティング剤、ペレット剤、舌下剤、ぺ 一スト剤等、非経口剤として注射剤、坐剤、経皮剤、軟膏剤、硬膏剤、外用液剤等が 挙げられ、当業者においては投与経路や投与対象等に応じた最適の剤型を選ぶこ とがでさる。
[0038] RecQl遺伝子を抑制する本発明の siRNAを発現する DNAを生体内に投与する場合 、レトロウイルス、アデノウイルス、センダイウィルスなどのウィルスベクターゃリポソ一 ムなどの非ウィルスベクターを利用することができる。また、 RecQl遺伝子を抑制する 本発明の合成 siRNAを生体内に投与する場合、リボソーム、高分子ミセル、カチオン 性キャリアなどの非ウィルスベクターを利用することができる。投与方法としては、例え ば in vivo法および ex vivo法を挙げることができる。
[0039] 本発明には、癌細胞特異的細胞増殖抑制作用を有する上記の医薬組成物も含ま れる。本発明の薬剤または医薬組成物の投与量は、剤型の種類、投与方法、患者の 年齢や体重、患者の症状等を考慮して、最終的には医師の判断により適宜決定する ことができる。
[0040] なお、本発明にお 、て細胞増殖抑制効果が期待される癌の種類としては、特に制 限されないが、例えば、乳癌、肺癌、骨肉腫、子宮頸癌、繊維肉腫、卵巣の奇形癌、 胎生期癌、膀胱癌、慢性骨髄性白血病、急性リンパ芽球性白血病、神経膠芽細胞 腫、肝癌、膠芽細胞腫、黒色腫、腎癌、膝癌、胃癌、前立腺癌等を例示することがで きる。
また本発明は、本発明の RNAもしくは DNA、または本発明の薬剤を個体 (例えば、 患者等)もしくは細胞組織 (癌細胞組織等)へ投与する工程を含む、癌細胞特異的に 細胞の増殖を抑制する方法、および、癌細胞特異的に癌を抑制する方法 (癌細胞特 異的な癌治療方法)に関する。
本発明の方法における個体とは、好ましくはヒトであるが、特に制限されず、非ヒト動 物であってもよい。
個体への投与は、一般的には、例えば、動脈内注射、静脈内注射、皮下注射など 当業者に公知の方法により行うことができる。投与量は、対象者 (患者等)の体重や 年齢、投与方法などにより変動するが、当業者であれば適当な投与量を適宜選択す ることが可能である。
さらに本発明は、本発明の RNAもしくは DNA、または本発明の薬剤についての、癌 細胞特異的細胞増殖抑制剤もしくは抗癌剤の製造における使用に関する。
なお本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照として本明細書に 組み入れられる。
実施例
[0041] 以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明は、これに限定されるも のではない。
[0042] 〔実施例 1〕細胞培養
ヒト癌細胞として HeLa細胞 (ヒト子宫頸部癌細胞）を、ヒト正常細胞として TIG3細胞（ 正常二倍体線維芽細胞）を使用した。 HeLa細胞および、 TIG3細胞を、 10%牛胎児 血清、 50 g/mlゲンタマイシンを含む Dulbecco's modified Eagle's mediumを用いて、
37度、 5%CO条件下で培養した。
2
[0043] 〔実施例 2〕siRNAの設計
RecQl遺伝子に対する 32本の siRNAを、 Elbasherらの方法（Elbasher, M.S. et al. D uplexes of 21 -nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian eel Is. Nature 411, 494-498 (2001).)および、 Reynoldsらの方法（Reynolds A. et al., Rati onal siRNA design for RNA interference. Nat Biotechnol. 3, 326—30. (2004).)などに 従って設計した。それぞれの siRNA配列を図 1に示す。 siRNAを Qiagen社において合 成した。
[0044] 〔実施例 3〕 RecQl遺伝子発現抑制による癌細胞特異的な細胞増殖抑制効果
(1) siRNAによる RecQl遺伝子の発現抑制
トランスフエクシヨンを行う 24時間前に、細胞を 0.8-1.5 X 104個 Zゥエルの密度で 24 ゥエルプレートに播種し、 20— 50%コンフレントの状態で siRNAをトランスフエクシヨン した。 1ゥエルあたり 10 pmolの siRNAを、 Oligofectamine (Invitrogen)あるいは、 Lipofe ctoamine2000 (Invitrogen)を使用して、製造者のプロトコールに従ってトランスフエク シヨンした。 siRNA導入 24時間後の RecQl遺伝子の mRNA発現を Taqman PCRにより 定量した。詳しくは、 siRNAをトランスフエクシヨン後 24時間の細胞から、 RNeasy Mini Kit (Qiagen)を用いて全 RNAを抽出した。定量的 PCRには、 ABI PRISM 7000 Sequen ce Detection System (Applied Biosystems)を用いた。 RecQl遺 子および、 β -, - ヅ チン遺伝子の RT- PCR用プライマーおよび、 TaqManプローブを、 Applied Biosystems より購入した。 RT- PCR反応を、 QuantiTect Probe RT- PCR Kit (Qiagen)を用いて、 そのマニュアルに従って行った。 RecQl mRNAの発現を、 j8 -ァクチンを標準として用 いて、定量比較した。 RecQlの遺伝子発現に影響しないコントロール siRNAを導入し た細胞における、 RecQl遺伝子の mRNAの発現量を 100%として、それぞれの siRNAを 導入した細胞における RecQl mRNAの発現を比較した。
[0045] (2)細胞増殖試験
上記の条件と同様に siRNAをトランスフエクシヨンし 96時間後に、生細胞を生細胞数 測定試薬 SFけ力ライテスタ）を用いて測定した。 N=3で実験を行い、その平均値を 算出した。 RecQl遺伝子の発現に影響を示さな 、コントロール siRNAを導入した細胞 の生細胞数を 100%として、それぞれの siRNAを導入した細胞の生細胞数を算出した。
[0046] (3)結果
ヒト子宫頸部癌細胞である HeLa細胞を用いて、 siRNAによる RecQl遺伝子の発現 抑制が細胞の増殖に及ぼす影響を調べた。 RecQl遺伝子に対する 32種類の siRNA をそれぞれ HeLa細胞に導入した結果、すべての siRNAで 70%以上の遺伝子発現抑 制効果が観察された（図 2)。この条件下で、 96時間後の HeLa細胞の生細胞数を NS- siRNA処理群と比較したところ、全ての siRNA処理群で 30%以上の増殖抑制が観察 された（図 3)。
[0047] 次に、 TIG3細胞を用いて正常細胞の増殖に対する影響を調べた。 HeLa細胞で強 V、増殖抑制効果を示した配列番号 15と 24の siRNAを、それぞれ TIG3細胞に導入した ところ、 RecQl遺伝子の発現をそれぞれおよそ 70%抑制した（図 4)。この条件下で、 9 6時間後の TIG3細胞の生細胞数を NS-siRNA処理群と比較したところ、 TIG3細胞の 増殖には影響が認められな力つた（図 5)。
これらの結果から、 RecQl-siRNAは癌細胞の増殖を強く阻害し、正常細胞の増殖 にはほとんど影響を示さない事が証明された。
〔実施例 4〕 担癌動物モデルにおける siRNAによる腫瘍細胞の増殖阻害
動物試験に用いた siRNAおよび、 27 mer dsRNA配列を以下に示す。
〔表 1〕 動物実験で使用した RecQ1に対する siRNA配列
S iRNAの酉己列
24 GGGCAAUCAGGAAUCAUAU (配列番号 : 24)
33 GCUUGAAACUAUUAACGUA (配列番号 : 40)
34 UAAGACCACAGUUCAUAGA (配列番号 : 41 )
35 GUUAUCCAUCAUUCAAUGA (配列番号 : 42)
すべての SiRNA配列は RNA
すべての SiRNAのオーバーハング配列はデォキシヌクレオチドの Ί 動物実験で使用した RecQ1に対する 27mer dsRNA配列
36 GGAAAAGUUCAGACCACUUCAGCUUGA (配列番号： 43)
dsRNA配列は全て RNAで、オーバーハングを持たない。
[0049] 上記記載の RecQl-siRNAで処理した HeLa細胞の RecQl遺伝子の発現量は以下 の通りである。
〔表 2〕
Figure imgf000018_0001
[0050] RecQlヘリカーゼの siRNAによる腫瘍細胞の増殖阻害が担癌動物モデルでも起こ るか否かを検証した。上記に示した RecQl遺伝子に対する siRNAと 27 mer dsRNAを 使用した。
雄性 BALBZcAヌードマウスを日本クレア（CLEA Japan, Inc)力も購入した。 A549細 胞 (5 X 106個 ZO.lml)をヌードマウス（7週齢)の背部に皮下移植した。 siRNAの投与 は、腫瘍細胞の移植後 8日目に開始した。 RecQl-siRNAに関して、 5'末端がリン酸化 型の 22 μ g siRNAを 50 μ 1の生理食塩水中にて、 5 μ gのポリエチレンィミン（分子量 10 ,000、 Wako)と混合した。この混合物を、固形腫瘍の最上部に 3日毎、 6回（8、 11、 14 、 17、 20、 23日目）、皮下注射した。腫瘍体積はノギスにより測定した。腫瘍体積を算 出するための式は、 L XW2Z2とした。ここで Lは腫瘍の長径であり、 Wは短径である。 t検定を用いることにより、腫瘍体積の統計学的有意性について解析した。
その結果、全ての RecQl-siRNAは腫瘍の増殖を抑制した力 ポリエチレンィミンと 同様に混合した NS-siRNA (ヒトおよび、マウスの遺伝子発現に影響を及ぼさな ヽ siRN A)は効果がなぐ腫瘍の体積は増加した（図 6)。 RecQl-siRNAとポリエチレンィミン の混合物を投与したマウスは、非担癌マウスと比較して体重減少は認められず、この 処理による重要な副作用はな 、ことが示された。
本発明者らの研究から、 RecQlヘリカーゼの発現のサイレンシンダカ 担癌動物モ デルの腫瘍の抑制を引き起こすことが明らかとなつた。
産業上の利用可能性
ある化合物について癌細胞増殖抑制作用を有することが分力つた場合であっても、 正常細胞に対する増殖抑制作用の有無が不明な化合物は、医薬品として使用する ことは難 、。該化合物が正常細胞にぉ 、ても細胞増殖抑制作用が見られる場合、 副作用の危険を伴うからである。即ち、細胞増殖抑制作用が癌細胞特異的なもので なければ、実際に医薬品として使用することは、通常困難である。本発明の薬剤 (RN Ai効果を有する核酸）は、細胞増殖抑制作用が癌細胞特異的である点で、非常に実 用的かつ実効性の高い薬剤であると言える。

Claims

請求の範囲
[1] RecQl遺伝子の発現を RNAi効果により抑制し得る RNAであって、配列番号： 1〜32 、または、配列番号: 40〜43のいずれかに記載の塩基配列力 なる RNAと、該 RNA と相補的な配列カゝらなる RNAとがハイブリダィズした構造を含む二本鎖 RNA。
[2] 末端において 1もしくは複数の DNAまたは RNAがオーバーハングした構造を有する 請求項 1に記載の二本鎖 RNA。
[3] 配列番号： 1〜32、または、配列番号: 40〜43のいずれかに記載の塩基配列から なる RNAを発現し得る DNAベクター。
[4] 請求項 1または 2に記載の RNA、または請求項 3に記載の DNAを含有する、癌細胞 特異的細胞増殖抑制剤。
[5] 請求項 4に記載の癌細胞特異的細胞増殖抑制剤を有効成分として含有する抗癌 剤。
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