WO2006043586A1

WO2006043586A1 - 細胞遊走活性測定法

Info

Publication number: WO2006043586A1
Application number: PCT/JP2005/019187
Authority: WO
Inventors: Shiro Shibayama; Kazuhiko Takeda; Noriki Watanabe; Tetsuya Sugiyama
Original assignee: Ono Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Ono Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2004-10-20
Filing date: 2005-10-19
Publication date: 2006-04-27
Anticipated expiration: 2007-04-20

Abstract

［課題］　本発明は、ｉｎ　ｖｉｖｏにおいて特定の細胞遊走誘導物質の作用に対応する細胞遊走を測定する方法ならびに当該方法を用いることによる細胞遊走抑制化合物の評価法および当該化合物の製造方法に関する。［解決手段］　本発明の方法を使用することにより、ｉｎ　ｖｉｖｏにおいて特定の細胞遊走誘導物質の作用に対応した細胞遊走を測定することが可能となり、特異性あるいは選択性を有する細胞遊走抑制化合物のｉｎ　ｖｉｖｏにおける作用評価が可能となった。

Description

明細書

細胞遊走活性測定法

技術分野

[0001] 本発明は、細胞遊走活性測定法に関する。さらに詳しく言えば、本発明は、 in viv oにお 1、て、特定の細胞遊走誘導物質に対応する細胞遊走活性を測定する方法ならびに当該方法を用いることによる細胞遊走抑制化合物の評価法および当該化合物の製造方法に関する。

背景技術

[0002] 組織炎症部位では非常に多種類の細胞遊走誘導物質 (ケモカインやサイト力イン等）が産生されている。さらに当該炎症の発症や増悪には、当該細胞遊走誘導物質により誘引される免疫担当細胞の関与が知られている。

[0003] 当該免疫担当細胞の遊走を評価する方法として、従来用いられている air— pouch

(空気のう）モデルは、 LPSや力ラゲニン等の炎症惹起剤を空気のう内に注入することにより炎症を惹起し、内在性の好中球やマクロファージ等を空気のう内に集積させるモデルとして知られている（非特許文献 1、 2、および 3)。

[0004] 非特許文献 1 :ガルシアラマ口，ィー（Garcia-Ramallo,E) ,ジャーナル'ォブ'ィムノロジー（Journal of lmmunology) , 2002年， 169卷，第 11号， p.6467- 6473。

[0005] 非特許文献 2：ナカムラ，ェイチ（Nakamura,H) ,プロシーディングス ·ォブ ·ザ ·ナショナル ·ァカデミ一 ·ォブ ·サイエンス ·ォブ ·ジ ·ユナイテッド ·ステイツ ·ォブ ·アメリカ（Pr oceedings of the National Academy of Sciences or the United States of America.ノ , 2

001年, 98卷,第 26号， P.15143- 15148。

[0006] 非特許文献 3：マックコール，エスアール (McColl.SR) ,ジャーナル'ォブ 'ィムノロジ

― (Journal of Immunology) , 1999年， 163卷，第 5号， ρ.2829- 2835)。

[0007] 一方、特定の細胞遊走誘導物質を優位に産生する細胞を空気のうに移入すること

、当該細胞遊走誘導物質に誘引され得る細胞を任意に選択し、外部から必要数移入することによる空気のうモデルは、全く知られて、な!/、。

発明の開示発明が解決しょうとする課題

[0008] 細胞遊走を測定する方法として、従来用いられて!/ヽる空気のうモデルは、 LPSや力ラゲニン等の炎症惹起剤を空気のう内に注入することにより、炎症を惹起させるモデルである。当該方法において遊走されてくる細胞は、好中球やマクロファージが主であり、特定の細胞遊走誘導物質に一対一の対応関係にある細胞の遊走作用を測定することは困難であった。そこで、当該課題を解決することができる評価モデルの開発が望まれていた。

課題を解決するための手段

[0009] 本発明者らは、従来用いられている空気のうモデルの課題を解決すベぐ鋭意研究した結果、特定の細胞遊走誘導物質を優位に産生する細胞を空気のうに移入すること、当該細胞遊走誘導物質に誘引され得る細胞を任意に選択し、外部から必要数移入することにより、この課題を解決することを見出し、本発明を完成した。

[0010] すなわち、本発明は、

[1] (1)哺乳動物の皮下に作製した空気のうに細胞遊走誘導物質を産生する細胞を移入する工程、 (2)哺乳動物の当該空気のう以外の部位に被測定細胞を移入する工程、（3)当該空気のう内の細胞を回収する工程、および (4)工程 (3)で回収された細胞のうち当該被測定細胞数を測定する工程力なる細胞遊走活性測定法、

[2] (1)被験化合物またはその対照媒体を別々の哺乳動物に投与する工程、（2)哺乳動物の皮下に作製した空気のうに細胞遊走誘導物質を産生する細胞を移入する工程、（3)哺乳動物の当該空気のう以外の部位に被測定細胞を移入する工程、（4) 当該空気のう内の細胞を回収する工程、 (5)工程 (4)で回収された細胞のうち当該被測定細胞数を測定する工程、および (6)対照媒体が投与された哺乳動物の空気のう中の被測定細胞数に対する、被験化合物を投与した哺乳動物の空気のう中の被測定細胞数を比較する工程力なる被験化合物の細胞遊走抑制活性の評価法、 [3]前記 [2]記載の細胞遊走活性の評価法を用いて細胞遊走抑制活性を有する物質を選択する工程、および、前記工程によって選択された物質を化学合成する工程を含むことを特徴とする細胞遊走抑制物質の製造方法、

[4]細胞遊走誘導物質を産生する細胞が、細胞遊走誘導物質を産生するよう遺伝子導入または遺伝子改変された細胞である前記 [ 1 ]乃至 [3]記載の方法、

[5]細胞遊走誘導物質が、ケモカインまたはサイト力インである前記 [ 1 ]乃至 [3]記載の方法、

[6]ケモカインが、 1— 309、 MCP— 1、 MIP - 1 a、 MIP— 1 a P、 MIP— 1 β、 RA NTESゝ MRP—1、 MCP— 3、 MCP— 2、 MIP— 1 γ、ェォタキシン、 MCP— 5、 M CP— 4、 MCIF、 MIP - 1 δ、 NCC -4/LEC, TARC、 MIP— 4、 MIP— 3 j8、 M IP— 3 a、 SLC、 MDC、 MIP— 3、ェォタキシン一 2、 TECK、ェォタキシン一 3、スキン力イン、 MEC、 NAP— 3、 MIP— 2 a、 MIP— 2 j8、 Cinc2、 CXCL4、 CXCL4 VI、 ENA— 78、 CKA— 3、 PPBP、 PPBPL1、 IL— 8、 MIG、 IP— 10、 I— TAC、 SDF - 1 a、 SDF— 1 β、 BCA— 1、 MIP— 2 γ、ラング力イン、 SR— PSOX、 NAP —4、ニューロタクチン、ミドカイン、 SCYC1、および SCYC2から選択される 1種以上である前記 [5]記載の方法、

[7]ケモカインが、 SDF - l a、 SDF- l jS、 TARC、または MDCである前記 [5]記載の方法、

[8]被測定細胞が、 T細胞、 B細胞、単球、マクロファージ、または顆粒球細胞である前記 [ 1]乃至 [3]記載の方法、

[9]T細胞力 CD4陽性 T細胞または CD8陽性 T細胞であるである前記 [8]記載の方法、

[ 10]Τ細胞力 Thl様分ィ匕細胞または Th2様分ィ匕細胞である前記 [8]記載の方法

[ 11 ]ケモカインおよび Zまたは被測定細胞がヒト由来であって、哺乳動物が免疫不全哺乳動物である前記 [5]記載の方法、

[ 12]哺乳動物が、マウスである前記 [ 1]乃至 [3]記載の方法、および

[ 13]ケモカインおよび Zまたは被測定細胞がヒト由来であって、哺乳動物がマウスである前記 [5]記載の方法に関する。

本明細書中、哺乳動物とは、例えば、マウス、ラット、モルモット、サル等が挙げられる力好ましくはマウスである。当該マウスは、被測定細胞の由来となるマウスと同種のハプロタイプを有するマウスが好まし、。 [0012] 本明細書中、被測定細胞が、ヒト由来である場合には、免疫不全哺乳動物であることが好ましい。免疫不全哺乳動物としてはマウス、ラット等が挙げられる。免疫不全マウスとしては、マウスヌードマウス、スキッドマウス、 ALYマウス等が挙げられる。

[0013] 本明細書中、哺乳動物の皮下に作製した空気のうは、本発明の方法を実施する数日前に哺乳動物の皮下にシリンジ等で空気を注入することによって作製することができる。当該哺乳動物の背部に作製するのが好ましい。

[0014] 本明細書中、細胞遊走活性測定法においては、（1)の工程と（2)の工程の順序は任意であるが、（1)の工程および（2)の工程の順に行われるのが好ましぐついで（3 )および (4)の工程が行われる。（2)の工程は、（1)の工程を行って力も約 1時間後に行うことが好ましぐさらに、 9時間後に（3)の工程が行われるのが好ましい。

[0015] 本明細書中、被験化合物の細胞遊走抑制活性の評価法においては、（1)の工程乃至（3)の工程の順序は任意である力 (1)の工程乃至（3)の工程の順に行われるのが好ましぐついで (4)乃至（6)の工程の順で行われる。（2)の工程は、（1)の工程を行ってから 30分後に行うことが好ましぐ以後の工程は上記方法に対応する工程の間隔で行われるのが好まし、。

[0016] 当該評価法は、複数の個々の被験化合物の集団から、細胞遊走抑制化合物を選別する場合にぉ、ても用いることができる。

[0017] 本明細書中、本発明の評価方法で評価される被験化合物としては、化学合成化合物、ペプチド、非ペプチド性化合物、タンパク質、発酵生産物、細胞抽出物、植物抽出物、動物組織抽出物またはそれらの誘導体もしくは修飾体が挙げられ、これら化合物は新規な化合物であってもよいし、公知の化合物であってもよい。被験化合物として好ましくは、化学合成化合物である。

[0018] 被験化合物は塩を形成していてもよぐ生理学的に許容される塩が用いられる。被験化合物の塩としては、アルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩、アンモ-ゥム塩、アミン塩、酸付加塩等が挙げられる。

[0019] 塩は、水溶性のものが好ましい。適当な塩としては、アルカリ金属（カリウム、ナトリウム等）の塩、アルカリ土類金属（カルシウム、マグネシウム等）の塩、アンモ-ゥム塩、薬学的に許容される有機アミン (テトラメチルアンモ-ゥム、トリェチルァミン、メチルァミン、ジメチルァミン、シクロペンチルァミン、ベンジルァミン、フエネチルァミン、ピペリジン、モノエタノールァミン、ジエタノールァミン、トリス（ヒドロキシメチル）ァミノメタン、リジン、アルギニン、 N—メチルー D—グルカミン等）の塩が挙げられる。

[0020] 酸付加塩は水溶性であることが好ま、。適当な酸付加塩としては、例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、硫酸塩、リン酸塩、硝酸塩のような無機酸塩、または酢酸塩、乳酸塩、酒石酸塩、安息香酸塩、クェン酸塩、メタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、トルエンスルホン酸塩、イセチオン酸塩、グルクロン酸塩、ダルコン酸塩のような有機酸塩が挙げられる。

[0021] 本明細書中、被験化合物の対照媒体とは、動物に経口又は非経口投与可能な溶媒であって、被験化合物を溶解あるいは懸濁させることができるものであればよい。経口投与の場合、蒸留水、生理食塩水、メチルセルロース（MC)水溶液、カルボキシメチルセルロース（CMC)水溶液、ショ糖脂肪酸エステル (DKエステル)水溶液等が挙げられる。

[0022] 本明細書中、細胞遊走誘導物質とは、本発明に係る被測定細胞の遊走を誘引しえる物質であって、空気のうに移入した細胞から一過的に、断続的に、継続的に、あるいは持続的に産生されるものである。当該細胞遊走誘導物質は、低分子化合物であつても、タンパク質であってもよい。タンパク質である場合には、いずれの哺乳動物由来のものであってもよぐ内因性あるいは導入あるいは改変された遺伝子由来のタンノク質であってもよヽ。導入ある、は改変された遺伝子由来のタンパク質である場合には、同等の細胞遊走誘導活性を有する限り、他のタンパク質と融合された形態で発現されるものであってもよい。融合に適当な他のタンパク質としては、例えば、タンデムヒスチジン（6xHis)、免疫グロブリン定常部の Fc断片、 GST (ダルタチオン ' S 'トランスフェラーゼ)等が挙げられる。これらは、大量生産後の精製作業を有利にでき、また、融合タンパク質の溶解度を増加でき、さらに、立体配座を安定させる効果を期待することができる。

[0023] また、当該タンパク質としては、例えば、当該タンパク質の GenBankもしくは RefSe qに掲載される遺伝子から翻訳されるアミノ酸配列、または SwissProt、 PIR、 PRF、もしくは PDBに掲載されるタンパク質のアクセス番号に係るアミノ酸配列力なるもの以外に、実質的に同等の活性を有する限り、その一部のアミノ酸 (好ましくは 1〜10 個、より好ましくは 1〜5個）が欠失したもの、任意のアミノ酸と置換したもの、そのアミノ酸配列の数力所 (好ましくは 1〜10力所、より好ましくは 1〜5力所）に任意のアミノ酸が付加または挿入されたもの、およびそれらを組み合わせたアミノ酸配列を含有するものも含まれる。ここで、アミノ酸の欠如、置換、付加、または挿入の位置は特に限定されない。

[0024] 実質的に同等の活性としては、例えば、シグナル情報伝達活性、受容体結合活性等が挙げられる。実質的に同等とは、それらの性質が実質的に (例えば、生理学的に、または薬理学的に）同等であることを示す。したがって、シグナル情報伝達活性または受容体結合活性が同等 (例、約 0.01〜： LOO倍、好ましくは約 0. 1〜10倍、より好ましくは 0. 5〜2倍)であることが好ましいが、これらの活性の程度、タンパク質の分子量等の量的要素は異なって、てもよ、。

[0025] 当該タンパク質として好ましくは、ケモカインまたはサイト力インであり、さらに好ましくはケモカインである。

[0026] 当該ケモカインとしては、例えば、 1-309 (A37236, S 24236, P50229), MCP

-KP13500, Q62401, NP_062078) , MIP- 1 a (P10147, P10855, P50 229) , ΜΙΡ- 1 a Ρ (Β35673, -, ―)、 ΜΙΡ— 1 j8 (P13236, P14097, Ρ5023 0)、 RANTES(P13501, A46539, NP— 112378)、 MRP— 1 (—, P27784, - ), MCP-3(A54678, Q62401, NP_062078) , MCP-2(P80075, Q6240 1, ―)、 MIP— 1γ (-, P51670, ―)、ェォタキシン（Eotaxin) (2208449A, P4 8298, NP— 062078)、 MCP— 5 (P13500, NP— 035461, -), MCP~4(Q9 9616, -, 一）、 MCIF(NP— 116741, -, 一）、 MIP— 1 δ (NP— 116741, -, -), NCC-4/LEC(NP_004581, -, -), TARC(Q92583, NP— 035462 , NP— 476492)、 MIP— 4 (Ρ55774, -, ―)、 MIP— 3j8 (Q99731, 070460, -) , ΜΙΡ-3α (P78556, 089093, P97884)、 SLC(NP— 002980, NP— 07 5539, ―)、 MDC (000626, 088430, ―)、 MIP— 3 (P55773, -, ―)、ェォタキシン— 2 (Eotaxin— 2) (000175, Q9JKC0, ―)、 TECK(015444, NP— 03 3164, ―)、ェォタキシン一 3 (Eotaxin— 3) (NP 006063, -, 一）、スキン力イン (Skinkine) (NP— 006655, NP— 035466, ―)、 MEC(Q9NRJ3, Q9JIL2, NP —446152)、 NAP— 3 (P09341, P10889, S21467) , MIP-2 α (P19875, P 10889, 2022188A), MIP-2j8 (NP— 002081, -, ―)、 Cinc2(— , P10889 , S46198), CXCL4(P02776, NP— 064316, P06765) , CXCL4V1 (P1072 0, -, ―)、 ENA— 78(P80162, A57325, NP— 071550)、 CKA— 3 (P80162 , -, -) , PPBP(P02775, NP— 076274, 2022188A) , PPBPL1 (XP_1162 62, -, —)、 IL— 8 (NP— 000575, -, -), MIG(JN0470, A35766, P4897 3)、 IP— 10(1312356A, NP— 067249, P48973)、 I— TAC (NP— 005400, Q9JHH5, P48973) , SDF- 1 a (NP_954637, 181182, NP— 071513)、 S DF-lj8 (NP— 000600, 181182, NP— 071513)、 BCA— 1 (NP— 006410, -, ―)、 MIP— 2γ (JG0182, NP— 062514, ―)、ラング力イン（Lungkine) (- , NP— 035469, ―)、 SR— PSOX(— , NP— 079673, ―)、 NAP— 4(Ρ19877 , -, ―)、ニューロタクチン（Neurotactin) (NP— 002987, 035188, 055145) 、ミドカイン（Midkine) (P21741, A35305, NP— 110486)、 SCYC1 (P47992, P47993, P51672)、および SCYC2(P47992, -, ―)等力挙げ、られ、好ましく【ま、 MIP-1 a、 MIP— 1 β、 RANTESゝ SDF— 1 a、 SDF— 1 β、 TARC、 SLC、 M IG、 IP— 10、 I— TAC、および MDCであり、さらに好ましくは、 SDF— 1 a、 SDF— 1 β、 TARC、および MDCである。

[0027] 上記ケモカインは、 GenBankもしくは RefSeqに掲載される遺伝子から翻訳されるタンパク質、または SwissProt、 PIR、 PRF、もしくは PDBに掲載されるタンパク質のアクセス番号に係るアミノ酸配列を有するタンパク質として定義される。上記ケモカインの一般的名称に続く括弧書き中の番号は、右からそれぞれヒト、マウス、およびラットの当該一般的名称で表わされるケモカインを定義するタンパク質のアミノ酸配列へのアクセス番号を示し、 " "はその動物種におけるケモカインの存在が確認されていないことを示している。

[0028] 本明細書中、ケモカインおよびサイト力インとしては、被測定細胞に対して遊走活性を有するものであれば、ずれのものであってもよ、。

[0029] 本明細書中、細胞遊走誘導物質を産生する細胞とは、初代継代培養細胞、株化細胞、またはそれらの遺伝子導入細胞もしくは遺伝子導入安定形質転換細胞の何れであってもよい。ただし、 1種または 2種以上の細胞遊走誘導物質を優位に産生する細胞であるのが好ましい。さらに、当該 1種または 2種以上の細胞遊走誘導物質を優位に産生する細胞としては、細胞遊走誘導物質を優位に発現するように遺伝子改変された細胞が好ましヽ。細胞遊走誘導物質を優位に発現するように遺伝子改変された細胞とは、細胞遊走誘導物質の産生に関与するタンパク質をコードする遺伝子が導入された細胞または当該遺伝子が導入された安定形質転換細胞、および細胞遊走誘導物質がタンパク質であって、当該タンパク質をコードする遺伝子が導入された細胞または当該遺伝子が導入された安定形質転換細胞を含む。

[0030] 遺伝子改変によって動物細胞に細胞遊走誘導物質を産生させる際、遺伝子導入のために用いる発現ベクターのプロモーターとしては、動物細胞で機能するものであればいずれでもよい。該プロモーターとしては、例えば、 SV40プロモーター、 LTRプ口モーター、メタロチォインプロモーター、サイトメガロウィルスプロモーター等が挙げられる。発現ベクターには、以上のほかに、ェンハンサー、 RNAスプライシングのシダナル、ポリ A付加のシグナル、選択マーカー等を用いる。発現ベクターを構築する方法自体は公知であり、例えば、モレキュラークローユング (Molecular Cloning),ァラボラトリーマニュアル、コールドスプリングハーバーラボラトリーお Laboratory Ma nual、 Cold Spring HarborLaboratory), 1982年に記載されている。

[0031] 形質転換は、宿主の種類に応じ、公知の方法に従って実施することができる。動物細胞は、例えば、細胞工学別冊 8新細胞工学実験プロトコール，秀潤社， 1995年， p .263-267、ヴイロロジー（Virology) , 1973年， 52卷， 456に記載の方法に従って形質転換することができる。

[0032] 宿主が動物細胞である形質転換体を培養する際、培地としては、たとえば約 5〜20 %の胎児牛血清を含む MEM培地 [サイエンス（Science) , 122卷， 501 (1952)]、 DM EM培地 [ヴイロロジー（Virology) , 1959年， 8卷， 396]、 RPMI 1640培地 [ジャーナル'ォブ'アメリカン'メディカル'アソシエーション (J. Am. Med. Assoc.) , 1967年， 199 卷， 519]、 199培地 [プロシージングス 'ォブ 'ソサイエティ'ォブ'ェクソ 'バイオロジカル'メディシン（Proc. Soc. Exo. Biol. Med.) , 1950年, 73卷， 1]等が挙げられる。 pHは約 6〜8であるのが好ましい。培養は通常約 30〜40°Cで約 15〜60時間行い、必要に応じて通気や撹拌を加える。

[0033] 当該遺伝子の発現ベクターで形質転換された動物細胞を用いて当該蛋白質を安定に発現させる方法としては、細胞遊走誘導物質発現ベクターが導入細胞の染色体に組み込まれる方法と、導入細胞にお!、て当該遺伝子が染色体に組み込まれることなく安定に存在させる方法がある。前者の場合には、例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素 (DHFR)遺伝子等の増幅系 [ジャーナルォブモレキュラーバイオロジー (J. Mol. Biol), 1982年， 159卷， 601]を利用して当該蛋白質の生産量を増大させることができる。

[0034] 形質転換された動物細胞 (クローン)を選択する方法自体は公知であり、例えば、実験医学、臨時増刊号、 1987年， 5卷， 11号に記載されている。具体的には、細胞遊走誘導物質遺伝子と共に選択マーカー遺伝子を指標にして形質転換株を選択する。この場合、選択マーカーを当該遺伝子と同一ベクターに乗せて細胞に導入しても良ぐまた選択マーカーを別のベクターに乗せ、これよりも多量の当該遺伝子をもつベクタ一とともに別のベクターに乗せ、細胞に導入 (co-transformation)しても良い。これらの選択マーカーとしては、例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素 (DHFR) [メトトレキセート（ MTX)耐性]、チミジンキナーゼ、 Ecogpt遺伝子 (ミコフエノール酸耐性)、 neo遺伝子（ G418I¾),ハイグロマイシン Bホスホトランスフェラーゼ遺伝子 (ノヽィグロマイシン B 耐性)等が挙げられる。

[0035] 細胞遊走誘導物質であるタンパク質をコードする遺伝子を導入された細胞または当該遺伝子が導入された安定形質転換細胞としては、当該タンパク質を発現ある、は過剰発現する発現ベクターが遺伝子導入され、一過的にある、は安定的に当該タンパク質を発現し得る細胞である。当該発現ベクターは、公知のもの、市販されているもの、またはそれらを適切にカ卩ェしたものを用いることができる。例えば、 pFLAG -CMV- 5a, b, c (シグマアルドリッチジャパン）、 pcDNA/V5— HisA, B, C、 p EF6/V5-HisA, B, C (インビトロジェン）、および pUC— SR a ZFLAG等が挙げられ、好ましくは pUC— SR a ZFLAGである。細胞への遺伝子導入は、公知の方法で行うことができるが、好ましくは市販されている遺伝子導入用試薬を用いた方法に準じた方法で行うのが好ましい。特に好ましくは、リポフエクシヨン法である。遺伝子導入される細胞としては、例えば、 CHO細胞株、 COS— 7細胞株、 WEHI— 3細胞株、および 293T細胞株が挙げられる力好ましくは 293T細胞株である。

[0036] 本明細書中、空気のうに移入される細胞遊走誘導物質を産生する細胞数は、被測定細胞の遊走が測定可能な程度に十分量の細胞遊走誘導物質量を産生する細胞数であれば足りる。例えば、当該哺乳動物としてマウスを使用する場合には、 lxlO⁷ 個 Zマウスを用いることが好ましい。ただし、当該細胞数は、使用する哺乳動物または細胞遊走誘導物質、または細胞遊走誘導物質を産生する細胞の種類により異なる。

[0037] 本明細書中、被測定細胞とは、本発明に係る細胞遊走誘導物質により遊走されえる細胞であって、移入される哺乳動物と同種のハプロタイプを有する細胞であれば、ずれのものでもよい。好ましくは、免疫担当細胞であるリンパ球 (T細胞、 B細胞、ナチュラルキラー細胞 (NK細胞）、単球、榭上細胞、マクロファージ、または顆粒球細胞（例えば、好中球、好酸球、また好塩基球等）が挙げられる。さらに好ましくは T細胞であり、 CD4陽性 T細胞もしくは CD8陽性 T細胞、特に好ましくは Thl様分ィ匕細胞または Th2様分ィ匕細胞として濃縮された細胞である。

[0038] 本明細書中、被測定細胞の移入とは、被測定細胞を外部から必要数移入することであり、当該空気のうへの細胞遊走が可能な部位であれば何れにぉ、て行ってもよぐ好ましくは、哺乳動物の静脈、さらに好ましくは尾静脈に対して行うのがよい。

[0039] 移入される被測定細胞数は、空気のうへの遊走細胞が測定可能な程度に十分量の数であればよぐ例えば、当該哺乳動物としてマウスを使用し、被測定細胞として T hi様分ィ匕細胞または Th2様分ィ匕細胞を用いる場合には、 2xl0⁷個 Zマウスを用いるのが好ましい。ただし、当該細胞数は、使用する哺乳動物または細胞遊走誘導物質、または細胞遊走誘導物質を産生する細胞の種類により異なる。

[0040] 本明細書中、被測定細胞数の測定とは、空気のう中に存在する被測定細胞数を測定することにより行う。当該測定には FACSを用いるのが好ましい。 FACSにおける被測定細胞の検出は、当該被測定細胞に特異的な抗原に対する抗体を用いて行うのが好ましい。当該被測定細胞が導入される哺乳動物に内在する遊走細胞と区別するためである。例えば、被測定細胞上に発現しているァロ抗原に対する抗体を用いて検出することにより、当該内在性の遊走細胞の影響を排除することができる。ァロ抗原とは、同種抗原のことを意味し、同種間で免疫反応を惹起する抗原のことである

[0041] 本明細書中、細胞遊走抑制活性とは、空気のうに移入された細胞力ゝら産生される細胞遊走誘導物質のみに起因する細胞遊走を抑制する活性を意味し、実施例 4〖こ記載された計算式に準じて計算される。

[0042] 本明細書中、細胞遊走抑制物質おける細胞遊走抑制活性とは、本発明の細胞遊走抑制活性の評価法によって細胞遊走抑制活性が認められた化合物を意味する。具体的には、当該化合物を被験化合物として 1乃至 300mgZkg経口投与した場合に、被測定細胞の細胞遊走活性を約 50%以上、好ましくは約 90%以上、さらに好ましくは約 95%以上抑制する活性を意味する。さらに好ましくは、当該化合物を被験化合物として 1乃至 30mgZkg経口投与した場合に、被測定細胞の細胞遊走活性を約 50%以上、好ましくは約 90%以上、さらに好ましくは約 95%以上抑制する活性である。また、当該化合物を被験化合物として 0. 1乃至 30mgZkg静脈投与した場合には、被測定細胞の細胞遊走活性を約 50%以上、好ましくは約 90%以上、さらに好ましくは約 95%以上抑制する活性を意味する。さらに好ましくは、当該化合物を被験化合物として 0. 1乃至 3mgZkg経口投与した場合に、被測定細胞の細胞遊走活性を約 50%以上、好ましくは約 90%以上、さらに好ましくは約 95%以上抑制する活性である。同様に、当該化合物を被験化合物として 0. 1乃至 30mgZkg腹腔内投与した場合には、被測定細胞の細胞遊走活性を約 50%以上、好ましくは約 90%以上、さらに好ましくは約 95%以上抑制する活性を意味する。さらに好ましくは、当該化合物を被験化合物として 0. 1乃至 3mgZkg腹腔内投与した場合に、被測定細胞の細胞遊走活性を約 50%以上、好ましくは約 90%以上、さらに好ましくは約 95%以上抑制する活性である。

[0043] 本明細書中、細胞遊走誘導物質がケモカインである MDCである場合、細胞遊走抑制物質としては、例えば、 N— [5—ブロモ—3— (ピリジン— 3—ィルメトキシ)ビラジン— 2—ィル]—4—メチルベンゼンスルホンアミド、 N— [5—ブロモ—3— ({3- [ 2- (ジメチルァミノ）エトキシ]—4—メトキシベンジル }ォキシ）ピラジン一 2—ィル]

4—メチルベンゼンスルホンアミド、 N— { 3— [ (3—ァミノベンジル）ォキシ]ピラジン一 2—ィル }—4—メチルベンゼンスルホンアミド、 N— {3— [ (3, 4 ジメトキシベンジル )ォキシ ] 5—メチルビラジン 2—ィル } 4 メチルベンゼンスルホンアミド、および N— [3— ({3- [2- (ジメチルアミド）エトキシ]ー4ーメトキシベンジル }ォキシ）

5 メチルビラジンー2—ィル ]ー4 メチルベンゼンスルホンアミド等が挙げられる。また、細胞遊走誘導物質がケモカインである SDF— 1 aまたは βである場合には、細胞遊走抑制化合物として（3S) -Ν- (4ーァゼパン 1ーィルピリミジン 2—ィル )— 1，一（シクロへキシルカルボ-ル）一 1, 4，一ビピペリジン一 3 ァミンおよび 1, 4 —シス— 4— (3S)—3— [ (4 ァゼパン— 1—ィルピリミジン— 2—ィル）ァミノ]ピペリジン 1 ィルシクロへキサノール等が挙げられる。

[0044] 本明細書中、細胞遊走抑制物質の製造方法とは、細胞遊走活性の評価法を用いて細胞遊走抑制活性を有する物質を選択する工程、および、前記工程によって選択された物質をィ匕学合成する工程をその一連の製造過程に含む方法である。さらに、当該製造方法における工程のうち、選択された物質を合成する工程は、例えば、国際公開第 2004Ζ007472号パンフレットおよび国際公開第 2004Ζ052862号パンフレットに掲載された方法、またはそれらの実施例に記載された方法に準じて行うことができる。

[0045] 当該細胞遊走抑制物質は、それ自体単独で投与することもできるが、これらの有効成分の 1種又は 2種以上を含むこともでき、また、薬理学的に許容される製剤用添カロ物等を用いて医薬品組成物として調製し、これを投与するのが好ましい。通常、全身的または局所的に、一般的には経口または非経口の形で投与されるが、好ましくは、経口投与、および静脈内投与である。

[0046] 当該細胞遊走抑制物質は、公知の方法で塩に変換される。塩としては薬学的に許容される塩が好ましい。

[0047] 塩としては、アルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩、アンモニゥム塩、アミン塩、酸付加塩等が挙げられる。

[0048] 塩は、水溶性のものが好ましい。適当な塩としては、アルカリ金属（カリウム、ナトリウム等）の塩、アルカリ土類金属（カルシウム、マグネシウム等）の塩、アンモ-ゥム塩、薬学的に許容される有機アミン (テトラメチルアンモ-ゥム、トリェチルァミン、メチルァミン、ジメチルァミン、シクロペンチルァミン、ベンジルァミン、フエネチルァミン、ピペリジン、モノエタノールァミン、ジエタノールァミン、トリス（ヒドロキシメチル）ァミノメタン、リジン、アルギニン、 N—メチルー D—グルカミン等）の塩が挙げられる。

[0049] 酸付加塩は水溶性であることが好ま、。適当な酸付加塩としては、例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、硫酸塩、リン酸塩、硝酸塩のような無機酸塩、または酢酸塩、乳酸塩、酒石酸塩、安息香酸塩、クェン酸塩、メタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、トルエンスルホン酸塩、イセチオン酸塩、グルクロン酸塩、ダルコン酸塩のような有機酸塩が挙げられる。

[0050] 投与量は、年齢、体重、症状、治療効果、投与方法、処理時間等により異なるが、通常、成人一人あたり、一回につき、 100 /^から100111₈の範囲で、ー日ー回カも数回経口投与される力または、成人一人あたり、一回につき、 ΙΟ /z gから lOOmgの範囲で、一日一回力数回非経口投与される。もちろん前記したように、投与量は種々の条件により変動するので、上記投与量より少ない量で十分な場合もあるし、また範囲を越えて必要な場合もある。

[0051] 経口投与のための固体組成物には、錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤等が含まれる。カプセルには、ソフトカプセルおよびハードカプセルが含まれる。

[0052] このような固体糸且成物においては、一つまたはそれ以上の活性物質力少なくとも一つの不活性な希釈剤（例えば、ラタトース、マン-トール、グルコース、ヒドロキシプ口ピルセルロース、微結晶セルロース、デンプン、ポリビュルピロリドン、メタケイ酸ァルミン酸マグネシウム等）と混合される。組成物は、常法に従って、不活性な希釈剤以外の添加物、例えば、潤滑剤 (ステアリン酸マグネシウム等）、崩壊剤 (繊維素ダリコール酸カルシウム等）、安定化剤 (ヒト血清アルブミン、ラタトース等）、溶解補助剤（アルギニン、ァスパラギン酸等）を含有して、てもよ、。

[0053] 錠剤または丸剤は、必要により白糖、ゼラチン、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート等の胃溶性ある、は腸溶性のフィルムで被膜してもよいし、また 2以上の層で被膜してもよい。さらにゼラチンのような吸収されうる物質のカプセルも包含される。

[0054] 経口投与のための液体組成物は、薬学的に許容される乳濁剤、溶液剤、懸濁剤、シロップ剤、エリキシル剤等を含み、一般に用いられる不活性な希釈剤（例えば、精製水、エタノール等)を含んでいてもよい。この様な組成物は、不活性な希釈剤以外に湿潤剤、懸濁剤のような補助剤、甘味剤、風味剤、芳香剤、防腐剤を含有していてちょい。

[0055] 非経口投与のための注射剤としては、無菌の水性または非水性の溶液剤、懸濁剤、乳濁剤を包含する。水性または非水性の溶液剤、懸濁剤としては、一つまたはそれ以上の活性物質が、少なくとも一つの不活性な希釈剤と混合される。水性の希釈剤としては、例えば注射用蒸留水および生理食塩水が挙げられる。非水性の希釈剤としては、例えば、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、ォリーブ油のような植物油、エタノールのようなアルコール類、ポリソルベート 80 (登録商標）等が挙げられる。

[0056] このような組成物は、さらに防腐剤、湿潤剤、乳化剤、分散剤、安定化剤 (例えば、ヒト血清アルブミン、ラタトース等）、溶解補助剤（例えば、アルギニン、ァスパラギン酸等)等の補助剤を含んで、てもよ、。

[0057] 非経口投与のための外用剤としては、例えば、軟膏剤、ゲル剤、クリーム剤、湿布剤、貼付剤、リニメント剤、噴霧剤、吸入剤、スプレー剤、エアゾル剤、点眼剤、および点鼻剤等が挙げられる。これらはひとつまたはそれ以上の活性物質を含み、公知の方法または通常使用されている処方により製造される。

[0058] 噴霧剤、吸入剤、およびスプレー剤は、一般的に用いられる希釈剤以外に亜硫酸水素ナトリウムのような安定剤と等張性を与えるような緩衝剤、例えば、塩化ナトリウム、クェン酸ナトリウムあるいはクェン酸のような等張剤を含有していてもよい。スプレー剤の製造方法は、例えば、米国特許第 2,868,691号および同第 3,095,355号に詳しく記載されている。

[0059] 非経口投与のための上記以外の組成物としては、ひとつまたはそれ以上の活性物質を含み、常法により処方される直腸内投与のための坐剤および膣内投与のためのペッサリー等が含まれる。発明の効果

[0060] 本発明の方法を使用することにより、 in vivoにおいて特定の細胞遊走誘導物質の作用に対応した細胞遊走を測定することが可能となり、特異性あるいは選択性を有する細胞遊走抑制化合物の in vivoにおける作用評価が可能となった。

図面の簡単な説明

[0061] [図 l] (a)マウス MDC発現ベクター、（b)マウス SDF— 1発現ベクター

[図 2]被験化合物の細胞遊走抑制活性の評価

発明を実施するための最良の形態

[0062] 以下、実施例および生物学的実施例によって本発明を詳述するが、本発明はこれらに限定されるものではない。

実施例 1：マウス MDCおよびマウス SDF— lcDNAの単離

マウス MDCcDNAは、配列番号 1に示されるプライマー： 5， -AAAAAAAGAT CTGCCACCATGGCTACCCTGCGTGTCCCACT- 3，および配列番号 2に示されるプライマー：5， -AAAAAAGCGGCCGCGGACAGTTTATGGAGTA GCTTCT— 3，を用いて、マウス脾臓 cDNAライブラリ一力既知の PCR法に準じた方法によって増幅し、単離した。同様に、マウス SDF— lcDNAも、配列番号 3に示

GTA- 3，および配列番号 4に示されるプライマー： 5， - AAAAG AGCTCGCC A CCATGGACGCCAAGGTCGTCGCCGTG— 3，を用いて、マウス月卑臓 cDNAライブラリーから既知の PCR法に準じた方法によって増幅し、単離した。さらに、マウス TARCcDNAも、配列番号 5に示されるプライマー： 5， - AAAAAAAG ATCTGC C ACC ATG AGGTC ACTTC AG ATGCTGCT - 3，および配列番号 6に示される

CT— 3 'を用いて、マウス脾臓 cDNAライブラリ一力既知の PCR法に準じた方法によって増幅し、単離した。

[0063] それぞれの PCR産物をァガロースゲル電気泳動によって分離および抽出した後、 Bglllおよび Notlによる制限酵素処理を行った。同様に制限酵素処理を行った発現ベクター pUC— SR a ZFLAGにライゲーシヨンさせ、これを大腸菌 DH5 aに遺伝子導入した。得られたアンピシリン耐性コロニーを培養後、当該大腸菌から当該発現ベクターを抽出した。

実施例 2：マウス MDC発現 293T細胞およびマウス SDF— 1発現 293T細胞の作製 3xl0⁶/dishとなるように播種された 293T細胞に対して、翌日にリポフエクシヨン法により、マウス MDC発現ベクターマウス MDCZpUC— SR a ZFLAGのトランスフェクシヨンを行った。当該リポフエクシヨン法は、インビトロジェンカも購入したリボフエタタミン試薬および PLUS試薬の使用説明書に記載された方法に準じて行った。翌日、当該細胞を回収した。マウス MDCZpUC— SR a ZFLAGは、図 1 (a)に記載された構成を有する。

[0064] 同様の方法により、マウス SDF— 1発現 293T細胞を調製した。マウス SDF— 1/p UC— SR a ZFLAGは、図 1 (b)に記載された構成を有する。

実施例 3：被測定細胞の調製 (Thlおよび Th2様分ィヒ細胞の調製）

BalbZcマウスの脾臓より常法に従い脾臓細胞を調製した。調製した脾臓細胞からマウス CD4サブセットエンリッチメントカラム（R&D)を用いてネガティブセレクション法により、マウス CD4陽性 T細胞を精製した。この細胞を用いてマウス Thl様および Th2様分化細胞を調製した。

[0065] すなわち、抗 mTCR jS抗体をコートした 24ゥエルプレートにゥエル当たり 1. 5〜2.

OxlO⁶細胞 /2mLを播き、 37° Cで COインキュベーター内で 48時間培養した。こ

2

のとき、 Thl様分ィ匕細胞に分ィ匕誘導を行う場合には、 20ngZmL mIL— 12、2. 5 μ gZmL抗 mIL—4抗体、および 1. 0 μ g/mL 抗 mCD28抗体を添カ卩し、 Th2様細胞に分化誘導を行う場合には、 20ngZmL mIL-4, 2. 5 μ g/mL 抗 mIL— 12抗体、 1. O ^ g/mL 抗 mCD28抗体をそれぞれ添カ卩した。

[0066] 刺激力 48時間後に当該細胞を回収して、抗 mTCR β抗体を除去した。その後 2 ng/mL mIL— 2存在下で 72時間培養して、被測定細胞とした。

実施例 4：被験化合物の細胞遊走抑制活性の評価法

各被験化合物は、 1%DKエステル (対照媒体）に懸濁させたものを調製した。被験化合物 1、被験化合物 2(30mgZkgおよび lOOmgZkg)または対照媒体を、それぞれ別の動物に経口投与し、 30分後に、空気のう（予めマウス背部皮下に注射シリンジにて作製）へマウス MDC発現 293T細胞（もしくは 293T細胞， mock— 293T細胞）を 1χ10⁷/500 /ζ L/マウスで当該空気のう内へ移入した。さらに 1時間後に 1x1 0⁷/500 μ LZマウスの被測定細胞である Th2様分ィ匕細胞を尾静脈内に移入した。

[0067] 24時間後にエーテル麻酔下で、 2. 5mLの PBS (—）で空気のう内を洗浄した。回収した洗浄液を 70 mのセルストレーナ一を通し、遠心後上清を回収した。得られた細胞は抗マウス CD16Z32抗体により Fc受容体をブロック後，抗 Lyl . 2抗体及び抗マウス CD4抗体にて染色した。続いて F ACSを用いて Lyl. 2陽性および CD4陽性細胞を検出し、当該陽性細胞数を測定した。

[0068] 細胞遊走抑制活性は、各被験化合物投与でのマウス MDC発現 293T細胞移入動物の Lyl. 2陽性および CD4陽性細胞を (A)、対照媒体投与での mock— 293T細胞移入動物の Lyl. 2陽性および CD4陽性細胞を (B)、対照媒体投与での 293T細胞移入動物の Lyl. 2陽性および CD4陽性細胞を (C)として、以下の式に従い算出した。

[0069] 細胞遊走抑制活性 (％)=(1— ((A)— (B)Z(C)— (B) ) ) X 100

本発明の細胞遊走抑制活性評価法は、図 2に示すように、被験化合物 1 (N [5— ブロモ 3— (ピリジン一 3—ィルメトキシ）ピラジン一 2—ィル]—4—メチノレベンゼンスルホンアミド）および被験化合物 2 (N— [5 ブロモー 3— ({3- [2- (ジメチルァミノ )ェトキシ] 4ーメトキシベンジル }ォキシ）ピラジン 2 ィル] 4 メチルベンゼンスルホンアミド)の細胞遊走抑制活性を評価することができた。

[0070] 同様の方法により、マウス SDF— 1発現 293T細胞と被測定細胞として Thl様分ィ匕細胞を用いて、マウス SDF— 1による細胞遊走に対する（3S) -N- (4ーァゼパン 1—ィルピリミジン— 2—ィル）—1，（シクロへキシルカルボ-ル）— 1, 4，—ビピペリジン— 3 ァミンおよび 1, 4 シス— 4— (3S)— 3— [ (4 ァゼパン— 1—ィルピリミジン— 2—ィル)ァミノ]ピぺリジン— 1—ィルシクロへキサノールの抑制活性 (それぞれ 30mgZkg経口投与の場合、 63%、 58%抑制）を評価することができた。

産業上の利用可能性

[0071] 本発明の細胞遊走活性測定法は、特異性ある!/、は選択性を有する細胞遊走抑制化合物の in vivoにおける作用評価を可能とし、当該化合物を有効成分とする医薬品の開発において使用することができる。

Claims

請求の範囲

[1] ( 1)哺乳動物の皮下に作製した空気のうに細胞遊走誘導物質を産生する細胞を移入する工程、 (2)哺乳動物の当該空気のう以外の部位に被測定細胞を移入するェ程、（3)当該空気のう内の細胞を回収する工程、および (4)工程（3)で回収された細胞のうち当該被測定細胞数を測定する工程を含む細胞遊走活性測定法。

[2] ( 1)被験化合物またはその対照媒体を別々の哺乳動物に投与する工程、（2)哺乳動物の皮下に作製した空気のうに細胞遊走誘導物質を産生する細胞を移入するェ程、（3)哺乳動物の当該空気のう以外の部位に被測定細胞を移入する工程、（4)当該空気のう内の細胞を回収する工程、 (5)工程 (4)で回収された細胞のうち当該被測定細胞数を測定する工程、および (6)対照媒体が投与された哺乳動物の空気のう中の被測定細胞数に対する、被験化合物を投与した哺乳動物の空気のう中の被測定細胞数を比較する工程を含む被験化合物の細胞遊走抑制活性評価法。

[3] 請求の範囲 2記載の細胞遊走活性の評価法を用いて細胞遊走抑制活性を有する物質を選択する工程、および、前記工程によって選択された物質を化学合成する工程を含むことを特徴とする細胞遊走抑制物質の製造方法。

[4] 細胞遊走誘導物質を産生する細胞が、細胞遊走誘導物質を産生するよう遺伝子導入または遺伝子改変された細胞である請求の範囲 1乃至 3記載の方法。

[5] 細胞遊走誘導物質が、ケモカインまたはサイト力インである請求の範囲 1乃至 3記載の方法。

[6] ケモカインが、 1— 309、 MCP— 1、 MIP - 1 a、 MIP— 1 a P、 MIP— 1 β、 RANT ESゝ MRP— 1、 MCP— 3、 MCP— 2、 MIP— 1 γ、ェォタキシン、 MCP— 5、 MCP —4、 MCIF、 MIP - 1 δ、 NCC -4/LEC, TARC、 MIP— 4、 MIP— 3b、 MIP— 3 a、 SLC、 MDC、 MIP— 3、ェォタキシン 2、 TECK、ェォタキシン 3、スキン力イン、 MEC、 NAP— 3、 MIP— 2 α、 MIP— 2 j8、 Cinc2、 CXCL4、 CXCL4V1、 E NA— 78、 CKA— 3、 PPBP、 PPBPL1、 IL— 8、 MIG、 IP— 10、 I— TAC、 SDF— 1 a、 SDF- 1 β、 BCA— 1、 MIP— 2 γ、ラング力イン、 SR— PSOX、 NAP— 4、二ユーロタクチン、ミドカイン、 SCYC1、および SCYC2から選択される 1種以上である請求の範囲 5記載の方法。

[7] ケモカインが、 SDF- 1 a、 SDF- 1 β、 TARC、または MDCである請求の範囲 5 記載の方法。

[8] 被測定細胞が、 T細胞、 B細胞、単球、マクロファージ、または顆粒球細胞である請求の範囲 1乃至 3記載の方法。

[9] T細胞が、 CD4陽性 T細胞または CD8陽性 T細胞である請求の範囲 8記載の方法。

[10] T細胞が、 Thl様分ィ匕細胞または Th2様分ィ匕細胞である請求の範囲 8記載の方法。

[11] ケモカインおよび Zまたは被測定細胞がヒト由来であって、哺乳動物が免疫不全哺乳動物である請求の範囲 5記載の方法。

[12] 哺乳動物が、免疫不全マウスである請求の範囲 1乃至 3記載の方法。

[13] ケモカインおよび Zまたは被測定細胞がヒト由来であって、哺乳動物がマウスである請求の範囲 5記載の方法。