WO2006049157A1

WO2006049157A1 - コネキシン２６阻害活性を有する多量体型オレアミド誘導体と、その癌治療等への利用

Info

Publication number: WO2006049157A1
Application number: PCT/JP2005/020089
Authority: WO
Inventors: Hiroshi Nojima; Yasuyuki Kita
Original assignee: The New Industry Research Organization; Osaka University
Priority date: 2004-11-02
Filing date: 2005-11-01
Publication date: 2006-05-11
Also published as: JP4884231B2; JPWO2006049157A1; US20080089924A1; US7846972B2

Description

明細書

コネキシン 26阻害活性を有する多量体型ォレアミド誘導体と、その癌治療等への利用

技術分野

[0001] 本発明は、コネキシン 26阻害活性を有する多量体型ォレアミド誘導体とその利用に関する。これらの新規ォレアミド誘導体は、研究用試薬として利用できるほか、癌の転移抑制 ·増殖抑制など有用な生理活性を示すことから、癌の予防薬 '治療薬をはじめとして、医薬、サプリメント、機能性食品などの各種用途を有し、産業上広く利用できるものである。

背景技術

[0002] コネキシンは、ギャップ結合を構成する膜結合タンパク質ファミリーの総称である。コネキシンは、その分子量の違いによって、 12を超えるサブタイプが発見されている。分子量が 26kDaのものはコネキシン 26、 43kDaのものはコネキシン 43と称されている。

[0003] コネキシンの 6量体は、コネクソンと呼ばれ、導管状構造を形成して細胞膜を貫通する。コネクソンが隣接細胞間で連結したものがギャップ結合であり、この連結によつて形成された導管内をイオンや低分子量タンパク質が細胞から細胞へと受け渡される。この機構は、上皮性細胞の増殖の恒常性維持などのために必須であると考えられている。

[0004] 本発明者らは以前、癌の転移機序を遺伝子レベルで解明する基礎研究を行っている中で、コネキシン 26が癌転移に密接に関わっていること、より具体的には、コネキシン 26の機能を抑制することにより癌の転移が抑制されることを見出している（下記の特許文献 1および非特許文献 1)。

[0005] また、ギャップ結合を阻害する物質として、ォレイン酸のアミド誘導体であるォレアミドおよびその誘導体が知られている（下記の非特許文献 2)。本発明者らは、ォレアミド誘導体のうち、コネキシン 26を特異的に阻害し、良好な癌転移抑制活性を示すものを同定し、その 1つにつ!、て「MI— 18」と命名した（下記の特許文献 2)。 [0006] なお、下記の特許文献 3 · 4には、イミダゾリジンの原料として、 2量体型ォレアミド誘導体を使用する例が記載されている。また、生成物であるイミダゾリジンは、 in vitroでバクテリア、酵母等の成長阻害活性を有することが記載されて！ヽる。

[0007] 特許文献 1 :特開 2001— 17184号公報

特許文献 2：国際公開 WO2004Z060398号公報

特許文献 3 :米国特許 3, 872, 120号公報

特許文献 4 :米国特許 3, 875, 159号公報

非特許文献 l : Ito, A. et al. ： J. Clin. Invest. , 105 : 1189 - 1197, 2000. 非特許文献 2 : Boger, D. L. et al. ： Proc. Nat. Acad. Sci. USA. , 95 : 4810 -4815. 1998.

発明の開示

発明が解決しょうとする課題

[0008] 現在の癌治療では、抗癌剤の投与、癌細胞および癌組織の摘出、放射線治療など、直接癌細胞に対する治療が行われている。しかし、癌細胞は転移が非常に早いため、癌治療を行っている途中に、別の組織に転移する場合が多い。その結果、治療が長期化し、あるいは、転移が広がり死に至る事態が生じ得る。

[0009] したがって、癌治療の治療効果を上昇させるためには、抗癌剤投与や癌組織摘出などによる直接的な癌治療のほかに、癌の転移を抑制することが重要となる。しかしながら、癌転移抑制剤の研究開発は難航しており、臨床的に確立された癌転移抑制剤は未だ開発されて、な、。

[0010] 前述のように、本発明者らは、コネキシン 26を特異的に阻害し、良好な癌転移抑制活性を示す Ml— 18等のォレアミド誘導体を同定している。医薬開発などに産業利用するためには、さらに良好な物質の探索を行い、高いコネキシン 26阻害活性を示し、取扱いの容易性、安定性、非毒性などの点でも優れたォレアミド誘導体を同定することが求められている。こうして得られたォレアミド誘導体は、癌転移抑制剤としても非常に有用と考えられる。

[0011] 本発明は、上記の事情に鑑みなされたものであって、コネキシン 26阻害活性を有する新規ォレアミド誘導体の開発をその課題とする。本発明はさらに、得られた新規ォレアミド誘導体を用いた医薬、サプリメント、機能性食品、および研究用試薬の提供をその課題とする。

課題を解決するための手段

[0012] 本発明者らは、構造上安定な多量体型ォレアミド誘導体を種々合成し、この中から色素トランスファーアツセィによってコネキシン 26阻害活性を示す物質を探索した結果、コネキシン 26を特異的に阻害する複数の新規ォレアミド誘導体を見出した。このうち良好なコネキシン 26阻害活性を示した後述の Ml— 22は、癌自然転移を顕著に抑制し、細胞毒性も殆どなく生体に安全な物質であり、油状物で取扱いにも優れ、さらに、癌の増殖抑制能 (抗腫瘍効果)も認められた。これらの知見等から、今回得られた新規ォレアミド誘導体は、抗癌自然転移薬、抗癌増殖薬などとして医薬開発に利用可能であり、その他、サプリメント、機能性食品、研究用試薬などとしても有用であることを見出し、本発明を完成させるに至った。

[0013] 即ち、本発明は、医療及び産業上有用な発明として、下記 A)〜L)の発明を包含するものである。

A) 下記の式（1)により表される二量体型ォレアミド誘導体、又はその薬理上許容される塩。

[化 1]

(ただし、 nは 3, 5又は 8の整数である。炭素、水素は慣用表記にしたがって省略した。数字は炭化水素の繰り返し個数である。「Et」はジェチル基を表す。他の式の表記

2

も同様である。 )

上記式（1)中、 n= 3のものを以下「MI— 22」と称する。同様に、上記式（1)中、 n = 5、 n=8のものを、それぞれ、以下「MI— 39」、「MI— 40」と称する。 B) 下記の式 (2)により表される二量体型ォレアミド誘導体、又はその薬理上許容される塩。

[化 2]

0

(ただし、 nは 3又は 5の整数である。 )

上記式（2)中、 n= 3、 n= 5のものを、それぞれ、以下「MI— 45」、「MI— 46」と称する。

C) 下記の式 (3)により表される二量体型ォレアミド誘導体、又はその薬理上許容される塩。

[化 3]

(ただし、 nは 5又は 8の整数である。 )

上記式（3)中、 n= 5、 n=8のものを、それぞれ、以下「MI— 41」、「MI— 42」と称する。

D) 下記の式 (4)により表される二量体型ォレアミド誘導体、又はその薬理上許容される塩。

(ただし、 nは 3又は 5の整数である。 )

上記式（4)中、 n= 3、 n= 5のものを、それぞれ、以下「MI— 47」、「MI— 48」と称する。

E) 下記の式 (5)により表される三量体型ォレアミド誘導体、又はその薬理上許容される塩。

[化 5]

上記式（5)により表されるォレアミド誘導体を、以下「MI— 50」と称する。

F) 下記の式 (6)により表される四量体型ォレアミド誘導体、又はその薬理上許容される塩。

上記式 (6)により表されるォレアミド誘導体を、以下「MI— 52」と称する。

G) 下記の式 (7)により表される三量体型ォレアミド誘導体、又はその薬理上 f される塩。

[化 7]

上記式（7)により表されるォレアミド誘導体を、以下「MI— 51」と称する。

H) 下記の式 (8)により表される四量体型ォレアミド誘導体、又はその薬理上 f される塩。

上記式 (8)により表されるォレアミド誘導体を、以下「MI— 53」と称する。

I) 上記の式（1)〜（8)のいずれかにより表される多量体型ォレアミド誘導体、又はその薬理上許容される塩を有効成分とする癌の転移抑制剤。

J) 上記の式（1)〜（8)のいずれかにより表される多量体型ォレアミド誘導体、又はその薬理上許容される塩を有効成分とする癌の増殖抑制剤。

K) 上記の式（1)〜（8)のいずれかにより表される多量体型ォレアミド誘導体、又はその薬理上許容される塩を含有する食用組成物。

L) 上記の式（1)〜（8)のいずれかにより表される多量体型ォレアミド誘導体、又はその薬理上許容される塩を含有するコネキシン 26阻害剤。

[0014] なお、本明細書にぉ、て「多量体型」とは、脂肪酸の炭素鎖を複数有する意味で用いており、例えば「二量体型」とは、脂肪酸の炭素鎖を 2つ有するものを意味する。同様に、「三量体型」「四量体型」とは、それぞれ脂肪酸の炭素鎖を 3つと 4つ有するものを意味する。

発明の効果

[0015] 本発明のォレアミド誘導体、即ち、上記の式（1)〜（8)により表される多量体型ォレアミド誘導体は、コネキシン 26の機能を阻害することによって癌の自然転移を抑制. 阻害し、癌の予防薬'治療薬として有用である。また、医薬のほか、サプリメント、機能性食品として利用可能であり、さらに、コネキシン 26阻害剤として、研究用試薬 (生化学試薬)などに利用することができる。図面の簡単な説明

[0016] [図 1]本発明に係る多量体型ォレアミド誘導体の合成方法を概略的に示す図であり、

(a)は二量体型ォレアミド誘導体、（b)は三 ·四量体型ォレアミド誘導体、の合成方法を示す。

[図 2]色素トランスファーアツセィによって観察された顕微鏡写真の一例を示す図である。

[図 3]色素トランスファーアツセィによって本発明に係る多量体型ォレアミド誘導体のコネキシン 26阻害活性およびコネキシン 43阻害活性を検討した結果を示すグラフである。

[図 4]MI— 22投与による癌の自然転移抑制の有無を検討した結果を示すグラフである。

[図 5]MI— 22の投与によるマウスの肺へのマウス'メラノーマ BL6細胞の転移の程度を示す図である。転移の程度は、無し (上段)、中程度（中段）、高頻度（下段)の 3つに分類してあり、典型的なマウス解剖時の肺の写真を載せてある。数値は各程度の肺転移を示したマウスの数を示してある。

[図 6]ヒト胃がん細胞である Az521細胞の培養条件下にお、て Ml 22が細胞毒性を持たないことを示すグラフであり、 (a)は培養液に何も加えないコントロールの結果、 (b)は培養液に MI— 22をカ卩えたときの結果である。

[図 7]MI— 22投与によってヌードマウスにおけるヒト胃がん細胞である Az521細胞が増殖抑制を受けることを示すグラフである。

[図 8]ヒト胃がん細胞が皮下移植されたヌードマウスに対して Ml— 22を腹腔内投与し、その抗腫瘍効果を検討した結果を示すグラフである。図中「NT」は、薬剤投与 '処置を何も行わな力つた皮下腫瘍マウス群の結果である。

発明を実施するための最良の形態

[0017] 以下、本発明の具体的態様、技術的範囲等について詳しく説明する。

[1]本発明のォレアミド誘導体の生理活性とその特徴

本発明者らは、上記の式（1)〜（8)により表される多量体型ォレアミド誘導体を後述の実施例に示す方法により合成し、各誘導体についてコネキシン 26阻害活性の有無を検討した。その結果、上記誘導体のすべてにコネキシン 26阻害活性が認められた (図 3参照)。

[0018] このうち、強いコネキシン 26阻害活性が認められた 3つの二量体型ォレアミド誘導体（Ml— 22 ·ΜΙ— 39 ·ΜΙ— 45)について、更にコネキシン 43阻害活性の有無を検討したところ、図 3に示すように、これらの誘導体はコネキシン 43の機能を殆ど阻害しなかった。

[0019] コネキシン 43は、コネキシンファミリーの中で、中枢神経や心筋細胞に多く存在し、その機能が阻害されると、不整脈などの悪影響を及ぼすと考えられている。それゆえ、医薬開発に利用する場合は、コネキシン 43の機能を阻害することなぐコネキシン 2 6を特異的に阻害する特性が望ましい。この点で、上記 3つのォレアミド誘導体のうち Ml— 22が最も望ましい結果を示したため、この Ml— 22の抗癌自然転移薬、抗癌増殖薬としての利用可能性につ!、て検討を行った。

[0020] その結果、上記 Ml— 22は、癌の自然転移を顕著に抑制し（図 4· 5)、癌の増殖抑制能 (抗腫瘍効果)も認められた（図 7)。なお、詳細は後述の実施例において説明する。

[0021] また、上記 Ml— 22は、以下の特徴を有し、抗癌自然転移薬、抗癌増殖薬などの医薬開発に好適な物質である。

( 1)油状物で、有機溶媒に良溶であり、取扱いに優れている。

(2)後述の色素—トランスファーアツセィによってコネキシン 26を介した GJICスコアが「2」以下という低い値を示し、コネキシン 26の機能を強力に阻害する一方、コネキシン 43を介した GJICスコアはコントロールと殆ど変わらず、コネキシン 43の阻害作用は認められな力つた (図 3)。したがって、不整脈などの副作用の少ない安全な薬剤開発が期待できる。

(3)細胞毒性も認められず（図 6)、生体に安全な物質と考えられる。 Ml— 22による癌の自然転移阻害を調べた実験（実施例 3)において、 Ml— 22をマウスに連日投与しても、 Ml— 22投与が原因で死亡したマウスは皆無であり、この結果からも安全性が極めて高!、物質と考えられる。

(4)一般に酸、塩基、熱、光、求核反応等の種々の条件で容易に分解するようなェポキシド構造を有しておらず、比較的安定である。また、核酸等の塩基と反応して、 D NAに損傷を与える可能性もな、。

(5) Ml— 22の二量体構造は、炭素鎖によって形成されているため、分解してモノマ一体のォレアミドとなることはない。同様に、本発明の他のォレアミド誘導体についても、その多量体構造は炭素鎖によって形成されているため、容易に分解しがたく変化しにくいため、種々の処理を行いやすい。

[0022] なお、注目すべきは、上記 Ml— 22が実験転移ではなぐ癌の自然転移を抑制（阻害)することである。従来の薬効評価 (癌転移抑制活性の評価）は、癌細胞を移植するのではなぐ実験的に癌を転移させる実験転移により行っていた。すなわち、癌細胞を静注し、候補薬剤の投与 2週間後の肺への癌の転移から、有効性を評価していた。これに対し、後述の実施例では、癌細胞を移植して、移植後の癌の転移から、薬効評価を行っている。これにより、実際の癌に近い状態での、有効性の評価が可能となる。すなわち、上記 Ml— 22、そのほか本発明のォレアミド誘導体は、生体における癌転移を直接反映する癌の自然転移を抑制（阻害)するものとして、実効性ある癌治療薬の開発に利用できる可能性が極めて高い。

[0023] 本発明のォレアミド誘導体は、後述の実施例記載の方法により製造することができるが、製造方法はもちろん当該方法に限定されるものではなぐ種々の改変が可能である。また、もし天然に存在することがわかれば、本発明のォレアミド誘導体を天然物から単離 ·精製してもよいし、あるいは、天然物から得られた物質を原材料として反応等の処理を施し、製造してもよい。必要であれば、微生物などの生物材料を使用して生産したものであってもよ、。

[0024] 図 1に示される工程で製造する場合、炭素鎖に 2重結合 (アルケン)を有する 7個のォレァミド誘導体（MI— 22 ·MI— 39 ·MI—40·MI—45 ·MI—46 ·MI— 50·MI— 52)は、 2重結合をォキシランに変換する反応を省略できる分、より少ない工程で製造可能である。

[0025] 本発明のォレアミド誘導体は、コネキシン 26阻害活性を有する力ここで「コネキシン 26阻害活性」は、本発明のォレアミド誘導体を投与することにより、コネキシン 26を介した細胞間物質移動が抑制されることを意味する。このことは、後述の色素ートランスファーアツセィによりコネキシン 26を介した GJICスコアの変化を調べることによって容易に確認することができる。

[0026] [2]本発明のォレアミド誘導体の用途

上記のように、本発明のォレアミド誘導体はコネキシン 26阻害活性を示すことから、コネキシン 26阻害剤として研究用試薬に利用することができる。また、このようにギヤップ結合を構成するコネキシン 26を特異的に阻害するという生理活性を有することから、この特性を利用した医薬開発も期待できる。

[0027] さらに上記 Ml— 22等のォレアミド誘導体には、強い癌の転移抑制活性、抗腫瘍活性が認められるので、抗癌剤 (制癌剤)などの医薬、さらには抗癌作用または癌予防効果をもつサプリメント、機能性食品 (食用組成物)の原材料などに利用可能である。

[0028] なお、本発明には上記ォレアミド誘導体のほかに、これら誘導体の薬理上許容される塩も含まれる。このような薬理上許容される塩としては、フッ化水素酸塩、塩酸塩などのハロゲンィ匕水素酸塩、硫酸塩、硝酸塩などの無機酸塩、ナトリウム塩、カリウム塩などのアルカリ金属塩、スルホン酸塩、および、有機酸塩を例示することができる。

[0029] 本発明のォレアミド誘導体、又はその薬理上許容される塩 (以下、単に「ォレアミド誘導体」という。）を医薬開発に利用する場合、その一態様として、本発明のォレアミド誘導体を医薬品開発過程におけるリードィ匕合物として利用するものであってもよい

[0030] 本発明のォレアミド誘導体を医薬品（医薬用組成物）に用いる場合の一例について説明する。本発明のォレアミド誘導体は、これをそのまま、あるいは慣用の医薬製剤担体とともに医薬用組成物となし、ヒト (または動物）に投与することができる。医薬用糸且成物の剤形としては特に制限されるものではなく必要に応じて適宜選択すればよいが、例えば、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、細粒剤、散剤等の経口剤、注射剤、坐剤、塗布剤等の非経口剤が挙げられる。

[0031] 錠剤、カプセル剤、顆粒剤、細粒剤、散剤等の経口剤は、例えば、デンプン、乳糖、白糖、トレノヽロース、マンニット、カルボキシメチルセルロース、コーンスターチ、無機塩類等を用いて常法に従って製造される。これらの製剤中の本発明のォレアミド誘導体の配合量は特に限定されるものではなく適宜設定できる。この種の製剤には、結合剤、崩壊剤、界面活性剤、滑沢剤、流動性促進剤、矯味剤、着色剤、香料等を適宜に使用することができる。

[0032] 非経口剤の場合、患者の年齢、体重、疾患の程度などに応じて用量を調節し、例えば、静注、点滴静注、皮下注射、筋肉注射などによって投与する。この非経口剤は常法に従って製造され、希釈剤として一般に注射用蒸留水、生理食塩水等を用いることができる。さらに必要に応じて、殺菌剤、防腐剤、安定剤を加えてもよい。また、この非経口剤は安定性の点から、バイアル等に充填後冷凍し、通常の凍結乾燥処理により水分を除き、使用直前に凍結乾燥物から液剤を再調製することもできる。さらに必要に応じて、等張化剤、安定剤、防腐剤、無痛化剤を加えてもよい。これら製剤中の本発明のォレアミド誘導体の配合量は特に限定されるものではなく任意に設定できる。その他の非経口剤の例として、外用液剤、軟膏等の塗布剤、直腸内投与のための坐剤等が挙げられ、これらも常法に従って製造される。

[0033] なお、公知の DDS (ドラッグ ·デリバリー 'システム）を利用し、例えば、本発明のォレアミド誘導体をリボソームなどの運搬体に封入して体内投与してもよ、。このとき標的部位 (癌細胞等)を特異的に認識する運搬体などを利用すれば、標的部位に本発明のォレアミド誘導体を効率よく運ぶことができ効果的である。

[0034] また前述したように、本発明のォレアミド誘導体は、サプリメント、機能性食品などの食品（食用組成物）に利用することができる。すなわち、各種飲料や各種加工食品の原材料として本発明のォレアミド誘導体を飲食品に添加したり、必要に応じてデキストリン、乳糖、澱粉等の賦形剤や香料、色素等とともにペレット、錠剤、顆粒等に加工したり、またゼラチン等で被覆してカプセルに成形加工して健康食品や保健食品等として禾 lj用でさる。

実施例

[0035] 以下、本発明の実施例について説明する力本発明は下記実施例によって何ら限定されるものではない。

[0036] 〔実施例 1：本発明に係る多量体型ォレアミド誘導体の合成〕

まず、 Ml— 22をはじめとする本発明の多量体型ォレアミド誘導体の合成方法について説明する。図 1 (a)は、二量体型ォレアミド誘導体の化学合成を概略的に示したもの、同図 (b)は、三量体型 ·四量体型ォレアミド誘導体の化学合成を概略的に示したもの、である。

[0037] なお、以下の実施例では、核磁気共鳴（ — NMR)スペクトルは、 20— 25°Cでテトラメチルシランを内部標準物質として 300MHzにて測定した。赤外線 (IR)吸収スベクトルは、 KBrを希釈剤とした拡散反射法により測定した。カラムクロマトグラフィの吸着剤には E. Merck silica gel 60を使用し、薄層クロマトグラフィには E. Merck pre-c oatea rLし platesおよ！ siiica gel F 使用した。

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[0038] [1. 1] MI— 22の合成

MI— 22、即ち、 Ν^Ν^ί^,Ν⁷—テトラエチル— 2,6 ジ [ (Z)— 7 へキサデセ-ル ]ヘプタンジアミド（^,Ν^Ν ,Ν⁷— Tetraethy卜 2,6— di[(Z)— 7— hexadecenyl]heptanediamid e)を以下の方法により合成した。

[0039] 窒素雰囲気下、ォレイン酸（503mg, 1. 8mmol)の無水メチレンクロリド溶液（8. 5 mL)に氷冷下、ォキザリルクロリド（0. 46mL, 5. 4mmol)を滴下して、室温で 4時間撹拌した後、減圧濃縮した。得られた残渣にジェチルァミン（1. OmL, 9. 7mmol)を加え、室温で 0. 5時間攪拌した後、水を加え、酢酸ェチルで抽出した。得られた有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧濃縮した。得られた粗抽出物をカラムクロマトグラフィ (n—へキサン：酢酸ェチル = 1： 2)を用いて精製し、無色油状物として、（Z)— Ν,Ν ジェチル— 9—ォクタデセンアミド（(Z)- Ν,Ν-dieth yl-9-octadecenamide) (495mg, 82%)を得た。

[0040] 上記無色油状物の核磁気共鳴 NMR)スペクトルデータを以下に示す。

1H NMR (CDC1 , 300 MHz): δ 0.88 (3Η, t, J = 6.6 Hz), 1.11 (3H, t, J = 7.2 Hz), 1.

3

17 (3H, t, J = 7.2 Hz), 1.25-1.39 (20H, m), 1.50-1.75 (2H, m), 1.95-2.10 (4H, m), 2.28 (2H, t, J = 7.4 Hz), 3.30 (2H, q, J = 6.6 Hz), 3.37 (2H, q, J = 6.6 Hz), 5.32—5. 36 (2H, m).

[0041] 上記無色油状物（153mg, 0. 45mmol)の THF溶液（12mL)を 40°Cに冷却し、 LDA(0. 7mL, 1. 4mmol)を加え、 40°Cで 0. 5時間攪拌した。その後、ジョードプロパン（1,3- diiodopropane) (0. 26mL, 2. 3mmol)を加え、—40°Cで 3時間攪拌した後、飽和塩化アンモ-ゥム水溶液を加えた。次に、有機層を分別し、水層を酢酸ェチルで抽出した。混合有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧濃縮した。得られた粗抽出物をカラムクロマトグラフィ (n キサン:酢酸ェチル =4 : 1)を用いて精製し、無色油状物として、 MI- 22 (22mg, 21%)を得た。

[0042] 上記 Ml— 22の赤外線（IR)吸収スペクトル、核磁気共鳴（ , ¹³C— NMR)スぺクトル、質量分析法 (FAB)の各データを以下に示す。

IR (KBr) 3416, 2855, 1614 cm"¹;

^JH NMR (CDCl , 300 MHz): δ 0.88 (6H, t, J = 6.4 Hz), 1.09 (6H, t, J = 7.2 Hz), 1.

3

14 (6H, t, J = 7.2 Hz), 1.20-1.38 (48H, m), 1.50—1.62 (2H, m), 1.98—2.03 (8H, m), 2.42-2.52 (2H, m), 3.31 (4H, q, J = 7.2 Hz), 3.36 (4H, q, J = 7.2 Hz), 5.32—5.35 (4 H, m);

¹³C NMR (CDCl , 300 MHz): δ 12.9, 13.9, 14.8, 22.5 (2C), 27.0 (2C), 27.4, 29.0 (

3

3C), 29.3, 29.6 (2C), 31.7 (2C), 33.3, 33.5, 40.2, 41.0, 41.6, 129.5, 129.7, 175.1. LRMS (FAB) m/z 716 (MH⁺). HRMS (FAB) calcd for C H N O , 715.7081; found, 7

47 91 2 2

15.7078.

[0043] [1. 2]MI— 39の合成

MI— 39、即ち、 N¹ ,Ν¹ ,N⁹,N⁹—テトラェチル— 2, 8—ジ [ (Z)— 7—へキサデセ-ル ]ノナンジアミド（N^N^N^N⁹— Tetraethy卜 2,8— di[(Z)— 7— hexadecenyl]nonanediamide) を以下の方法により合成した。

[0044] 上記 Ml— 22の合成と同様に、（Z)- N,N- diethy卜 9- octadecenamide (70mg, 0. 22 mmol)の THF溶液に LDA(0. 34mL, 0. 66mmol)を加え、— 40°Cで 0. 5時間攪拌した。その後、ジョードペンタン（1,5- diiodopentane) (3. OmL, 0. 17mmol)をカロえ、— 40°Cで 3時間攪拌した後、飽和塩ィ匕アンモニゥム水溶液を加えた。次に、有機層を分別し、水層を酢酸ェチルで抽出した。混合有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧濃縮した。得られた粗抽出物をカラムクロマトグラフィ（n キサン：酢酸ェチル =8 : 1)を用いて精製し、無色油状物として、 MI— 39 ( 50mg, 30%)を得た。

[0045] 上記 MI— 39の核磁気共鳴（¹H— NMR)スぺクトル、質量分析法（FAB)の各データを以下に示す。 H NMR (CDC1 , 300 MHz): δ 0.88 (6H, t, J = 6.4 Hz), 1.07-1.29 (64H, m), 1.50—

3

1.62 (2H, m), 1.99—2.01 (8H, m), 2.28 (2H, m), 3.35 (8H, q, J = 5.4 Hz), 5.33 (4H, m).

LRMS (FAB) m/z 744 (MH⁺). HRMS (FAB) calcd for C H N O , 743.7394; found, 7

49 95 2 2

43.7415.

[0046] [1. 3] MI— 40の合成

MI— 40、即ち、 Ν',Ν',Ν^,Ν¹²—テトラェチル 2, 11 ジ [ (Ζ)— 9 へキサデセ -ル]ドデカンジアミド（ ^{2 2}- Tetraethyト 2,11- di[(Z)- 9- hexadecenyl]dodecan ediamide)を以下の方法により合成した。

[0047] 上記MI— 22の合成と同様に、（Z)-N,N-diethyl-9-octadecenamide (52mg, 0. 17 mmol)の THF溶液に LDA(0. 25mL, 0. 51mmol)をカロえ、 40°Cで 0. 5時間攪拌した。その後、ジョードオクタン（1,5- diiodooctane) (0. 17mL, 0. 85mmol)をカロえ、 40°Cで 3時間攪拌した後、飽和塩ィ匕アンモニゥム水溶液を加えた。次に、有機層を分別し、水層を酢酸ェチルで抽出した。混合有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧濃縮した。得られた粗抽出物をカラムクロマトグラフィ（n キサン：酢酸ェチル =8 : 1)を用いて精製し、無色油状物として、 MI—40 ( 21mg, 16%)を得た。

[0048] 上記 Ml— 40の核磁気共鳴 NMR)スペクトル、質量分析法（FAB)の各データを以下に示す。

1H NMR (CDC1 , 300 MHz): δ 0.88 (6Η, t, J = 6.4 Hz), 1.08-1.59 (72H, m), 1.99-

3

2.04 (8H, m), 2.50 (2H, m), 3.35 (8H, q, J = 5.4 Hz), 5.33 (4H, m).

LRMS (FAB) m/z 786 (MH⁺). HRMS (FAB) calcd for C H N O , 785.7863; found,

52 101 2 2

785.7897.

[0049] [1. 4] MI— 45の合成

MI— 45、即ち、 N¹— [ (Z)—3—ォクタデック 9—エノィルァミノプロピル]— (Z) 9ーォクタデセンアミド（N¹- [(Z)- 3- Octadec- 9- enoylaminopropyl]- (Z)- 9- octadecen amide)を以下の方法により合成した。

[0050] 窒素雰囲気下、ォレイン酸（lOOmg, 0. 35mmol)の無水メチレンクロリド溶液（3. OmL)に氷冷下、ォキザリルクロリド（0. l lmL, 1. 2mmol)を滴下して、室温で 4時間撹拌した後、減圧濃縮した。得られた残渣にプロパン— 1, 3 ジァミン (0. 015m L, 0. 18mmol)を加え、室温で 1時間攪拌した後、水を加え、酢酸ェチルで抽出した。得られた有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧濃縮した。得られた粗抽出物をカラムクロマトグラフィ (n—へキサン:酢酸ェチル = 1 :4)を用いて精製し、無色油状物として、 MI-45 (89mg, 84%)を得た。

[0051] 上記 Ml— 45の核磁気共鳴 NMR)スペクトル、質量分析法（FAB)の各データを以下に示す。

^JH NMR (CDC1 , 300 MHz): δ 0.88 (6Η, t, J = 6.6 Hz), 1.27-1.31 (40H, m), 1.57-

3

1.61 (6H, m), 1.98-2.05 (8H, m), 2.20 (4H, dd, J = 7.4 Hz), 3.27 (4H, dd, J = 12.4, 5.9 Hz), 5.34 (4H, m), 6.19 (2H, brs).

LRMS (FAB) m/z 604 (MH⁺). HRMS (FAB) calcd for C H N O , 603.5829; found, 6

39 75 2 2

03.5813.

[0052] [1. 5]MI— 46の合成

MI— 46、即ち、 N¹— [ (Z)—5—ォクタデック 9—エノィルァミノペンチル]一（Z) 9ーォクタデセンアミド（N¹- [(Z)- 5- Octadec- 9- enoylaminopentyl]- (Z)- 9- octadecen amide)を以下の方法により合成した。

[0053] Ml— 45の合成と同様に、ォレイン酸（127mg, 0. 45mmol)の無水メチレンクロリド溶液に氷冷下、ォキザリルクロリド（0. 14mL, 1. 58mmol)を滴下して、室温で 4 時間撹拌した後、減圧濃縮した。得られた残渣にペンタン— 1, 5 ジァミン (0. 026 mL, 0. 22mmol)をカ卩え、室温で 1時間攪拌した後、水を加え、酢酸ェチルで抽出した。得られた有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧濃縮した。得られた粗抽出物をカラムクロマトグラフィ (ジクロロメタン:メタノール = 20 : 1 )を用いて精製し、無色油状物として、 MI-46 (127mg, 45%)を得た。

[0054] 上記 Ml 46の核磁気共鳴 NMR)スペクトル、質量分析法（FAB)の各データを以下に示す。

^JH NMR (CDC1 , 300 MHz): δ 0.85 (6Η, t, J = 6.5Hz), 1.25—1.64 (42H, m), 1.97—2

3

.01 (8H, m), 2.13-2.19 (4H, dd, J = 7.2 Hz), 3.23 (4H, dd, J = 12.4, 5.9 Hz), 5.27—5 .40 (4H, m), 5.88 (2H, brs).

LRMS (FAB) m/z 631 (MH⁺). HRMS (FAB) calcd for C H N O , 631.6142; found, 6

41 78 2 2

31.6130.

[0055] [ 1. 6] MI— 50の合成

MI— 50、即ち、 N¹— { (Z)—3—オタタデックー 9 エノイノレー N [ (Z)—4—オタタデックー 9 エノィルアミノブチル]ーァミノプロピル } (Z) 9ーォクタデセンアミド (N - {(Z)- 3- Octadec- 9- enoyト N- [、ん)- 4- octadec- 9- enoylaminobutyl]- aminopropyl}-、 Z)-9-octadecenamide)を以下の方法により合成した。

[0056] Ml— 45の合成と同様に、ォレイン酸（lOOmg, 0. 35mmol)の無水メチレンクロリド溶液に氷冷下、ォキザリルクロリド（0. l lmL, 1. 2mmol)を滴下して、室温で 4時間撹拌した後、減圧濃縮した。得られた残渣にスペルミジン (0. 020mL, 0. 12mm ol)を加え、室温で 1時間攪拌した後、水を加え、酢酸ェチルで抽出した。得られた有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧濃縮した。得られた粗抽出物をカラムクロマトグラフィ (ジクロロメタン:メタノーノレ = 20： 1)を用いて精製し、無色油状物として、 Ml— 50 (75mg, 23%)を得た。

[0057] 上記 Ml— 50の核磁気共鳴 NMR)スペクトル、質量分析法（FAB)の各データを以下に示す。

^JH NMR (CDC1 , 300 MHz): δ 0.88 (9Η, t, J = 6.5Hz), 1.27—1.80 (72H, m), 1.99—2

3

.01 (12H, m), 2.14-2.36 (6H, m), 3.11-3.42 (8H, m), 5.28-5.40 (6H, m).

LRMS (FAB) m/z 939 (MH⁺). HRMS (FAB) calcd for C H N O , 938.9017; found,

61 116 3 3

938.9005.

[0058] [1. 7] MI— 52の合成

MI— 52、即ち、 N¹— { (Z)—3—オタタデックー 9 エノイノレー N [ (Z)—4—オタタデックー 9—エノィル一 N— { (Z)—3—ォクタデック 9—エノィルァミノプロピル } アミノブチル]—ァミノプロピル } - (Z)— 9—ォクタデセンアミド（N¹- {(Z)- 3- Octadec - 9- enoyl- N- [(Z)- 4- octadec- 9- enoyl- N- {(Z)- 3- octadec- 9- enoylaminopropyl}- amino butyl]— aminopropyl}— (Z)— 9— octadecenamideノを下の方法により合成し 7こ。

[0059] Ml— 45の合成と同様に、ォレイン酸（lOOmg, 0. 35mmol)の無水メチレンクロリド溶液に氷冷下、ォキザリルクロリド（0. l lmL, 1. 2mmol)を滴下して、室温で 4時間撹拌した後、減圧濃縮した。得られた残渣に N, N¹-ビス（3 ァミノプロピル）— 1 , 4 ブタンジァミン（18. 2mg, 0. 086mmol)を加え、室温で 1時間攪拌した後、水を加え、酢酸ェチルで抽出した。得られた有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧濃縮した。得られた粗抽出物をカラムクロマトグラフィ (ジクロロメタン:メタノール = 20 : 1)を用いて精製し、無色油状物として、 Ml— 52 (71mg, 1 6%)を得た。

[0060] 上記 MI— 52の核磁気共鳴（¹H— NMR)スぺクトル、質量分析法（FAB)の各データを以下に示す。

^JH NMR (CDC1 , 300 MHz): δ 0.88 (12H, t, J = 6.5Hz), 1.27-1.77 (96H, m), 1.99-

3

2.02 (16H, m), 2.16-2.37 (8H, m), 3.14—3.41 (12H, m), 5.28—5.30 (8H, m).

LRMS (FAB) m/z 1260 (MH+). HRMS (FAB) calcd for C H N O , 1260.2048; foun

68 155 4 4

d, 1260.2062.

[0061] [1. 8]MI— 41の合成

MI— 41、即ち、 , ^{9 9}—テトラエチル— 2,8 ジ [8— { (2S*， 3R*)— 3—ォクチルーォキシラ-ル }ーォクチル]ノナンジアミド（N^N^N^N⁹- Tetraethy卜 2,8- di[8- {(2S*, 3R*)- 3- octy卜 oxiranyl}- octyl]nonanediamide)を以下の方法により合成した。

[0062] 前記 Ml— 39 (50mg, 0. 064mmol)のジクロロメタン溶液（3mL)に、氷冷下、 m クロ口過安息香酸（28mg, 0. 13mm o l)をカ卩えて、室温で 3時間撹拌した。次に、飽和チォ硫酸ナトリウム水溶液を加えて、有機層を分別し、水層をジクロロメタンで抽出した。混合有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧濃縮した。得られた粗抽出物をカラムクロマトグラフィ (n—へキサン:酢酸ェチル = 3 : 1)を用いて精製し、白色固体として、 MI-41 (39mg, 76%)を得た。

[0063] 上記 MI— 41の核磁気共鳴（¹H— NMR)スぺクトル、質量分析法（FAB)の各データを以下に示す。

1H NMR (CDC1 , 300 MHz): δ 0.88 (6Η, t, J = 6.4 Hz), 1.08-1.64 (78H, m), 2.44-

3

2.53 (2H, m), 2.89 (4H, brs), 3.36 (8H, q, J = 7.2 Hz).

LRMS (FAB) m/z 776 (MH⁺). HRMS (FAB) calcd for C H N O , 775.7292; found, 7 75.7323.

[0064] [1. 9] MI— 42の合成

MI— 42、即ち、 , , ², ² テトラエチル— 2,11 ジ [8— { (2S*， 3R*)— 3— ォクチルーォキシラ-ル }—ォクチル]ドデカンジアミド（ ,^, ^{2 2}- Tetraethy卜 2,1 l-di[8-{(2S*, 3R*)- 3- octyト oxiranyl)- octyl]dodecanediamide)を以下の方法により合成した。

[0065] 前記 Ml— 40 (30mg, 0. 038mmol)のジクロロメタン溶液に、氷冷下、 m—クロ口過安息香酸（21mg, 0. 095mm o l)をカ卩えて、室温で 3時間撹拌した。次に、飽和チォ硫酸ナトリウム水溶液を加えて、有機層を分別し、水層をジクロロメタンで抽出した。混合有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧濃縮した。得られた粗抽出物をカラムクロマトグラフィ (n—へキサン:酢酸ェチル =4 : 1)を用いて精製し、無色油状物として、 MI-42 (25mg, 81%)を得た。

[0066] 上記 Ml— 42の核磁気共鳴 NMR)スペクトル、質量分析法（FAB)の各データを以下に示す。

^JH NMR (CDC1 , 300 MHz): δ 0.88 (6Η, t, J = 6.4 Hz), 1.08-1.64 (80H, m), 2.45-

3

2.53 (2H, m), 2.89 (4H, brs), 3.36 (8H, q, J = 7.2 Hz).

LRMS (FAB) m/z 818 (MH⁺). HRMS (FAB) calcd for C H N O , 817.7761; found,

52 101 2 4

817.7729.

[0067] [1. 10]MI— 47の合成

MI— 47、即ち、 N¹— [3— {8— [ (2S*, 3R*)—3—ォクチル—ォキシラエル]—ォクタノィルアミノ}—プロピル] {8— (2S*, 3R*)— 3—ォクチルーォキシラ-ル }オタタンアミド（N¹- [3- {8- [(2S*， 3R*)-3-Octyl-oxiranyl]-octanoylamino}-propyl]-{8-(2S*, 3R*) -3-octyl-oxiranyl}octanamide)を以下の方法により合成した。

[0068] 前記 Ml— 45 (60mg, 0. lOmmol)のジクロロメタン溶液に、氷冷下、 m—クロ口過安息香酸（lOOmg, 0. 45mm o l)をカ卩えて、室温で 3時間撹拌した。次に、飽和チォ硫酸ナトリウム水溶液を加えて、有機層を分別し、水層をジクロロメタンで抽出した。混合有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧濃縮した。得られた粗抽出物をカラムクロマトグラフィ (酢酸ェチル)を用いて精製し、無色油状物として、 MI— 47 (60mg, 94%)を得た。

[0069] 上記 MI— 47の核磁気共鳴 NMR)スペクトル、質量分析法（FAB)の各データを以下に示す。

1H NMR (CDC1 , 300 MHz): δ 0.88 (6Η, t, J = 6.5Hz), 1.25—1.76 (54H, m), 2.20 (4

3

H, t, J = 7.5Hz), 3.01 (4H, brs), 3.27 (4H, q, J = 6.4Hz), 6.49 (2H, brs).

LRMS (FAB) m/z 636 (MH⁺). HRMS (FAB) calcd for C H N O , 635.5727; found, 6

39 75 2 4

35.5726.

[0070] [1. 11] MI— 48の合成

MI— 48、即ち、 N¹— [5— {8— [ (2S*, 3R*)—3—ォクチル—ォキシラエル]—ォクタノィルアミノ}—ペンチル]— {8— (2S*, 3R*)—3—ォクチル一ォキシラ-ル }オタタンアミド（N¹— [5— {8— [(2S*， 3R*)-3-Octyl-oxiranyl]-octanoylamino}-pentyl]-{8-(2S*, 3 R*) -3-octyl-oxiranyl}octanamide)を以下の方法により合成した。

[0071] 前記 Ml— 46 (63mg, 0. lOmmol)のジクロロメタン溶液に、氷冷下、 m—クロ口過安息香酸（78mg, 0. 35mm o l)をカ卩えて、室温で 3時間撹拌した。次に、飽和チォ硫酸ナトリウム水溶液を加えて、有機層を分別し、水層をジクロロメタンで抽出した。混合有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧濃縮した。得られた粗抽出物をカラムクロマトグラフィ (ジクロロメタン:メタノール = 20： 1)を用いて精製し、無色油状物として、 MI— 48 (66mg, 99%)を得た。

[0072] 上記 Ml— 48の核磁気共鳴 NMR)スペクトル、質量分析法（FAB)の各データを以下に示す。

1H NMR (CDC1 , 300 MHz): δ 0.88 (6Η, t, J = 6.5Hz), 1.25—1.73 (58H, m), 2.17 (4

3

H, t, J = 7.5Hz), 2.90 (4H, brs), 3.24 (4H, q, J = 6.4Hz), 5.70 (2H, brs).

LRMS (FAB) m/z 664 (MH⁺). HRMS (FAB) calcd for C H N O , 663.6040; found, 6

41 79 2 4

60.6050.

[0073] [1. 12]MI— 51の合成

MI— 51、即ち、 N¹— {3— [8— { (2S*， 3R*)— 3 ォクチルォキシラ-ル } -ォクタノィル] N— [4— {8 [ (2S*, 3R*)—3—ォクチルーォキシラエル] オタタノィルァミノ }—ブチル]—ァミノプロピル }— {8— (2S*, 3R*)—3—ォクチル一ォキシラ -ル }オクタンアミド（N¹- {3- [8- {(2S*， 3R*)-3-Octyl-oxiranyl}-octanoyl]-N-[4-{8-[(2S* , 3Rノ一 3— octyト oxiranyl]— octanoylamino}— butyl]— aminopropyl}— {8— (2S , 3R*)— 3— octyl -oxiranylloctanamide)を以下の方法により合成した。

[0074] 前記 MI— 50 (36mg, 0. 038mmol)のジクロロメタン溶液に、氷冷下、 m—クロ口過安息香酸（30mg, 0. 19mm o l)をカ卩えて、室温で 3時間撹拌した。次に、飽和チォ硫酸ナトリウム水溶液を加えて、有機層を分別し、水層をジクロロメタンで抽出した。混合有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧濃縮した。得られた粗抽出物をカラムクロマトグラフィ (ジクロロメタン:メタノール = 20： 1)を用いて精製し、無色油状物として、 MI- 51 (38mg, 100%)を得た。

[0075] 上記 MI— 51の核磁気共鳴（¹H— NMR)スぺクトル、質量分析法（FAB)の各データを以下に示す。

^JH NMR (CDCl , 300 MHz): δ 0.88 (9Η, t, J = 6.5Hz), 1.26-1.77 (84H, m), 2.14—2

3

.36 (6H, m), 2.89-2.91 (6H, m), 3.07-3.42 (8H, m), 5.31 (1H, brs), 6.88 (1H, brs). LRMS (FAB) m/z 987 (MH⁺). HRMS (FAB) calcd for C H N O , 986.8864; found,

61 116 3 6

986.8820.

[0076] [1. 13]MI— 53の合成

MI— 53、即ち、 N¹—（3— { [8— { (2S*， 3R*)—3—ォクチル—ォキシラ-ル }—ォクタノィル] - [4— ({8- [ (2S*, 3R*)—3—ォクチル一ォキシラエル] オタタノィル } -N- {3- [8- { (2S*, 3R*)— 3—ォクチルーォキシラ-ル }—オタタノィルァミノ] —プロピル }—ァミノ）一ブチノレ]—アミノ}—プロピル） 8 { (2S*, 3R*)—3—オタチルォキシラ-ル }オクタンアミド（N¹- (3- {[8- {(2S*， 3R*)-3-Octyl-oxiranyl}-octanoy l]-[4-({8-[(2S*, 3R*)-3-octyl-oxiranyl]-octanoyl}-N-{3-[8-{(2S*, 3R*)— 3— octyト oxira nylト octanoylamino]- propyl}- amino)- butyl]- amino}- propyl)- 8- {(2¾ , 3R, - 3- octyト o xiranylloctanamide)を以下の方法により合成した。

[0077] 前記 MI— 52 (36mg, 0. 029mmol)のジクロロメタン溶液に、氷冷下、 m—クロ口過安息香酸（32mg, 0. 14mm o l)をカ卩えて、室温で 3時間撹拌した。次に、飽和チォ硫酸ナトリウム水溶液を加えて、有機層を分別し、水層をジクロロメタンで抽出した。混合有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧濃縮した。得られた粗抽出物をカラムクロマトグラフィ (ジクロロメタン:メタノール = 20： 1)を用いて精製し、無色油状物として、 MI- 53 (36mg, 94%)を得た。

[0078] 上記 MI— 53の核磁気共鳴（¹H— NMR)スぺクトル、質量分析法（FAB)の各データを以下に示す。

1H NMR (CDC1 , 300 MHz): δ 0.88 (12H, t, J = 6.5Hz), 1.11-1.77 (112H, m), 2.15

3

-2.66 (8H, m), 3.01—3.02 (8H, m), 3.09—3.41 (12H, m), 6.81 (1H, brs), 6.93 (1H, br s).

LRMS (FAB) m/z 1324 (MH+). HRMS (FAB) calcd for C H N O , 1324.1845; foun

82 155 4 8

d, 1324.1849.

[0079] 〔実施例 2：上記多量体型ォレアミド誘導体のコネキシン 26特異的阻害〕

次に、上記方法により合成した各ォレアミド誘導体について、各誘導体によるコネキシン 26阻害の有無 (換言すれば、コネキシン 26によって構成されるギャップ結合を介した細胞間物質輸送の阻害の有無)を検討した。実験方法は、国際公開 WO2004 Z060398号公報に記載の方法と同様であり、色素—トランスファーアツセィにより各被検物質の GJICスコア (ギャップ結合細胞間コミュニケーション値)を評価した。

[0080] [2. 1]細胞株と細胞培養

上記公報に記載の方法と同様に、実験にはヒト子宫頸部偏平上皮癌細胞 (HeLa 細胞）を使用した。より具体的には、ラットコネキシン 26 (Cx26)を安定して発現する HeLa細胞サブクローン（HeLa— Cx26)、および、ラットコネキシン 43 (Cx43)を安定して発現する HeLa細胞サブクローン (HeLa— Cx43)を使用した。すべての細胞 (後述の実施例で使用した細胞を含む）は、ダルベッコ改変イーグル培地 (DMEM) 中で、 10%ゥシ胎仔血清 (FCS)を加えて培養した。

[0081] [2. 2]色素トランスファーアツセィ

アツセィの前日、 1¾1^ーじ 26細胞ぉょび1¾1^ーじ 43細胞をそれぞれ別個に、 10%FCS含有 DMEM中に懸濁させた。そして、いずれの細胞もドナー細胞用と、レシピエント細胞用とに分けて培養した。レシピエント細胞は、直径 3cmの培養皿で培養し、アツセィ時にほぼコンフルェントな単層を形成するように、調節された。

[0082] アツセィにおいてはまず、ドナー細胞の培養液に力ルセイン (ギャップ結合透過性）および Dil (ギャップ結合非透過性）の両色素をそれぞれ 10 /ζ Μ、 2 Μ添加し、 1時間インキュベートした。 2重標識ドナー細胞は、トリプシン処理し、リン酸緩衝溶液で 3 回洗浄した。その後、各単一のドナー細胞を、標識ィ匕されていないレシピエント細胞上に静かに載置した。ドナー細胞が単層に定着するには 1時間を要した。そして、約 1. 5時間で色素カップリングを示し始め、ギャップ結合を介したドナー細胞力隣接レシピエント細胞への色素移動が観察された。

[0083] 色素カップリングに対する各被検物質の阻害活性を評価するために、ドナー細胞培養 1時間後、ォレアミドおよび上記多量体型ォレアミド誘導体をそれぞれエタノールに溶解し、各培養皿に対して 10 レ終濃度 20 Μとなるよう添加した。また、コントロールとして、エタノールを 1000倍希釈して培養皿に添カ卩した。それから 1時間後、各培養皿を共焦点走査顕微鏡 (LSM510)により観察した。図 2は、こうして観察された顕微鏡写真の一例を示す。

[0084] 図中、 *印で示されるドナー細胞は、力ルセイン (緑色蛍光）および Dil (赤色蛍光）を両方含むため、原図では黄色に表示される。また、色素カップリングにより、ギヤップ結合透過性の力ルセインがギャップ結合を介してレシピエント細胞に色素移動すると、当該細胞は緑色に表示される。このようなアツセィにより、各被検物質の GJICスコアは、次のように評価される。

[0085] すなわち、ドナー細胞が色素カップリングしなければ「0」、ドナー細胞から隣接レシピエント細胞に色素カップリングすれば「1」、このレシピエント細胞に移動した力ルセインが、上記ドナー細胞から離れる方向の次の隣接細胞に移動すれば「2」、さらに上記ドナー細胞力離れた 3番目の隣接細胞に移動すれば「3」、 · · ·というように評価する。また、中間レベルとして、図中矢印に示すように、細胞染色の程度を 0. 2 5、 0. 5、 0. 75、 1. 0の 4段階に評価した。

[0086] このようなアツセィを 3回繰り返し行い、各被検物質について、少なくとも 30個のドナ一細胞を使用して評価を行った。そして、各被検物質の GJICスコアの平均値、標準偏差を算出した。図 3は、このアツセィ結果を示すグラフであり、各ォレアミド誘導体の GJICスコアが示される。グラフ中、黒色のバーはコネキシン 26を介した GJICスコア、灰色のバーはコネキシン 43を介した GJICスコア、である。コネキシン 26を介した GJI cスコアについて、実験に供された二量体型ォレアミド誘導体はすべて、ォレアミドと同程度またはそれより低い値を示し、コネキシン 26阻害活性を有することが認められた。

[0087] 3量体型ォレアミド誘導体（Ml— 50· Ml— 51)、および、 4量体型ォレアミド誘導体

(MI- 52 -MI- 53)についても、コントロールと比較してコネキシン 26阻害活性を有することが、上記アツセィ時に目視で観察された。

[0088] 上記アツセィにより、強いコネキシン 26阻害活性が認められた 3つの二量体型ォレアミド誘導体（Ml— 22·ΜΙ— 39 ·ΜΙ— 45)は、図に示すように、コネキシン 43阻害活性を示さな力つた。すなわち、これらのォレアミド誘導体は、コネキシン 26を特異的に阻害し、コネキシン 43は阻害しなかった。このように、コネキシン 43は阻害せずに、コネキシン 26を特異的に阻害するという性質の点で、上記 3つのォレアミド誘導体のうち Ml— 22が最も良好な結果を示したため、以下ではこの Ml - 22を使用して解析を行った。

[0089] 〔実施例 3：上記 Ml— 22による癌の自然転移阻害〕

上記のようにコネキシン 26阻害活性を有する Ml— 22が、実際に動物個体にお!、て癌の自然転移を抑制するかどうかを以下の実験により検討した。

[0090] [3. 1]方法

実験は、国際公開 WO2004Z060398号公報に記載の方法と同様に行った。すなわち、 1 X 10⁵個の BL6細胞（B16マウスメラノーマ細胞の亜株）を 4週齢の C57BL Z6マウスの足底部皮下に接種した後、マウスを次の 2群に分けた。

1 ) Ml— 22投与群： Ml— 22 ( 1 Omg)をォリーブ油（ 1 OmL)に溶解したものをマウスの体重 lgあたり O.OlmLとなるよう 1日 1回（約 0.2mLずつ）、連日腹腔内注射したマウス群。

2)無処置 (Nt)群：注射による薬剤投与 ·処置を何も行わな力つたマウス群。

[0091] 上記の処置を BL6細胞接種の翌日より連日行ヽ、接種部に形成された腫瘤が径約 7mmに成長した時点で、膝関節切断により足を切除した。この 2日後まで上記の処置を行い、その後は無処置でマウスを飼育する。膝関節切断後 4週間でマウスを安楽死させ、左右両肺の胸膜表面に形成された転移結節 (肺への転移巣の数)を肉眼的に数えた。なお、各群マウス 15匹で評価を行った。

[0092] [3. 2]結果

上記実験結果を、図 4および図 5に示す。図 4のグラフ縦軸は肺への転移巣の数を示し、 Ml— 22投与群は、無処置 (Nt)群と比較して、転移巣の数が 80%減少し、 Ml —22が癌の自然転移を顕著に阻害 '抑制することが示された。

[0093] 図 5には、 Ml— 22投与群および無処置 (Nt)群の各マウス力も摘出された肺の写真などが示される。すなわち、パネル上段は癌の自然転移が生じていない肺とそのマウスの数を、パネル中段はやや自然転移が見られた肺とそのマウスの数を、パネル下段は自然転移が多く見られた肺とそのマウスの数を、それぞれ示す。無処置 (Nt) 群では、癌の自然転移が生じて！/、な！、肺、やや自然転移が見られた肺、自然転移が多く見られた肺の数がそれぞれ 2, 8, 5匹であるのに対して、 Ml— 22投与群では 7, 6, 2匹である。この結果力もも、 Ml— 22は癌の自然転移を強力に阻害 ·抑制することが認められた。

[0094] また、上記実験において、 Ml— 22を毎日投与しても、癌の自然転移以外の原因で死亡したマウスは皆無であり、 Ml— 22は、安全性が極めて高い物質である。したがつて、 Ml— 22は、副作用の少ない癌転移抑制剤 (抗癌転移薬）として利用可能と考えられる。

[0095] [3. 3]細胞毒性実験

Ml— 22の細胞毒性 (細胞増殖阻害能）を調べるため、直径 3. 5cmのシャーレに、ヒト胃がん細胞である Az521細胞を約 1 X 10⁵個撒き、 Ml— 22存在下または非存在下（control)で培養を行った。培養を開始して 6, 12, 24, 36, 48時間経過した後、おのおのトリプシン— EDTAで細胞をはがし、遠心後 10%FBSを含む DMEMに細胞を溶解させ、この細胞溶解液 10 Lに、トリパンブルーを 10 Lカ卩え、計算板で細胞数をカウントした。その結果を図 6のグラフに示す。縦軸は細胞数、横軸は時間である。 3回の実験の平均を示す。

[0096] 同図に示すように、 Ml— 22とコントロールとの間に有意差はなぐ Ml— 22の細胞毒性 (細胞増殖阻害能）は認められな力つた。

[0097] 〔実施例 4：上記 Ml— 22による癌の増殖抑制〕ヌードマウスの背中皮下にヒト胃がん細胞である Az521細胞を移植し、 Ml— 22腹腔投与による癌増殖抑制効果 (抗腫瘍効果)について検討を行った。より具体的には、 4週齢の BALBZcヌードマウス（nuZnu)の背中に、 1— 2 X 10⁵個の Az521細胞を皮下注射した。この皮下移植 3日前に、 MI— 22 (10mg)をォリーブ油（10mL)に溶解したものをヌードマウスに 0. lmL腹腔内注射した。皮下移植後は、週 2回の割合で Ml— 22を同様に腹腔内投与した。コントロールのマウス群には、注射による薬剤投与 ·処置を何も行わな力た。

[0098] 皮下移植後に形成される腫瘍の大きさを観察し、 Ml— 22の抗腫瘍効果は、腫瘍重量を経時的に測定することで評価した。その結果を図 7のグラフに示す。縦軸は腫瘍重量 (mg)、横軸は皮下移植後の日数である。 3匹のヌードマウスについて 6つの腫瘍の平均値を示す。

[0099] 同図に示すように、 Ml— 22を投与したマウスでは、コントロールのマウス群と比較して腫瘍の増大が顕著に抑制され、 Ml— 22による抗腫瘍効果が認められた。

[0100] 図 8は、上記と同様の実験方法で、ヒト胃がん細胞である Az521細胞が皮下移植されたヌードマウスに対して Ml— 22を腹腔内投与し、その抗腫瘍効果を検討した結果である。同図に示すように、 Ml— 22を投与したマウスでは、無処置のマウス群（NT) と比較して腫瘍体積の肥大化が顕著に抑制され、 Ml— 22による抗腫瘍効果が認められた。

[0101] これらの結果は、 Ml— 22が従来の抗癌剤には無い際立って優れた特徴を有することを示している。すなわち、従来開発されてきた抗癌剤の殆どは「正常細胞より増殖能力の高、癌細胞の増殖を優先的に阻害する」特徴を利用したものである。これらは正常細胞に対しても増殖阻害を示すため必然的に細胞毒性を持ち、これが抗癌剤の副作用の原因となるという欠点は免れなかった。これに対して、 Ml— 22はシャーレで培養した正常細胞および癌細胞に対しては細胞毒性 (細胞増殖阻害能)を全く示さないにもかかわらず、生体内（ここでは野生マウスおよびヌードマウス）に移植した癌細胞には細胞増殖阻害作用を示したのである。この特徴は、 Ml— 22が極めて高 V、新規性を持つこれまでに前例の無、新、タイプの抗癌剤であることを示して!/、る産業上の利用可能性

以上のように、本発明は、コネキシン 26阻害活性を有する多量体型ォレアミド誘導体に関するものであり、これらの新規ォレアミド誘導体は、研究用試薬として利用できるほか、癌の転移抑制 ·増殖抑制など有用な生理活性を示すことから、癌の予防薬' 治療薬をはじめとして、医薬、サプリメント、機能性食品などの各種用途を有し、産業上広く利用できるものである。